DE3688900T3

DE3688900T3 - Expression von Protein C.

Info

Publication number: DE3688900T3
Application number: DE3688900T
Authority: DE
Inventors: Kathleen L Berkner; Earl W Davie; Donald C Foster; Mark J Murray
Original assignee: University of Washington; Zymogenetics Inc
Current assignee: University of Washington; Zymogenetics Inc
Priority date: 1985-06-27
Filing date: 1986-06-26
Publication date: 1998-06-10
Anticipated expiration: 2006-06-27
Also published as: ATE93272T1; DE3688900T2; EP0215548B1; NO862601L; JPS62111690A; JP2614848B2; NO305660B1; DE3688900D1; DK175574B1; JPH09107976A; DK308586A; EP0215548B2; NO862601D0; JP2688407B2; CA1341228C; DK308586D0; EP0215548A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Plasmaproteine und DNA-Sequenzen, die sie kodieren, und genauer gesagt, die Expression von Proteinen mit im wesentlichen derselben Struktur und/oder Aktivität wie menschliches Protein C.

Hintergrundtechnik

Protein C ist ein Zymogen, oder Vorläufer, einer Serin-Protease, die eine wichtige Rolle in der Regulierung der Blutgerinnung und Erzeugung von fibrinolytischer Aktivität in vivo spielt. Es wird in der Leber als ein einzelkettiges Polypeptid synthetisiert, das eine erhebliche Verarbeitung durchläuft, um zu einem zweikettigen Molekül zu führen, das eine schwere (Mr - 40.000) und eine leichte (Mr = 21.000) Kette umfaßt, die von einer Disulfidbindung zusammengehalten werden. Das zirkulierende zweikettige Zwischenprodukt wird zur biologisch aktiven Form des Moleküls, bekannt als "aktiviertes Protein C" (APC), umgewandelt durch die Thrombin-mediatisierte Abspaltung eines 12-Reste-Peptids vom Amino-Terminus der schweren Kette. Die Abspaltungsreaktion wird in vivo durch Thrombomodulin, einen endothelialen Zell-Cofaktor, verstärkt (Esmon und Owen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2249-2252, 1981).
Protein C ist ein Vitamin-K-abhängiges Glykoprotein, das ungefähr neun Reste Gamma-Carboxyglutaminsäure (Gla) und ein Aqulvalent Beta-Hydroxyasparaginsäure enthält, die durch posttranslationale Modifikationen von Glutaminsäure- bzw. Asparaginsäureresten gebildet werden. Die post-translationale Bildung von spezifischen Gamma-Carboxyglutaminsäureresten in Protein C erfordert Vitamin K. Diese unüblichen Aminosäurereste binden sich an Calciumionen, und man glaubt, daß sie für die Wechselwirkung des Proteins mit Phospholipid verantwortlich sind, die für die biologische Aktivität von Protein C erforderlich ist.
Im Gegensatz zur gerinnungsfördernden Wirkung anderer Vitamin- K-abhängiger Plasmaproteine, wie etwa Faktor VII, Faktor IX und Faktor X, wirkt aktivertes Protein C als ein Regulator des Gerinnungsprozesses durch die Inaktivierung von Faktor Va und Faktor VIIIa durch begrenzte Proteolyse. Die Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa durch Protein C ist abhängig von der Gegenwart von sauren Phospholipiden und Calciumionen. Es ist berichtet worden, daß Protein S diese Aktivität durch Beschleunigung der APC-katalysierten Proteolyse von Faktor Vareguliert (Walker, J. Biol. Chem. 255: 5521-5524, 1980).
Protein C ist auch in Verbindung gebracht worden mit der Wirkung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Kisiel und Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42, 1983). Infusion von Rinder-APC in Hunde führt zu erhöhter Plasminogen-Aktivator-Aktivität (Comp und Esmon, J. Clin. Invest. 68: 1221-1228, 1981). Kürzliche Studien (Sakata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1121-1125, 1985) haben gezeigt, daß Zugabe von APC zu kultivierten Endothelzellen zu einem schnellen, dosisabhängigen Anstieg in der fibrinolytischen Aktivität in den konditionierten Medien führt, was Anstiege in der Aktivität von sowohl - - Urokinase-ähnlichen als auch Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren durch die Zellen widerspiegelt. APC-Behandlung führt auch zu einer dosisabhängigen Abnahme in der Anti-Aktivator-Aktivität.
Ererbter Protein C-Mangel steht in Zusammenhang mit rezidivierender thrombotischer Erkrankung (Broekmans et al., New Eng. J. Med. 309: 340-344, 1983; und Seligsohn et al., New Eng. J. Med. 310: 559-562, 1984) und kann von einer genetischen Störung oder von einem Trauma, wie etwa einer Lebererkrankung oder einem chirurgischen Eingriff, herrühren. Dieser Zustand wird im allgemeinen mit oralen gerinnungshemmenden Mitteln behandelt. Vorteilhafte Wirkungen sind auch erzielt worden durch die Infusion von Protein C enthaltendem Normalplasma (s. Gardiner und Griffin in Prog. in Hematology, Hrg. Brown, Grune & Stratton, NY, 13: 265-278). Zusätzlich haben einige Forscher entdeckt, daß die gerinnungshemmende Aktivität von Protein bei der Behandlung thrombotischer Störungen, wie etwa Venenthrombose, nützlich ist (WO85/00521). Es wird geschätzt, daß in einigen Teilen der Welt ungefähr 1 unter 16.000 Individuen Protein-C-Mangel zeigt. Außerdem ist ein totaler Mangel an Protein C bei Neugeborenen tödlich.
Obgleich natürliches Protein C aus Gerinnungsfaktorkonzentraten (Marlar et al., Blood 59: 1067-1072) oder aus Plasma (Kisiel, aaO) gereinigt werden kann, ist es ein komplexes und teures Verfahren, teilweise wegen der beschränkten Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials und der niedrigen Konzentration von Protein C in Plasma. Außerdem trägt der therapeutische Einsatz von Produkten, die aus menschlichem Blut gewonnen sind, das Risiko von Krankheitsübertragung durch z.B. Hepatitis-Virus, Zytomegab-Virus oder das auslösende Agens für erworbene Immuninsuffizienz (AIDS). Angesichts der klinischen Anwendbarkeit von Protein C in der Behandlung von thrombotischen Störungen ist die Herstellung brauchbarer Mengen von Protein und aktiviertem Protein C klar von unschätzbarem Wert.
EP-A-191606, veröffentlicht am 20. August 1986, offenbart DNA- Sequenzen, die menschliches Protein C kodieren.

Erfindungsoffenbarung

Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das bei Aktivierung durch proteolytische Verarbeitung im Sekretionsweg zu menschlichem aktivierten Protein C führt, wobei besagte DNA-Sequenz nicht eine Sequenz einschließt, die das in Figur 2 dargestellte Aktivierungspeptid aus 12 Aminosäuren kodiert, wobei besagtes aktiviertes Protein C eine Aminosäuresequenz aufweist, die in Figur 2 dargestellt ist. Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Protein kodiert, das bei Aktivierung durch proteolytische Verarbeitung im Sekretionsweg zu einem menschlichen aktivierten Protein C führt, wobei besagte DNA-Sequenz nicht eine Sequenz einschließt, die das in Figur 2 dargestellte Aktivierungspeptid aus 12 Aminosäuren kodiert, wobei besagtes aktiviertes Protein C eine Aminosäuresequenz aufweist, die in Figur 2 dargestellt ist. Zusätzlich offenbart die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, der zur Integration in Säugetier-Wirtszell-DNA in der Lage ist, wobei besagter Expressionsvektor einen Promotor einschließt, dem stromabwärts eine Nukleotidsequenz von Anspruch 2 folgt, wobei besagter Nukleotidsequenz stromabwärts ein Polyadenylierungssignal folgt, wobei die Transkription der Nukleotidsequenz durch den Promotor gesteuert wird. In einer Ausführungsform schließt der Expressionsvektor einen selektionierbaren Marker ein, der zwischen der Nukleotidsequenz und dem Polyadenylierungssignal angeordnet ist, wobei die Transkription des selektionierbaren Markers von dem Promotor gesteuert wird. Der Exspressionsvektor kann auch einen Satz RNA-Spleißstellen einschließen.
Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart Säugetierzellen, die transfiziert sind, um menschliches aktiviertes Protein C zu exprimieren. Die Säugetierzellen werden mit einem wie oben definierten Expressionsvektor transfiziert. In einer Ausführungsform ist auch ein selektionierbarer Marker in die Zellen eingeführt, und stabil transfizierte Zellen werden selektioniert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem aktivierten Protein C. Das Verfahren umfaßt das Einführen einer Expressionseinheit, die eine Sequenz von Anspruch 1 umfaßt, die ein Protein kodiert, das bei Aktivierung durch intrazelluläre proteolytische Verarbeitung zu einem menschlichen aktivierten Protein C führt, in eine Säugetier-Wirtszelle; das Züchten besagter Säugetier- Wirtszelle in einem geeigneten Medium, das Vitamin K enthält; und das Isolieren des Proteinproduktes, das von besagte Expressionseinheit kodiert und von besagter Säugetier-Wirtszelle produziert wird.
Die in der vorliegenden Erfindung produzierten Proteine können als aktive therapeutische Substanzen verwendet werden, einschließlich zur Regulierung der Blutgerinnung. Außerdem können diese Proteine mit einem physiologisch annehmbaren Trägerstoff und/oder Verdünnungsstoff kombiniert werden, um geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen.
Andere Aspekte der Erfindung werden bei Bezugnahme auf die detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine Teilrestriktionskarte der Protein-C-cDNA in pHCλ6L. Die Kodierungsregion ist durch einen offenen Kasten angegeben.
Figur 2 veranschaulicht die Nukleotidsequenz der vollständigen Protein-C-cDNA und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Protein C. Pfeile geben Schnittstellen für die Entfernung des Verbindungspeptids und Aktivierungspeptids an.
Figur 3 veranschaulicht eine Restriktionsenzymkarte der Genom- DNA, die für menschliches Protein C kodiert. Zahlen unter der Linie geben die Länge in Kilobasen (kb) an.
Figur 4 veranschaulicht die vollständige Genomsequenz, einschließlich Exons und Introns, des menschlichen Protein-C- Gens. Pfeilspitzen zeigen Intron-Exon-Spleißverbindungsstellen an. Die Polyadenylierungs- oder Verarbeitungssequenzen von A-T-T-A-A-A und A-A-T-A-A-A am 3'-Ende sind eingekästelt. , potentielle Kohlehydratanknüpfungsstellen; , scheinbare Schnittstellen zur Verarbeitung des Verbindungsdipeptids; , Schnittstelle in der schweren Kette, wenn Protein C zu aktiviertem Protein C umgewandelt wird; , Polyadenylierungsstellen.
Figur 5 veranschaulicht ein schematisches zweidimensionales Modell für die Struktur von menschlichem Protein C.
Figur 6 veranschaulicht die Subklonierung der 5'- und 3'-Abschnitte eines partiellen Protein-C-cDNA-Klons.
Figur 7 veranschaulicht die Entfernung von Intron A aus dem Genomklon, was zur Fusion der Exons I und II führt.
Figur 8 veranschaulicht die Fusion der Exons I und II an den 5'-sten Abschnitt des cDNA-Inserts von Figur 1.
Figur 9 veranschaulicht die Konstruktion eines Plasmids, das die vollständige Kodierungssequenz für Protein C umfaßt.
Figur 10 veranschaulicht den Expressionsvektor pD7C. Verwendete Symbole sind on, die Adenovirus-5-0-1-Map-Unit-Sequenz; E, der SV40-Verstärker; Ad2MLP, der Adenovirus-2-Major-Late-Promotor; L 1-3, der Adenovirus-2-Tripartite-Leader; 5'ss, 5,- Spleißstelle; 3'ss, 3'-Spleißstelle; pA; das frühe SV40-Polyadenylierungssignal; und Δ, die deletierte Region der pBR322- "Gift"-Sequenzen.
Figur 11 veranschaulicht den Expressionsvektor pD5 (PC-DHFRr). DHFRr bezeichnet die Methotrexat-resistente, mutante Dihydrofolat-Reduktase-Gensequenz; pA bezeichnet das späte SV40-Polyadenylierungssignal. Andere verwendete Symbole sind wie für Figur 7 beschrieben.
Figur 12 veranschaulicht den Expressionsvektor pDX/PC. Verwendete Symbole sind wie für Figur 11 beschrieben.

Beste Art und Weise für die Durchführung der Erfindung

Vor der Darlegung der Erfindung kann es für deren Verständnis hilfreich sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke, die hier im weiteren verwendet werden sollen, darzulegen.

Biologische Aktivität:

Eine Funktion oder ein Satz von Funktionen, die (der) von einem Molekül in einem biologischen Kontext ausgeführt wird (d.h. in einem Organismus oder in einem in-vitro-Facsimile). Biologische Aktivitäten von Proteinen können unterteilt werden in katalytische und Effektor-Aktivitäten. Katalytische Aktivitäten der Vitamin-K-abhängigen Plasmaproteine umfassen im allgemeinen das spezifische proteolytische Spalten anderer Plasmaproteine, was zur Aktivierung oder Desaktivierung des Substrats führt. Effektor-Aktivitäten schließen spezifische Bindung des biologisch aktiven Moleküls an Calcium oder andere kleine Moleküle, an Makromoleküle, wie etwa Proteine, oder an Zellen ein. Effektor-Aktivität verstärkt häufig, oder ist wesentlich für, katalytische Aktivität unter physiologischen Bedingungen.
Für Protein C ist biologische Aktivität gekennzeichnet durch seine gerinnungshemmenden und fibrinolytischen Eigenschaften. Protein C, wenn es aktiviert ist, inaktiviert Faktor Va und Faktor VIIIa in der Gegenwart von Phospholipid und Calcium. Protein S scheint bei der Regulation dieser Funktion eine Rolle zu spielen (Walker, aaO). Aktiviertes Protein C verstärkt auch die Fibrinolyse, eine Wirkung, von der man glaubt, daß sie mediatisiert wird durch das Absenken der Gehalte an Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren (van Hinsbergh et al., Blood 65: 444-451, 1985). Wie unten vollständiger beschrieben, ist jener Abschnitt von Protein C, der durch die Exons VII und VIII des Protein-C-Gens kodiert wird, primär verantwortlich für dessen katalytische Aktivitäten.

Präpropeptid:

Eine Aminosäuresequenz, die am Aminoterminus einiger Proteine auftritt und im allgemeinen während der Translokation vom Protein abgespalten wird. Präpropeptide umfassen Sequenzen, die das Protein in den Sekretionspfad der Zelle lenken (Signalsequenzen), und sind gekennzeichnet durch das Vorhandensein eines Kerns aus hydrophoben Aminosäuren. Sie können auch Verarbeitungssignale umfassen. Wie hierin verwendet, kann der Ausdruck "Präpropeptid" auch einen Abschnitt des natürlich auftretenden Präpropeptids bedeuten.

Expressionseinheit:

Ein DNA-Konstrukt, das eine primäre Nukleotidsequenz, die ein interessierendes Protein kodiert, zusammen mit anderen Nukleotidsequenzen, die die Transkription der primären Nukleotidsequenz lenken und steuern, umfaßt. Eine Expressionseinheit besteht aus wenigstens der primären Nukleotidsequenz und einer Promotorsequenz, die stromaufwärts von und operabel verknüpft mit der primären Nukleotidsequenz angeordnet ist, und einem Polyadenylierungssignal, das stromabwärts angeordnet ist. Zusätzliche genetische Elemente können ebenfalls eingeschlossen sein, um die Expressionseffizienz zu erhöhen. Diese Elemente schließen Verstärkersequenzen, Leader und mRNA-Spleißstellen ein.

Expressionsvektor:

Ein DNA-Molekül, das unter anderem eine DNA-Sequenz, die ein interessierendes Protein kodiert, zusammen mit einem Promotor und anderen Sequenzen, die die Expression des Proteins erleichtern, enthält. Expressionsvektoren enthalten außerdem genetische Information, die für ihre Replikation in einer Wirtszelle sorgt. Beispiele für Expressionsvektoren, die üblicherweise für rekombinante DNA verwendet werden, sind Plasmide und bestimmte Viren, obgleich sie Elemente von beiden enthalten können. Sie können auch einen selektionierbaren Marker einschließen.
Wie oben angemerkt, wird Protein C in der Leber produziert und benötigt Vitamin K für seine Biosynthese. Vitamin K ist für die Bildung spezifischer Gamma-Carboxyglutaminsäurereste in der aminoterminalen Region der leichten Kette notwendig. Diese Aminosäurereste werden gebildet durch eine post-translationale Modifikation und sind erforderlich für die Calcium-mediatisierte Bindung an Phospholipid. Zusätzlich enthält Protein einen Beta-Hydroxyasparaginsäurerest, der ebenfalls in einer post-translationalen Modifikation gebildet wird. Die Rolle dieses Aminosäurerestes ist jedoch nicht bekannt.
In Anbetracht der Tatsache, daß die Aktivität von Protein von post-translationalen Modifikationen abhängig ist, die die Gamma-Carboxylierung spezifischer Glutaminsäurereste umfassen, und auch von der Hydroxylierung eines spezischen Asparaginsäurerestes abhängig sein kann, ist es unwahrscheinlich, daß ein aktives Produkt durch die Klonierung und Expression von Protein C in einem Mikroorganismus produziert werden könnte.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins zur Verfügung, das gamma-carboxyliert ist und die biologische Aktivität von menschlichem aktivierten Protein C besitzt, ohne die Notwendigkeit zur Aktivierung.
Die leichte und die schwere Kette von Rinder-Protein C sind sequenziert worden (Fernlund und Stenflo, J. Biol. Chem. 257:12170-12179, 1982; und Stenflo und Fernlund, J. Biol. Chem. 257:12180-12190, 1982). Isolierung und Charakterisierung von menschlichem Protein C ist beschrieben worden von Kisiel, J. Clin, Invest. 64: 761:769, 1979. Mit der Ausnahme des aminoterminalen Asparaginsäurerestes ist die aminoterminale Sequenz der schweren Kette von menschlichem Protein C verschieden von den ersten 18 Aminosäuren, die in der schweren Kette des Rinder-Proteins gefunden wurden. Die gerinnungshemmenden Aktivitäten von sowohl dem menschlichen als auch dem Rinder-Enzym erwiesen sich als hoch speziesspezifisch. Man glaubt, daß Speziesspezifität indirekt bewirkt wird durch Protein S (Walker, Thromb. Res. 22:321-327, 1981). Das menschliche und das Rinder-Protein zeigen jedoch insgesamt beträchtliche strukturelle Homologie zueinander und zu anderen Vitamin-K-abhängigen Plasmaproteinen, einschließlich Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X. Ähnlichkeiten schließen das Vorhandensein der Gla-Reste in der leichten Kette und der aktiven Stelle Serin in der schweren Kette ein, sowie andere Aminosäuresequenzhomologie in der aminoterminalen Region der leichten Kette.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine λgt11-cDNA- Bibliothek aus menschlicher Leber-mRNA hergestellt. Diese Bibliothek wurde dann mit ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper auf menschliches Protein C gescreent. Antikörper-reaktive Klone wurden weiter analysiert auf die Synthese eines Fusionsproteins von β-Galactosidase und Protein C im λgt11-Vektor.
Einer der Klone gab ein starkes Signal mit der Antikörpersonde, und es wurde festgestellt, daß er ein Insert von ungefähr 1400 bp enthielt. DNA-Sequenzanalyse des DNA-Inserts enthüllte eine vorhergesagte Aminosäuresequenz, die einen hohen Homologiegrad zu Hauptabschnitten des Rinder-Proteins C zeigt, wie bestimmt von Fernlund und Stenflo (J. Biol. Chem. 257:12170- 12179; J. Biol. Chem. 257: 12180-12190).
Das DNA-Insert enthielt den Hauptteil der Kodierungsregion für Protein C, beginnend mit Aminosäure 64 der leichten Kette, einschließlich der gesamten Kodierungsregion der schweren Kette, und fortschreitend bis zum Terminationscodons. Außerdem gab es, im Anschluß an das Stopcodon der schweren Kette, 294 Basenpaare einer 3' nicht-kodierenden Sequenz und ein Poly(A)- Tail von 9 Basenpaaren. Das Verarbeitungs- oder Polyadenylierungssignal A-A-T-A-A-A war 13 Basenpaare stromaufwärts vom Poly(A)-Tail in diesem cDNA-Insert vorhanden. Diese Sequenz war eine von zwei potentiellen Polyadenylierungsstellen.
Die cDNA-Sequenz enthielt auch das Dipeptid Lys-Arg an Position 156-157, welches die leichte Kette von der schweren Kette trennt und während der Verarbeitung durch proteolytische Spaltung entfernt wird, was zur Sekretion der zwei Kettenmoleküle führt. Bei Aktivierung durch Thrombin wird die schwere Kette von menschlichem Protein C zwischen Arginin-169 und Leucin-170 gespalten, wobei das Aktivierungspeptid freigesetzt wird (Figur 2).
Mit einem ähnlichen Verfahren wurde eine zweite cDNA, der die Kodierungssequenz für das Präpropeptid und die ersten 23 Aminosäuren von Protein C fehlten, isoliert. Unter Verwendung dieser cDNA als einer Hybridisierungssonde wurde der Rest der Kodierungssequenz aus einer menschlichen Genom-DNA-Bibliothek in λ Charon 4A erhalten (Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4673-4677, 1985). Drei verschiedene λ-Charon-4A-Phagen wurden isoliert, die überlappende Inserts für das Protein-C- Gen enthielten.
Die Positionen der Exons auf den drei Phagen-Klonen wurden durch Southern-Blot-Hybridisierung von Verdauungsprodukten dieser Klone mit Sonden, die aus der oben beschriebenen 1400 bp cDNA hergestellt worden waren, bestimmt. Die Genom-DNA-Inserts in diesen Klonen wurden durch Einzel- und Doppel-Restriktionsenzymverdauung, gefolgt von Agarosegel-Elektrophorese, Southern-Blotting und Hybridisierung an radioaktiv markierte 5'- und 3'-Sonden, abgeleitet aus der cDNA für menschliches Protein C, kartiert, wie in Figur 3 gezeigt.
DNA-Sequenzierungsstudien wurden unter Verwendung der Didesoxykettenterminationsmethode durchgeführt. Wie in Figur 4 gezeigt, überspannt die Nukleotidsequenz für das Gen für menschliches Protein C ungefähr 11 kb DNA. Diese Studien enthüllten außerdem ein potentiellen Präpropeptid von 42 Aminosäuren. Gestützt auf Homologie mit dem Präpropeptid von Rinder-Protein C in der Region -1 bis -20, ist es wahrscheinlich, daß die Präprosequenz im Anschluß an den Ala-Rest an Position -10 von einer Signalpeptidase gespalten wird. Verarbeitung des reifen Proteins bringt zusätzliche proteolytische Spaltung im Anschluß an Rest -1, um das aminoterminale Propeptid zu entfernen, und an den Resten 155 bis 157, um das Lys- Arg-Dipeptid zu entfernen, das die leichte und die schwere Kette verbindet, mit sich. Diese letzte Verarbeitung liefert eine leichte Kette von 155 Aminosäuren und eine schwere Kette von 262 Aminosäuren.
Das Protein-C-Gen ist zusammengesetzt aus 8 Exons, die in der Größe im Bereich von 25 bis 885 Nukleotiden liegen, und 7 Introns, die in der Größe im Bereich von 92 bis 2668 Nukleotiden liegen. Exon I und ein Abschnitt von Exon II kodieren für das 42 Aminosäuren lange Präpropeptid. Der restliche Abschnitt von Exon II, Exon III, Exon IV, Exon V und ein Abschnitt von Exon VI kodieren für die leichte Kette von Protein C. Der restliche Abschnitt von Exon VI, Exon VII und Exon VIII kodieren für die schwere Kette von Protein C. Die Aminosäure- und DNA-Sequenzen für eine cDNA, die für menschliches Protein C kodiert, sind in Figur 2 dargestellt.
Die Stellen der Introns im Gen für Protein C liegen primär zwischen verschiedenen funktionellen Domänen. Exon II überspannt die hochkonservierte Region des Präpropeptids und die Gamma-Carboxyglutaminsäure (Gal) -Domäne. Exon III schließt eine Strecke von 8 Aminosäuren ein, die die Gla- und Wachstumsfaktor-Domänen verbindet. Die Exons IV und V repräsentieren jede eine potentielle Wachstumsfaktor-Domäne, während Exon VI eine Verbindungsregion überdeckt, die das Aktivierungspeptid einschließt. Die Exons VII und VIII decken die katalytische Domäne ab, die für alle Serin-Proteasen typisch ist.
Die Aminosäuresequenz und provisorische Struktur für menschliches Präproprotein C sind in Figur 5 dargestellt. Protein ist ohne das Lys-Arg-Dipeptid dargestellt, welches die leichte und die schwere Kette verbindet. Die Anordnung der 7 Introns (A bis G) ist durch Vollbalken angegeben. Aminosäuren, die bekannte proteolytische Schnittstellen flankieren, sind eingekreist. bezeichnet potentielle Kohlehydrat-Bindungsstellen. Die erste Aminosäure in der leichten Kette, im Aktivierungspeptid und in der schweren Kette beginnt mit Nr. 1. Diese Numerierung unterscheidet sich von der in den Figuren 2 und 4 dargestellten.
Kohlehydrat-Bindungen sind an Rest 97 in der leichten Kette und an den Resten 79, 144 und 160 in der schweren Kette angeordnet, gemäß dem Numerierungsschema von Figur 5. Die Kohlehydrateinheit ist kovalent mit Asn verknüpft. In der Mehrheit der Fälle kann die Kohlehydrat -Bindungsumgebung dargestellt werden durch Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr, wobei X = jede Aminosäure.
Wie oben angegeben, spielt Protein C eine regulatorische Rolle im Gerinnungsprozeß. Die katalytische Domäne, kodiert von den Exons VII und VIII, besitzt Serin-Protease-Aktivität, die bestimmte Plasmaproteine (d.h. die Faktoren Va und VIIIa) spezifisch spaltet, was zu ihrer Aktivierung oder Desaktivierung führt. Als ein Ergebnis dieser selektiven Proteolyse zeigt Protein C gerinnungshemmende und fibrinolytische Aktivitäten.
Wegen des Vorhandenseins dazwischenliegender Sequenzen im Genomklon ist das reine Verknüpfen der Genom- und cDNA-Sequenzen, um eine vollständige Kodierungssequenz zur Verfügung zu stellen, nicht ausreichend, um eine annehmbare Expressionseinheit zu konstruieren. Es ist daher notwendig, diese dazwischenliegenden Sequenzen aus Gründen, die unten vollständiger beschrieben werden, zu deletieren, wenn ein Genomklon verwendet wird, um die Expressionsheit zu konstruieren.
Die 5'-Kodierungsregion kann auch mit alternativen Verfahren erhalten werden und diminiert folglich die Notwendigkeit, dazwischenliegende Sequenzen zu deletieren. Die 5'-Kodierungsregion kann erhalten werden durch Verwendung von Sonden, die von den existierenden cDNA- oder Genom-Klonen abgeleitet sind, um zusätzliche Bibliotheken zu sondieren. Mit diesem Verfahren wurde eine Vollängen-cDNA isoliert. Außerdem sind die aminoterminalen Abschnitte der Vitamin-K-abhängigen Plasmaproteine verantwortlich für ihre entsprechenden Calcium-bindenden Aktivitäten. Es ist festgestellt worden, daß, als ein Ergebnis dieser funktionellen Homologie, die Calcium-bindenden Domänen dieser Moleküle ausgetauscht werden können und immer noch die für die katalytische Domäne des resultierenden Moleküls spezifische Aktivität beibehalten. Zum Beispiel kann der aminoterminale Abschnitt (Calcium-bindende Domäne) von Faktor IX, wie in US-Patentanmeldung Serial No. 724,311, eingereicht 17. April 1985, beschrieben, mit Faktor VII an Aminosäure 36 verknüpft werden, um ein Protein herzustellen, das die Aktivität von Faktor VII besitzt. Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin und Protein S teilen diese aminoterminale Sequenzhomologie mit Protein C. Folglich könnte eine klonierte Sequenz, die die 5'-Kodierungsregion des Gens für irgendeines dieser Proteine umfaßt, für die entsprechende Sequenz des Protein-C- Gens substituiert werden. Zusätzlich können geeignete Kodierungssequenzen auf der Grundlage bekannter Aminosäuresequenzen von mehreren der Vitamin-K-abhängigen Plasmaproteine oder der Sequenz der hierin offenbarten Genom-Protein-C-Exons synthetisiert werden. Techniken zur Herstellung synthetischer Nukleotidsequenzen sind auf diesem Gebiet gut bekannt. Zum Beispiel kann ein Satz überlappender Oligonukleotide synthetisiert und in Paaren aneliert werden, um doppelsträngige Fragmente mit überlappenden kohäsiven Termini zu liefern. Diese Fragmente werden dann ligiert, wie dies irgendwelche Restriktionsfragmente würden. Das resultierende synthetische Fragment wird dann an die cDNA an einer geeigneten Restriktionsstelle ligiert. Die Verknüpfungssequenz kann, wie erforderlich, durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese modifiziert werden.
Wenn Klone, die die gesamte Kodierungssequenz repräsentieren, erhalten worden sind, können die geeigneten Regionen, wie erforderlich, verknüpft werden, um die gewünschte Kodierungssequenz zu erzeugen. Fragmente, die aus einer oder mehreren Bibliotheken erhalten werden, werden mit geeigneten Restriktionsendonukleasen geschnitten und in der richtigen Orientierung enzymatisch miteinander verknüpft. Abhängig von den Fragmenten und den ausgewählten besonderen Restriktionsendonukleasen kann es notwendig sein, unerwünschte DNA- Sequenzen durch ein "loop out"-Verfahren zur Deletionsmutagenese oder durch eine Kombination von Restriktionsendonukleasespaltung und Mutagenese zu entfernen. Die so erhaltene Sequenz sollte vorzugsweise in der Form eines kontinuierlichen offenen Leserahmens vorliegen, d.h., daß ihr die dazwischenliegenden Sequenzen (Introns) fehlen, die im allgemeinen in höheren eukaryontischen Genen angetroffen werden. Das Vorhandensein von Introns in klonierten Genen kann zu abweichendem Spleißen von Boten-RNA und/oder verringerter Effizienz der Genexpression oder Instabilität bei Amplifikation, wenn die Gensequenz in eine Säugetier-Wirtszelle eingeführt wird, führen. Es ist bevorzugt, daß diese Kodierungssequenz außerdem ein Präpropeptid kodiert, um richtige Verarbeitung und Sekretion des Proteins zu erleichtern. Das Präpropeptid kann dasjenige von Protein oder einem anderen sekretierten Protein, wie etwa Faktor IX, Faktor VII oder Prothrombin, sein.
Es ist jedoch wünschenswert, direkt aktives Protein herzustellen, wodurch die Notwendigkeit beseitigt wird, das Proteinprodukt entweder in vitro oder in vivo zu aktivieren. Die Spaltungsstellen, die bei der Maturierung und Aktivierung von Protein C betroffen sind, sind bekannt (Foster und Davis, aaO). Eine Sequenz, die APC kodiert, kann konstruiert werden, indem die Region, die das Aktivierungspeptid kodiert, durch Oligonukleotid-gerichtete Deletionsmutagenese deletiert wird. Das resultierende Protein wird dann durch proteolytische Verarbeitung im Sekretionspfad aktiviert werden.
Die Kodierungssequenz für aktiviertes Protein C wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, der seinerseits verwendet wird, um eine Säugetier-Zellinie zu transfizieren. Expressionsvektoren zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden einen Promotor umfassen, der in der Lage ist, die Transkription eines fremden Gens, das in eine Säugetierzelle eingeführt wird, zu steuern. Virale Promotoren sind wegen ihrer Effizienz in der Steuerung der Transkription bevorzugt. Ein besonders bevorzugter Promotor ist der Major-Late-Promotor aus Adenovirus 2. Solche Expressionsvektoren werden vorzugsweise auch einen Satz von RNA- Spleißstellen enthalten, die stromabwärts vom Promotor und stromaufwärts von der Insertionsstelle für die Protein-C-Sequenz oder innerhalb der Protein-C-Sequenz selbst angeordnet sind. Bevorzugte RNA-Spleißstellen können aus Adenovirus- und/oder Immunglobulin-Genen erhalten werden. Ebenfalls enthalten in den Expressionsvektoren ist ein Polyadenylierungssignal, das stromabwärts der Insertionsstelle angeordnet ist. Virale Polyadenylierungssignale sind besonders bevorzugt, wie etwa das frühe oder späte Polyadenylierungssignal aus SV40 oder das Polyadenylierungssignal aus der Adenovirus-5-EIb-Region. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Expressionsvektor auch eine nicht-kodierende virale Leader-Sequenz, wie etwa den Adenovirus-2-Tripartite-Leader, der zwischen dem Promotor und den RNA-Spleißstellen angeordnet ist. Bevorzugte Vektoren können auch Verstärkersequenzen einschließen, wie etwa den SV40-Verstärker und die Sequenzen, die die Adenovirus-VA-RNAs kodieren.
Klonierte Gensequenzen können dann in kultivierte Säugetierzellen durch zum Beispiel Calciumphosphat-mediatisierte Transfektion eingeführt werden (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Ein Niederschlag wird aus der DNA und Calciumphosphat gebildet und dieser Niederschlag wird auf die Zellen aufgebracht. Einige der Zellen nehmen die DNA auf und behalten sie für mehrere Tage im Inneren der Zelle. Eine kleine Fraktion dieser Zellen (typischerweise 10&supmin;&sup4;) integriert die DNA in das Genom. Um diese Integranten zu identifizieren, wird im allgemeinen ein Gen, das einen selektierbaren pHänotyp verleiht (ein selektierbarer Marker), zusammen mit dem interessierenden Gen in die Zellen eingeführt. Bevorzugte selektionierbare Marker schließen Gene ein, die Resistenz gegen Arzneimittel, wie etwa Neomycin, Hygromycm und Methotrexat, verleihen. Selektionierbare Marker können in die Zelle auf einem separaten Plasmid zur selben Zeit wie das interessierende Gen eingeführt werden oder sie können auf demselben Plasmid eingeführt werden. Wenn auf demselben Gen, können der selektionierbare Marker und das interessierende Gen unter der Kontrolle verschiedener Promotoren oder desselben Promotors stehen. In einer Ausführungsform ist der selektionierbare Marker auf demselben Plasmid so mit der Protein kodierenden Sequenz angeordnet, daß beide Sequenzen vom selben Promotor kontrolliert werden, eine Anordnung, die als eine dicistronische Botschaft bekannt ist. Konstrukte dieser Art sind in der Technik bekannt (z.B. europaische Patentveröffentlichung 117,058). Es kann auch vorteilhaft sein, zusätzliche DNA, bekannt als "Träger-DNA", zu der Mischung, die in die Zellen eingeführt wird, zuzuset-zen. Nachdem die Zellen die DNA aufgenommen haben, läßt man sie für einen Zeitraum, typischerweise 1-2 Tage, wachsen um die Expression des interessierenden Gens zu beginnen. Arznei-mittelselektion wird dann angewendet, um auf das Wachstum von Zellen zu selektionieren, die den selektionierbaren Marker in einer stabilen Weise exprimieren. Klone solcher Zellen können auf Expression von Protein C gescreent werden.
Die Kopienzahl der integrierten Gensequenz kann durch Amplifikation unter Verwendung bestimmter selektionierbarer Marker (z.B. Dihydrofolat-Reduktase, die Resistenz gegen Methotrexat verleiht) erhöht werden. Der selektionierbare Marker wird in die Zellen zusammen mit dem interessierenden Gen eingeführt, und Arzneimittelselektion wird angewendet. Die Arzneimittelkonzentration wird dann schrittweise erhöht, mit Selektion resistenter Zellen in jedem Schritt. Durch Selektionieren auf erhöhte Kopienzahl klonierter Sequenzen können die Expressionsniveaus des kodierten Proteins beträchtlich erhöht werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestelltes Protein C kann mit einer Modifikation des Verfahrens von Kisiel und Davie (aaO) gereinigt werden. Protein C enthaltendes Medium wird mit Natriumcitrat und Bariumchlorid vermischt und der Niederschlag gesammelt. Der Niederschlag wird gewaschen, erneut gelöst und erneut mit Ammoniumsulfat ausgefällt, dann in Natriumphosphat- Benzamidin gelöst, dialysiert und auf eine DEAE-Sephadex-A-50- Säule aufgebracht. Der Protein C enthaltende Peak, der auch Prothrombin enthält, wird weiter mit Affinitätschromatographie auf Heparin-Agarose (Comp und Esmon, Blood 54:1272,1979) oder mit Immunadsorption gereinigt.
Um die Beispiele, die folgen, zusammenzufassen, beschreibt Beispiel 1 die Klonierung von DNA-Sequenzen, die menschliches Protein C kodieren. Beispiel 2 beschreibt die Konstruktion einer Vollängen-Kodierungssequenz für Protein C aus den in Beispiel 1 isolierten Sequenzen. Beispiel 3 beschreibt die Konstruktion von Expressionsvektoren für die Protein-C-DNA. Beispiel 4 beschreibt die Herstellung von Protein C unter Verwendung transfizierter Säugetierzellen. Beispiel 5 beschreibt eine Vollängen-cDNA, die Protein C kodiert, und ihre Expression in transfizierten Säugetierzellen. Diese Beispiele sind, obgleich nicht direkt Beispiele für die beanspruchte Erfindung, eine nützliche Leitlinie für die praktische Umsetzung der beanspruchten Erfindung.

BEISPIELE

Restriktionsendonukelasen und andere DNA-Modifikationsenzyme (z.B. T&sub4;-Polynukleotid-Kinase, alkalische Phosphatase vom Kalb, Klenow-DNA-Polymerase, T&sub4;-Polynukleotid-Ligase) wurden erhalten von Bethesda Research Laboratories (BRL) und New England Biolabs und werden verwendet, wie vom Hersteller angegeben, sofern nicht anders vermerkt.
Oligonukleotide können auf einem DNA-Synthesizer Applied Biosystems Model 380 A synthetisiert und mit Polyacrylamidgel- Elektrophorese auf denaturierenden Gelen gereinigt werden. E. coli-Zellen können transformiert werden, wie von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben. M13- und pUC-Klonierungsvektoren und Wirtsstämme wurden erhalten von BRL.

Beispiel 1

Klonierung von DNA-Sequenzen, die menschliches Protein C kodieren

Eine cDNA-Kodierung für einen Abschnitt von menschlichem Protein C wurde hergestellt, wie von Foster & Davie (aaO) beschrieben. Kurz gesagt, wurde eine λgt11-cDNA-Bibliothek aus menschlicher Leber-mRNA mit herkömmlichen Methoden hergestellt. Klone wurden unter Verwendung von mit ¹²&sup5;I markiertem, affinitätsgereinigten Antikörper gegen menschliches Protein gescreent und aus positiven Klonen wurden Phagen mit der Plattenlysatmethode (Maniatis et al., aaO), gefolgt durch Banden auf einem Cäsiumchlorid-Gradienten, hergestellt. Die cDNA-Inserts wurden unter Verwendung von Eco RI entfernt und in Plasmid pUC9 subkloniert (Vieira und Messing, Gene 19:259-268, 1982). Restriktionsfragmente wurden in die Phagenvektoren M13mp10 und m13mp11 (Messing, Meth. in Enzymology 101:20-77, 1983) subkloniert und mit der Didesoxymethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977) sequenziert. Ein Klon wurde selektioniert, der DNA enthielt, die der bekannten Sequenz von menschlichem Protein C (Kisiel, aaO) entsprach, und Protein C, beginnend bei Aminosäure 64 der leichten Kette und sich durch die schwere Kette und in die 3' nicht-kodierende Region erstreckend, kodierte. Dieser Klon wurde mit λHC1375 bezeichnet. Ein zweiter cDNA-Klon, der für Protein C von Aminosäure 24 an kodierte, wurde identifiziert. Das Insert aus diesem Klon wurde in pUC9 subkloniert und das Plasmid mit pHCλ6L bezeichnet (Figur 1). Dieser Klon kodiert einen Hauptabschnitt von Protein C, einschließlich der Kodierungsregion für die schwere Kette, des Terminationscodons und der 3' nicht-kodierenden Region.
Das cDNA-Insert aus λHC1375 wurde unter Verwendung von α-³²P- dNTPs nick-transliert und verwendet, um eine menschliche Genombibliothek in Phage λ Charon 4A (Maniatis et al., Cell 15:687-702, 1978) unter Verwendung des Plaque-Hybridisierungsverfahrens von Benton und Davis (Science 196:181-182, 1977)1 wie modifiziert von Woo (Meth. in Enzymology 68:381-395, 1979), zu sondieren. Positive Klone wurden isoliert und Plaque-gereinigt (Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4673-4677, 1985, hierin durch Bezugnahme mit einbezogen) Phagen-DNA, die aus positiven Klonen hergestellt war (Silhavy et al., in Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984), wurde mit Eco RI oder Bgl II verdaut und die Genom-Inserts wurden gereinigt und in pUC9 subkloniert. Insert-Restriktionsfragmente wurden in M13-Vektoren subkloniert und sequenziert, um ihre Identität zu bestatigen und die DNA-Sequenz des gesamten Gens festzustellen.
Das cDNA-Insert von pHCλ6L wurde nick-transliert und verwendet, um die Phage-λ-Charon 4A-Bibliothek zu sondieren. Ein Genomklon wurde identifiziert, der an Sonden hybridisierte, die hergestellt waren aus den 5'- und 3'-Enden der cDNA. Dieser Phagenklon wurde mit Eco RI verdaut und ein 4,4 kb Fragment, entsprechend dem 5'-Ende des Protein-C-Gens, wurde in pUC9 subkioniert. Das resultierende rekombinante Plasmid wurde mit pHCR4.4 bezeichnet. Vollständige DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß das Insert in pHCR4.4 zwei Exons mit 70 und 167 Basenpaaren umfaßte, getrennt durch ein Intron von 1263 bp. Das erste Exon kodiert Aminosäuren -42 bis -19; das zweite kodiert Aminosäuren -19 bis 37. Sequenzanalyse bestätigte die DNA-Sequenz des gesamten Protein-C-Gens.
Wie oben angemerkt, ist es notwendig, das Intron zu entfernen, um zur Konstruktion einer annehmbaren Kodierungssequenz zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung einen Genomklon zu verwenden.

Beispiel 2

Konstruktion einer Vollängen-Kodierungsseguenz für Protein C

Eine Vollängen-Kodierungssequenz für Protein C, einschließlich des Präpropeptids, wird konstruiert, indem die geeigneten Fragmente der cDNA- und Genomklone verknüpft werden. Dies wird erreicht durch Entfernen des Introns aus dem Genomklon (pHCR4.4) und Verknüpfen der fusionierten Exons mit der cDNA (aus pHCλ6L) an geeigneten Restriktionsstellen. Die gewünschte Genom:cDNA-Verknüpfung wird dann durch "looping out" unerwünschter Sequenzen durch Oligonukleotid-gerichtete Deletionsmutagenese erzeugt.
Plasmid pHCλ6L enthält die partielle Protein-C-cDNA, kloniert in der Eco RI-Stelle von pUC9 (Figur 1). Das cDNA-Insert wird in zwei Fragmenten subkloniert, um es zur Verknüpfung mit der 5'-sten Kodierungsregion aus dem Genomklon herzustellen. Plasmid pHCλ6l wird mit Eco RI und Sal I verdaut und die Reaktionsmischung wird dann mit Phenol und CHCl&sub3; extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die resultierenden DNA-Fragmente werden in Ligationspuffer resuspendiert und T&sub4;-DNA-Ligase wird zugegeben. Die Ligationsmischung wird bei 15ºC für 14 Stunden inkubiert. Ein aliquoter Teil der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli JM83 zu transformieren, und die Zellen werden auf LB- Agar, der X-gal enthält, plattiert. Weiße Kolonien werden selektiert und Plasmid-DNA wird hergestellt. Die DNA wird durch Restriktionsenzymverdauung analysiert, um Klone zu identifizieren, die den 3'-Abschnitt der cDNA (ca. 1450 bp Insert) und den 5'-Abschnitt der cDNA (ca. 65 bp Insert) enthalten. Diese Klone werden mit p9C3' bzw. p9C5' bezeichnet (Figur 6).
Die 5'-Kodierungsregion, die von der cDNA fehlt, ist enthalten in den Exons I und II des Genomklons pHCR4.4. Dieses Plasmid enthält ein Insert mit ungefähr 4400 Basenpaaren und endet an seinem 3'-Ende an einer Eco RI-Stelle, angeordnet in Intron B.
Um die Kodierungssequenzen aus pHCR4.4 zu entfernen, wird das Plasmid mit Pst I und Eco RI verdaut und die resultierenden Fragmente werden durch Elektrophorese in einem Agarosegel getrennt. Das ca. 2540 bp Fragment, das die Exons I und II enthält, wird aus dem Gel isoliert und mit CTAB extrahiert (Langridge, et al., Analyt. Biochem. 103:264, 1980). Dieses Fragment, bezeichnet mit 5'P-R, wird in pUC9 subkioniert, um Plasmid p5'P-R herzustellen (Figur 7).
Das Intron in p5'P-R (bezeichnet als Intron A) wird in einem Zweistufenverfahren entfernt (Figur 7). Das Plasmid wird mit Apa I verdaut, das an einer einzigen Stelle im Intron schneidet und 3' überstehende Enden zurückläßt. Das linearisierte Plasmid wird dann mit Bal 31-Exonuklease oder T&sub4;-Polymerase behandelt, um ungefähr 400 bp von jedem Ende zu entfernen, und die resultierenden Fragmentenden werden mit S1-Nuklease stumpf gemacht. Das linearisierte Plasmid wird mit Ligase rezirkularisiert und verwendet, um E. coli JM83 zu transformieren. Plasmid-DNA wird extrahiert und auf das Vorhandensein der Sma I- und Sst I-Restriktionsstellen in Intron A analysiert, und ein Plasmid mit einem Sma I-Sst I-Fragment, reduziert auf 300-400 bp, wird ausgewählt und mit p5'PΔaR bezeichnet.
Der Rest von Intron A wird durch Oligonukleotid-gerichtete Deletionsmutagenese entfernt, im wesentlichen beschrieben wie von Zoller und Smith (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983) für die Zwei-Primer-Methode. p5'PΔaR wird mit Pst I und Eco RI verdaut und das Protein-C-Fragment wird in mit Pst I + Eco RI verdauten M13mp9 subkloniert. Plusstrang-Phagen-DNA wird als Matrize hergestellt und zu Oligonukleotid mut-1 aneliert (Tabelle 1). Dieses mutagene Oligonukleotid umfaßt Sequenzen, die zu den Exon I- und II-Sequenzen, die verknüpft werden sollen, komplementar sind. Der universelle M13-Sequenzierungsprimer wird 3' zu mut-1 auf derselben Matrize aneliert. Die Primer werden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Nukleosidtriphosphaten in der Gegenwart von T&sub4;-Ligase extendiert. Die resultierenden Duplex-DNA-Kreise werden in E. coli JM103 transformiert und die resultierenden Plaques unter stringenten Hybridisierungsbedingungen unter Verwendung des mit ³²P markierten mutagenen Oligonukleotids als Sonde gescreent. DNA aus positiven Plaques wird isoliert und unter Verwendung von Oligonukleotid-Primer-1 (Tabelle 1) sequenziert, der in Exon II startet, was die Bestimmung der DNA-Sequenz über die Deletionsverknüpfung hinweg ermöglicht. Ein Molekül mit der richtigen Inframe-Fusion von Exons I und II wird ausgewählt. Das PstI-EcoRI-Fragment wird aus der M13-Replikativform durch Restriktionsendonukleaseverdauung und Agarosegel-Elektrophorese isoliert und wird in pUC9 subkloniert, um Plasmid p5'I-II herzustellen (Figur 7).
Bezugnehmend auf Figur 8, wird, um die 5'-Kodierungsregion an die cDNA anzuhängen, das ca. 1277 bp PstI-EcoRI-Fragment von p5'I-II aus einem Pst I + Eco RI-Verdauungsprodukt des Plasmids isoliert und mit Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Das 65 bp 5'-ste cDNA-Fragment wird aus einem Sal I + Eco RI-Verdauungsprodukt von p9C5' isoliert und durch Elektrophorese auf einem Acrylamidgel gereinigt. Die zwei Fragmente werden an ihren Eco RI-Termini ligiert und das resultierende ca. 1330 bp Pst I-Sal I-Fragment wird in mit Pst I + Sal I verdauten M13mp9 subkioniert (Figur 8). Plusstrang-Phagen-DNA wird als Matrize für Oligonukleotid-gerichtete Deletionsmutagenese hergestellt. Oligonukleotid mut-2 (Tabelle 1) wird zur Matrize aneliert und Oligonukleotid mut-3 (Tabelle 1) wird stromaufwärts als zweiter Primer aneliert. Die Primer werden extendiert, wie oben beschrieben. Oligonukleotid mut-2 lenkt die Fusion von Exon 1-Sequenzen, die Aminosäuren 23-26 kodieren, an die cDNA an Codon 27. Der zweite Primer (mut-3) führt eine Eco RI-Stelle 35 bp stromaufwärts vom Translationsstart ein. Die resultierende Phage wird auf die Abwesenheit von Nco I- und Xho I-Stellen und auf das Vorhandensein der eingeführten Eco RI-Stelle gescreent. Phagen-DNA, die das gewünschte Restriktionsmuster zeigt, wird unter Verwendung von Primer-2 (Tabelle 1) sequenziert, um das Vorhandensein der richtigen Verknüpfung zwischen Exon II und der cDNA zu verifizieren. Phagen-DNA mit der richtigen Sequenz wird ausgewählt und das PstI-SalI-Fragment, das die 5'-Kodierungsregion umfaßt, wird aus der Replikativform der rekombinanten M13-Phage isoliert. Das Fragment wird mit Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und in mit Pst I + Sal I verdauten pUC9 inseriert, um Plasmid pCU5' end herzustellen.
Bezugnehmend auf Figur 9, wird Plasmid pC5' end mit Eco RI und Sal I verdaut und das 5'-Protein-C-Fragment wird mit Agarosegel-Elektrophorese und Extraktion mit CTAB gereinigt. Der Rest der cDNA wird als ein Sali-EcoRI-Fragment aus p9C3' isoliert. Die zwei Fragmente werden in einer Dreistückligation mit EcoRI verdautem pUC9 verknüpft. Die Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli JM83 zu transformieren, die Zellen werden auf LB + X-gal plattiert und Plasmid-DNA wird aus weißen Kolonien isoliert. Das resultierende Plasmid wird mit pMMC bezeichnet. Es enthält die vollständige Kodierungssequenz für menschliches Protein C auf einem ca. 1500 bp Eco RI-Fragment. Tabelle 1

Beispiel 3

Konstruktion von Expressionsvektoren für Protein C

Das Protein C-kodierende Insert wird aus pMMC als ein Eco RI- Fragment entfernt und in einen geeigneten Saugetierzell-Expressionsvektor inseriert. Ein beispielhafter Vektor ist pD7, der den SV40-Verstärker und den Adenovirus-2-Major-Late-Promotor und -Tripartite-Leader umfaßt.
Plasmid pD7 wird erzeugt aus Plasmid pDHFRIII (Berkner und Sharp, Nuc. Acids. Res. 13:841-857, 1985). Die Pst I-Stelle unmittelbar stromaufwärts von der DHFR-Sequenz in pDHFRIII wurde in eine Bcl I-Stelle umgewandelt, indem 10 µg Plasmid mit 5 Einheiten Pst I für 10' bei 37ºC in 100 µl Puffer A (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl&sub2;, 6 mM NaCl, 7mm β-MSH) verdaut wurden. Die DNA wurde phenolextrahiert, EtOH-gefällt und in 40 µl Puffer B (50 mM Tris pH 8, 7 mM MgCl&sub2;, 7 mM β-MSH) der 10 mM dCTP und 16 Einheiten T&sub4;-DNA-Polymerase enthielt resuspendiert, und bei 12ºC für 60 Minuten inkubiert. Im Anschluß an EtOH- Ausfällung wurde die DNA an 2,5 µg kinasierte Bcl I-Linker in 14 µl Puffer C (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 1,4 mM ATP), der 400 Einheiten T&sub4;-Polynukleotid-Ligase enthielt, für 12 Stunden bei 12ºC ligiert. Im Anschluß an Phenolextraktion und EtOH-Ausfällung wurde die DNA in 120 µl Puffer D (75 mM KCl, 6 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT) resuspendiert, mit 80 Einheiten Bcl I für 60 Minuten bei 50ºC verdaut, dann durch Agarose elektrophoresiert. Form-III-Plasmid-DNA (10 µg) wurde aus dem Gel isoliert und in 10 µl Puffer C, der 50 Einheiten T&sub4;-Polynukleotid-Ligase enthielt, für 2 Stunden bei 12ºC ligiert und verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren. Positive Kolonien wurden durch Schnell-DNA-Präparationsanalyse identifiziert und Plasmid-DNA (bezeichnet als pDHFR'), hergestellt aus positiven Kolonien, wurde in dAM&supmin;-E. coli transformiert.
Plasmid pD2' wurde dann erzeugt, indem pDHFR' (15 µg) und pSV40 (der mit Bam HI verdaute SV40-DNA umfaßt, kloniert in die Bam HI-Stelle von pML-1) (25 µg) in 100 µl Puffer D mit 25 Einheiten Bcl I für 60 Minuten bei 50ºC gespalten wurden, gefolgt von der Zugabe von 50 Einheiten Bam HI und zusätzlicher Inkubation bei 37ºC für 60 Minuten. DNA-Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese aufgelöst und das 4,9 kb pDHFR'- Fragment und 0,2 kb SV40-Fragment wurden isoliert. Diese Fragmente (200 ng pDHFR'-DNA und 100 ng SV40-DNA) wurden in 10 µl Puffer C, der 100 Einheiten T&sub4;-Polynukleotid-Ligase enthielt, für 4 Stunden bei 12ºC inkubiert und das resultierende Konstrukt (pD2') wurde verwendet, um E. coli RRI zu transformieren.
Plasmid pD2' wurde modifiziert, indem die "Gift"-Sequenzen in der pBR 322-Region deletiert wurden (Lusky und Botchan, Nature 293:79-81, 1981). Plasmide pD2' (6,6 µg) und pML-1 (Lusky und Botchan, aaO) (4 µg) wurden in 50 µl Puffer A mit jeweils 10 Einheiten Eco RI und Nru I für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, gefolgt von Agarosegel-Elektrophorese. Das 1,7 kb pD2'-Fragment und 1,8 kb pML-1-Fragment wurden isoliert und zusammen (jeweils 50 ng) in 20 µl Puffer C, der 100 Einheiten T&sub4;-Polynukleotid-Ligase enthielt, für 2 Stunden bei 12ºC ligiert, gefolgt von Transformation in E. coli HB101. Kolonien, die das gewünschte Konstrukt (bezeichnet als pD2) enthielten, wurden durch Schnellpäparationsanalyse identifiziert. 10 µg pD2 wurden dann mit jeweils 20 Einheiten Eco RI und Bgl II verdaut, in 50 µl Puffer A für 2 Stunden bei 37ºC. Die DNA wurde durch Agarose elektrophoresiert und das gewünschte 2,8 kb Fragment (Fragment C), das die pBR322-, 3'-Spleißstellen- und Poly A- Sequenzen umfaßte, wurde isoliert.
Um die zur Konstruktion von pD3 verwendeten restlichen Fragmente zu erzeugen, wurde pDHFRIII modifiziert, um die Sac II (Sst II)-Stelle in entweder eine Hind III- oder Kpn I-Stelle umzuwandeln. 10 µg pDHFRIII wurden mit 20 Einheiten Sst II für 2 Stunden bei 37ºC verdaut, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolausfällung. Resuspendierte DNA wurde in 100 µl Puffer B, der 10 mM dCTP und 16 Einheiten T&sub4;-DNA-Polymerase enthielt, für 60 Minuten bei 12ºC inkubiert, phenolextrahiert, dialysiert und ethanolgefällt. DNA (5 µg) wurde mit 50 ng kinasierten Hind III- oder Kpn I-Linkem in 20 µl Puffer C, der 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase enthielt, für 10 Stunden bei 12ºC ligiert, phenolextrahiert und ethanolgefällt. Nach Resuspension in 50 µl Puffer A wurden die resultierenden Plasmide mit 50 Einheiten Hind III oder Kpn I, wie passend, verdaut und durch Agarose elektrophoresiert. Gel-isolierte DNA (250 ng) wurde in 30 µl Puffer C, der 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase enthielt, für 4 Stunden bei 12ºC ligiert und verwendet, um E. coli RRI zu transformieren. Die resultierenden Plasmide wurden mit pDHFRIII (Hind III) und pDHFRIII (Kpn I) bezeichnet. Ein 700 bp Kpn I - Bgl II-Fragment (Fragment A) wurde dann aus pDHFRIII (Kpn I) durch Verdauung mit Bgl II und Kpn I, gefolgt von Agarosegel-Elektrophorese, gereinigt.
Die SV40-Verstärkersequenz wurde in pDHFRIII (Hind III) wie folgt inseriert: 50 µg SV40-DNA wurden in 120 µl Puffer A mit 50 Einheiten Hind III für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert und das HindIII-C-SV40-Fragment (5089-968 bp) wurde gelgereinigt.
Plasmid pDHFRIII (Hind III) (10 µg) wurde mit 250 ng Kalbsintestinalphosphatase für 1 Stunde bei 37ºC behandelt, phenolextrahiert und ethanolgefällt. Das linearisierte Plasmid (50 ng) wurde mit 250 ng HindIII-C-SV40 in 16 µl Puffer C für 3 Stunden bei 12ºC unter Verwendung von 200 Einheiten T&sub4;-Polynukleotid-Ligase ligiert und in E. coli HB101 transformiert. Ein 700 Basenpaare langes Eco RI-Kpn 1-Fragment (Fragment B) wurde dann aus diesem Plasmid isoliert.
Für die abschließende Konstruktion von pD3 wurden die Fragmente A und B (jeweils 50 ng) mit 10 ng Fragment C mit 200 Einheiten T&sub4;-Polynukleotid-Ligase für 4 Stunden bei 12ºC ligiert, gefolgt von Transfektion von E. coli RRI. Positive Kolonien wurden durch Schnellpräparationsanalyse nachgewiesen und eine Herstellung von pD3 in großem Maßstab wurde durchgeführt.
Plasmid pD3 wird modifiziert, um die Insertion der Protein-C- Sequenz zu akzeptieren, indem die Bd I-Insertionsstelle in eine Eco RI-Stelle umgewandelt wird. Es ist zunächst erforderlich, die Eco RI-Stelle, die in pD3 am linkesten Terminus der Adenovirus-5-0-1-Map-Unit-Sequenz vorliegt, zu entfernen, indem sie über herkömmliche Linkering-Verfahren in eine Bam HI- Stelle umgewandelt wird. Kurz gesagt, das Plasmid wird mit Eco RI verdaut und die linearisierte DNA mit T&sub4;-DNA-Polymerase und allen vier Desoxynukleotidtriphosphaten behandelt, um stumpfe Termini zu erzeugen. Das Plasmid wird dann an Octonukleotide ligiert, die die Bam HI-Restriktionsstelle umfassen, die DNA mit Bam HI verdaut, um überschüssige Linker zu entfernen, und das Fragment, das die Säugetierzell-Expressionssequenzen umfaßt, wird in die Bam HI-Stelle von pML-1 kloniert. Das resultierende Plasmid wird in E. coli HB101 transformiert und Plasmid-DNA wird hergestellt und auf richtige Umwandlung gescreent. In einer ähnlichen Art und Weise wird die Bcl I-Stelle unter Verwendung geeigneter Octonukleotid-Linker in eine Eco RI-Stelle umgewandelt. Das resultierende Vektor ist bekannt als pD7. Das 1,5 kb Protein-C-EcoRI-Fragment aus pMMC wird dann in die Eco RI-Stelle von pD7 inseriert, um den Expressionsvektor pD7C herzustellen (Figur 10).
Ein Vektor, der Expression der Protein-C-Sequenz aus einer polycistronischen Botschaft ermöglicht, wird durch Verwendung von pD5 konstruiert, ein zu pD3 ähnliches Plasmid, das eine DHFR-Kodierungssequenz enthält, der der Großteil der 5' nichtkodierenden Region fehlt. Die DHFR-Sequenz wird weiter modifiziert, um ihre Bindungsaffinität an Methotrexat zu verringern.
Der Vektor pD5 wird mit einer zu der für pD3 beschriebenen analogen Methode konstruiert und unterscheidet sich von pD3 nur darin, daß eine Bam HI-Stelle die Insertionsstelle heterologer DNAs ist und daß das BclI-BamHI-SV40-Fragment, das das SV40-Polyadenylierungssignal enthält, sich in der späten Orientierung befindet.
Die DHFR-Sequenz wird modifiziert, indem zunächst pDHFRIII mit Pst I und Sst I verdaut und das 400 bp DHFR-Fragment isoliert wird. Dieses wird in einen M13-Phagenvektor subkloniert und mutagenisiert, wie beschrieben von Simonsen und Levinson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495-2499, 1983). Mutagenese führt zu einem Einzelbasenpaaraustausch in der DHFR-Sequenz. Das geänderte Fragment wird dann in pDHFRIII re-inseriert, um Plasmid pDHFRrIII herzustellen.
Die 5' nicht-kodierende Region der DHFR-Sequenz wird dann entfernt. Plasmid pDHFRrIII wird mit Fnu 4HI gespalten, welches das Plasmid an ungefähr 20 Stellen schneidet, dann mit T&sub4;-DNA- Polymerase und allen vier Desoxynukleotidtriphosphaten behandelt, um stumpfe Termini zu erzeugen. Bam HI-Linker werden an die Enden ligiert und die Mischung mit Bam HI und Nco I verdaut. Ein 0,6 kb Bam HI-Nco I-Fragment, das die DHFRr-cDNA umfaßt, wird isoliert. Plasmid pDHFR III wird mit Nco I und Bam HI verdaut und das 0,2 kb Fragment, das das SV40-Polyadenylierungssignal umfaßt, wird isoliert. Das Polyadenylierungssignal, in der frühen Orientierung, wird dann an das DHFRr-Fragment ligiert. Nach Verdauung mit Bam HI wird dann das resultierende Bam HI-Fragment in die Bam HI-Stelle von pD5 inseriert und die Ligationsmischung verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren. Plasmid-DNA wird hergestellt und durch Restriktionsendonukleaseverdauung gescreent. Ein Plasmid mit dem DHFRr-Insert in der richtigen Orientierung zur Transkription vom Ad2-Major-Late-Promotor wird mit pD5(DHFRr) bezeichnet.
Um Protein C unter Verwendung von Plasmid pD5(DHFRr) zu exprimieren, wird pMMC mit Eco RI verdaut und das 1,5 kb Protein-C- Fragment wird isoliert. Die Eco RI-Termini werden durch Linkering in Bcl I-Termini umgewandelt. Plasmid pD5 (DHFRr) wird mit Bam HI teilverdaut, um es am 5'-Ende der DHFRr-Sequenz zu spalten, und wird an das Protein-C-Fragment ligiert. Plasmid-DNA wird auf die richtige Orientierung und Insertion des Protein- C-Fragments gescreent. Der resultierende Vektor, bezeichnet mit pD5(PC-DHFRr), ist in Figur 11 veranschaulicht.

Beispiel 4

Expression von Protein C in transfizierten Säugetierzellen

Babyhamsternieren(BHK)-Zellen (American Type Culture Collection, Zugangsnummer CCL10) werden transfiziert mit pD70, im wesentlichen wie beschrieben (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; und Graham und Can der Eb, Virology 52:456, 1973). Die Zellen werden bei 37ºC, 5 % CO&sub2; in Dulbecco-Medium (plus 10 % hitzeinaktiviertes fötales Kalbsserum und ergänzt mit Glutamin und Penicillin-Streptomycin) in 60 ml Gewebskultur-Petrischalen auf eine Konfluenz von 20 % gezüchtet. Insgesamt 10 µg DNA werden verwendet, um eine 60 ml-Schale zu transfizieren: 3,75 µg pD7C, 1,25 µg pKO-neo (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet 1:327-341, 1982) und 5 µg Lachssperma-DNA. Die DNAs werden in 0,3 NaOAc, 75 % Ethanol, gefällt, gespült mit 70 % Ethanol und erneut gelöst in 20 µl 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA. Die DNA wird kombiniert mit 440 µl H&sub2;O und 500 µl 280 mM NaCl, 1,5 mM NaHPO&sub4;, 12 mM Dextrose, 50 mM HEPES pH 7,12. 60 µl 250 mM CaCl&sub2; werden tropfenweise zur obigen Mischung zugegeben und die Lösung wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen. Die Lösung wird dann zu den Zellen zugegeben und die Zellen auf 3700 für 4 Stunden zurückgebracht. Das Medium wird entfernt und 5 ml 20 % DMSO in Dulbecco mit Serum werden über 2 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben. Die Schale wird dann mit 2 Mediumwechseln schnell gewaschen und in frischem Medium über Nacht inkubiert. 24 Stunden nach Zugabe der DNA wird das Medium entfernt und selektives Medium (10 mg/ml G418, 498 u/mg, Gibco, in Dulbecco mit Serum) zugegeben. Nach ungefähr 10-13 Tagen werden einzelne Klone, die Zellen repräsentieren, die das PKO-neo-Gen eingebaut haben und somit gegen G418 resistent sind, auf Platten mit 96 Vertiefungen überführt und für Protein-Assays in Dulbecco plus 10 % fötales Kalbsserum gezüchtet.
Um auf Protein C zu testen, wird das Medium von den Zellen und Zelltrümmern durch Zentrifugation getrennt und auf Protein-C- Polypeptid und biologische Aktivität getestet. Die Zellen werden von den Platten mit Trypsin entfernt, mit frischem Medium gewaschen, zentrifugiert und bei -20ºC eingefroren. Für den Test werden die Zellpellets in PBS aufgetaut, pelletiert und in PBS, das 0,25 % TritonR X-100 enthält, resuspendiert. Proben werden verdünnt und auf Polypeptid und Aktivität getestet.
Der ELISA auf Protein C wird wie folgt durchgeführt: 200 µl Antikörper (monoklonal oder polyklonal) gegen menschliches Protein C (5 µl/ml in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3; pH 9,6) werden in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zwei Stunden bei 3700 inkubiert. Die Vertiefungen werden dann mit 220 µl 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,05 % TweenR 20 in PBS pH 7,2 für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Platten werden mit H&sub2;O gespült, luftgetrocknet und bei 4ºC gelagert. Um Proben zu testen, werden 200 µl-Proben 1 Stunde bei Raumtemperatur in den mit Antikörper beschichteten Vertiefungen inkubiert. Die Vertiefungen werden dann viermal mit 200 µl PBS, das 0,05 % TweenR 20 enthält, gespült. Die Vertiefungen werden dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 200 µl einer IgG-Fraktion von polyklonalem Kaninchen-Antiserum gegen Protein C (5 µg/ml in PBS, das 1 % BSA und 0,05 % Tween 20 enthält) inkubiert. Dem folgt Inkubation mit Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt an eine alkalische Phosphatase. Die Vertiefungen werden dann viermal mit PBS, das 0,05 % TweenR 20 enthält, gespült. Zu den Vertiefungen werden 200 µl p-Nitrophenylphosphat (30 mg), gelöst in Diethanolamin-Puffer (96 ml pro Liter) pH 9,8, der 56 mg/l MgCl&sub2; enthält, zugegeben. Die Enzymreaktion wird bei 37ºC durchgeführt und die Entwicklung einer gelben Farbe wird bei 405 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesers überwacht.
Biologische Protein-C-Aktivität wird getestet durch dessen Fähigkeit, die Kaolin-Cephalin-Gerinnungszeit von Plasma im Anschluß an seine Aktivierung durch Thrombin zu verlängern, wie von Kisiel und Davie beschrieben (Meth. in Enzvmologv 80:320- 332, 1981).

Beispiel 5

Expression einer Vollängen-cDNA die Protein C kodiert

A. Isolierung von cDNA.

Ein Genomfragment, das ein Exon enthält, das den Aminosäuren -42 bis -19 des Präpropeptids (Exon 1 in Figur 4) von Protein C entspricht, wurde isoliert, nicktransliert und als eine Sonde zum Screenen einer cDNA-Bibliothek verwendet, die mit der Technik von Gubler und Hoffman (Gene 25:263-269, 1983) unter Verwendung von mRNA aus HepG2- Zellen konstruiert worden war. Diese Zellinie wurde aus menschlichen Hepatozyten gewonnen und hatte sich schon früher als Protein C synthetisierend erwiesen (Fair und Bahnak, Blood 64: 194-204, 1984). Zehn positive Klone, die in die Eco RI- Stelle von Phage Xgtll inserierte cDNA umfaßten, wurden isoliert und mit einer Oligonukleotid-Sonde, entsprechend der 5' nicht-kodierenden Region eines Protein-C-Gens, gescreent. Ein Klon war auch mit dieser Sonde positiv und seine gesamte Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Die cDNA enthielt 70 bp 5' nicht-translierte Sequenz, die gesamte Kodierungssequenz für menschliches Präproprotein C und die gesamte 3' nicht-kodierende Region, entsprechend der zweiten Polyadenylierungsstelle (Figur 2).

B. Expressionsvektorkonstruktion.

Die Expression von Protein- C-cDNA wurde in Vektor pDX erreicht. Dieser Vektor wurde abgeleitet von pD3 (beschrieben in Beispiel 3 oben) und pD3', einem zu pD3 identischen Vektor, ausgenommen, daß das SV40-Polyadenylierungssignal (d.h. das SV40-BamHI[2533 bp]-BclI[2770 bp]-Fragment) sich in der späten Orientierung befindet. So enthält pD3' eine BamHI-Stelle als die Stelle der Geninsertion.
Um pDX zu erzeugen, wurde die Eco RI-Stelle in pD3' durch Eco RI-Spaltung, Inkubation mit S1-Nuklease und anschließende Ligation mit BclI-Linkern in eine BclI-Stelle umgewandelt. DNA wurde aus einer positiv identifizierten Kolonie hergestellt und das 1,9 kb XhoI-PstI-Fragment, das die geänderte Restriktionsstelle enthielt, wurde über Agarosegel-Elektrophorese hergestellt. In einer zweiten Modifikation wurde mit BclI geschittener pD3 mit kinasierten EcoRI-Bcli-Adaptoren (konstruiert aus Oligonukleotiden ZC525, 5'GGAATTCT3'; und ZC526, 5'GATCAGAATTCC3') ligiert, um eine EcoRI-Stelle als die Position zum Inserieren eines Gens in den Expressionsvektor zu erzeugen. Positive Kolonien wurden durch Restriktionsendonukleaseanalyse identifiziert und DNA daraus wurde verwendet, um ein 2,3 kb XhoI-PstI-Fragment zu isolieren, das die modifizierte Restriktionsstelle enthielt. Die zwei oben beschriebenen DNA-Fragmente wurden zusammen mit T4-DNA-Ligase inkubiert, in E. coli HB101 transformiert und positive Kolonien wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Eine Herstellung solcher DNA, bezeichnet mit pDX, wurde dann durchgeführt. Dies Plasmid enthält eine einzige EcoRI-Stelle zur Insertion fremder Gene.
Die Protein-C-cDNA wurde dann in pDX als ein EcoRI-Fragment inseriert. Rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse gescreent, um diejenigen zu identifizieren, die das Protein-C-Insert in der richtigen Orientierung im Hinblick auf die Promotor-Elemente besitzen, und Plasmid-DNA (bezeichnet mit pDX/PC) wurde aus einem richtigen Klon hergestellt (Figur 12). Weil das cDNA-Insert in pDX/PC ein ATG-Codon in der 5' nicht-kodierenden Region enthält (siehe Figur 2), wurde Deletionsmutagenese auf der cDNA vor Transfektions- und Expressionsexperimenten durchgeführt. Deletion der drei Basenpaare wurde gemäß Standardverfahren der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese durchgeführt. Der Vektor auf pDX-Basis, der die modifizierte cDNA enthielt, wurde mit p594 bezeichnet.

C. cDNA-Expression.

Plasmid p594 wurde in COS-Zellen durch Calciumphosphat-Ausfällung transfiziert. Vier Stunden später wurden frische Kulturmedien (ergänzt mit 5 µg/ml Vitamin K) zugegeben. Zu geeigneten Zeitpunkten (üblicherweise 48 oder 72 Stunden) wurden die Kulturmedien geerntet und die Zellen wurden gesammelt und lysiert.
Das in das Kulturmedium sekretierte Protein C oder die Zellextrakte wurden mit ELISA unter Verwendung desselben affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpers getestet, der bei der anfänglichen Identifizierung der cDNA-Klone verwendet wurde. Ergebnisse der Tests (Tabelle 2) zeigten, daß Protein C in den experimentellen Proben synthetisiert wurde und ohne weiteres aus den transfizierten Zellen sekretiert wurde, wobei ungefähr 90 % des Proteins C in den Kulturmedien gefunden wurden.
Um das Ausmaß der Gamma-Carboxylierung des rekombinanten Proteins zu bestimmen, wurden Proben der Kulturmedien einer Bariumcitrat-Ausfällung unterzogen, einem Verfahren, das selektiv nur gamma-carboxylierte Proteine aus Plasma ausfällt (Bajaj et al., J. Biol. Chem. 256:253-259, 1981). Über 70 % des antigenischen Materials konnte mit Bariumcitrat ausgefällt werden.
Das rekombinante Protein C wurde auf gerinnungshemmende Aktivität durch Messen seiner Fähigkeit, die Gerinnung zu verlängern, getestet. Dialysierte Medienproben wurden mit Protac (American Diagnostica) behandelt, um das Protein C zu aktivieren. Die Proben wurden dann zu einem in-vitro-Gerinnungstest (Sugo et al., J. Biol. Ohem. 260:10453, 1985) zugegeben und die Gerinnungszeit wurde gemessen. Die Aktivität des rekombinanten Materials erwies sich als im wesentlichen dieselbe wie diejenige des natürlich auftretenden Proteins C. TABELLE 2 ÜBERGANGSEXPRESSION UND SEKRETION VON PROTEIN C IN COS-ZELLEN
Aus dem Vorstehenden wird man anerkennen, daß, obgleich spezifische Ausführungsformen der Erfindung hierin zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen ausgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß ist die Erfindung ausgenommen durch die beigefügten Ansprüche nicht beschränkt.
Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in irgendeiner Kombination derselben, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.

Claims

1. Eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das bei Aktivierung durch proteolytische Verarbeitung im Sekretionsweg zu einem menschlichen aktivierten Protein C führt, wobei besagte DNA-Sequenz nicht eine Sequenz einschließt, die das in Figur 2 dargestellte Aktivierungspeptid aus zwölf Aminosäuren kodiert, wobei besagtes aktiviertes Protein C eine Aminosäuresequenz aufweist, die in Figur 2 dargestellt ist.

2. Ein rekombinanter Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Protein kodiert, das bei Aktivierung durch proteolytische Verarbeitung im Sekretionsweg zu einem menschlichen aktivierten Protein C führt, wobei besagte DNA-Sequenz nicht eine Sequenz einschließt, die das in Figur 2 dargestellte Aktivierungspeptid aus zwölf Aminosäuren kodiert, wobei besagtes aktiviertes Protein C eine Aminosäuresequenz aufweist, die in Figur 2 dargestellt ist.

3. Ein Expressionsvektor, der zur Integration in Säugetier- Wirtszell-DNA in der Lage ist, wobei besagter Expressionsvektor einen Promotor einschließt, dem stromabwärts eine Nukleotidsequenz von Anspruch 2 folgt, wobei besagter Nukleotidsequenz stromabwärts ein Polyadenylierungssignal folgt, wobei die Transkription der Nukleotidsequenz durch den Promotor gesteuert wird.

4. Ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem aktivierten Protein C, welches umfaßt:

Einführen einer Expressionseinheit, die eine Sequenz von Anspruch 1 umfaßt, die ein Protein kodiert, das bei Aktivierung durch intrazelluläre proteolytische Verarbeitung zu einem menschlichen aktivierten Protein C führt, in eine Säugetier- Wirtszelle;

Züchten besagter Säugetier-Wirtszelle in einem geeigneten Medium, das Vitamin K enthält;

und Isolieren des Proteinproduktes, das durch besagte Expressionseinheit kodiert und durch besagte Säugetier-Wirtszelle produziert wird.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, welches außerdem das Einführen, mit besagter Expressionseinheit, eines selektionierbaren Markers in die Wirtszelle umfaßt.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 4, wobei besagte Expressionseinheit auf einem Expressionsvektor enthalten ist, der zur Integration in Säugetier-Wirtszell-DNA in der Lage ist, wobei besagter Expressionsvektor einen Promotor einschließt, dem stromabwärts eine Nukleotidsequenz folgt, die menschliches aktiviertes Protein C kodiert, wobei besagter Nukleotidsequenz stromabwärts ein Polyadenylierungssignal folgt, wobei die Transkription der Nukleotidsequenz durch den Promotor gesteuert wird.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 4, wobei besagte Säugetier- Wirtszelle eine Babyhamster-Nierenzelle oder eine COS-Zelle ist.

8. Eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der Aktivität von menschlichem Protein C oder ein Protein, das bei Aktivierung durch intrazelluläre proteolytische Verarbeitung zu einem Protein mit der biologischen Aktivität eines menschlich aktivierten Proteins C führt, kodiert, wobei besagtes Protein außerdem eine aminoterminale Calciumbindungsdomäne eines Proteins umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Faktor VII, Faktor IX, Faktor X und Prothrombin besteht.

9. Säugetierzellen, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 transfiziert sind, um menschliches aktiviertes Protein C zu exprimieren.