DE60215671T2

DE60215671T2 - Verfahren zur isolierung von terpentrilactonen (ginkgoliden, bilobaliden) aus blättern und pharmazeutische pulver aus ginkgo biloba

Info

Publication number: DE60215671T2
Application number: DE60215671T
Authority: DE
Inventors: Andreas Dirk LITCHBLAU; John Oro Valley BERGER; Nina New York BEROVA; Koji New York NAKANISHI
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 2001-07-11
Filing date: 2002-07-11
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2022-07-12
Also published as: EP1416949A1; WO2003006040A1; US20050136136A1; US20040077883A1; EP1416949B1; ATE343393T1; US20030031736A1; EP1416949A4; US6844451B2; DE60215671D1; HK1065939A1; US6590109B2; CA2453467A1; KR20040031772A

Description

Hintergrund der Erfindung
Früchte und Samen von Ginkgo biloba werden bereits seit langem in der Chinesischen Volksmedizin verwendet. Die erste Erwähnung einer solchen Verwendung erschien in dem Buch von Liu Wen-Tai im Jahre 1505 in China. In den 1960-ern wurden die Strukturen der aktiven Komponenten analysiert. Etwa zur gleichen Zeit, im Jahr 1965, wurden die ersten Blattpräparate durch die Willmar Schwabe AG, Deutschland, in die moderne Medizin eingeführt. Im Jahr 1911 wurde nach einer Zusammenarbeit zwischen der Willmar Schwabe AG, Deutschland, und der Beuafour-Gruppe (IPSEN) in Frankreich der erste konzentrierte und standardisierte Extrakt EGb761 (Deutschland 1971: DE 21 174 29 C3 und Frankreich 1972: 72.12288) als Tanakan (Frankreich) und Tebonin Forte (Deutschland) herausgebracht und vermarktet. Nach der Europäischen Anwendung wurde im Jahr 1977 ein Blattextrakt in dem Medizinischen Handbuch der Republik China beschrieben. Im Laufe des nächsten Jahrzehnts haben weitere Firmen ebenfalls ähnliche Produkte auf den Markt gebracht. Heute findet man Extrakte von Ginkgo biloba-Blättern in verschiednen Arten von Produkten, wie beispielsweise Nahrungsergänzungsmitteln und Energiepillen, homöopathischen Verwendungen, Säften, Kosmetika, verschiedenen Teezubereitungen, Zigaretten, Ginkgowein oder und selbst in dem als "Memory Snack" bezeichneten Kartoffelsnack. Die biologischen Aktivitäten der Extrakte sind verschiedenartig und es ist bekannt, dass sie wirksam sind bei: Verbesserung des Kurzzeitgedächtnisses, Behandlung von zerebraler Insuffizienz und Demenz, vorteilhafte Wirkungen wie eine antiasthmatische und gegen Polyurie oder Tinitus, PAF-Inhibitor und Verbesserung des Blutflusses, Gefäßschutz und Radikalfänger.
Da der gegenwärtige Extrakt Egb761 nur zwischen 5-7 % von diesen Terpentrilactonen enthält, wird der Extrakt nur als ein Nahrungs- und Gesundheits-Ergänzungsmittel verwendet. Um den Markt für Ginkgo biloba-Produkte zu erweitern, richtet sich das Interesse auf Extrakte mit höherer Reinheit. Im Gegensatz zu der großen Anzahl an Patenten, bei denen das Extraktionsverfahren ziemlich kompliziert ist oder die Terpentrilactone nur in einer niedrigen Reinheit erhalten werden können, wird hier ein einfaches Extraktionsverfahren zum Herstellen einer Konzentration an Terpentrilactonen offenbart, die 10-fach höher ist. Es wird ein Verfahren zum Isolieren und Konzentrieren der Terpentrilactone aus Blättern des Ginkgo biloba-Baums oder aus pharmazeutischem Pulver offenbart, das in industriellem Maßstab angewandt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein Verfahren zum Isolieren von Terpentrilactonen aus Pflanzenmaterial oder einem Extrakt von Ginkgo biloba offenbart, das die Schritte umfasst: Suspendieren des Pflanzenmaterials oder Extrakts in Wasser oder einer wässrigen Lösung eines Oxidationsreagenz; Extrahieren der Terpentrilactone unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsagens; Separieren der organischen Schicht von der wässrigen Schicht; Waschen der organischen Schicht mit einer geeigneten wässrigen Salzlösung, die eine alkalische Lösung sein kann; und Trocknen der organischen Schicht, um einen getrockneten Extrakt auszubilden, der Terpentrilactone enthält. Weitere Aufarbeitung durch Umkehrphasenchromatographie der Extrakte mit polymeren Harzen reduziert das Niveau an unerwünschten Ginkgolsäuren auf Werte von kleiner als 10 ppm.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Bilobalid und Ginkgolid A, B, C, J und M.
2 Zusammenfassung des offenbarten Isolierungsverfahrens von Terpentrilactonen aus Blättern von Ginkgo biloba.
3 Eine Ausführungsform des offenbarten Isolierungsverfahrens von Terpentrilactonen aus Blättern von Ginkgo biloba. Schritt 1. kann mit einem von A, B oder C durchgeführt werden. Schritt 3. kann mit C und D durchgeführt werden und einem von A oder B. Schritt 3. kann auch mit C und D durchgeführt werden, und mit A und B.
4 Isolierung von Terpentrilactonen aus Blättern von Ginkgo biloba 0-10 % H₂O₂ und 0-5 % H₂SO₄.
5 Quantitative NMR von TTLen auf Grundlage vom 12-H-Signal (Bruker 400 MHz).
6 Optimiertes Extraktionsprotokoll für getrocknete Blätter.
7 Mengen und Verteilungsmuster von TTLen, die aus A) Bioginkgo^TM Pulver; B) getrockneten gelben Blättern; und C) getrockneten grünen Blättern gewonnen wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Isolieren von Terpentrilactonen aus Ginkgo biloba Pflanzenmaterial oder -extrakt, das die Schritte umfasst:
Suspendieren des Pflanzenmaterials oder -extrakts in Anwesenheit eines Oxidationsreagenz,
Extrahieren der Terpentrilactone unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsagens, und
Separieren der organischen Schicht von der wässrigen Schicht, um dadurch die Terpentrilactone in der organischen Schicht zu isolieren. Das Oxidationsreagenz kann in wässriger Lösung vorliegen.
Bei dem Verfahren kann die wässrige Lösung 0,1 % bis 50 % Oxidationsreagenz enthalten, bevorzugt 0,1 % bis 30 %, noch bevorzugter 1 % bis 20 %, noch mehr bevorzugt 2 % bis 15 %, am meisten bevorzugt 3 % bis 5 %. Das Oxidationsreagenz kann irgendein oxidierendes Mittel sein und kann 3-Chlorperbenzoesäure (MCPBA), MnO₂ oder Wasserstoffperoxid sein. Das Oxidationsreagenz ist bevorzugt Wasserstoffperoxid.
Bei dem Verfahren kann die wässrige Lösung weiter eine Säure enthalten. Die Menge an Säure in der wässrigen Lösung kann von etwa 0,1 % bis 15 % reichen, oder wie auf sonstige Weise erforderlich, um eine saure Umgebung zu erzeugen. Die Säure kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Essigsäure, Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure besteht.
Bei dem Verfahren kann das geeignete Extraktionsagens ausgewählt sein aus der Gruppe, die aus niedrigen Essigsäureestern, niedrigen Ketonen, niedrigen Ethern, niedrigen Alkoholen und Benzolen besteht.
Das Verfahren kann weiter wenigstens einen ersten Waschschritt umfassen, um die organische Schicht mit einer geeigneten wässrigen Salzlösung zu waschen. Die geeignete wässrige Lösung kann eine Lösung von einem Salz oder Hydroxid sein, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ammoniumchlorid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumthiosulfat, Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfid besteht. Die geeignete wässrige Salzlösung kann bevorzugt eine Lösung eines Salzes sein, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Natriumthiosulfat, Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfid besteht.
Die wässrige Salz- oder Hydroxidlösung weist bevorzugt einen pH zwischen 5 und 14 auf, bevorzugter einen pH von 7-14, oder einen pH von 6-12, noch bevorzugter einen pH von 7,5-9,5, am meisten bevorzugt einen pH von 8,3-9,3. Im Allgemeinen ist der bevorzugte pH der wässrigen Salz- oder Hydroxidlösung ein alkalischer pH, was somit eine wässrige alkalische Salz- oder Hydroxidlösung ergibt.
Die wässrige alkalische Lösung kann auch eine alkalische Hydroxidlösung sein, wie zum Beispiel eine Natriumhydroxidlösung oder eine Kaliumhydroxidlösung.
Das Verfahren kann weiter einen zweiten Waschschritt umfassen, um die organische Schicht mit einer geeigneten wässrigen Salz- oder Hydroxidlösung zu waschen. Die geeignete wässrige Salz- oder Hydroxidlösung des zweiten Waschschritts ist ausgewählt aus der Gruppe, die aus Ammoniumchlorid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumthiosulfat, Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfid besteht. Der zweite Waschschritt kann mit einer Lösung durchgeführt werden, die von der bei dem ersten Waschschritt verwendeten Lösung verschieden ist.
Das Verfahren kann weiter einen Schritt zum Zerstören von überschüssigem Oxidationsreagenz in der organischen Schicht umfassen, durch in Kontakt bringen der organischen Schicht mit einem metallhaltigen Katalysator oder einem Nichtmetallkatalysator.
Das Verfahren kann weiter einen Schritt des Trocknens der organischen Schicht umfassen, um einen Extrakt auszubilden, der Terpentrilactone enthält. Der getrocknete Extrakt enthält mehr als 50 Gew.-% Terpentrilactone, bevorzugt mehr als 55 Gew.-%, noch mehr bevorzugt mehr als 60 Gew.-%.
Das Verfahren kann weiter einen Schritt des Umkristallisierens des Terpentrilactone enthaltenden Extrakts umfassen, um Terpentrilactone in höherer Reinheit zu erhalten. Das Umkristallisieren kann mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einer geeigneten Lösungsmittelmischung durchgeführt werden.
Das Verfahren kann weiter einen Schritt des Reinigens durch Behandlung mit oder Filtration über Aktivkohle umfassen.
Das Verfahren kann weiter einen Schritt des Reinigens durch Behandlung mit oder Filtration über Tonerde, wie zum Beispiel Aluminiumoxid umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Isolieren von Terpentrilactonen aus Ginkgo biloba Pflanzenmaterial oder -extrakt, das die Schritte umfasst:
Suspendieren des Pflanzenmaterials oder -extrakts in einer wässrigen Lösung eines Oxidationsreagenz;
Extrahieren der Terpentrilactone unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsagens;
Separieren der organischen Schicht von der wässrigen Schicht;
Waschen der organischen Schicht mit einer geeigneten wässrigen Salz- oder Hydroxidlösung; und
Trocknen der organischen Schicht, um einen getrockneten Extrakt auszubilden, der Terpentrilactone enthält, um dadurch die Terpentrilactone zu isolieren.
Die Parameter dieser Ausführungsform können die sein, die oben für das vorhergehende Verfahren diskutiert wurden. Auf ähnliche Weise können bei dieser Ausführungsform irgendwelche zusätzlichen Schritte vorhanden sein, wie sie oben diskutiert wurden.
Dieses Verfahren, wie auch das vorhergehende Verfahren, können weiter einen Schritt des Erwärmens oder Kochens des suspendierten Pflanzenmaterials oder -extrakts in wässriger Lösung für eine Zeitdauer zwischen 5 Minuten und 5 Stunden umfassen.
Dieses Verfahren, wie auch das vorhergehende Verfahren, können weiter einen Schritt des Einstellens des pH des suspendierten Pflanzenmaterials oder -extrakts in wässriger Lösung auf einen Bereich von etwa pH 4 und pH 6,5 umfassen.
Noch eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Isolieren von Terpentrilactonen aus Ginkgo biloba Pflanzenmaterial oder -extrakt, das die Schritte umfasst:
Suspendieren des Pflanzenmaterials oder -extrakts in einer wässrigen Wasserstoffperoxidlösung;
Einstellen des pH des suspendierten Pflanzenmaterials oder -extrakts in wässriger Lösung auf einen pH von zwischen 4 und 6,5;
Extrahieren der Terpentrilactone unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsagens;
Trennen der organischen Schicht von der wässrigen Schicht;
Waschen der organischen Schicht mit einer wässrigen alkalischen Salz- oder Hydroxidlösung;
Trocknen der organischen Schicht, um einen getrockneten, Terpentrilactone enthaltenden Extrakt auszubilden; und
Umkristallisieren des getrockneten, Terpentrilactone enthaltenden Extrakts, um Terpentrilactone in größerer Reinheit zu erhalten,
um dadurch die Terpentrilactone zu isolieren.
Die Parameter dieser Ausführungsform können die sein, die oben für die zwei vorhergehenden Ausführungsformen diskutiert wurden. Auf ähnliche Weise können bei dieser Ausführungsform irgendwelche zusätzlichen Schritte vorhanden sein, wie sie oben diskutiert wurden.
Bei dieser Ausführungsform kann die wässrige Lösung 0,1 % bis 30 % Wasserstoffperoxid enthalten. Das Umkristallisieren kann mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einer geeigneten Lösungsmittelmischung durchgeführt werden.
Das Verfahren kann weiter einen Schritt des Reinigens durch Behandlung mit oder Filtration über Aktivkohle umfassen.
Das Verfahren kann weiter einen Schritt des Reinigens durch Behandlung mit oder Filtration über Tonerde, wie zum Beispiel Aluminiumoxid umfassen.
Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Isolieren von Terpentrilactonen aus Ginkgo biloba Pflanzenmaterial oder aus einem Extrakt, das die Schritte umfasst:
Suspendieren des Pflanzenmaterials oder -extrakts in Wasser;
Extrahieren der Terpentrilactone unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsagens;
Trennen der organischen Schicht von der wässrigen Schicht;
Waschen der organischen Schicht mit einer wässrigen alkalischen Salz- oder Hydroxidlösung;
um dadurch die Terpentrilactone in der organischen Schicht zu isolieren.
Die Parameter dieser Ausführungsform können die sein, die oben für die vorhergehenden Ausführungsformen diskutiert wurden. Auf ähnliche Weise können bei dieser Ausführungsform irgendwelche zusätzlichen Schritte vorhanden sein, wie sie oben diskutiert wurden.
Bei dieser Ausführungsform kann die Trennung mit der Zugabe von Natriumchlorid zu der Emulsion durchgeführt werden, die organische und wässrige Schichten enthält. Die wässrige alkalische Salzlösung kann auch eine Natriumsulfitlösung sein.
Die Terpentrilactone von einer der Ausführungsformen können durch weitere Aufarbeitung gereinigt werden, zum Beispiel durch Umkehrphasenchromatographie, um irgendwelche unerwünschten Ginkgolsäuren zu verringern. Zum Beispiel kann Chromatographie mit Silikagel durchgeführt werden.
Das Verfahren zum Isolieren und Konzentrieren von Terpentrilactonen (Ginkgolide A, B, C, J und Bilobalid) aus Blättern des Baums Ginkgo biloba oder aus pharmazeutischem Pulver, das durch Extraktion der Blätter von Ginkgo biloba hergestellt wurde, zum Beispiel Egb761, kann im Allgemeinen durch die folgenden Verfahren durchgeführt werden:

(A) Suspendiere die getrockneten Blätter oder das pharmazeutische Pulver 1) in Wasser oder 2) in einer wässrigen Lösung, die Wasserstoffperoxid in einem Konzentrationsbereich von 0,1-30 % enthält, oder 3) in einer wässrigen Lösung, die Wasserstoffperoxid in einem Konzentrationsbereich von 0,1-3 0 % und zusätzlich 0,1-15 % Mineralsäuren, wie beispielsweise Essig-, Salz-, Salpeter-, Phosphor- oder Schwefelsäure enthält;
(B) Rühre nur, Rühre und Erwärme, oder Rühre und Koche die Suspension von (A) für eine Zeitdauer zwischen 5 Minuten und 5 Stunden;
(C) Sofern notwendig, stelle nach dieser Behandlung den pH mit wässrigen Alkalihydroxidlösungen, wie zum Beispiel Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, auf einen Bereich von pH 4-6 ein;
(D) Extrahiere die Suspension von (B) oder (C) mit niedrigen Essigsäureestern, niedrigen Ketonen, niedrigen Ethern, niedrigen Alkoholen oder Benzolen, Trenne die organische Schicht von der wässrigen Lösung;
(E) Wasche die organische Schicht 1) mit einer wasserbasierten Lösung, wie zum Beispiel Ammoniumchlorid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat oder mit wässrigen Alkalihydroxidlösungen, wie zum Beispiel Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, oder 2) mit einer wässrigen Lösung, wie zum Beispiel Natriumthiosulfat, Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfid oder Zerstöre den Überschuss an Wasserstoffperoxid mit Metallstaub oder auf Metall beruhenden Katalysatoren, oder sowohl 1) als auch 2);
(F) Wasche die organische Schicht mit Wasser und/oder mit einer wässrigen Natriumchloridlösung;
(G) Trenne, Entwässere und Trockne die verbleibende organische Schicht, entferne Lösungsmittel und erhalte einen Extrakt, der mehr als 50 % Terpentrilactone enthält; und
(H) Kristallisiere den Extrakt von Schritt (G) mit einer Mischung aus Wasser/Methanol oder einem anderen geeigneten Lösungsmittelsystem um, um die Ginkgolide mit hoher Reinheit zu erhalten.

Die Parameter und Eigenschaften einer jeden der oben beschriebenen Ausführungsformen sind austauschbar, wenn sie aufeinander anwendbar sind, und werden daher nicht wiederholt. So kann zum Beispiel irgendein Parameter oder irgendeine Eigenschaft der ersten Ausführungsform bei den anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen angewandt werden.
EXPERIMENTELLE DETAILS
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen detailliert beschrieben. Alle Beispiele erzeugen einen Extrakt, der vor Umkristallisation zwischen 55 % und 75 % Terpentrilactone enthält. Nach Umkristallisation mit einer Wasser/Methanol-Mischung wurden die Terpentrilactone mit hoher Reinheit erhalten. Daneben, dass es zu einer höheren Reinheit und höheren Ausbeuten führt, wird das offenbarte Verfahren in einer verringerten Zeitdauer für das Extraktionsverfahren durchgeführt, was somit hilft, Energie zu sparen. Auch sind bei diesem Verfahren die Wasser- und die organische Schicht leicht zu trennen, behält das Verfahren die natürliche Verteilung der Terpentrilactonkonzentrationen bei, und ergibt eine hohe Ausbeute an Terpentrilactonen.
BEISPIEL 1
250 g getrocknete Blätter von Ginkgo biloba wurden in 2 L wässriger 5 %-iger Wasserstoffperoxidlösung suspendiert und 1 Stunde lang gekocht. Die Suspension wurde heiß durch einen Büchner-Filter ohne Filterpapier filtriert. Die verbleibenden Blattfasern wurden mit 2× 100 mL Wasser durch Vakuumfiltration gewaschen. Das Filtrat wurde dann ein erstes Mal mit 250 mL Ethylacetat extrahiert, dann ein zweites Mal mit 125 mL Ethylacetat. Die organischen Schichten wurden kombiniert, gefolgt von dem Waschverfahren. Einem ersten Waschen 3× (200 mL, 100 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung, einem Zweiten 2× (200 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumsulfitlösung und einem Dritten mit 100 mL Wasser und dann mit 100 mL Natriumchloridlösung (80 %). Nach diesem Waschverfahren wurde die organische Schicht über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Die resultierenden 830 mg Pulver enthielten 52 % durch NMR quantifiziertes Terpentrilacton. Das Verhältnis zwischen den Terpentrilactonen BB : GA : GB : GC : GJ mit 4,8 (57 %) : 1,4 (16 %) : 1,0 (12 %) : 0,9 (11 %) : 0,3 (4 %) entsprach dem natürlichen Verteilungsmuster.
BEISPIEL 2
250 g getrocknete Blätter von Ginkgo biloba wurden in 2,5 L wässriger 5 %-iger Wasserstoffperoxidlösung suspendiert und 1 Stunde lang gekocht. Die Suspension wurde heiß durch einen Büchner-Filter ohne Filterpapier filtriert. Die verbleibenden Blattfasern wurden mit 2× 100 mL Wasser durch Vakuumfiltration gewaschen. Der pH des Filtrats wurde durch Zugabe einer wässrigen 1 N Natriumhydroxidlösung auf 4,5 eingestellt. Nach dieser Behandlung wurde die wässrige Lösung ein erstes Mal mit 300 mL einer 2:1-Mischung aus Ethylacetat und Diethylether und ein zweites Mal mit 150 mL der gleichen Mischung extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert, gefolgt von dem Waschverfahren. Erstes Waschen 3× (200 mL, 100 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung, ein Zweites 2× (200 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumthiosulfatlösung und ein Drittes mit 100 mL Wasser und schließlich mit 100 mL Natriumchloridlösung (80 %). Nach diesem Waschverfahren wurde die organische Schicht über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Das resultierende Pulver enthielt 50 % durch NMR quantifizierte Terpentrilactone.
BEISPIEL 3
25 g Pulver eines pharmazeutischen Extrakts von Ginkgo biloba wurden in 500 mL 5 %-iger wässriger Wasserstoffperoxidlösung suspendiert und 1 Stunde lang gekocht. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Suspension durch einen Büchner-Filter ohne Filterpapier filtriert. Danach wurde das Filtrat ein erstes Mal mit 250 mL Ethylacetat extrahiert, dann ein zweites Mal mit 125 mL Ethylacetat. Nach dem Trennen von der Wasserschicht wurden die organischen Schichten kombiniert, gefolgt von dem Waschverfahren. Ein erstes Waschen 3× (200 mL, 100 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung, ein Zweites 2× (200 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumsulfitlösung und ein Drittes mit 100 mL Wasser und schließlich mit 100 mL Natriumchloridlösung (80 %). Nach diesem Waschverfahren wurde die organische Schicht über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Die resultierenden 3,4 g Pulver enthielten 55 % durch NMR quantifiziertes Terpentrilacton.
BEISPIEL 4
25 g Pulver eines pharmazeutischen Extrakts von Ginkgo biloba wurden in 500 mL einer wässrigen 5 %-igen Wasserstoffperoxidlösung suspendiert und 30 Minuten lang gekocht. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Suspension durch einen Büchner-Filter ohne Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde ein erstes Mal mit 250 mL Ethylacetat extrahiert, dann ein zweites Mal mit 125 mL Ethylacetat. Die organischen Schichten wurden kombiniert, gefolgt von 3× Waschen mit gesättigter wässriger Natriumsulfitlösung (200 mL, 100 mL, 50 mL), danach mit 100 mL Wasser und schließlich mit 100 mL Natriumchloridlösung (80 %). Nach diesem Waschverfahren wurde die organische Schicht über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Die resultierenden 2,8 g enthielten 60 % durch NMR quantifizierte Terpentrilactone.
BEISPIEL 5
25 g Pulver eines pharmazeutischen Extrakts von Ginkgo biloba wurden in 500 mL Wasser suspendiert und 30 Minuten lang gekocht. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde diese Suspension mit Ethylacetat extrahiert (1. Mal mit 250 mL, 2. Mal mit 50 mL). Es wurde ohne Wasserstoffperoxid eine Emulsion erhalten, aber die Schichten dieser Emulsion trennten sich langsamer als bei dem Verfahren, bei dem Wasserstoffperoxid verwendet wurde. Nach Filtration und der Zugabe von Natriumchlorid trennten sich die Schichten. Die organischen Schichten wurden kombiniert, gefolgt von 3× Waschen mit einer gesättigten wässrigen Natriumsulfitlösung (200 mL, 100 mL, 50 mL), danach Waschen mit 100 mL Wasser und schließlich mit 100 mL Natriumchloridlösung (80 %). Nach diesem Waschverfahren wurde die organische Schicht über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Die resultierenden 3,0 g Pulver enthielten 53 % durch NMR quantifiziertes Terpentrilacton.
BEISPIEL 6
25 g Pulver eines pharmazeutischen Extrakts von Ginkgo biloba wurden in 500 mL einer wässrigen 5 %-igen Wasserstoffperoxidlösung suspendiert, die zusätzlich 1 % Schwefelsäure enthielt, und wurden 15 Minuten lang gekocht. Die Suspension wurde heiß durch einen Büchner-Filter ohne Filterpapier filtriert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Filtrat ein erstes Mal mit 250 mL Ethylacetat extrahiert, dann ein zweites Mal mit 125 mL Ethylacetat. Nach dem Abtrennen von der Wasserschicht wurden die organischen Schichten kombiniert, gefolgt von dem Waschverfahren. Erstes Waschen 3× (200 mL, 100 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung, ein Zweites 2× (200 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumsulfitlösung und ein Drittes mit 100 mL Wasser und dann mit 100 mL Natriumchloridlösung (80 %). Nach diesem Waschverfahren wurde die organische Schicht über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Die resultierenden 1,9 g Pulver enthielten 70 % durch NMR quantifiziertes Terpentrilacton.
BEISPIEL 7
25 g Pulver eines pharmazeutischen Extrakts von Ginkgo biloba wurden in 500 mL einer wässrigen 5 %-igen Wasserstoffperoxidlösung suspendiert, die zusätzlich 1 % Essigsäure enthielt, und wurden 30 Minuten lang gekocht. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Suspension durch einen Büchner-Filter ohne Filterpapier geleitet. Das Filtrat wurde ein erstes Mal mit 250 mL Ethylacetat extrahiert, dann ein zweites Mal mit 125 mL Ethylacetat. Die organischen Schichten wurden kombiniert, gefolgt von dem Waschverfahren. Erstes Waschen 3× (200 mL, 100 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung, ein Zweites 2× (200 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumthiosulfitlösung. Danach Waschen mit 100 mL Wasser und dann mit 100 mL Natriumchloridlösung (80 %) zum Entfernen von Base und Salzüberschuss. Nach diesem Waschverfahren wurde die organische Schicht über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Die resultierenden 2,8 g Pulver enthielten 59 % durch NMR quantifiziertes Terpentrilacton.
BEISPIEL 8
25 g Pulver eines pharmazeutischen Extrakts von Ginkgo biloba wurden in 500 mL einer wässrigen 5 %-igen Wasserstoffperoxidlösung suspendiert und 1 Stunde lang gekocht. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Suspension durch einen Büchner-Filter ohne Filterpapier filtriert. Der pH des Filtrats wurde durch Zugabe von wässriger 1 N Natriumhydroxidlösung auf 5-6 eingestellt. Nach dieser Behandlung wurde die wässrige Lösung ein erstes Mal mit 250 mL Ethylacetat extrahiert, dann ein zweites Mal mit 125 mL Ethylacetat. Nach Abtrennen von der Wasserschicht wurden die organischen Schichten kombiniert, gefolgt von dem Waschverfahren. Erstes Waschen 3× (200 mL, 100 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung, ein Zweites 2× (200 mL, 100 mL) mit einer gesättigten wässrigen Natriumsulfitlösung und ein Drittes mit 100 mL Wasser und dann mit 100 mL Natriumchloridlösung (80 %). Nach diesem Waschverfahren wurde die organische Schicht über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Die resultierenden 2,73 g Pulver enthielten 60 % durch NMR quantifiziertes Terpentrilacton.
BEISPIEL 9
Einige Blattextrakte enthielten eine signifikante Menge an im Allgemeinen unerwünschten Ginkgolsäuren.
Ginkgolsäuren
Die Ginkgolsäuren wurden durch Umkehrphasenchromatographie entfernt (Chang, M.) Der Gehalt an den zwei in G. biloba Blättern überwiegend gefundenen Ginkgolsäuren wurde durch HPLC unter Verwendung von PDA-Nachweis gemessen; in jedem gemessenen Fall waren die jeweiligen Ginkgolsäuren in Mengen vorhanden, die niedriger waren als die Grenze des mengenmäßigen Nachweises (10 ppm).
Allgemeine experimentelle Verfahren.
¹H- und ¹³C-Spektren wurden auf einem 300 oder einem 400 MHz Bruker NMR gemessen unter Verwendung von Standardimpulsfolgen und -parametern; weitere Details sind nachfolgend beschrieben. FABMS-Daten von negativen Ionen wurden unter Verwendung eines JMS-HX110 Tandem-Massenspektrometers (JEOL, Tokyo Japan) unter Verwendung eines Xe-Strahls (6 kV) mit einer Beschleunigungsspannung von 10 kV und einer m-Nitrobenzylalkohol-Matrix (NBA=Nitrobenzylalkohol) bestimmt. Analytische HPLC-Messungen wurden auf einem Waters 996 PDA-System mit einem Millenium^TM-Softwarepaket, Version 2.15.01, durchgeführt. Konzentrationsgraphen und lineare Regression wurden mit Microsoft Excel 2000 bestimmt. Halbpräparative HPLC-Isolierungen wurden auf einem LC-908 Instrument (Japan Analytical Industry Co., Ltd.) erzielt, das mit internen Brechungsindex- und Ultraviolettdetektoren und einem Aufzeichnungsgerät ausgestattet war.
Extrahiertes Material.
Bioginkgo^TM 27/7 Marke G. biloba-Extrakt wurde großzügiger Weise von Pharmanex (Provo, UT) kostenlos zur Verfügung gestellt.
Pflanzenmaterial.
Die Blätter wurden von einem weiblichen G. biloba-Baum im Morningside Park, New York, New York gesammelt. Gelbe Blätter wurden im Nov. 2000 gesammelt (nachdem sie zu Boden gefallen waren) und grüne Blätter wurden im Juni 2001 gesammelt. Sie wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, zerkleinert und bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Der Feuchtigkeitsgehalt in den gelben Blättern betrug 59 % und 73 % in grünen Blättern. Weitere Proben dieser Blätter werden in unserem Labor gelagert.
Allgemeine Extraktion von TTLen.
Bioginkgo^TM 27/7 Extrakt (25 g) oder lyophilisierte Blätter (250 g) wurden 1 Stunde lang in 0,5 L (Extrakt) oder 2 L (Blätter) wässrigem 5 %-igem H₂O₂ (oder anderen Oxidationsreagenzien in Wasser) gekocht. Nach dem Passieren (Extrakt = Raumtemperatur, Blätter = kochend) durch einen Büchner-Filter ohne Filterpapier wurde die verbleibende Lösung bis zu 3 Mal mit EtOAc (250/125/75 mL) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit gesättigter wässriger Salzlösung (NaHCO₃/Na₂S₂O₃, NaHCO₃/Na₂SO₃ oder Na₂SO₃) gewaschen, gefolgt von Wasser und 80 %-igem wässrigem NaCl (gesättigte wässrige Lösung, verdünnt auf 80 %). Nach einem Trocknen über Na₂SO₄ wurde Lösungsmittel entfernt, um ein amorphes gelbes Pulver mit 50-60 % TTL-Gehalt zu erhalten. Siehe 6.
Zur weiteren Reinigung wurden diese Extrakte in EtOAc gelöst und durch eine Säule mit Aktivkohle geleitet. Aufkonzentrieren ergab ein cremefarbenes amorphes Pulver mit 60-70 % Gehalt an TTLen. Ein drastischeres Verfahren beinhaltete Lösen der Extrakte in Methanol, Zugeben von Aktivkohle und Filtrieren über Celite 545.
TLC-Analyse von TTLen.
Dünnschichtchromatographie von TTLen wurde so durchgeführt, wie es beschrieben worden war. (van Beek, 1993)
HPLC-Trennung von TTLen.
Eine 1 × 25 cm 5 m YMC ODS-AM-Säule mit einem 1 mL/min H₂O:MeOH:THF-Lösungsmittelsystem (7:2:1) wurde verwendet, um die TTLe zu trennen; Überwachung wurde mit einem Brechungsindex-Anzeigegerät durchgeführt. (O'Reilly)
Entfernung von Ginkgolsäuren.
Ginkgolsäuren wurden aus den Extrakten durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung von polymeren Harzen, wie zum Beispiel Dianon^® HP-20 (Chang, M.) oder Amberlite^® XAD-16 mit einem Stufengradienten mit zunehmendem Methanol (30-90 %) in Wasser entfernt. TTL-haltige Fraktionen (40-80 %, bestimmt durch NMR oder TLC) wurden kombiniert und das Lösungsmittel wurde entfernt, um die endgültigen Produkte hervorzubringen. Auch wurde WP C18-Siliciumdioxid (zweimal) erfolgreich mit wässrigem 60 %-igem Methanol angewandt, um Ginkgolsäuren zu entfernen.
Extraktion von Ginkgolsäuren.
Es wurden Standards aus mit Hexan extrahierten G. biloba-Blättern isoliert, die einer Chromatographie mit Silikagel (1 % MeOH in CHCl₃), RP-18 Silikagel (0-100 % MeOH, Einbehalten der Fraktion mit 100 % MeOH) und halbpräparativer HPLC (1 × 25 cm 5 m YMC ODS-AM-Säule, H₂O:MeOH:AcOH-Lösungsmittelsystem (100:10:1), überwacht bei 215 hm) unterzogen wurden. Spektroskopische Analysen dieser Verbindungen (¹H NMR, ¹³C NMR und negativer Modus von FABMS) ergaben Ergebnisse, die früher berichteten ähnlich waren. (Itokawa, H.)
Quantifizierung von Ginkgolsäuren.
Ginkgolsäure-Standards (3, 5, 25, 50, 250 hg) in MeOH (5 mL) wurden auf eine 4,6 × 150 mm Phenomenex^® Luna 5 m C18(2)-Säule mit 0,1 % TFA in MeCN-Lösungsmittelsystem (Fließgeschwindigkeit = 1 mL/min) injiziert und Nachweis bei 215 hm; Konzentrationsgraphen zeigten eine gute Linearität (R² ≥ 0,99). Mehrfache Injektionen ergaben, dass das Quantifizierungsniveau 10 ppm betrug. Proben wurden hergestellt durch Lösen von 1-2 mg Extrakt in 100 mL MeOH; 20 mL-Injektionen wurden dann auf eine ähnliche Weise analysiert.
DISKUSSION
Es ist ein effizientes und schnelles Protokoll zum Extrahieren von Ginkgoliden und Bilobalid (Terpentrilactonen, TTLen) aus Ginkgo biloba-Blättern entwickelt worden. Das Verfahren macht sich die außergewöhnliche Stabilität der TTL-Struktur trotz der Anwesenheit von mehrfachen Sauerstofffunktionen gegen eine Anzahl an chemischen Behandlungen, insbesondere Oxidation, zu Nutze. Das Protokoll beinhaltet Kochen des wässrigen Extrakts von Blättern mit verdünntem Wasserstoffperoxid, Extraktion mit Ethylacetat, Waschen mit basischen Lösungen und Filtration mit Aktivkohle, um ein cremefarbenes Pulver zu ergeben, TTL-Gehalt 60-70 %. Wahrscheinlich baut die Behandlung mit Wasserstoffperoxid unerwünschte Blattbestandteile ab, die zu intensiver Emulgierung während Extraktionen führen. Des Weiteren entfernt Umkehrphasenchromatographie der Extrakte mit polymeren Harzen die unerwünschten Ginkgolsäuren auf Mengen von kleiner als 10 ppm. Die Extrakte sind für reine TTL-Präparate, Anreicherung von TTL-Gehalt in Nutrazeutika und Präparaten mit niedrigen Flavonoid/hohen TTL-Kontrollen in medizinischen Studien geeignet.
EGb 761, (Polich, J.), ein standardisierter Extrakt der Blätter, enthält 5-7 % Ginkgolide (Kennedy, D. O.; DeFeudis, F. V.) und Bilobalid (BB) (Braquet P.) (Terpentrilactone, TTLe) zusammen mit 22-24 % Flavonoiden und weniger als 5 ppm Ginkgolsäuren (auch als Anacardinsäuren bekannt). (Polich, J.) Diese Grenze war erforderlich, da von Alkylphenolen, wie zum Beispiel Ginkgolsäuren, berichtet worden war, dass sie Kontaktdermatitis induzieren (Ishii, S.; Kato, K.); auch wurde bei diesen Verbindungen von Zytotoxizität berichtet. (Bito, H.)
Eine effiziente und ökonomische Extraktion von TTLen ist wesentlich für eine Sicherstellung der Mengen an Materialien, die für bioorganische und andere Studien erforderlich sind. Im Gegensatz zu herkömmlichen Isolierungsverfahren, die zeitraubend und umständlich sind, (O'Reilly, J.) konzentriert das beschriebene Verfahren die TTLe in den Blättern (ca. 0,2 %) auf 70 % in drei raschen Schritten aus Oxidation, Extraktion und Waschen. Der klare Vorteil ist, dass wenigstens im Labormaßstab aufgrund minimaler Emulsionsbildung bei dem EtOAc-Extraktionsverfahren die Extraktion von einigen Tagen auf einen Tag verkürzt wird, und dass nur ein einzelnes gemeinsames organisches Lösungsmittel verwendet wird. Die resultierenden Extrakte sind ideal als Ausgangsmaterialien für reine TTL-Zubereitung aus Blättern, zum Anreichern des TTL-Gehalts in diätischen Ergänzungsmitteln, und als niedrige-Flavonoid/hohe-TTL-Kontrollen in medizinischen Studien.
Durch quantitative NMR wurden die TTLe in den Extrakten analysiert (van Beek, 1993), indem man sich die 12-H-Signale zu Nutze machte, die bei allen TTLen als gut separierte Singuletts erscheinen. Unter Verwendung der zwei olefinischen Protone der Maleinsäure als einen internen Standard wurde DMSO an Stelle der ursprünglich beschriebenen Lösungsmittelmischung verwendet, und es wurde eine kleine Menge an Essigsäure zugegeben, um eine Verschiebung von Peaks in dem 12-H-Bereich des Spektrums zu vermeiden. Siehe, 5.
Während struktureller Studien von Ginkgoliden wurde herausgefunden, dass sie trotz der Anwesenheit von vielen Sauerstofffunktionen Käfigverbindungen von außerordentlicher Stabilität sind (Maruyama, M.). Sie werden durch Kochen in konzentrierter Salpetersäure nicht verändert, alkalische Fusion von GA führt lediglich zum Abtrennen von C-10/C-11, um ein Halbacetal zu erzeugen, während Behandlung von GA in konzentrierter Schwefelsäure mit Natriumdichromat einfach das Hydroxylacton in sein Oxolacton umwandelte. Unter Verwendung dieser außerordentlichen Stabilität untersuchten wir verschiedene Oxidationszustände und nachfolgende Aufarbeitung, um andere Komponenten als TTLe in den Blättern zu zerstören/entfernen.
Das Verfahren setzt sich zusammen aus Kochen des TTL-haltigen Materials in Wasser mit einem oxidierenden Agens, Filtrieren, Extrahieren des Filtrats mit Ethylacetat, Waschen der organischen Phase mit basischen Lösungen, und Entfernen von Lösungsmittel. Diese Extraktionsverfahren wurden zuerst mit einem G. biloba-Extrakt (Pharmanex Bioginkgo^TM 27/7, 27 % Flavonoide/7 % TTLe) optimiert und dann auf Blätter angewandt. Es wurden verschiedene oxidierende Reagenzien, wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid, 3-Chlorperbenzoesäure (MCPBA) und MnO₂ auf Geeignetheit für Extraktion von TTLen aus Bioginkgo^TM-Pulver getestet. Die Ausbeuten und prozentualen Gehalte an TTLen der Extrakte, die mit H₂O₂, MCPBA und reinem Wasser gekocht wurden, waren ähnlich, d.h. 55 % TTLe. Es gab eine signifikante Abnahme bei der Ausbeute nach Behandlung mit MnO₂ aufgrund Zerstörung von BB (das viel weniger stabil ist als die Ginkgolide), es nahmen aber auch die Mengen an Ginkgoliden ab, wahrscheinlich aufgrund von Absorption auf festem MnO₂.
Weitere Untersuchungen konzentrierten sich auf H₂O₂, da es das einzige oxidierende Agens war, das eine klare Schichtentrennung während der Extraktion bereitstellte, während die anderen Agenzien zu Emulsionen mit niedrigerer Ausbeute an TTLen führten; es ist wahrscheinlich, dass die Behandlung mit H₂O₂ den/die Inhaltsstoff(e) zerstört, der/die zu hartnäckiger Emulgierung in dem Schritt führt/führen, der Extraktion in die organische Schicht (Ethylacetat) enthält.
Es wurde die Konzentration an H₂O₂ variiert, um die optimale Konzentration zu ermitteln. Mit Waschen nahm die Gesamtmenge an Extrakt bei höheren Prozentgehalten an H₂O₂ ab, aber ohne Waschen wurde das Gegenteil beobachtet. Eine gute Trennung von Schichten wurde bei 5 % und 10 % H₂O₂ gefunden, wohingegen 1 % H₂O₂ eine Emulsion ergab und 3 % H₂O₂ eine längere Zeit für Schichtentrennung erforderte. Die höchsten Ausbeuten an TTLen mit Waschen wurden mit 3 % und 5 % H₂O₂ ermittelt. Nach Extraktion wurde H₂O₂ in der organischen Schicht nachgewiesen (durch die Farbveränderung auf mit Kaliumiodid imprägniertem Filterpapier) und im Fall von 10 % H₂O₂ verursachte der Überschuss an Peroxid eine exotherme Reaktion bei der Aufarbeitung. Daher wurden 5 % H₂O₂ für alle weiteren Untersuchungen verwendet. In Bezug auf die Kochdauer wurde herausgefunden, dass 1 Stunde optimal ist.
Sowohl das Bioginkgo^TM-Pulver als auch Blätter verursachten nach dem Kochen saures Wasser (pH 3). Da Oxidation mit Peroxid unter sauren Bedingungen besser funktionieren sollte, wurde Oxidation mit 5 % H₂O₂ und zusätzlich 1 % an verschiedenen Säuren getestet. Die Ergebnisse waren entweder keine Veränderung oder eine verringerte Ausbeute an TTLen. Daraus wurde geschlossen, dass die Verwendung von wässrigem H₂O₂ ohne zusätzliche Säure optimal war.
Nach Kochen mit Peroxid wurden alle Mischungen drei Mal mit EtOAc extrahiert. In Bezug auf die Anzahl an Extraktionen stellte sich heraus, dass drei ausreichend sind. Bei Blattextraktionen musste ein in der organischen Schicht vorhandener Niederschlag durch Filtration entfernt werden. Für einen hohen TTL-Gehalt war Waschen der EtOAc-Schicht mit basischen Lösungen kritisch. Es wurde Base verwendet, um organische Säuren zu neutralisieren und um Peroxidüberschuss zu zerstören, aber die Lactone in den TTLen könnten sich durch eine sol che Behandlung öffnen, was zu einer erhöhten Wasserlöslichkeit führt. Für GB wurde berichtet, dass Lactone anfangen, sich bei einem pH von 6,5 zu öffnen. (Zekri, O) Wie erwartet, führten wässriges Na₂CO₃ (pH 10,4) und NaSH (pH 10,8) zu einer verringerten Ausbeute an TTLen, wobei BB und Ginkgolid C (GC) nicht mehr in dem Extrakt nachgewiesen wurden. Jedoch führte Waschen mit gesättigten Lösungen aus NaHCO₃ und Na₂S₂O₃ (beide pH 8,3) und Na₂SO₃ (pH 9,3) zu gleichbleibenden Extraktionsausbeuten und hohem TTL-Gehalt. Weitere Aufarbeitung ergab Extrakte, die 50-70 % TTLe enthielten. Im Gegensatz zu basischen Lösungen war Verwendung von wässrigem NH₄Cl (pH 5) bei dem Entfernen von Verunreinigungen nicht wirksam.
Da die Lactone von TTLen bei pH 3 geschlossen sind, wurde die Anwesenheit von irgendwelchem TTL in der verworfenen wässrigen Schicht nach Waschen mit Na₂SO₃ (pH 9,3) getestet nach Ansäuern der kombinierten Wasserschichten mit 1 N HCl; es wurden durch TLC keine TTLe nachgewiesen. Unter Verwendung des gleichen Verfahrens bei den Wasserschichten wurden nach Waschen mit Na₂CO₃ (pH 10,4) GC und Zersetzungsprodukte von BB gefunden.
Ein aus Bioginkgo^TM 27/7 hergestellter typischer Extrakt ist in 7A gezeigt. Kleine Mengen an reinen TTLen wurden mit halbpräparativer Umkehrphasen-HPLC aus solchen Extrakten erhalten (Teng, B. P.); größere Mengen können durch eine Anzahl an verschiedenen Verfahren gereinigt werden. (Teng, B. P.; van Beek 1997)
Nach Optimierung wurde das Protokoll bei getrockneten Blättern angewandt. Die Gesamt-TTL-Gehalte waren bei dem behandelten Bioginkgo^TM 27/7 Pulver (65 %), den gelben Blättern (65 %) und den grünen Blättern (70 %) ähnlich (7).
Der Gehalt an TTLen in Blättern hängt von den Jahreszeiten und weiteren Faktoren, wie zum Beispiel dem Baumalter, ab. (Laurain, D.) Wie für Blätter und für EGb761 (26 % Flavonoide, 6 % TTL) beschrieben ist, war BB immer die Hauptkomponente des TTL-Gehalts (ca. 50 %). (van Beek, 1992; Sticher, O) Die beschriebenen Verfahren führten zu minimaler BB-Zerstörung, großer Ausbeute und hielten ein natürliches Verteilungsmuster bei.
Literatur

Bito, H.; Nakamura, M.; Honda, Z.; Izumi, T.; Iwatsubo, T.; Seyama, Y.; Oguram A.; Kudo, Y.; Shimizu, T. Neuron, 1992, 9, 285-294.
Braquet P.; Etienne A.; Touvay C.; Bourgain R. H.; Lefort J.; Vargaftig B. Lancet 1985, 1, 1501.
Chang, M.; Yu, Z; Cooper, R.; Zhang, D.C. PCT Int. Anmeldung WO 99/26643, 3. Juni 1999.
Clark, G. D.; Bazan, N. G.; Zorumski, C. F. Nature, 1994, 367, 175-179.
DeFeudis, F. V. Ginkgo biloba Extrakt (Egb 761): From Chemistry to the Clinic; Ullstein Medical: Wiesbaden, 1998.
Ishii, S.; Shimizu, T. Prog. Lipid Res. 2000, 39, 41-82.
Itokawa, H.; Totsuka, N.; Nakahara, K.; Takeya, K.; Lepoitteven, J.-P.; Asakawa, Y. Chem. Pharm. Bull. 1987, 35, 3016-3020.
Kennedy, D. O.; Scholey, A. B.; Wesnes, K. A. Psychopharmacology 2000, 151, 416-423.
Laurain, D. In Med. Aromat. Plants – Ind. Profiles, Band 12 (Ginkgo biloba); van Beek, T. A. Herausgeber; Harwood: Amsterdam, 2000; Seiten 63-77.
Maruyama, M.; Terahara, A.; Nakadaira, Y.; Woods, M.C.; Takagi, Y.; Nakanishi, K. Tet. Lett. 1967, 4, 315-320; siehe auch Nakanishi, K. Pure Appl. Chem. 1967,14, 89-113.
O'Reilly, J. In Med. Aromat. Plants – Ind. Profiles, Band 12 (Ginkgo biloba); van Beek, T. A. Herausgeber; Harwood: Amsterdam, 2000; Seiten 99-108.
Polich, J.; Gloria, R. Hum. Psychopharmacol. Clin. Exp. 2001, 16, 409-416.
Sticher, O. Planta Med. 1993, 59, 2-11.
Teng, B. P. In Ginkgolides – Chemistry, Biology, Pharmacology und Clinical Perspectives; Braquet, P. Herausgeber; J. R. Prous Science Publishers: Barcelona, 1988; Seiten 37-48.
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van Beek, T. A.; Lelyveld, G. P. Phytochem. Anal. 1993, 4,109-114.
van Beek, T. A.; Lelyveld, G. P. J. Nat. Prod. 1997, 60, 735-738.
Zekri, O.; Boudeville; Genay; Perly; Braquet; Jouenne; Burgot. Anal. Chem. 1996, 68, 2598-2604.

Claims

Verfahren zum Isolieren von Terpentrilactonen aus Ginkgo biloba Pflanzenmaterial oder -extrakt, umfassend die Schritte: – Suspendieren des Pflanzenmaterials oder -extrakts in Anwesenheit eines Oxidationsreagenz, – Extrahieren der Terpentrilactone unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsagens, und – Separieren der organischen Schicht von der wässrigen Schicht, um dadurch die Terpentrilactone in der organischen Schicht zu isolieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oxidationsreagenz in wässriger Lösung ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend mindestens einen ersten Waschschritt, um die organische Schicht mit einer geeigneten wässrigen Salz- oder Hydroxidlösung zu waschen.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, weiterhin umfassend einen Schritt des Trocknens der organischen Schicht um einen Extrakt zu bilden, der Terpentrilactone enthält.
Verfahren zum Isolieren von Terpentrilactonen aus Ginkgo biloba Pflanzenmaterial oder -extrakt, umfassend die Schritte: – Suspendieren des Pflanzenmaterials oder -extrakts in Wasser; – Extrahieren der Terpentrilactone unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsagens; – Separieren der organischen Schicht von der wässrigen Schicht; – Waschen der organischen Schicht mit einer wässrigen alkalischen Salz- oder Hydroxidlösung, um dadurch die Terpentrilactone in der organischen Schicht zu isolieren.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, weiterhin umfassend einen Schritt des Erwärmens oder Kochens des suspendierten Pflanzenmaterials oder -extrakts in wässriger Lösung für einen Zeitraum zwischen 5 Minuten und 5 Stunden.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, weiterhin umfassend einen Schritt des Einstellens des pH des suspendierten Pflanzenmaterials oder -extrakts in wässriger Lösung auf einen Bereich von etwa pH 4 und pH 6,5.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, weiterhin umfassend einen Schritt des Zerstörens von überschüssigem Oxidationsreagenz in der organischen Schicht durch in Kontakt bringen der organischen Schicht mit einem Metall- oder einem Nichtmetallkatalysator.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei das Oxidationsreagenz Wasserstoffperoxid ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die wässrige Lösung 0,1 % bis 50 % Oxidationsreagenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die wässrige Lösung 0,1 % bis 30 % Oxidationsreagenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die wässrige Lösung 3 % bis 5 % Oxidationsreagenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die wässrige Lösung weiterhin eine Säure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die wässrige Lösung 0,1 % bis 15 % Säure enthält.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Säure ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Essigsäure, Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei das geeignete Extraktionsagens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus niedrigen Essigsäureestern, niedrigen Ketonen, niedrigen Ethern, niedrigen Alkoholen und Benzolen.
Verfahren nach Anspruch 3, weiterhin umfassend einen zweiten Waschschritt, um die organische Schicht mit einer geeigneten wässrigen Salz- oder Hydroxidlösung zu waschen.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 17, wobei die geeignete wässrige Salz- oder Hydroxidlösung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ammoniumchlorid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumthiosulfat, Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfid besteht.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die geeignete wässrige Salz- oder Hydroxidlösung eine Lösung eines Salzes ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumthiosulfat, Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfid besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die geeignete wässrige Salzlösung eine wässrige Alkalisalz- oder Hydroxidlösung ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die wässrige alkalische Salzlösung eine Natriumsulfitlösung ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die wässrige Alkalisalz- oder Hydroxidlösung einen pH von zwischen etwa 7 und 14 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die wässrige Alkalisalz- oder Hydroxidlösung eine wässrige Alkalihydroxidlösung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Natriumhydroxidlösung und einer Kaliumhydroxidlösung besteht.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die wässrige Alkalisalzlösung einen pH von zwischen etwa 7,5 und 9,5 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Extrakt mehr als 50 Gewichtsprozent Terpentrilactone enthält.
Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend einen Schritt des Umkristallisierens des Terpentrilactone enthaltenden Extrakts, um Terpentrilactone in höherer Reinheit zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der zweite Waschschritt mit einer Lösung durchgeführt wird, die verschieden ist von der im ersten Waschschritt verwendeten Lösung.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die wässrige alkalische Salz- oder Hydroxidlösung einen pH von zwischen etwa 8,3 und 9,3 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, weiterhin umfassend einen Schritt des Reinigens der isolierten Terpentrilactone durch Umkehrphasenchromatographie.
Zusammensetzung umfassend mehr als 50 % Terpentrilactone, wobei der Anteil jedes Terpentrilactons relativ zur Gesamtmenge der Terpentrilactone in der Zusammensetzung 57 % Bilobalid, 16 % Ginkgolid A, 12 % Ginkgolid B, 11 % Ginkgolid C und 4 % Ginkgolid J beträgt.
Zusammensetzung umfassend mehr als 50 % Terpentrilactone, wobei der Anteil jedes Terpentrilactons relativ zur Gesamtmenge der Terpentrilactone in der Zusammen setzung 25 % Bilobalid, 42 % Ginkgolid A, 14 % Ginkgolid B, 14 % Ginkgolid C und 5 % Ginkgolid J beträgt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 30 oder 31, umfassend 65 % Terpentrilactone.
Zusammensetzung, umfassend mehr als 50 % Terpentrilactone, wobei der Anteil von jedem Terpentrilacton relativ zur Gesamtmenge der Terpentrilactone in der Zusammensetzung 58 % Bilobalid, 21 % Ginkgolid A, 9 % Ginkgolid B, 8 % Ginkgolid C und 4 % Ginkgolid J beträgt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 33, umfassend 70 % Terpentrilactone.
Zusammensetzung, umfassend Terpentrilactone, die mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-29 hergestellt wurde.