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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung beschreibt
ein verbessertes Verfahren für
die Extraktion eines wichtigen biochemischen Reagens, Carnosinsäure. Die
vorliegende Erfindung beschreibt genauer ein verbessertes Verfahren
für die
Extraktion von Carnosinsäure
aus Rosmarinblättern,
ein Verfahren zum Stabilisieren der Säure vor Zersetzung und ein
Verfahren zur Herstellung der Säure
in hoher Konzentration. Carnosinsäure ist charakterisiert durch
seine antioxidative Funktion und ist der wirksamste Inhaltsstoff
bei der Prävention
der Oxidation von Fettsäuren.
Von Linde wurde im Jahr 1962 herausgefunden, dass das biochemische
Reagens in slavia officinalis existiert, und von Wenkert im Jahr
1965, dass es in rosmarinus offinalis existiert. Später wurde
herausgefunden, dass die Carnosinsäure auch in anderen Pflanzen
der gleichen Familie wie z. B. s. canariesis, s. sclarea und s.
triloban. existiert. Carnosinsäure
ist Phenolditerpen (C20H28O4), das durch Brieskorn und Domling im Jahr
1964 als sehr wirksames Antioxidans identifiziert wurde. Von seiner
antibiotischen Wirkung gegen Stephilococus und Dentalkaries wurde
ebenfalls berichtet.
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Zahlreiche Verfahren für die Extraktion
der Carnosinsäure
sind beschrieben in U.S. Patent Nummer 5,256,700, deren Inhalte
durch deren Erwähnung
eingeschlossen sind. Weitere Verfahren werden in den folgenden U.S.
Patenten gefunden: 2,124,706; 4,012,531; 4,363,823; und 4,450,097
und in WO 93/06190.
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Insbesondere offenbart WO 93/06190
ein Verfahren für
die Herstellung von einer Oleoresinzusammensetzung. Die beschriebenen
Extraktionslösungen
können
einen weiten Bereich an Konzentrationen in Ethanol haben. Wie WO
93/06190 erklärt,
kann nicht jede Konzentration von Alkohol erfolgreich verwendet werden,
um Carnosinsäure
zu extrahieren, entweder wegen der niedrigen Löslichkeit des Produkts in einer
niederen Konzentration von Alkohol (Seite 9, letzter Paragraph,
Zeilen 1– 6)
oder wegen der unerwünschten
Extraktion von Unreinheiten bei einer hohen Konzentration an Alkohol
(Seite 10, Zeilen 5–8).
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ZIELE DER
ERFINDUNG
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Es ist das Ziel der vorliegenden
Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, um Carnosinsäure aus
Rosmarinblättern
zu extrahieren. Es ist ebenfalls das Ziel der Erfindung, ein Verfahren
bereitzustellen, um Carnosinsäure
aus Rosmarinblättern
zu extrahieren, das die Carnosinsäure vor der Zersetzung stabilisiert.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
bereitzustellen, das sehr hohe Konzentrationen an Carnosinsäure liefert.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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In Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung wird ein neues Verfahren bereitgestellt, um Carnosinsäure aus
Rosmarinblättern
zu extrahieren, das das Behandeln der Rosmarinblätter mit einer wässerigen Lösung eines
Niederalkylalkohols in der Anwesenheit einer wasserlöslichen
Säure umfaßt, und
weiterhin wahlweise das Reinigen der Carnosinsäure durch Extraktion.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Niederalkylalkohole, die als
für die
vorliegende Erfindung geeignet gefundenen wurden, werden gewählt aus
der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Pentanol
und Mischungen dieser, wobei Ethanol bevorzugt ist.
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Die Niederalkylalkohole sind in dem
Extraktionsmedium anwesend in einer Konzentration von 40% bis 70%
Alkohol, vorzugsweise 55% bis 65% Alkohol und am meisten bevorzugt
60% Alkohol. Die Extraktion unter Verwendung von wässerigen
Niederalkylalkoholen kann in einem oder mehreren Schritten ausgeführt werden.
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Die wasserlöslichen Säuren, die als für die vorliegende
Erfindung geeignet gefunden wurden, werden gewählt aus der Gruppe bestehend
aus Phosphorsäure
und Ascorbinsäure,
Chlorwasserstoffsäure,
Essigsäure,
Citronensäure
und Mischungen dieser, wobei Phosphorsäure bevorzugt ist. Die Säuren sind
anwesend in einer Konzentration von 0,1% bis 30%, vorzugsweise 0,1
bis 2%. Die Carnosinsäure
wird aus den wässerigen alkoholischen
Lösungen
durch Behandeln mit pflanzlichem Öl entfernt, wobei fast jede
Sorte von pflanzlichem Öl
allein oder in Kombination mit einem anderen pflanzlichem Öl verwendet
werden kann.
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Die Carnosinsäure, die in dem pflanzlichem Öl aufgelöst ist,
kann weiter konzentriert werden durch Extraktion unter Verwendung
eines Puffers von Dinatriumtetraborat bei einem pH Bereich von 7,5
bis 9,5, vorzugsweise 8,5 bis 9,5, um Carnosinsäure in der Konzentration von
so viel wie 80% bis 90% zu liefern.
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Beispiele 1, 2, 6 bis 8 zeigen das
Verfahren der Extraktion mit Alkylalkohol und die erhaltene gute
Ausbeute. Beispiele 3 bis 5 sind Vergleichsbeispiele, die die niedrigere
Ausbeute zeigen, die unter Verwendung von anderen organischen Lösungsmitteln
erhalten wird.
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Beispiel 9 zusammen mit Tabelle 1
zeigen den Effekt der Säure
auf die Stabilität
der Carnosinsäure und
die Vorteile von Ascorbinsäure
und Phosphorsäure,
insbesondere von Phosphorsäure.
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Beispiel 10 zeigt, wie die Konzentrationen
von Carnosinsäure
durch aufeinanderfolgende Extraktion in der Anwesenheit eines Puffers
von Dinatriumtetraborat erhöht
werden können.
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Die vorliegende Erfindung beschreibt
insbesondere die selektive Extraktion von Carnosinsäure direkt aus
der Pflanze, unter Verwendung einer sauren polaren Lösung, die
Wasser, Niederalkylalkohol und Säure enthält. Die
Verwendung dieser besonderen Extraktionslösung ist sehr nützlich in
Bezug auf die folgenden Ergebnisse: a) Hohe Ausbeute von Carnosinsäure in dem
Konzentrat. b) Die Extraktion der Carnosinsäure ist sehr selektiv. Sehr
wenige andere Chemikalien, wie beispielsweise pro-Oxidationsmittel
aus den Pflanzen werden extrahiert. c) Eine weitere Oxidation der
Carnosinsäure
zu Carnosol oder in dem Extraktionsverfahren wird verhindert. Zusätzlich ist
die Carnosinsäure
in dieser Lösung
stabil für
einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden. d) Der hohe Verteilungskoeffizient
der Extraktionslösung
resultiert in einem effektiven Extraktionsverfahren von Carnosinsäure. Nach
der Extraktion wandert die Carnosinsäure zur apolaren Phase als
ein Ergebnis der Veränderung
in dem Verteilungskoeffizienten der Lösung, da der Alkohol verdampft
wird. Eine Kontrolle der Alkoholkonzentration in der Lösung befähigt die
unerwünschten
Fraktionen, daß diese
zu der polaren Phase wandern. Als eine apolare Phase kann man eine
nicht-Carnosinsäure
verwenden. Alternativ kann die polare Phase die flüchtigen
Lösungsmittel
von Anspruch 1 sein, wodurch die Kristallisation der Carnosinsäure ermöglicht wird.
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Während
die Erfindung nun in Verbindung mit bevorzugten Ausführungsformen
in den folgenden Beispielen beschrieben wird, wird es verstanden
werden, dass es nicht beabsichtigt ist, die Erfindung auf diese besonderen
Ausführungsformen
zu begrenzen.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Zu 1,6 Liter von Ethanol (60%), enthaltend
1% Phosphorsäure,
wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die
eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde
für 3 Stunden
bei Raumtemperatur durchgeführt.
1,26 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten,
45 gr von pflanzlichem Öl
wurden hinzugefügt
und von 0,86 Liter Alkohol verdampft. Die zwei Phasen wurden getrennt
und das restliche Wasser und der Alkohol, der in der Ölphase anwesend
ist (ca. 30% Alkohol) wurden durch eine Vakuumpumpe entfernt, was
56 gr einer braunen Flüssigkeit
ergab. Die Carnosinsäurekonzentration
ist 10,3% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 67,1%.
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Vergleichsbeispiel 2
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Zu 1,6 Liter absolutem Ethanol, enthaltend
1% Phosphorsäure,
wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die
eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde
für 3 Stunden
bei Raumtemperatur durchgeführt.
1,29 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten,
45 gr von pflanzlichem Öl
wurden hinzugefügt
und das Konzentrat wurde verdampft. Restliches Lösungsmittel wurde durch eine
Vakuumpumpe entfernt, so daß 83,4
gr einer viskosen dunkelgrünen Paste
erhalten wurden. Die Carnosinsäurekonzentration
ist 7,1% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 68,6%.
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Beispiel 3
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Zu 1,6 Liter Hexan wurden 200 gr
trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die
eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion
wurde für
3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,31 Liter Extrakt wurden
durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden
hinzugefügt
und das Hexan wurde verdampft. Restliches Lösungsmittel wurde durch eine
Vakuumpumpe entfernt, so daß 50,5
gr einer dunkelgrünen
Flüssigkeit
erhalten wurden. Die Carnosinsäurekonzentration
ist 2,1% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 12,5%.
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Beispiel 4
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Zu 1,6 Liter Benzen wurden 200 gr
trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine
Konzentration von 4,3% Carnosinsäure
hatten. Die Extraktion wurde für
3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,28 Liter Extrakt wurden
durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden
hinzugefügt
und das Benzen wurde verdampft. Restliches Lösungsmittel wurde durch eine
Vakuumpumpe entfernt, so daß 54,6
gr einer dunkelgrünen
Flüssigkeit
erhalten wurden. Die Carnosinsäurekonzentration
ist 2,8% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 17,8%.
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Beispiel 5
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Zu 1,6 Liter Ethylacetat wurden 200
gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine
Konzentration von 4,3% Carnosinsäure
hatten. Die Extraktion wurde für
3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,24 Liter Extrakt wurden
durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden
hinzugefügt
und das Ethylacetat wurde verdampft. Restliches Lösungsmittel
wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt, so daß 71,3 gr einer dunkelgrünen viskosen
Paste erhalten wurden. Die Carnosinsäurekonzentration ist 8,5% und
die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 70,4%.
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Beispiel 6
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Zu 1,6 Liter Ethanol (73%), enthaltend
1% Phosphorsäure,
wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die
eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion
wurde für
3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,28 Liter Extrakt wurden
durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden
hinzugefügt
und 1,1 Liter Alkohol verdampfte. Die zwei Phasen wurden getrennt
und das restliche Wasser und Alkohol, der in der Ölphase anwesend
war (ca. 30% Alkohol), wurden durch eine Vakuumpumpe entfernt, was
zu 62,2 gr einer braunen Flüssigkeit
führte.
Die Carnosinsäurekonzentration
ist 9,5% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 68,7%.
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Beispiel 7
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Zu 1,6 Litern Ethanol (50%), enthaltend
1% Phosphorsäure,
wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die
eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion
wurde für
3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,23 Liter Extrakt wurden
durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurde
hinzugefügt
und 0,49 Liter Alkohol verdampfte. Die zwei Phasen wurden getrennt
und das restliche Wasser und Alkohol, der in der Ölphase anwesend
war (ca. 30% Alkohol), wurden durch eine Vakuumpumpe entfernt, was
zu 53,1 gr einer braunen Flüssigkeit
führte.
Die Carnosinsäurekonzentration
ist 8,9% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 54,9%.
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Beispiel 8
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Zu 1,6 Liter Ethanol (40%), enthaltend
1% Phosphorsäure,
wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die
eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion
wurde für
3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,19 Liter Extrakt wurde
durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden
hinzugefügt
und 0,24 Liter Alkohol verdampfte. Die zwei Phasen wurden getrennt
und das restliche Wasser und Alkohol, der in der Ölphase anwesend
war (ca. 30% Alkohol) wurden durch eine Vakuumpumpe entfernt, was
zu 49,2 gr einer braunen Flüssigkeit
führte.
Die Carnosinsäurekonzentration
ist 4,0% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 22,9%.
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Beispiel 9
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Stabilisierung von Carnosinsäure für einen
Zeitraum von mehr als 24 Stunden
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Zu 4,0 Liter Ethanol (60%) wurden
500 gr rockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die
eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion
wurde für
3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 3,22 Liter Extrakt wurden
durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten. Das Konzentrat wurde
in 200 ml Anteile geteilt, wobei verschiedene Säuren bei verschiedenen Konzentrationen
zu diesen Anteilen hinzugefügt
wurden. Alle Anteile wurden in der Dunkelheit gehalten und die Carnosinsäure-Konzentrationsschwankungen
der verschiedenen Anteile wurden überprüft. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse,
in denen sichtbar wird, daß ein
Mangel an Säure
zu einer Verminderung von 50% Carnosinsäure führt. Nur unter sauren Bedingungen
wurde die Konzentration von Carnosinsäure aufrechterhalten, wobei
die optimalen Säuren
Phosphorsäure
und Ascorbinsäure
sind.
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Tabelle
1
DER EFFEKT DES PH AUF DIE KONZENTRATION VON CARNOSINSÄURE Konzentration
von Carnosinsäure
(mg/ml)
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Das Aussetzen von Carnosinsäure in einem
Extrakt, wenn sie Raumtemperatur und Licht ausgesetzt wurde, verursacht
eine merkliche Verminderung in einer Konzentration von Carnosinsäure, wenn
der pH des Extrakts über
6 ist.
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Beispiel 10
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ERHÖHUNG DER KONZENTRATION VON
CARNOSINSÄURE
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300 gr einer 5% Natriumbicarbonatlösung (pH
= 8,16) wurde zu 100 gr eines flüssigen
Produkts hinzugefügt,
das 4,3% Carnosinsäure
enthielt, wie aus den anfänglichen
Extraktionen von Rosmarinblättern
erhalten, und es wurde für
10 Minuten gerührt.
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Die Phasen wurden getrennt und die
Wasserphase wurde verworfen. Das Material wurde aus der Ölphase mit
300 gr 0,01 Dinatriumtetraboratpuffer (pH = 9,18) für 20 Min.
extrahiert und die Schichten wurden getrennt. Der pH der wässerigen
Phase wurde durch Hinzufügen
von HCl von 7,96 auf 1,5 erniedrigt. Das erhaltene Präzipitat
wurde gefiltert, unter 40°C
luftgetrocknet, was zu einem 0,59 gr getrockneten Präzipitat
führte,
das 70% Carnosinsäure
enthielt. Zu der restlichen Ölphase
wurden 300 gr 0,01 M Dinatriumtetraboratpuffer (pH = 9,18) hinzugefügt und die
Lösung
wurde für
20 Min. gerührt.
Die Phasen wurden getrennt, wobei der pH der wässerigen Phase durch Hinzufügen von
HCl von 7,93 auf 1,52 erndiedrigt wurde. Das erhaltene Präzipitat wurde
gefiltert, luftgetrocknet unter 40°, was zu zusätzlichen 1,29 gr getrocknetem
Präzipitat
führte,
das 80% Carnosinsäure
enthielt. Zu der restlichen Ölphase
wurde 300 gr 0,01 M Dinatriumtetraboratpuffer (pH = 9,18) hinzugefügt und die
Lösung
wurde für
20 Minuten gerührt.
Die Phasen wurden getrennt, wobei der pH der wässerigen Phase durch Hinzufügen von
HCl von 8,08 auf 1,5–2
erniedrigt wurde. Das erhaltene Präzipitat wurde gefiltert, luftgetrocknet
unter 40°C,
was zu einem 1,39 gr getrockneten Präzipitat führte, das 89% Carnosinsäure enthielt.
Zu der vorher dreimal extrahierten Ölphase wurden 0,01 M Dinatriumtetraboratpuffer
(pH = 9,18) hinzugefügt
und die Lösung
wurde für
20 Minuten gerührt.
Die Phasen wurden getrennt, wobei der pH der wässerigen Lösung durch Hinzufügen von
HCl von 8,68 auf 1,5 erniedrigt wurde, und ein Ölpräzipitat wurde erhalten. Die
Ausbeute an Carnosinsäure
ist 65%.