DE60207016T2

DE60207016T2 - Verfahren und Kit zur Quantifizierung von Beta-Laktam Penizillinen

Info

Publication number: DE60207016T2
Application number: DE60207016T
Authority: DE
Inventors: Robert Ivan County Antrim BT29 4QY McConnell; El Ouard County Antrim BT29 4QY Benchikh; Stephen Peter County Antrim BT29 4QY Fitzgerald; John Victor County Antrim BT29 4QY Lamont
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 2001-08-02
Filing date: 2002-07-18
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2022-07-19
Also published as: CN1405563A; CN1223596C; EP1281971B1; DE60207016D1; ES2251559T3; HK1053352B; JP2003114227A; US6960653B2; HK1053352A1; ATE308757T1; EP1281971A1; US20030143653A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren und Kit zum Nachweis oder zur Bestimmung der Menge an β-Lactam-Penicillinen ebenso wie darin nützlichen Haptenen, Immunogenen, Konjugaten und Antikörpern.
Unter „Nachweis" versteht man die qualitative Analyse auf die An- oder Abwesenheit einer Substanz.
Unter „Bestimmung" versteht man die quantitative Analyse auf die Menge einer Substanz.
Gegenstand der Erfindung ist die beabsichtigte breite Applizierbarkeit hinsichtlich der wichtigsten β-Lactam-Penicilline der ersten Generation, wie zum Beispiel Ampicillin, Penicillin G, Amoxycillin, Cloxacillin, Dicloxacillin und Oxacillin, ist aber nicht als Beschränkung auf diese spezifischen β-Lactam-Penicilline beabsichtigt.
Antibiotika werden routinemäßig in der Tierhaltung für prophylaktische ebenso wie für therapeutische Zwecke eingesetzt. Die β-Lactam-Klasse der Antibiotika wird häufig in der Fleisch- und Molkereiindustrie als Wachstumsförderer angewendet. Diese Klasse, die auch als die Penicilline bekannt ist, wird zur Behandlung der Mastitis von Milchkühen angewendet, wodurch die Milcherträge und die Nutzdauer der Kuh verlängert wird. B-Lactame können auch in Tierfutter eingeschlossen werden, mit der Absicht zur Förderung des Wachstums von Geflügel und Schweinen. Durch Krankheitsprävention oder durch Inhibition der Aktivität der natürlichen Darmflora in solchen Tieren führen die Antibiotika dazu, dass die Tiere eine vermarktbare Größe schneller als ohne die Anwendung solcher Enhancer erreichen.
Probleme können jedoch entstehen, wenn Rückstände der β-Lactame in Fleisch- und Molkereiprodukten vorhanden sind. Wie mit jedwedem Antibiotikum kann die kontinuierliche Exposition von Menschen gegenüber den β-Lactamen aufgrund der Entwicklung resistenter Stämme von pathogenen Bakterien zu einer Reduktion der Effizienz der zur Behandlung von Erkrankungen angewendeten Arzneimittel führen. Das Vorliegen der β-Lactame in verzehrten Lebensmitteln kann bei Penicillin-empfindlichen Menschen auch zu allergischen Reaktionen führen. Molkereiprodukte, die diese Antibiotika enthalten, können auch bei der Verarbeitung verwendete Bakterienkulturen stören.
Auf Grund dessen wurden in der Europäischen Gemeinschaft in Bezug auf die Entzugszeiten und die empfohlenen Maximalkonzentrationen (MRL) der β-Lactame in Milch und Fleisch durchweg strikte Richtlinien auferlegt. Milch- und Fleischproben werden routinemäßig getestet, um sicherzustellen, dass sie dieser EG-Legislation Genüge leisten. Verschiedene Verfahren werden zum Testen auf Antibiotika, wie zum Beispiel β-Lactame, verwendet. Viele dieser Tests basieren auf mikrobiellen Inhibitionstests, die zeitaufwendig sind und für individuelle β-Lactame gegebenenfalls spezifisch sein können. Die Entwicklung eines Verfahrens zum Schnellnachweis der β-Lactame in Milch und Fleisch wäre besonders wertvoll, wenn das Verfahren generisch wäre, d.h. es die meisten, wenn nicht alle, β-Lactam-Antibiotika nachweisen würde.
Es wurden viele Versuche zur Bildung von Antikörpern in β-Lactamsensibilisierten Tieren mit dem Ziel der Herbeiführung eines Immunassays zum Nachweis von β-Lactamen im Allgemeinen unternommen. Die erste Stufe eines solchen Vorgangs besteht in der Bildung eines Immunogens, das eine Immunantwort im Tierwirt auslöst. Dies ist aufgrund des Versagens des Intaktbleibens des β-Lactamrings während der Konjugation an ein Trägerprotein problematisch. Auf dem offenen Lactamring basierende bekannte Konjugationsverfahren sind zum Beispiel in US-A-4,347,312, US-A-5,128,240, in de Haan et al., 1985 und in Faghihi Shirazi et al., 1991, offenbart. Dies führt zur Herstellung von Antiseren, die gegen die offene Form des β-Lactam-Rings empfindlich sind, die jedoch gegebenenfalls nicht unbedingt gegen die generische Ringstruktur empfindlich sein könnten.
Als Alternative kann die freie Carboxylgruppe des geschlossenen β-Lactamrings, wie in EP-A-309,299 und in Usleber et al., 1994, offenbart ist, zum Beispiel verestert sein. Auf diese Weise konjugierte gegen β-Lactam-Antibiotika gebildete Antiseren sind für die Acylseitenketten spezifisch und kreuzreagieren nur mit anderen β-Lactam-Antibiotika, wenn sie ähnliche Seitenketten aufweisen, wie dies bei den Isoxazolyl-Penicillinen der Fall ist. Als Alternative kann weiter eine Konjugation über die 6-Aminogruppe der 6-Aminopenicillansäure auftreten, wie in EP-A-309,299 und de Leuw et al., 1997, offenbart ist. In solchen Fällen, in denen der β-Lactamring während der Konjugation intakt bleibt, weisen die Antikörper eine hohe Kreuzreaktivität mit den wichtigsten β-Lactamen der ersten Generation auf. Eine weitere potenzielle Konjugationsstelle für β-Lactam-Penicilline besteht über die α-Aminogruppe der D-α-Aminoacetamidogruppe des Penicillins, wie zum Beispiel in Nagakura et al., 1991, offenbart ist. Die in Nagakura et al., 1991, offenbarten Zelllinien, Abp4 und Abp7, betreffen Haptene und Konjugate unter Verwendung eines MBS (Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid)-Crosslinkers, und das Dokument folgert, dass eine der Zelllinien (Abp4) den Thiazolidinring erkennt, während die andere der Zelllinien (Abp7) die Acylseitenkette erkennt. Abp4 kreuzreagiert mit Penicillin G, 6-Aminopenicillansäure und bestimmten Cephalosporinen, während Abp7 hochspezifisch ist, wobei es wenig oder keine Kreuzreaktivität mit den wichtigsten β-Lactamen der ersten Generation aufweist. DE 4 013 004 betrifft die Verwendung von markierten Haptenen im ELISA.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Beschreibung der Konjugation eines neuen Haptens (Ampicillinderivats) an der α-Aminogruppe der D-α-Aminoacetamidogruppe des Penicillins an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial zur Bildung eines Immunogens. Sie beschreibt auch, wie gegen dieses Immunogen gebildete Antikörper bei der Entwicklung eines generischen Assays eingesetzt werden, der zum Testen von Milch und Fleisch und dergleichen auf das Vorliegen von β-Lactam-Antibiotika verwendet werden kann.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Ein erster erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Hapten bereit, umfassend ein 6-[D-α-Aminoacetamido]-Penicillinderivat, das an der α-Aminogruppe mit einem substituiertem oder unsubstituiertem Phenyldicarbaldehyd, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem Phthalaldehyd, substituiertem oder unsubstituiertem Isophthalaldehyd und substituiertem oder unsubstituiertem Terephthalaldehyd, vernetzt ist.
Ein repräsentatives 6-[D-α-Aminoacetamido]-Penicillinderivat weist die folgende Strukturformel auf:
und die Konjugationsstelle ist durch einen Pfeil identifiziert.
Der Phenyldicarbaldehyd stellt bevorzugt einen substituierten oder unsubstituierten Terephthalaldehyd, am bevorzugtesten einen unsubstituierten Terephthalaldehyd dar. Geeignete Substitutionen schließen die Addition von funktionellen Aldehyd-, Thioisocyanat- und N-Hydroxysuccinimid-Gruppen an den para- und ortho-Positionen ein.
Die Haptene werden durch Reaktion eines substituierten oder unsubstituierten Phenyldicarbaldehyds mit einem 6-[D-α-Aminoacetamido]-Penicillinderivat in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt, von dem Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid geeignete Beispiele darstellen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Immunogen, umfassend das erfindungsgemäße Hapten, das an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist. Das Trägermaterial stellt bevorzugt ein Protein, ein Proteinfragment, ein synthetisches Polypeptid oder ein semisynthetisches Polypeptid dar.
Ein noch weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft gegen das erfindungsgemäße Immonogen gebildete Antikörper, wobei die Antikörper zur Bindung mit mindestens einem strukturellen Epitop von einem intakten β-Lactamring fähig sind. Die Antikörper sind bevorzugt an ein Trägersubstrat fixiert.
Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Herstellung der Antikörper, wobei das Verfahren die Schritte des Immunisierens eines nicht humanen Tieres, bevorzugt eines Wirbeltieres, am bevorzugtesten eines Säugetieres, durch wiederholte Verabreichung eines erfindungsgemäßen Immunogens und Sammeln der sich ergebenden Serumantikörper aus dem immunisierten Tier umfasst. Das Verfahren umfasst bevorzugt weiter das Fixieren der genannten Serumantikörper an einem Trägersubstrat, bevorzugt einem festen Träger, am bevorzugtesten einem festen Träger aus Polystyrol. Die Antikörper sind bevorzugt polyklonal. Als Alternative sind die Antikörper monoklonal.
Ein noch weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfasst ein Konjugat, umfassend das erfindungsgemäße Hapten, das kovalent an ein nachweisbares Markierungsmittel gebunden ist. Das Markierungsmittel ist bevorzugt aus einem Enzym, einer lumineszierenden Substanz, einer radioaktiven Substanz oder einem Gemisch davon ausgewählt. Das Markierungsmittel stellt bevorzugt ein Enzym, bevorzugt eine Peroxidase, am bevorzugtesten Meerettich-Peroxidase (HRP) dar. Als Alterna tive oder zusätzlich kann die lumineszierende Substanz ein biolumineszierendes, chemilumineszierendes oder fluoreszierendes Material darstellen.
In einem noch weiteren erfindungsgemäßen Aspekt umfasst ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Menge an β-Lactam-Penicillinen in einer Probe, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Probe mit dem erfindungsgemäßen Konjugat oder einem Gemisch davon; und mit erfindungsgemäßen Antikörpern oder einem Gemisch davon; den Nachweis oder die Bestimmung der Menge an gebundenem Konjugat; und Ableitung von einer Kalibrationskurve das Vorliegen oder die Menge an β-Lactam-Penicillinen in der Probe umfasst.
Die Antikörper sind bevorzugt polyklonal.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt schließt ein Kit zum Nachweis oder zur Bestimmung der Menge an β-Lactam-Penicillinen ein, wobei das Kit das erfindungsgemäße Konjugat oder ein Gemisch davon und die erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Gemisch davon einschließt. Das Kit kann optional Anleitungen zur Anwendung von genanntem Konjugat/genannten Konjugaten und genannten Antikörpern zum Nachweis oder zur Bestimmung der Menge an β-Lactam-Penicillinen in einer Probe einschließen.
Die Probe stellt bevorzugt eine Lösung, wie zum Beispiel eine biologische Flüssigkeit, einschließlich Milch oder einen Schnitt aus zellulärem Gewebe, wie zum Beispiel Fleisch, dar.
Im erfindungsgemäßen Verfahren und Kit können die entsprechenden an der α-Aminoposition vernetzten Crosslinker (des Immunogens und des Konjugats) gleich oder verschieden sein.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt beinhaltet die Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate oder ein Gemisch davon mit den erfindungsgemäßen Antikörpern oder einem Gemisch davon zum Testen von Proben, wie zum Beispiel Milch und Fleisch zum Nachweis oder zur Bestimmung der Menge an β-Lactam-Antibiotika.
Gegenstand der Erfindung sind neue Haptene, die bei der Herstellung neuer Immunogene durch Konjugation an übliche Antigenität-verleihende Trägermaterialien eingesetzt werden. Das resultierende Immunogen wird dann an Tiere, bevorzugt Wirbeltierwirte, am bevorzugtesten Säugetierwirte, zur Auslösung der Produktion von aviden polyklonalen Antiseren verabreicht, die dann zur Entwicklung eines generischen Immunassays auf die β-Lactam-Penicilline verwendet werden, wobei ein Konjugat (ein Hapten-Markierungsmittel) oder ein Gemisch davon als das Nachweisreagenz eingesetzt wird.
Die chemische Struktur von Ampicillin und den anderen β-Lactam-Penicillinen ist in der folgenden Tabelle in Bezug auf die nachstehend dargelegte Strukturformel zusammengefasst:
Tabelle 1:
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Antikörpern, die für die gesamte Gruppe der β-Lactam-Penicilline spezifisch sind. Um diese breite Spezifität zu erreichen, wird das Ampicillin durch die Aminogruppe derivatisiert, wobei ein bifunktioneller Crosslinker, wie zum Beispiel ein substituierter oder unsubstituierter Phenyldicarbaldehyd, bevorzugt ein substituierter oder unsubstituierter Terephthalaldehyd (der unsubstituierte Terephthalaldehyd ist in 1 der beiliegenden Zeichnungen ersichtlich) eingesetzt wird. Der β-Lactamring von Ampicillin wird während der Derivatisierung zur Gewährleistung so konserviert, dass die der Penicillingruppe gemeinen Epitope beibehalten werden.
Obwohl das erfindungsgemäße Hapten (Ampicillin-Derivat) definierte strukturelle Epitope bereitstellt, ist es selbst nicht immunogen und muss deshalb an ein geeignetes Antigenität-verleihendes Trägermaterial dergestalt konjugiert werden, dass das auf diese Weise gebildete Immunogen eine immunogene Response auslöst, wenn es in ein Wirtstier injiziert wird. Geeignete Antigenität-verleihende Trägermaterialien schließen Proteine und Proteinfragmente, wie zum Beispiel Albumine, Serumproteine, wie z.B. Globuline, Augenlinsen-Proteine und Lipoproteine, ein.
Erläuternde Proteinträger schließen Rinderserumalbumin, Ei-Ovalbumin, bovines γ-Globulin, Thyroxin-bindendes Globulin, Keyhole-Limpet-Hämocyanin usw. ein. Als Alternative können synthetische Poly(aminosäuren) mit einer ausreichenden Anzahl an verfügbaren Amingruppen, wie zum Beispiel Lysin ebenso wie andere synthetische oder natürliche Polymermaterialien, die reaktive funktionelle Gruppen tragen, eingesetzt werden. Insbesondere können Kohlenhydrate, Hefen oder Polysaccharide zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Immunogens an das Hapten konjugiert werden.
Das Hapten (Ampicillin-Derivat) wird auch zur Herstellung eines Nachweisreagenzes zur Verwendung im Immunassay an ein Markierungsmittel, wie zum Beispiel ein Enzym (zum Beispiel an Meerettich-Peroxidase), eine fluoreszierende Substanz oder eine radioaktive Substanz, konjugiert. Die fluoreszierende Substanz kann zum Beispiel einen monovalenten Fluoreszeinrest oder ein Derivat davon darstellen.
Die Herstellung des Haptens und seine Konjugation entweder an das Trägermaterial oder an das Markierungsmittel (z.B. Enzym oder eine andere Markierung) wird gemäß dem in 1 dargelegten Reaktionsschema 1 durchgeführt. Ampicillin wird folglich zum Beispiel mit Terephthalaldehyd in Dimethylformamid 18 Stunden bei Raumtemperatur zur Herstellung einer intermediären Schiffschen Base zur Reaktion gebracht. Das Intermediät wird entweder mit dem Trägermaterial (zum Beispiel dem Rinderserumalbumin) oder mit dem Markierungsmittel (z.B. Enzym oder Markierung) in Acetatpuffer bei pH 4–5 zur Reaktion gebracht und dem schließt sich die Reduktion der Schiffschen Base mit zum Beispiel Natriumcyanborhydrid an, um entweder das erfindungsgemäße Immunogen bzw. das erfindungsgemäße Konjugat zu ergeben.
Zur Bestätigung, dass eine angemessene Konjugation von Hapten an das Trägermaterial erreicht wurde, wird vor der Immunisation jedes Immunogen unter Verwendung von Matrix-unterstützter UV-Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) bewertet. Im Fall des bevorzugten Trägermate rials, Rinderserumalbumin, sind mindestens 6 Moleküle Hapten pro Trägermolekül, bevorzugt.
Zur Bildung von polyklonalen Antiseren wird das Immunogen mit Freund's Adjuvans gemischt und das Gemisch wird in ein Wirtstier, wie zum Beispiel ein Kaninchen, ein Schaf, eine Maus, ein Meerschweinchen oder ein Pferd, injiziert. Weitere Injektionen (Booster) werden vorgenommen und es werden Serumproben zur Bewertung des Antikörpertiters entnommen. Wenn der optimale Titer erreicht wird, dann wird das Wirtstier geblutet, um ein geeignetes Volumen des spezifischen Antiserums zu ergeben. Der Grad der erforderlichen Antikörperreinigung hängt von der beabsichtigten Applikation ab. Für viele Zwecke besteht keinerlei Notwendigkeit zur Reinigung, in anderen Fällen, wenn der Antikörper zum Beispiel auf einem festen Träger immmobilisiert werden muss, können jedoch Reinigungsschritte zur Entfernung von unerwünschtem Material und zur Reduktion oder Elimination von nicht spezifischer Bindung vorgenommen werden.
Die gegen Ampicillin gebildeten Antikörper sind als Reagenzien in biochemischen Assays zur Bestimmung des Vorliegens von β-Lactam-Penicillinen in biologischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Milch und in Lebensmittelprodukten, wie zum Beispiel Fleisch, nützlich.
In den Zeichnungen –
betrifft 1 das Reaktionsschema 1, bei dem es sich im Allgemeinen um ein Reaktionsschema zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Haptens und seine sich anschließende Konjugation an entweder ein Trägermaterial oder ein Markierungsmittel zur Bildung eines erfindungsgemäßen Immunogens oder eines erfindungsgemäßen Konjugats handelt;
erläutert 2 schematisch einen kompetitiven ELISA-Titrationsassay auf einer Mikrotiterplatte;
stellt 3 eine Kalibrationskurve für einen kompetitiven ELISA dar; und
stellt 4 eine durch Einsetzen von jeweils jedem der β-Lactam-Penicilline als Standard in einem ELISA erstellte Kalibrationskurve dar.
BEISPIEL 1
Herstellung von Hapten
183 mg (1,364 mmol) Terephthalaldehyd wurden einer Lösung aus 500 mg (1,24 mmol) Ampicillin-Trihydrat in 10 ml Dimethylformamid bei 20°C unter Stickstoff zugefügt. Das Gemisch wurde vor Licht geschützt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Bestätigung, dass die Reaktion abgeschlossen war, wurde eine Dünnschichtchromatographie (DC) (80% Chloroform, 20% Methanol (v/v)) durchgeführt, die keine zurückgebliebenen Ausgangsmaterialien und die Bildung eines neuen Flecks, der weniger polar als Ampicillin war, aufwies. Die Hapten-Lösung wurde unter Stickstoff bei –20°C gelagert (1 Jahr stabil).
BEISPIEL 2
Herstellung von Immunogen (Hapten-Rinderserumalbumin)
Die in Beispiel 1 hergestellte Hapten-Lösung wurde einer Lösung aus 200 mg Rinderserumalbumin (BSA) in 10 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,1, tropfenweise zugefügt. Das Gemisch wurde vor Licht geschützt und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reduktion der Schiffschen Base wurde durch Zufügen von 30 mg Natriumcyanborhydrid erreicht. Das Gemisch wurde 90 min gerührt und 5 mg Natriumborhydrid wurden zugefügt. Nach dem Rühren für weitere 10 min wurde das Gemisch gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2, 24 Stunden bei 4°C (3 Wechsel) dialysiert. Der Grad der Hapten-Konjugation an BSA wurde anhand der MALDI-MS bewertet, die ein Konjugationsverhältnis von 6,3 Haptenmolekülen zu einem Molekül BSA zu erkennen gab.
BEISPIEL 3
Herstellung von Konjugat (Hapten-HRP)
Die Konjugation des Haptens von Beispiel 1 an HRP wurde auf ähnliche Weise wie die für die Herstellung des Immunogens vorgenommene durchgeführt. 40 μl der in Beispiel 1 hergestellten Hapten-Lösung wurden zu 20 mg HRP (Meerettich-Peroxidase) in 2 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer bei pH 4–5 gegeben. Das Gemisch wurde vor Licht geschützt und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Natriumcyanborhydrid (0,7 mg) wurde zugefügt und das Gemisch wurde 90 min gerührt. Das Konjugat wurde unter Verwendung von zwei PD-10-Säulen (Pharmacia Biotech) gereinigt und über Nacht vor Licht geschützt, gegen doppelt deionisiertes Wasser bei 2–8°C dialysiert.
BEISPIEL 4
Herstellung von gegen das Immunogen von Beispiel 2 gebildeten Antikörpern
Eine wässrige Lösung des Immunogens von Beispiel 2 wurde mit Freund's komplettem Adjuvans (FCA) zur Bildung einer Emulsion, bestehend aus 2 mg/ml Immunogen in 50% (v/v) FCA, formuliert. Mit dieser Emulsion wurden drei Schafe immunisiert, wobei an jeder von 4 Stellen in der Flanke eines jeden Tieres 0,25 ml subkutan injiziert wurden. Sich anschließende Immunisationen (Booster) enthielten 1 mg/ml in 50% (v/v) Freund's inkomplettem Adjuvans (FIA) emulgiertes Immunogen und wurden auf die gleiche Weise 1 Jahr lang in monatlichen Intervallen verabreicht. Blutproben wurden 7 bis 14 Tage nach jedem Booster entnommen. Jede Probe wurde zur Herstellung von Antiserum verarbeitet, das weiter durch Präzipitation mit Caprylsäure und Ammoniumsulfat gereinigt wurde, um eine Immunglobulin-G-Fraktion (IgG-Fraktion) zu ergeben. Die IgG-Fraktion wurde anhand des kompetitiven ELISA-Mikrotiterplatten-Assays wie nachstehend beschrieben bewertet.
BEISPIEL 5
Entwicklung eines kompetitiven ELISAs
Zur Bestimmung der optimalen Capture-Antikörper- und Konjugat-Konzentrationen (Ampicillin-HRP) wurde eine Checkerboard-Titration durchgeführt. Reihenverdünnungen von der IgG-Fraktion von jedem zu testenden Antiserum (Herstellung gemäß Beispiel 4) wurden in 10 mM Tris, pH 8,5, hergestellt. Die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte aus Polystyrol mit verstärkter Bindung wurden mit diesen Verdünnungen (wie in 2 ersichtlich) durch 2-stündige Inkubation bei 37°C (125 μl/Well) beschichtet. Die Platte wurde 4-mal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4), enthaltend Tween^TM 20 (TBST), gewaschen und durch Beklopfen getrocknet. 50 μl einer Ampicillin-Lösung (10 ng/ml; mittlerer Assay-Bereich) in TBST wurden den entsprechenden Wells (2) zugefügt. 50 μl TBST wurden den übrigen Wells (Kontrollen) zugefügt. Reihenverdünnungen vom Konjugat (Ampicillin-HRP) wurden in Tris-Puffer bei pH 7,2, enthaltend EDTA, D-Mannitol, Saccharose, Thimerosal und BSA, hergestellt, und 75 μl von jeder Verdünnung wurden den Wells, wie in 2 ersichtlich, zugefügt. Die Platte wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Das überschüssige ungebundene Konjugat wurde durch Waschen, 6-mal über eine 10-minütige Periode mit TBST, entfernt. 125 μl Tetramethylbenzidin-Substratlösung (TMB-Substratlösung) wurden jedem Well der Platte zugefügt, die dann 15 bis 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Zufügen von 125 μl 0,2 M H₂SO₄ zu jedem Well abgebrochen. Danach wurde die Absorption bei 450 nm unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts gemessen. Eine Verdünnung von 1/1000 des Capture-Antikörpers in Kombination mit einer Verdünnung von 1/15000 des Konjugats führte zu einer zulässigen oberen Absorption von 2,15 und einem signifikanten Abfall der Absorption der Antigenkonzentrationen zwischen 0 und 10 ng/ml von 80%.
Eine Mikrotiterplatte wurde dann mit der IgG-Fraktion von Antiampicillin-Antiserum bei der optimalen Beschichtungsverdünnung von 1/1000 in Tris, pH 8,5, wie vorstehend umrissen, beschichtet. Standardlösungen aus Ampicillin (Natriumsalz) wurden in TBST hergestellt und in den folgenden Konzentrationen appliziert: 0, 1, 5, 10, 50, 100, 200, 500 ng/ml. Die erfassten Daten führten zur in 3 erläuterten empfindlichen Kalibrationskurve, worin B die bei 450 nm gemessene Absorption für xng/ml Ampicillin und B₀ die bei 450 nm für 0 ng/ml Ampicillin gemessene Absorption darstellt.
BEISPIEL 6
Kreuzreaktivität des Ampicilin-Immunassays mit jedem der β-Lactam-Penicilline
Standardlösungen aus Benzylpenicillin (Penicillin G – PenG), Amoxycillin (Amox), Cloxacillin (Clox), Dicloxacillin (Diclox) und Oxacillin (Oxa) wurden in TBST bei 0, 1, 5, 10, 50, 100, 200 und 500 ng/ml hergestellt. Die Kalibrationskurven wurden erfasst, wobei jeder der β-Lactam-Penicillin-Standards im Ampicillin-Immunassay (4) eingesetzt wurde und diese wurden zur Bestimmung der Kreuzreaktivität des Immunassays mit jedem Penicillin verwendet. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 2 ersichtlich, wobei die Kreuzreaktivität gemäß der folgenden Formel berechnet wurde: CR(%) = IC50Amp/IC50Pen × 100worin CR (%) die Kreuzreaktivität in Prozent darstellt, IC50_Amp die Konzentration von Ampicillin, die zu einer 50%igen Signalverschiebung führt, darstellt und IC50_Pen die Konzentration von β-Lactam-Penicillin darstellt, für die die CR (%) bewertet wird, die zu einer 50%igen Signalverschiebung führt.
Der Ampicillin-Immunassay wies einen hohen Kreuzaktivitätsgrad mit jedwedem der β-Lactam-Penicilline auf (Tabelle 2). Unter einem hohen Kreuzreaktivi tätsgrad versteht man eine Kreuzreaktivität von größer als 35% im Vergleich zu 100% für Ampicillin. Der vorliegende Immunassay ist für Ampicillin (100% CR), Amoxycillin (87% CR) und Benzylpenicillin (72% CR) am spezifischsten. Da die empfohlenen Maximalkonzentrationen (MRL) für Amoxycillin, Ampicillin und Benzylpenicillin in Milch jeweils 4 μg/kg und für Oxacillin, Cloxacillin und Dicloxacillin jeweils 30 μg/kg betragen, geben die für jedes der β-Lactam-Penicilline bestimmten IC50-Werte zu erkennen, dass der beschriebene ELISA zur Verwendung als ein generischer Immunassay auf β-Lactam-Antibiotika gemäß EG-Richtlinien 2377/90 geeignet ist.
Tabelle 2:
Beispiel 7
Qualitative Analyse von β-Lactam-Antibiotika in Milch unter Einsatz des generischen Immunassays
Eine Reihe von Milchproben wurden auf das Vorliegen von β-Lactam-Antibiotika unter Verwendung antimikrobieller Standardverfahren getestet. Diese Proben mit zugeordneten Werten wurden dann unter Verwendung des vorliegenden ELISAs getestet. Mikrotiterplatten wurden beschichtet und Reagenzien wurden wie in Beispiel 5 beschrieben angesetzt. Das Immunassay-Verfahren wurde wie folgt angepasst. Eine 1%ige Lösung aus Milchpuffer bei pH 7,4 wurde durch Auflösen von Magermilchpulver in destilliertem Wasser hergestellt und 25 μl dieses Puffers wurden den Wells der Platte zugefügt. Nach dem Zufügen des Milchpuffers wurden Ampicillin-Standards (25 μl pro Well) zugegeben, gefolgt von Milchproben (25 μl pro Well). Sowohl Standards als auch Proben wurden in Doppelbestimmung durchgeführt. Dann wurde das Konjugat (Ampicillin-HRP) zugefügt (75 μl pro Well) und die Mikrotiterplatte 2 Stunden bei 37°C zum Herbeiführen der kompetitiven Reaktion inkubiert. Nach der kompetitiven Reaktion wurde die Platte gewaschen und unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 5 beschrieben entwickelt. Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 3 ersichtlich, die die berechneten Konzentrationen für eine Reihe von Milchproben zeigt, die anhand des beschriebenen generischen ß-Lactam-ELISAs getestet wurden. Der beschriebene β-Lactam-ELISA wurde zum Testen bekannter negativer Milchproben auf das Vorliegen von β-Lactamen (Proben 1–6) ebenso wie für bestätigte β-Lactam-positive Proben (Proben 7 und 8) verwendet. Die ELISA-Ergebnisse bestätigen, dass die auf den β-Lactam-Antibiotika-Gehalt getesteten Proben 1–6 negativ sind und dass die Proben 7 und 8 positiv sind (siehe Tabelle 3).
Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse des ELISAs weisen darauf hin, dass der Immunassay zum Screening von Milchproben auf das Vorliegen von β-Lactamen erfolgreich verwendet werden kann. Anhand des ELISAs getestete negative Proben wurden als negativ und bekannte positive Proben als positiv bestätigt.
Tabelle 3:
Bibliographie

Faghihi Shirazi M., Hung TV., Womersley DM., 1991. Polyclonal antibodies reactive to some Beta-Lactam antibiotics. Australian Journal of Dairy Technology, 46(2), 88–90.
De Haan P., de Jonge A. J. R, Verbrugge T. und Boorsma D. M., 1985. Three epitope specific monoclonal antibodies against the hapten penicillin. Int. Arch. Allergy Appl Immun. 76: 42–46.
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Nagakura N., Souma S., Shimizu T., Yanagihara Y., 1991. Anti-ampicillin monoclonal antibodies and their cross-reactivities to various β-lactams. J. of Antimicrobial Chemotherapy 28: 357–368.
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Claims

Hapten, umfassend ein 6-[D-α-Aminoacetamido]-Penicillinderivat, das an der α-Aminogruppe mit einem substituierten oder unsubstituierten Phenyldicarbaldehyd, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem Phthalaldehyd, substituiertem oder unsubstituiertem Isophthalaldehyd und substituiertem oder unsubstituiertem Terephthalaldehyd, vernetzt ist.
Hapten nach Anspruch 1, worin der Phenyldicarbaldehyd einen substituierten oder unsubstituierten Terephthalaldehyd, bevorzugt einen unsubstituierten Terephthalaldehyd darstellt.
Verfahren zur Herstellung eines Haptens nach Anspruch 1 oder 2, worin ein substituierter oder unsubstituierter Phenyldicarbaldehyd mit einem 6-[D-α-Aminoacetamido]-Penicillinderivat in einem geeigneten Lösungsmittel zur Reaktion gebracht wird.
Immunogen, umfassend ein Hapten nach Anspruch 1 oder 2, das an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist.
Immunogen nach Anspruch 4, worin das Trägermaterial ein Protein, ein Proteinfragment, ein synthetisches Polypeptid oder ein semisynthetisches Polypeptid darstellt.
Antikörper, gebildet gegen ein Immunogen nach Anspruch 4 oder 5, worin die Antikörper zur Bindung mit mindestens einem strukturellen Epitop von einem intakten ββ-Lactamring fähig sind.
Antikörper nach Anspruch 6, worin die Antikörper auf einem Trägersubstrat fixiert sind.
Verfahren zur Herstellung der Antikörper nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Verfahren die Schritte des Immunisierens eines nicht humanen Tieres durch wiederholte Verabreichung eines Immunogens nach Anspruch 4 oder 5 und des Sammelns der sich ergebenden Serumantikörper aus dem immunisierten Tier umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Verfahren weiter das Fixieren der genannten Serumantikörper an einem Trägersubstrat umfasst.
Konjugat, umfassend ein Hapten nach Anspruch 1 oder 2, das kovalent an ein nachweisbares Markierungsmittel gebunden ist.
Konjugat nach Anspruch 10, worin das Markierungsmittel aus einem Enzym ausgewählt ist, das bevorzugt eine Peroxidase, am bevorzugtesten Meerrettich-Peroxidase; eine lumineszierende Substanz, die bevorzugt aus einer biolumineszierenden, chemilumineszierenden oder fluoreszierenden Substanz ausgewählt ist; eine radioaktive Substanz; oder ein Gemisch davon darstellt.
Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Menge an β-Lactam-Penicillinen in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren der Probe mit einem Konjugat nach Anspruch 10 oder 11 oder einem Gemisch davon, und mit Antikörpern nach Anspruch 6 oder 7 oder einem Gemisch davon; Nachweis oder Bestimmung der Menge an gebundenem Konjugat; und Ableitung von einer Kalibrationskurve das Vorliegen oder die Menge an β-Lactam-Penicillinen in der Probe.
Kit zum Nachweis oder zur Bestimmung der Menge an β-Lactam-Penicillinen, wobei das Kit ein Konjugat nach Anspruch 10 oder 11 oder ein Gemisch davon und Antikörper nach Anspruch 6 oder 7 oder ein Gemisch davon einschließt.