JP2002003500A - Lsdと2−オキソ−3−ヒドロキシ−lsdのイムノアッセイ - Google Patents
Lsdと2−オキソ−3−ヒドロキシ−lsdのイムノアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】新規LSDおよびイソ-LSD、酸化LSDの新規ハプテ
ンおよび免疫原、該免疫原から誘導される抗体、ならび
に該抗体を利用するイムノアッセイ法を提供する。 【解決手段】LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの検出の
ためのイムノアッセイで使用される抗原、抗体および試
薬の調製に有用なハプテン誘導体を提供する。2-オキシ
LSD核をインドール窒素から誘導体化し、アミノアルキ
ル誘導体を形成する。続いて生じたハプテンを適当な免
疫原性基または標識基に連結するための官能基化位置で
さらに修飾し、LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの両方
に対して実質的に同等の特異性を有するイムノアッセイ
用の試薬を提供する。
ンおよび免疫原、該免疫原から誘導される抗体、ならび
に該抗体を利用するイムノアッセイ法を提供する。 【解決手段】LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの検出の
ためのイムノアッセイで使用される抗原、抗体および試
薬の調製に有用なハプテン誘導体を提供する。2-オキシ
LSD核をインドール窒素から誘導体化し、アミノアルキ
ル誘導体を形成する。続いて生じたハプテンを適当な免
疫原性基または標識基に連結するための官能基化位置で
さらに修飾し、LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの両方
に対して実質的に同等の特異性を有するイムノアッセイ
用の試薬を提供する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、2-オキソ-3-ヒド
ロキシ-リセルグ酸ジエチルアミド(LSD)のカルボキシ
アルキル誘導体と、抗体産生の刺激用の免疫原を調製す
るためのこれらの誘導体の使用とに関する。本発明によ
り産生される抗体は、LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
を測定するためのイムノアッセイにおいて有用である。
本発明はまた、抗体スクリーニング法に関する。
ロキシ-リセルグ酸ジエチルアミド(LSD)のカルボキシ
アルキル誘導体と、抗体産生の刺激用の免疫原を調製す
るためのこれらの誘導体の使用とに関する。本発明によ
り産生される抗体は、LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
を測定するためのイムノアッセイにおいて有用である。
本発明はまた、抗体スクリーニング法に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】LSD
の化学構造は、9,10-ジデヒドロ-N,N-ジエチル-6-メチ
ルエルゴリン-8β-カルボキサミドであり、次式:
の化学構造は、9,10-ジデヒドロ-N,N-ジエチル-6-メチ
ルエルゴリン-8β-カルボキサミドであり、次式:
【化5】 で示される。LSDは、非常に強力な幻覚剤であり、典型
的な投与範囲は25〜150μgである。この薬物は、急速か
つ広範な代謝を受け、実際にヒトの尿では親薬物の約1
%が***されるのみである(Poch, G.K.ら、J. Chromat
ogr. B724, 23-33,1999)。可能な代謝的変換は、リセ
ルグ酸への加水分解、N-デスメチル-LSD(ノル-LSD)へ
のN-脱メチル化、および2-オキソ-LDSおよび2-オキソ-3
-ヒドロキシ-LSDへの酸化である。イソリセルギックジ
エチルアミド(イソ-LSD)は、LSD合成の副産物であ
り、街で売られているLSD中の混入物質として存在する
ために、しばしばLSD使用者の尿中に検出される。イソ-
LSDの構造は、次式:
的な投与範囲は25〜150μgである。この薬物は、急速か
つ広範な代謝を受け、実際にヒトの尿では親薬物の約1
%が***されるのみである(Poch, G.K.ら、J. Chromat
ogr. B724, 23-33,1999)。可能な代謝的変換は、リセ
ルグ酸への加水分解、N-デスメチル-LSD(ノル-LSD)へ
のN-脱メチル化、および2-オキソ-LDSおよび2-オキソ-3
-ヒドロキシ-LSDへの酸化である。イソリセルギックジ
エチルアミド(イソ-LSD)は、LSD合成の副産物であ
り、街で売られているLSD中の混入物質として存在する
ために、しばしばLSD使用者の尿中に検出される。イソ-
LSDの構造は、次式:
【化6】 で示される。
【0003】LSDは尿中に排出される親薬物の濃度が非
常に低いため、尿で検出することが最も困難な濫用薬物
の1つである。2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDは、LSDより
4〜40倍高い濃度でLSD使用者の尿中に存在することが
わかり、薬物摂取後LSDより長期にわたり検出しうる、
最近同定されたLSDの代謝産物である(Reuschel, S. A.
ら、J. Anal. Toxicol. 23, 306-312, 1999:Verstraet
e, A. G., Van de Velde, E. J., Annual Society of F
orensic Toxicologists Meeting Scientific Session,
Albuquerque, NM, October 5-9, 1998)。
常に低いため、尿で検出することが最も困難な濫用薬物
の1つである。2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDは、LSDより
4〜40倍高い濃度でLSD使用者の尿中に存在することが
わかり、薬物摂取後LSDより長期にわたり検出しうる、
最近同定されたLSDの代謝産物である(Reuschel, S. A.
ら、J. Anal. Toxicol. 23, 306-312, 1999:Verstraet
e, A. G., Van de Velde, E. J., Annual Society of F
orensic Toxicologists Meeting Scientific Session,
Albuquerque, NM, October 5-9, 1998)。
【0004】他の濫用薬物の試験において、イムノアッ
セイ、特に競合的結合イムノアッセイが、特に有利であ
ることが証明されている。競合的結合イムノアッセイで
は、生物サンプル中のアナライトが、アナライトおよび
アナライト類似体に対して特異的な抗体上の限定された
数の受容体結合部位について、標識試薬、またはアナラ
イト類似体、またはトレーサーと競合する。β−ガラク
トシダーゼやペルオキシダーゼのような酵素、フルオレ
セイン化合物のような蛍光性分子、および125Iのような
放射性化合物が、トレーサーとして使用される常用標識
物質である。サンプル中のアナライトの濃度は、抗体に
結合するアナライト類似体の量を決定する。アナライト
とアナライト類似体は、それぞれの濃度に比例して抗体
に結合するため、結合するアナライト類似体の量は、サ
ンプル中のアナライト濃度に反比例する。次に遊離のま
たは結合したアナライト類似体の量を、使用した特定の
標識に適した方法により測定できる。
セイ、特に競合的結合イムノアッセイが、特に有利であ
ることが証明されている。競合的結合イムノアッセイで
は、生物サンプル中のアナライトが、アナライトおよび
アナライト類似体に対して特異的な抗体上の限定された
数の受容体結合部位について、標識試薬、またはアナラ
イト類似体、またはトレーサーと競合する。β−ガラク
トシダーゼやペルオキシダーゼのような酵素、フルオレ
セイン化合物のような蛍光性分子、および125Iのような
放射性化合物が、トレーサーとして使用される常用標識
物質である。サンプル中のアナライトの濃度は、抗体に
結合するアナライト類似体の量を決定する。アナライト
とアナライト類似体は、それぞれの濃度に比例して抗体
に結合するため、結合するアナライト類似体の量は、サ
ンプル中のアナライト濃度に反比例する。次に遊離のま
たは結合したアナライト類似体の量を、使用した特定の
標識に適した方法により測定できる。
【0005】現在利用可能なLSDの市販のイムノアッセ
イ法では、LSDに特異的であって2-オキソ-3-ヒドロキシ
-LSDとの交差反応性が低いモノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体を使用する。例えば、EMIT(Syva Com
pany)、CEDIA(MicrogenicsCorporation)およびKIMS
(Roche Diagnostics)イムノアッセイ中の2-オキソ-3-
ヒドロキシ-LSDの交差反応性は、それぞれ1.7、1.8およ
び11%である(Verstraete, A. G.、同上)。また本発
明者らの知る限り、本明細書に記載した本発明よりも前
に報告された、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDに特異的な
モノクローナル抗体は存在しない。
イ法では、LSDに特異的であって2-オキソ-3-ヒドロキシ
-LSDとの交差反応性が低いモノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体を使用する。例えば、EMIT(Syva Com
pany)、CEDIA(MicrogenicsCorporation)およびKIMS
(Roche Diagnostics)イムノアッセイ中の2-オキソ-3-
ヒドロキシ-LSDの交差反応性は、それぞれ1.7、1.8およ
び11%である(Verstraete, A. G.、同上)。また本発
明者らの知る限り、本明細書に記載した本発明よりも前
に報告された、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDに特異的な
モノクローナル抗体は存在しない。
【0006】ハプテンは、部分的または不完全な抗原で
ある。これらは、タンパク質を含まない物質であり、主
に低分子量物質からなり、これらは抗体形成を刺激する
ことができないが、抗体と反応する。抗体は、ハプテン
を高分子量担体に結合させ、この結合産物をヒトまたは
動物に注入することにより形成される。ハプテンの例
は、ジゴキシンやテオフィリンのような治療薬、モルヒ
ネやLSDのような濫用薬物、ゲンタマイシンやバンコマ
イシンのような抗生物質、エストロゲンやプロゲステロ
ンのようなホルモン、ビタミンB12や葉酸のようなビタ
ミン、チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、アドレナ
リンなどを含む。
ある。これらは、タンパク質を含まない物質であり、主
に低分子量物質からなり、これらは抗体形成を刺激する
ことができないが、抗体と反応する。抗体は、ハプテン
を高分子量担体に結合させ、この結合産物をヒトまたは
動物に注入することにより形成される。ハプテンの例
は、ジゴキシンやテオフィリンのような治療薬、モルヒ
ネやLSDのような濫用薬物、ゲンタマイシンやバンコマ
イシンのような抗生物質、エストロゲンやプロゲステロ
ンのようなホルモン、ビタミンB12や葉酸のようなビタ
ミン、チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、アドレナ
リンなどを含む。
【0007】
【課題を解決するための手段】活性化ハプテンとは、誘
導体コンジュゲートを合成するための連結基の結合など
により、反応のために利用し得る部位が提供されたハプ
テン誘導体を意味するものである。
導体コンジュゲートを合成するための連結基の結合など
により、反応のために利用し得る部位が提供されたハプ
テン誘導体を意味するものである。
【0008】本明細書において担体という用語は、ハプ
テンと結合することにより該ハプテンを免疫応答を刺激
し得るものとする免疫原性物質(通常、タンパク質)で
ある。担体物質には、外来として認識され宿主の免疫応
答を誘発するタンパク質、糖タンパク質、複合多糖、お
よび核酸がある。
テンと結合することにより該ハプテンを免疫応答を刺激
し得るものとする免疫原性物質(通常、タンパク質)で
ある。担体物質には、外来として認識され宿主の免疫応
答を誘発するタンパク質、糖タンパク質、複合多糖、お
よび核酸がある。
【0009】本明細書で使用される免疫原および免疫原
性であるという用語は、生物中で免疫応答を起こし得る
物質を意味する。
性であるという用語は、生物中で免疫応答を起こし得る
物質を意味する。
【0010】誘導体という用語は、1以上の化学反応に
より親化合物または分子から作成される化学的化合物ま
たは分子を意味する。
より親化合物または分子から作成される化学的化合物ま
たは分子を意味する。
【0011】連結基は活性化のため、すなわちハプテン
を合成するために利用し得る薬物誘導体上の部位を提供
するために使用される。連結基の使用は、具体的なハプ
テンと担体との組合せに依存して、有利または必要であ
る場合も、そうではない場合もある。リンカーという用
語は、ハプテンを担体、免疫原、標識、トレーサー、ま
たは別のリンカーに連結する化学的部分を意味する。リ
ンカーは、直鎖状または分枝状、飽和または不飽和の炭
素鎖でもよい。これらはまた、鎖内または鎖の末端で1
以上のヘテロ原子を含有してもよい。ヘテロ原子とは、
酸素、窒素およびイオウよりなる群から選択される炭素
以外の原子を意味する。
を合成するために利用し得る薬物誘導体上の部位を提供
するために使用される。連結基の使用は、具体的なハプ
テンと担体との組合せに依存して、有利または必要であ
る場合も、そうではない場合もある。リンカーという用
語は、ハプテンを担体、免疫原、標識、トレーサー、ま
たは別のリンカーに連結する化学的部分を意味する。リ
ンカーは、直鎖状または分枝状、飽和または不飽和の炭
素鎖でもよい。これらはまた、鎖内または鎖の末端で1
以上のヘテロ原子を含有してもよい。ヘテロ原子とは、
酸素、窒素およびイオウよりなる群から選択される炭素
以外の原子を意味する。
【0012】本明細書において検出体分子、標識または
トレーサーとは、担体物質または分子に結合させてアナ
ライトの検出に使用できる同定用のタグをいう。標識は
直接的に、または連結部分もしくは架橋部分により間接
的に担体物質に結合してもよい。標識の例には、β−ガ
ラクトシダーゼやペルオキシダーゼのような酵素、ロー
ダミンやフルオレセインイソチオシアネート(FITC)の
ような蛍光性化合物、ジオキセタンやルシフェリンのよ
うな発光物質、および125Iのようなラジオアイソトープ
がある。
トレーサーとは、担体物質または分子に結合させてアナ
ライトの検出に使用できる同定用のタグをいう。標識は
直接的に、または連結部分もしくは架橋部分により間接
的に担体物質に結合してもよい。標識の例には、β−ガ
ラクトシダーゼやペルオキシダーゼのような酵素、ロー
ダミンやフルオレセインイソチオシアネート(FITC)の
ような蛍光性化合物、ジオキセタンやルシフェリンのよ
うな発光物質、および125Iのようなラジオアイソトープ
がある。
【0013】ペプチドは、アミド(ペプチド)結合によ
る2個以上のアミノ酸の結合によって生成されるあらゆ
る化合物であり、通常、線状の鎖中でNH2末端を除いた
各アミノ酸残基のα−アミノ基が次の残基のα−カルボ
キシル基に結合しているα-アミノ酸のポリマーであ
る。ペプチド、ポリペプチドおよびポリ(アミノ酸)と
いう用語は、大きさについては限定せずにこのクラスの
化合物を同義に意味するのに使用される。このクラスの
最も大きいメンバーは、タンパク質と呼ばれる。
る2個以上のアミノ酸の結合によって生成されるあらゆ
る化合物であり、通常、線状の鎖中でNH2末端を除いた
各アミノ酸残基のα−アミノ基が次の残基のα−カルボ
キシル基に結合しているα-アミノ酸のポリマーであ
る。ペプチド、ポリペプチドおよびポリ(アミノ酸)と
いう用語は、大きさについては限定せずにこのクラスの
化合物を同義に意味するのに使用される。このクラスの
最も大きいメンバーは、タンパク質と呼ばれる。
【0014】本明細書において、酸化LSDとは、2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDおよび2-オキソ-LSDを意味する。
ソ-3-ヒドロキシ-LSDおよび2-オキソ-LSDを意味する。
【0015】本発明は、次式:
【化7】 [式中、R1とR2は、独立してHとCON(CH2CH3)2よりなる群
から選択されるが、ただし、R1とR2の少なくとも1つは
Hであり;R3はHまたはOHであり;R4は、0〜2個の不飽和
結合と0〜6個のヘテロ原子とともに1〜10個の炭素原子
を有する分枝状または直鎖状連結基であり;R5は、COR6
とNHR7よりなる群から選択され、ここでR6は、OH、Lま
たはLXであり、R7は、H、LまたはLXであり、ここでL
は、連結基であり、Xは、Lを介して結合した検出体分子
または担体分子である]で示される新規LSDおよびイソ-L
SDハプテンを提供する。
から選択されるが、ただし、R1とR2の少なくとも1つは
Hであり;R3はHまたはOHであり;R4は、0〜2個の不飽和
結合と0〜6個のヘテロ原子とともに1〜10個の炭素原子
を有する分枝状または直鎖状連結基であり;R5は、COR6
とNHR7よりなる群から選択され、ここでR6は、OH、Lま
たはLXであり、R7は、H、LまたはLXであり、ここでL
は、連結基であり、Xは、Lを介して結合した検出体分子
または担体分子である]で示される新規LSDおよびイソ-L
SDハプテンを提供する。
【0016】本発明はまた、LSDおよびLSDコンジュゲー
トと高い交差反応性を示す2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
免疫原から誘導される新規抗体を開示する。本発明の別
の態様において、該新規抗体およびLSDコンジュゲート
を使用して、尿中の2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDとLSDを
検出するための競合的イムノアッセイ法が提供される。
トと高い交差反応性を示す2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
免疫原から誘導される新規抗体を開示する。本発明の別
の態様において、該新規抗体およびLSDコンジュゲート
を使用して、尿中の2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDとLSDを
検出するための競合的イムノアッセイ法が提供される。
【0017】
【発明の実施の形態】本発明は、酸化LSDの新規ハプテ
ンおよび免疫原、該免疫原から誘導される抗体、ならび
に該抗体を利用するイムノアッセイ法に関する。LSDか
ら2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDへの酸化は、当該分野で
公知の方法を修飾して達成される(Troxler, F., Hofma
nn, A., Helv. Chim. Acta 42, 793, 1959)。これらの
方法において、LSD塩は、2当量の次亜塩素酸塩、好まし
くは次亜塩素酸カルシウムを用いて、水と水混合性有機
溶媒(好ましくはアセトニトリル)の混合物中で処理さ
れる。反応は、-10〜30℃、好ましくは0℃〜5℃の温度
で0.5〜2時間行われる。反応混合物を塩基性pHに調整
し、生成物を有機溶媒中に抽出する。好ましくは中性ア
ルミナ上でのカラムクロマトグラフィーにより精製す
る。2-オキソ-LSDは、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDを酢
酸中で亜鉛で還元する(Troxler, F.同上)か、またはL
SDをN-ブロモスクシンイミドで制御酸化すること(Sidd
ik, Z.ら、Biochemical Pharmacology 28, 3081, 197
9)により得ることができる。
ンおよび免疫原、該免疫原から誘導される抗体、ならび
に該抗体を利用するイムノアッセイ法に関する。LSDか
ら2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDへの酸化は、当該分野で
公知の方法を修飾して達成される(Troxler, F., Hofma
nn, A., Helv. Chim. Acta 42, 793, 1959)。これらの
方法において、LSD塩は、2当量の次亜塩素酸塩、好まし
くは次亜塩素酸カルシウムを用いて、水と水混合性有機
溶媒(好ましくはアセトニトリル)の混合物中で処理さ
れる。反応は、-10〜30℃、好ましくは0℃〜5℃の温度
で0.5〜2時間行われる。反応混合物を塩基性pHに調整
し、生成物を有機溶媒中に抽出する。好ましくは中性ア
ルミナ上でのカラムクロマトグラフィーにより精製す
る。2-オキソ-LSDは、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDを酢
酸中で亜鉛で還元する(Troxler, F.同上)か、またはL
SDをN-ブロモスクシンイミドで制御酸化すること(Sidd
ik, Z.ら、Biochemical Pharmacology 28, 3081, 197
9)により得ることができる。
【0018】インドール窒素(すなわち、N-1位)でア
ルキル化した酸化LSDの新規ハプテン誘導体は、ハロゲ
ン原子の反対側の末端に保護された官能基を含む2官能
性ハロアルキルリンカーを使用して、穏やかな条件下で
調製される。好適な保護官能基の例は、保護されたアミ
ンおよびカルボン酸である。2官能性ハロアルキルリン
カーのいくつかの好適な例は、ヨード酪酸エチルおよび
N-ヨードプロピルフタルイミドである。2官能性ハロア
ルキルリンカーの他の例は、当業者には容易に明らかで
あろう。塩基の存在下で酸化LSDのピロリドン窒素でハ
ロゲン原子を置換することにより、アルキル化が容易に
行われる。クラウンエーテルの存在下でアルカリ金属炭
酸塩を塩基として使用するこのアルキル化について、驚
くほど穏やかな反応条件が見いだされている。好適なア
ルカリ金属炭酸塩/クラウンエーテルの組合せは、炭酸
カリウムおよび18-クラウン-6である。この反応は、添
加するクラウンエーテルの量が、炭酸カリウムの量と等
モルであるかまたはそれ以上である場合に最も好ましい
ことが見出されている。すなわち、触媒的な量以上が必
要である。この反応は、両性非プロトン性溶媒、好まし
くはジメチルホルムアミド(DMF)中で、20〜100℃、好
ましくは50〜70℃の温度範囲で1〜24時間行われる。次
に、アルキル化生成物は単離され、保護基は、酸化LSD
に副作用を及ぼさない条件下で、連結基から除去され
る。そのような条件の例は、水酸化リチウムでケン化し
て、アルキルエステルを除去して遊離カルボン酸を生成
するか、またはメチルアミン処理を行ってフタルイミド
保護基を除去して遊離アミンを生成する。
ルキル化した酸化LSDの新規ハプテン誘導体は、ハロゲ
ン原子の反対側の末端に保護された官能基を含む2官能
性ハロアルキルリンカーを使用して、穏やかな条件下で
調製される。好適な保護官能基の例は、保護されたアミ
ンおよびカルボン酸である。2官能性ハロアルキルリン
カーのいくつかの好適な例は、ヨード酪酸エチルおよび
N-ヨードプロピルフタルイミドである。2官能性ハロア
ルキルリンカーの他の例は、当業者には容易に明らかで
あろう。塩基の存在下で酸化LSDのピロリドン窒素でハ
ロゲン原子を置換することにより、アルキル化が容易に
行われる。クラウンエーテルの存在下でアルカリ金属炭
酸塩を塩基として使用するこのアルキル化について、驚
くほど穏やかな反応条件が見いだされている。好適なア
ルカリ金属炭酸塩/クラウンエーテルの組合せは、炭酸
カリウムおよび18-クラウン-6である。この反応は、添
加するクラウンエーテルの量が、炭酸カリウムの量と等
モルであるかまたはそれ以上である場合に最も好ましい
ことが見出されている。すなわち、触媒的な量以上が必
要である。この反応は、両性非プロトン性溶媒、好まし
くはジメチルホルムアミド(DMF)中で、20〜100℃、好
ましくは50〜70℃の温度範囲で1〜24時間行われる。次
に、アルキル化生成物は単離され、保護基は、酸化LSD
に副作用を及ぼさない条件下で、連結基から除去され
る。そのような条件の例は、水酸化リチウムでケン化し
て、アルキルエステルを除去して遊離カルボン酸を生成
するか、またはメチルアミン処理を行ってフタルイミド
保護基を除去して遊離アミンを生成する。
【0019】遊離カルボキシル基またはアミン末端を有
する脱保護したN-1-アルキル化酸化LSDは、コンジュゲ
ートの調製に直接使用し得る。例えばカルボキシル連結
基を有する酸化LSDは、アミド結合の形成のための当該
分野で公知の縮合試薬を使用して、担体、標識またはト
レーサー上のアミンに結合してもよい。同様にアミン基
は、担体、標識またはトレーサー上のカルボキシル基に
結合してもよい。しかし、遊離カルボキシルまたはアミ
ン末端を有するN-1-アルキル化酸化LSDを、第2の連結
基に結合させることが特に好ましい。この第2の連結基
は、当該分野で公知の種々のヘテロ2官能性またはホモ
2官能性リンカーでもよい。例えば、カルボキシル基で
終わる第1の連結基の場合、第2の連結基の例は、PCT
公報WO90/15798に記載のマレイミドアルキルアミン、お
よびアミノ酸である。これらのアミンを含有する第2の
連結基は、典型的にはアミド結合の形成のために当該分
野で公知の多くの縮合試薬の任意の1つを使用して、第
1のリンカー上のカルボキシル基と反応させる。第1の
リンカーがアミンで終わる場合、好適な第2のリンカー
の例は、テレフタル酸ジ-N-ヒドロキシスクシンイミド
エステル、1,1'-ビフェニル-4,4'-ジ-N-ヒドロキシスク
シンイミド、4-イソチオシアネート-ベンゾイルクロリ
ド、3-マレイミドプロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル(MPS)、S-アセチルチオプロピオン酸-N-
ヒドロキシスクシンイミド(SATP)である。N-ヒドロキ
シスクシンイミドエステル第2リンカーは、典型的には
第1のリンカーを含有するアミンと、穏やかな条件下で
直接反応させる。
する脱保護したN-1-アルキル化酸化LSDは、コンジュゲ
ートの調製に直接使用し得る。例えばカルボキシル連結
基を有する酸化LSDは、アミド結合の形成のための当該
分野で公知の縮合試薬を使用して、担体、標識またはト
レーサー上のアミンに結合してもよい。同様にアミン基
は、担体、標識またはトレーサー上のカルボキシル基に
結合してもよい。しかし、遊離カルボキシルまたはアミ
ン末端を有するN-1-アルキル化酸化LSDを、第2の連結
基に結合させることが特に好ましい。この第2の連結基
は、当該分野で公知の種々のヘテロ2官能性またはホモ
2官能性リンカーでもよい。例えば、カルボキシル基で
終わる第1の連結基の場合、第2の連結基の例は、PCT
公報WO90/15798に記載のマレイミドアルキルアミン、お
よびアミノ酸である。これらのアミンを含有する第2の
連結基は、典型的にはアミド結合の形成のために当該分
野で公知の多くの縮合試薬の任意の1つを使用して、第
1のリンカー上のカルボキシル基と反応させる。第1の
リンカーがアミンで終わる場合、好適な第2のリンカー
の例は、テレフタル酸ジ-N-ヒドロキシスクシンイミド
エステル、1,1'-ビフェニル-4,4'-ジ-N-ヒドロキシスク
シンイミド、4-イソチオシアネート-ベンゾイルクロリ
ド、3-マレイミドプロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル(MPS)、S-アセチルチオプロピオン酸-N-
ヒドロキシスクシンイミド(SATP)である。N-ヒドロキ
シスクシンイミドエステル第2リンカーは、典型的には
第1のリンカーを含有するアミンと、穏やかな条件下で
直接反応させる。
【0020】ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
の場合、ジ置換生成物よりモノ置換生成物の形成を促進
する条件下で反応が行われる。例えば酸化LSD N-1-リン
カーアミンをジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
に滴下して加えると、モノ置換が促進される。酸化LSD
に第2のリンカーを結合させると、第2のリンカー上に
新しい末端官能基が現れる。ジ-N-ヒドロキシスクシン
イミドエステル第2リンカーの場合は、新しい末端官能
基は、単にモノ置換により得られる未反応N-ヒドロキシ
スクシンイミドエステルである。この後者の基は、直接
縮合により担体、標識およびトレーサー上のアミン基に
結合し、アミド結合を形成することができる。同様に末
端リンカー基がイソチオシアネートである場合、担体、
標識およびトレーサー上のアミン基への直接結合はこの
段階で行われて、チオ尿素結合を形成する。
の場合、ジ置換生成物よりモノ置換生成物の形成を促進
する条件下で反応が行われる。例えば酸化LSD N-1-リン
カーアミンをジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
に滴下して加えると、モノ置換が促進される。酸化LSD
に第2のリンカーを結合させると、第2のリンカー上に
新しい末端官能基が現れる。ジ-N-ヒドロキシスクシン
イミドエステル第2リンカーの場合は、新しい末端官能
基は、単にモノ置換により得られる未反応N-ヒドロキシ
スクシンイミドエステルである。この後者の基は、直接
縮合により担体、標識およびトレーサー上のアミン基に
結合し、アミド結合を形成することができる。同様に末
端リンカー基がイソチオシアネートである場合、担体、
標識およびトレーサー上のアミン基への直接結合はこの
段階で行われて、チオ尿素結合を形成する。
【0021】MPSと同様に新しい末端官能基がマレイミ
ドである場合、担体、標識およびトレーサー上のチオー
ル基への付加により結合が達成されてチオエーテル結合
が形成される。チオール基は、担体、標識およびトレー
サーに存在するものであっても、SATPのようなチオール
化剤により導入されてもよい。
ドである場合、担体、標識およびトレーサー上のチオー
ル基への付加により結合が達成されてチオエーテル結合
が形成される。チオール基は、担体、標識およびトレー
サーに存在するものであっても、SATPのようなチオール
化剤により導入されてもよい。
【0022】新しい官能基がSATPと同様にチオールまた
は保護されたチオールである場合、チオールを直接結合
するか、脱保護の後でマレイミド修飾免疫原または標識
と結合する。当業者にはさらに多くのリンカーの化学が
明らかであろうが、これらは単に例示のために示したも
のである。ホモ2官能性およびヘテロ2官能性連結基の
総括的な処理、ならびにアミンおよびカルボン酸への結
合のための反応条件については、Bioconjugate Techniq
ues, G. Hermanson, Academic Press (1995)を参照され
たい。
は保護されたチオールである場合、チオールを直接結合
するか、脱保護の後でマレイミド修飾免疫原または標識
と結合する。当業者にはさらに多くのリンカーの化学が
明らかであろうが、これらは単に例示のために示したも
のである。ホモ2官能性およびヘテロ2官能性連結基の
総括的な処理、ならびにアミンおよびカルボン酸への結
合のための反応条件については、Bioconjugate Techniq
ues, G. Hermanson, Academic Press (1995)を参照され
たい。
【0023】好適な実施形態において、本発明の免疫原
を調製する場合、免疫原性を有する担体ポリ(アミノ
酸)または他の物質を、活性化ハプテンに結合させる。
ウシチログロブリンは特に好適な抗原性ポリ(アミノ
酸)または担体タンパク質であるが、任意のタンパク質
担体(アルブミン、血清タンパク質、例えばグロブリ
ン、水晶体タンパク質、リポタンパク質などを含む)が
利用できることを理解されたい。タンパク質担体の例に
は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ
血清アルブミン、卵オボアルブミン、ウシガンマグロブ
リンなどがある。あるいは合成ポリ(アミノ酸)が利用
でき、反応性官能基を有する他の合成または天然のポリ
マー性物質も利用できる。特に、炭水化物、酵母、また
は多糖をハプテンに結合させて免疫原を産生してもよ
い。
を調製する場合、免疫原性を有する担体ポリ(アミノ
酸)または他の物質を、活性化ハプテンに結合させる。
ウシチログロブリンは特に好適な抗原性ポリ(アミノ
酸)または担体タンパク質であるが、任意のタンパク質
担体(アルブミン、血清タンパク質、例えばグロブリ
ン、水晶体タンパク質、リポタンパク質などを含む)が
利用できることを理解されたい。タンパク質担体の例に
は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ
血清アルブミン、卵オボアルブミン、ウシガンマグロブ
リンなどがある。あるいは合成ポリ(アミノ酸)が利用
でき、反応性官能基を有する他の合成または天然のポリ
マー性物質も利用できる。特に、炭水化物、酵母、また
は多糖をハプテンに結合させて免疫原を産生してもよ
い。
【0024】ハプテン誘導体はまた、当該分野で公知の
方法により多様なトレーサー、検出体分子または標識分
子に結合して、種々のイムノアッセイフォーマットで有
用な多様な試薬を提供することができる。検出のために
は、蛍光団(例えば、フルオレセイン)のような検出体
分子を結合させて、トレーサー、または放射性標識もし
くは化学発光基を産生することができる。ハプテンは、
分光測光法または直接の光学的検出フォーマット(例え
ば、ラテックス凝集またはクロマトグラフィーストリッ
プ試験)で使用される微粒子(着色ラテックスを含む)
に結合させることができる。結合した基はまた、間接的
検出体分子(例えば、エネルギー転移パートナー、酵素
またはさらなる化学反応により検出される他の基)でも
よい。
方法により多様なトレーサー、検出体分子または標識分
子に結合して、種々のイムノアッセイフォーマットで有
用な多様な試薬を提供することができる。検出のために
は、蛍光団(例えば、フルオレセイン)のような検出体
分子を結合させて、トレーサー、または放射性標識もし
くは化学発光基を産生することができる。ハプテンは、
分光測光法または直接の光学的検出フォーマット(例え
ば、ラテックス凝集またはクロマトグラフィーストリッ
プ試験)で使用される微粒子(着色ラテックスを含む)
に結合させることができる。結合した基はまた、間接的
検出体分子(例えば、エネルギー転移パートナー、酵素
またはさらなる化学反応により検出される他の基)でも
よい。
【0025】本発明において2-オキソ-3-ヒドロキシ-LS
Dハプテン誘導体は活性化され、タンパク質(例えば、B
SAまたはBTGのような担体タンパク質)に結合されて、
免疫原を生成する。さらにこれらの担体基は、イムノア
ッセイのための試薬(すなわち、ハプテンを固体マトリ
ックスに結合するためのつなぎ鎖)を生成するか、また
は標識−コンジュゲートを生成する標識基(微粒子、放
射性標識など)を生成するのに使用される。標識−コン
ジュゲートは、抗体への結合に関して薬物と競合するイ
ムノアッセイまたはELISAマイクロタイタープレートア
ッセイの試薬として使用される。標識−コンジュゲート
は、例えば特定のアッセイフォーマットではマイクロタ
イターアッセイプレートを被覆するために使用できる。
Dハプテン誘導体は活性化され、タンパク質(例えば、B
SAまたはBTGのような担体タンパク質)に結合されて、
免疫原を生成する。さらにこれらの担体基は、イムノア
ッセイのための試薬(すなわち、ハプテンを固体マトリ
ックスに結合するためのつなぎ鎖)を生成するか、また
は標識−コンジュゲートを生成する標識基(微粒子、放
射性標識など)を生成するのに使用される。標識−コン
ジュゲートは、抗体への結合に関して薬物と競合するイ
ムノアッセイまたはELISAマイクロタイタープレートア
ッセイの試薬として使用される。標識−コンジュゲート
は、例えば特定のアッセイフォーマットではマイクロタ
イターアッセイプレートを被覆するために使用できる。
【0026】抗体を作成するために、凍結乾燥した免疫
原を再水和して免疫原の溶液または懸濁液を形成するこ
とにより、免疫原を宿主動物への注射用に都合よく調製
する。次に免疫原溶液を、フロイントアジュバントのよ
うなアジュバントと合わせる。免疫原は、多くの部位
に、複数回用量で、1回またはそれ以上の回数、数週間
にわたって投与しうる。
原を再水和して免疫原の溶液または懸濁液を形成するこ
とにより、免疫原を宿主動物への注射用に都合よく調製
する。次に免疫原溶液を、フロイントアジュバントのよ
うなアジュバントと合わせる。免疫原は、多くの部位
に、複数回用量で、1回またはそれ以上の回数、数週間
にわたって投与しうる。
【0027】免疫原を使用するポリクローナル抗体の調
製は、当業者に公知の任意の従来法に従って行う。通
常、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、またはウマの
ような宿主動物に免疫原混合物を注射する。最適の力価
に達するまで血清の抗体力価を評価しながら、さらに注
射を行う。次に宿主動物から採血し、適量の特異的抗血
清を得る。所望の場合は精製工程を行って、抗血清がア
ッセイの実施に使用するのに適するとみなされるまで、
好ましくない物質(例えば、非特異的抗体)を除去す
る。
製は、当業者に公知の任意の従来法に従って行う。通
常、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、またはウマの
ような宿主動物に免疫原混合物を注射する。最適の力価
に達するまで血清の抗体力価を評価しながら、さらに注
射を行う。次に宿主動物から採血し、適量の特異的抗血
清を得る。所望の場合は精製工程を行って、抗血清がア
ッセイの実施に使用するのに適するとみなされるまで、
好ましくない物質(例えば、非特異的抗体)を除去す
る。
【0028】モノクローナル抗体は、例えばMethods in
Enzymology 73 (パートB), pp. 3-46, 1981に記載の方
法のようなポリエチレングリコール法を使用して、前記
のように免疫したマウスリンパ球とミエローマ細胞とを
ハイブリダイズさせて得ることができる。
Enzymology 73 (パートB), pp. 3-46, 1981に記載の方
法のようなポリエチレングリコール法を使用して、前記
のように免疫したマウスリンパ球とミエローマ細胞とを
ハイブリダイズさせて得ることができる。
【0029】本発明の免疫原を使用して産生した抗体
は、好ましくは、LSDおよび2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
に対して実質的に同等の交差反応性を有する。実質的に
同等の交差反応性とは、2つの成分のうちの1つ(すな
わちLSDまたは2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD)に対する抗
体の反応性を100%に設定する場合、もう一方の化合物
(すなわち、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDまたはLSD)に
対する交差反応性は50%を超え、好ましくは70%を超え
ることを意味する。例えば2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
に対して100%の反応性を有する抗体は、LSDに対して好
ましくは50%を超え、さらに好ましくは70%を超える交
差反応性を有するであろう。同抗体の反応性を100%に
設定すると、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDに対する交差
反応性は100%を超える(故に好ましい場合は150%まで
となる)であろう。
は、好ましくは、LSDおよび2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
に対して実質的に同等の交差反応性を有する。実質的に
同等の交差反応性とは、2つの成分のうちの1つ(すな
わちLSDまたは2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD)に対する抗
体の反応性を100%に設定する場合、もう一方の化合物
(すなわち、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDまたはLSD)に
対する交差反応性は50%を超え、好ましくは70%を超え
ることを意味する。例えば2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
に対して100%の反応性を有する抗体は、LSDに対して好
ましくは50%を超え、さらに好ましくは70%を超える交
差反応性を有するであろう。同抗体の反応性を100%に
設定すると、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDに対する交差
反応性は100%を超える(故に好ましい場合は150%まで
となる)であろう。
【0030】これらの抗体は好ましくは、サンプル中の
LSDおよび/または2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの検出に
使用しうる。
LSDおよび/または2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの検出に
使用しうる。
【0031】
【実施例】以下の例で使用されるローマ数字は、図1、
2および3の対応する化学構造模式図を意味する。
2および3の対応する化学構造模式図を意味する。
【0032】実施例1.D-リセルグ酸ジエチルアミド
(I)の合成 500mlの無水ジメチルホルムアミド(DMF)中の10.0g
(0.037mol)のd-リセルグ酸の混合物を、9.0gのカル
ボニルジイミダゾールでアルゴン下で処理し、室温で1
時間攪拌した。次に反応物を38mlのジエチルアミンで処
理して室温で一晩攪拌した。反応物を減圧下で濃縮し
た。残渣を500mlの塩化メチレンに取り、500mlの水で洗
浄した。不溶性物質をろ過して除去し、層を分離させ
た。有機部分を250mlの飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、800
gのシリカゲルで塩化メチレン中3%メタノールを使用
してクロマトグラフィーを行って、溶媒を留去後9.0g
(75%)のd-リセルグ酸ジエチルアミド(LSD)を淡褐
色の無定形固体として得た。
(I)の合成 500mlの無水ジメチルホルムアミド(DMF)中の10.0g
(0.037mol)のd-リセルグ酸の混合物を、9.0gのカル
ボニルジイミダゾールでアルゴン下で処理し、室温で1
時間攪拌した。次に反応物を38mlのジエチルアミンで処
理して室温で一晩攪拌した。反応物を減圧下で濃縮し
た。残渣を500mlの塩化メチレンに取り、500mlの水で洗
浄した。不溶性物質をろ過して除去し、層を分離させ
た。有機部分を250mlの飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、800
gのシリカゲルで塩化メチレン中3%メタノールを使用
してクロマトグラフィーを行って、溶媒を留去後9.0g
(75%)のd-リセルグ酸ジエチルアミド(LSD)を淡褐
色の無定形固体として得た。
【0033】実施例2.2-オキソ-3-ヒドロキシ-d-リセ
ルグ酸ジエチルアミド(II)の合成 5mlのアセトニトリル中の500mg(1.55mmol)のLSDの溶
液を氷浴で冷却し、25mlの水中の354mgのl-酒石酸溶液
で処理した。442mgの次亜塩素酸カルシウムを25mlの水
で処理し激しく攪拌して、次亜塩素酸カルシウムの溶液
を調製した。白濁した溶液を0.45μmのMillex-HVフィル
ターでろ過し、次に氷浴で冷却した。これをLSD−酒石
酸溶液に加え、反応物を0℃〜5℃で45分間攪拌した。
反応物を200mlの飽和重炭酸ナトリウム溶液で希釈し、
6×250mlのクロロホルムで抽出した。クロロホルム抽
出物を合わせ、減圧下で濃縮した。残渣を500gの中性
アルミナで1リットルの塩化メチレン中5%メタノール
を使用してクロマトグラフィーを行って前面に移動する
不純物を除去し、次に塩化メチレン中10%のメタノール
で生成物を溶出して、溶媒を留去後160mg(29%)の褐
色固体を得た。
ルグ酸ジエチルアミド(II)の合成 5mlのアセトニトリル中の500mg(1.55mmol)のLSDの溶
液を氷浴で冷却し、25mlの水中の354mgのl-酒石酸溶液
で処理した。442mgの次亜塩素酸カルシウムを25mlの水
で処理し激しく攪拌して、次亜塩素酸カルシウムの溶液
を調製した。白濁した溶液を0.45μmのMillex-HVフィル
ターでろ過し、次に氷浴で冷却した。これをLSD−酒石
酸溶液に加え、反応物を0℃〜5℃で45分間攪拌した。
反応物を200mlの飽和重炭酸ナトリウム溶液で希釈し、
6×250mlのクロロホルムで抽出した。クロロホルム抽
出物を合わせ、減圧下で濃縮した。残渣を500gの中性
アルミナで1リットルの塩化メチレン中5%メタノール
を使用してクロマトグラフィーを行って前面に移動する
不純物を除去し、次に塩化メチレン中10%のメタノール
で生成物を溶出して、溶媒を留去後160mg(29%)の褐
色固体を得た。
【0034】実施例3.N-(3-ヨードプロピル)フタル
イミド(III)の合成 1.2リットルのアセトン中50.0g(0.187mol)のN-(3-
ブロモプロピル)フタルイミドの溶液を、208.5gのヨ
ウ化カリウムで処理し、室温で4日間攪拌した。反応物
をろ過し、ろ液を4リットルのエーテルで希釈した。次
にこれをセライトでろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して
黄色の固体とした。これをヘキサンから再結晶して、4
6.5g(79%)のオフホワイトの固体を得た。
イミド(III)の合成 1.2リットルのアセトン中50.0g(0.187mol)のN-(3-
ブロモプロピル)フタルイミドの溶液を、208.5gのヨ
ウ化カリウムで処理し、室温で4日間攪拌した。反応物
をろ過し、ろ液を4リットルのエーテルで希釈した。次
にこれをセライトでろ過した。ろ液を減圧下で濃縮して
黄色の固体とした。これをヘキサンから再結晶して、4
6.5g(79%)のオフホワイトの固体を得た。
【0035】実施例4.N-1-(3-フタルイミドプロピル)
-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD(IV)の合成 30mlの無水DMF中の2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの600mg
(1.69mmol)の溶液を、600mg(4.34mmol)の無水炭酸
カリウム、600mg(1.9mmol)のN-(3-ヨードプロピル)
フタルイミド、および1.9g(7.19mmol)の18-クラウン
-6で処理した。反応物を60℃で45分間攪拌した。反応物
を減圧下で濃縮し、塩化メチレンに溶解し、8×200ml
の水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で
濃縮した。残渣を100gのシリカゲルで塩化メチレン中
5%メタノールを使用してクロマトグラフィーを行って
前面に移動する不純物を除去し、次に塩化メチレン中10
%メタノールで生成物を溶出して、溶媒を留去後467mg
(51%)の黄色の固体を得た。
-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD(IV)の合成 30mlの無水DMF中の2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの600mg
(1.69mmol)の溶液を、600mg(4.34mmol)の無水炭酸
カリウム、600mg(1.9mmol)のN-(3-ヨードプロピル)
フタルイミド、および1.9g(7.19mmol)の18-クラウン
-6で処理した。反応物を60℃で45分間攪拌した。反応物
を減圧下で濃縮し、塩化メチレンに溶解し、8×200ml
の水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で
濃縮した。残渣を100gのシリカゲルで塩化メチレン中
5%メタノールを使用してクロマトグラフィーを行って
前面に移動する不純物を除去し、次に塩化メチレン中10
%メタノールで生成物を溶出して、溶媒を留去後467mg
(51%)の黄色の固体を得た。
【0036】実施例5.N-1-(3-アミノプロピル)-2-オ
キソ-3-ヒドロキシ-LSD(V)の合成 367mg(0.68mmol)の1-(3-フタルイミドプロピル)-2-オ
キソ-3-ヒドロキシ-LSDをアルゴン下で、30mlの2Mメ
チルアミンのメタノール液で処理し、室温で3時間攪拌
した。反応物を減圧下で濃縮した。残渣を30gのシリカ
ゲルで塩化メチレン中30%メタノールを使用してクロマ
トグラフィーを行って前面に移動する不純物を除去し、
次に2%トリエチルアミン/30%メタノール/68%塩化
メチレンを使用して生成物を溶出して、溶媒を留去後13
8mg(49%)の黄色の無定形の固体を得た。
キソ-3-ヒドロキシ-LSD(V)の合成 367mg(0.68mmol)の1-(3-フタルイミドプロピル)-2-オ
キソ-3-ヒドロキシ-LSDをアルゴン下で、30mlの2Mメ
チルアミンのメタノール液で処理し、室温で3時間攪拌
した。反応物を減圧下で濃縮した。残渣を30gのシリカ
ゲルで塩化メチレン中30%メタノールを使用してクロマ
トグラフィーを行って前面に移動する不純物を除去し、
次に2%トリエチルアミン/30%メタノール/68%塩化
メチレンを使用して生成物を溶出して、溶媒を留去後13
8mg(49%)の黄色の無定形の固体を得た。
【0037】実施例6.テレフタール酸ジ-N-ヒドロキ
シスクシンイミドエステル(VI)の合成 15g(73.8mmol)のテレフタロイルクロリドに300mlの
塩化メチレンを加え、溶液を約10分間0℃で冷却した。
この溶液に、30gのN-ヒドロキシスクシンイミド、次に
30mlのトリエチルアミンを滴下して加えた。混合物を0
℃で1時間攪拌し、室温で48時間攪拌した。反応混合物
をろ過し、残渣を200mlの塩化メチレンで洗浄した。洗
浄後の固形分を300mlの塩化メチレンに再懸濁し、室温
で10分間攪拌した。さらにその固形分をろ過し真空下で
乾燥して、24.1g(67mmol、90%)の生成物を得た。
シスクシンイミドエステル(VI)の合成 15g(73.8mmol)のテレフタロイルクロリドに300mlの
塩化メチレンを加え、溶液を約10分間0℃で冷却した。
この溶液に、30gのN-ヒドロキシスクシンイミド、次に
30mlのトリエチルアミンを滴下して加えた。混合物を0
℃で1時間攪拌し、室温で48時間攪拌した。反応混合物
をろ過し、残渣を200mlの塩化メチレンで洗浄した。洗
浄後の固形分を300mlの塩化メチレンに再懸濁し、室温
で10分間攪拌した。さらにその固形分をろ過し真空下で
乾燥して、24.1g(67mmol、90%)の生成物を得た。
【0038】実施例7.N-1-(3-[4-(スクシンイミド
キシカルボニル)-フェニル-1-カルボニルアミノ]-プ
ロピル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD(VII)の合成 20mlの無水テトラヒドロフラン中の41mg(0.114mmol)
のテレフタル酸ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルの溶液を、アルゴン下で、10mlの無水テトラヒドロフ
ランと0.2mlのトリエチルアミン中の47mg(0.114mmol)
の1-(3-アミノプロピル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
の溶液を30分かけて滴下して加えて処理した。反応物を
室温で一晩攪拌した。反応物を減圧下で濃縮した。残渣
を5gのシリカゲルで酢酸エチルを使用してクロマトグ
ラフィーを行って前面に移動する不純物を除去し、次に
蒸留したテトラヒドロフランを使用して生成物を溶出し
て、溶媒を留去後40mg(53%)の黄褐色の固体を得た。
キシカルボニル)-フェニル-1-カルボニルアミノ]-プ
ロピル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD(VII)の合成 20mlの無水テトラヒドロフラン中の41mg(0.114mmol)
のテレフタル酸ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルの溶液を、アルゴン下で、10mlの無水テトラヒドロフ
ランと0.2mlのトリエチルアミン中の47mg(0.114mmol)
の1-(3-アミノプロピル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
の溶液を30分かけて滴下して加えて処理した。反応物を
室温で一晩攪拌した。反応物を減圧下で濃縮した。残渣
を5gのシリカゲルで酢酸エチルを使用してクロマトグ
ラフィーを行って前面に移動する不純物を除去し、次に
蒸留したテトラヒドロフランを使用して生成物を溶出し
て、溶媒を留去後40mg(53%)の黄褐色の固体を得た。
【0039】実施例8.2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD免
疫原(VIII)の合成 4.5mlの50mMリン酸カリウム(pH7.5)中の270mgのウシ
チログロブリン(BTG)の溶液を氷浴中で冷却した。こ
の溶液に15mlのジメチルスルホキシド(DMSO)を滴下し
て加え、反応温度を室温以下に維持した。このタンパク
質溶液に、1mlのDMF中の40mg(0.062mmol)の2-オキソ
-3-ヒドロキシ-LSDモノフェニルNHSエステル誘導体(VI
I)の溶液を滴下して加えた。混合物を室温で18時間攪
拌した。生じたコンジュゲートを透析チューブ(カット
オフ50,000MW)に入れ、50mMリン酸カリウム(pH7.5)
中の2リットルの70%DMSO[3回交換、各少なくとも3
時間]、50mMリン酸カリウム中の2リットルの50%DMSO
[少なくとも3時間]、50mMリン酸カリウム中の2リッ
トルの30%DMSO[少なくとも3時間]、50mMリン酸カリ
ウム中の10%DMSO[少なくとも3時間]で室温で透析
し、次に4℃の50mMリン酸カリウム(pH7.5)で6回交
換して透析した(各2リットルで、各少なくとも6時
間)。Bioradクマシーブループロテインアッセイ(Brad
ford, M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976))を使用し
て、タンパク質濃度は6.84mg/mlと測定された。総量35m
lの2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD BTG免疫原を調製した。
利用可能なリジン修飾の程度は、TNBS法により60%であ
ると測定された。Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14, 32
8-34 (1988)。
疫原(VIII)の合成 4.5mlの50mMリン酸カリウム(pH7.5)中の270mgのウシ
チログロブリン(BTG)の溶液を氷浴中で冷却した。こ
の溶液に15mlのジメチルスルホキシド(DMSO)を滴下し
て加え、反応温度を室温以下に維持した。このタンパク
質溶液に、1mlのDMF中の40mg(0.062mmol)の2-オキソ
-3-ヒドロキシ-LSDモノフェニルNHSエステル誘導体(VI
I)の溶液を滴下して加えた。混合物を室温で18時間攪
拌した。生じたコンジュゲートを透析チューブ(カット
オフ50,000MW)に入れ、50mMリン酸カリウム(pH7.5)
中の2リットルの70%DMSO[3回交換、各少なくとも3
時間]、50mMリン酸カリウム中の2リットルの50%DMSO
[少なくとも3時間]、50mMリン酸カリウム中の2リッ
トルの30%DMSO[少なくとも3時間]、50mMリン酸カリ
ウム中の10%DMSO[少なくとも3時間]で室温で透析
し、次に4℃の50mMリン酸カリウム(pH7.5)で6回交
換して透析した(各2リットルで、各少なくとも6時
間)。Bioradクマシーブループロテインアッセイ(Brad
ford, M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976))を使用し
て、タンパク質濃度は6.84mg/mlと測定された。総量35m
lの2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD BTG免疫原を調製した。
利用可能なリジン修飾の程度は、TNBS法により60%であ
ると測定された。Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14, 32
8-34 (1988)。
【0040】実施例9.1,1'-ビフェニル-4,4'-ジ-N-ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル(IX)の合成 480mlの無水テトラヒドロフラン中の24.0g(0.1mol)
の1,1'-ビフェニル-4,4'-ジカルボン酸の混合物を、60m
lの塩化オキザリルで処理し、次に0.24mlの無水DMFで処
理し、室温で10分間攪拌し、次に90分加熱還流した。反
応物を減圧下で濃縮して黄色の固体を得た。これを200m
lの無水テトラヒドロフラン中に取り、減圧下で濃縮し
た。この工程をさらに2回繰り返し、残存する塩化オキ
ザリルを排除した。生成物をエーテルで粉砕し、吸引ろ
過して25.6g(93%)の1,1'-ビフェニル-4,4'-ジカル
ボニルクロリドを黄色の固体として得た。
ドロキシスクシンイミドエステル(IX)の合成 480mlの無水テトラヒドロフラン中の24.0g(0.1mol)
の1,1'-ビフェニル-4,4'-ジカルボン酸の混合物を、60m
lの塩化オキザリルで処理し、次に0.24mlの無水DMFで処
理し、室温で10分間攪拌し、次に90分加熱還流した。反
応物を減圧下で濃縮して黄色の固体を得た。これを200m
lの無水テトラヒドロフラン中に取り、減圧下で濃縮し
た。この工程をさらに2回繰り返し、残存する塩化オキ
ザリルを排除した。生成物をエーテルで粉砕し、吸引ろ
過して25.6g(93%)の1,1'-ビフェニル-4,4'-ジカル
ボニルクロリドを黄色の固体として得た。
【0041】500mlの無水塩化メチレン中の11.5g(0.0
4mol)の1,1'-ビフェニル-4,4'-ジカルボニルクロリド
を、25.0g(0.22mol)のN-ヒドロキシスクシンイミド
で処理し、次に25mlのトリエチルアミンで処理し、室温
で一晩攪拌した。生じた固体を吸引ろ過して集めて、1
1.58gの白色の固体を得た。ろ液を減圧下で濃縮して褐
色の固体とした。これを塩化メチレンで1時間攪拌して
粉砕し、次に5.56gの白色の固体を集めた。こうして1
7.14g(95%)の複合収率を得た。
4mol)の1,1'-ビフェニル-4,4'-ジカルボニルクロリド
を、25.0g(0.22mol)のN-ヒドロキシスクシンイミド
で処理し、次に25mlのトリエチルアミンで処理し、室温
で一晩攪拌した。生じた固体を吸引ろ過して集めて、1
1.58gの白色の固体を得た。ろ液を減圧下で濃縮して褐
色の固体とした。これを塩化メチレンで1時間攪拌して
粉砕し、次に5.56gの白色の固体を集めた。こうして1
7.14g(95%)の複合収率を得た。
【0042】実施例10.4-イソチオシアネートベンゾイ
ルクロリドの合成 500mg(2.79mmol)の4-カルボキシフェニルイソチオシ
アネートと5mlの塩化チオニルの混合物を、6時間還流
した。反応混合物を減圧下で濃縮し、生じた黄褐色の固
体を、ポンプで一晩高真空下にした。この固体を少量の
ヘキサンで粉砕して、吸引ろ過して集めて516mg(93
%)の生成物をオフホワイトの固体として得た。
ルクロリドの合成 500mg(2.79mmol)の4-カルボキシフェニルイソチオシ
アネートと5mlの塩化チオニルの混合物を、6時間還流
した。反応混合物を減圧下で濃縮し、生じた黄褐色の固
体を、ポンプで一晩高真空下にした。この固体を少量の
ヘキサンで粉砕して、吸引ろ過して集めて516mg(93
%)の生成物をオフホワイトの固体として得た。
【0043】実施例11.N-1-(3-[4-イソチオシアネー
トフェニル-1-カルボニルアミノ]-プロピル)-2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDの合成 15mlの無水テトラヒドロフラン中の1.0mmolの4-イソチ
オシアネートベンゾイルクロリドの溶液を、アルゴン下
で0℃に冷却し、10mlの無水テトラヒドロフラン中の1.
0mmolの1-(3-アミノプロピル)-2-オキソ-3-ヒドロキ
シ-LSDの溶液で処理した。反応物を1.0mmolのトリエチ
ルアミンで処理し、0℃で30分間、次に室温で一晩攪拌
した。反応物を減圧下で濃縮した。残渣を塩化メチレン
に溶解し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、
減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルで塩化メチレン中
10%メタノールでクロマトグラフィーを行って、所望の
生成物を得た。
トフェニル-1-カルボニルアミノ]-プロピル)-2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDの合成 15mlの無水テトラヒドロフラン中の1.0mmolの4-イソチ
オシアネートベンゾイルクロリドの溶液を、アルゴン下
で0℃に冷却し、10mlの無水テトラヒドロフラン中の1.
0mmolの1-(3-アミノプロピル)-2-オキソ-3-ヒドロキ
シ-LSDの溶液で処理した。反応物を1.0mmolのトリエチ
ルアミンで処理し、0℃で30分間、次に室温で一晩攪拌
した。反応物を減圧下で濃縮した。残渣を塩化メチレン
に溶解し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、
減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルで塩化メチレン中
10%メタノールでクロマトグラフィーを行って、所望の
生成物を得た。
【0044】実施例12.N-1-(3-[4'-スクシンイミド
オキシカルボニル-1,1'-ビフェニル-4-カルボニルアミ
ノ]プロピル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD(XII)の
合成 70mlの無水テトラヒドロフラン中の146mg(0.33mmol)
の1,1'-ビフェニル-4,4'-ジ-N-ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル(XI)の溶液をアルゴン下で、25mlの無水テ
トラヒドロフランと0.55mlのトリエチルアミン中の138m
g(0.33mmol)の1-(3-アミノプロピル)-2-オキソ-3-
ヒドロキシ-LSDの溶液を30分かけて滴下して加えて処理
した。反応物を室温で一晩攪拌した。反応物を減圧下で
濃縮した。残渣を20gのシリカゲルで酢酸エチルを使用
してクロマトグラフィーを行って、前面に移動する不純
物を除去し、次に蒸留テトラヒドロフランで生成物を溶
出して、溶媒を留去後90mg(37%)の黄褐色の固体を得
た。
オキシカルボニル-1,1'-ビフェニル-4-カルボニルアミ
ノ]プロピル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD(XII)の
合成 70mlの無水テトラヒドロフラン中の146mg(0.33mmol)
の1,1'-ビフェニル-4,4'-ジ-N-ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル(XI)の溶液をアルゴン下で、25mlの無水テ
トラヒドロフランと0.55mlのトリエチルアミン中の138m
g(0.33mmol)の1-(3-アミノプロピル)-2-オキソ-3-
ヒドロキシ-LSDの溶液を30分かけて滴下して加えて処理
した。反応物を室温で一晩攪拌した。反応物を減圧下で
濃縮した。残渣を20gのシリカゲルで酢酸エチルを使用
してクロマトグラフィーを行って、前面に移動する不純
物を除去し、次に蒸留テトラヒドロフランで生成物を溶
出して、溶媒を留去後90mg(37%)の黄褐色の固体を得
た。
【0045】実施例13.1-(3-フタルイミドプロピル)-2
-オキソ-LSDの合成 20mlの無水DMF中の1.0mmolの2-オキソ-LSDの溶液を、2.
6mmolの無水炭酸カリウム、1.2mmolのN-(3-ヨードプロ
ピル)フタルイミドおよび4.0mmolの18-クラウン-6で処
理する。反応物を60℃で45分間攪拌する。反応物を減圧
下で濃縮し、塩化メチレンに溶解し、10×100mlの水で
洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮す
る。残渣をシリカゲルで塩化メチレン中5%メタノール
でクロマトグラフィーを行って前面に移動する不純物を
除去し、次に塩化メチレン中10%メタノールで生成物を
溶出して所望の生成物を得る。
-オキソ-LSDの合成 20mlの無水DMF中の1.0mmolの2-オキソ-LSDの溶液を、2.
6mmolの無水炭酸カリウム、1.2mmolのN-(3-ヨードプロ
ピル)フタルイミドおよび4.0mmolの18-クラウン-6で処
理する。反応物を60℃で45分間攪拌する。反応物を減圧
下で濃縮し、塩化メチレンに溶解し、10×100mlの水で
洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮す
る。残渣をシリカゲルで塩化メチレン中5%メタノール
でクロマトグラフィーを行って前面に移動する不純物を
除去し、次に塩化メチレン中10%メタノールで生成物を
溶出して所望の生成物を得る。
【0046】実施例14.1-(3-アミノプロピル)-2-オ
キソ-LSDの合成 1.0mmolの1-(3-フタルイミドプロピル)-2-オキソ-LSDを
アルゴン下で、メタノール中50mlの2Mメチルアミンで
処理し、室温で3時間攪拌する。反応物を減圧下で濃縮
する。残渣を50gのシリカゲルで塩化メチレン中30%メ
タノールを使用してクロマトグラフィーを行って前面に
移動する不純物を除去し、次に2%トリエチルアミン/
30%メタノール/68%塩化メチレンを使用して、溶媒を
留去後所望の生成物を得る。
キソ-LSDの合成 1.0mmolの1-(3-フタルイミドプロピル)-2-オキソ-LSDを
アルゴン下で、メタノール中50mlの2Mメチルアミンで
処理し、室温で3時間攪拌する。反応物を減圧下で濃縮
する。残渣を50gのシリカゲルで塩化メチレン中30%メ
タノールを使用してクロマトグラフィーを行って前面に
移動する不純物を除去し、次に2%トリエチルアミン/
30%メタノール/68%塩化メチレンを使用して、溶媒を
留去後所望の生成物を得る。
【0047】実施例15.N-1-(3-[4-スクシンイミド−
オキシカルボニル)フェニル-1-カルボニルアミノ]-プ
ロピル)-2-オキソ-LSDの合成 200mlの無水テトラヒドロフラン中の1.0mmolのテレフタ
ル酸ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液を
アルゴン下で、75mlの無水テトラヒドロフランと2.0ml
のトリエチルアミン中の1.0mmolの1-(3-アミノプロピ
ル)-2-オキソ-LSDの溶液を30分かけて滴下して加えて
処理する。反応物を室温で一晩攪拌する。反応物を減圧
下で濃縮する。残渣をシリカゲルで酢酸エチルを使用し
てクロマトグラフィーを行って前面に移動する不純物を
除去し、次に蒸留テトラヒドロフランで、溶媒を留去後
所望の生成物を得る。
オキシカルボニル)フェニル-1-カルボニルアミノ]-プ
ロピル)-2-オキソ-LSDの合成 200mlの無水テトラヒドロフラン中の1.0mmolのテレフタ
ル酸ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液を
アルゴン下で、75mlの無水テトラヒドロフランと2.0ml
のトリエチルアミン中の1.0mmolの1-(3-アミノプロピ
ル)-2-オキソ-LSDの溶液を30分かけて滴下して加えて
処理する。反応物を室温で一晩攪拌する。反応物を減圧
下で濃縮する。残渣をシリカゲルで酢酸エチルを使用し
てクロマトグラフィーを行って前面に移動する不純物を
除去し、次に蒸留テトラヒドロフランで、溶媒を留去後
所望の生成物を得る。
【0048】実施例16.N-1-(3-[4'-スクシンイミド
−オキシカルボニル-1,1'-ビフェニル-4カルボニルアミ
ノ]プロピル)-2-オキソ-LSDの合成 200mlの無水テトラヒドロフラン中の1.0mmolの1,1'-ビ
フェニル-4,4'-ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルの溶液をアルゴン下で、75mlの無水テトラヒドロフラ
ンと2.0mlのトリエチルアミン中の1.0mmolの1-(3-アミ
ノプロピル)-2-オキソ-LSDの溶液を30分かけて滴下し
て加えて処理する。反応物を室温で一晩攪拌する。反応
物を減圧下で濃縮する。残渣をシリカゲルで酢酸エチル
を使用してクロマトグラフィーを行って前面に移動する
不純物を除去し、次に蒸留テトラヒドロフランで、溶媒
を留去後所望の生成物を得る。
−オキシカルボニル-1,1'-ビフェニル-4カルボニルアミ
ノ]プロピル)-2-オキソ-LSDの合成 200mlの無水テトラヒドロフラン中の1.0mmolの1,1'-ビ
フェニル-4,4'-ジ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルの溶液をアルゴン下で、75mlの無水テトラヒドロフラ
ンと2.0mlのトリエチルアミン中の1.0mmolの1-(3-アミ
ノプロピル)-2-オキソ-LSDの溶液を30分かけて滴下し
て加えて処理する。反応物を室温で一晩攪拌する。反応
物を減圧下で濃縮する。残渣をシリカゲルで酢酸エチル
を使用してクロマトグラフィーを行って前面に移動する
不純物を除去し、次に蒸留テトラヒドロフランで、溶媒
を留去後所望の生成物を得る。
【0049】実施例17.N-1-(3-[4-イソチオシアネー
トフェニル-1-カルボニルアミノ]-プロピル)-2-オキ
ソ-LSDの合成 15mlの無水テトラヒドロフラン中の1.0mmolの4-イソチ
オシアネートベンゾイルクロリドの溶液をアルゴン下0
℃に冷却し、10mlの無水テトラヒドロフラン中1.0mmol
の1-(3-アミノプロピル)-2-オキソ-N,N-ジエチル-d-
リセルグアミドの溶液で処理する。反応物を1.0mmolの
トリエチルアミンで処理し、0℃で30分間攪拌し、次に
室温で一晩攪拌する。反応物を減圧下で濃縮する。残渣
を塩化メチレンに溶解し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。残存物をシリカゲル
で塩化メチレン中10%メタノールを使用してクロマトグ
ラフィーを行って、溶媒を留去後所望の生成物を得る。
トフェニル-1-カルボニルアミノ]-プロピル)-2-オキ
ソ-LSDの合成 15mlの無水テトラヒドロフラン中の1.0mmolの4-イソチ
オシアネートベンゾイルクロリドの溶液をアルゴン下0
℃に冷却し、10mlの無水テトラヒドロフラン中1.0mmol
の1-(3-アミノプロピル)-2-オキソ-N,N-ジエチル-d-
リセルグアミドの溶液で処理する。反応物を1.0mmolの
トリエチルアミンで処理し、0℃で30分間攪拌し、次に
室温で一晩攪拌する。反応物を減圧下で濃縮する。残渣
を塩化メチレンに溶解し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。残存物をシリカゲル
で塩化メチレン中10%メタノールを使用してクロマトグ
ラフィーを行って、溶媒を留去後所望の生成物を得る。
【0050】実施例18.N-1-(3-カルボキシプロピル)
-2-オキソ-LSDの合成 20mlの無水DMF中の1.0mmolの2-オキソ-LSDの溶液を、2.
6mmolの無水炭酸カリウム、1.2mmolのヨード酪酸エチル
および4.0mmolの18-クラウン-6で処理する。反応物を60
℃で45分間攪拌する。反応物を減圧下で濃縮し、塩化メ
チレンに溶解し、10×100mlの水で洗浄し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。残渣をシリカゲ
ルで塩化メチレン中のメタノールでクロマトグラフィー
を行って、生成物のエチルエステルを得る。THFとメタ
ノールの1:1混合物10ml中の1.0mmolのエチルエステ
ル溶液を、10mmolの水酸化リチウム1水和物の溶液で処
理し、室温で一晩攪拌する。反応混合物を減圧下で濃縮
する。水性残渣をpH6に調整し、塩化メチレンで抽出
し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで9:1の塩化
メチレン/メタノールを溶出液として使用して精製す
る。
-2-オキソ-LSDの合成 20mlの無水DMF中の1.0mmolの2-オキソ-LSDの溶液を、2.
6mmolの無水炭酸カリウム、1.2mmolのヨード酪酸エチル
および4.0mmolの18-クラウン-6で処理する。反応物を60
℃で45分間攪拌する。反応物を減圧下で濃縮し、塩化メ
チレンに溶解し、10×100mlの水で洗浄し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。残渣をシリカゲ
ルで塩化メチレン中のメタノールでクロマトグラフィー
を行って、生成物のエチルエステルを得る。THFとメタ
ノールの1:1混合物10ml中の1.0mmolのエチルエステ
ル溶液を、10mmolの水酸化リチウム1水和物の溶液で処
理し、室温で一晩攪拌する。反応混合物を減圧下で濃縮
する。水性残渣をpH6に調整し、塩化メチレンで抽出
し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで9:1の塩化
メチレン/メタノールを溶出液として使用して精製す
る。
【0051】実施例19.N-1-(3-カルボキシプロピル)
-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの合成 20mlの無水DMF中の1.0mmolの2-オキソ-3-ヒドロキシ-LS
Dの溶液を、2.6mmolの無水炭酸カリウム、1.2mmolのヨ
ード酪酸エチルおよび4.0mmolの18-クラウン-6で処理す
る。反応物を60℃で45分間攪拌する。反応物を減圧下で
濃縮し、塩化メチレンに溶解し、10×100mlの水で洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。
残渣をシリカゲルで塩化メチレン中のメタノールでクロ
マトグラフィーを行って、生成物のエチルエステルを得
る。THFとメタノールの1:1混合物10ml中の1.0mmolの
エチルエステル溶液を、10mmolの水酸化リチウム1水和
物の溶液で処理し、室温で一晩攪拌する。反応混合物を
減圧下で濃縮する。水性残渣をpH6に調整し、塩化メチ
レンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮
する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで
9:1の塩化メチレン/メタノールを溶出液として使用
して精製する。
-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの合成 20mlの無水DMF中の1.0mmolの2-オキソ-3-ヒドロキシ-LS
Dの溶液を、2.6mmolの無水炭酸カリウム、1.2mmolのヨ
ード酪酸エチルおよび4.0mmolの18-クラウン-6で処理す
る。反応物を60℃で45分間攪拌する。反応物を減圧下で
濃縮し、塩化メチレンに溶解し、10×100mlの水で洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮する。
残渣をシリカゲルで塩化メチレン中のメタノールでクロ
マトグラフィーを行って、生成物のエチルエステルを得
る。THFとメタノールの1:1混合物10ml中の1.0mmolの
エチルエステル溶液を、10mmolの水酸化リチウム1水和
物の溶液で処理し、室温で一晩攪拌する。反応混合物を
減圧下で濃縮する。水性残渣をpH6に調整し、塩化メチ
レンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮
する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで
9:1の塩化メチレン/メタノールを溶出液として使用
して精製する。
【0052】実施例20.N-1-(3-フタルイミドプロピ
ル)-LSD(X)の合成 160mlの無水テトラヒドロフラン中の8.0g(24.7mmol)
の溶液を−78℃に冷却した。この反応混合物に11mlの2.
5M n-ブチルリチウム、次に80mlのN,N'-ジメチルプロ
ピレン尿素(DMPU)を加え、反応物を20分間攪拌した。
25mlのDMPU中の12g(38mmol)のヨードプロピルフタル
イミドの溶液を加え、混合物を−78℃で90分間攪拌し
た。反応物を2時間攪拌して室温まで暖めた。テトラヒ
ドロフランを真空下で除去し、油状残渣を500mlの酢酸
エチルで希釈した。これを5×250mlの水で洗浄し、硫
酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して黒い油状物を得た。こ
れを、シリカゲルカラムで溶出液としてジクロロメタン
中3%メタノールを使用して精製して、6.65g(13mmo
l、53%)の生成物を得た。
ル)-LSD(X)の合成 160mlの無水テトラヒドロフラン中の8.0g(24.7mmol)
の溶液を−78℃に冷却した。この反応混合物に11mlの2.
5M n-ブチルリチウム、次に80mlのN,N'-ジメチルプロ
ピレン尿素(DMPU)を加え、反応物を20分間攪拌した。
25mlのDMPU中の12g(38mmol)のヨードプロピルフタル
イミドの溶液を加え、混合物を−78℃で90分間攪拌し
た。反応物を2時間攪拌して室温まで暖めた。テトラヒ
ドロフランを真空下で除去し、油状残渣を500mlの酢酸
エチルで希釈した。これを5×250mlの水で洗浄し、硫
酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して黒い油状物を得た。こ
れを、シリカゲルカラムで溶出液としてジクロロメタン
中3%メタノールを使用して精製して、6.65g(13mmo
l、53%)の生成物を得た。
【0053】実施例21.N-1-(3-フタルイミドプロピ
ル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD(IV)とN-1-(3-フタ
ルイミドプロピル)-2-オキソ-LSD(XI)の合成 25mg(0.048mmol)のN-1-(3-フタルイミドプロピル)-
LSDの溶液に、1mlのHPLCグレードのアセトニトリルを
加えた。反応混合物を4℃に冷却した。1mlの水中のL-
酒石酸(12mg、0.079mmol)の溶液を4℃に冷却し、LSD
-N-アミノプロピルフタルイミド溶液に加えた。
ル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD(IV)とN-1-(3-フタ
ルイミドプロピル)-2-オキソ-LSD(XI)の合成 25mg(0.048mmol)のN-1-(3-フタルイミドプロピル)-
LSDの溶液に、1mlのHPLCグレードのアセトニトリルを
加えた。反応混合物を4℃に冷却した。1mlの水中のL-
酒石酸(12mg、0.079mmol)の溶液を4℃に冷却し、LSD
-N-アミノプロピルフタルイミド溶液に加えた。
【0054】1mlの水中の11mg(0.076mmol)の次亜塩
素酸カルシウムの懸濁液をMillex HVフィルター(4.5μ
m)でろ過し、4℃に冷却し、冷却し磁気攪拌したLSD N
-アミノプロピルフタルイミド酒石酸溶液に加えた。反
応混合物を4℃で10分間攪拌し、15mlの飽和重炭酸ナト
リウム溶液を加えた。反応混合物を室温に加熱し、5×
30mlのクロロホルムで抽出した。合わせた有機層を乾燥
(無水硫酸ナトリウム)し濃縮した。残渣をクロロホル
ム中10%メタノールを使用して分取用シリカゲルクロマ
トグラフィーで精製して、5mg(0.009mmol、20%)のN
-1-(3-フタルイミドプロピル)-2-オキソ-LSDと8mg
(0.014mmol、30%)のN-1-(3-フタルイミドプロピ
ル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDを得た。
素酸カルシウムの懸濁液をMillex HVフィルター(4.5μ
m)でろ過し、4℃に冷却し、冷却し磁気攪拌したLSD N
-アミノプロピルフタルイミド酒石酸溶液に加えた。反
応混合物を4℃で10分間攪拌し、15mlの飽和重炭酸ナト
リウム溶液を加えた。反応混合物を室温に加熱し、5×
30mlのクロロホルムで抽出した。合わせた有機層を乾燥
(無水硫酸ナトリウム)し濃縮した。残渣をクロロホル
ム中10%メタノールを使用して分取用シリカゲルクロマ
トグラフィーで精製して、5mg(0.009mmol、20%)のN
-1-(3-フタルイミドプロピル)-2-オキソ-LSDと8mg
(0.014mmol、30%)のN-1-(3-フタルイミドプロピ
ル)-2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDを得た。
【0055】実施例22.2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD-BS
A ELISAスクリーニングコンジュゲートの合成 6mlの50mMリン酸カリウム(pH7.5)中の400mgのウシ血
清アルブミン(BSA)の溶液を、氷浴中で冷却した。こ
の溶液に、6mlのDMSOを滴下して加え、反応温度を室温
以下に維持した。このタンパク質溶液に、1mlの無水DM
F中の10mg(0.015mmol)の2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
モノフェニルNHSエステル誘導体(VII)の溶液を滴下し
て加えた。反応混合物を室温で18時間攪拌した。生じた
コンジュゲートを透析チューブ(カットオフ10,000MW)
中に入れ、50mMリン酸カリウム中の2リットルの60%DM
SO[3回交換、各少なくとも3時間]、50mMリン酸カリ
ウム中の2リットルの50%DMSO(少なくとも3時間)、
50mMリン酸カリウム中の2リットルの30%DMSO(少なく
とも3時間)、50mMリン酸カリウム中の10%DMSO(少な
くとも3時間)で室温で逐次透析し、次に4℃の50mMリ
ン酸カリウム(pH7.5)で6回交換して透析した(各2
リットルで、各少なくとも6時間)。総量30mlの2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSD BSAコンジュゲートが得られた。B
ioradクマシーブループロテインアッセイを使用して、
タンパク質濃度は8.8mg/mlと測定された。
A ELISAスクリーニングコンジュゲートの合成 6mlの50mMリン酸カリウム(pH7.5)中の400mgのウシ血
清アルブミン(BSA)の溶液を、氷浴中で冷却した。こ
の溶液に、6mlのDMSOを滴下して加え、反応温度を室温
以下に維持した。このタンパク質溶液に、1mlの無水DM
F中の10mg(0.015mmol)の2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
モノフェニルNHSエステル誘導体(VII)の溶液を滴下し
て加えた。反応混合物を室温で18時間攪拌した。生じた
コンジュゲートを透析チューブ(カットオフ10,000MW)
中に入れ、50mMリン酸カリウム中の2リットルの60%DM
SO[3回交換、各少なくとも3時間]、50mMリン酸カリ
ウム中の2リットルの50%DMSO(少なくとも3時間)、
50mMリン酸カリウム中の2リットルの30%DMSO(少なく
とも3時間)、50mMリン酸カリウム中の10%DMSO(少な
くとも3時間)で室温で逐次透析し、次に4℃の50mMリ
ン酸カリウム(pH7.5)で6回交換して透析した(各2
リットルで、各少なくとも6時間)。総量30mlの2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSD BSAコンジュゲートが得られた。B
ioradクマシーブループロテインアッセイを使用して、
タンパク質濃度は8.8mg/mlと測定された。
【0056】実施例23.LSD-BSA ELISAスクリーニング
コンジュゲートの合成 N-1-[(4-イソチオシアネートフェニル-カルボニル)
アミノブチル]-LSDを、EP0816364A1の実施例7に記載
の方法により合成した。16mlの50mMリン酸カリウム(KP
I)pH7.5緩衝液中の1.0gのBSAの溶液を氷浴で冷却し、
1.5mlのDMF中のN-1-[(4-イソチオシアネートフェニ
ル)カルボニル)アミノブチル]-LSDの溶液をゆっくり
加えて処理し、次に室温で一晩攪拌した。反応混合物を
透析チューブ(カットオフ15,000MW)に入れ、2リット
ルの10%DMF−90% 50mM KPI(pH7.5)で室温で3時
間、次に2リットルの100% 50mM KPI(pH7.5)で室温
で4時間、そして最後に2リットルの100% 50mM KPI
(pH7.5)で4℃で5回(各少なくとも6時間)交換し
て透析した。最終のコンジュゲート容量は24mlであっ
た。クマシーブループロテインアッセイを使用して、タ
ンパク質濃度は38.2mg/mlであった。タンパク質の回収
は916.8mg(92%)であった。
コンジュゲートの合成 N-1-[(4-イソチオシアネートフェニル-カルボニル)
アミノブチル]-LSDを、EP0816364A1の実施例7に記載
の方法により合成した。16mlの50mMリン酸カリウム(KP
I)pH7.5緩衝液中の1.0gのBSAの溶液を氷浴で冷却し、
1.5mlのDMF中のN-1-[(4-イソチオシアネートフェニ
ル)カルボニル)アミノブチル]-LSDの溶液をゆっくり
加えて処理し、次に室温で一晩攪拌した。反応混合物を
透析チューブ(カットオフ15,000MW)に入れ、2リット
ルの10%DMF−90% 50mM KPI(pH7.5)で室温で3時
間、次に2リットルの100% 50mM KPI(pH7.5)で室温
で4時間、そして最後に2リットルの100% 50mM KPI
(pH7.5)で4℃で5回(各少なくとも6時間)交換し
て透析した。最終のコンジュゲート容量は24mlであっ
た。クマシーブループロテインアッセイを使用して、タ
ンパク質濃度は38.2mg/mlであった。タンパク質の回収
は916.8mg(92%)であった。
【0057】実施例24.ハイブリドーマの作成 マウスを2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD-BTGコンジュゲー
トで3回免疫した。最初の免疫は、完全フロイントアジ
ュバントで乳化した100μgで、後ろ足の足蹠と腹腔内投
与により行った。4週間後、(不完全フロイントアジュ
バント中の)同じ量と経路で2回目の免疫を行った。14
日後、マウスを眼窩後方から放血させて、分析用の血液
サンプルを得た。清澄化した血清のELISA分析により、
4匹のマウスのうちの3匹が4×105より高い抗体力価
(血清希釈系列の50%変曲点で定義)を示した。血液採
取の14日後、マウスを上記のように再度免疫した。
トで3回免疫した。最初の免疫は、完全フロイントアジ
ュバントで乳化した100μgで、後ろ足の足蹠と腹腔内投
与により行った。4週間後、(不完全フロイントアジュ
バント中の)同じ量と経路で2回目の免疫を行った。14
日後、マウスを眼窩後方から放血させて、分析用の血液
サンプルを得た。清澄化した血清のELISA分析により、
4匹のマウスのうちの3匹が4×105より高い抗体力価
(血清希釈系列の50%変曲点で定義)を示した。血液採
取の14日後、マウスを上記のように再度免疫した。
【0058】融合を計画した時、最も高い抗体血清力価
を示すマウスに、リン酸緩衝溶液中の50μgの免疫原を
両方の経路で注射して追加免疫した。4日後、マウスを
屠殺し、脾臓と鼠蹊および膝窩リンパ節を採取した。こ
れらの細胞を、常法に従ってF0ミエローマ株に融合させ
た(St Groth, D. E.ら、J. Immunol. Meth. 35, 1-21,
1980)。融合した細胞を、無菌の96ウェルプレート中
に4×104リンパ球/ウェルの濃度で標準的ハイブリド
ーマ選択培地に分散させた。濃度を測定して、プレート
中で増殖を示す任意のウェル中の単一のクローンを高い
確率で得た。約12〜14日後に、増殖はスクリーニングす
るのに充分であった。
を示すマウスに、リン酸緩衝溶液中の50μgの免疫原を
両方の経路で注射して追加免疫した。4日後、マウスを
屠殺し、脾臓と鼠蹊および膝窩リンパ節を採取した。こ
れらの細胞を、常法に従ってF0ミエローマ株に融合させ
た(St Groth, D. E.ら、J. Immunol. Meth. 35, 1-21,
1980)。融合した細胞を、無菌の96ウェルプレート中
に4×104リンパ球/ウェルの濃度で標準的ハイブリド
ーマ選択培地に分散させた。濃度を測定して、プレート
中で増殖を示す任意のウェル中の単一のクローンを高い
確率で得た。約12〜14日後に、増殖はスクリーニングす
るのに充分であった。
【0059】実施例25.ハイブリドーマのスクリーニン
グ 無菌条件下で160μlの培地を取り出して、充分な増殖を
示すウェルを試験した。このアリコートを50μlずつの
3つの部分に分けた。アリコートはLSD-BSA、2-オキソ-
3-ヒドロキシ-LSD-BSA、またはノル-LSD-BSAであらかじ
め被覆したウェルに入れ、37℃で1時間インキュベート
した。インキュベーション後、ウェルをリン酸緩衝溶液
(PBS)-ツイーン20乳化剤溶液で洗浄し、各ウェルに、
西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、Zymed, サンジエ
ゴ、カリホルニア州)に結合したあらかじめ最適化希釈
した50μlのヤギ抗マウスIgG抗体を加えた。プレートを
再度37℃で1時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後プレートを充分洗浄し、100μlの酵素基質溶液
(K-BLUE、Neogen Corp、レキシントン、ケンタッキー
州)を加えた。暗所で15分間発色させた後、100μlの2
Mリン酸を加えて反応を停止させた。光学密度は450ナ
ノメートルで読んだ。
グ 無菌条件下で160μlの培地を取り出して、充分な増殖を
示すウェルを試験した。このアリコートを50μlずつの
3つの部分に分けた。アリコートはLSD-BSA、2-オキソ-
3-ヒドロキシ-LSD-BSA、またはノル-LSD-BSAであらかじ
め被覆したウェルに入れ、37℃で1時間インキュベート
した。インキュベーション後、ウェルをリン酸緩衝溶液
(PBS)-ツイーン20乳化剤溶液で洗浄し、各ウェルに、
西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、Zymed, サンジエ
ゴ、カリホルニア州)に結合したあらかじめ最適化希釈
した50μlのヤギ抗マウスIgG抗体を加えた。プレートを
再度37℃で1時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後プレートを充分洗浄し、100μlの酵素基質溶液
(K-BLUE、Neogen Corp、レキシントン、ケンタッキー
州)を加えた。暗所で15分間発色させた後、100μlの2
Mリン酸を加えて反応を停止させた。光学密度は450ナ
ノメートルで読んだ。
【0060】3つの基質についての反応物の光学密度
を、試験した各ウェルについて比較した。こうして、各
モノクローナル抗体の交差特異性を迅速に推定すること
ができた。データは、このために設計したコンピュータ
ープログラムにより比較した。決定的に重要な点は、試
験した任意のウェル中の細胞の増殖が単一のクローンに
よるものであることを確認することである。1つのウェ
ルに複数のクローンがあると擬交差反応性プロフィール
が得られるため、これは重要な性質である。従ってこの
研究で使用したスクリーニングプロトコールは、モノク
ローナル性増殖が実際に得られる統計的証拠を提供する
点まで、融合細胞混合物をあらかじめ希釈することを含
む。次に、別々ではあるが同時にすべての3つの薬物−
BSAコンジュゲートからなるスクリーニング法を行っ
た。
を、試験した各ウェルについて比較した。こうして、各
モノクローナル抗体の交差特異性を迅速に推定すること
ができた。データは、このために設計したコンピュータ
ープログラムにより比較した。決定的に重要な点は、試
験した任意のウェル中の細胞の増殖が単一のクローンに
よるものであることを確認することである。1つのウェ
ルに複数のクローンがあると擬交差反応性プロフィール
が得られるため、これは重要な性質である。従ってこの
研究で使用したスクリーニングプロトコールは、モノク
ローナル性増殖が実際に得られる統計的証拠を提供する
点まで、融合細胞混合物をあらかじめ希釈することを含
む。次に、別々ではあるが同時にすべての3つの薬物−
BSAコンジュゲートからなるスクリーニング法を行っ
た。
【0061】結果は、16個のクローンが、LSDと2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDの両方に実質的に同等の反応を示
した。さらに7つは、LSD、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
に同等の反応を示し、ノル−LSDに有意な反応を示し
た。これらの23個のクローンを選択して、限界希釈法か
らなるさらなる研究を行って、抗体産生、液体窒素フリ
ーザー中の保存のための細胞を提供する増殖培養物、お
よび正確な交差反応性プロフィールを確立するために使
用する大量の抗体含有培地の安定性を確認した。
ソ-3-ヒドロキシ-LSDの両方に実質的に同等の反応を示
した。さらに7つは、LSD、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
に同等の反応を示し、ノル−LSDに有意な反応を示し
た。これらの23個のクローンを選択して、限界希釈法か
らなるさらなる研究を行って、抗体産生、液体窒素フリ
ーザー中の保存のための細胞を提供する増殖培養物、お
よび正確な交差反応性プロフィールを確立するために使
用する大量の抗体含有培地の安定性を確認した。
【0062】安定化クローンから得られた抗体を用いる
以後の交差反応性試験は、融合スクリーニングにより推
定されたものと本質的に同じプロフィールを示した。
以後の交差反応性試験は、融合スクリーニングにより推
定されたものと本質的に同じプロフィールを示した。
【0063】実施例26.抗体の交差反応性 LSD、ノル−LSDおよび2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDにつ
いての3つのクローンの交差反応性を、ELISA法を使用
して測定した。マイクロタイタープレートを、100μlの
0.325mg/ml LSD-BSAまたは100μlの0.325μg/ml 2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDで37℃で1時間被覆し、PBS中200
μlの1%BSAで室温で1時間、後ブロックした。プレー
トを400μlのPBS-0.1%ツイーン20で3回洗浄した。遊
離のLSD、ノル−LSDおよび2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
を、PBSで1000ng/mlに希釈した。抗体を8,000倍希釈し
た。薬物の溶液(1000ng/ml溶液の200μl)を、ELISAプ
レートの第1のカラムに入れた。残りのウェルに100μl
のPBSを満たした。100μlの薬物溶液を第1のカラムか
ら取りプレートの第2のカラムに入れることにより、薬
物の連続希釈物を調製した。溶液をピペットで5回上下
させて、ウェルの内容物を完全に混合した。第2のカラ
ムの100μlを第3のカラムに入れ、上記のように混合し
た。この方法を、ELISAプレートのすべての12カラムに
ついて繰り返した。最後のウェルの溶液100μlを捨て
た。8,000倍希釈した抗体100μlを各ウェルに加えた。
生じた薬物濃度は、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、6
2.5ng/ml、31.2ng/ml、15.6ng/ml、7.81ng/ml、3.90ng/
ml、1.95ng/ml、0.976ng/ml、0.488ng/ml、0.244ng/ml
である。最終の抗体希釈は16,000倍であった。プレート
を37℃で1時間インキュベートして、PBS-ツイーン20で
3回洗浄した。ウサギ抗マウスHRP結合IgGを5,000倍希
釈し、100μlをELISAプレートに加えた。プレートを37
℃で1時間インキュベートし、PBS-ツイーン20で3回洗
浄した。100μlのK-BLUE基質を各ウェルに入れた。プレ
ートを暗所で室温で30分間インキュベートした。100μl
の2Mリン酸を加えて反応を停止させ、450nmで吸光度
を読んだ。3つのクローンの結果は以下の通りである:
いての3つのクローンの交差反応性を、ELISA法を使用
して測定した。マイクロタイタープレートを、100μlの
0.325mg/ml LSD-BSAまたは100μlの0.325μg/ml 2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDで37℃で1時間被覆し、PBS中200
μlの1%BSAで室温で1時間、後ブロックした。プレー
トを400μlのPBS-0.1%ツイーン20で3回洗浄した。遊
離のLSD、ノル−LSDおよび2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD
を、PBSで1000ng/mlに希釈した。抗体を8,000倍希釈し
た。薬物の溶液(1000ng/ml溶液の200μl)を、ELISAプ
レートの第1のカラムに入れた。残りのウェルに100μl
のPBSを満たした。100μlの薬物溶液を第1のカラムか
ら取りプレートの第2のカラムに入れることにより、薬
物の連続希釈物を調製した。溶液をピペットで5回上下
させて、ウェルの内容物を完全に混合した。第2のカラ
ムの100μlを第3のカラムに入れ、上記のように混合し
た。この方法を、ELISAプレートのすべての12カラムに
ついて繰り返した。最後のウェルの溶液100μlを捨て
た。8,000倍希釈した抗体100μlを各ウェルに加えた。
生じた薬物濃度は、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、6
2.5ng/ml、31.2ng/ml、15.6ng/ml、7.81ng/ml、3.90ng/
ml、1.95ng/ml、0.976ng/ml、0.488ng/ml、0.244ng/ml
である。最終の抗体希釈は16,000倍であった。プレート
を37℃で1時間インキュベートして、PBS-ツイーン20で
3回洗浄した。ウサギ抗マウスHRP結合IgGを5,000倍希
釈し、100μlをELISAプレートに加えた。プレートを37
℃で1時間インキュベートし、PBS-ツイーン20で3回洗
浄した。100μlのK-BLUE基質を各ウェルに入れた。プレ
ートを暗所で室温で30分間インキュベートした。100μl
の2Mリン酸を加えて反応を停止させ、450nmで吸光度
を読んだ。3つのクローンの結果は以下の通りである:
【表1】
【表2】
【表3】 2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDに対する特異性に基づい
て、3つのクローンについて算出した交差反応性パーセ
ントは以下の通りである:
て、3つのクローンについて算出した交差反応性パーセ
ントは以下の通りである:
【表4】 LSDに対する特異性に基づいて、3つのクローンについ
て算出した交差反応性パーセントは以下の通りである:
て算出した交差反応性パーセントは以下の通りである:
【表5】 実施例27.アミノデキストランコンジュゲート(XVII)
の調製 機械スターラーを取り付けた3リットルの三ツ首丸底フ
ラスコに、700mlの脱イオン水を加えた。室温でデキス
トランを水に攪拌溶解しながら、70g(1.86mmol)のデ
キストラン(Sigma、分子量37,500)を反応フラスコに
少しずつ加えた。反応混合物に140mlの1N NAOHを加
え、反応物を30〜35℃に加熱した。反応混合物に、245m
lの1,4-ジオキサン中の79ml(923mmol)のエピブロモヒ
ドリンの溶液を、30〜35℃で45分間かけて滴下して加え
た。生じた反応混合物を攪拌し、さらに4時間30〜35℃
で加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、2リットル
の分液ロートに移した。有機層をゆっくり分離させ、多
量の蓄積物が見えなくなるまで底の層を捨てた。この水
性の溶液は3リットルの丸底フラスコに移し、氷浴で冷
却した。25%の水酸化アンモニウム700mlの溶液を反応
フラスコに加え、1N塩酸でpHを11に調整した。生じた
溶液を一晩室温まで暖めた。反応溶液を、分子量カット
オフ(MWCO)が2,000ダルトンの20個の透析チューブに
移し、2つの12リットルのバケツで以下の交換スケジュ
ールに従って透析を行った:1%の酢酸で6時間、1%
の酢酸で24時間、1%の酢酸で48時間、および脱イオン
水で24時間×6(容量=20リットル)。
の調製 機械スターラーを取り付けた3リットルの三ツ首丸底フ
ラスコに、700mlの脱イオン水を加えた。室温でデキス
トランを水に攪拌溶解しながら、70g(1.86mmol)のデ
キストラン(Sigma、分子量37,500)を反応フラスコに
少しずつ加えた。反応混合物に140mlの1N NAOHを加
え、反応物を30〜35℃に加熱した。反応混合物に、245m
lの1,4-ジオキサン中の79ml(923mmol)のエピブロモヒ
ドリンの溶液を、30〜35℃で45分間かけて滴下して加え
た。生じた反応混合物を攪拌し、さらに4時間30〜35℃
で加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、2リットル
の分液ロートに移した。有機層をゆっくり分離させ、多
量の蓄積物が見えなくなるまで底の層を捨てた。この水
性の溶液は3リットルの丸底フラスコに移し、氷浴で冷
却した。25%の水酸化アンモニウム700mlの溶液を反応
フラスコに加え、1N塩酸でpHを11に調整した。生じた
溶液を一晩室温まで暖めた。反応溶液を、分子量カット
オフ(MWCO)が2,000ダルトンの20個の透析チューブに
移し、2つの12リットルのバケツで以下の交換スケジュ
ールに従って透析を行った:1%の酢酸で6時間、1%
の酢酸で24時間、1%の酢酸で48時間、および脱イオン
水で24時間×6(容量=20リットル)。
【0064】透析溶液をまず、ロータリーエバポレータ
ーで濃縮し、次に凍結乾燥して48gの生成物を白色の固
体として得た。TNBSアッセイ(Goldfarb, A. R., Bioch
em.5, 2570-2574, 1966およびSnyder, S. L.ら、Anal.
Biochem. 64, 284-288, 1975)を使用すると、生成物は
アミノデキストラン1モルについて5.7個のアミノ基を
含有していた。
ーで濃縮し、次に凍結乾燥して48gの生成物を白色の固
体として得た。TNBSアッセイ(Goldfarb, A. R., Bioch
em.5, 2570-2574, 1966およびSnyder, S. L.ら、Anal.
Biochem. 64, 284-288, 1975)を使用すると、生成物は
アミノデキストラン1モルについて5.7個のアミノ基を
含有していた。
【0065】アミノデキストランコンジュゲートを以下
のように調製した。25mlのDMSO中のアミノデキストラン
(236mg、0.0063mmol)の攪拌溶液に、1mlの無水DMF中
の2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD NHSエステルXII(36.7m
g、0.05mmol)を加え、次に室温でトリエチルアミン
(0.008ml、0.058mmol)を加えた。溶液を室温で一晩攪
拌した。溶液を透析バッグ(カットオフ2000MW)に移
し、2リットルの以下の液に対して透析した:脱イオン
水中80%のDMSOで4時間、脱イオン水中60%のDMSOで4
時間、脱イオン水中40%のDMSOで一晩、脱イオン水中20
%のDMSOで4時間、脱イオン水で一晩、脱イオン水で4
時間、および脱イオン水で一晩。バッグ中の溶液を一晩
凍結乾燥して、225mgの生成物を白色の泡状物として得
た。
のように調製した。25mlのDMSO中のアミノデキストラン
(236mg、0.0063mmol)の攪拌溶液に、1mlの無水DMF中
の2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD NHSエステルXII(36.7m
g、0.05mmol)を加え、次に室温でトリエチルアミン
(0.008ml、0.058mmol)を加えた。溶液を室温で一晩攪
拌した。溶液を透析バッグ(カットオフ2000MW)に移
し、2リットルの以下の液に対して透析した:脱イオン
水中80%のDMSOで4時間、脱イオン水中60%のDMSOで4
時間、脱イオン水中40%のDMSOで一晩、脱イオン水中20
%のDMSOで4時間、脱イオン水で一晩、脱イオン水で4
時間、および脱イオン水で一晩。バッグ中の溶液を一晩
凍結乾燥して、225mgの生成物を白色の泡状物として得
た。
【0066】実施例28.LSDのアッセイ 0.1%BSAと0.1%アジ化ナトリウムを含有する0.175M P
IPES緩衝液(pH7.0)を作成することにより、第1の使
用試薬を調製した。ここに、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LS
Dアミノデキストランコンジュゲートを加えて、50ng/ml
の濃度にした。ここにまた、ポリアクリル酸を加えて1.
4%の濃度を得た。
IPES緩衝液(pH7.0)を作成することにより、第1の使
用試薬を調製した。ここに、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LS
Dアミノデキストランコンジュゲートを加えて、50ng/ml
の濃度にした。ここにまた、ポリアクリル酸を加えて1.
4%の濃度を得た。
【0067】0.09%アジ化ナトリウムと0.1%BSAを含有
する0.05M MOPS緩衝液(pH7.2)を作成することによ
り、第2の使用試薬を調製した。
する0.05M MOPS緩衝液(pH7.2)を作成することによ
り、第2の使用試薬を調製した。
【0068】微粒子を調製するために、0.09%アジ化ナ
トリウムを含有する0.05M MES緩衝液(pH6.5)中の等
量の1%微粒子溶液と15μg/ml抗体溶液を合わせ、一晩
インキュベートした。次に微粒子を0.09%アジ化ナトリ
ウムと0.05%BSAを含有する0.01Mリン酸緩衝化生理食
塩水溶液(pH7.4)で洗浄した。
トリウムを含有する0.05M MES緩衝液(pH6.5)中の等
量の1%微粒子溶液と15μg/ml抗体溶液を合わせ、一晩
インキュベートした。次に微粒子を0.09%アジ化ナトリ
ウムと0.05%BSAを含有する0.01Mリン酸緩衝化生理食
塩水溶液(pH7.4)で洗浄した。
【0069】微粒子を第2の使用試薬で0.15%の粒子濃
度に希釈して微粒子試薬を調製した。使用した抗体は、
2.1と呼ぶクローンであり、微粒子への添加量は約15μg
/mlであった。
度に希釈して微粒子試薬を調製した。使用した抗体は、
2.1と呼ぶクローンであり、微粒子への添加量は約15μg
/mlであった。
【0070】まず尿中1000ng/mlの濃度でLSDのストック
溶液を作成して、カリブレーターを調製した。このこの
ストック溶液から、尿で希釈して0.5、1.0、2.0、5.0お
よび10ng/mlのLSD濃度を有する溶液を作成した。
溶液を作成して、カリブレーターを調製した。このこの
ストック溶液から、尿で希釈して0.5、1.0、2.0、5.0お
よび10ng/mlのLSD濃度を有する溶液を作成した。
【0071】19μlのサンプル量、180μlの第1の使用
試薬および80μlの第2の使用試薬を用い、Hitachi917
オートアナライザー(Roche Diagnostics Corporation,
インディアナポリス)を使用してアッセイを行った。
結果を図7に示すが、ここでHUはHitachi単位の略であ
る(10,000Hitachi単位=1吸光度単位=1OD)。
試薬および80μlの第2の使用試薬を用い、Hitachi917
オートアナライザー(Roche Diagnostics Corporation,
インディアナポリス)を使用してアッセイを行った。
結果を図7に示すが、ここでHUはHitachi単位の略であ
る(10,000Hitachi単位=1吸光度単位=1OD)。
【0072】本発明を詳細に説明したが、明細書および
実施例は例示のためであり、決して本発明を限定するも
のではなく、当業者が考え得るその修飾および変更は、
添付の請求の範囲の精神と範囲から逸脱するものではな
い。
実施例は例示のためであり、決して本発明を限定するも
のではなく、当業者が考え得るその修飾および変更は、
添付の請求の範囲の精神と範囲から逸脱するものではな
い。
【図1】本発明の活性化2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDハ
プテンおよび2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD免疫原の合成
を示す。
プテンおよび2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD免疫原の合成
を示す。
【図2】2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSD誘導体および2-オ
キソ-LSD誘導体の別の合成を示す。
キソ-LSD誘導体の別の合成を示す。
【図3】本発明の好適なコンジュゲートの合成を示す。
【図4】クローン1.1と、LSD、ノル-LSD、および2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDとの反応性を示すデータのプロッ
トである。
ソ-3-ヒドロキシ-LSDとの反応性を示すデータのプロッ
トである。
【図5】クローン2.1と、LSD、ノル-LSD、および2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDとの反応性を示すデータのプロッ
トである。
ソ-3-ヒドロキシ-LSDとの反応性を示すデータのプロッ
トである。
【図6】クローン20.2と、LSD、ノル-LSD、および2-オ
キソ-3-ヒドロキシ-LSDとの反応性を示すデータのプロ
ットである。
キソ-3-ヒドロキシ-LSDとの反応性を示すデータのプロ
ットである。
【図7】実施例28に記載のように作成した較正(用量応
答)曲線である。LSDの濃度をX軸にプロットし、660nm
での吸光度をY軸にプロットする。
答)曲線である。LSDの濃度をX軸にプロットし、660nm
での吸光度をY軸にプロットする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C08B 30/18 C08B 30/18 G01N 33/53 G01N 33/53 G 33/531 33/531 A // C12P 21/08 C12P 21/08 (C12P 21/08 (C12P 21/08 C12R 1:91) C12R 1:91) (72)発明者 ステファン ブィトン アメリカ合衆国 46060 インディアナ州 ノブレスビル,バークシャイア レーン 209 (72)発明者 ゲラルド エフ.シグラー アメリカ合衆国 46033 インディアナ州 カーメル,アイロンウッド ドライブ 888 (72)発明者 アラン ジェー.マクナリー アメリカ合衆国 46033 インディアナ州 カーメル,マラリス ドライブ 2767 Fターム(参考) 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4C064 AA30 CC01 DD08 EE04 FF03 FF04 GG18 HH05 4C090 AA02 AA09 BA08 BB77 BB98 BD41 CA41 DA25 4H045 AA11 AA40 BA51 CA40 CA42 CA50 DA76 DA86 EA50 FA52 FA72 GA10
Claims (17)
- 【請求項1】 次式で示される化合物。 【化1】 [式中、 R1とR2は、HとCON(CH2CH3)2よりなる群から独立に選択
されるが、ただし、R1とR2の少なくとも1つはHであ
り、 R3はHまたはOHであり、 R4は、0〜2個の不飽和結合と0〜6個のヘテロ原子ととも
に1〜10個の炭素原子を有する分枝状または直鎖状連結
基であり、 R5は、COR6とNHR7よりなる群から選択され、ここでR
6は、OH、LまたはLXであり、R7は、H、LまたはLXであ
り、Lは、連結基であり、Xは、Lを介して結合した検出
体分子または担体分子である] - 【請求項2】 R1はCON(CH2CH3)2であり、R2はHであ
る、請求項1に記載の化合物。 - 【請求項3】 R3はOHである、請求項2に記載の化合
物。 - 【請求項4】 R5はCOR6であり、R6はOHである、請求項
3に記載の化合物。 - 【請求項5】 R5はNHR7であり、R7はHである、請求項
3に記載の化合物。 - 【請求項6】 R5はNHR7であり、R7は、 【化2】 [式中、Zは、COOH、SCNおよびN-ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルよりなる群から選択される]よりなる群か
ら選択される連結基Lである、請求項2に記載の化合
物。 - 【請求項7】 R5はNHR7であり、R7はLXであり、Xは、
ウシチログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、およびウシ血清アルブミンよりなる群から選択され
る担体分子である、請求項2に記載の化合物。 - 【請求項8】 R5はNHR7であり、R7はLXであり、Xは検
出体分子である、請求項2に記載の化合物。 - 【請求項9】 R1はCON(CH2CH3)2であり、R2はHであ
り、R3はOHであり、R4は(CH2)3であり、R5はNHR7であ
り、R7は、 【化3】 [式中、Zは、COOH、NCSおよびN-ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルよりなる群から選択される]よりなる群か
ら選択される連結基Lである、請求項1に記載の化合
物。 - 【請求項10】 R1はCON(CH2CH3)2であり、R2はHであ
り、R3はOHであり、R4は(CH2)3であり、R5はNHR7であ
り、R7は、 【化4】 [式中、Xは、検出体分子または担体分子である]よりな
る群から選択される連結基Lである、請求項1に記載の
化合物。 - 【請求項11】 Xは、ウシチログロブリン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン、およびウシ血清アルブミン
よりなる群から選択される担体分子である、請求項10
に記載の化合物。 - 【請求項12】 LSDに対して50%を超える交差反応性
を有することを特徴とする、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LS
Dに対して特異性を有する抗体。 - 【請求項13】 2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDに対して5
0%を超える交差反応性を有することを特徴とする、LSD
に対して特異性を有する抗体。 - 【請求項14】 LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDに対
して実質的に同等の交差反応性を有することを特徴とす
る、2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDの担体分子コンジュゲ
ートから作成される抗体。 - 【請求項15】 Xが担体分子である請求項10に記載
の化合物で免疫することにより産生される、LSDと2-オ
キソ-3-ヒドロキシ-LSDに対して実質的に同等の交差反
応性を有することを特徴とする、2-オキソ-3-ヒドロキ
シ-LSDの担体分子コンジュゲートから作成される抗体。 - 【請求項16】 LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDを含
有することが疑われるサンプル中のLSDと2-オキソ-3-ヒ
ドロキシ-LSDを測定する方法であって、 a. 該サンプル、LSDと2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDに対
して実質的に同等の交差反応性を有する抗体、ならびに
LSDハプテンまたは2-オキソ-3-ヒドロキシ-LSDハプテン
および検出可能な標識を含むコンジュゲートを含んでな
る反応混合物を、該抗体が該LSD、該2-オキソ-3-ヒドロ
キシ-LSD、および該コンジュゲートに結合するのに好ま
しい条件下で形成させる工程、 b. 該検出可能な標識の量を測定することにより、該抗
体に結合した該コンジュゲートの量を測定する工程、 c. あらかじめ決められた量のLSDと2-オキソ-3-ヒドロ
キシ-LSDを含有するサンプルを使用した場合に該抗体に
結合した該標識の量と工程(b)で測定された量を比較す
る工程、 とを含んでなる方法。 - 【請求項17】 サンプル中のLSDおよび/または2-オキ
ソ-3-ヒドロキシ-LSDを検出するための、請求項12〜
15のいずれか1項に記載の抗体の使用。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US19603000P | 2000-04-07 | 2000-04-07 | |
US09/733,534 US6794496B2 (en) | 2000-04-07 | 2000-12-08 | Immunoassay for LSD and 2-oxo-3-hydroxy-LSD |
US09/733534 | 2000-12-08 | ||
US60/196030 | 2000-12-08 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002003500A true JP2002003500A (ja) | 2002-01-09 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001108813A Withdrawn JP2002003500A (ja) | 2000-04-07 | 2001-04-06 | Lsdと2−オキソ−3−ヒドロキシ−lsdのイムノアッセイ |
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---|---|
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010134508A1 (ja) * | 2009-05-18 | 2010-11-25 | 国立大学法人大阪大学 | 抗マラリア薬の抗体、ならびにモノクローナル抗体、およびその製作方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US6699722B2 (en) * | 2000-04-14 | 2004-03-02 | A-Fem Medical Corporation | Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes |
ES2361907T3 (es) * | 2001-12-20 | 2011-06-24 | Randox Laboratories Ltd. | Haptenos, inmunógenos, anticuerpos y conjugados para lsd 2-oxo-3-hidroxi. |
US7795355B2 (en) * | 2004-03-05 | 2010-09-14 | Carnegie Mellon University | Preparation of functional polymers |
US20060223998A1 (en) * | 2005-03-30 | 2006-10-05 | Fang-Jie Zhang | Synthetic LSD metabolite for preparing haptens used in an LSD metabolite immunoassay |
US9405448B2 (en) * | 2012-08-30 | 2016-08-02 | Arria Data2Text Limited | Method and apparatus for annotating a graphical output |
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US5843682A (en) * | 1995-11-20 | 1998-12-01 | Boehringer Mannheim Corporation | N-1-carboxyalkyl derivatives of LSD |
US6063908A (en) | 1996-07-02 | 2000-05-16 | Roche Diagnostics Corporation | Reagents for lysergic acid diethylamide immunoassay |
WO1999042840A1 (en) | 1998-02-20 | 1999-08-26 | Microgenics Corporation | Immunoassays for determination of lsd and lsd metabolites |
US6548645B1 (en) * | 1999-06-18 | 2003-04-15 | Microgenetics Corporation | Immunoassay for 2-oxo-3-hydroxy LSD |
ES2361907T3 (es) * | 2001-12-20 | 2011-06-24 | Randox Laboratories Ltd. | Haptenos, inmunógenos, anticuerpos y conjugados para lsd 2-oxo-3-hidroxi. |
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-
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010134508A1 (ja) * | 2009-05-18 | 2010-11-25 | 国立大学法人大阪大学 | 抗マラリア薬の抗体、ならびにモノクローナル抗体、およびその製作方法 |
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