CN101153871B - 一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以7-氨基头孢烷酸为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白BSA偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了7-氨基头孢烷酸的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
Description
技术领域
一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
7-氨基头孢烷酸，英文名称：7-Amino Cephalosporanic Acid(7-ACA)，CAS号957-68-6，分子式为C10H12N2O5S，是β-内酰胺类中头孢类抗生素中间体。β-内酰胺类抗生素是指化学结构中含有β-内酰胺环的一类抗生素，主要包括青霉素类和头孢菌素类，其作用特点是能够抑制细菌黏肽转肽酶的活性，从而阻止细菌细胞壁的合成，呈现杀菌活性。在畜类动物饲养中，β-内酰胺类抗生素广泛用于控制奶牛的***炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。因此其在乳制品中的残留也越来越引起了国内外的重视。其中头孢类抗生素由于具有抗菌谱广等优点被广泛用于人畜疾病的防治。且头孢类抗生素种类繁多，现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对所有头孢类抗生素进行快速、准确的检测，有必要研究快速、便携的免疫检测技术——胶体金免疫技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内尚没有针对头孢类抗生素的胶体金免疫检测方法的报道，为了弥补这一空白，设计合成了以头孢类抗生素的中间体7-氨基头孢烷酸为半抗原的用于头孢类抗生素检测的完全抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法。所制备的产品用于头孢类抗生素的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案：一种头孢类抗生素中间体7-氨基头孢烷酸人工抗原的合成方法，7-氨基头孢烷酸缩写为7-ACA，以7-氨基头孢烷酸为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)偶联，用紫外扫描仪(UNICO，UV-2802pcs)测定偶联物的偶联比。其反应方程式为：
(1)人工抗原的合成：7-ACA、戊二醛、牛血清蛋白以摩尔比为100∶10∶1的比例反应，首先让戊二醛与半抗原7-ACA的氨基室温下反应30min，然后加入牛血清蛋白室温下搅拌反应3h，即得7-氨基头孢烷酸人工抗原混合液。因为7-ACA分子量为272，作为半抗原相对较小，采用戊二醛作为交联剂，戊二醛既是交联剂又是连接臂，省去了加入连接臂的半抗原合成步骤。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：7-ACA-牛血清蛋白。
(2)人工抗原的鉴定：7-ACA-牛血清蛋白采用紫外扫描仪测定其偶联比，分别在262nm、278nm处测吸光值，并计算其偶联比。
偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制7-氨基头孢烷酸(7-ACA)浓度为0，10，20，30μg·mL-1的超纯水溶液，通过紫外扫描可知7-氨基头孢烷酸的最大吸收波长为262nm，牛血清白蛋白的最大吸收波长为278nm，分别在262nm、278nm处测其吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：εA＝吸光值/摩尔浓度。本发明计算得εA262＝9850L·mol-1、εA278＝6177L·mol-1。
配制浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的牛血清蛋白(BSA)，通过紫外扫描可知BSA的最大吸收波长为278nm，分别在278nm、262nm测吸光值，每个浓度做平行样。本发明计算得摩尔吸光系数分别为：εB278＝40293L·mol-1、εB262＝24954L·mol-1。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算得抗原溶液的蛋白浓度为4.7916mg·mL-1。
偶联比测定：将偶联产物用超纯水稀释到150μg·mL-1，测262nm、278nm波长处的吸光值，以超纯水作空白对照，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率Ca/Cb为：Ca/Cb＝(A1×εB278-A2×εB262)/(A2×εA262-A1×εA278)，本发明计算得r≈16。其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1)，65000为牛血清蛋白的分子量，150×10-3为牛血清蛋白浓度(μg·mL-1)。
本发明的有益效果：本发明成功合成了7-ACA的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1 7-ACA、BSA及其偶联物的紫外扫描组合图。
具体实施方式：
实施例1
(1)人工抗原的制备
称取7-氨基头孢烷酸27.2mg(0.1mmol)溶于8mL PBS(0.01mol/L)溶液中，充分溶解后逐滴加入40μL 25％的戊二醛(0.01mmol)，反应30min。另称取BSA68mg(0.001mmol)溶于2mL PBS(0.01mol/L)溶液中后逐滴加入上述反应液，室温下搅拌反应3h。即得人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M pH7.4的PBS缓冲液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：7-ACA-牛血清蛋白。
(2)7-氨基头孢烷酸人工抗原的鉴定
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然方法很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制7-氨基头孢烷酸(7-ACA)浓度为0，10，20，30μg·mL-1的超纯水溶液，通过紫外扫描可知7-ACA的最大吸收波长为262nm，分别在262nm、278nm处测吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：εA＝吸光值/摩尔浓度。本发明计算得εA262＝9850L·mol-1、εA278＝6177L·mol-1。
配制浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的牛血清蛋白(BSA)，通过紫外扫描可知BSA的最大吸收波长为278nm，分别在278nm、262nm测吸光值，每个浓度做平行样。本发明计算得摩尔吸光系数分别为：εB278＝40293L·mol-1、εB262＝24954L·mol-1。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定7-ACA-牛血清蛋白抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算得抗原溶液的蛋白浓度为4.7916mg·mL-1。
偶联比测定：将偶联产物7-ACA-牛血清蛋白用超纯水稀释到150μg·mL-1，测262nm、278nm波长处的吸光值，以超纯水作空白对照，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r＝Ca/Cb为：r＝Ca/Cb＝(A1×εB278-A2×εB262)/(A2×εA262-A1×εA278)，本发明计算得r≈16。
Claims (1)
1. 一种头孢类抗生素中间体7-氨基头孢烷酸人工抗原的合成方法，7-氨基头孢烷酸缩写为7-ACA，其特征是以7-ACA为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白牛血清蛋白偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比；
(1)人工抗原的合成：7-ACA、戊二醛、牛血清蛋白以摩尔比为100∶10∶1的比例反应，首先让戊二醛与半抗原7-ACA的氨基室温下反应30min，然后加入牛血清蛋白室温下搅拌反应3h，即得7-氨基头孢烷酸人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将7-氨基头孢烷酸人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：7-ACA-牛血清蛋白；
(2)人工抗原的鉴定：7-ACA-牛血清蛋白采用紫外扫描仪测定其偶联比，分别在262nm、278nm处测吸光值，并计算其偶联比。
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