DE60219124T2

DE60219124T2 - Verfahren und Kit zum Nachweis, oder zum Quantifizieren von, Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten von Fentanyl Analoga

Info

Publication number: DE60219124T2
Application number: DE60219124T
Authority: DE
Inventors: Robert Ivan c/o Randox L County Antrim BT29 4QY McConnell; El Ouard c/o Randox L County Antrim BT29 4QY Benchikh; Stephen Peter c/o Randox L County Antrim BT29 4QY Fitzgerald; John Victor c/o Randox L County Antrim BT29 4QY Lamont
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2002-11-15
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2022-11-16
Also published as: DE60219124D1; US20030170728A1; US7109310B2; CN100402084C; ES2284783T3; ATE358275T1; CN1428607A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ein Verfahren und ein Kit zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten, bevorzugt Nor-Metaboliten, sowohl von Fentanyl als auch von seinen Analoga, sowie Immunogene, Konjugate und Antikörper, die darin nützlich sind.
Mit „Detektieren" ist das qualitative Analysieren auf die Gegenwart oder Abwesenheit einer Substanz gemeint.
Mit „Bestimmen" ist das quantitative Analysieren der Menge einer vorliegenden Substanz gemeint.
Mit „Fentanyl" ist N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)-N-phenylpropionamid gemeint.
Mit „Fentanyl-Analoga" sind Substanzen gemeint, die strukturelle Ähnlichkeit mit der N-Phenyl-N-(4-piperidinyl)amin-Struktur von Fentanyl zeigen und pharmakologische Aktivität mit Fentanyl gemein haben. Derartige „Fentanyl-Analoga" schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: Sufentanil, Carfentanil, Acetylfentanyl, p-Fluorfentanyl, Benzylfentanyl, Thienylfentanyl, α-Methylthienylfentanyl, Butyrylfentanyl und Alfentanil sowie die sogenannten Designerdrogen α- und p-Methylfentanyl und 3-cis/trans-Methylfentanyl.
Mit „Metaboliten" sind die Abbauprodukte in vivo sowohl von Fentanyl als auch von Fentanyl-Analoga gemeint. Somit umfasst dies für Fentanyl Folgende: Norfentanyl (N-(Propionyl)-4-N-anilinopiperidin), Despropionylfentanyl (N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)phenylamin), p-Hydroxyfentanyl (N-(p-Hydroxyphenyl)-N-[1-(2-phenylethyl)-4-piperidinyl]propanamid) und p-Hydroxynorfentanyl (N-Propionyl-4-N-(p-hydroxyanilino)piperidin).
Die vorliegende Erfindung soll eine breite Anwendbarkeit quer durch Metaboliten, sowohl von Fentanyl als auch von Fentanyl-Analoga, haben. Die vorliegende Erfindung soll eine spezielle Anwendbarkeit für Nor-Metaboliten, sowohl von Fentanyl als auch von Fentanyl-Analoga, haben. Die vorliegende Erfindung soll eine speziellste Anwendbarkeit für Nor-Metaboliten von Fentanyl haben. Die vorliegende Erfindung soll auch eine breite Anwendbarkeit quer durch Fentanyl selbst und seine Analoga haben.
Fentanyl ist ein starkes synthetisches Opioid mit mindestens 80-facher Wirksamkeit von Morphin als ein Analgetikum. Es wird routinemäßig perioperativ zur Induktion und Aufrechterhaltung von Anästhesie und postoperativ zur Analgesie verwendet. Es wurden Analoga von Fentanyl zur Steigerung seiner analgetischen und euphorischen Wirkung synthetisiert. Aufgrund ihrer großen Wirksamkeit und schnellen narkotischen Analgesie haben Fentanyl und seine Analoga Missbrauchpotential. Fentanyl verteilt sich schnell vom Blut zu Körpergeweben und wird erheblich metabolisiert. Im Menschen werden ungefähr 80 % einer Fentanyl-Dosis innerhalb von 72 Stunden im Urin ausgeschieden, wobei 92 % bis 98 % davon aus Metaboliten bestehen. Oxidative N-Dealkylierung zur Bildung von Norfentanyl ist der metabolische Hauptweg für Fentanyl im Menschen (Silverstein et al. 1993). N-Dealkylierung scheint auch typisch für Fentanyl-Analoga zu sein, wie zum Beispiel Alfentanil und Sufentanil (Camu et al. (1982) und Meuldermans et al. (1982)). Im Gegensatz dazu verläuft der metabolische Hauptweg in Pferden über metabolische Oxidation der Propionyl-Seitenkette von Fentanyl zur Bildung einer Malonanilinsäure (Frincke et al. (1980)). Die chemische Struktur von Fentanyl ist nachstehend dargestellt:
Fentanyl, das eine Halbwertszeit von 10 Minuten hat, wird, zumindest in Menschen, metabolisiert, um hauptsächlich Folgendes zu ergeben:
Es wurden verschiedene Verfahren verwendet, um die Quantität von Metaboliten von Fentanyl und seinen Analoga in einer Probe zu bestimmen. Analytische Verfahren schließen Folgende ein: Gaschromatographie mit Flammenionisations-, Elektroneneinfang- und Stickstoff-spezifischer Detektion und Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS). Es ist beispielsweise ein empfindliches Gas-Flüssig-Chromatographieverfahren zum Analysieren der Nor-Metabolite von Fentanyl und 3-Methylfentanyl im Urin in W. R. Hammargren und G. L. Henderson, 1988, offenbart. Das offenbarte Verfahren schließt die Detektion durch Elektroneneinfang-Detektor oder Massenspektroskopie ein. Derartige chromatographische Verfahren sind jedoch zu kostspielig und zeitaufwendig zur Verwendung als Screening-Mittel.
Radioimmunassays, die zur Bestimmung der Quantität von Fentanyl und seiner Analoga verwendet werden, sind sehr empfindlich, doch erfordern Radionuklid-Tracer, beispielsweise ¹²⁵I und ³H, und in einigen Fällen einen vorausgehenden Extraktionsschritt. Es werden beispielsweise viele verschiedene Arten von Radioimmunassays (RIAs), einschließlich Festphasen-RIA, zur Detektion von Fentanyl und ähnlichen Analoga verwendet. Hammargren & Henderson (1988) offenbaren die Verwendung eines von Diagnostic Products hergestellten ¹²⁵I-RIA.
Jedoch wurde gefunden, dass die Nor-Metaboliten und Despropionyl-Metaboliten bei Verwendung des Radioimmunassays nicht erheblich kreuzreagieren. Außerdem offenbaren Watts & Caplan (1990) einen Fentanyl-RIA (auch ein ¹²⁵I-RIA von Diagnostic Products), der die Daten von Hammargren & Henderson (1988) bestätigt, nämlich die schlechte Kreuzreaktivität für bestimmte Fentanyl-Metaboliten, speziell weniger als 5 % (Tabelle IV Reaktion von Analogon/Reaktion von Fentanyl) für Norfentanyl und 14-30 % (Tabelle IV Reaktion von Analogon/Reaktion von Fentanyl) für 2-Hydroxyfentanyl. Bezüglich 2-Hydroxyfentanyl wird derzeit angenommen, dass dies kein Hauptmetabolit von Fentanyl ist, zumindest im Menschen, trotz des Hinweises dazu in Watts & Caplan. Michiels et al. (1977) offenbaren einen ³H-RIA für Fentanyl von Janssen unter Verwendung von Carboxyfentanyl als das Hapten – es wurde keine Kreuzreaktion mit Despropionylfentanyl und Norfentanyl, den Hauptmetaboliten von Fentanyl in Menschen, beobachtet. Ähnlich offenbaren Henderson et al. (1975) einen Fentanyl-RIA von McNeil Laborstories unter Verwendung von Carboxyfentanyl als das Hapten, doch alle der Nor- und Despropionyl-Metaboliten von Fentanyl kreuzreagieren nicht erheblich.
Enzymgebundener Immunosorbent-Assays (ELISAs) sind eine nicht-radioaktive Alternative, die auch für die Bestimmung der Quantität von Fentanyl und seiner Analoga bekannt sind. Beispielsweise ist in Werawan Ruangyuttikarn et al., 1990, ein Prototyp-ELISA zum Detektieren der Gegenwart von Fentanyl unter Verwendung eines Carboxyfentanyl-Haptens offenbart. Diese Offenbarung führt aus, während sie zu Kreuzreaktivität gegen Metaboliten von Fentanyl deutlich verschwiegen ist, dass Modifikation um die Piperidin-Einheit herum die Kreuzreaktivität dramatisch verändert – dies deutet an, dass für Norfentanyl schlechte Kreuzreaktivität erwartet werden könnte. Gregory S. Makowski et al., 1995, offenbart einen ELISA mit schlechter Kreuzreaktivität gegen Despropionylfentanyl- und Norfentanyl-Metaboliten, speziell nur 0,53 % Kreuzreaktivität gegen Despropionylfentanyl und weniger als 0,03 % Kreuzreaktivität gegen Norfentanyl.
Eine Arbeit über Fentanyl-Immunassays (ob RIA oder ELISA), über die zuvor berichtet wurde, hat sich einzig, nach dem Wissen der Erfinder, auf die Derivatisierung von Fentanyl (durch eine Carboxylgruppe) durch das freie Ende der Propionamidgruppe von Fentanyl konzentriert. Eine derartige Derivatisierung unter Verwendung von -COOH als Crosslinker führt zu Carboxyfentanyl (N-Phenyl-N-[1-(2-phenethyl)-4-piperidinyl]carboxypropanamid) als dem Hapten, welches Hapten in J. McDonald et al., 1987, offenbart ist. J. McDonald et al. offenbaren einen Partikel-Konzentrations-Fluoreszenz-Immunassay (PCFIA = Particle Concentration Fluorescence Immunoassay) unter Verwendung eines Antiserums, das durch ein Carboxyfentanyl-Rinderserumalbumin (BSA)-Immunogen und Carboxyfentanyl, das mit b-Phycoerythrin verknüpft ist, produziert wurde. Ähnlich offenbaren M. Michiels et al. (1977) ein Carboxyfentanyl-BSA-Immunogen. Antikörper, die gegen ein Carboxyfentanyl-Rindergammaglobulin (BGG)-Immunogen produziert wurden, sind in G. L. Henderson et al., 1975, offenbart. Jedoch leiden Antikörper und Konjugate, die gegen Carboxyfentanyl als Hapten produziert werden, unter dem Nachteil, dass wenig oder keine Fähigkeit zur Detektion von Metaboliten von Fentanyl und/oder Metaboliten von Fentanyl-Analoga besteht.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Bindung eines neuen Haptenderivats von Fentanyl oder Norfentanyl, wobei das Hapten kovalent zu entweder zu einem Antigenität-verleihenden Trägermaterial, um ein Immunogen zu produzieren, oder zu einem detektierbaren Markierungsagens, um ein Konjugat (oder Detektionsreagenz) zu produzieren, verknüpft ist. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch, wie Antikörper, die gegen dieses Immunogen erzeugt wurden, bei der Entwicklung eines allgemeinen Assays, der zur Bestimmung der Quantität von Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten seiner Analoga in Flüssigkeiten, bevorzugt biologischen Flüssigkeiten, bevorzugter in biologischen Flüssigkeiten von Menschen verwendet werden kann, eingesetzt werden.
Ziele der Erfindung
Es ist ein Ziel der Erfindung, einige oder alle Nachteile des Stands der Technik zu bewältigen oder eine Alternative dazu bereitzustellen.
Es ist ein Ziel einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, ein Verfahren und einen Kit zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten von Fentanyl und/oder Metaboliten von Fentanyl-Analoga bereitzustellen. Es ist ein Ziel einer bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung, ein Verfahren und einen Kit zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten von Fentanyl und/oder Metaboliten von Fentanyl-Analoga bereitzustellen, die mehr als 5 %, bevorzugt mehr als 25 % Kreuzreaktivität für die Metaboliten von Fentanyl und/oder die Metaboliten von Fentanyl-Analoga, bevorzugter die Nor-Metaboliten, wenn mit Fentanyl selbst verglichen wird, zeigen.
Es ist ein weiteres Ziel einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, Antikörper, die zur Bindung mit einer N-Phenyl-N-(4-piperidinyl)amin-Einheit, als einem strukturellen Epitop, fähig sind, zu entwickeln.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Verfahren, Kits, Konjugate, Immunogene, Antikörper und Prozesse bereit, wie in den angefügten Patentansprüchen detailliert ist. In einem ersten Aspekt wird ein Immunogen bereitgestellt, das ein Hapten, das an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist, umfasst, wobei das Hapten mit einem Crosslinker an Position 1, 2 oder 4, bevorzugt an Position 1 oder 2, derivatisiert ist, mit der Maßgabe, dass der Crosslinker kein Carboxyl ist, wenn das Hapten an Position 1 derivatisiert ist
Position 1 ist als das freie oder terminale Ende der Propionamidgruppe von Fentanyl definiert. Position 2 ist als die para-Position der Phenethylgruppe von Fentanyl definiert. Position 3 ist als die para-Position der N-Phenylgruppe von Fentanyl definiert. Position 4 ist als das Piperidinyl-N von Norfentanyl definiert. Die Positionen 1-4 werden als R₁-R₄, bezüglich 1a der beigefügten Zeichnungen, bezeichnet.
Derivatisierungspositionen 1, 2, 3 und 4 der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Haptene sind nachstehend mit Hinsicht auf die struktuellen Formeln von Fentanyl oder Norfentanyl angegeben:
Spezieller wird in einem ersten Aspekt ein Immunogen der folgenden Formel bereitgestellt:
worin Z₁ ein Crosslinker, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist, oder Wasserstoff ist; Z₄ aus N-Phenethyl, einem Crosslinker ausgewählt ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist, oder
worin Z₂ ein Crosslinker ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial an einer ortho-, einer meta- oder einer para-Position gekoppelt ist, mit der Maßgabe, dass, wenn Z₁ Wasserstoff ist, Z₄ ein Crosslinker ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist, oder
worin Z₂ ein Crosslinker ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial an einer ortho-, einer meta- oder einer para-Position gekoppelt ist; und wenn Z₄ N-Phenethyl ist, ist Z₁ ein Crosslinker, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist, wobei der Crosslinker kein -COOH ist. Bevorzugt ist das Trägermaterial ein Protein, ein Proteinfragment, ein synthetisches Polypeptid oder ein halbsynthetisches Polypeptid.
In einem weiteren Aspekt wird ein Konjugat der folgenden Formel bereitgestellt:
worin Z₁ ein Crosslinker, der kovalent an ein detektierbares Markierungsagens gebunden ist, oder Wasserstoff ist; Z₄ ist aus N-Phenethyl, einem Crosslinker ausgewählt, der kovalent an ein detektierbares Markierungsagens gebunden ist, oder
worin Z₂ ein Crosslinker ist, der kovalent an ein detektierbares Markierungsagens an einer ortho-, einer meta- oder einer para-Position gebunden ist,
mit der Maßgabe, dass, wenn Z₁ Wasserstoff ist, Z₄ ein Crosslinker ist, der kovalent an ein detektierbares Markierungsagens gebunden ist, oder
worin Z₂ ein Crosslinker ist, der kovalent an ein detektierbares Markierungsagens an einer ortho-, einer meta- oder einer para-Position gebunden ist; und wenn Z₄ N-Phenethyl ist, ist Z₁ ein Crosslinker, der kovalent an ein detektierbares Markierungsagens gebunden ist, wobei der Crosslinker kein -COOH ist. Bevorzugt ist das Markierungsagens aus Folgenden ausgewählt ist: einem Enzym, einer lumineszierenden Substanz, einer radioaktiven Substanz oder einer Mischung davon. Bevorzugter ist das Markierungsagens ein Enzym, bevorzugt eine Peroxidase, am bevorzugtesten eine Meerrettichperoxidase. Alternativ oder zusätzlich kann die lumineszierende Substanz ein biolumineszierender, chemilumineszierender oder fluoreszierender Stoff sein.
Es wird eingesehen werden, dass in den beschriebenen Haptenen nur eine der Z₁-, Z₂- und Z₄-Positionen ein Crosslinker ist und dass in Immunogenen und Konjugaten der vorliegenden Erfindung nur eine der Z₁-, Z₂- und Z₄-Positionen einen Crosslinker einschließt, der kovalent entweder mit einem Antigenität-verleihenden Trägermaterial bzw. mit einem detektierbaren Markierungsagens verknüpft ist.
Es wird auch eingesehen werden, dass, wenn Z₁ Wasserstoff ist und Z₄ N-Phenethyl ist, die resultierende Verbindung Fentanyl ist und, wenn Z₁ und Z₄ jeweils Wasserstoff sind, die resultierende Verbindung Norfentanyl ist.
Tabelle 1, nachstehend, fasst die Crosslinker- und Derivatisierungspositionen für bestimmte der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Haptene und für bestimmte der Immunogene und Konjugate zusammen.
Tabelle 1: Chemische Strukturen von bestimmten Haptenen, die sich von Fentanyl und von seinem Metaboliten, Norfentanyl, ableiten.
Bevorzugt ist der Crosslinker von Z₂ an der para-Position.
Bevorzugt endet der Crosslinker von Z₁, Z₂ oder Z₄ an seinem freien Ende vor dem Koppeln an das Antigenität-verleihende Trägermaterial oder Binden an das Markierungsagens zur Bildung des Immunogens bzw. des Konjugats mit -CO-R, worin R Hydroxyl oder eine kurzkettige, gerad- oder verzweigtkettige Alkyl-Einheit ist. Mit „kurzkettigem Alkyl" ist eine C_1-5-Einheit gemeint. Bevorzugter ist die kurzkettige Alkyl-Einheit eine geradkettige Einheit. Noch bevorzugter ist die kurzkettige Alkyl-Einheit eine C_1-2-Einheit, bevorzugt eine geradkettige C_1-2-Alkyl-Einheit.
Bevorzugter umfasst der Crosslinker von Z₁, Z₂ oder Z₄ vor dem Koppeln an das Antigenität-verleihende Trägermaterial oder Binden an das Markierungsagens zur Bildung des Immunogens bzw. des Konjugats: -(NH)_a-(CO)_b-X_c-(CH₂)_d-Se-CO-R worin a 0 oder 1 ist; b 0 oder 1 ist; X Sauerstoff oder Schwefel ist; c 0 oder 1 ist; d aus den ganzen Zahlen 1-5 ausgewählt ist; e 0 oder 1 ist und R eine kurzkettige Alkyl-Einheit, bevorzugt eine gerad- oder verzweigtkettige C_1-5-Alkyl-Einheit oder eine Hydroxyl-Einheit ist. Bevorzugter ist die Alkyl-Einheit eine geradkettige C_1-5-Einheit. Noch bevorzugter ist die Alkyl-Einheit eine geradkettige C_1-2-Einheit. Am bevorzugtesten ist die Alkyl-Einheit Methyl.
Die letzten Maßgaben in ihrem breitesten Aspekt für ein Immunogen oder Konjugat der vorliegenden Erfindung, nämlich, dass der Z₁-Crosslinker nicht Carboxyl (-COOH) ist, das kovalent entweder mit einem Antigenität-verleihenden Trägermaterial bzw. mit einem detektierbaren Markierungsagens verknüpft ist, bedeutet, dass die vorstehend erwähnte Crosslinker-Formel einen Crosslinker ausschließt, worin a, b, c, d und e 0 sind und R Hydroxyl ist, wenn Z₁ der Crosslinker ist.
Bevorzugt ist c 0, wenn e 1 ist.
Bevorzugt ist a 0; ist b 0; und ist c 0. Bevorzugter ist d 0; ist e 1 und ist R Methyl oder alternativ ist d 1; ist e 0; und ist R Hydroxyl. Bevorzugter ist Z₁ oder Z₄ ein derartiger Crosslinker. Alternativ könnte Z₂ ein derartiger Crosslinker sein.
Alternativ ist a 1; ist b 1; ist c 0; und ist d 2. Bevorzugt ist e 1; und ist R Methyl oder alternativ ist e 0; und ist R Hydroxyl. Bevorzugter ist Z₂ ein derartiger Crosslinker an einer ortho-, einer para- oder einer meta-Position, bevorzugt einer para-Position. Alternativ könnten Z₁ oder Z₄ ein derartiger Crosslinker sein.
Weiter alternativ ist a 0; ist b 0; ist e 0; ist X O; und ist c 1. Bevorzugt ist d 3; und ist R Hydroxyl. Z₁, Z₂ oder Z₄ könnten ein derartiger Crosslinker sein.
Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Herstellung der Antikörper bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: des Immunisierens eines Tieres, bevorzugt eines Wirbeltieres, am bevorzugtesten eines Säugetieres, durch wiederholte Verabreichung eines erfindungsgemäßen Immunogens und des Sammelns des entstehenden Serums aus dem immunisierten Tier. Bevorzugt umfasst das Verfahren weiter das Fixieren von genannten Serum-Antikörpern an ein stützendes Substrat, bevorzugt einen festen Träger, am bevorzugtesten einen festen Polystyrol-Träger. Antikörper, die gemäß diesem Verfahren hergestellt werden, sind polyklonal.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die gegen das Immunogen der vorliegenden Erfindung produziert werden, wobei die Antikörper fähig sind, mit mindestens einem strukturellen Epitop eines Metaboliten von Fentanyl oder eines Metaboliten seiner Analoga zu binden. Bevorzugt umfasst das mindestens eine strukturelle Epitop die N-Phenyl-N-(4-piperidinyl)amin-Struktur von Fentanyl. Bevorzugter sind die Antikörper auf einem stützenden Substrat fixiert.
Die Erfindung betrifft bevorzugt die Produktion von aviden polyklonalen Antisera gegen Metaboliten von Fentanyl und gegen Metaboliten seiner Analoga, welche Antisera am bevorzugtesten auch etwas Kreuzreaktivität mit Fentanyl und seinen Analoga zeigen.
In einem noch weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten von Fentanyl-Analoga in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Probe mit dem Konjugat der vorliegenden Erfindung oder einer Mischung davon und mit Antikörpern der vorliegenden Erfindung oder einer Mischung davon; Detektieren oder Bestimmen der Quantität von gebundenem Konjugat; und Ableiten der Gegenwart oder der Menge von Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten von Fentanyl-Analoga in der Probe aus einer Kalibrierungskurve.
In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung einen Kit zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten von Fentanyl-Analoga ein, wobei der Kit das Konjugat der vorliegenden Erfindung oder eine Mischung davon und die Antikörper der vorliegenden Erfindung oder eine Mischung davon einschließt. Der Kit kann gegebenenfalls Anleitungen zum Gebrauch von genannten Konjugaten und genannten Antikörpern zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten von Fentanyl-Analoga in einer Probe einschließen.
Bevorzugt ist die Probe eine Lösung, wie zum Beispiel eine biologische Flüssigkeit. Bevorzugter ist die Probe Serum oder Urin. Am bevorzugtesten ist die Probe eine Lösung oder eine Suspension von einem menschlichen Patienten.
Ein Verfahren oder Kit kann ein Konjugat oder eine Mischung davon, worin das oder jedes Konjugat aus einem Hapten hergestellt ist, worin eines von Z₁, Z₂ oder Z₄, bevorzugt eines von Z₂ oder Z₄ ein Crosslinker ist, und einen Antikörper oder eine Mischung davon umfassen, worin der oder jeder Antikörper gegen ein Hapten erzeugt ist, worin eines von Z₁, Z₂ oder Z₄, bevorzugt eines von Z₁ oder Z₂ ein Crosslinker ist. Die jeweiligen Haptenbestandteile können identisch sein oder die jeweiligen Haptenbestandteile können an der gleichen Position, doch unter Verwendung verschiedener Crosslinker, derivatisiert sein, wobei Letzteres bevorzugt ist. Es ist jedoch bevorzugt, dass die jeweiligen Haptenbestandteile an verschiedenen Positionen, entweder unter Verwendung der gleichen Crosslinker oder unter Verwendung unterschiedlicher Crosslinker, derivatisiert sind. Bevorzugter ist ein Immunogen, das sich von einem Hapten, worin Z₂ ein Crosslinker ist, ableitet, zur Verwendung in einem Verfahren oder Kit mit einem Konjugat, das sich von einem Hapten, worin eines von Z₂ oder Z₄ ein Crosslinker ist, ableitet, worin die jeweiligen Crosslinker (des Immunogens und des Konjugats) die gleichen oder bevorzugter unterschiedlich sind. Bevorzugt ist ein Immunogen, das sich von einem Hapten, worin Z₂ ein Crosslinker ist, ableitet, zur Verwendung in einem Verfahren oder Kit mit dem Konjugat, das sich von einem Hapten, worin Z₄ ein Crosslinker ist, ableitet, worin die jeweiligen Crosslinker (des Immunogens und des Konjugats) die gleichen oder bevorzugter unterschiedlich sind.
Gleichermaßen wird ein Konjugat, das sich von einem Hapten, worin Z₂ oder Z₄ ein Crosslinker ist, ableitet, zur Verwendung in einem Verfahren oder Kit der vorliegenden Erfindung mit einem Immunogen, das sich von einem Hapten, worin eines von Z₁, Z₂ oder Z₄ ein Crosslinker ist, ableitet, worin die jeweiligen Crosslinker (des Immunogens und des Konjugats) die gleichen oder bevorzugter unterschiedlich sind, erwogen. Noch bevorzugter ist ein Konjugat, das sich von einem Hapten, worin Z₂ oder Z₄ ein Crosslinker ist, ableitet, zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren oder Kit mit einem Immunogen, das sich von einem Hapten, worin eines von Z₁ oder Z₂ ein Crosslinker ist, ableitet. Am bevorzugtesten ist ein Konjugat, das sich von einem Hapten, worin Z₂ oder Z₄ ein Crosslinker ist, ableitet, zur Verwendung in einem Verfahren oder Kit der vorliegenden Erfindung mit einem Immunogen, das sich von einem Hapten, worin Z₂ ein Crosslinker ist, ableitet, worin die jeweiligen Crosslinker (des Immunogens und des Konjugats) die gleichen oder bevorzugter unterschiedlich sind.
In einem weiteren Aspekt führt die vorliegende Erfindung zur Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate oder einer Mischung davon mit den erfindungsgemäßen Antikörpern oder einer Mischung davon, um Proben, wie zum Beispiel biologische Flüssigkeiten, zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten von Fentanyl-Analoga zu testen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Haptene, die bei der Herstellung von neuen Immunogenen durch Konjugation zu konventionellen Antigenität-verleihenden Trägermaterialien eingesetzt werden. Das entstehende Immunogen wird dann an Tiere, bevorzugt Wirbeltierwirte, am bevorzugtesten Säugetierwirte verabreicht, um die Produktion von aviden polyklonalen Antisera auszulösen, die dann zur Entwicklung eines allgemeinen Immunassays für Metaboliten von Fentanyl und für Metaboliten von Fentanyl-Analoga unter Einsatz eines Konjugats (Hapten – detektierbares Markierungsagens) als Detektionsreagenz verwendet werden.
Der Schwerpunkt ist die Herstellung von Antikörpern, die für Metaboliten von Fentanyl und für Metaboliten von Fentanyl-Analoga spezifisch sind. Um eine derartige breite Spezifität zu erzielen, werden Haptene und Immunogene durch Modifizierung von Fentanyl unter Verwendung von Z₁ oder Z₂ als Crosslinker und durch Modifizierung von Norfentanyl unter Verwendung von Z₄ als Crosslinker erzeugt.
Herstellung von Haptenen
Die Herstellung der Haptene A und B wird gemäß dem Reaktionsschema 1, das in 1 dargelegt ist, durchgeführt. Die Herstellung der Haptene C, D und E wird gemäß dem Reaktionsschema 2, das in 2 dargelegt ist, durchgeführt. Die Herstellung von Hapten F und Immunogen F wird gemäß den Reaktionsschemen 3 und 4, die in den 3 und 4 dargelegt sind, durchgeführt und die Herstellung von Hapten G und Immunogen G wird gemäß dem Reaktionsschema 5, das in 5 dargelegt ist, durchgeführt.
Mit Bezug auf 1 werden die Haptene N-[1-(p-Acetylthiopropionamido)phenethyl-4-piperidinyl]-N-phenylpropionamid (A) und N-[1-(p-Succinamido)phenethyl-4-piperidinyl]-N-phenylpropionamid (B) gemäß dem Reaktionsschema 1 hergestellt. Eine Kondensationsreaktion zwischen Anilin und N-Methyl-4-piperidon, über die Bildung einer Schiff-Base, in Gegenwart von 1,2-Dichlorethan, Essigsäure und NaBH(OAc)₃ führt zur Bildung von Verbindung 1. Diese Verbindung reagiert mit Propionanhydrid in Gegenwart von Toluol und unter Rückfluss zur Bildung von Verbindung 2. Norfentanyl (Verbindung 4) wird durch N-Demethylierung von Verbindung 2 in einem Zweischrittverfahren hergestellt, wobei im ersten Schritt 1-Chlorethylchlorformiat (ClCO₂CHClCH₃) in Gegenwart von 1,2-Dichlorethan unter Rückfluss für 2 Stunden und im zweiten Schritt Methanol eingesetzt wird. Die Reaktion von Verbindung 4 mit p-Nitrophenethylbromid in Gegenwart von 4-Methyl-2-pentanon und K₂CO₃ unter Rückfluss, gefolgt von der Reduktion der Nitrogruppe zu einer Aminogruppe unter Verwendung von Pd-C in Gegenwart von HCOONH₄ und CH₃OH, führt zur Bildung der intermediären Verbindung 6. Hapten A wird durch Reaktion von Verbindung 6 mit N-Succinimidyl-3-(acetylthio)propionat (SATP) in Gegenwart von EDPA und Dioxan hergestellt und Hapten B wird durch Reaktion von Verbindung 6 mit Succinanhydrid hergestellt.
Mit Bezug auf 2 werden die Haptene N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)-N-phenyl(S-acetylthiopropionamid) (C), N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)-N-phenylsuccinamid (D) und N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)-N-phenylglutaramid (E) gemäß dem Reaktionsschema 2 hergestellt. Despropionylfentanyl (Verbindung 7) wird durch Reaktion von 1-Phenethyl-4-piperidon mit Anilin, gefolgt von der Reduktion der Schiff-Base, hergestellt. Die gebildete Verbindung wird dann mit N-Succinimidyl-3-(acetylthio)propionat (SATP) in Gegenwart von EDPA und Dioxan zur Reaktion gebracht und ergibt Hapten C, wobei Succinanhydrid Hapten D ergibt oder Glutaranhydrid Hapten E ergibt.
Mit Bezug auf die 3 und 4 wird vor der Herstellung des Haptens N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)-N-(p-O-carboxypropyl)phenylpropionamid (F) [Ethyl p-(O-carboxypropyl)]anilin (Verbindung 9) gemäß dem Reaktionsschema 3 von 3 hergestellt. p-Nitrophenol wird mit Ethyl-4-brombutyrat in Gegenwart von Natriumhydrid zur Bildung von Verbindung 8 alkyliert. Die Nitrogruppe von Verbindung 8 wird dann zu einer Aminogruppe unter Verwendung von Pd-C reduziert, was zur Bildung von Verbindung 9 führt.
N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)-N-(p-O-carboxypropyl)phenylpropionamid (Hapten F) wird in drei Schritten gemäß dem Reaktionsschema 4 von 4 hergestellt. N-(1-Phenethyl)-4-piperidon wird mit [Ethyl p-(O-carboxypropyl)]anilin (Verbindung 9) in 1,2-Dichlorethan in Gegenwart von Natriumtriacetoxyborhydrid und Essigsäure zur Reaktion gebracht und bildet Verbindung 10. Verbindung 10 reagiert mit Propionanhydrid in Toluol unter Rückfluss und ergibt Verbindung 11. Hapten F wird durch Verseifung von Verbindung 11 mit 2 N Natriumhydroxid in Methanol gebildet.
Mit Bezug auf 5 wird das Hapten N-(1-Carboxymethyl-4-piperidinyl)-N-phenylpropionamid (G) in vier Schritten gemäß dem Reaktionsschema 5 hergestellt. Die Reaktion von 4-Piperidon-Monohydrat-Monohydrochlorid mit Ethylbromacetat in Gegenwart von Natriumhydrid in DMF ergibt Ethyl-N-carboxymethyl-4-piperidon (Verbindung 12). Verbindung 12 wird dann mit Anilin in Gegenwart von Natriumtriacetoxyborhydrid und Essigsäure zur Reaktion gebracht und bildet N-(Ethyl-1-carboxymethyl-4-piperidinyl)-N-phenylanilin (Verbindung 13). Verbindung 13 wird mit Propionanhydrid in Toluol unter Rückfluss behandelt und ergibt Verbindung 14. Hapten G wird durch Verseifung von Verbindung 14 mit Natriumhydroxid (2N) in Methanol hergestellt.
Herstellung von Immunogenen und Konjugaten
Obwohl die Fentanyl-Haptene definierte strukturelle Epitope bereitstellen, sind sie selbst nicht immunogen und müssen daher zu Trägermaterial konjugiert werden, das eine immunogene Reaktion auslösen wird, wenn es in ein Wirtstier injiziert wird. Geeignete Trägermaterialien schließen Proteine ein, wie zum Beispiel Albumine, Serumproteine, z.B. Globuline, Augenlinsenproteine und Lipoproteine. Erläuternde Proteinträger schließen Rinderserumalbumin, Ei-Ovalbumin, Rindergammaglobulin, Thyroxin-bindendes Globulin, Keyhole Limpet Hämocyanin usw. ein. Alternativ können synthetische Poly(aminosäuren) mit einer ausreichenden Anzahl von verfügbaren Amingruppen, wie zum Beispiel Lysin, eingesetzt werden, wie auch andere synthetische oder natürliche polymere Stoffe, die reaktive funktionelle Gruppen tragen. Insbesondere können Kohlenhydrate, Hefen oder Polysaccharide zum Hapten zur Bildung eines Immunogens konjugiert werden.
Jedes Hapten kann auch kovalent mit einer Markierungsgruppe, wie zum Beispiel einem Enzym (beispielsweise Meerrettichperoxidase), einer Substanz mit Fluoreszenzeigenschaften oder einer radioaktiven Markierung verknüpft werden, um Konjugate (auch als Detektionsreagenzien bekannt) zur Verwendung in den Immunassays herzustellen. Die fluoreszierende Substanz kann beispielsweise ein monovalenter Rest von Fluorescein oder ein Derivat davon sein.
Um zu bestätigen, dass eine ausreichende Konjugation von Hapten zum Trägermaterial erzielt wurde, wird jedes Immunogen vor der Immunisierung unter Verwendung von Matrix-gestützter UV-Laser-Desorpion/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS = Matrix-Assisted UV Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) beurteilt. Im Fall des bevorzugten Trägermaterials, Rinderserumalbumin, ist ein Minimum von 6 Molekülen Hapten pro Trägermolekül bevorzugt.
Beim Herstellen von Konjugaten oder Immunogenen mit Haptenen, wo e im Crosslinker 1 ist, beispielsweise Haptenen A und C, müssen Maleimid-, Halogen-, Mercaptopyridyl- oder Vinylsulfongruppen zuerst am Markierungsagens bzw. Trägermaterial unter Verwendung von heterobifunktionellen Linker, wie zum Beispiel der Folgenden, doch nicht beschränkt auf diese, eingeführt werden: N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimidester (GMBS); Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC); (m-Maleimidobenzoyl)-N-hydroxysuccinimid (MBS); Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB); N-Succinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB); Bromacetylglycin-N-hydroxysuccinimid; N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP); Vinylsulfon (Pierce Chemical Company, USA). Das derart modifizierte Markierungsagens oder Trägermaterial kann dann über die Thiolgruppen an Haptenen, worin e 1 ist, wie zum Beispiel Haptenen A und C, konjugiert werden. Für Haptene, wo e im Crosslinker 0 ist, wie zum Beispiel Haptene B, D, E, F und G, wird die Konjugation ohne vorherige Modifizierung von Markierungsagens oder Trägermaterial, wie jeweils anwendbar, unter Verwendung von Standardverfahren zur Konjugation, wie zum Beispiel EDC oder gemischten Anhydriden, durchgeführt.
Herstellung von Antisera
Zur Erzeugung von polyklonalen Antisera wird das Immunogen mit Freund-Adjuvans gemischt und die Mischung wird in ein Wirtstier, wie zum Beispiel ein Kaninchen, Schaf, eine Maus, ein Meerschweinchen oder Pferd, injiziert. Weitere Injektionen (Boosts) werden durchgeführt und Serum wird zur Beurteilung von Antikörpertiter geprüft. Wenn der optimale Titer erreicht wurde, wird das Wirtstier dann geblutet, um ein geeignetes Volumen von spezifischem Antiserum zu ergeben. Der erforderliche Grad der Antikörperaufreinigung hängt von der beabsichtigten Anwendung ab. Für viele Zwecke gibt es überhaupt kein Erfordernis zur Aufreinigung, jedoch in anderen Fällen, wie zum Beispiel, wo der Antikörper an einem festen Träger immobilisiert werden soll, können Reinigungsschritte zur Abtrennung von unerwünschtem Stoff und Eliminierung von nicht-spezifischer Bindung unternommen werden.
Die spezifischen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind als Reagenzien in biochemischen Assays zur Detektion oder zur Bestimmung der Menge von Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten seiner Analoga in biologischen Flüssigkeiten nützlich.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse von charakterisierenden Daten für Verbindungen, die in den folgenden Beispielen 4, 6-11 und 13-15 hergestellt werden, dargelegt.

Verbindung	Schmelzpunkt (°C)	FT-IR (KBr, Diffuse Reflectance, cm^–1)
Beispiel 6	154-157	3479,64, 3360,85, 1648,53 und 1594,23
Beispiel 7 (Hapten A)	164-167	3322,61, 1687,21, 1627,29 und 1594,98
Beispiel 4	94-96	3426,96, 1648,67 und 1594,62
Beispiel 9	92-94	3286,45, 1601,08
Beispiel 8 (Hapten B)	222-225	3244,1, 3180,1, 1677,7, 1648,7 und 1597,1
Beispiel 10 (Hapten C)		1687,02, 1627,42 und 1536,36
Beispiel 11 (Hapten D)	198-202	1714,06, 1650,94 und 1595
Beispiel 11 (Hapten E)	141-142	3442,02, 1654,13 und 1596,14
Beispiel 13	198-200	3330,98, 1735,92, 1614,7 und 1514,78
Beispiel 14	183-185	1730,99, 1654,98 und 1509,46
Beispiel 15 (Hapten F)	113 (Zersetz.)	3228, 1716,1, 1647,9 und 1510

Allgemeine Vorschrift zur MALDI-TOF-Analyse von Immunogenen
MALDI-TOF-Massenspektrometrie wurde unter Verwendung eines Voyager STR Biospectrometry Research Station Laser-Desorptions-Massenspektrometer, das mit verzögerter Extraktion gekoppelt war, durchgeführt. Ein Aliquot von jeder zu analysierenden Probe wurde in 0,1 % wässriger Trifluoressigsäure (TFA) zur Erzeugung von 1mg/ml Probenlösungen verdünnt. Aliquoten (1 μl) wurden unter Verwendung einer Matrix von Sinapinsäure analysiert und Rinderserumalbumin (Fluka) wurde als ein externes Kalibrierungsmittel verwendet. 6 der begleitenden Abbildungen zeigt die Analyse für BSA-Trägermaterial. Wie gesehen werden wird, lag ein Hauptsignal vor, das eine durchschnittliche protonierte Masse für diese Probe von m/z 66 525 anzeigt. Das Signal bei m/z 33 273 stimmt mit der Hauptkomponente in einer zweifach geladenen Form überein und es wurden weitere Signale beobachtet, einschließlich dessen bei m/z 13 641.
In den folgenden Beispielen sind alle Prozentangaben, sofern nicht anderweitig festgelegt, als v/v angegeben.
BEISPIEL 1: Reaktionsschema 1
Herstellung von N-(1-Methyl)-4-(phenylamin)piperidin (Verbindung 1)
Zu einer Lösung von 4-N-Methyl-1-piperidon (7 g, 0,0062 mol) in 100 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan wurden Anilin (12,7 g, 0,14 mol) und Essigsäure (4 ml) gegeben, gefolgt von Natriumtriacetoxyborhydrid (13,1 g, 0,062 mol). Die Mischung wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff über Nacht gerührt.
Nach Verdampfung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde Wasser (100 ml) zugegeben und die Lösung wurde durch Zugabe von NaOH (1 N) auf den alkalischen pH 9 gebracht. Die Lösung wurde dann unter Verwendung von Toluol (2 × 100 ml) extrahiert, die organischen Phasen wurden vereinigt und mit Wasser (150 ml), gesättigter Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (Kieselgel, 5 % MeOH/Chloroform) und ergab 9,4 g (80 % Ausbeute) von Verbindung 1 als einen weißen Feststoff nach Rekristallisation aus Ethylacetat.
BEISPIEL 2: Reaktionsschema 1
Herstellung von N-(1-Methyl-4-piperidinyl)-N-phenylpropionamid
(Verbindung 2)
Zu einer Lösung von Verbindung 1 von Beispiel 1 (9,0 g, 0,047 mol) in wasserfreiem Toluol (150 ml) wurde Propionanhydrid (15,4 g, 0,118 mol) gegeben. Die Mischung wurde über Nacht unter Rückfluss gerührt. Die Lösungsmittel wurden in vacuo entfernt und der Rückstand wurde aus Ethylacetat/Hexan rekristallisiert und ergab 10 g von Verbindung 2 als einen weißen Feststoff (86 % Ausbeute).
BEISPIEL 3: Reaktionsschema 1
Herstellung von N-[1-(1'-Ethylchlorformiat)-4-piperidinyl]-N-phenylpropionamid (Verbindung 3)
Es wurden 10 g (0,04 mol) von Verbindung 2 von Beispiel 2 in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan (100 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst und auf 0 °C in einem Eisbad abgekühlt. Zu dieser Lösung wurde 1-Chlorethylchlorformiat (6,6 g, 0,046 mol) tropfenweise zugegeben und die Lösung wurde 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt (Dünnschichtchromatographie zeigte die vollständige Umsetzung der Reaktion an). Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt. Der viskose ölige Rückstand wurde durch Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, 10 % Ethylacetat/90 % n-Hexan) und ergab die Titelverbindung als einen weißen amorphen Feststoff (10 g, 74 % Ausbeute).
BEISPIEL 4: Reaktionsschema 1
Herstellung von Norfentanyl (Verbindung 4)
Es wurden 10 g (0,03 mol) von Verbindung 3 von Beispiel 3 in wasserfreiem Methanol (150 ml) gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert und ergab die Titelverbindung als ein weißes Pulver in quantitativer Ausbeute.
BEISPIEL 5: Reaktionsschema 1
Herstellung von N-[1-(p-Nitrophenethyl)-4-piperidinyl]-N-phenylpropionamid (Verbindung 5)
Eine Suspension von Norfentanyl von Beispiel 4 (6,71 g, 0,029 mol), p-Nitrophenethylbromid (7,178 g, 0,0372 mol), Kaliumcarbonat (19 g, 0,14 mol) und einigen Kristallen Natriumiodid in 4-Methyl-2-pentanon (200 ml) wurde über Nacht unter Rückfluss und unter Stickstoff gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Niederschlag durch Filtration entfernt und die Lösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde in Ethylacetat (200 ml) gelöst und mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, 10 % MeOH/90 % CHCl₃ v/v) und ergab die Titelverbindung als einen gelben Feststoff (5,33 g, 56 % Ausbeute).
BEISPIEL 6: Reaktionsschema 1
Herstellung von N-[1-(p-Aminophenethyl)-4-piperidinyl]-N-phenylpropionamid (Verbindung 6)
Zu einer gerührten Lösung von Verbindung 5 von Beispiel 5 (5 g, 0,013 mol) in wasserfreiem Methanol (200 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre 10 % Pd-C (650 mg) gegeben, gefolgt von Ammoniumformiat (5 g, 0,063 mol). Die Mischung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und durch eine kurze Säule von Celite^® filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Wasser (100 ml) aufgenommen. Die wässrige Lösung wurde durch Zugabe von 1 N NaOH alkalisch gemacht und mit Ethylacetat (2 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit Wasser (50 ml), gesättigter Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde dann unter reduziertem Druck konzentriert und lieferte Verbindung 6 als ein weißes Pulver, das einen einzigen Fleck bei der Dünnschichtchromatographie zeigt (2,7 g, 60 % Ausbeute).
Die NMR-Daten von Verbindung 6 sind in 13 dargestellt.
BEISPIEL 7: Reaktionsschema 1
Herstellung von N-[1-(p-Acetylthiopropionamido)phenethyl-4-piperidinyl]-N-phenylpropionamid (Hapten A)
Zu einer gerührten Lösung von Verbindung 6 von Beispiel 6 (1 g, 0,0028 mol) und N-Succinimidyl-3-(acetylthio)propionat (SATP) (0,824 g, 0,00336 mol) in 25 ml wasserfreiem Dioxan unter Stickstoff wurde Diisopropylethylamin (EDPA) (0,72 ml, 0,0042 mol) zugegeben und die Mischung wurde gerührt und 6 Std. bei 60 °C erhitzt. Die Mischung wurde dann in vacuo konzentriert und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 10 % v/v Methanol in Chloroform gereinigt und lieferte Hapten A als einen weißen Feststoff, der aus Hexan Chloroform in der Kälte rekristallisiert wurde (835 mg, 62 % Ausbeute).
Die NMR-Daten von Hapten A sind in 14 dargestellt.
BEISPIEL 8: Reaktionsschema 1
Herstellung von N-[1-(p-Succinamido)phenethyl-4-piperidinyl]-N-phenylpropionamid (Hapten B)
Zu einer Lösung von Verbindung 6 von Beispiel 6 (1 g, 0,0028 mol) in wasserfreiem Benzol (75 ml) wurde Succinanhydrid (0,7007 g, 0,007 mol) gegeben und die Mischung wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag und DC bestätigte, dass der gesamte Ausgangsstoff verbraucht worden war. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Benzol gewaschen und getrocknet. Er wurde in Wasser (20 ml) aufgenommen und eine Stunde bei 50 °C erhitzt, filtriert und gründlich getrocknet. Der Feststoff wurde in Acetonitril (20 ml) aufgenommen und eine Stunde bei 60 °C erhitzt, filtriert, mit wenig kaltem Acetonitril gewaschen und unter Vakuum über Nacht getrocknet und ergab die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (0,82 g, 60 % Ausbeute).
BEISPIEL 9: Reaktionsschema 2
Herstellung von N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)phenylamin (Despropionylfentanyl) (Verbindung 7)
Die Titelverbindung wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren unter Verwendung von 1-Phenethyl-4-piperidon (5,3 g, 0,026 mol), Anilin (5,01 ml, 0,55 mol), Essigsäure (3 ml), 1,2-Dichlorethan (100 ml) und Natriumtriacetoxyborhydrid (5,82 g, 0,027 mol) hergestellt. Die Titelverbindung wurde als ein weißer Feststoff erhalten (74 % Ausbeute).
BEISPIEL 10: Reaktionsschema 2
Herstellung von N-(1-Phenethyl-4-piperidinyl)-N-phenyl-(S-acetylthiopropionamid) (Hapten C)
Hapten C wurde durch das gleiche, in Beispiel 7 beschriebene Verfahren mit 55 % Ausbeute, d.h. mit N-Succinimidyl-3-(acetylthio)propionat (SATP) in wasserfreiem Dioxan, zu dem Diisopropylethylamin (EDPA) gegeben ist, hergestellt.
BEISPIEL 11: Reaktionsschema 2
Herstellung der Haptene D und E
Haptene D und E wurden durch das gleiche, in Beispiel 8 beschriebene Verfahren hergestellt. Hapten D wurde unter Verwendung von Succinanhydrid (2 Äqu.) hergestellt und Hapten E wurde unter Verwendung von Glutaranhydrid (2 Äqu.) hergestellt.
BEISPIEL 12: Reaktionsschema 3
Herstellung von [Ethyl p-(O-carboxypropyl)]anilin (Verbindung 9)
Zu einer Suspension von Natriumhydrid (3,696 g, 0,11 mol) in 100 ml wasserfreiem Dimethylformamid unter Stickstoff wurde p-Nitrophenol (13,911 g, 0,1 mol) in 100 ml DMF tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde 1 h bei 60 °C erhitzt (keine Entwicklung von Wasserstoff) und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu dieser Mischung wurde Ethyl-4-brombutyrat (23,4 g, 0,12 mol) in 50 ml DMF über eine Zeitdauer von 15 min tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde erneut bei 60 °C erhitzt und 4 Std. gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft. Es wurden 150 ml Wasser zum Rohprodukt gegeben, das dann unter Verwendung von Ethylacetat (2 × 150 ml) extrahiert wurde. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (90 % Hexan/10 % Ethylacetat v/v) gereinigt und ergab 21,7 g (86 % Ausbeute) von [Ethyl-p-(O-carboxypropyl)-1-nitrophenyl] (Verbindung 8) als einen weißen Feststoff.
Zu einer gerührten Lösung von Verbindung 8 (9,87 g, 0,039 mol) in 400 ml wasserfreiem Methanol wurde unter Stickstoff Pd-C (10 %) (1,95 g) zugegeben, gefolgt von Ammoniumformiat (15 g, 0,189 mol). Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf DC bestätigte, dass alle Ausgangsstoffe verbraucht worden waren. Der Katalysator wurde durch Filtration über Celite^® entfernt. Dann wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in Wasser (150 ml) aufgenommen. Die wässrige Lösung wurde durch Zugabe von 2 N Natriumhydroxid alkalisch gemacht und mit Ether (2 × 150 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit Wasser (100 ml), gesättigter Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Dann wurde die Lösung unter reduziertem Druck konzentriert und es wurde ein weißer Feststoff von Verbindung 9 erhalten (6,52 g, 75 % Ausbeute).
BEISPIEL 13: Reaktionsschema 4
Herstellung von N-[(1-Phenethyl-4-piperidinyl)-N-(ethyl-p-(O-carboxypropyl))]phenylamin (Verbindung 10)
Verbindung 10 wurde auf die gleiche, in Beispiel 1 beschriebene Weise unter Verwendung von Verbindung 9 anstelle von Anilin und 1-Phenethyl-4-piperidon in Gegenwart von wasserfreiem 1,2-Dichlorethan, Essigsäure und Natriumtriacetoxyborhydrid hergestellt. Verbindung 10 wurde in Kristallform erhalten (65 % Ausbeute).
BEISPIEL 14: Reaktionsschema 4
Herstellung von [Ethyl p-(O-carboxypropyl)]fentanyl (Verbindung 11)
Die Titelverbindung wurde auf die gleiche, in Beispiel 2 beschriebene Weise unter Verwendung von Verbindung 10 in wasserfreiem Toluol und Propionanhydrid unter Rückfluss hergestellt. Die Titelverbindung 11 wurde als ein weißer Feststoff in 80 % Ausbeute erhalten.
BEISPIEL 15: Reaktionsschema 4
Herstellung von p-[(O-Carboxypropyl)]fentanyl (Hapten F)
Zu einer Lösung von Verbindung 11 (3,5 g, 7,5 mmol) in Methanol (80 ml) wurde 2 N Natriumhydroxid (20 ml) zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (DC zeigte, dass keine Ausgangsstoffe übrig waren). Die Mischung wurde in vacuo bis zur Trockne reduziert, es wurde Wasser (50 ml) zugegeben und der pH der entstehenden Lösung wurde auf 6 eingestellt. Die Lösung wurde mit Chloroform (2 × 100 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Extrakte wurden mit gesättigter Kochsalzlösung (1 × 50 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und in vacuo konzentriert. Der erhaltene Feststoff wurde mit Ether trituriert, filtriert und über Nacht getrocknet und ergab 2,1 g (64 % Ausbeute) von Hapten F.
Die NMR-Daten von Hapten F sind in 15 dargestellt.
BEISPIEL 16: Reaktionsschema 5
Herstellung von Ethyl-(1-carboxymethyl)-4-piperidon (Verbindung 12)
Zu einer Lösung von 4-Piperidon-Monohydrat-Monohydrochlorid (12 g, 78,12 mmol) in wasserfreiem Dimethylformamid (120 ml) unter Stickstoff wurde Natriumhydrid [60 % w/w Dispersion in Mineralöl] (5,25 g, 156 mmol) in kleinen Portionen zugegeben. Nach vollständiger Zugabe wurde die Mischung 1 Stunde bei 60 °C erhitzt (es wurde keine weitere Entwicklung von Wasserstoffgas beobachtet), auf Raumtemperatur abgekühlt und es wurde über 15 Minuten Ethylbromacetat (19,6 g, 177 mmol) in DMF (50 ml) tropfenweise zugegeben. Die entstehende Mischung wurde über Nacht bei 60 °C erhitzt. Es wurden einige Tropfen Wasser zum Quenchen der Reaktion zugegeben und die Lösungsmittel wurden in vacuo entfernt. Es wurde Wasser (100 ml) zugegeben und die Mischung wurde mit Ethylacetat (2 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (1 × 100 ml), gesättigter Kochsalzlösung (1 × 100 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (50 % Ethylacetat/50 % Hevan v/v) gereinigt und ergab die Titelverbindung 12 als ein klares Öl (3,4 g, 65 % Ausbeute).
BEISPIEL 17: Reaktionsschema 5
Herstellung von N-[Ethyl-1-carboxymethyl)-4-(phenylamino)]piperidin (Verbindung 13)
Die Verbindung 13 wurde auf die gleiche, in Beispiel 1 beschriebene Weise unter Verwendung von Ethyl-(1-carboxymethyl)-4-piperidon (Verbindung 12) (7,4 g, 0,04 mol) und Anilin (8,2 g, 0,14 mol) in 1,2-Dichlorethan (120 ml) in Gegenwart von Natriumtriacetoxyborhydrid (8,5 g, 0,04 mol) und Essigsäure (4 ml) hergestellt. Die Titelverbindung wurde nach Reinigung durch Säulenchromatographie (Kieselgel, 10 % v/v Methanol in Chloroform) erhalten (8,4 g, 80 % Ausbeute).
BEISPIEL 18: Reaktionsschema 5
Herstellung von N-(Ethylcarboxymethyl)norfentanyl (Verbindung 14)
Verbindung 14 wurde aus Verbindung 13 (7,86 g, 0,03 mol) in wasserfreiem Toluol und Propionanhydrid (8,59 g, 0,066 mol) unter Verwendung des gleichen, in Beispiel 2 gegebenen Verfahrens hergestellt. Verbindung 14 wurde nach Rekristallisation aus Ethylacetat/Hexan erhalten (7,15 g, 75 % Ausbeute).
BEISPIEL 19: Reaktionsschema 5
Herstellung von N-(Carboxymethyl)norfentanyl (Hapten G)
Zu einer Lösung von Verbindung 14 (3,78 g, 10 mmol) in Methanol (80 ml) wurde 2 N Natriumhydroxid (20 ml) gegeben und die Mischung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (DC zeigte, dass keine Ausgangsstoffe vorlagen). Die Mischung wurde bis zur Trockne reduziert, es wurde Wasser (50 ml) zugegeben und der pH durch Zugabe von 1 N HCl auf 5 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und über Nacht in Gegenwart von Phosphorpentoxid getrocknet. Der erhaltene weiße Feststoff entspricht Hapten G (1,38 g, 50 % Ausbeute).
Die NMR-Daten von Hapten G sind in 16 dargestellt.
BEISPIEL 20
Herstellung von Rinderserumalbumin (BSA)-Bromacetylglycin
Zu einer auf 0 °C gekühlten Lösung von BSA (1 g) in 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5, 45 ml) wurde N-Succinimidylbromacetylglycin (0,375 g, 0,13 mmol) in DMF (5 ml) tropfenweise zugegeben. Während der Zugabe wurde der pH auf 8 gehalten. Nach vollständiger Zugabe wurde der pH auf 8 stabilisiert und die Lösung wurde eine Stunde bei 0 °C gerührt. Der pH wurde dann auf ungefähr 7 eingestellt und die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gegen destilliertes Wasser (2-mal Austauschen) dialysiert. Die Lösung wurde dann gefriergetrocknet und ergab ungefähr 1 g Bromacetylglycin-modifiziertes BSA.
MALDI-TOF-Analyse (siehe 7) zeigt, dass ein Hauptsignal vorlag, das eine durchschnittliche protonierte Masse für diese Probe von m/z 73 818 anzeigt. Die Signale bei m/z 24 564, 36 897 und 147 713 stimmen mit der Hauptkomponente in dreifach geladener, zweifach geladener bzw. Dimerform überein. Es wurden weitere Signale beobachtet, einschließlich solcher bei m/z 14 927, 49 425 und 111 425.
Diese Daten deuten an, dass 40,3 Lysingruppen pro Molekül BSA durch Bromacetylglycin modifiziert wurden.
BEISPIEL 21
Produktion von Immunogen A unter Verwendung von Bromacetylglycin-modifiziertem BSA
Hapten A (58,15 mg, 0,12 mmol) wurde in wasserfreiem DMF (100 μl) gelöst und zu dieser Lösung wurde Hydroxylaminlösung (900 μl, pH 12) gegeben. Die Mischung wurde 10-15 min stehen gelassen (DC zeigte das Verschwinden von Hapten A und die Bildung einer neuen Verbindung mit niedrigerem Rf). Es wurde Phosphatpuffer zugegeben, um die Reaktion zu quenchen, und der pH wurde durch Zugabe von 0,5 M HCl auf 7 eingestellt. Diese Lösung wurde tropfenweise zu einer Lösung des modifizierten BSA von Beispiel 20 (200 mg in 10 ml Wasser) gegeben und die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt (vor Licht geschützt). Dann wurde die Lösung 24 Stunden gegen destilliertes Wasser (3-mal Austauschen) dialysiert und gefriergetrocknet.
MALDI-Ergebnisse (siehe 8 der begleitenden Abbildungen) zeigten, dass 12,5 Moleküle Hapten A zu einem Molekül modifiziertem BSA konjugiert worden waren. Insbesondere lag ein Signal vor, das eine durchschnittliche protonierte Masse für diese Probe von m/z 79 795 anzeigt. Das Signal bei m/s 39 759 stimmt mit der Hauptkomponente in zweifach geladener Form überein. Ein weiteres Signal wurde bei m/z 15 654 beobachtet.
BEISPIEL 22
Produktion von Immunogen C unter Verwendung von Bromacetylglycin-modifiziertem BSA
Die Konjugation wurde durch das in Beispiel 21 gegebene Verfahren unter Verwendung von Hapten C durchgeführt.
MALDI-Ergebnisse (siehe 9 der begleitenden Abbildungen) zeigten, dass 7,2 Moleküle Hapten C zu einem Molekül modifiziertem BSA konjugiert worden waren. Insbesondere lag ein Hauptsignal vor, das eine durchschnittliche protonierte Masse für diese Probe von m/z 76 770 anzeigt. Das Signal bei m/z 38 367 stimmt mit der Hauptkomponente in zweifach geladener Form überein. Ein weiteres Signal wurde bei m/z 15 514 beobachtet.
BEISPIEL 23: Reaktionsschema 4
Produktion von Immunogen F unter Verwendung von BSA
Es wurden 50 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) in 600 μl Wasser gelöst und sofort zu einer Lösung von 100 mg BSA (1,5 μmol) in 4 ml Wasser gegeben. In 2 ml wasserfreiem DMF gelöstes Hapten F (19,7 mg, 45 μmol) wurde unter Rühren tropfenweise zugegeben. Es wurden 5 mg Sulfo-NHS zugegeben und die entstehende Lösung wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die Lösung 24 Stunden bei 4 °C unter Rühren gegen 51 phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, dialysiert.
MALDI-Ergebnisse (siehe 10 der begleitenden Abbildungen) zeigten, dass 17,1 Moleküle Hapten F zu einem Molekül BSA konjugiert worden waren. Insbesondere lag ein Hauptsignal vor, das eine durchschnittliche protonierte Masse für diese Probe von m/z 73 590 anzeigt. Das Signal bei m/z 36 870 stimmt mit der Hauptkomponente in einer zweifach geladenen Form überein. Es wurden weitere Signale beobachtet, einschließlich dessen bei m/z 14 177.
BEISPIEL 24: Reaktionsschema 5
Produktion von Immunogen G unter Verwendung von BSA
Diese Konjugation wurde durch das in Beispiel 23 beschriebene Verfahren unter Verwendung von Hapten G (12,57 mg, 43 μmol) durchgeführt.
MALDI-Ergebnisse (siehe 11 der begleitenden Abbildungen) zeigten, dass 10,4 Moleküle Hapten G zu einem Molekül BSA konjugiert worden waren. Insbesondere lag ein Hauptsignal vor, das eine durchschnittliche protonierte Masse für diese Probe von m/z 69 355 anzeigt. Das Signal bei m/z 34 971 stimmt mit der Hauptkomponente in einer zweifach geladenen Form überein. Es wurden weitere Signale beobachtet, einschließlich dessen bei m/z 13 924.
BEISPIEL 25
Konjugation der Haptene B und E zum Markierungsagens
(Meerrettichperoxidase (HRP))
Es wurden 10 mg EDC in 800 μl Wasser gelöst und sofort zu einer Lösung des Haptens (1 mg) in 200 μl DMF gegeben. Die entstehende Lösung wurde vorsichtig gemischt und dann zu einer Lösung von HRP (20 mg) in 1 ml Wasser gegeben. Nach dem Mischen wurden 5 mg Sulfo-NHS zugegeben und die gesamte Reaktion wurde über Nacht bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Das entstehende Konjugat wurde durch Durchlaufen durch zwei PD10-Säulen (Pharmacia Biotech) gereinigt, mit 20 mM PBS, pH 7,2, eluiert und dann über Nacht bei 4 °C gegen 20 mM PBS, pH 7,2, dialysiert.
BEISPIEL 26
Konjugation von Hapten G zum Markierungsagens (HRP)
Es wurden 10 μl Triethylamin (TEA) zu einer Lösung von Hapten G (1 mg) in 400 μl DMF gegeben und die entstehende Lösung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Dann wurden 4 μl Isobutylchlorformiat (BCF) zugegeben und für weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das aktivierte Hapten wurde sofort zu einer Lösung von HRP (20 mg) in 2 ml Wasser gegeben und die Reaktion wurde über Nacht unter Mischen bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Das entstehende Konjugat wurde durch Durchlaufen durch zwei PD10-Säulen (Pharmacia Biotech) gereinigt, mit 20 mM PBS, pH 7,2, eluiert und dann über Nacht bei 4 °C gegen 20 mM PBS, pH 7,2, dialysiert.
BEISPIEL 27
Immunisierung und Bluten
Es wurde eine wässrige Lösung von jedem der Immunogene, die in den Beispielen 21, 22, 23 und 24 hergestellt wurden, mit komplettem Freund-Adjuvans (FCA) formuliert, um eine Emulsion zu bilden, die aus 2 mg/ml Immunogen in 50 % (v/v) FCA besteht. Es wurden drei Schafe mit dieser Emulsion immunisiert, wobei 0,25 ml subkutan an jeder von vier Stellen in der Flanke von jedem Tier injiziert wurden. Nachfolgende Immunisierungen (Boosts) enthielten 1 mg/ml Immunogen, das in 50 % (v/v) inkomplettem Freund-Adjuvans (FIA) emulgiert war, und wurden auf die gleiche Weise in monatlichen Abständen für 1 Jahr verabreicht. Die Blutprobenentnahme erfolgte 7 bis 14 Tage nach jedem Boost. Jede Probe wurde zur Produktion von Antiserum verarbeitet, das durch Caprylsäure- und Ammoniumsulfat-Fällung aufgereinigt wurde und ergab eine Immunoglobulin G (IgG)-Fraktion. Die IgG-Fraktion wurde durch kompetitiven ELISA-Miktrotiterplatten-Assay, wie nachstehend beschrieben ist, beurteilt.
BEISPIEL 28
Kompetitive ELISA-Mikrotiterplatten-Assays für Norfentanyl und Fentanyl.

(a) Die Wells einer 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatte mit erhöhter Bindung wurden mit der IgG-Frakion des gegen Immunogen A (Hapten A-BSA) (Beispiel 21) produzierten Antiserums, das in 10 mM Tris, pH 8,5, verdünnt wurde (125 μl/Well), beschichtet. Die geeignete Beschichtungsverdünnung des Antikörpers wurde unter Verwendung von normalen ELISA-Schachbrett-Techniken bestimmt. Die Platte wurde 2 Stunden bei 37 °C inkubiert, 4-mal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die Tween 20 (TEST) enthielt, gewaschen und trocken geklopft. Standardlösungen von Fentanyl und Norfentanyl wurden in TEST mit 0, 1, 5, 10, 50 und 500 ng/ml hergestellt und 25 μl von jedem wurde zu den entsprechenden Wells gegeben (siehe 12). Es wurden 100 μl von Konjugat B (Hapten B-HRP) (Beispiel 25), das in Tris-Puffer, der EDTA, D-Mannitol, Saccharose, Thimerosal und BSA enthielt, verdünnt war, zu jedem der Wells gegeben, wie in 12 gezeigt ist. Die geeignete Verdünnung von Konjugat wurde auch unter Verwendung von normalen ELISA-Schachbrett-Techniken bestimmt. Die Platte wurde 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Das überschüssige ungebundene Konjugat wurde durch 6-maliges Waschen mit TEST über eine Zeitdauer von 10 Minuten entfernt. Es wurden 125 μl von Tetramethylbenzidin (TMB)-Substratlösung zu jedem Well der Platte gegeben, die dann 15 bis 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 125 μl 0,2 M H₂SO₄ zu jedem Well abgebrochen. Dann wurde die Absorption bei 450 nm unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesers gemessen. Die in dem Assay erzeugten Daten sind nachstehend in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: In einem kompetitiven Mikrotiterplatten-Assay erzeugte Daten für Norfentanyl und Fentanyl, in dem Antiserum, das gegen Immunogen A (Hapten A-BSA) (Beispiel 21) produziert wurde, und Konjugat B (Hapten B-HRP) als Detektionsreagenz (Beispiel 25) eingesetzt wurden.

Standard-Konzentration ng/ml	Fentanyl		Norfentanyl
	A₄₅₀	% B/B₀	A₄₅₀	% B/B₀
0	2,3		2,29
0,05	2,07	90,15	2,18	94,94
0,1	1,84	80,2	2,11	91,83
0,5	1,26	54,91	1,94	84,57
1	0,87	38,01	1,77	77,27
5	0,27	11,74	1,37	59,8
25	0,08	3,68	0,76	33,32
250	0,08	3,53	0,24	10,57

IC₅₀	0,61 ng/ml		9,07 ng/ml

A₄₅₀ = Absorption bei 450 nm
B = Absorption bei 450 nm bei x ng/ml Standard-Konzentration
B₀ = Absorption bei 450 nm bei 0 ng/ml Standard-Konzentration
IC₅₀ = Standard-Konzentration, die 50 % B/B₀ erzeugt

(b) Auf ähnliche Weise zu der in Beispiel 28(a) Beschriebenen und unter Verwendung der gleichen Definitionen für A₄₅₀, B, B₀ und IC₅₀ wurden die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit der IgG-Fraktion des Antiserums, das gegen Immunogen A (Hapten A-BSA) (Beispiel 21) produziert wurde, beschichtet und Konjugat G (Hapten G-HRP) (Beispiel 26) wurde als Detektionsreagenz eingesetzt. Die erzeugten Daten sind nachstehend in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: In einem kompetitiven Mikrotiterplatten-Assay erzeugte Daten für Norfentanyl und Fentanyl, in dem Antiserum, das gegen Immunogen A (Hapten A-BSA) (Beispiel 21) produziert wurde, und Konjugat G (Hapten G-HRP) als Detektionsreagenz (Beispiel 26) eingesetzt wurden.

Standard-Konzentration ng/ml	Fentanyl		Norfentanyl
	A₄₅₀	% B/B₀	A₄₅₀	% B/B₀
0	1,99		1,94
0,05	1,94	97,09	1,85	95,69
0,1	1,94	97,54	1,82	93,93
0,5	1,71	85,9	1,67	86,31
1	1,47	73,66	1,52	78,48
5	0,4	19,97	1,03	53,04
25	0,07	3,54	0,56	29,14
250	0,03	1,43	0,14	7,05

IC₅₀	2,03 ng/ml		6,14 ng/ml

(c) Auf ähnliche Weise zu der in Beispiel 28(a) Beschriebenen wurden die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit der IgG-Fraktion des Antiserums, das gegen Immunogen C (Hapten C-BSA) (Beispiel 22) produziert wurde, beschichtet und Konjugat E (Hapten E-HRP) (Beispiel 25) wurde als Detektionsreagenz eingesetzt. Die erzeugten Daten sind nachstehend in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3: In einem kompetitiven Mikrotiterplatten-Assay erzeugte Daten für Norfentanyl und Fentanyl, in dem Antiserum, das gegen Immunogen C (Hapten C-BSA) (Beispiel 22) produziert wurde, und Konjugat E (Hapten E-HRP) als Detektionsreagenz (Beispiel 25) eingesetzt wurden.

Standard-Konzentration ng/ml	Fentanyl		Norfentanyl
	A₄₅₀	% B/B₀	A₄₅₀	% B/B₀
0	2,3		2,2
0,05	1,9	82,2	2,1	94,3
0,1	1,6	68,2	2,0	90,8
0,5	0,8	34,4	1,9	88,5
1	0,5	23,4	1,9	88,6
5	0,2	8,4	1,9	89,2
25	0,1	2,8	2,0	90,1
250	0,0	1,0	2,0	89,6

^IC50	0,24 ng/ml		> 250 ng/ml

Literatur

Camu et al.; Anesth. Analg.; 61; S. 657-61 (1982)
Frincke, J. M. & Henderson, G. L.; Drug Metab. Dispos.; 8(6); S. 425-7 (1980).
Hammargen, W. R. & Henderson, G. L.; J. Anal. Toxicol.; 12; S. 183-191 (1988).
Henderson et al.; J. Pharmacol. Exp. Ther.; 192 (2); S. 489-96 (1975).
Makowski et al.; Annals of Clinical and Laboratory Science; 25 (2); S. 169-177 (1995).
McDonald et al.; Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol.; 57 (3); S. 389-407 (1987).
Meuldermans et al.; Arch. Int. Pharmacodyn. Ther.; 257; S. 4-19 (1982).
Michiels et al.; Eur. J. Clin. Pharmacol.; 12 (2); S. 153-8 (1977).
Ruangyuttikarn et al.; J. Anal. Toxicol.; 14; S. 160-164 (1990).
Silverstein et al.; Anesthesia and Analgesia; 76; S. 618-621 (1993).
Watts, V. W. & Caplan, Y. H.; J. Anal. Toxicol.; 14; S. 266-272 (1990).

Claims

Immunogen der Formel:
worin Z₁ Wasserstoff ist und Z₄ aus einem Crosslinker ausgewählt ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist, oder
worin Z₂ ein Crosslinker ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial an einer ortho-, einer meta- oder einer para-Position gekoppelt ist, mit der Maßgabe, dass das Immunogen kein Heterodimer der Formel (BKAn)(X)(Y) ist; worin BKAn ein Bradykinin-Antagonist-Peptid ist; worin Y Folgendes ist:
worin R₁ die verbindende Gruppe X der Formel CH₂CH₂(Phe)CH₂C(O) ist.
Konjugat der Formel:
worin Z₁ Wasserstoff ist; Z₄ aus einem Crosslinker ausgewählt ist, der kovalent an ein Markierungsagens, das detektierbar ist, gebunden ist, oder
worin Z₂ ein Crosslinker ist, der kovalent an ein Markierungsagens gebunden ist, das an einer ortho-, einer meta- oder einer para-Position detektierbar ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, in dem der Crosslinker von Z₂ an der para-Position ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Crosslinker an seinem freien Ende vor dem Koppeln an das Antigenität-verleihende Trägermaterial oder Binden an ein Markierungsagens zur Bildung des Immunogens bzw. des Konjugats mit -CO-R endet, worin R Hydroxyl und ein kurzkettiges Alkyl (C_1-5), bevorzugt eine (C_1-2)-Alkyl-Einheit ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Crosslinker vor dem Koppeln an das Antigenität-verleihende Trägermaterial oder Binden an ein Markierungsagens zur Bildung des Immunogens bzw. des Konjugats Folgendes umfasst: -(NH)_a-(CO)_b-X_c-(CH₂)_d-S_e-CO-R worin unabhängig a 0 oder 1 ist; b 0 oder 1 ist; X Sauerstoff oder Schwefel ist; c 0 oder 1 ist; d aus den ganzen Zahlen 1-5 ausgewählt ist; e 0 oder 1 ist und R eine kurzkettige (C_1-5)-Alkyl-Einheit, bevorzugt eine C_1-2-Alkyl-Einheit oder eine Hydroxyl-Einheit ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach Anspruch 5, worin a 1 ist; b 1 ist; c 0 ist und d 2 ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach Anspruch 6, worin e 1 ist und R Methyl ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach Anspruch 6, worin e 0 ist und R Hydroxyl ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach einem der Ansprüche 6-8, worin Z₁ Wasserstoff ist und der Z₂-Crosslinker an der para-Position ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach Anspruch 5, worin a 0 ist; b 0 ist und c 0 ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach Anspruch 10, worin d 0 ist; e 1 ist und R Methyl ist.
Immunogen oder ein Konjugat nach Anspruch 10, worin d 0 oder 1 ist; e 0 ist und R Hydroxyl ist.
Immunogen oder Konjugat nach einem der Ansprüche 10-12, worin Z₄ der Crosslinker ist.
Immunogen nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 13, worin das Antigenität-verleihende Trägermaterial aus einem Protein, einem Proteinfragment, einem synthetischen Polypeptid und einem halbsynthetischen Polypeptid ausgewählt ist.
Antikörper, die gegen ein Immunogen gebildet sind, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die ein Immunogen der folgenden Formel umfasst:
worin Z₁ Wasserstoff ist und Z₄ aus einem Crosslinker ausgewählt ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist, oder
worin Z₂ ein Crosslinker ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial an einer ortho-, einer meta- oder einer para-Position gekoppelt ist, oder gegen ein Immunogen nach einem der Ansprüche 3 bis 14, worin die Antikörper fähig sind, mit mindestens einem strukturellen Epitop eines Metaboliten von Fentanyl oder eines Metaboliten eines Fentanyl-Analogons zu binden.
Verfahren zur Herstellung der Antikörper nach Anspruch 15, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: des Immunisierens eines Tieres durch wiederholte Verabreichung des Immunogens, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die das Immunogen der folgenden Formel umfasst:
worin Z₁ Wasserstoff ist und Z₄ aus einem Crosslinker ausgewählt ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial gekoppelt ist, oder
worin Z₂ ein Crosslinker ist, der an ein Antigenität-verleihendes Trägermaterial an einer ortho-, einer meta- oder einer para-Position gekoppelt ist, oder eines Immunogens nach einem der Ansprüche 3 bis 14; und des Sammelns des entstehenden Serums aus dem immunisierten Tier.
Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 13, worin das detektierbare Markierungsagens aus Folgenden ausgewählt ist: einem Enzym, das bevorzugt eine Peroxidase, am bevorzugtesten eine Meerrettichperoxidase ist; einer lumineszierenden Substanz, die bevorzugt aus einer biolumineszierenden Substanz, einer chemilumineszierenden Substanz und einer fluoreszierenden Substanz oder einer Mischung davon ausgewählt ist; und einer radioaktiven Substanz; oder einer Mischung davon.
Verfahren zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten von Fentanyl oder von Metaboliten von Fentanyl-Analoga in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Inkontaktbringen der Probe mit einem Konjugat nach einem der Ansprüche 2 bis 13 und 17 oder einer Mischung davon und mit den Antikörpern nach Anspruch 15 oder einer Mischung davon; Detektieren oder Bestimmen der Quantität von gebundenem Konjugat; und Ableiten der Gegenwart oder der Menge von Metaboliten von Fentanyl und Metaboliten von Fentanyl-Analoga in der Probe aus einer Kalibrierungskurve.
Kit zum Detektieren oder Bestimmen der Quantität von Metaboliten von Fentanyl oder Metaboliten von Fentanyl-Analoga, wobei der Kit ein Kojugat nach einem der Ansprüche 2 bis 13 und 17 oder eine Mischung davon und die Antikörper nach Anspruch 15 oder ein Mischung davon einschließt.
Verfahren oder ein Kit gemäß Anspruch 18 oder 19, worin die Antikörper gegen ein Immunogen, in dem Z₂ der Crosslinker ist, gebildet sind.
Verfahren oder ein Kit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, worin Z₄ des Konjugats der Crosslinker ist.