DE69922680T2

DE69922680T2 - Detektion und quantifikation von vancomycin in den biologischen flüssigkeiten

Info

Publication number: DE69922680T2
Application number: DE69922680T
Authority: DE
Inventors: Maciej Adamczyk; M. Elaine BRATE; M. Mary PERKOWITZ; D. Sushil REGE
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2019-10-16
Also published as: ATE285075T1; WO2000023806A1; US20020009708A1; JP4711509B2; CA2346717A1; DE69922680D1; ES2235534T3; EP1121599B1; JP2002528704A; EP1121599A1; WO2000023806A9; US6797479B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, die Antikörper verwenden, welche aus Immunogenen hergestellt sind, und markierte Reagenzien für die spezifische Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe, vorzugsweise für die Verwendung in Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays, worin diese Verfahren einen stabilen Kalibrator verwenden.
Hintergrund der Erfindung
Während der letzten 30 Jahre war Vancomycin der Arzneistoff der Wahl für die Behandlung von grampositiven Infektionen, ausgelöst durch Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus. Mit ihm werden auch bakterielle Infektionen bei Patienten behandelt, die gegen β-Lactamantibiotika allergisch sind. Vancomycin wird von Amycolatopsis orientalis produziert (zuvor bezeichnet als Nocardia orientalis und Streptomyces orientalis). Vancomycin ist resistent gegenüber gramnegativen Organismen. Eine Kreuzresistenz mit anderen Antibiotika ist unbekannt und trotz seiner langen Verwendung wurde wenig über das Auftreten von resistenten Organismen während der Therapie berichtet. Vancomycin wird nicht vom Gastrointestinaltrakt absorbiert und somit wird das Antibiotikum verwendet, um Enterocolitis zu behandeln, welche insbesondere durch Clostridium difficile im Darm verursacht wird. Nagarajan, R., J. Antibiotics, 46:1181 (1993). Vancomycin entfaltet seine antibakterielle Wirkung durch bevorzugte Bindung an Peptidintermediate, die in die Biosynthese von bakteriellem Zellwandpeptidoglycan involviert sind.
Vancomycin wird über die Nieren ausgeschieden. Die Halbwertszeit des Arzneistoffs, 5-11 Stunden bei normalen Patienten, ist verlängert auf 2-5 Tage bei Patienten mit Niereninsuffizienz und ist sogar noch länger bei Dialysepatienten. Obwohl Vancomycin ein relativ sicherer Arzneistoff ist, schließen nachteilige Wirkungen, die beobachtet wurden, Nephrotoxizität und Autotoxizität ein.
Für die sichere Verabreichung von Vancomycin ist es üblich, seine Spiegel im Patientenblut quantitativ zu bestimmen. Es wurde vermutet, dass, weil der Arzneistoff im Körper von nierengeschädigten Patienten länger bleibt, das Aussetzen gegenüber der internen Körpertemperatur für längere Zeiträume zu der Akkumulierung von Abbauprodukten führt, die als kristalline Abbauprodukte I und II bekannt sind ( Crystalline Degradation Product, CDP-I und CDP-II). CDP-I und CDP-II sind Rotationsisomere, welche getrennt voneinander isoliert werden können. Vancomycin und seine zwei Hauptabbauprodukte CDP-I & CDP-II sind in den 1-3 dargestellt.
Es ist bekannt, daß Vancomycin in einer wässerigen Umgebung instabil ist. U.S. Patent 4,670,258 von Harris u. a. offenbart eine Zusammensetzung aus Vancomycin und einem Tripeptid, welche den Arzneistoff in einer wässerigen Lösung stabilisieren soll. Solche Tripeptide können jedoch bei Immunoassaytechniken störend wirken. Zum Beispiel kann eine solche Störung auftreten, wo ein Antikörper mit einem stabilisierenden Peptid um dieselbe Bindungsstelle des Analyten konkurriert.
In der Geschichte wurden Vancomycinkonzentrationen in biologischen Flüssigkeiten durch Fluoreszenzimmunoassay (FIA), Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Radioimmunoassay (RIA), den homogenen Enzymimmuntest (enzyme multiplied immunoassay technique, EMIT) oder mikrobiologische Techniken bestimmt. Die HPLC wird zwar von Fachleuten als das genaueste aller Verfahren für die Quantifizierung von Vancomycin erachtet, ist aber ein langsames und arbeitsintensives Verfahren, das hochqualifiziertes Personal und eine spezielle Ausrüstung erfordert, die nicht immer in jeder klinischen Einrichtung verfügbar ist.
In letzter Zeit wurden Fluoreszenzpolarisationstechniken verwendet, um einen Assay für Vancomycin durchzuführen. Fluoreszenzpolarisationstechniken basieren auf kompetitiven Bindungs-Immunoassayprinzipien. Das Prinzip hinter der Fluoreszenzpolarisation ist, dass eine fluoreszierend markierte Verbindung, wenn sie durch ein linear polarisiertes Licht angeregt wird, Fluoreszenz emittieren wird, die einen Polarisationsgrad hat, der umgekehrt proportional zu ihrer Rotationsgeschwindigkeit ist. Deshalb bleibt, wenn ein fluoreszierend markierter Tracer-Antikörper-Komplex durch ein linear polarisiertes Licht angeregt wird, das emittierte Licht hochpolarisiert, weil der Fluorophor zwischen der Zeit, in welcher Licht absorbiert wird, und derjenigen, in der Licht emittiert wird, am Rotieren gehindert wird. Wenn eine "freie" Tracerverbindung (d.h., nicht an einen Antikörper gebunden,) durch linear polarisiertes Licht angeregt wird, ist seine Rotation viel schneller als das entsprechende Tracer-Antikörper-Konjugat, das in einem kompetitiven Bindungsimmunoassay produziert wird.
Fluoreszenzpolarisationstechniken und Verbindungen, die für die Verwendung als fluoreszierende Marker geeignet sind, wurden im Fachgebiet beschrieben. Zum Beispiel offenbaren U.S. Patent Nrn. 4,510,251 und 4,614,823 von Kirkemo et al. jeweils einen Fluoreszenzpolarisationsassay für Liganden, unter Verwendung von Aminomethylfluoresceinderivaten. U.S. Patetn Nr. 4,476,229 von Fino et al., offenbart substituierte Carboxyfluoresceine, einschließlich derjenigen, die ein Vancomycinanalog enthalten, für die Verwendung in einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay. U.S. Patent Nrn. 4,420,568 und 5,097,097 von Wang et al., offenbaren einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay, der substituierte Triazinylaminofluoresceine als Tracer verwendet. Wang in U.S. Patent Nr. 4,420,568 offenbart die Reaktion von Vancomycin und Dichlortriazinylaminofluorescein (DTAF). Jedoch beschreibt dieses Patent nicht die Struktur des Produkts einer solchen Reaktion oder seine Anwendung in dem heterogenen System. Griffin et al., (JACS 115, 6482 (1993)) beschreiben ein selektives Verfahren für die Synthese von Vancomycinderivaten, die funktionelle Alkyl-, Imidazol- und Amin-Gruppen tragen, die an den C-Terminus angeheftet sind, und sie haben die Nützlichkeit dieses Verfahrens für die Herstellung von Derivaten, die unterschiedliche funktionelle Gruppen tragen, angezeigt. Jedoch gibt es keine Beschreibung der Synthese von immunogenem Material oder Immunoverbindungen und deren Verwendung für die Quantifizierung von Vancomycin.
WO 96/31780 offenbart Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA)-Reagenzien, -Verfahren und -Testkits für die spezifische Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe. Eine Vorbehandlungslösung entfernt das Protein von allem an Protein gebundenen Vancomycin, um das Vancomycin für den Assay freizusetzen.
Handelsübliche Fluoreszenzpolarisationsassays (FPIA) für Vancomycin sind erhältlich. Zum Beispiel schließen handelsübliche Assays (Abbott TDX^®, TDXFLX^®-Assays (hiernach bezeichnet als die "handelsüblichen Abbott-Vancomycinassays")) Reagenzien für die quantitative Messung von Vancomycin in Serum oder Plasmaproben ein. Diese Assays verwenden ein Vancomycinderivat, das mit einem Dichlortriazinylaminofluorescein (DTAF) markiert ist (hiernach bezeichnet als der "handelsübliche Tracer"), und polyklonale Schaf-Antikörper gegen Vancomycin (hiernach bezeichnet als "handelsübliche Antikörper").
FPIAs haben einen Vorteil gegenüber Radioimmunoassays (RIA) dahingehend, dass es keine radioaktiven Substanzen gibt, die entsorgt werden müssen, und dass sie homogene Assays sind, die leicht und schnell durchgeführt werden können. Es wurde jedoch berichtet, dass die handelsüblichen Vancomycinassays einen gelegentlichen Anstieg der gemessenen Vancomycinwerte aufweisen, welcher nicht mit HPLC-Messungen übereinstimmt. Diese Anstiege wurden erhöhter Kreuzreaktivität mit CDP-I und CDP-II zugeschrieben. Wie oben angegeben, können die Isomere CDP-I und CDP-II getrennt voneinander isoliert werden. Wie erwartet wird jede Lösung, die aus CDP-I hergestellt wird, immer eine Gleichgewichtsmischung von beiden Isomeren enthalten. Somit messen die Messungen der CDP-I-Kreuzreaktivität, die hierin berichtet sind, die Kreuzreaktivität der Gleichgewichtsmischung. Somit existiert eine kontinuierliche Notwendigkeit verbesserter Assays, die die Konzentration von Vancomycin in der Gegenwart von kreuzreaktiven Abbauprodukten in biologischer Flüssigkeit schnell und genau bestimmen können.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Immunoassayverfahren bereit, welche Antikörperreagenzien und markierte Reagenzien für die Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe verwenden. Hierin offenbart sind synthetische Verfahren für die Herstellung von Immunogenen, welche für die Produktion solcher Antikörperreagenzien verwendet werden, ebenso wie Verfahren für die Herstellung solcher markierter Reagenzien.
Ebenfalls hierin offenbart sind Antikörperreagenzien, die verwendet werden können und in vielen Fällen entscheidend sind für die Konstruktion von stabilen Vancomycinkalibratoren und Kontrollen, welche in Assays verwendet werden können, um die Vancomycinkonzentration zu messen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet einen Vorteil im Fachgebiet außerhalb der zuvor bekannten Immunoassays für die Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe. Speziell wurde entdeckt, dass die hierin offenbarten Antikörperreagenzien, welche im Wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit den Metaboliten CDP-I und CDP-II haben, in der Gegenwart von Polypeptiden verwendet werden können, welche das Vancomycinmolekül stabilisieren, zur Quantifizierung von Vancomycin. In der vorliegenden Erfindung behindert die Anwesenheit solcher Polypeptide nicht die Quantifizierung von Vancomycin in einer Probe.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe bereit, worin:

(a) die Testprobe mit einem Antikörperreagens in Kontakt gebracht wird, das Antikörper hat, die in der Lage sind, sich spezifisch an Vancomycin zu binden, und die mit einem Immunogen in 6 produziert werden, worin P ein immunogenes Trägermaterial ist und X eine verbindende Einheit aus von 0 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatomen ist, einschließlich nicht mehr als zehn Heteroatomen, angeordnet als eine gerade oder verzweigte Kette oder als ein zyklischer Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Bedingungen, dass nicht mehr als zwei Heteroatome direkt aufeinander folgend miteinander verbunden werden dürfen, dass die Sequenzen keine -O-O-Bindungen enthalten können, dass zyklische Anteile 6 oder weniger Glieder enthalten und dass eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen vorkommen darf, und ein markiertes Reagens, das in der Lage ist, die Bindung des Antikörpers an das Vancomycin zu ersetzen, vorzugsweise das markierte Reagens von 8, worin Q ein nachweisbarer Anteil ist und X von 0 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatome ist, einschließlich nicht mehr als zehn Heteroatomen, angeordnet als eine gerade oder verzweigte Kette oder als ein zyklischer Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Bedingungen, dass nicht mehr als zwei Heteroatome direkt aufeinander folgend miteinander verknüpft werden dürfen, dass die Sequenz keine -O-O-Bindungen enthalten kann, dass zyklische Anteile 6 oder weniger Glieder enthalten und dass eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen stattfinden darf, um eine Reaktionslösung zu bilden; und
(b) die Menge des markierten Reagens' in der Reaktionslösung, welches entweder an einen Antikörper gebunden ist oder nicht, abhängig von der Menge an Vancomycin in der Testprobe gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Verfahren einen stabilen Kalibrator verwendet, der eine wässerige Lösung umfasst, die ein mit Polypeptid stabilisiertes Vancomycinmolekül enthält, worin das Polypeptid nicht die Bindung eines Antikörpers an das Vancomycinmolekül behindert.

Die Erfindung stellt weiterhin das obige Verfahren bereit, worin Fluoreszenzpolarisation verwendet wird.
Antikörper, die in dem Verfahren verwendet werden, sind spezifisch für Vancomycin und haben im Wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit CDP-I und CDP-II und sind in der Lage, sich an eine beliebige nicht peptidische Stelle am Vancomycin zu binden. Spezieller konkurrieren die Antikörper nicht mit stabilisierenden Peptiden, insbesondere Polypeptiden, die verwendet werden, um Vancomycin zu stabilisieren, um sich an die Peptid-bindende Stelle am Vancomycin zu binden.
Die monoklonalen Antikörper, die von der Hybridomzelllinie, bezeichnet als HB 11834, produziert werden, werden für die Quantifizierung von Vancomycin am meisten bevorzugt, am meisten bevorzugt durch Fluoreszenzpolarisation.
Das Verfahren der Erfindung verwendet stabile Kalibratoren für die Quantifizierung von Vancomycin. Die Kalibratoren sind in einer wässerigen Lösung und enthalten ein mit Polypeptid stabilisiertes Vancomycinmolekül. Das Polypeptid behindert die Bindung eines Antikörpers an das Vancomycinmolekül nicht.
Ebenfalls bereitgestellt werden Kits, die nützlich sind für die Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe, welche Antikörperreagenzien, markierte Reagenzien und stabile Kalibratoren wie oben definiert enthalten. Bevorzugte Kits haben monoklonale IgG-Antikörper, die von einem Immunogen in 5 produziert wurden.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die Datei dieses Patents enthält mindestens eine farblich ausgestaltete Zeichnung. Kopien dieses Patents mit Farbzeichnungen) werden durch das Patent- und Markenamt auf Anfrage und nach Zahlung der nötigen Gebühr bereitgestellt.
1 zeigt die Struktur von Vancomycin.
2 zeigt die Struktur eines der Hauptmetaboliten von Vancomycin, CDP-I.
3 zeigt die Struktur eines anderen der Hauptmetaboliten von Vancomycin, CDP-II.
4a bis 4c veranschaulichen einen repräsentativen synthetischen Weg für die Kopplung von Vancomycin an ein Trägerprotein.
5a bis 5d veranschaulichen den synthetischen Weg für die Kopplung von Vancomycin an Thyreoglobulin.
6 zeigt die Struktur des Immunogens, das in der Erfindung verwendet wird.
7 zeigt die Struktur des am meisten bevorzugten Immunogens, das in der Erfindung verwendet wird.
8 zeigt die Struktur des bevorzugten markierten Reagens', das in der Erfindung verwendet wird.
9 zeigt die allgemeine Struktur des am meisten bevorzugten markierten Reagens', das in der Erfindung verwendet wird.
10a und 10b veranschaulichen den synthetischen Weg zur Kopplung von Vancomycin an Fluorescein.
11 zeigt die Ergebnisse einer Korrelation eines existierenden kommerziellen Assays mit einem Assay, der den am meisten bevorzugten Antikörper, der hierin offenbart ist, verwendet.
12 zeigt die Korrelation eines Assays, der hierin offenbart ist, mit HPLC.
13 zeigt die Ergebnisse eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays, der hierin offenbart ist.
14 zeigt verschiedene chemische Schemata für die Synthese von N-Vancosaminyl-abgeleiteten, N-Methylleucyl-abgeleiteten und Carboxyl-HDA-abgeleiteten Tracern.
15 zeigt einen Biotin-aktiven Ester (2), einen 6-Carboxyfluorescein-aktiven Ester (3) und einen Acridiniumchemilumineszierenden Marker (4). Diese Verbindungen werden in den verschiedenen chemischen Schemata, die in 14 gezeigt sind, verwendet, um N-Vancosaminyl-abgeleitete Tracer und Carboxyl-HDA-abgeleitete Tracer zu synthetisieren.
16 zeigt die Strukturen von Vancomycinanalogen und -tracern.
17 zeigt Lösungskompetitionskurven für die Bestimmung von Gleichgewichtsdissoziationskonstanten für Ring-2-Dechlorvancomycin (dargestellt durch ·) und biotinylierten Carboxyl-HDA-Vancomycintracer (dargestellt durch ·).
18 zeigt ein Modell der Bindungswechselwirkung zwischen Vancomycin und einem Zellwandpeptidanalog, (N^α N^ε-Diacetyl)-KAA. Gestrichelte Linien stellen Wasserstoffbindungen dar.
19 zeigt die Bindung von Vancomycin, anti-Vancomycin- Fab-Fragment und Vancomycin/Antivancomycin-Fab-Fragmentkomplex an Aminocaproat-derivatisierte (N^ε-Acetyl)-KAA-Tripeptidbiosensoroberfläche.
20 zeigt die Bereiche von Vancomycin, an die sich die hierin offenbarten Antikörper binden. Speziell binden sich die Antikörper an die Bereiche, die in schwarz, rot und grün dargestellt sind. Die Antikörper binden sich jedoch nicht an den Peptid-bindenden Bereich, welcher in blau dargestellt ist.
21 zeigt die chemilumineszierenden Tracer, Vancomycinyl-N-methylleucylacridinium.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie in dieser Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendet, werden die folgenden Wörter diese entsprechenden Bedeutungen haben:
"Heteroatom" bedeutet Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor.
"CHCl₃" bedeutet Chloroform, "CDCl₃" bedeutet Deuterochloroform, "MeOH" bedeutet Methanol, "DMF" bedeutet Dimethylformamid, "CH₂Cl₂" bedeutet Methylenchlorid, "Et₂O" bedeutet Diethylether und "DMSO" bedeutet Dimethylsulfoxid.
"Verbindender Anteil", "Verknüpfer", "Spacer", "Spacerarm", und "Linker" werden miteinander austauschbar verwendet und sollen jede kovalent gebundene chemische Einheit bezeichnen, welche eine definierte Substanz (wie zum Beispiel ein Hapten) von einer zweiten definierten Substanz (wie zum Beispiel einem immunogenen Träger oder einem nachweisbaren Anteil) trennt.
"Stabil" bezieht sich auf die Umwandlung von Vancomycin in seine Abbauprodukte, CDP-I und CDP-II, in einer wässerigen Umgebung in Abhängigkeit von der Zeit. Wie hierin beschrieben, sind Kalibratoren, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, für nicht weniger als zwei (2) Monate stabil.
"Im Wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit CDP-I und CDP-II" bedeutet, dass die Kreuzreaktivität der hierin offenbarten Antikörper mit den Metaboliten CDP-I und CDP-II unterhalb der Empfindlichkeit eines Assays für Vancomycin liegt, wie hierin in Tabelle 3 veranschaulicht.
"Nicht peptidische Stelle" bezieht sich auf eine beliebige Stelle am Vancomycinmolekül, die nicht die Peptid-bindende Stelle ist.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, die Antikörper verwenden, die aus Immunogenen, markierten Reagenzien und stabilen Kalibratoren hergestellt werden, welche geeignet sind zur Verwendung für die Quantifizierung von Vancomycin. Die spezifische Quantifizierung von Vancomycin wird erreicht, indem zunächst eine Testprobe mit einem markierten Reagens (hierin auch als Tracer bezeichnet) und einem Antikörperreagens in Kontakt gebracht wird, entweder gleichzeitig oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge, und dann die Menge an markiertem Reagens gemessen wird, welches entweder in einer Bindungsreaktion mit dem Antikörperreagens teilgenommen hat oder nicht, als eine Funktion der Menge des Vancomycins in der Testprobe. Die hierin offenbarten Antikörper und markierten Reagenzien sind insbesondere nützlich in Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays (FPIA) für die spezifische Quantifizierung von Vancomycin.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden das markierte Reagens und die Antikörperreagenzien in einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay verwendet, welcher Spezifität mit der Geschwindigkeit und der Bequemlichkeit von homogenen Verfahren verbindet, um eine verlässliche Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe und das Vermeiden einer Störung durch die Hauptmetaboliten von Vancomycin, CDP-I und CDP-II, bereitzustellen.
Die Testprobe kann jede natürlich vorkommende Körperflüssigkeit sein, oder ein Extrakt oder eine Verdünnung davon und schließt folgendes ein, soll aber nicht darauf beschränkt sein: Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Fäzes, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Hirngewebe und dergleichen.
Wie es einem, der im Fachgebiet durchschnittlich bewandert ist, bekannt ist, muß jemand, wenn er spezifische Antikörper und komplementär markierte Haptene herstellt, die chemische Struktur von sowohl dem verwendeten Immunogen, um die Antikörperantwort zu erzeugen, als auch von dem markierten Hapten berücksichtigen. Traditionell heftet man das Hapten über eine Stelle auf dem Hapten an das Trägerprotein an, die von den einzigartigen Merkmalen des Haptens, welche für das Erzielen von selektiven Antikörpern entscheidend sind, entfernt ist. In ähnlicher Weise ist es üblich, wenn man ein markiertes Hapten herstellt, das in der Lage ist, an solche Antikörper zu binden, den Marker über dieselbe Stelle auf dem Hapten, wie für das Verknüpfen des Trägerproteins mit dem Hapten verwendet, anzuheften. Ein Grund für eine solche Vorgehensweise ist, daß das Trägerprotein sterisch den Zugang des Immunsystems zu diesem Teil des Haptens blockieren kann. Das komplementär markierte Hapten wird synthetisiert durch Anheften seines Markers an dieselbe Stelle auf dem Hapten, wie sie das Immunogen für die Anheftung seines Trägerproteins verwendet, um die Antikörperbindung an die entscheidenden Merkmale des Haptens nicht zu stören.
Deshalb wurde überraschend und unerwartet entdeckt, das die Vancomycinimmunogene, welche von verschiedenen Anheftungsstellen auf Vancomycin abgeleitet sind, zu der Entwicklung von Antikörpern führen, die für Vancomycin spezifisch sind, und zu einem Assay, der ein exzellentes Kreuzreaktivitätsprofil für die Hauptmetaboliten von Vancomycin zeigt. Unter den überraschendsten Entdeckungen ist dass, basierend auf den Einschränkungen der Sensitivität des Assays, der monoklonale Antikörper, der von HB 11834 sezerniert wird, im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit CDP, insbesondere mit CDP-I und CDP-II, zeigt. Zusätzlich war es auch überraschend zu entdecken, daß dieser monoklonale Antikörper nicht an die Peptidbindungsstelle bindet. Dies resultiert in einem verbesserten Assay für die Quantifizierung von Vancomycin und erlaubt die Verwendung von stabilen Kalibratoren und Kontrollen.
Synthese von Immunogenen
Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sowohl polyklonal als auch monoklonal, werden mit Immunogenen produziert, die aus einem Vancomycinmolekül hergestellt sind, das an das Trägerprotein über das Carbonsäureende von Vancomycin konjugiert ist, wie in der allgemeinen Formel von 6 gezeigt, worin P ein immunogenes Trägermaterial ist und X ist ein verbindender Anteil.
In den Immunogenen ist X ein verbindender Anteil, der aus von 0 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatomen besteht, einschließlich nicht mehr als zehn Heteroatomen, angeordnet in einer geraden oder verzweigten Kette oder einem zyklischen Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Bedingungen, daß nicht mehr als zwei Heteroatome direkt miteinander verbunden sind, dass zyklische Anteile sechs oder weniger Glieder enthalten, und daß eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen vorkommen kann.
Wie es von jemandem, der im Fachgebiet bewandert ist, verstanden werden würde, kann das immunogene Trägermaterial P gewählt sein aus irgendeinem von denjenigen, die konventionell bekannt sind. In den meisten Fällen wird P ein Protein oder ein Polypeptid sein, obwohl andere Materialien, wie zum Beispiel Kohlenhydrate, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Poly (Aminosäuren), Nucleinsäuren und dergleichen von ausreichender Größe und Immunogenität auch verwendet werden können. Vorzugsweise ist das immunogene Trägermaterial ein Protein, wie zum Beispiel Rinderserumalbumin (BSA), Napfschneckenhaemocyanin (heyhole limpet hemocyanin, KLH), Thyroglobulin und dergleichen.
In dem bevorzugten Immunogen ist P Thyroglobulin und X ist -NH(CH₂)₃C (=O) -. Das am meisten bevorzugte Immunogen ist in 7 gezeigt. Jedoch ist die Verbindung von 7 nicht beschränkt auf ein einzelnes Konjugat von Vancomycin und dem immunogenen Träger, wie jemand, der im Fachgebiet bewandert ist, realisieren würde. Eher wird das Verhältnis von Vancomycinderivat zu immunogenem Träger durch die Anzahl an chemisch verfügbaren funktionellen Gruppen auf dem immunogenen Träger P definiert und wird durch das Verhältnis der zwei Materialien in der Synthese gesteuert. Der Grad an Substitution auf P durch das Vancomycinderivat kann zwischen 1 bis 100% der verfügbaren funktionellen Gruppen auf den immunogenen Träger variieren. Der Sustitutionsgrad ist vorzugsweise zwischen 10% bis 95%; und noch bevorzugter zwischen 15% bis 85%.
Wie oben angegeben, wird das immunogene Konjugat hergestellt durch Koppeln von Vancomycin an ein Trägermaterial über das Carbonsäureende von Vancomycin. Wie in 4a bis 4c gezeigt, wird Vancomycin entsprechend Verfahren, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, mit einer bifunktionellen Verbindung bezeichnet als V-X-Y gekoppelt, worin X ein verknüpfender Anteil ist, und V- und -Y sind funktionelle Gruppen, von denen eine mit dem Carboxylat von Vancomycin (I) reagieren kann, und die andere mit chemisch verfügbaren funktionellen Gruppen auf P. Viele bifunktionelle Linker sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel sind heterobifunktionelle Linker in z.B., U.S. Patent 5,003,883 von Bieniarz et al. beschrieben. Heterobifunktionelle Linker können in einigen Fällen bevorzugt sein aufgrund der Spezifität ihrer Enden für eine funktionelle Gruppe oder eine andere. In ähnlicher Weise können, für die Bequemlichkeit in der Synthese des Immunogens, die funktionellen Gruppen V- und -Y geschützt werden, und zu der gewünschten Zeit entschützt werden, gemäß Techniken, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt oder leicht zu erfahren sind (siehe z.B., T. W. Greene und P.G.M. Wutts, "Protective Groups in Organic Synthesis, 2te Ausgabe" 1991, John Wiley and Sons).
Im allgemeinen wird in der Herstellung der Immunogene V gewählt aus der Gruppe bestehend aus -OH, -Halo (-Cl, -Br, -I), -SH oder -NHR'-, worin R' gewählt ist aus H, Alkyl, Aryl, substituiertem Alkyl oder substituiertem Aryl. Y kann gewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Carboxy (-C(=O)OH), Amino (-NH₂), Aldehyd (-CH(=O)) oder Azido (-N₃). Wie oben angegeben ist X ein verknüpfender Anteil von 0 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatomen, einschließlich nicht mehr als zehn Heteroatomen, angeordnet in einer geraden oder verzweigten Kette oder einem zyklischen Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Bedingungen, daß nicht mehr als zwei Heteroatome direkt miteinander verknüpft sein können, daß die Sequenz V-X-Y keine -O-O-Bindungen enthalten kann, daß die zyklischen Anteile sechs oder weniger Glieder enthalten und daß eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen vorkommen kann.
Nun bezugnehmend auf das repräsentative synthetische Schema, das in 4a bis 4c gezeigt ist, erzeugt die Reaktion von Vancomycin (siehe 4a) mit V-X-Y eine verknüpfte (tethered) Intermediatverbindung (4b), die den verknüpfenden Anteil X mit einer funktionellen Gruppe Y hat. Die funktionelle Gruppe kann in irgendeinem der Wege, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, mit den funktionellen Gruppen auf einem immunogenen Träger reagiert werden. Es wird bevorzugt, Amidbindungen zu bilden, welche typischerweise ziemlich stabil sind. Amidbindungen werden gebildet durch zuerst Aktivieren des Carbonsäureanteils [Y=(-C (=O)OH)] des Spacerarms durch Reaktion mit einem aktivierenden Reagens, wie zum Beispiel 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid und einem Zusatzstoff, wie zum Beispiel N-Hydroxysuccinimid. Die aktivierte Form (siehe 4b) wird dann mit einer gepufferten Lösung, die die immunogenen Trägermaterialien enthält, reagiert. Alternativ kann die Carbonsäuregruppe umgewandelt werden, mit oder ohne Isolierung, in ein hoch reaktives gemischtes Anhydrid, Acylhalid, Acylimidazolid, oder ein gemischtes Carbonat, und dann mit den immunogenen Trägermaterial kombiniert werden. Wie jemandem, der im Fachgebiet durchschnittlich bewandert ist, leicht ersichtlich ist, gibt es viele Reagenzien, welche verwendet werden können um Amidbindungen zu bilden, anders als diejenigen die oben aufgeführt sind, und solche Reagenzien bedürfen keiner speziellen Erwähnung.
Alternativ kann ein Spacerarm mit einer terminalen Aminfunktionalität (Y=-NH₂) umgewandelt werden in ein hochreaktives N-Hydroxysuccinimidurethan durch Reaktion mit N,N'-Disuccinimidylcarbonat in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel Acetonitril oder Dimethylformamid. Das resultierende Urethan wird dann mit den immunogenen Trägermaterialien in einer gepufferten, wässerigen Lösung reagiert, um ein Immunogen bereitzustellen.
Zusätzlich kann ein Spacerarm mit einer terminalen Aldehydfunktionalität in [Y=-CH(=O)] an die immunogenen Trägermaterialien gekoppelt werden, in einer gepufferten, wässerigen Lösung und in der Anwesenheit von Natriumcyanoborhydrid, durch reduktive Aminierung entsprechend Verfahren, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind.
Alternativ können Spacerarme, die eine Alkoholgruppe enthalten [Y=-OH] an die immunogenen Trägermaterialien gekoppelt werden durch zuerst Reagieren mit Phosgen oder einem Phosgenäquivalent, wie zum Beispiel Di- oder Triphosgen oder Carbonyldiimidazol, was in der Bildung eines hochreaktiven Chlorformats oder Imidazolformatderivats resultiert (üblicherweise ohne Isolation). Der resultierende aktive Formatester wird dann mit den immunogenen Trägermaterialien in einer gepufferten, wässerigen Lösung reagiert.
Alternativ kann, wenn Y=-N₃, das verknüpfte Intermediat an den immunogenen Träger gekoppelt werden durch Photolyse in einer wässerigen gepufferten Lösung.
Das bevorzugte Immunogen von 6 wird somit entsprechend dem Schema von 5a bis 5d hergestellt. Die Carboxylgruppe von Vancomycin (siehe 5a) wird mit Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxybenzotriazol (HOBT) aktiviert. Eine weitere Reaktion mit dem Linker, 4-Aminobuttersäuremethylester [V=-NH₂, X=-(CH₂)₃-, Y=-CO₂H] was nach Hydrolyse das verknüpfte Intermediat [X=-(CH₂)₃-, Y=-CO₂H] ergibt. Y wird dann mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDAC) aktiviert und an P gekoppelt. Diejenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, werden erkennen, daß andere Verfahren für die Peptidbindungsbildung verwendet werden könnten mit gleichem Erfolg.
Somit kann Vancomycin in der soeben beschriebenen Art und Weise, über diese und andere reaktive Stellen auf dem Molekül wie zum Beispiel Aminen oder Alkoholen an immunogene Trägermaterialien gekoppelt werden, durch verschiedene konventionelle Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, wo P ein immunogenes Trägermaterial wie zuvor beschrieben ist.
Desweiteren können in einer Art und Weise, die zum Anknüpfen von Haptenen an Trägermaterialien analog ist, Spacerarme an feste Träger mit funktionellen Gruppen konjugiert werden, wie zum Beispiel Amino, Hydroxyl oder Carboxylgruppen, die in einem komplementären Sinn mit reaktiven Gruppen auf dem Spacerarm reaktiv sind. Das Eregbnis ist eine feste Phase, welche verwendet werden kann, um Antikörper gegen das Hapten abzutrennen oder zu reinigen. Solche Kopplungstechniken sind ebenfalls im Fachgebiet wohl bekannt.
Die Antikörper
a. Produktion von Antikörpern
Die Immunogene, die hierin offenbart sind, können verwendet werden, um Antikörper herzustellen, sowohl polyklonale als auch monoklonale, gemäß den Verfahren, die im Fachgebiet wohl bekannt sind. Im allgemeinen wird einem Wirtstier, wie zum Beispiel einem Hasen, einer Ziege, einer Maus, einem Guineaschwein oder einem Pferd an einer oder mehreren von einer Vielzahl von Stellen das Immunogen injiziert, normalerweise in einer Mischung mit einem Adjuvans. Weitere Injektionen werden an derselben Stelle oder an unterschiedlichen Stellen in regelmäßigen oder unregelmäßigen Intervallen durchgeführt, wonach Blutproben genommen werden, um den Antikörper-Titer festzustellen, bis bestimmt wird, daß ein optimaler Titer erreicht wurde. Die Antikörper werden entweder durch Blutabnahmen des Wirtstiers erhalten, um ein Volumen von Antiserum zu ergeben, oder durch somatische Zellhybridisierungstechniken oder andere Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, um monoklonale Antikörper zu erhalten, und sie können zum Beispiel bei -20°C gelagert werden. Neben intakten Immunglobulinen schließt der Ausdruck Antikörper, wie hierin verwendet, Antigen-bindende Fragmente der Immunglobuline ein, die durch bekannte Verfahren produziert werden können, zum Beispiel Fab, F(ab')₂ und Fv.
Es soll bemerkt werden, daß das Ersetzen des kommerziell erhältlichen Antikörpers mit dem bevorzugten Antikörper, der hierin offenbart ist, alleine die Durchführung des Vancomycinassays verbessert.
Es soll auch bemerkt werden, daß das bevorzugte Verfahren der Erfindung Antikörper verwendet, welche nicht Metaboliten binden, die nicht detektiert werden sollen, bis zu dem Ausmaß, daß eine solche Bindung die Genauigkeit des Assays stört, insbesondere die Metaboliten CDP-I und CDP-II.
b. Die Spezifität und Bindungsaffinität der Antikörpern
Die Antikörper, die durch das hierin offenbarte Immunogen produziert werden, sind spezifisch für Vancomycin und sie zeigen im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit den Metaboliten CDP-I und CDP-II.
Zusätzlich binden die Antikörper, die hierin offenbart sind, an eine nicht-peptidische Stelle auf dem Vancomycinmolekül. Die Peptidbindungsstelle von Vancomycin, wo die Antikörper, die hierin offenbart sind, nicht binden, ist in blau in 20 gezeigt. Die nicht-peptidischen Stellen auf dem Vancomycinmolekül, wo die hierin offenbarten Antikörper binden, sind in schwarz, rot und grün in 20 gezeigt. Vorzugsweise binden die hierin offenbarten Antikörper an die zwei Zuckereinheiten (gezeigt in rot) in 20 und an das chlorierte Phenyl (gezeigt in grün) in 20.
Weil die hierin offenbarten Antikörper nicht an die Vancomycinpeptidbindungsstelle binden, wird die Vancomycinpeptidbindungsstelle für die Bindung von stabilisierenden Peptiden bewahrt. Die Bindung von Peptiden an die Peptidbindungsstelle erlaubt die Stabilisierung von Vancomycin in wässerigen Lösungen. Peptide, welche verwendet werden können um Vancomycin zu stabilisieren, sind diejenigen Polypeptide, die dafür bekannt sind, daß sie eine Bindungsaffinität für Vancomycin haben. Die bevorzugten Polypeptide sind diejenigen, die mindestens drei Aminosäurereste enthalten und die das folgende Fragment innerhalb ihrer Struktur enthalten: α, ε-DiAc·L-lys·D-ala·D-ala.
Die hierin offenbarten Antikörper können, aufgrund ihrer Bindungsaffinität zu Stellen, die nicht die Peptidbindungsstelle auf dem Vancomycinmolekül sind, für die Konstruktion von Vancomycinkalibratoren und Kontrollen verwendet werden, welche in Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Vancomycinkonzentration zu messen. Die Kalibratoren und Kontrollen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind in einer wässerigen Lösung und enthalten ein Polypeptid stabilisiertes Vancomycinmolekül. Eines oder mehrere der Polypeptide, die oben beschrieben sind, können verwendet werden, um das Vancomycinmolekül zu stabilisieren. Die Polypeptide, die verwendet werden, um das Vancomycinmolekül zu stabilisieren, stören nicht die Bindung eines Antikörpers an das Vancomycinmolekül. Die Kalibratoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind für mindestens zwei Monate, vorzugsweise sechs Monate und am bevorzugtesten für über ein Jahr stabil.
Herstellung des markierten Reagenzes
Wie oben angegeben, wird das markierte Vancomycinreagens, das hierin offenbart ist, hergestellt durch Anheften des Markers an das sekundäre Aminoende von Vancomycin, das heißt in einer Position, welche sich von der Position unterscheidet, bei welcher das Trägerprotein angeheftet wird.
Markierte Reagenzien für Vancomycin, die hierin offenbart sind, haben die allgemeine Formel, die in 8 gezeigt ist, worin Q ein detektierbarer Anteil ist, wie zum Beispiel ein chemilumineszenter oder ein fluoreszierender Anteil; und X ist ein verbindender Anteil. In dem bevorzugten markierten Reagens ist Q ein Fluoresceinderivat, gewählt aus der Gruppe bestehend aus 4'-Aminomethylfluorescein, 5-Aminomethylfluorescein, 6-Aminomethylfluorescein, 6-Carboxyfluorescein, 5-Carboxyfluorescein, 5- und 6-Aminofluorescein, Thioureafluorescein und Methoxytriazinylaminofluorescein, oder ein chemilumineszenter Anteil, wie zum Beispiel Vancomycin-N-methylleucylacridinium; und X ist vorzugsweise ein verbindender Anteil bestehend aus von 0 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatomen, einschließlich nicht mehr als zehn Heteroatomen, angeordnet in einer geraden oder verzweigten Kette oder einem cyclischen Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Bedingungen, dass nicht mehr als zwei Heteroatome direkt miteinander verbunden sind, daß cyclische Anteile 6 oder weniger Glieder enthalten und daß eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen vorkommen kann. In einem bevorzugteren markierten Reagens ist Q Chlortriazinylaminofluorescein und X=O, d.h., das Vancomycinderivat ist direkt an das Fluoresceinderivat angeheftet. Das bevorzugte markierte Reagens für die Verwendung in der Erfindung hat die Struktur, die in 9 gezeigt ist.
In einer analogen Weise zu der Synthese des immunogenen Konjugats werden die markierten Reagenzien, die hierin offenbart sind, von Vancomycin synthetisiert durch zuerst differenziertes Schützen der primären Aminogruppe (siehe, T.W. Greene und P.G. M. Wutts, "Protective Groups in Organic Synthesis, 2te Ausgabe" 1991, John Wiley and Sons) gefolgt von dem selektiven Reagieren der sekundären Aminogruppe mit dem detektierbaren Anteil.
Genauer gesagt kann das bevorzugte markierte Reagens synthetisiert werden wie in 10a und 10b gezeigt durch (i) Reagieren von Vacomycinbase mit verdünnter HCl bei pH 6,0, um die primäre Aminogruppe als einen quaternisierten Stickstoff zu schützen, gefolgt von (ii) Reagieren desselben mit Dichlortriazinylaminofluorescein (DTAF), um das markierte Reagens zu ergeben.
In ihrem bevorzugtesten Aspekt werden die obigen synthetischen Verfahren verwendet, um die markierten Reagenzien von 9 herzustellen.
Vancomycin Assay unter Verwendung eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays
Durch Befolgen eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA) Formats, das die hierin offenbarten Reagenzien verwendet, kann die Konzentration, oder der Spiegel von Vancomycin in einer Testprobe genau quantifiziert werden. Um einen FPIA für die spezifische Quantifizierung von Vancomycin durchzuführen, werden Kalibrationskurven von Kalibratoren erzeugt, die eine bekannte Konzentration von Vancomycin haben.
Im allgemeinen basieren Fluoreszenzpolarisationstechniken auf dem Prinzip, daß ein fluoreszierender Tracer, wenn er durch linear polarisiertes Licht einer charakteristischen Wellenlänge angeregt wird, Licht bei einer anderen charakteristischen Wellenlänge emittieren wird (d.h., Fluoreszenz), die relativ zu dem einfallenden anregenden Licht einen Grad der Polarisation zurückhält, der umgekehrt proportional ist zu der Rotationsgeschwindigkeit des Tracers in einem gegebenen Medium. Als eine Konsequenz dieser Eigenschaft wird eine Tracersubstanz mit eingeschränkter Rotation, wie zum Beispiel in einer viskosen Lösungsphase oder wenn sie an eine andere Lösungskomponente mit einer relativ geringeren Rotationsgeschwindigkeit gebunden ist, einen relativ größeren Grad an Polarisation von emittiertem Licht zurückhalten als in freier Lösung. Deshalb sollten, innerhalb des Zeitrahmens, in welchem der Ligand und der Tracer um die Bindung an den Antikörper konkurrieren, die Tracer- und Ligand- Bindungsgeschwindigkeiten ein geeignetes Verhältnis von freiem und gebundenem Tracer ergeben unter Bewahrung von wichtigen Durchführungsparametern, wie zum Beispiel Selektivität, Empfindlichkeit und Genauigkeit.
Wenn ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für die spezifische Quantifizierung von Vancomycin gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, wird eine Testprobe, von der vermutet wird, daß sie Vancomycin enthält, mit einem Antiserum oder monoklonalen Antikörpern in Kontakt gebracht, die mit hierin offenbarten Immunogenen hergestellt wurden, in der Anwesenheit von dem hierin offenbarten markierten Reagens. Linear polarisiertes Licht wird dann durch die Lösung geführt, um eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu erhalten, und die Antwort wird als ein Maß der Menge an Vancomycin, die in der Testprobe vorhanden ist, detektiert.
Die Fluoreszenzpolarisationsassays können in kommerziell erhältlichen automatisierten Instrumenten durchgeführt werden (zum Beispiel AxSYM^®, TDX^® und TDXFLX^®, Abbott Laboratories).
Gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet das Assayverfahren einen stabilen Kalibrator, der eine wässerige Lösung umfaßt, die ein Polypeptid-stabilisiertes Vancomycin enthält, worin das Polypeptid nicht die Bindung eines Antikörpers an das Vancomycinmolekül stört.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde überraschend und unerwartet herausgefunden, daß überragende Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay-Ergebnisse für die Quantifizierung von Vancomycin erhalten werden, wenn ein Antikörper verwendet wird, der von dem Immunogen, das in 6 gezeigt ist, abgeleitet ist, mit dem fluoreszierend markierten Reagens, das in 8 gezeigt ist.
Insbesondere wurde unerwartet und überraschend herausgefunden, daß die Verwendung des markierten Reagenzes von 9 in Kombination mit einem monoklonalen Antikörper, der als Antwort auf das Immunogen von 7 produziert wurde, zu einem Assay führte, der sehr geringe, im wesentlichen keine, (d.h., unterhalb der Sensitivitätsgrenzen des Assays) Kreuzreaktivität mit den Hauptmetaboliten von Vancomycin, CDP-I und CDP-II zeigt. Am meisten bevorzugt ist das Fluoreszenzpolarisationsverfahren, welches monoklonale IgG Antikörper verwendet, die durch das Hybridom mit der Bezeichnung ATCC HB 11834 produziert wurden.
Die Menge an Tracer, die an den Antikörper gebunden ist, variiert umgekehrt zu der Menge an Vancomycin, die in der Testprobe vorhanden ist. Dementsprechend sind die relativen Bindungaffinitäten von Vancomycin und dem Tracer für die Antikörperbindungsstelle wichtige Parameter des Assaysystems.
Andere Assayformate
Zusätzlich zu Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays können verschiedene andere Immunoassayformate für die Quantifizierung von Vancomycin gemäß der vorliegenden Erfindung befolgt werden. Im allgemeinen hängen solche Immunoassaysysteme von der Fähigkeit eines Immunglobulins ab, d.h., eines ganzen Antikörpers oder Fragments davon, an einen spezifischen Analyten von einer Testprobe zu binden, worin ein markiertes oder detektierbares Reagens verwendet wird, um das Ausmaß der Bindung zu bestimmen. Solche detektierbaren Marker schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Enzyme, Radiomarker, Biotin, Toxine, Arzneistoffe, Haptene, DNA, RNA, Liposome, Chromophore, chemilumineszente Verbindungen, wie zum Beispiel aber nicht beschränkt auf diejenigen, die in 21 gezeigt sind, gefärbte Partikel und gefärbte Mikropartikel, und fluoreszierende Verbindungen, wie zum Beispiel diejenigen, die zuvor beschrieben wurden.
Typischerweise wird das Ausmaß der Bindung in solchen Immunoassaysystemformaten bestimmt durch die Menge des detektierbaren Anteils, der in dem markierten Reagens vorhanden ist, welcher entweder an einer Bindungsreaktion mit dem Analyten teilgenommen hat oder nicht, und erfordert, daß die Menge des detektierbaren Anteils, der detektiert und gemessen wird, mit der Menge des Analyten, der in der Testprobe vorhanden ist, korreliert werden kann. Zum Beispiel konkurriert in einem kompetitiven Immunoassaysystem die Substanz, die gemessen wird, (oft als ein Ligand bezeichnet) mit einer Substanz von naher struktureller Ähnlichkeit mit der des Liganden, und welche an einen detektierbaren Anteil gekoppelt ist (oft bezeichnet als ein Tracer) um eine eingeschränkte Anzahl an Bindungsstellen auf Antikörpern, die spezifisch sind für den Teil oder die Teile des Liganden und Tracers mit struktureller Ähnlichkeit.
Testkits
Ein Testkit gemäß der vorliegenden Erfindung schließt Reagenzien ein, die nötig sind, um einen gewünschten Immunoassay für die Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe durchzuführen. Der Testkit kann in einer kommerziell verpackten Form präsentiert werden, als eine Kombination aus einem oder mehreren Behältern, die die nötigen Reagenzien beinhalten, und/oder als eine Zusammensetzung oder Beimischung, wo es die Kompatibilität der Reagenzien erlaubt. Vorzugsweise schließt ein Testkit alle Reagenzien, Standards, Puffer, Verdünnungsmittel etc., welche notwendig sind, um den Assay durchzuführen, ein.
Insbesondere bevorzugt ist ein Testkit für die Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay-Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe, welcher fluoreszierende Tracerverbindungen, Antikörper und stabile Kalibratoren, wie oben für die Quantifizierung von Vancomycin beschrieben, einschließt. Es soll verstanden werden, daß der Testkit natürlich andere Materialien einschließen kann als diejenigen, die im Fachgebiet bekannt sind, und welche vom Standpunkt eines Benutzers aus wünschenswert sein können, wie zum Beispiel Probenvorbehandlungslösungen, Puffer, Verdünnungsmittel, Standards, und dergleichen.
BEISPIEL 1. Synthese von Vancomycin-Immunogen
a) Synthese von Methyl-4-aminobutyrat
4-Aminobuttersäure (5,00 g, 48,5 mmol) wird in einen 200 ml Rundkolben gegeben. Dimethoxypropan (80 ml, 65 mmol) wird zu dem Kolben unter Rühren hinzugefügt. Konzentrierte Salzsäure (15 ml) wird zu der Reaktion hinzugefügt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck auf einem Rotationsverdampfer ohne Erhitzen entfernt. Der Feststoff wird in einer minimalen Menge an MeOH aufgelöst und wird mit Ether wieder ausgefällt. Der ausgefallene Feststoff wird unter Saugen filtriert und mit Et₂O (2×50 ml) gewaschen. Der Feststoff (Ausbeute: 6,9 g (96%) wird dann unter Vakuum getrocknet.
¹H des freien Amins (CDCl₃): 2,1 (Quintett, 2H), 2,5 (Triplett, 2H), 3,2 (breites Triplett, 2H), 3,7 (Singulett, 3H), 8,1 (Singulett, 2H).
b) Synthese von Vancomycin-Aminobutyratderivat
Vancomycin (500 mg, 0,34 mmol) -Base wird in einen 25 ml Rundkolben gegeben. DMSO (4 ml) wird hinzugefügt und es wird gerührt, wenn nötig unter Erwärmen, bis eine klare Lösung entsteht. Methyl-4-aminobutyrat HCl aus Beispiel 1(a) (506 mg, 3,4 mmol) wird zu der Reaktion hinzugefügt, gefolgt von Hydroxybenzotriazol (105 mg, 0,69 mmol) und Triethylamin (0,0976 ml, 0,69 mmol). Die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 3 bis 7 Tage unter N₂ gerührt. Der Reaktion folgt eine HPLC. Nachdem das Ausgangsmaterial verbraucht wurde, wird der ausgefallene Feststoff durch Filtration entfernt und das Filtrat wird durch reverse Phase HPLC unter Verwendung einer C-18 Säule wie unten beschrieben gereinigt. Die gesammelten Fraktionen werden lyophilisiert (Ausbeute: 310 mg).
Die analytischen HPLC Bedingungen sind wie folgt: die Säule ist 7,8 mm × 300 mm C-18 (Bondapak C-18, Waters, Marlborough, MA) mit einer mobilen Phase mit einem kontinuierlichen Gradienten von Acetonitril: Ammoniumacetat (50 mM) (10% Acetonitril bis 50% Acetonitril entwickelt über 15 Minuten) bei einer Fließgeschwindigkeit von 3,0 ml/Minute. Die Detektion wird bei 254 nm durchgeführt.
Präparative HPLC Bedingungen sind wie folgt: die Säule ist 19 mm × 250 mm C-18 (Dynamax 60A C-18, Rainin, Woburn, MA) mit einer mobilen Phase mit einem kontinuierlichen Gradienten von Acetonitril: Ammoniumacetat (50 mM) (10% Acetonitril bis 50% Acetonitril, entwickelt über 15 Minuten) bei einer Fließgeschwindigkeit von 8,0 ml/Min. Die Detektion wird bei 254 nm durchgeführt.
Massenspektrometrie (MS): Elektronensprayionisation (ESI) MH⁺ 1547, (MH₂)²⁺ 774 .
c) Synthese von Vancomycinhapten
Das Vancomycin-Aminobutyratderivat aus Beispiel 1(b) (165 mg, 0,1 mmol) wird in DMF/Wasser (2ml:3ml) aufgelöst in einem 25 ml Rundkolben. Der Kolben wird auf 0°C abgekühlt und LiOH wurde hinzugefügt und es wurde für 2 Stunden gerührt und auf Raumtemperatur erwärmt, und es folgte einen HPLC. Nachdem das Ausgangsmaterial aufgebraucht war, wurde die Reaktion direkt durch präparative HPLC gereinigt unter Verwendung einer reverse Phase Säule. Das Lösungsmittel wird lyophilisiert, um das Produkt zu ergeben (Ausbeute: 160 mg). Sowohl die analytische als auch die präparative HPLC waren wie oben angegeben.
Massenspektrometrie (MS): ESI MS ergibt (MH)⁺ bei 1533, was das korrekte Molekulargewicht des hydrolysierten Linkers, der an Vancomycin angeheftet ist, anzeigt.
d) Synthese von Immunogen
Thyroglobulin (100 mg, 0,0002 mmol) wird in Natriumphosphat monobasischem Puffer aufgelöst (5 ml, pH eingestellt auf 6,7 mit verdünnter NaOH). Vancomycinhapten aus Beispiel 1(c) (50 mg, 0,0321 mmol) wird hinzugefügt, gefolgt von EDAC (9,2 mg, 0,0482 mmol). Die resultierende Reaktion wird für 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Inhalte werden auf eine Membran überführt und mit 0,1 M Na₂HPO₄ Puffer dialysiert (monobasisch, pH 7,8, eingestellt mit NaOH) für 2 Tage, wobei das Lösungsmittel alle 4 Stunden gewechselt wurde. Die Inhalte in der Dialysetasche werden lyophilisiert, um 130 mg des gewünschten Immunogens zu ergeben.
BEISPIEL 2. Produktion von Anti-Vancomycin-Antikörper 15-109-592
Eine weibliche, 6-8 Wochen alte, RBF/DnJ Maus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) wird mit dem Vancomycinimmunogen von Beispiel 1, emulgiert mit Freund's Adjuvans (Difco, Detroit, MI) immunisiert. Die primäre Immunisierung wird verabreicht mit Freund's komplettem Adjuvans und nachfolgenden Boosts mit Freund's inkomplettem Adjuvans. Der Tier Booster-Intervall für dieses langzeit-immunisierte Tier ist in Wochen 1, 3, 5, 12, 17 und 24 mit dem entsprechenden Dosierspiegel bei 25, 12,5, 12,5 , 10, 10 und 10 μg pro Tier an einer subkutanen Stelle und einer intraperitonetalen Stelle für die ersten drei Boosts und an zwei subkutanen Stellen jeweils für die letzten drei Boosts. Periodisch werden Blutentnahmen durchgeführt, um zu bestätigen, daß sich eine Antikörperantwort entwickelt. Dem Tier wurde eine 7-wöchige Pausenperiode erlaubt, bevor ein 10 μg Boost an die Milz 3 Tage vor der Fusion verabreicht wurde.
Am Tag der Fusion wird die Maus durch einen schnellen Nackenschlag getötet und die Milz wird entfernt. Die Splenocyten werden einmal in Iscove's modifizierten Dulbecco's Medium (IMDM) gewaschen (Gibco, Grand Island, New York) und bei 1000 RPM für 10 Minuten zentrifugiert. Die pelletierten Splenocyten werden mit SP2/o Myelomazellen kombiniert (Dr. Milstein, Cambridge, UK) bei einem 1:1 Verhältnis, in IMDM gewaschen, und zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und 1 ml von 50% Polyethylenglycol (PEG; American Type Tissue Culture Dollection, Rockville, MD) wird zu dem Pellet für 1 Minute hinzugefügt als das Pellet in IMDM resuspendiert wird, das Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin (HAT Gibco) und 15% fetales Rinderserum (FBS; Hyclone Labs, Logan, Utah) enthielt. Um die Fusionsfrequenz zu erhöhen, werden 0,5% Salmonella typhimurium Mitogen v/v (STM, RIBI immunochem Research, Inc., Hamilton, Montana) und 1% v/v ORIGEN (Igen, Rockville, MD) zu der Fusionszellsuspension hinzugefügt und in 24 Auskerbungen Gewebekulturplatten platziert.
Das primäre Screening der Fusion fand am Tag 10 der zerfließenden Kulturen statt. Ein kommerzieller Assay (TDX^®; Abbott Laboratories) wird verwendet, um eine, Anti-Vancomycin- Reaktivität in Überstandproben zu detektieren. Der Gewebekulturüberstand wird doppelt in die Proben-Auskerbung geladen und 10 μl von entweder dem A Kalibrator (0 μg/ml Vancomycin) oder dem F Kalibrator (100 μg/ml Vancomycin) aus dem kommerziellen Kalibratorkit wird in die vorverdünnte Auskerbung (pre-dil well) geladen. Verdünnungspuffer wird in die S- und P-Töpfe des Reagenzienpacks platziert und der kommerzielle Tracer wird in dem T-Topf verwendet. Weil die Hybridomkulturüberstände sehr verdünnt sind, wird das Probenvolumen auf 90 μl erhöht. Die Polarisation der Proben wird gemessen und nur ein Hybrid 15-109 wird als spezifisch für Vancomycin identifiziert, wie durch einen Abstieg in der Polarisation in der Anwesenheit des F Kalibrators (siehe Tabelle 1) gemessen. Dies ist begründet in der freien Vancomycinbindung an den Antikörper und dem Abhalten des Tracers an der Bindung, wodurch ein Abstieg im Signal bewirkt wird.
Tabelle 1
Hybrid 15-109 wird kloniert durch Begrenzen der Verdünnungen von 1-100 auf 1-100,000. Das Klonierungsmedium ist IMDA mit 10% v/v FBS und 1% v/v HT Ergänzung (Gibco). Eine 200 μl Zellsuspension wird zu jeder Auskerbung einer 96 Auskerbungen Gewebekulturplatte hinzugefügt.
Das Hybrid, nun als 15-109-133 bezeichnet, wird für die weitere Bewertung basierend auf einem zusätzlichen Screening des Klonüberstands von zusammenfließenden Kulturen ausgewählt.
Das monoklonale Antikörperhybrid 15-109-133 wird zuerst 10- fach konzentriert unter Verwendung eines Amicon Filtrationssystems. Dann wird der rohe Antikörper (der Antikörper ist immer noch in fetalem Rinderserum) geschnitten unter Verwendung von gesättigtem Ammoniumsulfat (50%). Die Lösung wird dann bei 4000 RPM (Revolution per minute, Umdrehungen pro Minute) zentrifugiert, und der Überstand wird verworfen. Das Pellet wird in PBS (pH 7,4) bei einem 1/10 Volumen des ursprünglichen Volumens nach der Konzentration resuspendiert. Die Antikörperlösung wird dann in PBS (pH 7,4) dialysiert und wird nach der Dialyse unter Verwendung des herkömmlichen Puffers (Phosphat, Azid und Rindergammaglobulinpuffer) wie folgt verdünnt: gerade (straight), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 und 1:32. Die Proben werden doppelt in der Probenauskerbung laufen gelassen unter Verwendung eines Probenvolumens von 10 (1O0 μl) anstatt von 2 (20 ml), unter Verwendung desselben Mode 1 Vancomycinassays, der zuvor besprochen wurde. Das Instrument berechnet die mP (Millipolaristionswerte) wie zuvor beschrieben und die Verdünnung des Antikörpers, welche die höchste mP erzeugt, wird als die Verdünnung des Antikörpers gewählt, um sie in dem 5-Topf (Antikörpertopf) in dem Reagenzkit zu verwenden. Der Antikörper wird in Phosphatpuffer einschließlich 10% Glycerol und 5% BSA verdünnt. Der Tracertopf enthält den existierenden Tracer des Marktes, wieder gereinigt durch HPLC und verdünnt in einem Tris-Puffer (Plus 0,7% SDS und 0,5% LDS). Dieser gereinigte Tracer wird auf 1,7 μg/ml in dem Tracertopf verdünnt. Der Auslöser (Popper) besteht aus 20 mM Kupfersulfat und 2,5% 5-SSA. Diese Reagenspackung wird in das Instrument geladen mit Vancomycin (Analyt) bei 0, 5, 10, 25, 50 und 100 g/ml als die Kalibratoren, die doppelt zusammen mit Kontrollen bei 7, 35 und 75 μg/ml laufen gelassen werden. Assay 16 mit Mode 1 Pipettierung wird auf dem Instrument verwendet und eine Standardkurve wird kalibriert und gelagert. CDP-I Proben bei verschiedenen Konzentrationen werden laufen gelassen, um sicherzustellen, daß keine CDP-I Kreuzreaktivität existiert.
Basierend auf den weiteren Screenings wird ein Klon, nun bezeichnet als 15-109-592, für die Hinterlegung gewählt.
Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers, der von der Zell-Linie sezerniert wird, die als 15-109-592 identifiziert wird, wurde auf einem Antikörper-Isotypisierungskit bestimmt (Mouse ; Monoclonal, Southern Biotech # 5080-05, Brimingham, Alabama). Der Assay wird gemäß den Empfehlungen des Verkäufers durchgeführt und die Ergebnisse zeigen einen Isotyp von Igel, kappa leichte Kette an.
Zelllinien-Hinterlegung
In Übereinstimmung mit dem Budapest Vertrag wird die Hybridom-Zelllinie, bezeichnet als Hybrid 15-109-592, mit der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Untied States of America hinterlegt. Das Hinterlegungsdatum ist der 16. Februar 1995 und die ATCC Nummer, die der Zell-Linie zugeordnet wurde, ist HB 11834. Die Hinterlegung wird in dem ATCC Aufbewahrungsort gehalten, welches ein öffentlicher Aufbewahrungsort ist, für einen Zeitraum von 30 Jahren, oder 5 Jahren nach der jüngsten Nachfrage, oder für das durchsetzbare Leben des Patents, je nachdem was länger ist, und wird ersetzt werden, wenn es während dieses Zeitraums lebensunfähig wird. Zusätzlich haben die Anmelder alle Erfordernisse von 37 C.F.R. §1.801-1.809 erfüllt, einschließlich dem Bereitstellen eines Zeichens für die Lebensfähigkeit der Probe.
BEISPIEL 3. Synthese des Vancomycinchlortriazinylaminofluorescein-Tracers
Vancomycinbase (576 mg, 0,4 mmol, 1,5 Äqu.) wird in DMF (8 ml) aufgelöst (wenn nötig unter Erwärmen auf 40°C) in einem 50 ml Rundkolben mit einer weiten Öffnung. Eine kleine pH Elektrode wird eingeführt, um den pH-Wert der Reaktion zu überwachen. Eine Lösung von Chlortriazinylaminofluorescein HCl (DTAF; 132 mg, 0,26 mmol, 1 Äqu.) in DMF (2 ml) wird zu dem Kolben hinzugefügt. Die Reaktion wird orange-gelb und der pH fiel auf 6,0 ± 0,5 und es wurde über Nacht gerührt, während dieser pH aufrechterhalten wurde. Die Reaktionsprodukte werden durch analytische HPLC überwacht. Nachdem alles DTAF aufgebraucht war, wurde DMF unter Vakuum auf ungefähr 2-3 ml entfernt. Der Rückstand wird durch HPLC gereinigt. Geeignete Fraktionen werden gesammelt und das Lösungsmittel wird lyophilisiert, um ein orange-gelbes Pulver zu ergeben (Ausbeute: 350 mg).
Analytische HPLC-Bedingungen sind wie folgt. Die Säule ist 3,9 mm × 300 mm C-18 (DYNAMAX C-18, Rainin) mit einer mobilen Phase mit kontinuierlichem Gradienten (A = Ammoniumacetat; B = Acetonitril (50 mM); % B=10, % B=50, entwickelt über 15 Minuten ) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute. Die Detektion findet entweder bei 254 oder bei 486 nm statt.
Präparative HPLC verwendet dieselben Bedingungen wie oben mit einer 19 mm × 250 mm C-18 Säule (DYNAMAX C-18, Rainin).
MS: ESMS ergibt MH⁺ bei 1908, (MH₂)²⁺ bei 953.
BEISPIEL 4. Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für Vancomycin
Der Tracer (Beispiel 3) und der monoklonale Antikörper # 15-109-592 (Beispiel 2) werden optimiert, um ähnlich oder besser als TDX^®/TDXFLX^® Abbott Vancomycinassay zu laufen, mit dem Vorteil keiner CDP-I Kreuzreaktivität in der Anwesenheit von Vancomycin. Wie zuvor besprochen ist, durch Hinzufügen einer konstanten Konzentration von Antikörper und Tracer zu der Testprobe, das Verhältnis von Vancomycin-Antikörperkomplexen zu Tracer-Antikörperkomplexen, die gebildet werden, direkt proportional zu der Menge an Vancomycin in der Probe. Wenn die Mischung mit linear polarisiertem Licht angeregt wird, und die Polarisation der durch ungebundenen Tracer und Tracer-Antikörperkomplexe emittierten Fluoreszenz gemessen wird, kann man die Anwesenheit von Vancomycin in einer Testprobe quantitativ oder qualitativ bestimmen. Die Ergebnisse können quantifiziert werden durch Netto-Millipolarisationseinheiten (mP) und durch den Bereich (span). Die Netto-Millipolarisation zeigt die Polarisation an, welche detektiert wird, wenn eine maximale Menge an Tracer an den Antikörper gebunden ist (d.h., in der Abwesenheit von Vancomycin). Je höher die Netto-mP-Einheiten desto besser ist die Bindung des Tracers an den Antikörper. Der Assaybereich (span) ist der Unterschied zwischen den Netto-Millipolarisationswerten, die erhalten werden, wenn die maximale Menge an Tracer in der Abwesenheit von irgendeinem Vancomycin gebunden ist, und der Netto-Millipolarisation, die erhalten wird, wenn eine spezifische Menge an Vancomycin in einer Testprobe vorhanden ist. Die Millipolarisationseinheiten werden automatisch interpoliert von einer gelagerten Standardkurve und als die Menge an Vancomycin (Mikrogramm) pro ml Probe ausgedrückt.
Der gereinigte (Ammoniumsulfat-geschnittene) Vancomycinantikörper 15-109-133 wird in einem Phosphatpuffer mit 2,5% Rinderserumalbumin und 10% Glycerol auf eine Konzentration von 20 μg/ml verdünnt, was die Zusammensetzung des S-Topfes ausmacht. Der Tracertopf (T-Topf) ist ein Vancomycin-DTAF-Tracer, verdünnt in Tris-Puffer mit 0,7% Natriumlaurylsulfat und 0,5% Lithiumlaurylsulfat auf eine Konzentration von 0,275 μg/ml. Diese zwei Komponenten zusammen mit dem Vorbehandlungstopf (P-Topf) ergeben eine 96,94 mP-Spanne mit Intensitätswerten im Bereich von 3500 bis 4500 Einheiten. (Intensitätswerte sind ein Maß der Wirksamkeit des Antikörpers und des Tracers, die zusammen reagieren. Da entweder die Antikörper- oder die Tracerkonzentration in dem Assay erhöht wird, werden die Intensitätswerte größer).
Die Genauigkeit des Vancomycinassays des vorliegenden Beispiels wird gezeigt durch Vergleich mit dem kommerziell erhältlichen Vancomycinassay, unter Verwendung von 56 Patientenproben. Beide Assays werden korreliert, um eine R=0,995 und y=0,92x-0,008 zu ergeben (11). Desweiteren wurde der Assay des vorliegenden Beispiels verglichen mit der quantitativen HPLC-Bestimmung. Die Korrelation des neuen Assays gegen HPLC ergab eine R=0,998 und Y=1,007+1,053 (12), während der kommerziell erhältliche Vancomycinassay, korreliert gegen HPLC, eine R=0,996 und Y=1,088x+1,252 (Daten nicht gezeigt) ergab. Sowohl der Assay des vorliegenden Beispiels als auch die kommerziell erhältichen Vancomycinassays haben eine Sensitivität von weniger als 2,00 μg/ml und können zwischen 0 und 100 μg/ml Vancomycin in einer Probe detektieren. Proben, die mehr als 100 μg/ml Vancomycin enthalten, können automatisch zweifach oder vierfach verdünnt werden, durch Reduktion des Probenvolumens auf 1,0 oder 0,5, wie in dem Assayhandbuch angewiesen. Die Präzision von sowohl dem Assay des vorliegenden Beispiels als auch des kommerziell erhältichen Vancomcyinassays ist die gleiche. Alle zwischen der Durchführung, während der Durchführung und die Gesamt-Abweichungskoeffizienten (total coefficient of variation, CV) sind weniger als 6% (siehe Tabelle 2) .
Für Kreuzreaktivitäten wird Vancomycin bei Spiegeln von 0, 40 und 80 μg/ml getestet mit verschiedenen Kreuzreaktanden, die bei Spiegeln von 0, 1, 10, 50 und 100 μg/ml vorhanden sind. Überraschenderweise zeigen alle Kreuzreaktanden, einschließlich CDP-I, weniger als 2% Kreuzreaktivität mit Vancomycin, was bedeutet, daß alle Ablesungen unterhalb der Sensitivität des Assays (2 μg/ml) liegen. Im Gegensatz dazu hat der kommerziell erhältliche Vancomycinassay erhöhte Spiegel von CDP-I Kreuzreaktivität im Bereich von 39,58% bis 65% mit oder ohne anwesendem Vancomycin. Überraschenderweise zeigt der Antikörper, der hierin offenbart ist, keine detektierbare Kreuzreaktivität mit CDP-I bei den höchsten getesteten Konzentrationen. Diese Ergebnisse sind eine signifikante Verbesserung gegenüber dem existierenden kommerziellen Assay. (Siehe Tabelle 3 für CDP-I Kreuzreaktivitätsdaten).
13 ist repräsentativ für die Daten, die mP bei 0-100 μg/ml Vancomcin zeigen, unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 4.
Der Vancomycinantikörper (der 5-Topf) 15-109-592 des vorliegenden Beispiels kann bei 45°C für 14 Tage gelagert werden, und es wurde unerwartet entdeckt, daß der monoklonale Antikörper hochgradig resistent ist gegenüber einer Veränderung aufgrund von Frier-/Tauzyklen. Der monoklonale Antikörper kann drei Frier/Tauzyklen mit minimalen Veränderungen in der Spanne und den Intensitätswerten durchlaufen. Zusätzlich sind, da der Antikörper ein monoklonaler ist, die Assayparameter, wie zum Beispiel die Spanne, Kreuzreaktivität und Stabilität im wesentlichen die gleichen von Lot zu Lot. Desweiteren ist die Herstellbarkeit verbessert, da das Hybridom unter Verwendung von Hohlfaser-Gewebekultur-Systemen kultiviert werden kann. Der Antikörper kann auch bei zwei Airset-Fluktuationen überleben (ungefähr 1,5°C) in einem klinischen Analysator; somit sind ebenfalls die Assay-Kinetiken in der Analysator-Umgebung stabil (ungefähr 34 ± 0,5°C). Letztlich ermöglicht die Verwendung einer Vorbehandlungslösung (10% 5-Sulfosalicylat, 0,1 M Tris, 20 mM Kupfersulfat), daß die Störung durch Bilirubin (bis zu 30 mg/dL) geringer als 5% ist, und sie reduziert die Verschleppung (einer 250 μg/ml Vancomycinprobe) auf weniger als die Sensitivität des Assays, d.h., 2%. Die Vorbehandlungslösung entfernt das Protein von irgendeinem Protein-gebundenen Vancomycin, um das Vancomycin für die Durchführung des Assays freizusetzen.
Tabelle 2 GENAUIGKEIT VORLIEGENDES BEISPIEL
KOMMERZIELL ERHÄLTLICHER VANCOMYCINASSAY
Tabelle 3 CDP-I KREUZREAKTIVITÄT ALLE WERTE SIND IN μg/ml 3a. 0 μg/ml VANCOMYCIN
3b. 40 μg/ml VANCOMYCIN VORLIEGENDES BEISPIEL KOMERZIELLER ASSAY
3c. 80 μg/ml VANCOMYCIN VORLIEGENDES BEISPIEL KOMERZIELLER ASSAY
BEISPIEL 5. Analyse der Strukturellen Bindungsbeziehungen zwischen Vancomycin monoklonalem Antikörper Fab-Fragment und Vancomycin-Analogen und Tracern
a) Materialien und Verfahren
Protein A Affinitäts-Pak-Säulen und ImmunoPure Fab Herstellungskits, DupH Phosphat-gepufferte Salzlösungspackungen, Slide-A-Lyzer 10K MWCO Dialysekassetten, das Micro BCA-Proteinassaykit und das Immunopure Mause IgG F(ab')₂ Fragment wurden von Pierve (Rockford, IL) erhalten. Mikrokonzentratoren wurden erhalten von Millipore Corp. (Bedford, MA). Vancomycin wurde von der Chemical and Agricultural Products Division, Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) erhalten. Anti-Vancomycin mAb wurde von der Abbott Zellkultureinrichtung (Abbott Park, IL) erhalten (Siehe Adamczyk, M., et al., Therapeutic Drug Monitoring, 20:191-201 (1998) . (N^α,N^ε-Diacetyl) K_DA_DA Tripeptid wurde von Peninsula Laboratories (Belmont, CA) erhalten. Aminocaproat-derivatisiertes (N^ε-Acetyl) K_DA_DA Tripeptid wurde erhalten von Research Genetics (Huntsville, Al). Ein Biotin aktiver Ester, welcher Verbindung (2) ist, gezeigt in 15, (hiernach bezeichnet als "Verbindung 2") wurde hergestellt durch das Verfahren von Wilchek, wie beschrieben in Wilchek, M., et al., "Biotin-containing reagents". In Avidin-Biotin Technology (M. Wilchek, Ed.) Seiten 123-138, Academic Press, New York.
Ein 6-Carboxyfluorescein-aktiver Ester, welcher Verbindung (3) ist, gezeigt in 15, (hiernach bezeichnet als "Verbindung 3") wurde hergestellt durch das Verfahren von Adamczyk et al. wie beschrieben in Adamczyk M., et al., Bioconjugate Chem., 8:253-255 (1997).
Ein chemilumineszenter Acridinium Marker, welcher Verbindung (4) ist, gezeigt in 15, (hiernach bezeichnet als "Verbindung 4") wurde hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Mattingly, P.G., J. Biolumin. Chemilumin. 6:107-114 (1991) und in U.S. Patent 5,468,646 beschrieben ist. Desvancosaminylvancomycin, welches Verbindung (5) ist, gezeigt in 16, (hiernach bezeichnet als "Verbindung 5") Aglucovancomycin, welches Verbindung (6) ist, gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 6") und N-Acetylvancosaminylvancomycin, welches Verbindung (7) ist, gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 7") wurden hergestellt gemäß dem Verfahren beschrieben in Kannan, R., et al., J. Am. Chem. Soc., 110:2946-2953 (1988).
Ring-2 Dechlorvancomycin, welches Verbindung (8) ist, gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als Verbindung 8") wurde hergestellt durch das Verfahren beschrieben in Harris, C. M., et al., J. Am. Chem. Soc., 107:6652-6658 (1985). Kristallines Abbauprodukt (CDP) welches Verbindung (10) ist, gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 10") wurde hergestellt gemäß dem Verfahren beschrieben in Marshall, F.J., J. Med. Chem. 8:18-22 (1965) .
Ring-2 Dechlor-CDP, welches Verbindung (12) ist, gezeigt in 16, (hiernach bezeichnet als "Verbindung 12") wurde hergestellt gemäß dem Verfahren beschrieben in Harris, C. M., et al., J. Am. Chem. Soc., 107:6652-6658 (1985) .
Alle anderen Reagenzien, die in der Synthese verwendet wurden, wurden erhalten von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Die synthetisierten Verbindungen wurden durch HPLC gereinigt (Waters Millford, MA) Delta Prep 3000 präparatives Chromatographiesystem, ausgestattet mit einem Lambda-Max 281 UV-Detektor, ein Model 740 Datenmodul, und eine 40 × 100 mm μBondapak C18 Säule). Die analytische HPLC wurde mit demselben System unter Verwendung einer 8 × 100 mm μBondapak C18 Säule durchgeführt. Die HPLC-Säulen wurden mit einem linearen Gradienten von 5-50% CH₃CN in 50 mM Ammoniumformat eluiert (hiernach bezeichnet als "Lösungsmittel A") oder isokratisch in wässeriger CH₃CN enthaltend Trifluoressigsäure (v:v:v, CH₃CN/H₂O/TFA; hiernach bezeichnet als "Lösungsmittel B") wie angegeben. Die Elutionsprofile wurden bei 254 nm aufgezeichnet. Die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI/MS) wurde ausgeführt auf einem Perkin-Elmer (Norwalk, CT) Sciex API 100 Benchtop System unter Verwendung der Turbo IonSpray^TM Ionenquelle. Das Protein wurde analysiert durch SDS-PAGE auf einem BioRad Minigelsystem (Hercules, CA) unter Verwendung von 12,5 Polyacrylamidgelen (7 cm × 10 cm × 1 mm), gefolgt von der Färbung mit Coomassie Blue. Die Oberflächen-Plasmonresonanzmessungen wurden durchgeführt auf einem BIAcore 100 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) automatisierten System unter Verwendung von CM-5 Vier-Kanal Sensorchips. Reagenzien für das BIAcore Instrument bestanden aus HBS-Puffer (10 mM Hepes (pH 7, 4) , 150 mM NaCl, 3, 4 mM EDTA und 0, 05% Oberflächen-aktivem P-20), einem Kopplungskit, der N-Hydroxysuccinimid (NHS), N-Ethyl-N-(3-diethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC), und 1 M Ethanolaminhydrochlorid (pH 8,5) enthielt, alles von BIAcore Inc.
b) Herstellung von AglucoCDP.
Verbindung 10, welche CDP ist (siehe Marshall, F.J., J. Med. Chem. 8:18-22 (1965) (100 mg, 0,069 mmol) wurde auf einem Wasserbad für 1 Stunde in 1N HCl (3 ml) erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der Feststoff wurde abfiltriert. Das rohe Produkt wurde in gesättigtem NaHCO₃ aufgelöst, durch präparative HPLC gereinigt (Lösungsmittel A über 20 Minuten; Fließgeschwindigkeit, 45 ml/Minute), und lyophilisiert (45 mg, 57%). Analytische HPLC (Lösungsmittel A über 20 Minuten; Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute) Retentionszeit 9,4 Minuten, 99%. ESI MS m/z 1145 (MH⁺).
c) Verfahren für die Herstellung von N-Vancosaminyl abgeleiteten Vancomycintracern
Zu einer Lösung von Vancomycin (482 mg, 0,33 mmol) in trockenem DMF (6 ml) wurden Verbindungen 2, 3 oder 4 (0,36 mmol) und Triethylamin (0,91 ml, 6,6 mmol) hinzugefügt. Nach Rühren für 24 Stunden bei Raumtemperatur unter N₂ wurden die rohen Reaktionsmischungen durch präparative HPLC gereinigt und lyophilisiert.
Verbindung (13) gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 13"), wurde erhalten von Vancomycin und Biotinaktivem Ester (405 mg, 81%). Präparative HPLC (Lösungsmittel A über 20 Minuten; Fließgeschwindigkeit 45 ml/Minute).
Analytische HPLC (Lösungsmittel A über 15 Minuten; Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute): Retentionszeit, 9,4 Minuten, 99%. ESI/MS m/z: 1674 (MH⁺), 1305 (MH^– – Vancosaminylbiotin), 1143 (MH⁺ – Disaccharid – Biotin), 554 Disaccharid + Biotin + Na⁺.
Verbindung (14), gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 14"), wurde erhalten von Vancomycin und 6-Carboxyfluorescein-aktivem Ester (20 mg, 11%).
Präparative HPLC (Lösungsmittel B, 30:70:0,1; Fließgeschwindigkeit, 45 ml/Minute). Analytische HPLC (Lösungsmittel B, 30:70:0,1; Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute): Retentionszeit, 4,0 Minuten, 99%.
ESI/MS m/z: 1809 (MH⁺) , 904 (MH₂ ²⁺) , 1305 (MH⁺ – Vancosaminylfluorescein), 1143 (MH⁺ – Disaccharid – Fluorescein), 665 (Disaccharid + Fluorescein).
Verbindung (15), gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 15") erhalten von Vancomycin und Acridiniumaktivem Ester (409 mg, 70%).
Präparative HPLC (Lösungsmittel A über 20 Minuten; Fließgeschwindigkeit, 45 ml/Minute). Analytische HPLC (Lösungsmittel A über 20 Minuten; Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute): Retentionszeit, 10,4 Minuten, 99%.
ESI/MS m/z: 2016 (MH⁺), 1305 (MH⁺ – Vancosaminylacridinium), 1143 (MH⁺ – Disaccharid – Acridinium), 710 (Disaccharid + Acridinium).
d) Verfahren für die Herstellung von N-Methylleucyl abgeleiteten Vancomycintracern
Zu einer Lösung von Vancomycin (296 mg, 0,20 mmol) in DMSO (10 ml) wurden Biotin oder 10-(3-Sulfopropyl)-N-tosyl-N-(3-carboxypropyl)acridinium-9-carboxamid (0,20 mmol) und N-hydroxybenztraizol (33 mg, 0,24 mmol) hinzugefügt.
Dicyclohexylcarbodiimid (206 mg, 1,0 mmol) wurde hinzugefügt, und die Mischungen wurden für 72 Stunden bei Raumtemperatur unter N₂ gerührt. Die rohen Reaktionsmischungen wurden durch präparative HPLC gereinigt und lyophilisiert.
Verbindung (16), gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 16"), wurde erhalten von Vancomycin und Biotin (136 mg, 40%). Präparative HPLC (Lösungsmittel A über 20 Minuten; Fließgeschwindigkeit, 45 ml/Minute). Analytische HPLC (Lösungsmittel A über 20 Minuten, Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute): Retentionszeit, 9,4 Minuten, 99%. ESI/MS m/z: 1675 (MH⁺), 1531 (MH⁺ – Vancosamin), 1372 (MH⁺ – Disaccharide), 838 (MH₂ ²⁺) .
Verbindung (17) gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 17"), wurde erhalten von Vancomycin und 10-(3-Sulfopropyl)-N-tosyl)-N-(3-carboxypropyl)acridinium-9-carboxamid (190 mg, 35%).
Präparative HPLC (Lösungsmittel A war über 20 Minuten; Fließgeschwindigkeit, 45 ml/Minute). Analytische HPLC (Lösungsmittel A über 15 Minuten; Fließgeschwindigkeit 2 ml/Minute): Retentionszeit, 12,1 Minuten, 99%.
ESI/MS m/z: 2016 (MH⁺), 1874 (MH⁺ – Vancosamin), 1711 (MH⁺ – Disaccharid), 694 (N-Methylleucylacridinium).
e) Verfahren für die Herstellung von Carboxyl-derivatisierten Vancomycintracern

(i) Verbindung 9 wurde hergestellt gemäß dem Verfahren beschrieben in Sundram, U.N., et al., J. Org. Chem. 60:1102-1103 (1995). Zu einer Lösung von Vancomycin (500 mg, 0,35 mmol) und Hexandiaminhydrochlorid (196 mg, 1,04 mmol) in wasserfreiem DMSO/DMF (v:v, 1:1, 8 ml) bei 0°C wurden HBTU (262 mg, 0,69 mmol) und Diisopropylethylamin (480 μl, 276 mmol) hinzugefügt. Nach Rühren für 72 Stunden bei Raumtemperatur wurde die rohe Reaktionsmischung durch präparative HPLC gereinigt (Lösungsmittel B, 17:83:0,0; Fließgeschwindigkeit, 40 ml/Minute) und lyophilisiert (228 mg, 43%). Analytische HPLC (Lösungsmittel B, 17:83:0,0; Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute): Retentionszeit, 7,9 Minuten, 99%, ESI/MS m/z: 1548 (MH⁺).
(ii) Zu einer Lösung von Verbindung 9 (19 mg, 12 μmol) in trockenem DMF (0,5 ml) wurden Verbindungen 2, 3 oder 4 (12 μmol) und Triethylamin (2 μl, 12 μmol) hinzugefügt. Nach Rühren für 24 Stunden bei Raumtemperatur unter N₂ wurden die rohen Reaktionsmischungen durch präparative HPLC gereinigt und lyophilisiert.

Verbindung (18), gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 18"), wurde erhalten von Verbindung 9 und Biotin-aktivem Ester (9 mg, 31% basierend auf wiedergewonnenem Ausgangsmaterial. Präparative HPLC (Lösungsmittel B, 20:80:0,05; Fließgeschwindigkeit, 40 ml/Minute). Analytische HPLC (Lösungsmittel B, 20:80:0,05; Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute): Retentionszeit, 6,1 Minute, 99%. ESI/MS m/z: 1797 (M + Na⁺) , 1775 (MH⁺) , 1632 (MH⁺ – Vancosamin 1469 ( MH^– -Disaccharide).
Verbindung (19), gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 19"), wurde erhalten von Verbindung 9 und 6-Carboxyfluorescein-aktivem Ester (4 mg, 26% basierend auf wiedergewonnenem Ausgangsmaterial). Präparative HPLC (Lösungsmittel B, 27:73:0,05; Fließgeschwindigkeit, 40 ml/Minute). Analytische HPLC (Lösungsmittel B, 27:73.0,05; Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute): Retentionszeit, 7,5 Minuten, 99%. ESI/MS m/z: 1929 (M + Na⁺) , 1907 (MH⁺) , 1764 (MH⁺ -Vancosamin), 1600 (MH^– – Disaccharide).
Verbindung (20), gezeigt in 16 (hiernach bezeichnet als "Verbindung 20"), wurde erhalten aus Verbindung 9 und Acridinium-aktivem Ester (3 mg, 35% basierend auf wiedergewonnenem Ausgangsmaterial). Präparative HPLC (Lösungsmittel B, 27:73:0,05; Fließgeschwindigkeit, 40 ml/Minute). Analytische HPLC (Lösungsmittel B, 27:73:0,05; Fließgeschwindigkeit, 2 ml/Minute): Retentionszeit, 5,8 Minuten, 995. ESI/MS m/z: 2137 (M + NA⁺) , 2115 (MH⁺) , 1972 (MH⁺ – Vancosamin), 1810 (MH^– – Disaccharide).
f) monoklonale Anti-Vancomycin Antikörper-Herstellung
Anti-Vancomycin mAb, welches gegen Vancomycin gekoppelt an Thyroglobulin durch einen Carboxy-terminalen Aminobutyratlinker gezüchtet wurde, wurde auf einer Affinitäts-Pak-Protein-A-Säule gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt. Kurz gesagt wurde die Zellkultur, welche mAb (25,4 mg) enthielt, durch Zentrifugation geklärt (3500 g, 30 Minuten), durch einen 0,2 um Filter gefiltert, und der Überstand wurde auf die Affinitäts-Pak-Proteinsäule aufgetragen, welche mit 12 ml IgG Bindungspuffer ins Gleichgewicht gebracht wurde. Nach dem Waschen mit IgG Bindungspuffer wurde der Antikörper mit 6 ml von IgG Elutionspuffer in eine Phiole eluiert, welche 1,0 ml von 1,5 M Tris-Puffer, pH 9,0, enthielt. Das gereinigte IgG wurde gegen PBS-Puffer dialysiert (20 mM Phosphat, 30 mM NaCl, pH 7,2) für 12 Stunden bei 4°C, und dann in einer Amicon Microcon-50 Microkonzentrationsvorrichtung auf ungefähr 10 mg/ml konzentriert. Die mAb -Konzentration war 12,4 mg/Ml, wie durch den Mikro-BCA-Protein-Assay bestimmt, wie beschrieben in Smith, P.K., et al., Anal. Biochem. 150:76-85 (1985). Die Gesamtwiedergewinnung des gereinigten mAb war 18,6 mg.
g) Anti-Vancomycin Fab-Fragment Herstellung
Die Verdauung von Anti-Vancomycin mAb wurde mit dem ImmunoPure Fab Herstellungskit gemäß den Angaben des Herstellers ausgeführt. Gereinigtes Anti-Vancomycin mAb (ungefähr 12 mg) in Verdauungspuffer (0,5 ml; 20 mM Natriumphosphat, 10 mM EDTA und 30 mM Cystein, pH 7,0) wurde für 5 Stunden in einem 37°C Inkubator-Schüttler mit immobilisiertem Papain in Verdaungspuffer (0,5 ml) inkubiert. Papain-verdautes Anti-Vancomycin mAb wurde dann durch eine vorher ins Gleichgewicht gebrachte immobilisierte Protein-A-Säule (2 ml) geleitet, die mit dem Kit geliefert wurde, um unverdautes mAb und das Fc-Fragment zu entfernen. Die Protein-A-Säule wurde mit zusätzlichen 13 ml ImmunoPure Bindungspuffer gewaschen. Der Säulendurchfluß und die Säulenwaschungen, welche das Fab-Fragment enthielten, wurden gepoolt und für 12 Stunden bei 4°C gegen PBS-Puffer dialysiert und in einer Centriprep-10 Konzentrationsvorrichtung konzentriert. Die Konzentration des Anti-Vancomycin Fab-Fragments war 2,0 mg/ml wie durch das Micro-BCA-Verfahren bestimmt, unter Verwendung von Maus IgG (Fab')₂ als den Standard. Gereinigtes Anti-Vancomycin Fab-Fragment wurde durch SDS-PAGE und LC/ESI Massenspektrometrie charakterisiert. Die Molekulargewichte der schweren und leichten Ketten des Fab-Fragments waren 23,986 bzw. 24,033 Da. Alle Studien wurden mit dem Fab-Fragment von Anti-VAcomycin mAb durchgeführt, um die Komplexität zu eliminieren, welche mit der Bivalenz des monoklonalen Antikörpers im Zusammenhang steht.
h) Herstellung von Biosensoroberflächen
Die Immobilisierung von Verbindung 9 oder des Aminocaproatderivatisierten (N^ε-Acetyl)K_DA_DA Tripeptids über eine Aminkopplung an den CM-5 Sensorchip wurde durchgeführt gemäß dem Verfahren, das in Adamczyk, M., et al., Bioconjugate Chem., 9:23-32 (1998) beschrieben ist.
Kurz gesagt wurde ein kontinuierlicher Fluß von HBS-Puffer bei 10 μl/Minute über die Biosensoroberfläche initiiert. Die carboxymethylierte Dextranmatrix auf der Sensoroberfläche wurde durch eine 3,5 minütige Injektion einer Lösung von 0,05 M HNS und 0, 2 M EDAC aktiviert . Eine Lösung von Verbindung 9 oder des Aminocaproat-derivatisierten (N^ε-Acetyl)K_DA_DA Tripeptids (10 μM) und Ethanolamin (990 μM; 1 mM Gesamtamin in HBS Puffer) wurde dann injiziert (7 Minuten), gefolgt von einer 7 minütigen Injektion von 1,0 M Ethanolaminhydrochlorid, um zurückbleibende unreagierte aktive Estergruppen zu blockieren. Leere Oberflächen wurden unter identischen Bedingungen erzeugt, wobei der Liganden-Immobilisierungsschritt weggelassen wurde.
i) Lösungskompetitionsanalyse der Bindungswechselwirkung des Vancomycin-Analog/Anti-Vacomycin Fab-Fragments
Lösungskompetitionsstudien wurden durchgeführt auf einem BIRcore 2000 gemäß dem Verfahren, das in Adamczyk, M., et al., Bioconjuagte Chem., 9:23-32 (1998) beschrieben ist. Biosensoroberflächen wurden nach jeder Injektion regeneriert mit aufeinanderfolgenden 1 Minute Pulsen von 6 M, 6M und 1,5 M Guanidinhydrochlorid. Anfängliche Bindungsgeschwindigkeitn (-geschwindigkeiten) von Anti-Vancomycin Fab-Fragment an die Biosensoroberfläche wurden über ein 15 Sekunden Fenster beginnend 20 Sekunden nach der Injektion gemessen. Die Daten wurden durch nicht lineare Regressionsanalyse unter Verwendung des Lösungsaffinitätsmodels, das in BIAevaluation 3,0 Software (BIAcore, Inc) eingebaut wurde, bewertet.
j) Herstellung von Vancomycinanalogen und Tracern
Vancomycinanaloge, denen die Zucker oder das Ring-2-Chlor fehlt, wurden hergestellt wie beschrieben in Kannan, R., et al., J. Am. Chem. Soc., 110:2946-2953 (1988) und Harris, C.M., et al., J. Am. Chem. Soc., 107:6652-6658 (1985). Tracerverbindungen 13-15, welche einen derivatisierten N-Vancosaminylkohlenhydratanteil enthielten, wurden in 11-81% Ausbeute hergestellt durch Koppeln von Vancomycin mit den NHS aktiven Estern von Biotin (Verbindung 2), 6-Carboxyfluorescein (Verbindung 3) oder 10-(3-Sulfopropyl)-N-tosyl-N-(3-carboxypropyl)acridinium-9-carboxami (Verbindung 4) und Reinigung durch präparative HPLC (siehe Schema 1 in 14). Vacomycintracerverbindungen 16 und 17, die einen derivatisierten N-Methylleucylanteil tragen, wurden in 40 bzw. 35%iger Ausbeute hergestellt durch koppeln von Vancomycin mit freiem Biotin oder Acridiniumsäure in der Anwesenheit von N,N'-dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxybenztriazol (Siehe Schema 1 in 14). Verbindung 9, welche einen Aminoalkyllinker der freien Carboxylfunktionalität von Vancomycin enthält, wurde hergestellt durch das Verfahren beschrieben in Sundram, U.N., et al., J. Org. Chem., 60:1102-1103 (1995). Die Kopplung von Verbindung 9 mit den NHS aktiven Estern von Biotin (Verbindung 2), 6-Carboxyfluorescein (Verbindung 3) oder 10-(3-Sulfopropyl)-N-tosyl-n-(3-carboxypropyl)acridinium-9-carboxamid (Verbindung 4) wie oben, lieferte Mischungen der Carboxyl- und N-Vancosaminylkohlenhydrat-derivatisierten Vancomycintracern. Wiederholte Reinigungen durch präparative HPLC lieferten reine Carboxyl-modifizierte Tracerverbindungen 18-20 in 26-35%iger Ausbeute (siehe Schema 1 in 14). Kristalline Abbauprodukt- Analoge wurden hergestellt gemäß den Verfahren der Literatur oder gemäß der allgemeinen Methodik, die für die Herstellung von Vancomycinanalogen beschrieben ist (siehe Marshall F.J. Structure Studies on Vancomycin, J. Med. Chem., 8:18 (1965)).
Vancomycin HCl (100 mg) wurde in Wasser (2 ml) aufgelöst und der pH wurde auf 4,2 mit 1N NaOH eingestellt. Die Lösung wurde für 40 Stunden in einem Ölbad erhitzt, bei einer internen Temperatur von 60-70°C. CDP-I wurde durch Filtration wiedergewonnen und mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute war ungefähr 60%.
k) Herstellung einer immobilisierten Vancomycin Biosensoroberfläche
Anfängliche Versuche, eine Biosensoroberfläche zu erzeugen, schlossen die Immobilisierung von Vancomycin an die aktivierte Carboxymethyldextranoberfläche eines CM-5 Sensorchips durch das primäre Amin des Vancosaminzuckeranteils ein.
Darauf folgende Bindungsstudien mit gesättigten Mengen an Antivancomycin Fab-Fragment zeigten, daß diese Oberflächen eine minimale Bindungskapazität für das Antikörperfragment hatten. Im Gegensatz dazu lieferte die Immobilisierung von Verbindung 9 , welche den Aminoalkyllinker von der freien Carboxylfunktionalität enthielt, unter identischen Bedingungen Biosensoren mit relativ hoher Bindungskapazität (Ru_maX=4000) und einer hohen Affinität für Antivancomycin Fab-Fragment. Zusätzliche Bindungsstudien des Antivancomycin Fab-Fragments an die immobilisierte Aminoalkyl modifizierte Vacomycinoberfläche zeigte daß die Bindung durch Massentransfer eingeschränkt ist und geeignet ist für die Verwendung in den Lösungsbindungsstudien, die unten beschrieben sind.
l) Bestimmung der Bindungsaffinitäten von Vancomycinanalogen und Tracern für Anti-Vancomycin Fab-Fragment
Die Bindungsaffinitäten von verschiedenen Vancomycinanalogen und Tracern für Anti-Vancomycin Fab-Fragment wurden aus Lösungskompetitionsexperimenten bestimmt, welche auf einem BIAcore 2000 durchgeführt wurden. Am Anfang wurden bekannte Konzentrationen von Antivancomycin Fab-Fragment (0-22 nM) über die Aminoalkylvancomycin-Biosensoroberfläche injiziert.
Die anfängliche Bindungsgeschwindigkeit für jede Anti-Vancomycin Fab-Fragmentkonzentration wurde erhalten durch Bilden des Durchschnitts der beobachteten Bindungsgeschwindigkeit über ein 145 Sekunden Fenster, beginnend 20 Sekunden nach der Injektion. Daten von den ersten 20 Sekunden von jedem Sensorgramm wurden weggelassen aufgrund von Probendispersionseffekten am Beginn der Injektionen. Ein Plot der anfänglichen Bindungsgeschwindigkeit versus der Konzentration von Anti-Vancomycin Fab-Fragment wurde zusammengestellt unter Verwendung einer 4-Parameterlogistik (allgemeines Modell in BIAevaluation 3,0) was eine Standardkurve lieferte. Verschiedene Standardkurven wurden während des Verlaufs dieser Studien erzeugt und alle waren identisch innerhalb des experimentellen Fehlers. Eine festgelegte Konzentration von Anti-Vacomycin Fab-Fragement (20 nM) wurde dann mit zwölf Konzentrationen von jedem Vancomycinanalog oder Tracer gemischt und ein Gleichgewicht erreichen gelassen. Die Gleichgewichtsmischungen wurden individuell über die Aminoalkylvancomycin-Biosensoroberfläche injiziert, und die Konzentration an freiem Anti-Vancomycin Fab-Fragment, das zurückblieb, wurde quantitativ bestimmt durch Bestimmung der anfänglichen Bindungsgeschwindigkeit an die Biosensoroberfläche wie oben beschrieben. Ein Plot von freiem Anti-Vancomycin Fab-Fragment versus der Gesamtkonzentration von hinzugefügtem Analog oder Tracer liefert eine Kompetitionskurve. 17 zeigt typische Kompetitionskurven, die gemäß diesem Beispiel erzeugt wurden. Die Datenpunkte repräsentieren die experimentell bestimmten Konzentrationen von freiem Anti-Vancomycin Fab-Fragment in Gleichgewichtslösungen bei einer gegebenen Konzentration von löslichem Analog oder Tracer. Die Kurven repräsentieren die beste nicht lineare Anpassung der Daten unter Verwendung der Gleichung 1 (Lösungsaffinitätsmodell in BIAevaluation Software) unten:
worin Fab_τ die Konzentration an freiem Anti-Vancomycin Fab-Fragment in Gleichgewichtslösungen ist, Fab_τ ist die Gesamtkonzentration an Anti-Vancomycin Fab-Fragment in Lösung (20 nM), A ist die Gesamtkonzentration an hinzugefügtem Vancomycinanalog oder Tracer, und K_D ist die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante für die Bindung des Vancomycinanalogs oder Tracers an Anti-Vancomycin Fab-Fragment in Lösung.
Die Struktur-Bindungsbeziehungen für die Wechselwirkung zwischen Vancomycinanalogen und dem Anti-Vancomycin Fab-Fragment, wie gemessen durch die Änderungen in den Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten (K_D) sind in Tabelle 4 unten gezeigt.
Tabelle 4
Tabelle 4 zeigt, daß Vancomycin und das N-Acetylvancosaminyl-derivatisierte Analog (Verbindung 7) ausgesprochen eng binden, mit KD-Werten, die außerhalb des Bereichs liegen, für welche das BIAcore Instrument genaue Werte aus Lösungskompetitionsstudien liefern kann. Der Einschluß des Aminoalkyllinkers auf der freien Carboxylfunktionalität von Vancomycin, was Verbindung 9 lieferte, welche für die Herstellung der immobilisierten Vancomycinbiosensoroberfläche verwendet wurde, hat einen minimalen Effekt auf die Anti-Vancomycin Fab-Fragmentwiedererkennung in Lösung. Die Entfernung des Ring-2 Chloratoms von Vancomycin resultiert in einem signifikanten Verlust der Bindungswiedererkennung durch das Antikörperfragment (siehe die Ergebnisse für Verbindung 8 in Tabelle 4 oben). Die Abspaltung von einem oder beiden der Kohlenhydratringe von Vancomycin durch Säurehydrolyse, was Verbindungen 5 bzw. 6 liefert, resultiert in einem weiteren sequenziellen Verlust in der Bindungswiedererkennung durch das Antikörperfragment mit dem Verlust von jedem Monosaccharid. Antivancomycin Fab-Fragment Bindungswechselwirkungen mit Vancomycinabbauprodukten waren extrem schwach im Vergleich zu der nativen antibiotischen Bindungswechselwirkung. Kristallines Abbauprodukt (Verbindung 10) bindet mit einem KD von 488 ± 34 nM. Die Entfernung des Chloratoms von der 2-Position resultiert in einem signifikanten Verlust in der Bindungswiedererkennung durch das Antivancomycin Fab-Fragment, und eine vollständige Hydrolyse der Kohlenhydratringe, was Verbindung 11 liefert, resultiert in einer Bindungswechselwirkung mit dem Anti-Vancomycin Fab-Fragment, die zu schwach ist, um durch die Lösungskompetitionsstudien bestimmt zu werden.
Die Strukturbindungsbeziehungen für die Bindungswechselwirkung zwischen Vancomycintracern und dem Anti-Vancomycin Fab-Fragment, wie durch die Veränderungen in den Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten (KD) gemessen, sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.
Tabelle 5
Tabelle 5 zeigt, daß die Bindungswechselwirkungen abhängig von dem Marker, der auf dem Tracer enthalten war, variierten. Jedoch binden N-Methylleucyl (Verbindungen 16 und 17) und Carboxyl-HDA-abgeleitete Tracer (Verbindungen 18-20), die denselben Marker enthalten, das Antikörperfragment mit ähnlichen Affinitäten. Im Gegensatz dazu binden N-Vancosaminyl abgeleitete Tracer (Verbindungen 13-15), die den äquivalenten Marker enthalten, das Antikörperfragment im wesentlichen schwächer.
m) Bewertung einer Vancomycin/K_DA_DA Tripeptid Bindungswechselwirkung auf die Anti-Vancomycin Fab-Fragmentwiedererkennung
Um die Topologie von Vancomycin weiter zu bewerten, welche entscheidend ist für die Anti-Vancomycin Fab-Fragment-Wiedererkennung, wurde die Rolle der Reste, die in der Peptidbindungstasche auf dem Antibiotikum lokalisiert sind, untersucht (siehe 18). Für diese Studien wurde ein (N^ε-Acetyl)KDADA-Tripeptid, das einen Aminocabroatlinker von dem Aminoende enthielt, über eine Aminkopplung an eine aktivierte Carboxymethyldextranoberfläche von einem CM-5 Sensorchip immobilisiert. Vancomycin (0,5 μM) bindet an diese Oberfläche (siehe 19). Jedoch, da die Masse des Antibiotikums klein ist, ist die Antwort des Instruments relativ klein (ungefähr 50 Rus bei Gleichgewicht). Im Gegensatz dazu resultiert die Injektion eines Vancomycin (0,5 μM)/Anti-Vancomycin Fab-Fragment (1 μM) Komplexes, in welchem ≥ 99% des Vancomycins durch das Antikörperfragment gebunden ist, in ungefähr einem 10-fachen Anstieg in der Antwort aufgrund der erhöhten Masse des Komplexes (siehe 19). Antivancomycin Fab-Fragment alleine hat keine Affinität für die immobilisierte Tripeptidoberfläche (19). Um weiter zu beweisen, daß die Peptid und Antikörperbindungstaschen von Vancomycin gegenseitig exklusiv waren, wurde die Vancomycin/Anti-Vancomycin Fab-Fragmentlösungsbindungs-Wechselwirkung wiederum untersucht unter den Bedingungen, die oben beschrieben sind, in der Anwesenheit von (N^a,N^ε-Diacetyl)KDADA Tripeptid (500 μM). Der erhaltene KD-Wert für die Vancomycin/Anti-Vancomycin Fab-Fragmentbindungswechselwirkung in Lösung in der Anwesenheit von (N^a,N^ε-Diacetyl)KDADA Tripeptid war identisch mit dem Wert, der in der Abwesenheit des Tripeptids (≤ 0,2 nM) erhalten wurde.

Claims

Ein Verfahren für die Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit (i) einem Antikörperreagens, das Antikörper umfaßt, die in der Lage sind spezifisch an Vancomycin zu binden, wobei der Antikörper mit einem Immunogen der folgenden Formel hergestellt wird;
worin P ein immunogenes Trägermaterial ist, und X ist ein verbindender Anteil aus von 0 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatomen, einschließlich nicht mehr als zehn Heteroatomen, angeordnet als eine gerade oder verzweigte Kette oder als ein cyclischer Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Voraussetzungen, daß nicht mehr als zwei Heteroatome direkt in Sequenz miteinander verbunden sein können, daß die Sequenz keine -O-O-Bindungen enthalten kann, daß cyclische Anteile 6 oder weniger Glieder enthalten, und daß eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen vorkommen kann, und (ii) einem markierten Reagens, das in der Lage ist, die Bindung des Antikörpers an das Vancomycin zu verdrängen, um eine Reaktionslösung zu bilden; und (b) Messen der Menge des markierten Reagens in der Reaktionslösung, welches entweder an den Antikörper gebunden ist oder nicht, als eine Funktion der Menge an Vancomycin in der Testprobe, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren einen stabilen Kalibrator verwendet, der eine wässerige Lösung umfaßt, die ein mit einem Polypeptid stabilisiertes Vancomycinmolekül enthält, worin das Polypeptid die Bindung eines Antikörpers an das Vancomycinmolekül nicht beeinflußt.
Das Verfahren gemäß Anspruch .1, worin das markierte Reagens die folgende Formel hat:
worin Q ein detektierbarer Anteil ist, und X besteht aus von 0 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatomen, einschließlich nicht mehr als zehn Heteroatomen, angeordnet als eine gerade oder verzweigte Kette oder als ein cyclischer Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Voraussetzungen, daß nicht mehr als zwei Heteroatome direkt in Sequenz miteinander verbunden sein können, daß die Sequenz keine -O-O-Bindungen enthalten kann, daß cyclische Anteile 6 oder weniger Glieder enthalten, und daß eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen vorkommen kann.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der detektierbare Anteil gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Enzymen, Reagens die folgende Chromophoren, fluoreszierenden Molekülen, chemilumineszierenden Molekülen, phosphoreszierenden Molekülen und lumineszierenden Molekülen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das immunogene Trägermaterial gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rinderserumalbumin, Napfschneckenhämocyanin (keyhole limpet hemocyanin) und Thyreoglobulin.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Immunoassayverfahren ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay ist, worin der detektierbare Anteil des markierten Reagens ein fluoreszierendes Molekül ist, und das immunogene Trägermaterial gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rinderserumalbumin, Napfschneckenhaemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) und Thyreoglobulin.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die Messung in Schritt (b) folgendermaßen durchgeführt wird: (a) Hindurchführen einer Ebene von polarisiertem Licht durch die Reaktionslösung, um eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu erhalten, und (b) Detektieren der Fluoreszenzpolarisationsantwort der Reaktionslösung als ein Maß für die Menge an Vancomycin in der Testprobe.
Das Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das fluoreszierende Molekül gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminomethylfluorescein, Aminofluorescein, 5-Carboxyfluorescein, 6-Carboxyfluorescein, Thioureafluorescein und Dichlortriazinylaminofluorescein.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das markierte Reagens
ist, und der Antikörper wird mit einem Immunogen der Formel
hergestellt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, worin der Antikörper durch eine Hybridomzell-Linie sezerniert wird, die als A.T.C.C. HB 11834 bezeichnet ist.
Ein Testkit für die Quantifizierung von Vancomycin in einer Testprobe, wobei der Testkit folgendes umfaßt: (a) ein Antikörperreagens, das Antikörper umfaßt, welche in der Lage sind, Vancomycin in einer Testprobe spezifisch zu binden, wobei der Antikörper mit einem Immunogen der folgenden Formel hergestellt wird:
worin P ein immunogenes Trägermaterial ist, und X ist ein verbindender Anteil aus von 9 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatomen, einschließlich nicht mehr als 10 Heteroatomen, angeordnet als eine gerade oder verzweigte Kette oder als ein cyclischer Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Voraussetzungen, daß nicht mehr als zwei Heteroatome direkt in Sequenz miteinander verbunden sein können, daß die Sequenz keine -O-O-Bindungen enthalten kann, daß cyclische Anteile 6 oder weniger Glieder enthalten, und daß eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen vorkommen kann; (b) ein markiertes Reagens, das in der Lage ist, die Formel Bindung des Antikörpers an das Vancomycin zu verdrängen; und (c) einen stabilen Kalibrator, der eine wässerige Lösung umfaßt, die ein mit einem Polypeptid stabilisiertes Vancomycinmolekül enthält, worin das Polypeptid die Bindung eines Antikörpers an das Vancomycinmolekül nicht beeinflußt.
Der Testkit gemäß Anspruch 10, worin das markierte Reagens folgende Formel hat:
worin Q ein detektierbarer Anteil ist, und X besteht aus von 0 bis 50 Kohlenstoff- und Heteroatomen, einschließlich nicht mehr als zehn Heteroatomen, angeordnet als eine gerade oder verzweigte Kette oder als ein cyclischer Anteil, gesättigt oder ungesättigt, unter den Voraussetzungen, daß nicht mehr als zwei Heteroatome direkt in Sequenz miteinander verbunden sein können, daß die Sequenz keine -O-O-Bindungen enthalten kann, daß cyclische Anteile 6 oder weniger Glieder enthalten, und daß eine Verzweigung nur an Kohlenstoffatomen vorkommen kann.
Der Testkit gemäß Anspruch 10, worin das immunogene Trägermaterial gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rinderserumalbumin, Napfschneckenhaemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) und Thyreoglobulin.
Der Testkit gemäß Anspruch 10, worin der immunogene Träger Thyreoglobulin ist.
Der Testkit gemäß Anspruch 10, worin der Antikörper durch eine Hybridomzell-Linie sezerniert wird, die als A.T.C.C. HB 11834 bezeichnet ist.
Verwendung eines stabilen Kalibrators für den Zweck der Quantifizierung von Vancomycin, worin der stabile Kalibrator eine wässerige Lösung umfaßt, die ein mit einem Polypeptid stabilisiertes Vancomycinmolekül enthält, worin das Polypeptid die Bindung eines Antikörpers an das Vancomycinmolekül nicht beeinflußt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 15 eines stabilen Kalibrators, worin der Kalibrator für mindestens zwei Monate stabil ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 15 eines stabilen Kalibrators, worin der Kalibrator für mindestens sechs Monate stabil ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 15 eines stabilen Kalibrators, worin der Kalibrator für mindestens ein Jahr stabil ist.