DE4013004A1 - Verfahren zur quantitativen enzymimmunologischen bestimmung von niedermolekularen organischen substanzen mittels elisa-methode unter verwendung eines enzymgekoppelten antikoerpers - Google Patents
Verfahren zur quantitativen enzymimmunologischen bestimmung von niedermolekularen organischen substanzen mittels elisa-methode unter verwendung eines enzymgekoppelten antikoerpersInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von niedermolekularen organischen Substanzen
mit der Technik des Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay
(ELISA: Festphasenimmuntest).
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Bestimmung
niedermolekularer Substanzen mit Nachweisgrenzen, die bis
zu zwei Zehnerpotenzen unter denen liegen, die mit
herkömmlichen Verfahren erreicht werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können praktisch alle
niedermolekularen organischen Substanzen, für die Antikörper
verfügbar sind, bestimmt werden.
Insbesondere eignet es sich zur Bestimmung von Mykotoxinen,
Antibiotika und Pestiziden, bevorzugt von Ochratoxin A,
Aflatoxin M1, Aflatoxin B1, Deoxynivalenol, Ergot-alkaloiden,
Zearalenon, Patulin, Chloramphenicol, β-Lactamen (Penicillinen),
Triazinen, Dinitroaromaten, Phenylharnstoffen, chlorierten
Anilinen, chlorierten Phenolen und Nitrosaminen.
Das Prinzip des Enzymimmunoassays beruht auf einer spezifi
schen Antigen-Antikörper-Reaktion.
Unter Antigenen versteht man dabei körperfremde Substanzen,
die, gelangen sie in einen Organismus, eine Immunreaktion
auslösen. Diese besteht im Wesentlichen in der Produktion
von Eiweißstoffen, die ganz spezifisch das entsprechende
Antigen binden. Diese Eiweißstoffe bezeichnet man als
Antikörper.
Handelt es sich bei dem Antigen um eine niedermolekulare
organische Substanz, so spricht man von Haptenen.
Da Haptene jedoch selbst nicht immunogen sind, muß man sie
zur Herstellung der Antikörper an Trägerproteine binden.
Dabei muß die Kopplungsstelle so gewählt werden, daß die für
die jeweilige Substanz charakteristische Struktur möglichst
unverändert erhalten bleibt.
Mit so hergestellten Antikörpern werden sog. kompetitive
ELISAs entwickelt. Darunter versteht man Testsysteme, bei
denen der Antikörper an Trägermaterial, z. B. Mikrotiter
platten gebunden wird. In der anschließenden Reaktion
konkurrieren freie Haptene (in Standard oder Probe) mit
gekoppelten Haptenen (z. B. an alkalische Phosphatase,
Peroxidase) um einen Unterschuß an Antikörper.
Die in dieser Reaktion gebundene Menge an gekoppelten
Haptenen wird durch die Enzymaktivität gemessen.
Bei Enzymimmuntests gegen Haptene muß in jedem Fall der
Antikörper an das Trägermaterial gebunden werden.
Bei den bisherigen Verfahren wird zum Nachweis des Haptens
die Verbindung selbst an das Enzym (z. B. alkalische
Phosphatase, Peroxidase, β-Galactosidase) chemisch gebunden.
Das Enzym darf bei dieser Kopplung seine Aktivität nicht
verlieren.
In der Regel steht für diese Kopplung aufgrund der geringen
Größe des Haptens nur eine Bindungsstelle im Molekül zur
Verfügung. Somit erfolgt die Kopplung an das Enzym über die
selbe Struktureinheit im Hapten wie bei der Kopplung des
Haptens an das Trägerprotein für die Immunisierung.
Bei der Durchführung des Tests werden die mit Antikörpern
beschichteten Reaktionsgefäße (Küvetten, Kavitäten der
Mikrotiterplatte) zunächst mit Probe und dann mit einer
bestimmten Menge an Hapten-Enzym-Konjugat gefüllt.
In der darauf folgenden Reaktionzeit konkurrieren die
Haptene in der Probe (also die zu bestimmenden Substanzen)
mit den enzymgebundenen Haptenen um einen Unterschuß an
Antikörpern.
Antikörper und Hapten-Enzym-Konjugat befinden sich dabei
immer in gleichbleibend konstantem Konzentrationsverhältnis.
Variabel ist jeweils nur die Konzentration des Haptens in
der Probe.
Anhand von definierten Standards läßt sich der Gehalt
in der Probe quantitativ bestimmen.
Die Herstellung eines spezifischen Antikörpers gegen Aflatoxin
M1, mit dem ein heterologer Immunoassay zum Nachweis von
Aflatoxin M1 in Milch und Milchpulver entwickelt wurde,
ist aus "Archiv für Lebensmittelhygiene" 36, 49-76, 1985
bekannt. Als enzymmarkiertes Toxin diente dabei ein
Aflatoxin B1-Meerrettichperoxidase-Konjugat.
In "Archiv für Lebensmittelhygiene" 38, 1-32, 1987 ist ein
enzymimmunologischer Nachweis von Chloramphenicol in Milch
beschrieben. Bei der Entwicklung dieses heterologen
Enzymimmunoassays zum Nachweis von Chloramphenicol wurde
peroxidasemarkiertes Chloramphenicol als Enzymkonjugat
verwendet. Die Nachweisgrenze dieses Verfahrens lag unter
500 ng/kg.
Aus "Journal of Food Protection" Bd. 49, Nr. 10, S. 792-795,
Okt. 1986 ist ein ELISA zum Nachweis von Aflatoxin B1,
in dem als Enzymkonjugat Aflatoxin B1-Peroxidase verwendet
wird, bekannt.
Im Zuge der fortschreitenden Analytik auf allen Gebieten
werden immer niedrigere Nachweisgrenzen für die analytischen
Methoden gefordert.
Um den nötigen Sicherheitsspielraum für toxische Substanzen
zu gewährleisten, werden Grenzwerte bewußt niedrig angesetzt.
So liegen z. B. laut Trinkwasserverordnung vom 1.10.1989
die Grenzwerte für Pestizide bei 100 ng/l. Der Grenzwert
für Aflatoxine in Milch bei Babynahrung soll laut Bundes
gesundheitsamt sogar bei 10 pg/ml liegen.
Bei den nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren
werden jedoch meist nur Nachweisgrenzen erreicht, die im
Bereich des gesetzlichen Grenzwerts oder sogar darüber
liegen.
Die Entscheidung, ob ein Nahrungsmittel noch den Vorschriften
entspricht, ist mitunter schwer zu treffen.
Die oft nicht ausreichende Empfindlichkeit der Tests hat
ihren Grund in der Kompetition mit enzymgekoppeltem Hapten:
Wird ein Tier mit einem Hapten-Protein-Konjugat immunisiert,
so bildet der Organismus die Antikörper nicht gegen das
ganze Molekül, sondern nur gegen Teilstrukturen, z. B.
funktionelle Gruppen.
Man erhält also eine Vielzahl von Antikörpern, die gegen
unterschiedliche Bereiche des Konjugats gerichtet sind.
Darunter befinden sich Antikörper, die gegen die gewünschten
Strukturen des Haptens gerichtet sind, Antikörper, die
gegen Teilsequenzen des Trägerproteins gerichtet sind
und Antikörper, die gegen die Verbindungsstelle zwischen
Hapten und Trägerprotein gerichtet sind.
Alle diese Antikörper werden (bei der Verwendung polyklonaler
Seren) an die Mikrotiterplatten oder Küvetten fixiert und
können somit ihr entsprechendes Antigen binden.
Die Antikörper gegen das Trägerprotein beeinträchtigen den
Test nicht, da die Trägerproteine sich in ihrer Struktur
von den Proteinstrukturen des verwendeten Enzyms stark
unterscheiden.
Problematisch sind die Antikörper, die gegen die Verbindung
zwischen Hapten und Protein gerichtet sind.
So wird durch die fixierten Antikörper nicht nur freies
oder enzymgebundenes Hapten erkannt, sondern auch die
Bindungsstelle zwischen Hapten und Enzym, da normalerweise
nur eine günstige Kopplungsstelle im Hapten zur Verfügung
steht, und somit die Verbindungsstellen zwischen Hapten
und Trägerprotein und Hapten und Enzym identisch sind.
Das enzymgekoppelte Hapten besitzt so eine höhere Affinität
zum Antikörperpool als freies Hapten in der Probe (Brücken
effekt).
Daraus ergibt sich, daß die zu bestimmende Verbindung (in
Standard oder Probe) in höherer Konzentration vorhanden
sein muß, um das Hapten-Enzym-Konjugat vom Antikörper zu
verdrängen.
Dies verringert die Empfindlichkeit des Tests.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die durch
den Brückeneffekt bedingte Unempfindlichkeit der enzym
immunologischen Bestimmungen von Haptenen mittels der
ELISA=Technik zu minimieren und das Verfahren zugleich
kostengünstiger und schneller zu gestalten.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß
man statt eines Hapten-Enzym-Konjugats ein Antikörper-Enzym-
Konjugat als Reaktionspartner verwendet.
Es wurde gefunden, daß die Teile des Antikörpers, die das
Hapten erkennen (Fab-Teile), zueinander eine Affinität
besitzen, die in der Größenordnung der Affinität von
Antikörpern zu Haptenen liegt.
Die entsprechenden Affinitätskonstanten wurden durch
Bildung von Antikörper-Antikörper-Komplexen bei steigenden
Mengen an enzymgekoppeltem Antikörper und konstanten
Konzentrationen an fixiertem Antikörper ermittelt.
Zum Vergleich wurden die Affinitätskonstanten der Antikörper
zu den Haptenen selbst dadurch ermittelt, daß die Bildung
von Hapten-Antikörper-Komplexen bei steigenden Mengen an
enzymmarkiertem Hapten und konstanter Konzentration an
fixiertem Antikörper ermittelt wurde.
Die jeweiligen Affinitätskonstanten sind in folgender
Tabelle für einige Tests beispielhaft aufgezeigt.
Daher läßt sich die Empfindlichkeit des Verfahrens deutlich
erhöhen (Wegfall des Brückeneffekts), wenn man zum
quantitativen Nachweis ein Antikörper-Enzym-Konjugat
anstelle des bisher verwendeten Hapten-Enzym-Konjugats
einsetzt.
Bei der Testdurchführung werden die Mikrotiterplatten
nach an sich bekannten Methoden mit Antikörpern gegen die
zu bestimmende Substanz beschichtet und anschließend
abgeblockt (Maskieren unspezifischer Bindungsstellen).
In den Testansatz pipettiert man Standards und Proben, die
die zu bestimmende Verbindung enthalten.
Erfindungsgemäß gibt man statt eines Hapten-Enzym-Konjugats
ein Antikörper-Enzym-Konjugat zu.
In einer anschließenden Inkubationszeit konkurrieren enzym
gekoppelte Antikörper und die zu bestimmende Verbindung
um die Bindungsstellen des an die Mikrotiterplatten
fixierten Antikörpers, der sich im Unterschuß befindet.
Nach Auswaschen nicht gebundener Reaktanden kann durch
Substratzugabe die Menge des gebundenen Antikörper-Enzym-
Konjugats ermittelt werden.
Das gekoppelte Enzym bildet aus dem Substrat einen Farbstoff,
der photometrisch gemessen werden kann. Dabei ist die Farb
intensität umgekehrt proportional zur Konzentration des
Haptens in der Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die im Folgenden
aufgeführten Beispiele näher erläutert. Diese dienen jedoch
nicht dazu, den Umfang der Erfindung zu beschränken.
Als Plattenmaterial wurden handelsübliche Mikrotiterplatten
verwendet.
Als alkalische Phosphatase wurde ein im Handel übliches
Produkt eingesetzt.
Sämtliche verwendeten Reagenzien sollen dem Reinheitsgrad
p. a. entsprechen.
Das Wasser zur Herstellung der Puffer, sowie zum Waschen
der Mikrotiterplatten sollte höchsten Reinheitsgraden
entsprechen.
Die Antikörper wurden nach an sich bekannten Verfahren
zur Herstellung von Antikörpern gegen Haptene gewonnen.
So sind derartige Verfahren z. B. aus "Immunoassays in
Food Analysis", Elsevier Verlag, 1985, 159-167 bekannt.
Die Kopplungsreaktionen der einzelnen Antikörper an das
verwendete Enzym (alkalische Phosphatase) wurden nach
allgemein bekannten Methoden durchgeführt - als Kopplungs
reagenz wurde Glutardialdehyd eingesetzt (Practice and
Theory of Enzymeimmunoassays, Elsevier Verlag, Burdon,
1985, 242-245).
Zur Aufarbeitung der Proben, die mit dem ELISA untersucht
werden sollen, eignet sich im Prinzip jede Methode, die
gewährleistet, daß sich die zu bestimmende Substanz
am Ende der Probenaufarbeitung in wäßriger Phase befindet.
Der Anteil an organischen Lösungsmitteln soll 5% nicht
überschreiten.
Die im Folgenden aufgeführten Probenaufarbeitungen lassen
sich für alle festen Materialien wie z. B. Getreide und
-produkte (Brot, Futtermittel, Nudeln etc.), Nüsse, Ei
und -produkte u. a. m. anwenden.
Bei der Extraktion von Ochratoxin A werden 2 g fein ge
mahlene Probe mit 5 ml Chloroform und 0,1 ml 1n-HCl
15 Minuten gerührt. Anschließend werden die Festbestand
teile abzentrifugiert und die organische Phase mit einem
Aliquot an 0,15 m Bicarbonatlösung pH 8,5 extrahiert.
Zur Phasentrennung wird erneut abzentrifugiert und die
wäßrige Phase im Test eingesetzt.
Zur Extraktion von Chloramphenicol, Aflatoxin M1, Aflatoxin
B1, Ergot-alkaloiden und Patulin werden 2 g zerkleinerte
Probe mit 5 ml 55%igem Methanol und 2 ml Hexan (bei hohem
Fettgehalt, z. B. Butter, Nüsse, Trockeneigelb etc. 4 ml
Hexan) 15 Minuten gerührt. Bei der Extraktion von
Zearalenon und Deoxynivalenol verlängert sich diese Rühr
zeit auf 10 Stunden.
Anschließend zentrifugiert man ab, die Wasser-Methanol-
Phase kann direkt mindestens 1 : 10 verdünnt im Test ein
gesetzt werden.
Die verwendeten Extrakte müssen völlig frei von Schwebeteilen
sein. Ist dies bei manchen Proben allein durch Zentrifugation
nicht zu erreichen, wird eine Membranfiltration des Extrakts
angeschlossen.
Will man die Pestizide (Triazine, Dinitroaromaten, Phenyl
harnstoffe, chlorierte Aniline, chlorierte Phenole) in
festem Probenmaterial (z. B. Gemüse) nachweisen, kann die
selbe Probenaufarbeitung wie bei den Mykotoxinen verwendet
werden. Dabei ist jedoch der eigene Wassergehalt (z. B.
Gurken 90%) zu berücksichtigen. Es muß prozentual mehr
Methanol eingesetzt werden, um eine Endkonzentration von
55% im Extrakt zu erreichen.
Für Trinkwasser (Pestizide), Milch (Aflatoxin M1), Bier
(Pestizide, Mykotoxine) und andere flüssige Proben (außer
Serum) ist keine Probenaufarbeitung notwendig.
Die Proben können selbst unverdünnt im Test eingesetzt
werden.
Bei der Probenextraktion werden eine Reihe anderer Inhalts
stoffe mitisoliert, so z. B. Salze, Farbstoffe, evtl. Pro
teine, Aminosäuren, Zucker u. a. m.
Da es sich bei Antikörpern um Eiweißstoffe handelt, kann
deren Ladung und Struktur vom umgebenden Medium beein
flußt werden (pH-Wert, Ionenstärke, Proteinkonzentration,
Lösungsmittelreste etc.).
Pipettiert man nun den Extrakt in den Test, so setzt man
sowohl den fixierten Antikörper als auch den enzymge
koppelten Antikörper diesen Einflüssen des Extrakts aus.
Dadurch werden bei der Messung später andere Extinktions
wert erzielt als bei Einsatz von destilliertem Wasser.
Diese Beobachtung wird als Matrixeffekt bezeichnet.
Um durch diesen Matrixeffekt bedingte falsch positive
oder falsch negative Ergebnisse zu vermeiden, werden bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren die Standards jeweils in
einem Nullextrakt des selben Probenmaterials angesetzt,
z. B. werden bei der Untersuchung von Weizenproben die
Standards in einem toxin- oder pestizidfreiem Weizen
extrakt angesetzt.
Die Verdünnung dieses Nullextrakts ist dabei dieselbe
wie die Verdünnung der Probenextrakte.
Dadurch herrschen sowohl in den Kavitäten der Standards
als auch bei den Proben die gleichen Reaktionsbedingungen.
Die Ergebnisse können unter Berücksichtigung der Wieder
findungsrate direkt ohne Verwendung von Umrechnungsfaktoren
ausgewertet werden.
Für die Kopplung von Antikörpern gegen Ochratoxin A an
alkalische Phosphatase werden 0,5 mg Antikörper in 1 ml
phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS)
mit 300 U alkalischer Phosphatase und 0,05 ml 25%igem
Glutardialdehyd 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach abgeschlossener Inkubationszeit gibt man 0,1 ml
1 m Lysin (in Wasser) dazu und reinigt dann das Kopplungs
produkt durch dreitägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C.
Die Standardkonzentrationen, die im Test eingesetzt werden,
liegen zwischen 10 pg/0,1 ml und 10 ng/0,1 ml.
Bei der Testdurchführung pipettiert man in die mit Anti
körper beschichteten Kavitäten (die dabei zu verwendende
Konzentration ist abhängig von Kopplungsrate des Antikörper-
Enzym-Konjugats und vom Plattenmaterial selbst - die
optimalen Konzentrationsverhältnisse müssen jeweils
ausgetestet werden) zunächst 0,1 ml Standard oder Probe.
Darauf gibt man 0,1 ml Antikörper-Enzymkonjugat in der
optimierten Verdünnung.
In einer anschließenden einstündigen Inkubationszeit werden
die Bindungsstellen der Antikörper besetzt.
Die Platte wird dann 3× mit dest. Wasser gewaschen.
Danach gibt man in jede Kavität 0,2 ml der Substratlösung.
Sie besteht aus 1 mg p-Nitrophenylphosphat/ml 10%igem
Diethanolaminpuffer pH 9,6.
Nach einer einstündigen Inkubationszeit bei 37 Grad C im
Dunkeln kann die Platte bei 410 nm gemessen werden.
Aufgrund des Matrixeinflusses kann sich diese Inkubationszeit
verschieben. Gemessen wird, wenn die Extinktion des
niedrigsten Standards zwischen 0,5 und 0,9 liegt.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 1.
Für die Kopplung von Antikörpern gegen Aflatoxin M1 an
alkalische Phosphatase werden 0,5 mg Antikörper in 1 ml
PBS mit 350 U alkalischer Phosphatase und 0,01 ml
25%igem Glutardialdehyd 2 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert.
Nach dieser Zeit gibt man zum Abstoppen der Reaktion
0,1 ml 1 m L-Lysin zu. Anschließend wird das Kopplungs
produkt drei Tage bei 4 Grad C durch Dialyse gegen PBS
gereinigt.
Die im Test verwendeten Standardkonzentrationen liegen
zwischen 0,1 pg/0,1 ml und 100 pg/0,1 ml.
Bei der Testdurchführung pipettiert man nacheinander
0,1 ml Standard oder Probe und 0,1 ml Antikörper-Enzym-
Konjugat pro Kavität. Die Konzentrationsverhältnisse
zwischen fixiertem Antikörper und Antikörper-Enzym-
Konjugat müssen optimiert werden (neue Synthese, anderes
Plattenmaterial).
Nach einer Inkubationeszeit von 1 Stunde bei 4 Grad C
wäscht man die Platte dreimal mit dest. Wasser und gibt
dann die Substratlösung zu (s. Beispiel 1).
Anschließend wird 2 Stunden bei 37 Grad C im Dunkeln
inkubiert und dann bei 410 nm gemessen.
Auch hier sollte die Extinktion des niedrigsten Standards
zwischen 0,5 und 0,9 liegen.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 2.
Um die Antikörper gegen Aflatoxin B1 an alkalische Phospha
tase zu koppeln, inkubiert man 0,5 mg Antikörper in 1 ml
PBS mit 300 U alkalischer Phosphatase und 0,1 ml 25%igem
Glutardialdehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml
1 m L-Lysin-Lösung abgestoppt und das Kopplungsprodukt
durch eine dreitägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C
gereinigt.
Als Standards wurden im Test Konzentrationen zwischen
0,1 pg/0,1 ml und 100 pg/0,1 ml eingesetzt.
Bei der Testdurchführung werden nacheinander zunächst
0,1 ml Standard oder Probe, dann 0,1 ml Antikörper-Enzym-
Konjugat pipettiert. Die optimalen Konzentrationen sind
auch hier von der jeweiligen Synthese und vom verwendeten
Plattenmaterial abhängig.
Der Testansatz inkubiert 1 Stunde bei 4 Grad C.
Anschließend wird gewaschen (dreimal mit dest. Wasser)
und die Substratlösung zugegeben (s. Beispiel 1).
Nach einer weiteren Stunde Inkubationszeit bei 37 Grad C
im Dunkeln wird die Platte bei 410 nm gemessen.
Der Matrixeinfluß kann auch hier eine Verlangsamung oder
Beschleunigung der Extinktionswerte bewirken.
Die Werte des niedrigsten Standards sollten bei der Messung
zwischen 0,5 und 0,9 liegen.
Verlauf der Standardkurve:s. Fig. 3.
Zur Kopplung der Antikörper gegen Chloramphenicol an
alkalische Phosphatase werden 0,5 mg Antikörper in 1 ml
PBS mit 300 U alkalischer Phosphatase und 0,1 ml 25%igem
Glutardialdehyd für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Zum Abstoppen der Kopplungsreaktion gibt man anschließend
0,1 ml 1 m L-Lysin-lösung dazu.
Das Syntheseprodukt wird im Folgenden durch eine drei
tägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C gereinigt.
Bei der Testdurchführung werden Standardkonzentrationen
zwischen 0,1 pg/0,1 ml und 100 pg/0,1 ml eingesetzt.
Zunächst gibt man nacheinander 0,1 ml Standard oder Probe
und 0,1 ml Antikörper-Enzym-Konjugat in jede Kavität.
Die optimale Verdünnung des Konjugats muß für jedes
Plattenmaterial abgestimmt werden (unterschiedliche
Bindungskapazitäten für den fixierten Antikörper etc.).
Nach einer einstündigen Inkubation im Kühlschrank
(4 Grad C) wird die Mikrotiterplatte dreimal mit dest.
Wasser gewaschen.
Anschließend wird die Substratlösung zugegeben (s. Bei
spiel 1).
Nach einer weiteren Inkubationszeit von in der Regel einer
Stunde bei 37 Grad C kann bei 410 nm gemessen werden.
Die Extinktion des niedrigsten Standards soll dabei
zwischen 0,5 und 0,9 liegen (Matrixeffekt).
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 4.
Um die Antikörper gegen Zearalenon an alkalische Phospha
tase zu koppeln werden 0,5 mg Antikörper mit 300 U alka
lischer Phosphatase und 0,05 ml 25%igem Glutardialdehyd
in 1 ml PBS eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dieser Zeit wird die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml
1m L-Lysin abgestoppt. Die Reinigung des Kopplungsprodukts
erfolgt durch dreitägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C.
Als Standards werden Konzentrationen des Haptens von
0,1 pg/0,1 ml bis 100 pg/0,1 ml eingesetzt.
Bei der Testdurchführung werden zunächst 0,1 ml Standard
oder Probe (Doppelbestimmung) und dann 0,1 ml des Anti
körper-Enzym-Konjugats pro Kavität pipettiert.
Die Konzentration des Konjugats ist im Hinblick auf
die Kopplungsrate (Verhältnis Antikörper zu Enzym) und
die Bindungskapazität der Platte zu optimieren.
Anschließend wird eine Stunde bei 4 Grad C inkubiert.
Danach wäscht man die Mikrotiterplatte dreimal mit dest.
Wasser. Nach Substratzugabe (s. Beispiel 1) und einer
Stunde Inkubation bei 37 Grad C im Dunkeln kann die Platte
zur Auswertung bei 410 nm gemessen werden.
Aufgrund des Matrixeffekts kann sich die Dauer der Inkuba
tionszeit nach oben oder unten verschieben.
Die Extinktionen des niedrigsten Standards sollten bei der
Messung zwischen 0,5 und 0,9 liegen.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 5.
Zur Kopplung der Antikörper gegen Triazine an alkalische
Phosphatase werden 0,5 mg Antikörper in 1 ml PBS mit
350 U alkalischer Phosphatase und 0,05 ml 25%igem Glutar
dialdehyd eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach stoppt man die Kopplungsreaktion durch Zugabe von
0,1 ml 1 m L-Lysin ab.
Die Reinigung des Konjugats erfolgt durch dreitägige
Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C.
Die Antikörper sind gegen die Gruppe der Triazine gerichtet.
Als häufigsten und wichtigsten Vertreter dieser Gruppe
wird in den Standardlösungen Atrazin eingesetzt.
Die Konzentrationen liegen dabei zwischen 0,1 pg/0,1 ml und
100 pg/0,1 ml.
Bei der Testdurchführung werden zunächst 0,1 ml Standard
oder Probe (Doppelbestimmung) und dann 0,1 ml Antikörper-
Enzym-Konjugat pro Kavität pipettiert. Die Verdünnung
des Konjugats muß in Hinblick auf Kopplungsrate und
Bindungskapazität der Platte optimiert werden.
Die Inkubationszeit beträgt eine Stunde bei 4 Grad C.
Anschließend wird die Mikrotiterplatte dreimal mit dest.
Wasser gewaschen.
Dann wird die Substratlösung zugegeben (s. Beispiel 1).
Nach einer weiteren Inkubationszeit von einer Stunde
bei 37 Grad C im Dunkeln wird die Platte bei 410 nm
gemessen.
Das Ergebnis wird bei der Auswertung in Atrazin-Einheiten
angegeben.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 6.
Um Antikörper gegen Deoxynivalenol an alkalische Phospha
tase zu koppeln, inkubiert man 0,5 mg Antikörper in 1 ml
PBS mit 300 U alkalischer Phosphatase und 0,05 ml
25%igem Glutardialdehyd für 90 Minuten bei Raumtem
peratur.
Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 0,1 ml 1 m L-Lysin
beendet. Die Reinigung des Produkts erfolgt durch drei
tägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C.
Bei der Testdurchführung werden Standardkonzentrationen
im Bereich von 0,1 pg/0,1 ml bis 100 pg/0,1 ml eingesetzt.
Zunächst werden 0,1 ml Standard oder Probe, dann 0,1 ml
Antikörper-Enzym-Konjugat pro Kavität pipettiert.
Die optimale Konjugatkonzentration muß für jede neue
Synthese, bzw. für ein bestimmtes Plattenmaterial er
mittelt werden.
Der Testansatz inkubiert eine Stunde bei 4 Grad C.
Danach wird die Mikrotiterplatte dreimal mit dest. Wasser
gewaschen. Anschließend wird die Substratlösung zugegeben
(s. Beispiel 1).
Die Platte inkubiert nun 90 Minuten bei 37 Grad C im
Dunkeln. Nach dieser Zeit wird der Test bei 410 nm ge
messen.
Durch Matrixeffekte kann es zu einer Verkürzung oder Ver
längerung dieser Inkubationszeit kommen - bei der Messung
soll die Extinktion des niedrigsten Standards zwischen
0,5 und 0,9 liegen.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 7.
Zur Kopplung der Antikörper gegen Ergot-alkaloide
werden 0,5 mg Antikörper mit 300 U alkalischer Phosphatase
und 0,05 ml 25%igem Glutardialdehyd in 1 ml PBS für zwei
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird
die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml 1 m L-Lysin-Lösung
gestoppt. Die Reinigung des Konjugats erfolgt durch drei
tägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C.
Die im Test eingesetzten Standardkonzentrationen liegen
zwischen 0,1 pg/0,1 ml und 100 pg/0,1 ml.
Welcher Vertreter aus der Gruppe der Ergot-alkaloide als
Standard gewählt wird, hat untergeordnete Bedeutung, da
die Erkennungsrate des Antikörpers in jedem Fall über
90% liegt.
Bei der Testdurchführung werden nacheinander 0,1 ml Standard
oder Probe und 0,1 ml Antikörper-Enzym-Konjugat pro Kavität
pipettiert. Die am besten geeignete Verdünnung des Konjugats
muß ermittelt werden (abhängig von Kopplungsrate bei der
Sythese und Plattenmaterial).
Die anschließende Inkubationszeit beträgt eine Stunde bei
4 Grad C.
Danach wäscht man die Platte dreimal mit dest. Wasser und
gibt anschließend die Substratlösung zu (s. Beispiel 1).
Nach einer weiteren Inkubationszeit von 90 Minuten bei
37 Grad C im Dunkeln wird die Platte bei 410 nm gemessen.
Durch Matrixeffekte kann sich diese Inkubationszeit nach oben
oder unten verschieben. Bei der Messung soll jedoch die
Extinktion des niedrigsten Standards zwischen 0,5 und
0,9 liegen.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 8.
Um die Antikörper gegen Nitrosamine an alkalische Phospha
tase zu koppeln, werden 0,5 mg Antikörper in 1 ml PBS mit
300 U alkalischer Phosphatase und 0,1 ml 25%igem Glutardi
aldehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach stoppt man die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml
1 m L-Lysin ab und reinigt das Syntheseprodukt durch eine
dreitägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C.
Als Standard wurde im Test Nitrosodiethanolamin eingesetzt.
Die Erkennungsraten der verschiedenen Nitrosamine liegen
zwischen 70 und 100%.
Als Standards wurden Konzentrationen zwischen 0,1 pg/0,1 ml
und 100 pg/0,1 ml eingesetzt.
Bei der Testdurchführung werden 0,1 ml Standard oder Probe
(Doppelbestimmung) und 0,1 ml Antikörper-Enzym-Konjugat
(in 0,5% Ovalbumin Grade V) pro Kavität pipettiert. Die
optimalen Konzentrationen (Verhältnis fixierter Antikörper-
enzymgebundener Antikörper) muß vorher ermittelt werden.
Die anschließende Inkubationszeit beträgt 45 Minuten bei
4 Grad C. Dann wird die Platte dreimal mit dest. Wasser
gewaschen.
Nach Zugabe der Substratlösung (s. Beispiel 1) inkubiert
man 120 Minuten bei 37 Grad C im Dunkeln.
Danach wird die Platte bei 410 nm gemessen.
Durch Matrixeffekte kann sich diese Inkubationszeit ändern.
Die Platte muß in jedem Fall gemessen werden, wenn die
Extinktion des niedrigsten Standards zwischen 0,5 und 0,9
liegt.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 9.
Für die Kopplung von Antikörpern gegen Dinitroaromaten an
alkalische Phosphatase werden 0,5 mg Antikörper in 1 ml
PBS mit 300 U alkalischer Phosphatase und 0,1 ml 25%igem
Glutardialdehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur in
kubiert. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 0,1 ml
1 m L-Lysin abgestoppt. Die Reinigung des Konjugats erfolgt
durch dreitägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C.
Als Standard wurde im Test Dinitrophenol eingesetzt. Die
Erkennungsraten des Antikörpers liegen bei den einzelnen
Dinitroaromaten zwischen 70 und 100%.
Die eingesetzten Standardkonzentrationen liegen zwischen
0,1 pg/0,1 ml und 100 pg/0,1 ml.
Zunächst werden beim Testablauf 0,1 ml Standard oder Probe
und 0,1 ml Antikörper-Enzym-Konjugat pro Kavität pipettiert.
Die optimalen Konzentrationen von fixiertem Antikörper
und enzymgekoppeltem Antikörper müssen wiederum ermittelt
werden.
Die anschließende Inkubationszeit beträgt eine Stunde bei
4 Grad C. Dann wird die Platte dreimal mit dest. Wasser
gewaschen und die Substratlösung zugegeben (s. Beispiel 1).
Nach einer einstündigen Inkubationszeit bei 37 Grad C im
Dunkeln kann die Platte bei 410 nm gemessen werden.
Die ermittelten Ergebnisse verstehen sich als Dinitro
aromat-Äquivalente.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 10.
Zur Kopplung von Antikörpern gegen Patulin an alkalische
Phosphatase werden 0,5 mg Antikörper in 1 ml PBS mit 300 U
alkalischer Phosphatase und 0,05 ml 25%igem Glutardialdehyd
eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach stoppt
man die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml 1 m L-Lysin-Lösung ab.
Die Reinigung des Konjugats erfolgt durch dreitägige Dialyse
gegen PBS bei 4 Grad C.
Die im Test eingesetzten Standardkonzentrationen liegen
zwischen 0,1 pg/0,1 ml und 100 pg/0,1 ml.
Bei der Testdurchführung werden zunächst 0,1 ml Standard
oder Probe, dann 0,1 ml Antikörper-Enzym-Konjugat
pipettiert. Die optimalen Konzentrationsverhältnisse
werden wie bei den anderen Tests zunächst ermittelt.
Die Inkubationszeit des Testansatzes beträgt eine Stunde
bei 4 Grad C. Danach wird die Platte dreimal mit dest.
Wasser gewaschen und die Substratlösung zugegeben (s. Bei
spiel 1).
Nach einer weiteren Inkubationszeit von einer Stunde bei
37 Grad C wird die Platte bei 410 nm gemessen.
Aufgrund des Matrixeffekts kann sich die Inkubationszeit
verkürzen oder verlängern.
Die Platte ist auf jeden Fall dann zu messen, wenn die
Extinktion des niedrigsten Standards zwischen 0,5 und 0,9
liegt.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 11.
Um die Antikörper gegen β-Lactame an alkalische Phosphatase
zu koppeln, inkubiert man 0,5 mg Antikörper in 1 ml PBS
mit 300 U alkalischer Phosphatase und 0,05 ml 25%igem
Glutardialdehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Die Reaktion wird anschließend durch Zugabe von 0,1 ml
1 m L-Lysin abgestoppt.
Die Reinigung des Syntheseprodukts erfolgt durch drei
tägige Dialyse gegen PBS bei 4 Grad C.
Bei der Testdurchführung werden Standardkonzentrationen
von 1 pg/0,1 ml bis 1 ng/0,1 ml eingesetzt.
Die Erkennungsraten des Antikörpers bei den einzelnen
Penicillinen liegt zwischen 90 und 100%.
Bei der Durchführung des Tests pipettiert man zunächst
0,1 ml Standard oder Probe, dann 0,1 ml Antikörper-Enzym-
Konjugat pro Kavität.
Die optimalen Verhältnisse der Reaktanden werden vorher
ermittelt.
Der Testansatz inkubiert anschließend eine Stunde bei
4 Grad C. Danach wäscht man die Platte dreimal mit dest.
Wasser und gibt die Substratlösung zu (s. Beispiel 1).
Nach einer zweiten Inkubationszeit von 45 Minuten bei
37 Grad C im Dunkeln kann der Test bei 410 nm gemessen
werden.
Aufgrund eventueller Matrixeffekte kann diese Inkubations
zeit differieren. Bei der Messung sollen die Extinktions
werte des niedrigsten Standards jeoch zwischen 0,5 und
0,9 liegen.
Verlauf der Standardkurve: s. Fig. 12.
Die ELISA-Technik ist in der Lebensmittelanalytik noch
ein neues Feld. So gibt es bereits eine Reihe von Tests,
die im Labormaßstab durchgeführt werden, aber nur wenige
Firmen, die derartige Test-kits kommerziell vertreiben.
Einige dieser Tests sind nur als semiquantitativ anzu
sehen.
Um die verbesserte Nachweisgrenze des erfindungsgemäßen
Verfahrens beispielhaft aufzuzeigen, sei dem erfindungs
gemäßen Test ein Kit der Firma Pfeiffer zum quantitativen
Nachweis von Triazinen gegenübergestellt.
Bei der Durchführung dieses Tests pipettiert man zuerst
0,1 ml Standard oder Probe. Anschließend gibt man 0,05 ml
Enzymtracer (Hapten-Enzym-Konjugat) zu. Die Mikrotiter
platte wird durchmischt und dann 1,5 Stunden bei Raum
temperatur inkubiert.
Die glatte wird dann dreimal mit einer Waschlösung gewaschen.
Anschließend gibt man eine Substratlösung zu. Nach 2-4
Stunden Inkubationszeit wird bei 405 nm gemessen.
Die sichere Nachweisgrenze dieses Tests (linearer Bereich)
lag im Versuch bei 0,1 ppb, das entspricht dem gesetz
lichen Grenzwert.
Von der Firma Transia wird ein enzymimmunologischer Test
zum Nachweis von Chloramphenicol vertrieben. Dieser Test
wird jedoch nicht auf einer Mikrotiterplatte, sondern auf
einer Karte durchgeführt, und ist nur als semiquantitativ
anzusehen. Die Nachweisgrenzen liegen je nach Probenart
zwischen 5 und 20 ppb. Der im Bundesgesetzblatt (1988,
S. 303) festgesetzte Grenzwert für Chloramphenicol liegt
bei 1 ppb!
Der Vergleich der Standardkurven von Triazin mit dem er
findungsgemäßen Verfahren und dem Test der Firma Pfeiffer
sei im Folgenden graphisch dargestellt: s. Fig. 13.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet einige wesentliche
wirtschaftliche Vorteile.
Die Synthese der Antikörper-Enzym-Konjugate kann in einem,
einfachen Reaktionsschritt durchgeführt werden. Aufwendigere
und oft auch kostspielige Derivatisierungen, die zum Koppeln
des Haptens an das Enzym notwendig sind, entfallen.
Antikörper sind in der Regel in ausreichender, gleich
bleibender Menge und Qualität vorhanden. Aus einem
Kaninchen können innerhalb sechs Monaten so viele Antikörper
isoliert werden, daß damit 500 000 Tests durchgeführt
werden können.
Diese Antikörper sind, bei -20 Grad C gelagert, praktisch
unbegrenzt haltbar.
Derselbe Antikörper, mit dem die Mikrotiterplatten beschichtet
werden, wird zur Herstellung des Antikörper-Enzym-Konjugats
eingesetzt. Dadurch ist ein Reaktand der Kopplungsreaktion
ohne zusätzlichen Aufwand und Kosten immer verfügbar.
Die alkalische Phosphatase ist jederzeit in größeren
Mengen erhältlich.
Das Antikörper-Enzymkonjugat ist somit mit geringem Aufwand
auch in großen Mengen herstellbar.
Diese effiziente Herstellung ermöglicht es, dem Abnehmer
eine kostengünstige analytische Methode zur Verfügung zu
stellen.
Die verbesserten Nachweisgrenzen des erfindungsgemäßen Ver
fahrens erlauben den Einsatz in Lebensmittelkontrolle und
Qualitätskontrolle der Lebensmittelhersteller (die Nach
weisgrenzen liegen erheblich unter den festgesetzten
Grenzwerten).
Dadurch werden die Kosten für lebensmittelchemische Unter
suchungen deutlich gesenkt.
Die einfache Probenaufarbeitung, die zum Teil sogar entfällt,
gibt auch kleinen Labors, die bisher aufgrund des erheblichen
analytischen Aufwands (auch in der Probenaufarbeitung) nicht
in der Lage waren, Kontrollen durchzuführen, die Möglichkeit,
die notwendigen Proben zu überprüfen.
Für den Verbraucher bedeutet dies nicht nur eine verbesserte
Lebensmittelqualität (mehr Kontrollen bieten mehr Sicherheit
vor belasteten Lebnsmitteln), sondern langfristig auch eine
geringere Preissteigerung, da die Hersteller durch weniger
Analysenkosten ihre Produkte evtl. preisgünstiger anbieten
können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglich es, Testpackungen
mit langfristig reproduzierbarer Qualität und ausreichender
Haltbarkeit herzustellen, so daß auch der Vertrieb in andere
Länder ohne weiteres zu gewährleisten ist.
Claims (19)
1. Verfahren zur quantitativen enzymimmunologischen
Bestimmung von niedermolekularen organischen Substanzen
mittels der ELISA-Methode, dadurch gekennzeichnet, daß
als Reaktionspartner ein enzymgekoppelter Antikörper
verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
als Markierungsenzym alkalische Phosphatase verwendet
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Kopplungsreagenz zwischen Antikörper und Enzym
Glutardialdehyd verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Ochratoxin A ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Aflatoxin M1 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Aflatoxin B1 ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Chloramphenicol ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Zearalenon ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Triazine ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Deoxynivalenol ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Dinitroaromaten ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Ergot-alkaloide ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Nitrosamine ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Penicilline ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Patulin ist.
16. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
Phenylharnstoffe ist.
17. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
chlorierte Aniline ist.
18. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der enzymgekoppelte Antikörper ein Antikörper gegen
chlorierte Phenole ist.
19. Verfahren nach Anspruch 1-18, dadurch gekennzeichnet,
daß zum Ausgleich der Matrixeffekte bei der Testdurch
führung die Standards in einem der Probe entsprechenden
Null-Extrakt (toxinfrei, pestizidfrei, Arzneimittelfrei)
angesetzt werden.
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