DE2738156A1 - Bestimmung von catecholaminen - Google Patents

Bestimmung von catecholaminen

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DE2738156A1
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DE19772738156
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Richard William Avenia
Benjamin Pecherer
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F Hoffmann La Roche AG
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Description

Patentanwälte
Dr. F:;. 7 L:j^rer . .
Dipl.-im ϊ i ^r F. Wsyerl 2 <*. Aug. 1977
8000 hX'nitfssn BO
ah·.-.;- r, Tel.(083)4729« 27 38156
RAN 4093/15
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Bestimmung von Catecholaminen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Catecholaminen vom Epinephrin- und Norepinephrintyp, sowie Antigene und Antikörper zur Durchführung dieses Verfahrens. Das Immunverfahren richtet sich auf die Seitenkette, welche den Catecholaminen vom Epinephrin- und Norepinephrintyp gemeinsam ist und beinhaltet eine Oxydation, welche selektiv eine oder mehrere dieser Verbindungen in eine andere Verbindung, die mit dem Antikörper nicht reagiert, überführt. Durch Messung des Unterschieds zwischen dem Gesamtgehalt an Catecholaminen vom Epinephrin- oder Norepinephrintyp vor und nach jedem der Oxydationsschritte können die Mengen der einzelnen Catecholamine, welche in der Probe ursprünglich vorhanden v/aren, bestimmt werden.
Die Verwendung eines Radioimmunverfahrens zur Bestimmung von Catecholaminen wurde in der US Patentschrift Nr. 3 704 282 beschrieben. Obwohl das beschriebene Verfahren sehr
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2Π/5.4.1977
empfindlich ist, kann der verwendete Antikörper nicht gut zwischen nah verwandten Catecholaminen unterscheiden und man erhält lediglich einen Hinweis über den Gesamtgehalt an Catecholaminen in der Probe. Dieses Verfahren eignet sich somit nicht zur Bestimmung der einzelnen Konzentrationen von spezifischen Catecholaminen vom Epinephrintyp wie Epinephrin, Metanephrin, Synephrin oder Phenylephrin oder vom Norepinephrintyp wie Norepinephrin, Normetanephrin, Octopamin oder Norphenephrin in einer Probe.
Ein verbessertes fluorometrisches Verfahren zur Bestimmung von Catecholaminen wurde von Laverty und Taylor in Analytical Biochemistry ^2, 219 (1969) beschrieben. In diesem Verfahren wurden die in der Probe vorhandenen Catecholamine mit Iod oxidiert und das erhaltene fluoreszierende Indolderivat in einem Fluorometer bestimmt. Mit diesem Verfahren ist es möglich bis zu einem gewissen Grad ein einzelnes Catecholamin in Anwesenheit von anderen ähnlichen Verbindungen zu bestimmen. Dies erfordert eine Oxydation bei verschiedenen pH-Werten, verschiedenen Behandlungen der Endlösung und die Verwendung von verschiedene Wellenlängen - Maxima. Selbst unter diesen Bedingungen können Einzelreaktionen auftreten und es können in Wirklichkeit nur wenige Catecholaminen ohne chemische Trennung vor der Bestimmung, bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von einzelnen Epinephrintyp - Catecholaminen, wie Epinephrin, Metanephrin, Synephrin und Phenylephrin, oder von einzelnen Norepinephrintyp - Catecholaminen wie Norepinephrin, Normetanephrin, Octopamin und Norphenephrin, die als Gemisch in einer Probe vorhanden sind. Insbesondere v/erden gemäss vorliegender Erfindung durch ein Oxydationsverfahren bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturbedingungen eine oder mehrere spezifische Catecholamine von Epinephrin- oder Norepinephrintvp in der Reihenfolge ihrer Fähigkeit zur Oxydation in Verbindungen
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übergeführt, die gegen spezifische Antikörper solcher Catecholamine nicht immunreaktiv sind. Die ursprüngliche Probe und jedes der aus der Oxydation resultierenden Reaktionsprodukte werden - nach Behandlung mit einem Sulfit-Reduktionsmittel - mittels einem für die Epinephrin- oder Norepinephrinseitenkette spezifischen Antikörper einer immunonologischen Bestimmung unterworfen. Da der in diesem Verfahren verwendete Antikörper keine Affinität für die in dem selektiven Oxydationsschritt erhaltenen Produkte besitzt, kann die Konzentration der spezifischen Epinephrin- oder Norepinephrintyp Catecholamine, die umgesetzt wurden, bestimmt werden, indem man die Menge an Catecholaminen, gemessen in einer unter bestimmten Bedingungen oxydierten Probe von der Menge an Catecholaminen, gemessen in einer nicht oxydierten oder unter milderen Bedingungen oxydierten zweiten Probe, subtrahiert.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von einzelnen Catecholaminen vom Epinephrintyp wie Epinephrin, Metanephrin, Synephrin und Phenylephrin oder von einzelnen Catecholaminen vom Norepinephrintyp wie Norepinephrin, Normetanephrin, Octopamin und Norphenephrin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) den Gesamtgehalt an Epinephrin- oder Norepinephrintyp Catecholaminen in der Probe unter Verwendung eines für Epinephrin- oder Norepinephrintyp - Catecholamine spezifischen Antikörpers in einem Immunverfahren bestimmt;
b) eine aliquote Menge der Probe bei dem pH-Wert 7,4 mit Iod behandelt, wobei allfällig vorhandenes Epinephrin oder Norepinephrin selektiv in eine Form übergeführt wird, die mit dem Antikörper nicht reagiert; diese aliquote Menge mit einem Ueberschuss an Sulfitlösung behandelt, um allfällig zurückbleibendes Iod zu reduzieren; den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf den für das Immunverfahren erforderlichen Wert einstellt und anschliessend diese Lösung zur Bestimmung der Konzentration von Epinephrintyp - Catecholaminen entsprechend
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der Gesamtmenge an Metanephrin/ Synephrin und Phenylephrin in der Probe, oder von Norepinephrintyp - Catecholaminen entsprechend der Gesamtmenge an Normetanephrin, Octopamin und Norphenephrin in der Probe, dem Immunverfahren unterwirft;
c) eine zweite aliquote Menge der Probe bei dem pH-Wert 8,6 mit Iod behandelt, wobei allfällig vorhandenes Epinephrin und Metanephrin oder Norepinephrin und Normetanephrin selektiv in Formen übergeführt wird, die mit dem Antikörper nicht reagieren; diese aliquote Menge mit einem Ueberschuss an Sulfitlösung behandelt; den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf den für das Immunverfahren geeigneten Wert einstellt und anschliessend diese Lösung zur Bestimmung der Konzentration von Catecholaminen des Epinephrintyps entsprechend der Gesamtmenge an Synephrin und Phenylephrin in der Probe oder von Catecholaminen des Norepinephrintyps entsprechend der Gesamtmenge an Octopamin und Norphenephrin in der Probe dem Immunverfahren unterwirft;
d) eine dritte aliquote Menge der Probe bei dem pH Wert 9,2 mit Iod behandelt, wobei allfällige vorhandenes Epinephrin, Metanephrin und Synephrin oder Norepinephrin, Normetanephrin und Octopamin selektiv in Formen übergeführt wird, die mit dem Antikörper nicht reagieren; diese aliquote Menge mit einem Ueberschuss an Sulfitlösung behandelt,- den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf den für das Immunverfahren geeigneten Wert einstellt und anschliessend diese Lösung zur Bestimmung von Catecholaminen des Epinephrintyps entsprechend der Gesamtmenge an Phenylephrin oder an Norepinephrin - Catecholaminen entsprechend der Gesamtmenge an Norphenephrin in der Probe dem Immunverfahren unterwirft;
wobei die Konzentration von Epinephrin oder Norepinephrin durch Subtrahieren der in Schritt b) gefundenen Konzentration von der in Schritt a) gefundenen Konzentration erhalten wird; die Konzentration von Metanephrin oder Normetanephrin durch Subtrahieren der in Schritt c) gefundenen Konzentration von
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der in Schritt b) gefundenen Konzentration erhalten wird; und die Konzentration von Synephrin oder Octopamin durch Subtrahieren der in Schritt d) gefundenen Konzentration von der in Schritt c) gefundenen Konzentration erhalten wird.
Der in dem Immunverfahren verwendete Antikörper kann auf bekannte Weise erhalten werden. So können zur Herstellung eines Antigens z.B. haptenische Verbindungen der allgemeinen Formel
worin R, Wasserstoff oder Hydroxy; R2 Wasserstoff oder nieder Alkyl; R'2 Wasserstoff oder eine übliche Schutzgruppe für Amine; R Wasserstoff, Hydroxy oder nieder Alkoxy; und η die ganze Zahl 1, 2 oder 3 bedeuten,
verwendet werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders geeignete haptenische Verbindungen sind Derivate von Epinephrin für die Epinephrintyp - Catecholamine und von Octopamin für die Norepinephrintyp - Catecholamine.
Um eine Selbstkondensation während den zur Herstellung der erforderlichen Antigenen notwendigen Umwandlungen zu vermeiden, wird die t.-Butoxycarbonylgruppe als Schutzgruppe für die Verbindungen der Formel I verwendet. Die t-Butoxycarbonylgruppe kann leicht abgespalten werden, wobei ein
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Antigen, worin R1 Wasserstoff ist, erhalten wird.
Zur Herstellung der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung notwendigen Antigene wird das Hapten der Formel I über die Carboxylgruppe kovalent an ein übliches immunogenes Trägermaterial gebunden. Der hier verwendete Ausdruck "immunogenes Trägermaterial" umfasst solche Materialien, die bei ihrer Injizierung in Wirtstiere selbständig eine immunogene Reaktion im Wirtstier hervorrufen und die mittels einer kovalenten Bindung an die beschriebenen Haptene gekuppelt werden können. Geeignete Trägermaterialien sind z.B. Proteine; natürliche oder synthetische polymere Stoffe, wie Polypeptide, z.B. Polylysin und Copolymere von Aminosäuren; Polysaccharide; und dergleichen. Bevorzugte Trägermaterialien sind Proteine und Polypeptide, wobei Proteine besonders bevorzugt sind.
Die Art des zur Herstellung eines bevorzugten Antigens verwendeten Proteins spielt keine besondere Rolle. Beispiele für bevorzugte Proteine sind Säugetier-Serumproteine, wie menschliches y-Globulin, menschliches Serumalbumin, Rinderserumalbumin, methyliertes Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin oder Rinder-y-Globulin. Es liegt im Vermögen des Fachmannes v/eitere geeignete Proteine zu verwenden. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, werden im allgemeinen bevorzugt solche Proteine verwendet, die für das mit dem Antigen zu behandelnde Wirtstier artfremd sind.
Die kovalente Bindung eines Haptens an ein immunogenes Trägermaterial kann in der für die Herstellung von Amidbindungen üblichen Art erfolgen. Um sicher zu stellen, dass die Kupplung unter den mildest möglichen Bedingungen durchgeführt v/ird, und somit das Risiko einer Beschädigung des Trägermaterials minimal ist, ist es jedoch wünschenswert, das Hapten vor der Kupplung in eine isolierbare aktivierte Form zu überführen. Eine geeignete isolierbare aktivierte Form ist der N-Hydroxysuccinimidester der Formel II
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R'
worin R-.
-., R2, Ro' R3
Bedeutung besitzen.
Andere geeignete isolierbare aktivierte Derivate umfassen p-Nitrophenylester; Acylimidazole und dergleichen. Es können auch Verfahren benützt werden, in welchen es nicht notwendig ist, die aktivierten Zwischenprodukte zu isolieren. Dies kann z.B.durch Gebrauch des Mischanhydrid-Verfahrens oder durch Verwendung von EEDQ (N-Aethoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin) als Kupplungsmittel erreicht werden.
Die Kupplung des Haptens - als freie Säure der Formel I oder vorzugseise als aktiviertes Derivat der Formel II - an ein inununogenes Trägermaterial kann in der für die Herstellung von Araidbindungen üblichen Art erfolgen. So können z.B. in einer Ausführungsform das immunogene Trägermaterial und das Kupplungsmittel in einem geeigneten inerten Lösungsmittel gelöst und anschliessend das gewünschte Hapten der Formel I zugesetzt werden. Die Reaktion wird bei einer Temperatur zwischen ungefähr 0°C und ungefähr 500C durchgeführt, obwohl je nach Reagenzien auch geringere oder höhere Temperaturen verv/endet werden können.
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Das bei der vorgenannten Reaktion verwendete Kupplungsmittel wird aus den üblicherweise in der organischen Chemie zur Bildung von Amidbindungen verwendeten Kupplungsmitteln ausgewählt. Eine besonders geeignete Gruppe von Kupplungsmitteln umfasst die Carbodiimide, insbesonders Dicyclohexylcarbodiimid oder l-Aethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid. Das molare Verhältnis von Hapten und Trägermaterial hängt selbstverständlich von der Art des für die Reaktion ausgewählten Haptens und Trägermaterials ab.
Die Kupplungsreaktion kann unter üblichen Bedingungen durchgeführt werden. Bei Verwendung von Carbodiimiden als Kupplungsmittel ist es wünschenswert, die Reaktion in einem leicht sauren Reaktionsmedium, d.h. in einem Medium mit einem pH-Wert zwischen ungefähr 3 bis 6,5,vorzugsweise zwischen 4 bis 6,5,durchzuführen. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird der Ueberschuss an Haptenmolekülen durch Dialyse entfernt.
Wie bereits erwähnt, wird in einer bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung der erfindungsgemässen Antigene erst ein aktiviertes Derivat, d.h. eine Verbindung der Formel II, hergestellt und isoliert und anschliessend diese Verbindung mit dem Trägermaterial zur Reaktion gebracht. Solche aktivierten Derivate werden mit Vorteil erhalten, indem man eine Verbindung der Formel I mit dem gewünschten Aktivierungsmittel wie beispielsweise N-Hydroxysuccinimid und einem Kupplungsmittel, wie. z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, in einem inerten Lösungsmittel umsetzt. Die Reaktion wird üblicherweise bei niedrigen Temperaturen (0-5°C) während 16 bis 60 Stunden fortgesetzt. Das aktivierte Derivat wird dann nach Filtration des Nebenproduktes Dicyclohexylharnstoff und Abdampfen des Lösungsmittels isoliert.
Das erhaltene Hapten kann dann kovalent an ein
immunogenes Trägermaterial gebunden werden, indem das aktivierte Derivat und das gewählte Trägermaterial in Kontakt gebracht
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werden. Besteht z.B. das aktivierte Hapten aus einem N-Hydroxysuccinimidester und das iiranunogene Trägermaterial aus Rinderserumalbumin, so wird das aktivierte Derivat in einem wasserlöslichen Lösungsmittel gelöst und zu einer wässerigen Lösung des Trägermaterials, die eine Base wie Natriumbicarbonat enthält, gegeben.
In einer weiteren Ausführungsform zur Kupplung eines Proteins als immunogenes Trägermaterial an ein Hapten der Formel I wird die Carboxylgruppe des Haptens ohne Isolierung eines Zwischenproduktes aktiviert und das aktivierte Hapten mit dem immunogenen Trägermaterial in Kontakt gebracht. Als Beispiel für ein derartiges Verfahren gilt das durch Umsetzung mit Chlorameisensäureisobutylester erhaltene Mischanhydrid. Das Hapten wird in einem wasserfreien, wasserlöslichen organischen Lösungsmittel wie z.B. Dioxan gelöst und die Lösung mit einer äquimolaren Menge von Triäthylamin neutralisiert. Nach Rühren bei Raumtemperatur wird die Temperatur der Mischung auf zwischen 0° bis 80C reduziert. Anschliessend wird ein leichter (10%) molarer Ueberschuss an Ameisensäureisobutylester zugegeben und das Rühren fortgesetzt.
In der Zwischenzeit wird das Protein, z.B. Rinderserumalbumin, in Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 9,0 eingestellt. Die Menge an verwendetem Trägermaterial entspricht der molaren Menge an Hapten geteilt durch die theoretische Anzahl von reaktiven Gruppen am Träger. Der Lösung vom Träger wird ein organisches Lösungsmittel zugesetzt und die Temperatur der Mischung wird auf zwischen O° bis 8° reduziert. Schliesslich wird diese Lösung dem aktivierten Hapten zugegeben und die Kupplungsreaktion während einer Zeitdauer, welche zwischen 3O Minuten und einer ganzen Nacht liegt, fortgesetzt. Das endgültige Verhältnis von organischem Lösungmittel zu Wasser ist 1:1.
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-'JOr-
Die Mischung wird neutralisiert, das wässerige-organische Lösungsmittel entfernt und eine wässerige Lösung hergestellt. Nach Dialyse und Lyophilisation wird die Schutzgruppe für Amine entfernt.
Nach der Kupplung einer Verbindung der Formel I oder der Formel II an ein Trägermaterial ist es notwendig,die Schutzgruppe (R1 in den Formeln I und II) abzuspalten, um die freie primäre oder sekundäre Aminfunktion wieder herzustellen. Im Falle einer t-Butoxycarbonylgruppe als Schutzgruppe erfolgt dies vorzugsweise durch Behandlung der geschützten Verbindung mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan bei Raumtemperatur. Das Mengenverhältnis von Trifluoressigsäure zu Dichlormethan und die Zeitdauer der Reaktion können in Abhängigkeit des spezifischen Falles beliebig variiert werden. Im allgemeinen hat sich herausgestellt, dass mit einem Volumenverhältnis von Dichlormethan zu Trifluoressigsäure von 1 bis 3 zu 1 und Reaktionzeiten zwischen 30 und 60 Minuten gute Resultate erhalten werden.
Die Antigene der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Bildung von gegenüber Catecholaminen vom Epinephrin- oder Norepinephrintyp spezifischen Antikörpern ii Wirtstieren zu induzieren, indem man das Antigen, vorzugsweise unter Zusatz eines Hilfsstoffes, diesen Wirtstieren injiziert. Erhöhte Antikörpertiter können durch v/iederholtes Injizieren über einen gewissen Zeitraum erreicht werden. Geeignete Wirtstiere sind z.B. Säugetiere, wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Rinder oder Schafe. Die erhaltenen Antisera enthalten Antikörper, welche/in Abhängigkeit vom Hapten, das zur Herstellung des Antigens mittels injizieren in Wirtstiere verwendet v/urde, selektiv mit Catecholaminen vom Epinephrin- oder Norepinephrintyp unter Komplexbildung reagieren.
Das Immunverfahren, welches zur Bestimmung von
Catecholaminen von Epinephrin- oder Norepinephrintyp in jedem Schritt des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet wird, kann
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eines der bekannten Immunverfahren sein. Ein für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugtes Imxnunverfahren ist ein Radioimmunverfahren, wie z.B. dasjenige; welches aus den US Patentschriften Nr. 3 704 282 und 3 709 bekannt ist, worin der oben beschriebene für Catecholamine vom Epinephrin- oder Norepinephrxntyp spezifische Antikörper verwendet wird. Es können jedoch auch andere Iinmunverfahren wie z.B. das in der US Patentschrift Nr. 3 817 837 beschriebene enzymatische Verfahren oder das in der US Patentschrift Nr. 3 690 834 beschriebene Verfahren unter Verwendung von mittels Elektronenspinresonanz - markierten Verbindungen benützt werden.
Die nachstehende Tabelle 1 dient zur Illustration der spezifischen Aktivität eines für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung geeigneten Antikörpers für Catecholamine vom Epinephrintyp.
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Antikörper - Aktivität
Rl R2 R
I		 4 ? R5 R6 OH
I		 5O% Hemmung
Verbindung H OH "1^ H
Ri		 — C 1
I
R5		 R CH3 C—C—OH
1
0		 von
125 *
Ab-I dl-MET
Komplex
H OH H CH3 -j- CH2- CH2NH2
N		 ng
H OH R3 R4 H CH3 H
1-Epinephrin H OH OH OH H CH3 0.250"
dl-Metanephrin OH H OCH3 CH H CH3 O.O5O
dl-Synephrin H OH H OH H H O.IOO
Epinin H OH OH H H H Ο.35Ο
1-Phenylephrin
(Neosynephrin)		 H H H OH CH3 H O.O6O
1-Norepinephrin H H OH OH CH3 CH3 >5OO
Dopamiη H H OH H CH3 CH3 >5OO
Anphetamin H OH H H H C(CH3J2H >5OO
Me thamphe tami η H OH H H COOH H >5OO
Ephedrin H OH >5OO
Isoprotarenol OH OH XX >5OO
DOPA OH R >5OO
VMA
(vanillylmandel-
säure)		 CH3O
HO		 >5OO
Serotonin Cc >5OO
\
NH
*Ab-I125 dl-MET
Antikörperkomplex mit I dl-Metanenhrin
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125
markiertes
Das erfindungsgemässe Verfahren kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
a) eine aliquote Menge der Probe wird einem Immunverfahren unterworfen, um den Gesamtgehalt an Epinephrintyp - Catecholaminen (Epinephrin + Metanephrin + Synephrin + Phenylephrin) zu bestimmen;
b) der pH-Wert einer weiteren aliquoten Menge an Probe wird mit Phosphatpuffer auf den Wert 7,4 eingestellt und diese Probe wird mit O,1N Iod (in wässriger Lösung, in Form eines Komplexes mit Natriumiodid) bei 4°C während 5 Minuten behandelt, wobei Epinephrin selektiv in die Adrenochromform übergeführt wird; das Reaktionsgemisch wird zur Reduktion des zurückbleibenden Iods mit einem Ueberschuss an wässrigem Natriumsulfit (in Form einer lO%igen Lösung) behandelt; falls notwendig wird der pH-Wert mittels einem Puffer so eingestellt, dass er sich' innerhalb des für das Immunverfahren notwendigen pH-Bereiches befindet; das Immunverfahren wird durchgeführt und der Gehalt an den zurückbleibenden Epinephrintyp - Catecholaminen (Metanephrin + Synephrin + Phenylephrin) bestimmt;
c) der pH-Wert einer weiteren aliquoten Menge an Probe wird mit Phosphatpuffer auf 8,6 eingestellt und diese Probe wird wie bereits erwähnt mit Iod bei 4 C während 5 Minuten behandelt, wobei sowohl Epinephrin als Metanephrin selektiv in die Adrenochromf orm übergeführt v/erden; das Reaktionsgemisch wird wie bereits erwähnt mit einem Ueberschuss an einer wässrigen Sulfitlösung behandelt; der pH v/ird auf den für das Immunverfahren geeigneten Wert (pH 7,4 mit dem oben beschriebenen Antikörper) eingestellt; das Immunverfahren wird durchgeführt und der Gehalt an zurückbleibenden Epinephrintyp - Catecholaminen (Synephrin + Phenylephrin) bestimmt;
d) der pH-Wert einer weiteren aliquoten Menge an Probe wird mit einem Carbonat- Bicarbonat Puffer auf 9,2 eingestellt und diese Probe wird v/ie bereits erwähnt mit Iod bei Raumtempe-
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ratur während 5 Minuten behandelt, v/obei Epinephrin, Metanephrin und Synephrin selektiv in die cyclische Form übergeführt werden; das Reaktionsgemisch wird wie bereits erwähnt mit einem Ueberschuss an einer wässrigen Sulfitlösung behandelt; der pH wird auf den für das Immunverfahren geeigneten Wert eingestellt; das Immunverfahren wird durchgeführt und der Gehalt an zurückbleibenden Epinephrintyp - Catecholaminen (Phenylephrin) bestimmt.
Der Phenylephringehalt in der Probe wird somit direkt durch die Ergebnisse des in Schritt d) durchgeführten Immunverfahrens bestimmt. Der Epinephringehalt wird erhalten indem man den in Schritt b) gefundenen Gehalt an Epinephrintyp Catecholaminen von dem in Schritt a) in einem direkten Immunverfahren gefundenen Gesamtgehalt an'Epinephrintyp - Catecholaminen subtrahiert. Auf ähnlicher Weise, wird der Metanenhringehalt durch Substrahieron der in Schritt c) gefundenen Konzentration von derjenigen,die in Schritt b) gefunden wurde, bestimmt. Schliesslich wird der Synephringehalt durch Subtrahieren der in Schritt d) gefundenen Konzentration von derjenigen,die in Schritt c) gefunden wurde, erhalten.
Das bereits beschriebene Immunverfahren eignet sich auch zur Bestimmung von einzelnen Norepinephrintyp - Catecholaminen, wenn ein für die Seitenkette von solchen Catecholaminen spezifischer Antikörper verwendet wird. In diesem Fall wird in dem bereits beschriebenen Schritt a) in einer aliquoten Menge einer Probe der Gesamtgehalt an Norepinephrintyp Catecholaminen (Norepinephrin + Normetanephrin + Octopamin + Norphenephrin) bestimmt. Schritt b) wird auf der gleichen Art und unter den gleichen Bedingungen durchgeführt und ergibt den Gehalt an den zurückbleibenden Norepinephrintyp - Catecholaminen (Normetanephrin + Octopamin + Norphenephrin). Schritt c) wird ähnlich v/ie oben durchgeführt und ergibt die Konzentration an Octopamin + Norphenephrin. Weiter ergibt der auf identische Art durchgeführte Schritt d) die Konzentration an Norphenephrin. Schliesslich werden die Konzentrationen
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der einzelnen Norepinephrintyp - Catecholaminen wie für die entsprechenden Fälle in der Reihe der Epinephrintyp Catecholami,ne berechnet, d.h. der Norphenephringehalt wird aus Schritt d) bestimmt, der Norepinephringehalt wird durch Subtrahieren der in Schritt b) gefundenen Konzentration von der in Schritt a) gefundenen Konzentration erhalten, der Normetanephringehalt wird durch Subtrahieren der in Schritt c) gefundenen Konzentration von der in Schritt b) gefundenen Konzentration erhalten und schliesslich wird der Octopamingehalt durch Subtrahieren der in Schritt d) gefundenen Konzentration von der in Schritt c) gefundenen Konzentration erhalten.
Das erfindungsgemäss Verfahren ermöglicht die Bestimmung des Gehaltes an einzelnen Epinephrin- oder Norepinephrintyp Catecholaminen in verschiedenen Proben. Solche Proben umfassen biologische Flüssigkeiten wie Urin, Blut, Gewebeextrakte und dergleichen. In nuinchen Fällen ist es notwendig,die Probe vorzubehandeln,damit sie den spezifischen Anforderungen des verwendeten Immunverfahrens entspricht. So kann es z.B. erforderlich sein, die Probe vor Durchführung des Tests auf übliche Weise zu enteiweissen.
Der Ausdruck "nieder Alkyl" umschreibt einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoff-Substituenten mit 1 bis 7, vorzugsv/eise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methyl, Aethyl, n-Propyl, η-Butyl usw. Der Ausdruck "nieder Alkoxy" umfasst nieder-Alkyloxy Reste, worin nieder Alkyl die obige Bedeutung besitzt. Ein besonders bevorzugtes nieder Alkyl ist Methyl und ein besonders bevorzugtes nieder Alkoxy ist Methoxy.
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Bevorzugte erfindungsgemäße Antigene bestehen im wesentlichen aus rac. 4-(2-N-Methylamino-i-hydroxyäthyl)phenoxyessigsäure oder rac. 4-(2-Amino-1-hydroxyäthyl)phenoxyessigsäure, jeweils kovalent gebunden an ein immunogenes Trägermaterial, welches vorzugsweise Rinderserumalbumin ist- Die Erfindung umfaßt auch die von den Antigenen erzeugten Antikörper und insbesondere die für Catecholamine des Epinephrintyps bzw. des Norepinephrintyps spezifischen Antikörper, die von den vorgenannten bevorzugten Antigenen erzeugt werden, sowie ihre Verwendung zur Bestimmung von Catecholaminen des Epinephrintyps bzw. des Norepinephrintyps.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Antigens bestehen in der Umsetzung von 4-/*2-(N-t-Butoxycarbony1-N-methylamino)-1-hydroxyäthyl7-phenoxyessigsäure oder von 4-(2-t-Butoxycarbonamido-1-hydroxyäthyl)phenoxyessigsäure mit einem immunogenen Trägermaterial, vorzugsweise Rinderserumalbumin, in Anwesenheit eines Kupplungsmittels und Entfernung der t-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele illustriert.
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- ♦?—
Beispiel 1
41,8 g (0,28 Mol) von rac. Synephrin und 53,6 g (0,375 Mol) von t-Butoxycarbonyloxid v/erden in 1 Liter 50%igem wässrigen Dioxan in Anwesenheit von 4 g Magnesiumoxid während 22 Stunden bei 4O-45°C zusammengerührt. Das Dioxan wird aus der blassen bernsteinfarbigen Lösung destilliert und dem Rückstand werden 500 ml Wasser zugesetzt. Nach Abkühlen werden 58,7 g eines Feststoffes vom Schmelzpunkt 141,5-143,5°C (nach Trocknen bei 100° v/ährend 3 Stunden) erhalten. Umkristallisation einer Probe dieses Materials ergibt den t-Butylester von rac. N-(4-a-Dihydroxyphenethyl)-N-methyl-" carbaminsäure in Form von weissen Kristallen vom Schmelzpunkt 141-141,5°C.
Beispiel 2
26,7 g t-IJutylester von rac. N-(4a-Dihydroxyphenethyl)-N-methyl-carbaminsäure (0,1 Mol) werden in 250 ml Hexamethylphosphorsäure-triamid gelöst und die Mischung gerührt. Unter Stickstoff werden 2,4 g Natriumhydrid (0,1 Mol) in kleinen Portionen zugegeben. Die Mischung wird gerührt bis die Wasserstoffentwicklung aufhört (ungefähr 3 Stunden). Dieser Lösung v/erden unter Rühren in einer Portion 17,0 g Aethylbromacetat (0,1 Mol) in 25 ml Benzol zugesetzt. Die Aussentemperatur steigt von 7° auf 19°C. Nach 10 Minuten ist die Mischung praktisch neutralisiert. Anschliessend werden der Mischung Wasser und Eis (5OO ml) zugegeben und das leicht trübe Gemisch wird fünf rial mit Anteile von je 150 ml Aether extrahiert. Die kombinierten Aetherextrakte werden einige Male mit kleinen Mengen an Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Trocknungsmittels wird das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer abdestilliert. Der Rückstand, 39 g eines viskosen Syrups des Aethylester der rac. 4- [ 2-Ii-t-Butoxycarbonyl-N-methylamino) -1-hydroxyäthyl] -phenoxvessigsäure,kann nicht kritallisiert werden und wird wie nachstehend beschrieben zur freien Säure hydrolisiert.
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Beispiel 3
Der in Beispiel 2 erhaltene Aethylester wird hydrolysiert, indem man das Material bei einer Temperatur von 8O-85°C in Wasser suspendiert und eine lO%ige Natriumhydroxidlösung zugibt bis ein gleichbleibender pH-Wert von 9-10 erhalten wird. Nach Ansäuern mit 20%iger Zitronensäure auf den pH-Wert 3, wird die Mischung mit mehreren Anteilen an Chloroform extrahiert. Die kombinierten Chloroformextrakte v/erden getrocknet, das Trocknungsmittel durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer abdestilliert.
Man erhält einen Syrup von Rac. 4-[(2-N-t-Butoxycarbonyl-N-methylamino) -1-hydroxyäthyl] phenoxyessigsäure, welcher nicht kristallisiert werden kann. Aus diesem Grund stellt man das kristalline S-Benzylthiuroniumsalz auf folgende Weise her: Eine bestimmte Menge der syrupförmigen Säure wird mit einer Menge an NatrLumhvdroxid behandelt ,die ausreicht,um das Natriumsalz :-.u bilden (pH 7,5-8,0). Dieser Lösung wird eine konzentrierte Lösung von S-Benzylthiuroniumchlorid zugegeben, wonach sich ein Niederschlag bildet. Der Feststoff wird abfiltriert, in it kaltem Wasser gewaschen und dann aus Wasser umkristallisiert. Man erhält das S-Benzylthiuroniumsalz der genannten Säurt; in Form von weissen Kristallen vom Schmelzpunkt 163-16 5°C.
Beispiel 4
3,25 g (0,01 Mol) der in Beispiel 3 beschriebenen syrupförmigen Säure werden zusammen mit 1,15 g N-Hydroxysuccinimid (0,01 Mol) in 40 ml Dimethoxyäthan gelöst. Dieser Lösung werden 2,06 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,01 Mol) zugegeben, wobei eine Erhöhung der Temperatur der Lösung bemerkbar wird. Die Mischung v/ird während 21 Stunden bei 5°C aufbewahrt. Der Dicyclohexylharnstoff, welcher sich abgetrennt hat, wird durch Filtration entfernt. Der Filterkuchen wird rnxt ein weniq Dimethoxyäthan gewaschen und die kombinierton Filtrate in einem Rot;it ionsvordainpEor c; Lru/cdanipf t. Es
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- Yf-
verbleiben 3,7 g eines trüben Syrups der in 75 ml Toluol gelöst v/ird. Der ungelöste Dicyclohexylharnstof f, welcher sich abgetrennt hat, wird durch Filtration entfernt. Die Destillation des Lösungsmittels ergibt einen Syrup, der in 50 ml 2-Propanol gelöst wird. 60-90° Petroläther v/ird bis zur Trübung zugegeben und die Lösung bei 5°C während 5 Tagen gelagert. Man erhält 2,5 g N-Hydroxysuccinimidester von rac. 4-[(2-N-t-Butoxycarbonyl-N-methylamino)-1-hydroxyäthyl] phenoxyessigsäure in Form von Kristallen vom Schmelzpunkt 106-108,5°C.
Beispiel 5
47,5 g rac. Octopaminhydrochlorid (0,25 Mol) und 53,6 g Butoxycarbonylazid (0,375 Mol) werden in einer Mischung von einem Liter 50oigem wässrigen Dioxan und 12 g Magnesiumoxid (0,30 Mol) boi 37-45°C während 21 Stunden unter Stickstoff zusammengerührt:. Das Dioxan wird in einem Rotationsverdampfer abdestilliert. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 6 mittels Essigsäure, v/ird die Lösung 5mal mit 200 ml Anteilen an Chloroform extrahiert. Die kombinierten Chloroformextrakte worden mit ein wenig Wasser gewaschen, die Lösung getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert, wobei 59,0 g eines kritalli.ner, Feststoffes vom Schmelzpunkt 146-148°C erhalten v/erden. Nach Umkristallisation aus einer Mischung von Aethylacetat und 60-90° Petroläther,erhält man den t-Butylester von rac. N- [ (4--a-Dihydroxyphenetyl) -carbaminsäure (Schmelzpunkt 147-148°C).
Beispiel 6
25,3 g t-Butylester von rac. N-(4-a-Dihydroxyphenetyl)-carbaminsäure (0,1 Mol) werden in 350 ml Hexamethylphosnhorsäuretriamid gelöst. Der cjerührten Lösung v/erden unter Stickstoff 2,4 g Natriumhvdrid (0,1 Mol) in kleinen Portionen zugegeben. Die Mischung wird gerührt bis die Wasserstoffentwicklung aufhört. Dieser gerührten Lösung werden in einer Portion
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17,0 g Aethylbromacetat (0,1 Mol) in 25 ml Benzol zugesetzt. Die Aussentemperatur steigt von 7 auf 19°C. Nach 10 Minuten ist die Mischung praktisch neutralisiert. Anschliessend werden der Mischung Wasser und Eis (500 ml) zugegeben und das leicht trübe Gemisch v/ird 5mal mit Anteilen von 50 ml Aether extrahiert. Die kombinierten Aetherextrakte werden einige Male mit kleinen Mengen an V/asser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Trocknungsmittels wird das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer abdestilliert. Der Rückstand,31,7 g eines bernsteinfarbigen Syrups,wird in heissem Kohlenstofftetrachlorid gelöst und nach Abkühlen wird der Aethylester von rac. 4-[(2-N-tbutoxycarbonylamido)-1-hydroxyäthyl]phenoxyessigsäure in Form von Kristallen erhalten. Diese Kristalle schmelzen bei 56-59°C. Nach Trocknen im Vakuum bei 45 C geben die Kristalle in ein farbloses Glas über.
Beispiel 7
Das in Beispiel 6 erhaltene Produkt wird hydrolisiert, indem man es bei einer Temperatur von 80-85°C in Wasser suspendiert und eine lO%ige Natriumhydrcxidlösung zugibt bis ein gleichbleibender nii-Wert von 9-10 erhalten wird. Nach Ansäuern mit 20%iger Zitronensäure auf den pH-Wert 3, wird die Mischung mit mehreren Anteilen an Chloroform extrahiert. Die kombinierten Chloroformextrakte werden getrocknet, das Trocknungsmittel durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer abdestilliert. Man erhält einen blassen bernsteinfarbigen Syrup. Dieser Syrup wird in heissem 60-90° Petroläther gelöst. Nach Abkühlen bilden sich 22,55 g farblose Kristalle, die in 100 ml Acetonitril gelöst und mit Holzkohle behandelt werden. Nach Filtration werden aus dem abgekühlten FiItrat 8,9 g eines Feststoffes vom Schmelzpunkt 18-1O1°C erhalten. Nach einer weiteren Umkristallisation aus Acetonitril unter Verwendung von Entfärbungskohle werden 6,65 g an leicht grauen Kristallen von rac. 4-(2-t-Butoxycarbonamido-1-hydroxyäthyl)phenoxyessigsäure (Schmelzpunkt:
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>-lll°C) erhalten.
Beispiel 8
Der N-Hydroxysuccinimidester von rac. 4-[(2-N-t-Butoxy-•bonyl-N-methylamino)-1-hydroxyäthyl]phenoxyessigsäure wird i folgt an menschliches Serumalbumin (BSA) gekuppelt.
300 mg (0,00447 mMol) von menschlichem Serumalbumin IA) in 12 ml Wasser werden mit 6 ml einer 0,5 M Lösung von iriumbicarbonat und anschliessend mit 6 ml Dimethoxyäthan :haltend 60 mg (0,075 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters ι rac. 4- [ (2-N-t-Butoxycarbonyl-N-methylamino)-1-hydroxyiyl]phenoxyessigsäure behandelt. Die Mischung wird während Itunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend werden ml Aethanol zugegeben und die Lösung bis zu einem geringen .umen abgedampft. Der Rückstand wird dann gegen 200 Volumen ;ser während 3 Tagen und unter Durchführung von 2 Wechseln ) Tag dialysiert. Schliesslich wird das geschützte Antigen jphilisiert. Das Verfahren wird unter den gleichen Bedinigen mit jedoch 162 mg des aktivierten Esters wiederholt.
Die Abspaltung der t-Butoxycarbonylschutzgruppe erfolgt •ch Rühren von 50 mg des geschützten Antigens mit 50%iger .fluoressigsäure in 50 ml Methylenchlorid während 1 Stunde . Raumtemperatur. Anschliessend wird die Trifluoressigsäure fedampft. Der Rückstand
d in Wasser gewas-chen, wonach abgedampft wird. Der erhaltene .-kstand wird in V/asser gelöst und zur Herstellung des wünschten Antigens lyophilisiert.
Das in beiden Vorgängen erhaltene Antigen v/ird durch jteinbestimmung und Differenzbestimmung mittels Spectroscopic tlysiert. Das im ersten Ansatz erhaltene Antigen enthält e an Hapten pro Mol BSA (17%ige Substitution bezogen auf • 85 theoretisch vorhandenen Aminogruppen). Das im zweiten atz erhaltene Antigen enthält dagegen 25 Mole an Hapten pro
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— -β* —
Mol BSA (29%ige Substitution). Dieses Antigen wird verwendet um Antikörper herzustellen, die für Epinephrin, Metanephrin, Synephrin und Phenylephrin spezifisch sind.
Beispiel 9
Rac. 4-(2-t-Butoxycarbonamido-l-hydroxyäthyl)phenoxyessigsäure wird unter Verwendung des Mischanhydridverfahrens wie folgt an BSA gekuppelt:
39,46 mg (0,1269 mMol) des geschützten Haptens werden 1 ml wasserfreiem Dioxan gegeben. Anschliessend v/erden 0,1269 mMol Triäthanolamin in 0,5 ml Dioxan zugesetzt und die Mischung bei Raumtemperatur während 10 Minuten gerührt. Nach Abkühlen auf 8°C werden 0,1395 mMol Ameisensäureisobutylester in 0,5 ml Dioxan zugegeben und die Lösung während 20 Minuten gerührt.
In einem separaten Eehälter v/erden 100 mg BSA in 10 ml Wasser gelöst, der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 9 eingestellt und 8 ml Dioxan langsam unter Rühren zugesetzt. Die Lösung wird auf 8 C abgekühlt und die obige Lösung des geschützten Haptens zugegeben und während 30 Minuten bei 8°C und anschliessend über Nacht bei 4°C und pH 9 gerührt.
Die Lösung v/ird dann mit Säure neutralisiert, das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in 5 ml Wasser (zum besseren Auflösen v/ird NaOH zugegeben) gelöst. 5 ml dieser Lösung werden nacheinander gegen 6000 ml 0,5N NaOH, 6000 ml O,1N NaOH und 6000 ml Wasser (2mal) dialysiert. Die Lösung des Amin- geschützten Antigens wird entfernt und lvophilisiert. Die t-Butoxycarbonylgruppe v/ird mit Trifluoressigsäure,wie in Beispiel 1 beschrieben,abgespalten.
Die Analyse des erhaltenen Antigens durch Proteinbestimmung und Differenzbestimmung mittels UV-Spectroscopie zeigt, dass 64 Mole Hapten pro Mol BSA vorhanden sind. Das
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auf diese Weise erhaltene Antigen dient nach Injektion in ein geeignetes Gasttier zur Herstellung von Antikörpern, die für Norepinephrin, Normetanephrin, Octopamin und Norphenephrin spezifisch sind.
Beispiel 10 Immunisierung und Blutentnahme
Zur Immunisierung von Hasen, werden je 10 mg der gemäss Beispiel 8 und Beispiel 9 erhaltenen Produkte in 1 ml einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) gelöst und mit 1 ml von "vollständigem Freund's-Hilfsstoff" emulgiert. Eine zweite Injektion erfolgt drei Wochen später und besteht aus 1,5 g Immunogen, emulgiert in 1 ml PBS mit 1 ml "vollständigem Freund's Hilfsstoff". Eine dritte Injektion, fünf Wochen nach der ersten Injektion, erfolgt mit der gleichen Konzentration an Antigen, jedoch unter Verwendung von "unvollständigem Freund1s Hilfsstoff". Die Immunisierung erfolgt subkutan.
Nach fünf Wochen und dann in monatlichen Zeitabständen werden Blutproben entnommen. Es werden 30 ml Blut gewonnen und das Serum in bekannter Weise abgetrennt.
Testverfahren
Es wird ein dem in der US Patentschrift Nr. 3 704 282 beschriebenen Verfahren ähnliches Radioimmunverfahren beruhend auf einer kompetitiven Bindung verwendet. Das Inkubationsvolumen beträgt 0,5 oder 1,0 ml und der Komplex des Antikörpers und der markierten Substanz wird von der freien markierten Substanz durch Fällung mit gesättigtem Ammoniumsulphat getrennt.
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Testbedingungen (und Reihenfolge der Zusätze)
1. ΙΟΟμΙ Probe enthaltend 1 ng Catecholamin;
2. 100-200μ1 O,2M Phosphatpuffer oder Carbonatbicarbonatpuffer vom geeigneten pH-Wert;
3. wässrige Lösung von O,1N Iod (I2-NaI), gefolgt von einer 10%igen wässrigen Lösung von Na-SO3;
4. das Inkubationsvolumen wird mit O,1M Phosphatpuffer (pH 7,4) auf 1 ml gebracht (dieser Puffer wird benützt,um den pH-Wert für die Bestimmung nach der Oxydation auf 7,4 einzustellen.);
5. ΙΟΟμΙ markierte Substanz in O,1M Phosphatpuffer
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vom pH-Wert 7,4 (I dl-metanephrin, spezifisch Aktivität von ungefähr 300 Ci/mMol, hergestellt durch die Chloramin T-Methode);
6. ΙΟΟμΙ Antikörper (1:400 verdünnt) in 10%igem (v/v) normalen Kaninchenserum in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4;
Inkubierung: 2 Stunden bis über Nacht bei 4°C , Fällung des Antikörper-Markierungsmittel-Komplexes: 1 ml gesättigtes Ammoniumsulfat.
Zentrifugierung: 3000UPM, 30 Minuten, 4°C. Ansaugen: überstehende Flüssigkeit.
Zählvorgang: Feststoff direkt in der Kammer des Gammacounters.
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Menge an Catecholamin, bestimmt durch das Radioimmunverfahren mit Epinephrinantikörper
R=
OH
C CH2
CH.
Behandlung der
Probe
Epinephrin Synephrin
IxJJ Metanephrin
H0 CH O
Neosynephrin
OH
keine, pH 7,4
1 ng ng
ng
1 ng
50 μΐ O,IN I2, 4°C, 5'
Reduktion mittels 50μ Na3SO3 10%
200μ1 Phosphatpuffer pH 8,8 (Einstellen der Probe auf 8,6) 50μ1 I2, 5 Min., 4°C, Reduktion
mittels 50μ Na 50^ ng
ng
ng
ng
1 ng
ΙΟΟμΙ Carbonat- Bicarbonat-Puffer O,1M pH 9,2, 5θμ1
IN I2, 5', 24°C, Reduktion mittels 50μ Na3SO3 . ng
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Herstellung der markierten Verbindungen
'S
Radioaktiv markierte Catecholamine vom Epinephrintyp,
welche in einem Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Catecholaminen vom Epinephrintyp eingesetzt werden können, sind entv/eder im Handel erhältlich (Epinephrin -H) oder können durch bekannten Methoden, wie z.B. die Chloramin T-Methode zur Markierung mit radioaktivem Iod, erhalten werden. (Synephrin I, Metanephrin I und Phenylephrin I).
Schliesslich sind auch mit Tritium markierte Catecholamine vom Norepinephrintyp im Handel erhältlich (Norepinephrin-
H und Normethanephrin - H). Andere markierte Catecholamine vom Norepinephrintyp können durch die Chloramin T-Methode hergestellt werden (Normetanephrin - I, Octopamin I oder
12S
Norphenephrin I)♦
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Claims (6)

  1. 2738T56
    Patentansprüche
    (l.J Verfahren zur Bestimmung von einzelnen Catecholaminen vom EpinephrintvD wie Epinephrin, Metanephrin, Synephrin und Phenylephrin oder von einzelnen Catecholaminen vom Norepinephrintyp v/ie Norepinenhrin, Normethanenhrin, Octopamin und Norphenephrin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man:
    a) den Gesamtgehalt an Epinephrin- oder Norepinephrintyp Catecholaminen in der Probe unter Verwendung eines für Epinephrin- oder Norepinephrintyp - Catecholaminen spezifischen Antikörpers in einem Immunverfahren bestimmt,
    b) eine aliquote Menge der Probe bei dem pH-Wert 7,4 mit Iod behandelt, wobei allfällig vorhandenes Epinephrin oder Norepinephrin selektiv in eine Form übergeführt wird, die mit : dem Antikörper nicht reagiert; diese aliquote Menge mit einem Ueberschuss an Gulf it: lösung behandelt um allfällig zurückbleibendes Iod zu reduzieren; den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf den für das Immunverfahren erforderlichen Wert einstellt und anschliessend diese Lösung zur Bestimmung der Konzentration von Epinephrintyp - Catecholaminen entsprechend der Gesamtmenge an MetanephrLn, Synephrin und Phenylephrin in der Probe, oder von Norepinephrintyp - Catecholaminen entsprechend der Gesamtmenge an Normetanephrin, Octopamin und Norphenephrin in der Probe, dem Immunverfahren unterwirft;
    c) eine zweite aliquote Menge der Probe, bei dem pH-Wert 8,6 mit Iod behandelt, wobei allfällig vorhandenes Epinephrin und Metanephrin oder Norepinephrin und Normetanephrin selektiv in Formen übergeführt wird, die mit dem Antikörper nicht reagieren; diese aliquote Menge mit einem Ueberschuss an Sulfitlösung behandelt; den pH-V/ert der erhaltenen Lösung auf den für das Immunverfahren geeigneten Wert einstellt und anschliessend diese Lösung zur Bestimmung der Konzentration von Catc cholnmir.en des Epinephrintvps entsnrechend der Gesamtmenge an Synephrin und Phenylonhrin in der Probe oder von Catecholaminen
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    des IJorepinephrintvps entsprechend der Gesamtmenge an Octopamin und Norphenephrin in der Probe dem Immunverfahren unterwirft;
    d) eine dritte aliquote Menge der Probe bei dem pH-Wert 9,2 mit Iod behandelt, v/obei allfällige vorhandenes Epinephrin, Metanephrin und Synephrin oder Norepinephrin, Mormetanephrin und Octopamin selektiv in dornen übergeführt v/ird, die mit dem Antikörper nicht reagieren; diese aliquote Menge mit einem üeberschuss an Sulfitlösung behandelt, den pH-Wert der erhaltenen Lösung auf den für das Immunverfahren geeigneten Viert einstellt und anschliessend diese Lösung zur Bestimmung von Catecholaminen des Epinephrintyps entsprechend der Gesamtmenge an Phenylephrin oder an Norepinephrintyp - Catecholaminen entsprechend der Gesamtmenge an Nomhenephrin in der Probe dem Immunverfahren unterwirft;
    wobei die Konzentration von Epinephrin oder Norepinephrin durch Subtrahieren der in Schritt b) gefundenen Konzentration von der in Schritt a) gefundenen Konzentration erhalten v/ird; die Konzentration von Motanephrin oder Normetanephrin durch Subtrahieren der Ln Schritt c) gefundenen Konzentration von der in Schritt b) gefundenen Konzentration erhalten v/ird; und die Konzentration von Synephrin oder Octopamin durch Subtrahieren der in Schritt d) gefundenen Konzentration von der in Schritt c) gefundenen Konzentration erhalten v/ird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während der lodierung in den Schritten b) und c) der pH-Wert mit Phosphatpuffer und in Schritt d) der pH-Wert mit Carbonat- ßicarbonatpuffer eingestellt v/ird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunverfahren ein Radioimmunverfahren ist.
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  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Epinenhrintyp - Catecholamine wie Epinephrin, Metanephrin, Synephrin und Phenylephrin bestimmt v/erden.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Norepinephrintyp - Catecholamine wie Hoiepinephrin, Normetanephrin, Octopamin und Norphenephrin bestimmt werden.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zur Entfernung von Substanzen v/ie Proteine, die mit der Oxydation interferieren könnten, vorbehandelt wird.
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