DE3751432T2 - Rezeptoren für Immunkomplexe, Verfahren zur ihrer Herstellung und Verfahren zur Prüfung diese benutzend. - Google Patents
Rezeptoren für Immunkomplexe, Verfahren zur ihrer Herstellung und Verfahren zur Prüfung diese benutzend.Info
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Description
- Es besteht ein anhaltender und steigender Bedarf für genaue, empfindliche Verfahren zur Messung von Spurenmengen organischer Materialien in einer großen Vielfalt von Proben. Dieser Bedarf schließt die Messung von Arzneistoffen/Drogen, natürlich vorkommenden, physiologisch aktiven Verbindungen oder Nahrungsmitteln in physiologischen Flüssigkeiten, die Anwesenheit von Spurenmengen von Verunreinigungen oder toxischen Materialien in Nahrungsmitteln, Wasser oder anderen Flüssigkeiten und dgl. sowie die Überwachung von Materialien auf eine Spurenverunreinigung ein, die durch chemische Verarbeitung eingeführt wurde.
- Unter den verschiedenen Verfahren, die eine zunehmende Verwertung gefunden haben, befinden sich Verfahren, an denen Rezeptoren beteiligt sind, die eine spezifische polare und räumliche Organisation eines oder mehrerer Moleküle erkennen oder sich daran binden. Meistens sind die Rezeptoren Antikörper, und die Verfahren werden als Immunassays bezeichnet. Diese Verfahren verwenden üblicherweise einen markierten Liganden, wobei die Bindung an den Rezeptor die Unterscheidung zwischen einem gebundenen markierten Liganden und einem ungebundenen markierten Liganden gestattet. Gewisse Verfahren, die im allgemeinen als heterogen bezeichnet werden, beruhen auf einer Abtrennung des gebundenen vom ungebundenen markierten Liganden. Andere Verfahren, die üblicherweise als homogen bezeichnet werden, beruhen darauf, daß der gebundene markierte Ligand einen Signalpegel bereitstellt, das von demjenigen des ungebundenen markierten Liganden verschieden ist.
- Es sind Verfahren für den Nachweis von mehrwertigen Antigenen bekannt, bei denen mindestens zwei verschiedene Bindungsstellen am Antigen verwendet werden. Immunometrische Assays an zwei Stellen sind wohlbekannt. Sie werden verwendet, um die Anwesenheit oder Konzentration eines Antigens mit mehreren Determinanten in einer flüssigen Probe nachzuweisen. Sie beinhalten die Umsetzung des Antigens sowohl mit einem immobilisierten Antikörper, der gegen eine der antigenen Determinanten gerichtet ist, als auch einem Antikörper, der gegen eine andere der antigenen Determinanten gerichtet ist und indirekt oder direkt markiert ist, um den Nachweis des resultierenden Immunkomplexes zu gestatten. Es ist auch bekannt, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper oder eine Kombination von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern zu verwenden. Die Verwendung von zwei Antikörpern im Immunassay vergrößert die Empfindlichkeit des Assays, indem sie die Verwendung von überschüssigem Antikörper gestattet, um eine vollständige Bindung des Antikörpers an den gesamten Analyten in der Probe sicherzustellen. Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern in einem Immunassay an zwei Stellen vergrößert in einigen Fällen auch die Spezifität des Assays, indem er die Anwesenheit von zwei Epitopen-Stellen am gleichen Molekül erfordert, um ein positives Ergebnis hervorzurufen.
- Während derartige Assays, an denen zwei Antikörper beteiligt sind, nützlich sind, wenn der Analyt ein mehrwertiges Antigen ist, sind die Vorteile, die durch Verwendung von zwei Antikörpern erhalten werden, nicht für monoepitope Antigene, wie Arzneistoffe/Drogen oder andere organische Verbindungen, erhältlich.
- Die Verwendung von doppelten Antikörpern zur Steigerung der Empfindlichkeit in Immunassays wird im US-Patent Nr. 4,281,061 beschrieben. Immunassays an zwei Stellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper verschiedener Klassen oder Unterklassen und Testsätze zur Durchführung derartiger Assays sind im US-Patent Nr. 4,474,892 offenbart. Ein Verfahren für den Nachweis und/oder die Bestimmung eines mehrwertigen Antigens unter Verwendung von mindestens zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern wird im US-Patent Nr. 4,471,058 beschrieben. Das US-Patent Nr. 4,486,530 offenbart immunometrische Assays unter Verwendung monoklonaler Antikörper. Monoklonale Antikörper-Mischungen und deren Verwendung fur eine gesteigerte Empfindlichkeit in Immunassays wird im US-Patent Nr. 4,514,505 diskutiert. Die Verwendung von Anti-Idiotyp-Antikörpern in Immunassays wird im US-Patent Nr. 4,536,479 besprochen. Das US- Patent Nr. 4,062,935 offenbart einen Immunassay, der die Bindung von RF an den Antigen-Antikörper-Komplex beinhaltet. Empfindliche Immunassays für Antigene oder Antikörper, die in Immunkomplexen maskiert sind, wird im US-Patent Nr. 4,459,359 offenbart. Ein Assay für Immunkomplexe wird im US-Patent Nr. 4,141,965 besprochen. Das US-Patent Nr. 4,420,461 offenbart Agglutinationshemmung-Testsätze zum Nachweis von Immunkomplexen. Ein verstärkender Antikörper, der eine neue Komponente der Immunantwort ist, wird von Nemazee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:3828-3832 (1982) beschrieben.
- GB-A-2,171,999 offenbart Immunassays unter Verwendung von Antikörpern, die gegen einen Komplex von modifiziertem Antikörper und Antigen gezüchtet wurden. Die Komplex-Komponenten können kovalent verknüpft sein.
- WO-A-85/04422 offenbart Systeme unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen einen Komplex eines kleinen Moleküls und eines bindenden Proteins, das ein ganzer Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers sein kann, gezüchtet wurden.
- EP-A-174,652 offenbart Assayverfahren, die Antikörper gegen Antikörper/Substanz-Komplex verwenden, welcher mit den einzelnen Komplex-Komponenten nicht reagieren kann.
- WO-A-87/07147 (Stand der Technik nur gemäß Artikel 54(3) EPÜ) offenbart monoklonale Antikörper gegen die Verbindungsstelle von Antikörper und Antigen in einem Komplex, wobei das Herstellungsverfahren das Abspalten des Fc-Fragments aus dem Antikörper beinhaltet, der den Komplex mit dem Antigen bildet.
- WO-A-88/00240 (Stand der Technik nur gemäß Artikel 54(4) EPÜ) wiederholt die Offenbarung von WO-A-85/04422, wobei weiter ein spezielles Verfahren zur Erzeugung von sekundären Antikörpern offenbart wird.
- Die vorliegende Erfindung stellt Antikörper, ein Verfahren zur Herstellung der Antikörper und Verfahren zur Durchführung eines Immunassays unter Verwendung der Antikörper bereit. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt Antikörper ein, die eine Bindungsaffinität zu einem Immunkomplex eines monoepitopen Antigens und eines Antikörpers gegen dieses Antigen aufweisen, welche beträchtlich größer ist als die Bindungsaffinität zu dem monoepitopen Antigen oder dem Antikörper gegen das Antigen außerhalb des Immunkomplexes.
- Normalerweise weist das monoepitope Antigen ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 1500 auf, und der Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper. Die Antikörper der Erfindung können für die Verwendung in Immunassays an einen Marker gebunden werden.
- Ein anderer Aspekt der Erfindung schließt Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers ein, der sich an einen Immunkomplex eines monoepitopen Antigens und eines ersten Antikörpers bindet. In dem Verfahren werden Tiere mit einem affinitätsmarkierten Immunkomplex den Antigens und eines ersten Antikörpers gegen das Antigen iinmunisiert, wobei in diesem Komplex das Antigen und der erste Antikörper kovalent gebunden sind und der erste Antikörper ein vollständiges und unmodifiziertes Immunglobulin ist.
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt Verfahren zur Bestimmung eines monoepitopen Antigens in einer Probe ein, von der man annimmt, daß sie das Antigen enthält. Das Verfahren umfaßt die Bildung eines Immun-Sandwichkomplexes, der das monoepitope Antigen oder Analogon desselben, einen ersten Antikörper, der sich an das monoepitope Antigen bindet, und einen zweiten Antikörper umfaßt, der eine Bindungsaffinität zu dem Immunkomplex des monoepitopen Antigens und des ersten Antikörpers aufweist, die beträchtlich größer ist als die Bindungsaffinität zu dem monoepitopen Antigen oder dem ersten Antikörper außerhalb des Immunkomplexes. Der Immun-Sandwichkomplex wird dann nachgewiesen, wobei die Anwesenheit des Komplexes mit der Menge an monoepitopem Antigen in der Probe in Beziehung gesetzt wird.
- In den Zeichnungen ist:
- Fig. 1 eine graphische Darstellung eines THC-ELISA gemäß den Beispielen 8 und 9 hierin, der einen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet;
- anwesend, = kein THC;
- Fig. 2 eine graphische Darstellung eines THC-ELISA gemäß den Beispielen 8 und 9 hierin, der einen monoklonalen Anti-Idiotyp- Antikörper verwendet; diese Darstellung wird nur zum Zweck des Vergleichs gegeben und ist kein Teil der vorliegenden Erfindung;
- = THC anwesend, = kein THC;
- Fig. 3 eine graphische Darstellung eines THC-ELISA gemäß den Beispielen 8 und 9 hierin, der einen monoklonalen Paratop-spezifischen Antikörper verwendet; diese Darstellung wird nur zum Zweck des Vergleichs gegeben und ist nicht Teil der vorliegenden Erfindung; = THC anwesend, = kein THC;
- Fig. 4 eine graphische Darstellung eines ELISA gemäß den Beispielen 8 und 9 hierin, der einen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung unter konstanten Antikörper- und Konjugat- Konzentrationen verwendet; = THC anwesend, = kein THC;
- Fig. 5 eine graphische Darstellung des AIC-Systems gemäß den Beispielen 8 und 9 hierin, der einen Carboxylat-Metaboliten von THC verwendet.
- Die vorliegenden Antikörper und Verfahren stellen verbesserte Immunassays bereit. Die Erfindung findet Anwendung bei Assays vom Sandwich-Typ, die bisher nicht für monoepitope Antigene verfügbar waren. Weiter stellt die vorliegende Erfindung eine verbesserte Empfindlichkeit und Spezifität bei homogenen Assays bereit.
- Bevor mit einer Beschreibung der speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, wird eine Anzahl von Begriffen definiert.
- "Analyt" -- ein zu messendes Antigen, normalerweise monoepitopes Antigen, das in der Lage ist, sich spezifisch an einen Antikörper zu binden, bei dem es sich um eine(n) Arzneistoff/Droge, ein Hormon, Pestizid, einen umweltverschutzenden Stoff, ein Toxin und dgl. handeln kann. Die genaue Natur von monoepitopen Antigenen und Arzneistoff/Drogen-Analyten zusammen mit zahlreichen Beispielen dafür ist im U.S.-Patent Nr. 4,299,916 von Litman et al., insbesondere Spalten 16 bis 23, und im U.S.-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 17 und 18, offenbart.
- Die Analyten sind gewöhnlich Verbindungen, die ein Molekulargewicht von weniger als 1500, gewöhnlich von 100 bis 1500, gewöhnlicher von 125 bis 1000 aufweisen. Die interessierenden Analyten schließen Arzneistoffe/Drogen, Metaboliten, Pestizide, umweltverschmutzende Stoffe und dgl. ein. Unter den interessierenden Arzneistoffen/Drogen sind auch die Alkaloide eingeschlossen. Unter den Alkaloiden befinden sich Morphinalkaloide, einschließlich Morphin, Kodein, Heroin, Dextromethorphan, deren Derivate und Metaboliten; Kokainalkaloide, die Kokain und Benzoylecgonin, deren Derivate und Metaboliten einschließen; Ergotalkaloide, die das Diethylamid der Lysergsäure einschließen; Steroidalkaloide; Imidazoylalkaloide; Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide; Chinolinalkaloide, die Chinin und Chinidin einschließen; Diterpenalkaloide, deren Derivate und Metaboliten.
- Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen schließt Steroide, einschließlich der Östrogene, Gestagene, Androgene, andreokortikalen Stereoide, Gallensäuren, kardiotonische Glykoside und Aglykone, einschließlich Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, deren Derivate und Metaboliten ein. Auch eingeschlossen sind die Steroid-nachahmenden Substanzen, wie z.B. Diethylstilböstrol.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Lactame mit 5 bis 6 Ringmitgliedern, die die Barbiturate, z.B. Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, Primidon, Ethosuximid und deren Metaboliten einschließen.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Aminoalkylbenzole mit Alkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, die die Amphetamine, Catecholamine, einschließlich Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin, und deren Metaboliten einschließen.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Benzheterocyclen, die Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, deren Derivate und Metaboliten einschließen, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Purine, einschließlich Theophyllin, Koffein, deren Metaboliten und Derivate.
- Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen schließt diejenigen ein, die von Marihuana abgeleitet sind, einschließlich Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
- Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen schließt die Vitamine ein, wie z.B. A, B, z.B. B&sub1;&sub2;, C, D, E und K, Folsäure, Thiamin.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Prostaglandine, die sich durch den Grad und die Stellen der Hydroxylierung und Unsättigung unterscheiden.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Antibiotika, die Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, die Metaboliten und Derivate einschließen.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um die Nukleoside und Nucleotide, die ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit ihren angemessenen Zucker- und Phosphatsubstituenten einschließen.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um verschiedene individuelle Arzneistoffe/Drogen, die Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valpronsäure, Butyrophenone, Antihistamine, anticholinerge Arzneistoffe/Drogen, wie z.B. Atropin, deren Metaboliten und Derivate einschließen.
- Metaboliten, die mit Krankheitszuständen in Beziehung stehen, schließen Spermin, Galaktose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1 ein.
- Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Aminoglykoside, wie z.B. Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.
- Unter den interessierenden Pestiziden sind polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, deren Metaboliten und Derivate.
- "Monoepitopes Antigen" -- ein Antigen, das sich stark (K > 10&sup6; M&supmin;¹) nur an einen Antikörper oder an irgendeinen einer Vielzahl von stark bindenden, Antigen-spezifischen Antikörpern binden kann, wobei die Bindung an irgendeinen derartigen Antikörper die Bindung an irgendeinen anderen derartigen Antikörper stark schwächt oder hemmt.
- "Antigen-Analogon" -- ein modifiziertes monoepitopes Antigen, das mit dem unmodifizierten monoepitopen Antigen um einen Antikörper konkurrieren kann, wobei die Modifikation mindestens ein Mittel bereitstellt, um das Antigen an ein anderes Molekül zu knüpfen. Das Antigen-Analogon unterscheidet sich gewöhnlich vom Antigen um mehr als den Ersatz eines Wasserstoffs durch eine Bindung und wird gewöhnlich an ein Reaktionszentrum oder einen Marker gebunden sein, muß dies aber nicht.
- "Antikörper" -- ein Immunglobulin, das sich spezifisch mit einer speziellen räumlichen und polaren Organisation eines anderen Moleküls verbindet und dadurch als komplementär definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann durch Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie die Immunisierung eines Wirts und das Sammeln von Sera (polyklonal) oder durch Herstellung kontinuierlicher Hybrid-Zellinien und Sammeln des sezernierten Proteins (monoklonal). Antikörper sind vollständiges Immunglobulin, wobei die Immunglobuline die verschiedenen Klassen und Isotypen einschließen, wie IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 und IgM.
- "Antikörper gegen das Antigen" -- ein Antikörper, der spezifisch für ein monoepitopes Antigen oder ein Antigen-Analogon ist, manchmal hierin als erster Antikörper bezeichnet. Der Antikörper ist gewöhnlich monoklonal.
- "Antikörper gegen einen Immunkomplex" -- ein Antikörper, der eine Affinitätskonstante für eine einzige Bindungsstelle an einen Immunkomplex eines monoepitopen Antigens und eines Antikörpers gegen ein derartiges monoepitopes Antigen aufweist, welche beträchtlich, d.h. mindestens zweifach, vorzugsweise mindestens zehnfach größer ist als die Affinitätskonstante für eine einzige Bindungstelle des monoepitopen Antigens oder des Antikörpers gegen ein derartiges monoepitopes Antigen außerhalb des Immunkomplexes, manchmal hierin als zweiter Antikörper bezeichnet.
- Vorzugsweise ist der zweite Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Die monoklonalen Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch das von Milstein und Köhler besprochene und in Nature, 256:495-497, 1975, mitgeteilte Verfahren erhalten werden. Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind wohlbekannt und werden hierin nicht wiederholt. Jedoch beinhaltet es grundsätzlich die Injektion eines Immunogens in einen Wirt, gewöhnlich eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier. Die Maus wird anschließend geopfert, und Zellen werden aus ihrer Milz entnommen. Alternativ kann es sich bei dem Wirt um unsensibilisierte Milzzellen handeln, die in vitro mit dem Immunogen sensibilisiert werden. Die resultierenden Zellen werden mit Myelomzellen fusioniert. Das Ergebnis ist eine Hybridzelle, als Hybridom bezeichnet, die in vitro kultiviert werden kann. Die Population von Hybridomen wird durchmustert und so gehandhabt, daß einzelne Klone isoliert werden, von denen jeder einen einzigen Antikörper gegen das Antigen sezerniert.
- Die Antikörper, die durch die einzelnen Hybrid-Zellinien erzeugt werden, werden in der vorliegenden Erfindung überprüft, um diejenigen zu identifizieren, die eine hohe Affinität zu dem Immunkomplex des Antigens und des Antikörpers gegen das Antigen und eine geringe Bindungsaffinität zu dem Antigen oder dem Antikörper gegen das Antigen außerhalb des Immunkomplexes aufweisen. In der vorliegenden Erfindung ist die verwendete immunogene Substanz ein Immunkomplex zwischen dem monoepitopen Antigen oder dem Antigen-Analogon und dessen verwandtem Antikörper. Ein derartiger Immunkomplex beinhaltet die Bindung zwischen dem Antigen und seinem verwandten Antikörper an der Bindungsstelle. Es müssen Mittel vorgesehen werden, um die Dissoziiation des Immunkomplexes sowohl vor als auch während des Immunisierungsverfahrens zu vermeiden. Die Methode, die Stabilität des Immunkomplexes sicherzustellen, beinhaltet eine "Affinitätsmarkierung", d.h., das Konjugieren der Antikörper-Bindungsstelle an ein chemisch aktiviertes Antigen-Analogon. Gruppen und Verfahren zur chemischen Aktivierung von Antigenen sind im Stand der Technik wohlbekannt, ebenso ihre Verwendung bei der Affinitätsmarkierung. Siehe z.B. J.P. Tite et al., Immunology (1981) 42:355. Jedoch ist die Verwendung des affinitätsmarkierten Materials als Immunogen gemäß der vorliegenden Erfindung nicht bekannt. Das Verfahren kann die Verwendung einer chemisch aktiven Gruppe beinhalten, die mit dem Antigen verknüpft ist und mit einer Gruppe in der Nähe der Antikörper-Bindungsstelle reagiert. Gewöhnlich sollte die chemisch aktive Gruppe nicht so schnell mit Gruppen reagieren, die am Protein gefunden werden, daß die nicht-kovalente Bindung an die Bindungsstelle vor der maßgebenden Reaktion nicht im wesentlichen beendet sein kann. Dies kann erreicht werden, indem man Gruppen von geeigneter Reaktivität wählt oder indem man Gruppen wählt, die unter den neutralen Bindungsbedingungen eine geringe Aktivität aufweisen und anschließend unter Veränderung der Bedingungen, z.B. durch Veränderung des pH oder der Temperatur, aktiviert werden können. Aktivierte Säuren sind speziell nützlich, einschließlich aktivierten Estern (NHS, Nitrophenyl), Säureaziden, gemischten Anhydriden, Thioestern und dgl. Diese Gruppen reagieren primär mit Aminen und können mit Ketten verknüpft sein, die an das Antigen gebunden sind und deren Länge so ausgewählt sind, daß sie die Reaktion mit einem Amin neben der Bindungsstelle gestattet. Andere Gruppen schließen Acylierungsmittel, wie Halogenacetamide, Maleimide, Acrylamide, Halogenketone, Diazoketone, Diazoester, Tosylate, Triflate usw., ein.
- Ein anderes Verfahren zur Affinitätsmarkierung verwendet eine photochemische Aktivierung. Bei einigen Antigenen, die Licht mit Wellenlängen von mehr als 300 nm absorbieren, kann die Bestrahlung des Immunkomplexes direkt eine kovalente Bindung an den Antikörper erzeugen. Wenn dies nicht möglich ist, wird eine photosensitive Gruppe an das Antigen geknüpft. Arylacide und die Azoketone werden häufig verwendet.
- Nach der Markierung ist es wünschenswert, das Produkt durch Immunadsorption mit an feste Phase gebundenem Antikörper zu reinigen. Eine weitere Reinigung kann durch Adsorption mit an fester Phase gebundenem Antigen erreicht werden.
- Es gibt verschiedene Verfahren zur Steigerung der Ausbeuten der monoklonalen Antikörper, und es existieren verschiedene herkömmliche Wege zur Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper, um die monoklonalen Antikörper von anderen Proteinen und anderen Verunreinigungen zu befreien (siehe z.B. Köhler und Milstein, oben).
- Auch im Bereich der Erfindung eingeschlossen sind nützliche bindende Fragmente der sekundären Antikörper, wie Fab, Fab', F(ab')&sub2; und Fv. Die Antikörperfragmente werden durch übliche Verfahren erhalten. Zum Beispiel können nützliche bindende Fragmente durch Peptidase-Verdauung des Antikörpers unter Verwendung von Papain oder Peptin hergestellt werden.
- Der zweite Antikörper kann aus einer Maus-Quelle, Säuger-Quelle, einschließlich Mensch, oder anderen Quellen oder aus Kombinationen derselben stammen. Eingeschlossen im Bereich dieser Erfindung sind Antikörper der Klassen wie IgG, IgM, IgA und IgE, einschließlich Isotypen innerhalb derartiger Klassen.
- "Immunkomplex" -- ein Komplex, der zwischen einem Antigen oder Antigen-Analogon und dessen verwandtem Antikörper als Ergebnis der Bindungsaffinität des Antikörpers zum Antigen oder Antigen-Analogon gebildet wird.
- "Marker" -- ein Marker kann irgendein Molekül sein, das an einen Analyten oder Antikörper oder an ein anderes Molekül konjugiert ist. In der vorliegenden Erfindung kann der Marker ein Mitglied des signalerzeugenden Systems sein, das ein signalerzeugendes Mittel einschließt. Der Marker kann isotop oder nicht-isotop, vorzugsweise nicht-isotop, sein. Als Beispiel und nicht zur Beschränkung aufgeführt, kann der Marker ein Katalysator sein, wie beispielsweise ein Enzym, ein Coenzym, ein Chromogen, wie z.B. ein Fluoreszenzfarbstoff, Farbstoff oder Chemilumineszenzfarbstoff, eine radioaktive Substanz, ein dispergierbares Teilchen, das nichtmagnetisch oder magnetisch sein kann, ein fester Träger, ein Liposom usw.
- "Signalerzeugendes Mittel" -- ein Mittel, das in der Lage ist, mit dem Marker wechselzuwirken, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Derartige Mittel schließen z.B. elektromagnetische Strahlung, Wärme, chemische Reagenzien und dgl. ein. Wenn chemische Reagenzien verwendet werden, können einige der chemischen Reagenzien als Teil einer Entwicklerlösung enthalten sein. Die chemischen Reagenzien können Substrate, Coenzyme, Beschleuniger, zweite Enzyme, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen, spezifische bindende Substanzen, die zum Binden von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, und dgl. einschließen. Einige der chemischen Reagenzien, wie Coenzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dgl. können an andere Moleküle oder an einen Träger gebunden sein.
- "Signalerzeugendes System" -- das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei mindestens eine Komponente ein Marker ist. Das signalerzeugende System schließt alle die Reagenzien ein, die erforderlich sind, um ein meßbares Signal zu erzeugen, einschließlich eines signalerzeugenden Mittels, das mit dem Marker wechselwirken kann, um ein Signal zu erzeugen.
- Das signalerzeugende System stellt ein Signal bereit, das durch äußere Mittel, normalerweise durch Messung der elektromagnetischen Strahlung, wünschenswerterweise durch visuelle Überprüfung, nachweisbar ist. Meistens schließt das signalerzeugende System ein chromophores Substrat und Enzym ein, wobei chromophore Substrate enzymatisch in Farbstoffe, welche Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, Phosphore oder Fluoreszenzfarbstoffe überführt werden.
- Das signalerzeugende System kann mindestens einen Katalysator als Marker, gewöhnlich mindestens ein Enzym, und mindestens ein Substrat einschließen, und es kann zwei oder mehr Katalysatoren und eine Mehrzahl von Substraten einschließen und es kann eine Kombination von Enzymen einschließen, worin das Substrat des einen Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist. Die Wirkungsweise des signalerzeugenden Systems besteht darin, ein Produkt zu erzeugen, das ein nachweisbares Signal bereitstellt, das zu der Menge an gebundenem oder ungebundenem Marker in der Probe in Beziehung steht. Wenn Enzyme verwendet werden, handelt es sich bei den beteiligten Reaktionen meistens um Hydrolyse- oder Redox-Reaktionen.
- Gekoppelte Katalysatoren können auch ein Enzym mit einem nicht-enzymatischen Katalysator beinhalten. Das Enzym kann einen Reaktanten erzeugen, der eine durch den nicht-enzymatischen Katalysator katalysierte Reaktionen eingehen kann, oder der nicht-enzymatische Katalysator kann ein Substrat (einschließlich Coenzymen) für das Enzym erzeugen. Eine große Vielfalt von nicht-enzymatischen Katalysatoren, die verwendet werden können, werden im US-Patent Nr. 4,160,645, herausgegeben am 10. Juli 1979, gefunden.
- Es wird ein Enzym oder Coenzym verwendet, das die gewünschte Verstärkung bereitstellt, indem es ein Produkt erzeugt, das Licht absorbiert, z.B. einen Farbstoff, oder nach Bestrahlung Licht emittiert, z.B. einen Fluoreszenzfarbstoff. Alternativ kann die katalytische Reaktion direkt zu einer Lichtemission führen, z.B. Chemiluminzeszenz. Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen zur Bereitstellung derartiger Produkte sind im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 19 bis 23, und im US-Patent Nr. 4,318,980, Spalten 10 bis 14, angegeben.
- Ein Anzahl von Enzymkombinationen ist im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 23 bis 28, aufgeführt, wobei diese Kombinationen in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können.
- "Poly(ligandenanalogon)" -- eine Mehrzahl von Ligandenanaloga, die kovalent miteinander verknüpft sind, normalerweise zu einem Reaktivitätskern. Der Reaktivitätskern ist ein polyfunktionelles Material, normalerweise polymer, gewöhnlich mit einer Mehrzahl von funktionellen Gruppen, z.B. Hydroxyl-, Amino-, Mercapto-, ethylenischen Gruppen usw., als Stellen zur Verknüpfung. Der Reaktivitätskern kann wasserlöslich oder -unlöslich sein, vorzugsweise wasserlöslich, und weist normalerweise ein Molekulargewicht von mindestens 30 000 auf, und er kann ein Molekulargewicht von 10 000 000 oder mehr aufweisen. Erläuternde Reaktivitätskerne schließen Polysaccharide, Polypeptide (einschließlich Proteinen), Nukleinsäuren, Anionenaustauscherharze und dgl. ein. Wasserunlösliche Reaktivitätskerne können auch Wände von Behältern, z.B. Glas oder Kunststoff, Glasperlen, Additions- und Kondensationspolymere, Sephadex - und Agarose -Perlen und dgl. einschließen.
- "Träger" -- ein poröses oder nicht-poröses wasserunlösliches Material. Der Träger kann hydrophil sein oder hydrophil gemacht werden und umschließt anorganische Pulver, wie Siliciumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche Polymermaterialien, insbesondere Cellulose-Materialien und von Cellulose abgeleitete Materialien, wie faserhaltige Papiere, z.B. Filterpapier, Chromatographiepapier usw.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly (4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat) usw.; entweder allein oder in Kombination mit anderen Materialien verwendet; Glas, Keramiken, Metalle und dergleichen.
- "Ergänzende Materialien" -- häufig werden verschiedene ergänzende Materialien in einem Assay gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Zum Beispiel sind normalerweise Puffer sowie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaykomponenten im Assaymedium anwesend. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven zusätzliche Proteine, wie z.B. Albumine, oder Tenside, insbesondere nicht-ionische Tenside, Bindungsbeschleuniger, z.B. Polyalkylenglykole, oder dgl. eingeschlossen sein.
- Wie oben erwähnt, betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Antikörper, der eine Bindungsaffinität zu einem Immunkomplex eines monoepitopen Antigens und eines Antikörpers gegen ein derartiges Antigen aufweist, welche beträchtlich größer ist als die Bindungsaffinität zu dem monoepitopen Antigen außerhalb des Immunkomplexes oder dem Antikörper gegen ein derartiges Antigen außerhalb des Immunkomplexes. Vorzugsweise handelt es sich bei einem derartigen Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
- Ein derartiger monoklonaler Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein neuer Antikörper, der als THC-AIC-10-4 bezeichnet wird. Dieser monoklonale Antikörper weist eine Bindungsaffinität zu einem Immunkomplex von Tetrahydrocannabinol (THC) und einem monoklonalen Antikörper gegen THC auf, welche beträchtlich größer ist als die Bindungsaffinität zu THC oder dem Antikörper gegen THC außerhalb des Immunkomplexes. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers der Erfindung zu dem Immunkomplex ist ungefähr fünfmal größer als die Bindungsaffinität zu THC oder den Antikörpern gegen THC allein. Dieser monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung ist vom IgG1-Isotyp. Der Antikörper THC-AIC-10-4 wird durch ein Maus-Hybridom erzeugt.
- Die neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung können für eine vergrößerte Spezifität sorgen. Die Antikörper erkennen den Immunkomplex des monoepitopen Anitgens und eines Antikörpers, der für ein derartiges Antigen spezifisch ist. Als Ergebnis der unabhängigen Bindung der beiden Antikörper kann weniger störende Wechselwirkung durch andere Moleküle stattfinden. Der Antikörper der Erfindung findet insbesondere in Immunassays Verwendung, kann aber auch in anderen Anwendungen verwendet werden, die Antikörper mit hoher Spezifität oder hoher Affinitäts erfordern, wie bei Affinitätsreinigungen, und er findet eine potentielle Verwendung in vivo zum Hervorrufen einer Zell-vermittelten Antwort auf eine(n) monoepitope(n) Arzneistoff/Droge.
- Bei Immunassays findet die vorliegende Erfindung eine spezielle Anwendung bei der Bestimmung von monoepitopen Antigen-Analyten, z.B. Arzneistoffen/Drogen. Wie oben erwähnt, findet das vorliegende Assayverfahren sowohl bei heterogenen als auch bei homogenen Assays Verwendung. Beispielhaft für heterogene Assays sind der Radioimmunassay (RIA, Yalow und Berson, J. Clin. Invest. (1960) 39, 1157) und Enzym-verknüpfte Immunassays, wie der Enzym-verknüpfte Immunosorbens-Assay (ELISA), siehe "Enzyme-Immunassay" von Edward T. Maggio, CRC Press Incorporated, Boca Raton, Florida, 1980. Beispiele für homogene Immunassays sind Enzym-multiplizierte Immunassay-Verfahren (siehe z.B. US-Patent Nr. 3,817,837), Immunfluoreszenz-Verfahren, wie diejenigen, die im US-Patent Nr. 3,993,345 offenbart sind, Enzym-Kanalbildungsverfahren, wie diejenigen, die in US-Patent Nr. 4,233,402 offenbart sind, und andere Enzymimmunassays, wie bei Maggio, oben, besprochen.
- Der Assay für den Analyten wird normalerweise in einem wäßrigen gepufferten Medium bei einem mäßigen pH durchgeführt, gewöhnlich bei demjenigen, der für eine optimale Assayempfindlichkeit sorgt. Der Assay kann entweder ohne Abtrennung (homogen) oder mit Abtrennung (heterogen) irgendwelcher der Assay-Komponenten oder - produkte durchgeführt werden.
- Beim wäßrigen Medium kann es sich allein um Wasser handeln, oder es kann 0 bis 40 Volumenprozent eines Cosolvens einschließen. Der pH des Mediums liegt gewöhnlich im Bereich von ungefähr 4 bis 11, gewöhnlicher im Bereich von ungefähr 5 bis 10 und vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6,5 bis 9,5. Der pH ist gewöhnlich ein Kompromiß zwischen dem optimalen Binden der Bindungsmitglieder und dem optimalen pH für andere Reagenzien des Assays, wie beispielsweise Mitglieder des signalerzeugenden Systems.
- Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH zu erreichen und den pH während der Bestimmung aufrechtzuerhalten. Erläuternde Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dgl. ein. Der spezielle verwendete Puffer ist nicht kritisch für diese Erfindung, aber in einem einzelnen Assay kann ein Puffer einem anderen vorgezogen werden.
- Mäßige Temperaturen werden gewöhnlich für die Durchführung des Assays verwendet, und gewöhnlich konstante Temperaturen während der Zeitspanne der Messung, insbesondere bei Geschwindigkeitsbestimmungen. Die Inkubationstemperaturen liegen normalerweise im Bereich von ungefähr 5 bis 45ºC, gewöhnlicher von ungefähr 15 bis 40ºC. Die Temperaturen während der Messungen liegen gewöhnlich im Bereich von ungefähr 10 bis 50ºC, gewöhnlicher von ungefähr 15 bis 40ºC.
- Die Konzentration des Analyten, der getestet werden kann, variiert gewöhnlich von ungefähr 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;¹&sup5; M, gewöhnlicher von ungefähr 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup4; M. Erwägungen, wie beispielsweise, ob der Assay qualitativ, halbqualitativ oder quantitativ ist, die spezielle Nachweistechnik und die Konzentration des interessierenden Analyten bestimmen normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien.
- Während die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Assaymedium im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich des Analyten bestimmt werden, wird die Endkonzentration jedes der Reagenzien gewöhnlich empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays über den Bereich zu optimieren. Das heißt, eine Schwankung in der Konzentration des Analyten, die signifikant ist, sollte für einen genauen meßbaren Signalunterschied sorgen.
- Während die Reihenfolge der Zugabe in weitem Bereich variieren kann, gibt es abhängig von der Art des Assays gewisse Präferenzen. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe ist es, alle Materialien gleichzeitig zuzugeben und die Auswirkung zu bestimmen, die das Assaymedium auf das signalerzeugende System besitzt, wie in einem homogenen Assay. Alternativ können die Reagenzien aufeinanderfolgend vereinigt werden. Gegebenenfalls kann nach jeder Zugabe ein Inkubationsschritt stattfinden, gewöhnlich im Bereich von ungefähr 30 Sekunden bis 6 Stunden, gewöhnlicher von ungefähr 2 Minuten bis 1 Stunde.
- In einem homogenen Assay wird nach der gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Vereinigung der Reagenzien die Auswirkung des Assaymediums auf das signalerzeugende System bestimmt. Die Auswirkung des Assaymediums auf das signalerzeugende System steht mit der Menge an monoepitopem Analyten in der getesteten Probe in Beziehung. Der neue Antikörper der Erfindung wird vorzugsweise nach Zugabe der Probe zugesetzt, die den Antigen-Analyten und den Antikörper gegen den Analyten enthält. Die Menge an erfindungsgemäßem Antikörper, die in einem homogenen Assay verwendet wird, hängt von der Art des monoepitopen Antigens und des Antigen-Marker-Konjugats ab. Derartige Mengen an Reagenzien sind im US-Patent Nr. 3,817,837 (insbesondere in Spalte 4) aufgeführt. Die Verwendung der Antikörper der Erfindung in homogenen Assays steigert die Empfindlichkeit und/oder Spezifität der Assays durch Verstärkung der effektiven Bindung zwischen dem monoepitopen Antigen und dem Antikörper gegen ein derartiges Antigen. Der erfindungsgemäße Antikörper vereinigt sich mit dem Immunkomplex des monoepitopen Antigen-Analyten und des Antikörpers gegen den Analyten, wobei er die Dissoziation dieses Immunkomplexes während des homogenen Assays verringert. Ein Beispiel für einen homogenen Assay ist das Enzym-multiplizierte Immunassayverfahren, das im US-Patent Nr. 3,817,837 beschrieben wird.
- Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet den Nachweis von monoepitopen Antigenen mittels eines Sandwich-Immunassays. In den Verfahren wird ein Immun-Sandwichkomplex gebildet, der das monoepitope Antigen oder ein Analogon desselben, einen ersten monoklonalen Antikörper, der sich an das Antigen bindet, und einen zweiten monoklonalen Antikörper umfaßt, der eine Bindungsaffinität zu dem Immunkomplex des Antigens und seines verwandten Antikörpers besitzt, welche beträchtlich größer ist als die Bindungsaffinität zu dem Antigen oder seinem verwandten Antikörper außerhalb des Immunkomplexes. Anschließend wird der Immun- Sandwichkomplex nachgewiesen und mit der Menge des monoepitopen Antigen-Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt. Der Immun-Sandwichkomplex wird mittels der Anwesenheit eines Markers im Komplex nachgewiesen, indem entweder einer oder beide aus erstem Antikörper und zweitem Antikörper Marker oder Substituenten enthalten, die sich mit Markern vereinigen können, wie die Verknüpfung des Antikörpers an Biotin und das Bereitstellen von an einen Marker gebundenem Avidin.
- Der Immun-Sandwichkomplex-Assay, an dem der neue Antikörper der vorliegenden Erfindung beteiligt ist, kann auf heterogene Weise durchgeführt werden, oder er kann auf homogene Weise durchgeführt werden. Das neue Verfahren der vorliegenden Erfindung gestattet es, einen Überschuß von einem oder beiden Antikörpern gegen das monoepitope Antigen zu verwenden, um die Reaktionsrate zu steigern.
- Die Immun-Sandwichkomplex-Assays für mehrwertige Antigene sind wohlbekannt, und meistens können Protokolle für solche Assays für monoepitope Antigene verwendet werden, welche die neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung verwenden. Derartige Assays vom Sandwich-Typ sind beispielsweise im US-Patent Nr. 4,486,530 offenbart. Der Immun-Sandwichkomplex-Assay kann durchgeführt werden, indem man den zweiten Antikörper an einem Träger gebunden vorliegen hat. Der Immun-Sandwichkomplex wird so an einen Träger gebunden, wenn der monoepitope Antigen-Analyt in der Probe anwesend ist. Die Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält, kann mit dem ersten Antikörper vereinigt werden, und die Vereinigung kann anschließend mit dem zweiten Antikörper vereinigt werden. Andererseits können die Reagenzien gleichzeitig vereinigt werden.
- Ein anderes Beispiel für ein Verfahren, in dem der Immun-Sandwichkomplex-Assay verwendet werden kann, der die neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet, ist das konzentrierende Zonenverfahren in einem heterogenen Immunassay, das im US-Patent Nr. 4,366,241 offenbart ist. Im konzentrierenden Zonenverfahren wird eine Vorrichtung verwendet, die eine kleine Testzone aufweist, in der ein Bindungspaar-Mitglied gebunden ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem Bindungsmitglied in der Testzone um den neuen monoklonalen Antikörper der Erfindung handeln. Die Testzone steht in flüssiger Beziehung mit einer großen flüssigkeitsabsorbierenden Zone, die dazu dient, Flüssigkeit durch die Testzone zu ziehen, Flüssigkeit zu speichern, und dazu dienen kann, die Geschwindigkeit zu steuern, mit der die Flüssigkeit durch die Testzone gezogen wird. Die Probe, von der man annimmt, daß sie den monoepitopen Antigen-Analyten enthält, wird in einem wäßrigen Medium mit einem Antikörper gegen dieses Antigen vereinigt. Das wäßrige Medium wird dann mit der Testzone in Kontakt gebracht. Bei diesem speziellen Verfahren kann der Antikörper gegen das monoepitope Antigen an einen Marker als Teil eines signalerzeugenden Systems gebunden sein. Alternativ könnte man den Antikörper gegen das monoepitope Antigen in der Testzone binden. Die Testzone würde mit dem wäßrigen Medium, das die zu analysierende Probe enthält, und mit dem neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden. Falls in der Probe Analyt anwesend wäre, würde der neue Antikörper der Erfindung in der Testzone gebunden werden. Der Antikörper der Erfindung würde einen Marker als Teil eines signalerzeugenden Systems tragen.
- Ein anderer Immunassay, in dem die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, wird im US-Patent Nr. 4,533,629 beschrieben. Dieses Verfahren beinhaltet einen heterogenen Immunassay mit gleichzeitiger Kalibrierung. Gewöhnlich werden zwei Oberflächen in Nachbarschaft bereitgestellt. Eine Oberfläche ist eine Meßoberfläche, und die andere Oberfläche ist eine Kalibrierungsoberfläche. Wenn man die vorliegende Erfindung auf den Assay mit gleichzeitiger Kalibrierung anwendet, kann die Meßoberfläche Antikörper gegen den monoepitopen Antigen-Analyten enthalten. Ein Assaymedium, das die zu analysierende Probe enthält, wird mit der Meßoberfläche in Kontakt gebracht. Anschließend wird die Meßoberfläche mit einem wäßrigen Medium in Kontakt gebracht, das den neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung an einen Marker gebunden enthält. Falls Analyt in der Probe anwesend ist, würde der neue Antikörper der Erfindung an die Meßoberfläche gebunden werden, und der Marker in Verbindung mit den anderen Mitgliedern des signalerzeugenden Systems würde ein Signal erzeugen. Alternativ kann der neue Antikörper der Erfindung an die Meßoberfläche gebunden sein. Ein wäßriges Medium, das die Probe und einen Antikörper gegen den monoepitopen Antigen-Analyten enthält, wird mit der Oberfläche in Kontakt gebracht. Der Antikörper gegen den Analyten enthält einen Marker, und die Anwesenheit eines Signals an der Meßoberfläche würde die Anwesenheit des Analyten in der Probe anzeigen.
- Ein anderes Assay-Beispiel, bei dem die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, wird in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 019640 beschrieben. Das Verfahren und die Vorrichtung dienen zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. Das Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen einer Testlösung, die die Probe und das erste Mitglied eines spezifischen Bindungspaares enthält, mit einem Endteil eines Teststreifens aus saugfähigem Material, der mittels Kapillarwirkung von der Testlösung durchwandert werden kann. Das erste Mitglied des spezifischen Bindungspaares ist in der Lage, den Analyten zu binden. Der Streifen enthält zum Konzentrieren und nicht-diffundierbaren Binden des ersten Mitglieds des spezifischen Bindungspaares an einer kleinen Stelle auf dem Streifen, die vom Endteil des Streifens getrennt vorliegt, ein zweites Mitglied eines spezifischen Bindungspaares als Einheit damit. Ein nachweisbares Signal wird in Beziehung zu der Anwesenheit des Analyten in der Testlösung erzeugt. Unter Anwendung der vorliegenden Erfindung auf das Verfahren und die Vorrichtung kann die kleine Stelle einen neuen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Probe, von der man annimmt, daß sie den monoepitopen Antigen-Analyten enthält, und Antikörper gegen diesen Analyten werden in einem wäßrigen Medium vereinigt. Das Medium wird mit einem Endteil des Streifens in Kontakt gebracht, und man läßt es mittels Kapillarwirkung entlang dem Streifen wandern. Falls Analyt in der Probe anwesend ist, wird ein Immunkomplex zwischen dem Analyten und seinem verwandten Antigen gebildet. Dieser Immunkomplex wird dann an der Stelle eingefangen. Mitglieder eines signalerzeugenden Systems werden verwendet, um als Ergebnis des eingefangenen Immunkomplexes an der Stelle ein Signal zu erzeugen. Andererseits bildet sich, falls kein Analyt in der Probe anwesend ist, kein Immunkomplex, und ein solcher wird nicht eingefangen, wenn das wäßrige Medium, das die Probe und den Antikörper gegen den Analyten enthält, mit dem Endteil des Streifens in Kontakt gebracht wird und man dieses entlang dem Streifen durch Kapillarwirkung an die Stelle wandern läßt. Deshalb wird an der Stelle kein Signal erzeugt, wodurch die Abwesenheit von Analyt in der Probe angezeigt wird.
- Um die Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung zu vergrößern, können die Reagenzien in abgepackter Kombination in demselben oder in gesonderten Behältern bereitgestellt werden, so daß das Verhältnis der Reagenzien für eine wesentliche Optimierung des Verfahrens und des Assays sorgt. Der Testsatz umfaßt als ein Reagenz einen Antikörper, der eine Bindungsaffinität zu einem Immunkomplex eines monoepitopen Antigens und eines Antikörpers gegen ein derartiges Antigen aufweist, welche beträchtlich größer ist als die Bindungsaffinität zu dem Antigen oder dem Antikörper außerhalb des Immunkomplexes. Der Testsatz schließt weiter andere gesondert abgepackte Reagenzien zur Durchführung eines Assays ein, einschließlich Mitgliedern des signalerzeugenden Systems, anderer Antikörper usw.
- Die Erfindung wird weiter durch die folgenden erläuternden Beispiele dargelegt.
- Bevor zu einer Beschreibung der Beispiele fortgeschritten wird, werden die folgenden Ausdrücke definiert:
- PBS - 0,01 M NaH&sub2;PO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,02% NaN&sub3;
- IgG - Immunglobulin G
- IgA - Immunglobulin A
- IgM - Immunglobulin M
- EIA - Enzymimmunassay
- MAb - monoklonaler Antikörper
- Ab&sub2; - monoklonaler Antikörper THC-AIC-10-4
- IgG&sub1; - IgG&sub1;-Isotyp von IgG
- Ab&sub1; - monoklonaler Antikörper THC-2-57
- HRP - Meerrettichperoxidase
- THC - Tetrahydrocannabinal
- ABTS - 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure)- ABTS ist eine Marke
- OD - optische Dichte
- DMEM - Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium
- ECDI - 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid- Hydrochlorid
- Ag8.653 - nicht-sezernierende Myelomzellinie von der A.T.C.C.
- S-DMEM - ergänztes DMEM
- ENDLO - "niedrig in Endotoxinen", eine Marke für Rinderserum
- NCTC - ein definiertes Zellkulturmedium von Gibco
- HEPES - N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
- CFA - komplettes Freund-Adjuvans
- IFA - inkomplettes Freund-Adjuvans
- MeOH - Methanol
- EtOAc - Ethylacetat
- HOAc(AcOH) - Essigsäure
- tlc - Dünnschichtchromatographie
- AIC - Anti-Immunkomplex gemäß der vorliegenden Erfindung.
- 42 mg (0,122 mMol) 11-Nor-Δ&sup8;-THC-9-carbonsäure (Research Triangle Institute), 15,4 mg (0,134 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 27,6 mg (0,134 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid wurden mit 3 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran vereinigt und 16 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch tlc-Analyse überwacht, Analtech-Kieselgel GF 0,5:9,5 MeOH-CH&sub2;Cl&sub2;, sichtbar gemacht mit 0,5% Cersulfat in 5%-iger H&sub2;SO&sub4;, Erwärmen, Rf ca. 0,67.
- Die obige aktivierte Ester-Lösung wurde tropfenweise zu einer geruhrten Lösung von 3 ml 5%-igem NaHCO&sub3; gegeben, das 32,8 mg (0,368 mmol) β-Alanin und 0,16 mg (0,0017 mMol) β-Alanin[1-¹&sup4;C], spezifische Aktivität 54,4 mG/mMol, enthielt. Nach 16-stündigem Rühren wurde die Lösung mit konzentrierter HCl auf pH 3-4 angesäuert, und das organische Lösungsmittel wurde unter einem Stickstoffstrom entfernt. Die Lösung wurde zweimal mit 5 ml Ethylacetat extrahiert, mit MgSO&sub4; getrocknet, konzentriert und auf einer 1 - 20 x 20 cm 1000 um Analtech-Kieselgel GF-Platte gereinigt, 0,5:9,5:0,05 MeOH-EtOAc- AcOH. Die geeignete Bande wurde isoliert und extrahiert, konzentriert und im Vakuum getrocknet, was 22 mg ergab, spezifische Aktivität 0,287 mCi/mMol.
- 47 mg (0,113 mMol) 11-Nor-Δ&sup8;-THC-9-carbonsäure, β-Alanyl(1-¹&sup4;C], 13,4 mg (0,113 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 23,3 mg (0,113 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid wurden mit 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran vereingt und 16 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Die obige Lösung wurde zu einer heftig gerührten Lösung von 15,1 ng (0,169 mMol) β-Alanin in 10 ml 5%-igem NaHCO&sub3; gegeben. Nach 15-stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur wurde die Produktisolierung auf die gleiche Weise wie bei der Verbindung des Beispiels 1 vorgenommen, was 35 mg ergab; tlc-Analyse: Analtech-Kieselgel GF, 0,5:9,5:0,05, MeOH-EtOAc-HOAc, Rf ca. 0,37, mit einer spezifischen Aktivität von 0,248 mCi/mMol.
- Mäuse wurden mit einem 11-Carboxymethyloxim-Derivat von Δ&sup9;-THC vom Research Triangle Institute, nach bekannten Verfahren an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) konjugiert, gemäß Standardverfahren immunisiert. Eine Auffrischinjektion in Kochsalzlösung wurde 96 Stunden vor der Fusion intravenös verabreicht.
- Splenozyten wurden durch sanfte Perfusion der Milz mit Serumfreiem RPMI hergestellt. Verbleibendes Gewebe wurde mit einer Gewebehomogenisierungs-Vorrichtung aufgebrochen. Eine Einzelzellen-Suspension wurde erhalten, indem man das Homogenisat durch steriles einfaseriges Nitex-Filtergewebe (Tobler, Ernst und Traber #HD-3-85) schickte. Die Splenozyten und Ag 8.653-Zellen wurden zweimal gewaschen und in einem Verhältnis von 2:1 gemischt. Die Zellen wurden mit Polyethylenglykol (PEG-1450, Bethesda Research Labs) gemäß dem in Clin. Immunol. Immunopathol, 23, 172-178 (1982) beschriebenen Verfahren fusioniert.
- Alle Hybridome und die nicht-sezernierende Myelom-Zellinie Ag 8.653 wurden in einer log-Wachstumsphase in S-DMEM mit 15% fetalem Kälberserum (FCS), 10% NCTC-109, 0,45 mM Pyruvat, 1,0 mM Oxalessigsäure, 10 ug/ml Rinder-Insulin, 2,0 mM L-Glutamin und 50 ug/ml Gentamicin gehalten.
- Die Klonierung von Hybridomen wurde in Anwesenheit von nichtimmunen Peritoneal-Makrophagen vorgenommen. Die Peritoneal-Spülung von einer Maus wurde in 150 ml SDMEM verteilt. Hybridomzellen aus einer Platte mit 96 Vertiefungen wurden in 5 ml Medium aufgenommen. Sie wurden dann in 100 ul-Portionen in eine erste Spalte von 8 Vertiefungen auf Platten mit 96 Vertiefungen verteilt. Diese Zellen wurden dann seriell über die ganze Platte verdünnt.
- EIA-Costar-Mikroplatten wurden mit 10 ul/Vertiefung Kaninchen- Antimaus-IgG+IgA+IgM(M+L) (Zymed Labs) zu 5 ul/ml in PBS, pH 7,2, über Nacht bei 4ºC beschichtet. Die Platten wurden mit 200 ul der Gammaglobulin-Fraktion von nicht-immunem Schafserum zu 200 ul/ml geblockt. Hybridom-Überstände wurden zu jeder Vertiefung gegeben und 90 Minuten inkubiert. Nach Waschen der Platten wurde ein Δ&sup9;-THC- HRP-Konjugat zu jeder Vertiefung gegeben und 45 Minuten inkubiert. Die Platten wurden wieder gewaschen und dann mit ABTS-Substrat entwickelt und bei 415 nm mit einem automatisierten Plattenablesegerät abgelesen. Vertiefungen mit den höchsten OD's [wurden ausgewählt], welche auch den größten Verlust an Farbentwicklung in einem ELISA mit einer Wiederholungsplatte zeigten, welcher 20 ng Δ&sup9;-THC/ml im Konjugatschritt enthielt. Das Hybridom THC-2-57 wurde aus einer großen Gruppe von erzeugten Monoklonen ausgewählt und durch dieses Verfahren selektiert.
- Der monoklonale Antikörper THC-2-57 wurde mit dem Affi-Gel Protein A System (MAPS ) von BioRad gemäß BioRad Bulletin 1172 gereinigt.
- THC-2-57 wurde in SDMEM gezüchtet:
- 1) DMEM (Gibco labs #430-2100; 101-Packungen)
- 2) 15% ENDLO fetales Rinderkälberserum (KC Biologics #3000)
- 3) 10% NCTC 109 (oder NCTC 135) (Gibco #440-110)
- 4) 4 mM L-Glutamin (Sigma G-5763)
- 5) 0,05 mg/ml Gentamicin (Gibco #600-5750)
- 6) 1 mM Natriumpyruvat (Gibco#320-1360)
- 7) 1 mM Oxalessigsäure (Sigma 0-4126)
- 8) 0,01 mg (25 IE/mg)/ml Rinder-Insulin (Sigma I-5500)
- 9) 4,765 mg/ml HEPES-Puffer (Sigma H-3375)
- Gesunde log-Phasen-Zellen mit einer Dichte von ungefähr 5x10&sup6; lebensfähige Zellen/ml (wie durch Trypan-Blau-Ausschließungs-Hämozytometrie bestimmt) wurden zur Einimpfung in eine Hohlfaser- Zuchtkapsel Vitafiber II (Amicon) geerntet.
- Die Hohlfaserkapsel wurde im wesentlichen wie von Amicon vorgeschlagen angeordnet:
- Ein magnetisch gerührtes Gefäß mit 1 Liter Medium war durch Siliciumrohre mit einer peristaltischen Pumpe mit variabler Geschwindigkeit verbunden, die Medium mit 100 ml pro Minute durch das Hohlfaser-Lumen (1000 cm² Oberfläche) im Kreis führte.
- 10&sup8; Zellen, die in 25 ml SUPER DMEM suspendiert waren, wurden in die extrakapilläre Wachstumskammer eingeimpft. Die Hohlfaser- Kapsel und das Reservoir für das Medium wurden dann in einen Konvektionsinkubator bei 37º gegeben.
- Dreimal wöchentlich wurde 1 [l] Medium ersetzt, und 30 ml extrakapillärer Überstand (der den konzentrierten Antikörper enthielt) wurden geerntet. Der Überstand wurde durch Agarose-Elektrophorese auf Antikörperproduktion überwacht und dann gefroren aufbewahrt (-20ºC).
- 25 mg HRP (Meerrettichperoxidase, Sigma, Gütegrad VI) wurden in 0,5 ml 0,1 M Na-Phosphat, pH 6,8, mit 1,25% Glutaraldehyd über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dies wurde unter Verwendung einer G-25-Säule in Hanks-Kochsalzlösung äquilibriert, wobei man die ersten 2,0 ml Eluat nahm. Ebenso wurden unter Verwendung einer G-25-Säule 10 mg mit Protein A gereinigter Ab&sub1; (THC-2-57) in Hanks- Kochsalzlösung äquilibriert.
- Am nächsten Tag wurden die 2,0 ml des Ab&sub1;-Präparats und die 2,0 ml des Glutaraldehyd-aktivierten HRP-Präparats zusammengemischt und 24 Stunden bei 4ºC gehalten. Dann wurden 0,2 ml 0,2 M Glycin zu der Konjugatmischung gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um jeglichen verbleibenden Glutaraldehyd umzusetzen, wodurch jede weitere Vernetzung blockiert wurde.
- Nachdem die Blockierungsreaktion beendet war, wurde das Konjugat gegen PBS-Puffer über Nacht dialysiert und unter Verwendung einer 2x180 cm Bio-Gel A1.5m-Gelfiltrationssäule gereinigt, um ungebundene HRP abzutrennen. Der erste eluierte Hauptpeak wurde gesammelt und als die Ab&sub1;-HRP-Konjugat-Vorratslösung verwendet.
- 3,0 mg (0,0062 mMol) der wie in Beispiel 2 hergestellten Verbindung (zuvor über P&sub2;O&sub5; bei 100ºC in einem Vakuum von 0,5 mm über 8 Stunden getrocknet), 1,0 mg (0,0087 mMol) N-Hydroxysuccinimid, 1,5 mg (0,0073 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und 1 ml wasserfreies Tetrahydrofuran wurden zusammengegeben und 16 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. TLC auf einer silanisierten RP-2-Kieselgelplatte zur Analyse, Merck, 2:8 EtOAc-Hexan, zeigt, daß die NHS-Esterbildung vollständig war.
- 150 ul (0,45 mg) (9,2 x 10&supmin;&sup4; mMol) der obigen Lösung wurden bei 5-10ºC tropfenweise zu einer gerührten Lösung von 3,0 ml, 49,6 mg (3,1 x 10&supmin;&sup4; mMol) (THC-2-57)-IgG in Phosphatpuffer, pH 8,5, und 0,5 ml Dimethylformamid gegeben. Die Lösung wurde 16 Stunden bei 4ºC gerührt und dann unter Verwendung einer M-Sephadex G-50-Säule in PBS (10 mM Na&sub2;HPO&sub4;-NaH&sub2;PO&sub4;, 154 mM NaCl, pH 7,4) mit einem 10-fachen Volumen einer Gelfiltration unterzogen.
- Die Bestimmung des Verhältnisses von ¹&sup4;C-markiertem THC zu (2-57)- IgG&sub1; nach Reinigung durch Gelfiltration und Affinitätsgelen.
- Die ¹&sup4;C-THC-Konzentrationen wurden durch Messen der Zählereignisse pro Minute in 100 ul Proteinlösung bestimmt, die mit 10 ml Szintillationsflüssigkeit verdünnt war, und mit Beckman LS 2800 gezählt.
- Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Extionktionskoeffizienten von ca. 1,4 x 10&sup5; IgG bei 280 nm oder unter Verwendung des Lowry-Verfahrens gemessen.
- Das markierte IgG&sub1; wurde jeweils 1,5 ml Sepharose 4B-IgG&sub1;(2- 57)- (16 Stunden) und AH-Sepharose 48-THC-Affinitätsgelen (15 Minuten) ausgesetzt. Gel m-Sephadex G-50 Sepharose
- Die obige Probe wurde einem Verfahren zur Bestimmung der Nicht- Verfügbarkeit von Bindungsstellen des kovalent modifizierten monoklonalen Antikörpers (THC-2-57)-IgG&sub1; unterzogen, wobei man die Beobachtung verwendete, daß G6PDH-THC-Konjugat eine deutliche Immunkomplex-Bande auf dem Elektrophoresegel bildet, wenn es mit unmodifiziertem (THC-2-57)-IgG&sub1; vereinigt wird. Diese Bande erscheint ungefähr in der Mitte zwischen der G6PDH-THC- und (THC-2-57)-IgG&sub1;-Bande. Das obige markierte (THC-2-57)-IgG&sub1;-¹&sup4;C-THC bildete keinen Immunkomplex mit einem Überschuß an G6PDH-THC. Deshalb wurde geschlossen, daß die Stellen kovalent durch das radiomarkierte THC-Derivat besetzt waren.
- 1 g CNBr-aktivierte Sepharose 4B wurde gewaschen, und man ließ sie 15 Minuten mit 1 mM HCl in einer Scheibennutsche mit mittlerer Fritte quellen, dann wusch man mit 200 ml 1 mM HCl. 15 ml IgG&sub1; (THC- 2-57) (10 mM PO&sub4;, 145 mM NaCl, 0,05% NaN&sub3;, pH 7,4) wurden in Membranschläuche gegeben und gegen 3 x 250 ml Kupplungspuffer, 0,2 M NaHCO&sub3;-Na&sub2;CO&sub3;, pH 8,5, der 0,5 M NaCl enthielt, jedes Mal 4 Stunden dialysiert. 1 g, ca. 3,5 ml, der gequollenen und gewaschenen CNBr- aktivierten Sepharose 4B, wurde mit Kupplungspuffer gewaschen. Die CNBr-Sepharose 4B und 15 ml IgG&sub1; wurden mit 20 ml Kupplungspuffer in einem Kunststoff-Serumbehälter zusammengegeben und durch 2-stündiges und dann über Nacht andauerndes Drehen entlang der Längsachse gemischt, um verbleibende aktivierte Gruppen zu blockieren. Das Gel wurde in eine M-gesinterte Filternutsche hineingewaschen und abwechselnd mit Acetatpuffer (0,1 M, pH 4) und Kupplungspuffer (0,2 M, pH 8,5) gewaschen. Das Gel wurde in 10 mM PO&sub4;, 145 mM NaCl, 0,05% NaN&sub3;, pH 7,4, bei 4ºC gelagert (ca. 7,5 mg IgG&sub1;/ml Gel).
- Man ließ 2 g AH-Sepharose 48 (10 uMol NH&sub2;-Gruppen/ml) in einer scheibenförmigen Nutsche mit M-Fritte quellen und wusch mit 400 ml 0,5 M Nacl. 55 mg, 160 uMol, 11-Nor-Δ&sup8;-THC-9-carbonsäure wurden in 10 ml 1:1 H&sub2;O,pH 4,5:Dioxan gelöst. Die 10 ml Ligandenlösung wurde zu 8 ml Gel gegeben, und das Volumen wurde auf ein Flüssigkeit:Gel-Verhältnis von 2:1 gebracht. Dann wurden 1,5 g ECDI dazugegeben und 16 Stunden bei Raumtemperatur über die vertikale Achse gemischt. Das Gel wurde mit 1:1 H&sub2;O-Dioxan, 1:1 0,2 M NaHCO&sub3;- Na&sub2;CO&sub3;-Dioxan und dann 1:1 Acetatpuffer(0,1 M, pH 4)-Dioxan, jeweils 4 x 50 ml, 50%-ig, gewaschen. Das Gel wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und in 10 mM PO&sub4;, 145 mM NaCl, 0,05% NaN&sub3;, pH 7,4, bei 4ºC aufbewahrt.
- Die Standardverfahren von Köhler und Milstein, oben, wurden befolgt. Myelomzellen (P3-NS1/1) wurden mit Milzzellen aus einer immunisierten Balb/c-Maus fusioniert. Das verwendete Immunogen war mit Protein A gereingter THC-2-57-Antikörper (Ab&sub1;), in Hohlfaser- Kultur gezüchtet und kovalent über einen Bis-β-alanin-Linker an delta-8-THC geknüpft (siehe Beispiele 1-6). Weibliche Balb/c-Mäuse wurden intraperitoneal (i.p.) dreimal alle 10 Tage mit 250 ug/Auffrischinjektion (1X CFA, 2X IFA) immunisiert. Nach 4-monatiger Ruhepause wurden die Mäuse dreimal i.p. mit 200 ug Immunogen/Auffrischinjektion einmal täglich 3 Tage vor der Fusion hyperimmunisiert.
- Die Zellfusionen wurden durch eine Polyethylenglykol-Behandlung gemäß Standard-Hybridomverfahren durchgeführt. Am Ende wurde eine Vertiefung, 2G3, ausgewählt, die auf der ELISA-Platte mit THC eine gute Farbentwicklung zeigte und auf der Wiederholungsplatte ohne THC eine geringere Farbentwicklung zeigte (siehe das nachstehende Verfahren in Beispiel 9). Diese Zellinie aus dieser Vertiefung wurde zu THC-AIC-10-4 umbenannt und auf einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen zur weiteren Analyse kloniert.
- Die ELISA-Ergebnisse der ersten Klonierungsplatte von THC-AIC- 10-4 zeigten eine für den Klon spezifische, reproduzierbare Immunkomplex-Aktivität. Zellen wurden in Vertiefungen über die erste Reihe verteilt und dann die Platte hinunter seriell verdünnt. Kulturüberstände wurden auf AIC-Aktivität überprüft, wie beschrieben. Die Ergebnisse wurden nicht bezüglich des Hintergrunds korrigiert, der 0,15 bei Vertiefungen ohne Wachstum betrug. Die durchschnittliche Absorbanz in Anwesenheit von THC bei Vertiefungen mit Zellwachstum betrug 0,95, verglichen mit 0,25 in Abwesenheit von THC.
- Der Kulturüberstand von THC-AIC-10-4 wurde zusammen mit einem Idiotyp-spezifischen Antiserum und einem Paratop-spezifischen Antiserum (die letzteren beiden wurden mit Aszites-Proben verdünnt), die gegen THC-2-57 gezüchtet worden waren, in einem Titrationsexperiment nochmals getestet, indem man im Immunkomplex-ELISA-Protokoll die Antikörper mit überschüssigem THC mischte und dann die Mischung seriell über die Platte hinweg verdünnte. Die Ergebnisse aus diesem Experiment sind in den Figuren 1-3 dargestellt.
- Die Titration der AIC-Antikörper in Fig. 1 zeigt konsistent höhere Werte in Anwesenheit der THC-Droge, abhängig von der Ab&sub2; Konzentration. Die beiden Kontroll-Antikörper zeigen Antworten für einen typtischen Anti-Idiotyp-MAB (Fig. 2 - keine Wirkung durch das Antigen für Ab&sub1;) und einen Paratop-spezifischen MAb (Fig. 3 - Konkurrenz mit Droge um das Binden an die antigene Stelle von Ab&sub1;).
- Auf ähnliche Weise wurde der Überstand von THC-AIC-10-4 auch unter konstanten Antikörper- und Konjugat-Konzentrationen dem Immunkomplex-ELISA unterzogen, um die Abhängigkeit der AIC-Antwort von THC zu zeigen. Die Ergebnisse dieses Experiments in Fig. 4 zeigten einen Anstieg der Bindung von THC-AIC-10-4 an das THC-2-57- HRP-Konjugat allein aufgrund einer Zunahme der Konzentration von THC.
- Um die Spezifität zu demonstrieren, die durch das AIC-System vermittelt wird, wurde das Experiment in Fig. 4 mit dem Carboxylat- Metaboliten von Δ&sup9;-THC (Δ&sup9;-THC-COOH) wiederholt. Obwohl der erste Antikörper THC-COOH bindet, kann der AIC-Antikörper diesen Komplex nicht erkennen. Deshalb tritt keine nachweisbare Bindung des Δ&sup9;-THC- COOH:THC-2-57-HRP-Konjugat-Komplexes durch den AIC-Antikörper auf den ELISA-Platten unter Bedingungen auf, bei denen der Δ&sup9;-THC:THC-2- 57-HRP-Komplex eine starke Antwort ergibt. Dieses Beispiel zeigt klar die Fähigkeit des AIC-Systems, bei monoepitopen Antigenen für eine vergrößerte Spezifität zu sorgen und störende Wechselwirkung von Molekülen oder Metaboliten mit verwandter chemischer Struktur zu verhindern (siehe Fig. 5).
- Dieses Experiment zeigt das Prinzip der Konstruktion eines Immunassays für ein kleines Antigen, speziell ein Hapten, unter Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern und des Anti-Immunkomplex-Konzepts.
- Zusätzliche Experimente zeigen, daß THC-AIC-10-4 THC nicht erkennt oder sich direkt daran oder an gewöhnliche Protein-Konjugate von THC bindet, wie durch ELISA unter Verwendung von THC-Meerrettichperoxidase als Plattenbeschichtung bestimmt. Stattdessen zeigt der monoklonale Antikörper THC-AIC-10-4 spezifisch eine verstärkte Bindung an einen monoklonalen Antikörper, THC-2-57, wenn ein derartiger Antikörper an sein Antigen, Δ&sup9;-THC, gebunden ist. Diese vergrößerte Spezifität von THC-AIC-10-4 für THC-2-57, das mit THC komplexiert ist, wird als Anti-Immunkomplex-Aktivität bezeichnet.
- 50 ul pro Vertiefung einer 1:400 Verdünnung von affinitätsgereinigtem Kaninchen-Anti-Maus-IgG-, -IgA-, -IgM-Antiserum (Zymed Katalog Nr. 61-6400 mit 1 mg/ml) wurde zu EIA-Costar-Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, die dann in einem feuchten Inkubator bei 37ºC inkubiert wurden.
- Vor Verwendung wurden die Platten dreimal mit ELISA-Waschpuffer (0,01 M NaH&sub2;PO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,0290 NaN&sub3;, 0,05% Tween, pH 7,2) gewaschen. 50 ul pro Vertiefung Probe (Ab&sub2;) wurden dazugegeben und wie im vorigen Schritt inkubiert. Dann wurden 50 ul pro Vertiefung Blocker-IgG&sub1; (dies war eine 1:100 Verdünnung einer 50%-igen gesättigten (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Fällung von Aszites-Flüssigkeit aus einer nichtrelevantes IgG&sub1; sezernierenden Hybridom-Zellinie) zu jeder Vertiefung gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses nicht-relevante IgG&sub1; wurde benötigt, um alle nicht gebundenen Stellen der Kaninchen-Anti-IgG&sub1;-Plattenbeschichtung abzusättigen, um zu verhindern, daß sich die Plattenbeschichtung an den IgG&sub1;-Teil des Ab&sub1;-HRP-Konjugats bindet und ein falsches positives Signal ergibt.
- Als nächstes wurden ohne Waschen der Platte 50 ul pro Vertiefung optimiertes Ab&sub1;-HRP-Konjugat zugegeben (Ab&sub1; ist ein monoklonaler Maus-Antikörper, der für THC spezifisch ist). Ein Satz von Wiederholungsplatten erhielt nur das Ab&sub1;-HRP-Konjugat plus eine 1:2000 Verdünnung von 1,0 mg/ml Vorrats-THC in Ethanol. Die Platten wurden wieder 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Die Platten wurden schließlich fünfmal unter Verwendung von ELISA-Waschpuffer gewaschen, und 100 ul pro Vertiefung Substrat (0,1 M Citrat, pH 4,2, 1,0 mg/ml ABTS, 1:1000 Verdünnung von 30%- igem H&sub2;O&sub2;) wurden zu jeder Platte gegeben. Als sich genügend Farbe entwickelt hatte, wurde die Absorbanz bei 414 nm gemessen.
- Die Hybrid-Zellinien THC-2-57 und THC-AIC-10-4 wurden bei der American Type Culture Collection (A.T.T.C.), 12301 Park Lawn Drive, Rockhill, Maryland 20852, am 25. September 1986 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern HB 9214 bzw. HB9213.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der eine
Bindungsaffinität zu einem Immunkomplex eines
monoepitopen Antigens und eines ersten Antikörpers gegen das
besagte Antigen aufweist, wobei die Bindungsaffinität
wesentlich größer als die Bindungsaffinität zu dem
besagten Antigen außerhalb des Immunkomplexes oder zu
dem ersten Antikörper gegen das besagte Antigen
außerhalb des Immunkomplexes ist, umfassend die Stufen:
Herstellung eines Affinitäts-markierten Immunkomplexes
des Antigens und eines ersten Antikörpers gegen das
besagte Antigen, in welchem Komplex das Antigen und der
erste Antikörper kovalent gebunden sind und der erste
Antikörper ein vollständiges und unmodifiziertes
Immunglobulin ist, und
Immunisieren eines Wirts mit dem besagten
Affinitätsmarkierten Immunkomplex, wobei der Wirt vorzugsweise ein
Tier ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der erste Antikörper
ein monoklonaler Antikörper ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in dem der
hergestellte Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, in dem der hergestellte
monoklonale Antikörper isoliert wird, um ihn von anderen
Proteinen und anderen kontaminierenden Stoffen zu
befreien.
5. Monoklonaler Antikörper, der eine Bindungsaffinität zu
einem Immunkomplex eines monoepitopen Antigens und eines
ersten Antikörpers gegen das Antigen aufweist, die
wesentlich größer ist als die Bindungsaffinität des
besagten monoklonalen Antikörpers zu dem besagten
Antigen außerhalb des besagten Immunkomplexes, worin der
besagte monoklonale Antikörper AIC 10-4, erhältlich von
der Hinterlegung ATTC HB 9213, ist.
6. Verfahren zur Bestimmung eines monoepitopen Antigens mit
einem Molekulargewicht von weniger als 1500 in einer
Probe, von der man annimmt, daß sie das Antigen enthält,
wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Bilden eines Immun-Sandwich-Komplexes, umfassend:
besagtes Antigen oder ein Analogon desselben, einen
ersten monoklonalen Antikörper, der an das Antigen
bindet, und einen zweiten monoklonalen Antikörper, der
eine Bindungsaffinität zu einem Immunkomplex des
besagten Antigens und des besagten Antikörpers gegen das
besagte Antigen aufweist, welche wesentlich größer ist
als die Bindungsaffinität zu dem besagten Antigen
außerhalb des besagten Immmunkomplexes oder zu dem
besagten Antikörper außerhalb des Immunkomplexes, und
Nachweisen des Immun-Sandwich-Komplexes, dessen Menge
die Menge des besagten Antigens in besagter Probe
anzeigt;
wobei diese Stufen der Herstellung des zweiten
Antikörpers durch ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche
1-4 folgen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem mindestens einer der
besagten Antikörper mit einem Mitglied der Gruppe
markiert ist, die aus Enzymen, Fluoreszenzfarbstoffen,
Chemilumineszenzfarbstoffen, Coenzymen, dispergierbaren
festen Teilchen, Liposomen, Radioisotopen, magnetischen
Teilchen und festen Trägern besteht.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei es sich bei dem
besagten zweiten monoklonalen Antikörper um AIC 10-4,
erhältlich von der Hinterlegung ATTC HB 9213, handelt.
9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, in dem der
Antikörper ein(e) Arzneistoff/Droge ist.
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