DE60131075T2

DE60131075T2 - Durch freisetzung in geschlossener, zirkulärer form aus einer grösseren nukleotidsequenz charakterisiertes konstrukt, welches die ortsspezifische und/oder entwicklungsspezifische, regulierte expression selektierter, genetischer sequenzen erlaubt

Info

Publication number: DE60131075T2
Application number: DE60131075T
Authority: DE
Inventors: James Langham Anstead DALE; Benjamin Milton DUGDALE; Greg John Manly West HAFNER; Scott Richard Strathpine HERMANN; Douglas Kenneth Alderley BECKER; Srimek Muang 7400 Samut CHOWPONGPANG; Robert Maxwell Highgate Hill HARDING
Original assignee: University of Queensland UQ; Queensland University of Technology QUT
Current assignee: University of Queensland UQ; Queensland University of Technology QUT
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2008-07-31
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: US20110119782A1; KR20030047880A; CA2404471C; EP1282697B1; BR0109522A; CA2404471A1; US8829170B2; US20040121430A1; JP4797141B2; CN1426465A; MXPA02009339A; EP1282697A1; PT1282697E; AP1645A; DE60131075D1; AP1440A; ES2296736T3; ATE376589T1; BRPI0109522B8; AU4393901A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Konstrukte und insbesondere genetische Konstrukte, die Polynucleotidsequenzen umfassen, die zur Freisetzung in kovalent geschlossener, zirkulärer Form aus einer größeren Nucleotidsequenz, beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, dem Genom einer eukaryotischen Zelle, fähig sind. Vorzugsweise wird eine Polynucleotidsequenz, sobald sie freigesetzt ist, in einer Form rekonstituiert, die die Expression der Polynucleotidsequenz gestattet. In einer Ausführungsform umfasst die rekonstituierte Polynucleotidsequenz eine Codiersequenz, in die ein vollständiges Fremdnucleotid oder ein Teil desselben, beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine Intronsequenz oder ein anderes Spleißsignal, eingefügt ist. Die Expression und insbesondere Transkription der Codiersequenz umfasst das Herausspleißen der Fremdsequenz. Gemäß dieser Ausführungsform kann die Codiersequenz für ein Peptid, Polypeptid oder Protein, ein Antisense- oder Sense-Nucleinsäuremolekül oder ein Ribozym codieren. In einer anderen Ausführungsform umfasst die rekonstituierte Polynucleotidsequenz eine Fremdpolynucleotidsequenz, die zwischen einem Promotorelement und einer Codiersequenz lokalisiert ist. In dieser Ausführungsform wird die Expression der Codiersequenz durch das Vorhandensein der Fremdsequenz nicht wesentlich nachteilig beeinflusst. In einer noch weiteren Ausführungsform bildet die rekonstituierte Sequenz einen RNA-Promotor oder eine andere regulatorische Gensequenz, die die Fremdsequenz umfasst, die die Funktion des Promotors nicht beeinflusst. Die Freisetzung und Zirkularisation erfolgt generell als Reaktion auf einen Stimulus, beispielsweise einen proteinvermittelten Stimulus. Insbesondere ist das Protein ein von Viren oder Prokaryoten oder Eukaryoten abgeleitetes Protein oder ein entwicklungsmäßig und/oder gewebespezifisches reguliertes Protein. Das Konstrukt der vorliegenden Erfindung ist insbesondere günstig zum Verleihen genetischer Resistenz gegenüber Pathogenen oder zur Induktion von Apoptose oder anderen Zelltodmechanismen, die beispielsweise bei der Behandlung von Krebs verwendbar sind, oder zur Induktion von männlicher oder weiblicher Sterilität bei Pflanzen. Die Konstrukte ermöglichen daher eine ortsspezifische Expression und/oder entwicklungsmäßig regulierte Expression ausgewählter Gensequenzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die zunehmende Verfeinerung der Gentechnik ermöglicht in hohem Maße Forschung und Entwicklung in einem Bereich von technologischen Gebieten, wie der Medizin-, Gartenbau- und Agrarindustrie. Von spezieller Bedeutung ist die Nutzung von natürlich auftretenden genetischen Mechanismen in beispielsweise Pathogenen zur Induktion von verwendbaren phänotypischen Änderungen in Zellen, wie Pflanzenzellen. Dies ist besonders offensichtlich auf dem Gebiet des Gartenbaus in Bezug auf Mechanismen zur Induktion von Resistenz gegenüber einer Reihe von Pflanzenpathogenen bei Pflanzen.
Es gibt beträchtliche Fortschritte in der Entwicklung von Virusresistenz bei Feldfrüchten, beispielsweise durch Transformation mit Transgenen, die von den Zielviren stammen. Die erfolgreichste Verwendung von Transgenen gelang mit RNA-Pflanzenviren. Jedoch waren, trotz einer Zahl von Versuchen zur Bekämpfung von Pflanzenviren mit einsträngiger DNA (ssDNA) durch transgene Resistenz, Strategien, die für RNA-Pflanzenviren erfolgreich waren, für ssDNA-Pflanzenviren nicht ebenso wirksam. DNA-Pflanzenviren und insbesondere die Pflanzenviren mit einsträngiger DNA (ssDNA) sind für signi fikante wirtschaftliche Verluste in einer langen Reihe von Obst-, Gemüse-, Getreide- und Faserfeldfrüchten in den Tropen und Subtropen verantwortlich.
Es gibt zwei Gruppen von ssDNA-Viren, die Pflanzen infizieren. Diese sind die Geminiviridae und die vor kurzen beschriebene Nanovirusgruppe. Mitglieder der Geminiviridae besitzen paarige Virionen und entweder ein einteiliges oder zweiteiliges zirkuläres ssDNA-Genom. Jedes Molekül weist eine Länge von 2,7 kb auf. Von den Gattungen der Geminiviridae sind die Begomoviren und die Mastriviren die bedeutendsten. Die Begomoviren werden von Weißen Fliegen übertragen und weisen entweder einteilige oder zweiteilige Genome auf. Mitglieder dieser Gattung umfassen einige der wirtschaftlich verheerendsten Viren der modernen Landwirtschaft, wie das Tomato (Yellow) Leaf Curl Virus (das aus einer Reihe von verschiedenen Viren besteht, die in sehr vielen tropischen und subtropischen Regionen verbreitet sind), das Afrikanische Cassavamosaik-Virus (Afrika), Bean Golden Mosaic Virus (Süd- und Zentralamerika), Mungbean Yellow Mosaic Virus (Indien) und Cotton Leaf Curl Virus (Süd- und Südostasien). Die Auswirkung von vielen der Begomoviren nahm infolge der weit verbreiteten Einführung des aggressiven "B-Biotyps" des Weiße-Fliegen-Vektors Bemesia tabaci in den letzten Jahren dramatisch zu. Die Mastreviren hatten eine geringere Auswirkung auf die Landwirtschaft, sie sind jedoch für signifikante Verluste bei einigen Feldfrüchten verantwortlich. Diese Viren werden durch die Zwergzikaden übertragen und weisen einteilige Genome auf. Mitglieder dieser Gattung umfassen das Maize Streak Virus (Afrika), Weizenverzwergungsvirus (Europa) und Tobacco Yellow Dwarf Virus (Australien).
Die Nanoviren weisen isometrische Virionen und Genome mit zirkulärer ssDNA auf, jedoch sind diese Genome mehrkompo nentig mit mindestens sechs verschiedenen integralen Genomkomponenten, von denen jede etwa 1 kb beträgt. Diese Viren werden von Blattläusen übertragen, mit Ausnahme eines vermutlichen Nanovirus, des Coconut Foliar Decay Virus, der von einer Buckelzirpe übertragen wird und nur aus Vanuatu berichtet wurde. Das wirtschaftlich wichtigste Nanovirus ist das Banana Bunchy Top Virus (BBTV), das in den 1920er Jahren die australische Bananenindustrie nahezu zerstörte und ziemlich große Verluste im Südpazifik, in Asien und Afrika verursachte. Das Subterranean Clover Stunt Virus (Australien), Faba Bean Necrotic Yellows Virus (Mittelmeer) und Coconut Foliar Decay Virus (Vanuatu) verursachen alle signifikante Ertragsverluste.
Die Genomorganisation der Begomoviren, der Mastreviren und der Nanoviren weisen signifikante Unterschiede auf, die die Zahl und Größe der Genomkomponenten und die Zahl und Größe der Gene, die Prozessierung der Transkripte, die Orientierung der Gene und dgl. umfassen. Es bestehen jedoch beträchtliche Ähnlichkeiten, die nahe legen, dass diese Viren sehr ähnliche Replikations- und Infektionsstrategien aufweisen. Alle Gemini- und Nanoviren codieren für (i) ein Rep-Protein, das Strangbruch- und Verbindungsaktivität aufweist und eine Rolling-Circle-Replikation des Virusgenoms dirigiert; (ii) ein Virionhüllprotein; (iii) ein Protein, das an der Bindung von Wirtszellen-Retinoblastom-ähnlichen Proteinen, die dazu führt, dass die Zelle in die S-Phase gelangt, beteiligt ist; (iv) ein Protein zur Bewegung von Zelle zu Zelle und (v) ein nukleäres Shuttle-Protein. Ferner weisen die Viren funktional ähnliche intergenische Regionen (IR) auf. Beispielsweise enthalten die IR von Begomoviren, die LIR von Mastreviren und die CR-SL des Banana Bunchy Top Nanovirus alle (i) eine Stamm/Schleife-Struktur, deren Nonanucleotid-Schleifensequenz zwischen allen Gemini- und Nanoviren hoch konserviert ist und der Ort des Strangbruchs und der Ligation durch das Rep-Protein ist; und (ii) eine Domäne innerhalb dieser Region, die das Rep-Protein erkennt. Die SIR der Mastreviren und die CR-M des Banana Bunchy Top Nanovirus sind der Ort der Bindung eines endogenen Primers, der für den Start der Umwandlung von Virion-ssDNA in transkriptional aktive dsDNA verantwortlich ist.
Der Erfolg im Hinblick auf die Entwicklung transgener Resistenz gegenüber RNA-Viren in Feldfrüchten und der zunehmende Bedarf an einer derartigen Resistenz gegenüber ssDNA-Viren führte zur Untersuchung einer langen Reihe von Strategien für ssDNA-Viren mit Zielrichtung auf verschiedene Virusgene, die das Hüllproteingen, Bewegungsproteingen und das Rep-Proteingen umfassen. Ferner wurden Strategien unter Verwendung defekter störender DNAs und eines Suizidgens untersucht. Die meisten Arbeiten in diesem Bereich umfassten eher Begomoviren als Mastre- oder Nanoviren.
Bei den zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten nutzten die Erfinder die Replikationsmechanismen von ssDNA-Viren, um genetische Resistenz in Pflanzen zu induzieren. Jedoch besitzt die vorliegende Erfindung weitreichende Anwendungsmöglichkeiten bei der Modulation genetischer Aktivitäten, wie der Expression von Polynucleotidsequenzen, um einen speziellen Phänotyp als Reaktion auf einen Stimulus zu bewirken.
RG Atkinson, LRF Bieleski, AP Gleave, B-J Janssen, BAM Morris (1998) Post transcriptional silencing of chalcone synthase in petunia using a gemini virus-based episomal vector. The Plant Journal 15 (5): 593–604, offenbart einen episomalen Vektor, der die im folgenden angegebenen Elemente enthält, die von dem Geminivirus Tobacco Yellow Dwarf Virus stammen: zwei Kopien einer LIR, die sowohl eine SIR als auch zwei offene Leseraster komplementärer Richtung C1 und C2, die Rep produzieren, flankieren. Die Expression des Rep-Proteins steht unter der Transkriptionskontrolle durch deren nativen Promotor innerhalb der LIR; ferner wird offenbart, dass transgene Petunia-Hybridpflanzen, die ein durch den CaMV 35S-Promotor angetriebenes Chalconsynthase-A-Gen in den episomalen Vektor kloniert enthalten, Freisetzung und episomale Replikation der Viruselemente des Vektors und des Chalconsynthase-A-Gens zeigen.
PD Needham, RG Atkinson, BAM Morris, RC Gardener, AP Gleave (1998) GUS expression patterns from tobacco yellow dwarf virus-based episomal vector. Plant Cell Reports 17: 631–639, offenbart einen binären Vektor, der die folgenden Elemente enthält, die von dem Tobacco Yellow Dwarf Virus stammen: zwei Kopien einer LIR, flankierend eine SIR und zwei offene Leseraster in komplementärer Richtung (C1 und C2), die ein Intron enthalten, die bei der Prozessierung ein Protein (Rep) produzieren, das das einzige zur Virusreplikation notwendige Virusprotein ist. Dieser Vektor umfasst keine offenen Leseraster mit Codierung für das vermutliche Bewegungsprotein (V1) und Hüllprotein (V2). Ferner wird offenbart, dass mit diesem Vektor transformierte Tabakpflanzen des weiteren ein Reportergen umfassen, Freisetzung und episomale Replikation der Viruselemente des Vektors und Expression des Reportergens zeigen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Durchgängig in dieser Beschreibung sollen, wenn der Zusammenhang dies nicht anders erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfassend" so verstanden werden, dass impliziert wird, dass ein angegebenes Element oder eine ganze Zahl oder eine Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen eingeschlossen ist, jedoch ein beliebiges anderes Element oder eine beliebige andere ganze Zahl oder Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen nicht ausgeschlossen ist.
Nucleotid- und Aminosäuresequenzen werden durch eine Sequenzidentifizierungsnummer (SEQ ID NO:) bezeichnet. Die SEQ ID NOs entsprechen zahlenmäßig den Sequenzidentifizierungszeichen <400>1, <400>2 und dgl. Ein Sequenzprotokoll ist nach den Ansprüchen angegeben.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Konstrukt bereit, das ein genetisches Element umfasst, das operabel von Nucleotidsequenzen flankiert ist, die von einem von einem Virus abgeleiteten, die Replikation erleichternden Protein erkannt werden können, wenn sie in das Genom einer eukaryotischen Zelle integriert sind, wobei das von einem Virus abgeleitete, die Replikation erleichternde Protein das Ausschneiden und Zirkularisieren des genetischen Elements und der gesamten flankierenden Nucleotidsequenzen oder eines Teils der flankierenden Nucleotidsequenzen erleichtert und wobei die Nucleotidsequenzen die durch das von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein erkannt werden, können sich angrenzend zu einer oder mehreren, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassenden Fremdsequenzen befinden oder in eine oder mehrere, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassende Fremdsequenzen eingefügt sind, wobei das genetische Element und die anderen Nucleotidsequenzen in einer nichtzirkulären Form zwei modulare Nucleotidsequenzen umfassen, die beim Zirkularisieren eine genetische Sequenz bilden, die eine Eigenschaft oder eine Fähigkeit zum Zeigen einer Eigenschaft, die in den zwei modularen Nucleotidsequenzen vor der Zirkularisierung oder vor der Zirkularisierung und Expression fehlt, zeigt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Konstrukt bereit, das ein genetisches Element umfasst, das von Rep-Proteinerkennungssequenzen flankiert ist, die die Erzeugung einer zirkulären Nucleotidsequenz, die das genetische Element umfasst, in Gegenwart eines Rep-Proteins erleichtern, wobei die Rep-Proteinerkennungssequenzen sich benachbart zu einem oder mehreren Spleißsignalen befinden oder in eines oder mehrere Spleißsignale eingefügt sind, wobei das genetische Element eine Polynucleotidsequenz umfasst, die operabel mit Regulatorsequenzen verknüpft ist, die erforderlich sind, um eine Expression der Polynucleotidsequenz zu erlauben, wenn das genetische Element in einem zirkularisierten Molekül enthalten ist, wobei das genetische Element in linearer Form in 5'→3'-Reihenfolge die folgenden Bestandteile umfasst: eine Polynucleotidsequenz und Regulatorsequenzen, die eine Expression der Polynucleotidsequenz bei Vorliegen in zirkulärer Form erlauben; derart, dass bei Zirkularisieren das genetische Element die Regulatorsequenz umfasst, die von der Polynucleotidsequenz durch die gesamte Rep-Proteinerkennungssequenz oder ein Teil der Rep-Proteinerkennungssequenz getrennt ist, wobei bei Expression die Polynucleotidsequenz für ein Expressionsprodukt codiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Konstrukt bereit, das in 5'→3'-Reihenfolge erste, zweite, dritte, vierte, fünfte und sechste Nucleotidsequenzen umfasst, wobei:
die ersten und sechsten Nucleotidsequenzen gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Rep-Proteinerkennungssequenz mit der Fähigkeit von einem oder mehreren Rep-Proteinen derart erkannt zu werden, dass das durch die ersten und sechsten Sequenzen, die die gesamten ersten und sechsten Sequenzen oder einen Teil der ersten und sechsten Sequenzen umfassen, wenn das Konstrukt in einer größeren Nucleotidsequenz wie einer Genomsequenz integriert ist, flankierte genetische Material ausgeschnitten und zirkulari siert werden kann, wenn die Rep-Proteinerkennungssequenzen sich benachbart zu einer oder mehreren, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder Spleißsignale umfassenden Fremdsequenzen befinden oder in eine oder mehrere, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassende Fremdsequenzen eingefügt sind, umfassen;
die zweite Nucleotidsequenz einen 3'-Bereich einer Polynucleotidsequenz umfasst;
die dritte Nucleotidsequenz ein Transkriptionsterminator oder ein funktionales Derivat oder Homolog hiervon ist, das mit der zweiten Sequenz operabel verknüpft ist;
die vierte Nucleotidsequenz eine Promotorsequenz ist, die mit der fünften Nucleotidsequenz operabel verknüpft ist; und
die fünfte Nucleotidsequenz ein 5'-Bereich einer Polynucleotidsequenz ist, wobei die 5'- und 3'-Bereiche der Polynucleotidsequenz eine vollständige Codiersequenz der Polynucleotidsequenz darstellen;
wobei in Gegenwart von einem oder mehreren Rep-Proteinen bei Integration des Konstrukts in eine größere Nucleotidsequenz wie eine Genomsequenz eine zirkularisierte genetische Sequenz getrennt von der größeren Nucleotidsequenz erzeugt wird, die in dieser Reihenfolge die Promotorsequenz, die operabel mit einer Polynucleotidsequenz verknüpft ist, die die gesamte Fremdsequenz oder das gesamte andere Spleißsignal oder einen Teil der Fremdsequenz oder des anderen Spleißsignals, umfasst, die gesamte erste und/oder sechste Nucleotidsequenz oder einen Teil der ersten und/oder sechsten Nucleotidsequenz umfasst, und eine Transkriptionsterminatorsequenz umfasst.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein genetisches Element zur Verwendung bei der Erzeugung eines Konstrukts gerichtet, wobei das genetische Element in 5'→3'-Richtung einen 3'-Bereich einer operabel mit einem Transkriptionsterminator verknüpften Polynucleotidsequenz, einen operabel mit einem 5'-Bereich einer Polynucleotidsequenz verknüpften Promotor, wobei bei Zirkularisierung der 5'-Bereich der Polynucleotidsequenz operabel mit dem 3'-Bereich der Polynucleotidsequenz, die durch eine ganze Fremdsequenz oder Intronsequenz oder ein anderes Spleißsignal oder einen Teil einer Fremdsequenz oder Intronsequenz oder eines anderen Spleißsignals getrennt ist, verknüpft wird, umfasst.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Konstrukt bereit, das die Nucleotidsequenz gemäß Darstellung in SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder eine Nucleotidsequenz mit einer 60%-igen Identität zu jeder von SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder eine Nucleotidsequenz mit der Fähigkeit zur Hybridisierung an eine oder mehrere von SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder eine komplementäre Form hiervon unter niedrigstringenten Bedingungen bei 42°C umfasst.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet ein Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze oder eines Nachkommens hiervon mit Resistenz gegenüber einem ssDNA-Virus, wobei das Verfahren das Einführen eines Konstrukts in das Genom der Pflanze umfasst, wobei das Konstrukt in 5'→3'-Reihenfolge eine Rep-Proteinerkennungssequenz, die sich benachbart zu oder in einer Intronsequenz oder einem anderen Spleißsignal befindet, einen 3'-Endbereich einer Polynucleotidsequenz, einen Transkriptionsterminator, eine Promotorsequenz, die mit einem 5'-Endbereich der Polynucleotidsequenz operabel verknüpft ist, wobei die 5'- und 3'-Bereiche der Polynucleotidsequenz den Codierbereich eines Peptids, Polypeptids oder Proteins mit der Fähigkeit zur Induktion von Zelltod oder eines Schlafzustands darstellen, und gleiche oder unterschiedliche Rep-Proteinerkennungssequenzen umfasst, wobei bei Infektion der Pflanzen zellen durch ssDNA-Virus, das ein Rep-Protein mit der Fähigkeit zur Erkennung der flankierenden Rep-Proteinerkennungssequenzen aufweist, das Konstrukt ausgeschnitten wird und zirkularisiert, wodurch die Polynucleotidsequenz in einer Form wiederhergestellt wird, die zu einem Peptid, Polypeptid oder Protein exprimiert wird, das die Pflanzenzelle tötet oder die Pflanzenzelle in einen Schlafzustand versetzt.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Konstrukt bereit, das ein genetisches Element, das von Rep-Proteinerkennungssequenzen flankiert ist, die die Erzeugung einer das genetische Element umfassenden zirkulären Nucleotidsequenz in Gegenwart eines Rep-Proteins oder dessen funktioneller Derivate oder Homologe erleichtern, umfasst, wobei die Rep-Proteinerkennungssequenzen sich benachbart zu oder eingefügt in eine oder mehrere Fremdsequenzen, die Intronsequenzen oder Teile hiervon oder ein anderes Spleißsignal umfassen, befinden, wobei das genetische Element einen 3'-Bereich und einen 5'-Bereich eines durch eine Länge einer Nucleotidsequenz getrennten Promotors umfasst, um im wesentlichen das Funktionieren des Promotors zu verhindern, wobei das genetische Element in linearer Form in 5'→3'-Reihenfolge die folgenden Bestandteile umfasst:
einen 3'-Bereich des Promotors;
optional eine Polynucleotidsequenz, die operabel mit dem 3'-Bereich des Promotors verbunden ist, und
einen 5'-Bereich des Promotors,
derart, dass beim Zirkularisieren das genetische Element die 5'- und 3'-Bereiche der Promotorsequenz umfasst, die von der gesamten Rep-Proteinerkennungssequenz und/oder Intronsequenzen oder einem anderen Spleißsignal oder einem Teil einer Rep-Proteinerkennungssequenz und/oder von Intronsequenzen oder einem anderen Spleißsignal getrennt sind, wobei jedoch nicht die Aktivität des Promotors inaktiviert ist, wobei das zirkuläre Molekül optional ferner den Promotor umfasst, der mit der Polynucleotidsequenz operabel verknüpft ist.
Der Promotor kann ein DNA-Promotor oder ein RNA-Promotor sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Diagrammdarstellung von pTBN.
2 ist eine Diagrammdarstellung von pTBN6.
3 ist eine Diagrammdarstellung von pTBN1.
4 ist eine Diagrammdarstellung von pRTBN6.
5 ist eine Diagrammdarstellung von pRTBN1.
6 ist eine Diagrammdarstellung von pRTBN1/6.
7 ist eine schematische Darstellung des Plasmids p35S-2301.
8 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pTEST1.
9 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pTEST2.
10 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pTEST3.
11 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pTEST4.
12 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pBI- TYDV1.1mer.
13 ist eine schematische Darstellung des Plasmids p35S-Rep.
14 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Zelltodassays unter Verwendung von Expressionsvektoren. Die Fehlerbalken zeigen 95%-Konfidenz-Intervalle.
15 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Rezirkularisation-Zelltodassays unter Verwendung von Expressionsvektoren. Die Fehlerbalken zeigen 95%-Konfidenz-Intervalle.
16 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse des Assays für induzierbaren Rezirkularisation-Zelltod unter Verwendung von Expressionsvektoren. Die Fehlerbalken zeigen 95%-Konfidenz-Intervalle.
17 ist eine schematische Darstellung der Plasmide (A) p35S-BTR-LIR und (B) p35S-BUTR-LIR.
18 ist eine schematische Darstellung der Plasmide (A) p35S-BTR und (B) p35S-BUTR.
19 ist eine schematische Darstellung der Plasmide (A) pBTR.test1 und (B) pBUTRtest1.
20 ist eine Diagrammdarstellung von pGI.
21 ist eine Diagrammdarstellung von pGI6.
22 ist eine Diagrammdarstellung von pGI1.
23 ist eine Diagrammdarstellung von pRGI6.
24 ist eine Diagrammdarstellung von pRGI1.
25 ist eine Diagrammdarstellung von pRGI1/6.
26 ist eine schematische Darstellung eines vorgeschlagenen Modells für Rep-aktivierte Expression von humanem Serumalbumin von dem Plasmid pHSA1.
27 ist eine Diagrammdarstellung eines Konstrukts zur Verwendung bei der Sense/Antisense-Modulation der Genexpression.

Eine Zusammenfassung von Sequenzidentifizierungszeichen wird im folgenden angegeben. ZUSAMMENFASSUNG VON SEQUENZIDENTIFIZIERUNGSZEICHEN

SEQUENZ IDENTIFIZIERUNGSZEICHEN	BESCHREIBUNG
SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 18	Synthetisches Oligonucleotid
SEQ ID NO: 19 bis SEQ ID NO: 44	Primer
SEQ ID NO: 45 bis SEQ ID NO: 52	Synthetisches Oligonucleotid
SEQ ID NO: 66	Barnase-pTBN
SEQ ID NO: 67	Barnase-pTBN6
SEQ ID NO: 68	Barnase-pTBN1
SEQ ID NO: 69	GFP-pGI
SEQ ID NO: 70	GFP-pGI6
SEQ ID NO: 71	GFP-pGI1
SEQ ID NO: 72	Primer
SEQ ID NO: 73	Primer

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung gründet teilweise auf der Erkenntnis, dass ein von einem Virus abgeleitetes, eine Replikation erleichterndes Protein verwendet werden kann, um spezifische Zielsequenzen aus dem Genom einer eukaryotischen Zelle auszuschneiden und zu zirkularisieren. Der Ausdruck "Ausschneiden" umfasst in diesem Fall die Freisetzung und insbesondere replikative Freisetzung von Zielsequenzen. Die von einem Virus abgeleiteten, eine Replikation erleichternden Proteine initiieren den Strangbruch, das Ausschneiden und die Zirkularisation von genetischen Elementen, die von speziellen Sequenzen flankiert werden, die für das von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein spezifisch sind und von diesem erkannt werden. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Derivate der von einem Virus abgeleiteten, erleichternden Proteine und eukaryotische und prokaryotische Homologa derselben. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich daher auf alle Sequenzen, die zur Erleichterung der Spaltung und Ligation von Polynucleotidsequenzen fähig sind und im folgenden als "Erkennungssequenzen" bezeichnet werden können und hierin auch als "Fremdsequenzen" betrachtet werden können. Die Erkennungssequenzen befinden sich angrenzend an Intronsequenzen oder andere Spleißsignale umfassende Fremdsequenzen oder sind in diese eingefügt.
In einer Ausführungsform ermöglicht der Zirkularisationsprozess die Bildung einer speziellen Gensequenz aus zwei modularen Komponenten, die durch eine spleißbare Fremdsequenz getrennt sind, bei der Expression. Vor der Zirkularisation sind die modularen Komponenten genetisch getrennt und daher nicht operabel verknüpft. Die operable Verknüpfung wird günstigerweise beispielsweise in einer Ausführungsform durch die Fähigkeit, dass die die modularen Komponenten umfassende Gensequenz exprimiert wird, gezeigt. Der Ausdruck "exprimiert" umfasst in diesem Fall die Transkription in eine mRNA-Sequenz und optional die Translation der mRNA-Sequenz in ein Translationsprodukt. Die Expression ist jedoch nicht das einzige Kriterium für den Aufbau einer Gensequenz aus modularen Komponenten. In einer anderen Ausführungsform kann die nach der Zirkularisation gebildete Gensequenz andere verwendbare Funktionen aufweisen, die keine Expression erfordern. Beispielsweise kann die gebildete Gensequenz eine Proteinbindungs-Erkennungssequenz umfassen, wodurch eine Zielausrichtung auf spezielle Cytoplasma- oder nukleäre Proteine erfolgt. Alternativ umfasst die rekonstituierte Polynucleotidsequenz eine Fremdsequenz zwischen den Promotorelementen und einer Codiersequenz. Im Falle des ersteren ist der Promotor vorzugsweise ein RNA-Promotor, beispielsweise von einem TMV-, AMV- oder TEV-Virus. Alternativ ist der Promotor ein DNA-Promotor, wobei die Insertion der Erkennung dessen Aktivität nicht wesentlich nachteilig beeinflusst.
Demgemäß stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Konstrukt bereit, das ein genetisches Element umfasst, das operabel von Nucleotidsequenzen flankiert ist, die von einem von einem Virus abgeleiteten, die Replikation erleichternden Protein erkannt werden können, wenn sie in das Genom einer eukaryotischen Zelle integriert sind, wobei das von einem Virus abgeleitete, die Replikation erleichternde Protein das Ausschneiden und Zirkularisieren des genetischen Elements und der gesamten flankierenden Nucleotidsequenzen oder eines Teils der flankierenden Nucleotidsequenzen erleichtert und wobei die Nucleotidsequenzen, die durch das von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein erkannt werden, sich angrenzend zu einer oder mehreren, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassenden Fremdsequenzen befinden oder in eine oder mehrere Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassende Fremdsequenzen eingefügt sind, wobei das genetische Element und die anderen Nucleotidsequenzen in einer nichtzirkulären Form zwei modulare Nucleotidsequenzen umfassen, die beim Zirkularisieren eine genetische Sequenz bilden, die eine Eigenschaft oder eine Fähigkeit zum Zeigen einer Eigenschaft, die in den zwei modularen Nucleotidsequenzen vor der Zirkularisierung oder vor der Zirkularisierung und Expression fehlt, zeigt.
Der Ausdruck "Konstrukt" wird in dessen breitestem Sinne verwendet und er umfasst ein Genkonstrukt, ein Nucleinsäuremolekül, einen Vektor, ein Plasmid oder eine beliebige andere Nucleotidsequenz, die mindestens zwei heterologe Sequenzen umfasst. Das Konstrukt ist daher ein rekombinantes Molekül, das technisch derart verändert wurde, dass es zwei oder mehrere Nucleotidsequenzen von verschiedenen genetischen Quellen umfasst. In einer Ausführungsform liegt das Konstrukt in isolierter Form vor. Der Ausdruck "isoliert" umfasst den biologisch reinen, im wesentlichen reinen oder einen anderen Zustand, wobei mindestens eine Reinigungsstufe an einer das Konstrukt umfassenden Probe durchgeführt wurde. Eine "Reinigungsstufe" umfasst beispielsweise eine Ausfällung, Zentrifugation und/oder eine chromatographische oder elektrophoretische Trennung. In einer anderen Ausführungsform ist das Genkonstrukt in das Genom einer Wirtszelle integriert. Das Konstrukt kann Nucleotidsequenzen umfassen, die nach der Integration verloren gegangen sind, entfernt wurden oder umgeordnet wurden. In einer noch weiteren Ausführungsform liegt das Konstrukt in zirkulärer Form vor, die entweder in vitro oder nach Ausschneiden aus dem Genom der Wirtszelle erzeugt wurde.
Der Ausdruck "genetisches Element" wird in dessen breitestem Sinne verwendet und er umfasst eine Reihe von zwei oder meh reren Nucleotidsequenzen, die technisch in einer speziellen Reihenfolge in Bezug auf die 5'→3'- oder 3'→5'-Orientierung des genetischen Elements technisch gebildet wurden. Kurz gesagt umfasst das genetische Element zwei Nucleotidsequenzen in modularer Form. Der Ausdruck "modular" soll keine Beschränkung der Konstruktion oder Struktur der Nucleotidsequenzen bedeuten, sondern er betont nur, dass eine einzelne Gensequenz in zwei Komponenten, d. h. modulare Komponenten, geteilt ist. Bei der Zirkularisation werden die zwei modularen Komponenten zusammen derart ausgerichtet, dass sie nach dem Entfernen etwaiger Fremdsequenzen, die Intron- und Spleißsequenzen oder andere Erkennungssequenzen umfassen, eine einzige Gensequenz bilden, die eine spezielle Aktivität oder Eigenschaft zeigt, die nicht vorhanden ist, wenn die Gensequenz in getrennter modularer Form vorliegt. Unter bestimmten Umständen kann die Entfernung von Fremdsequenzen, die zwischen den zwei modularen Komponenten liegen, wenn die zirkuläre Form vorliegt, nicht notwendig sein, wenn deren Vorhandensein die Funktion der modularen Komponenten nicht wesentlich nachteilig beeinflusst, wenn diese in der richtigen Orientierung in Bezug aufeinander nach der Zirkularisation zusammengebaut sind. Generell werden die modularen Komponenten als 5'-Bereiche und 3'-Bereiche einer Polynucleotidsequenz bezeichnet. Ein Bereich umfasst einige wenige Nucleotide (d. h. von etwa 2 bis etwa 500) bis viele Nucleotide (d. h. von etwa 501 bis etwa 10000). Die 5'- und 3'-Bereiche können einen zentralen Bereich umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das genetische Element, wenn dieses in zirkulärer Form vorliegt, einen Promotor, der operabel mit der die zwei modularen Sequenzen umfassenden Gensequenz verknüpft ist. Die zwei modularen Sequenzen können durch eine Intronsequenz, ein Spleißsignal oder eine andere Erkennungssequenz getrennt sein. Das genetische Element umfasst daher in linearer Form in der 5'→3'- Richtung eine erste modulare Nucleotidsequenz, die den 3'-Bereich einer Polynucleotidsequenz umfasst, eine Promotorsequenz, die operabel mit dem 5'-Bereich der oben genannten Polynucleotidsequenz verknüpft ist. Bei der Zirkularisation wird der 3'-Bereich der Polynucleotidsequenz nun zum 5'-Bereich der Polynucleotidsequenz ausgerichtet und durch Basenverknüpfung mit diesem verbunden, wodurch eine operabel mit einem Promotor verknüpfte funktionale Polynucleotidsequenz rekonstituiert wird. In Abhängigkeit von dem Konstrukt kann eine Intronsequenz, ein Spleißsignal oder eine andere Erkennungssequenz die 5'- und 3'-Bereiche der rekonstituierten Polynucleotidsequenz trennen. Bei der Prozessierung während der Expression kann die Intronsequenz, das Spleißsignal oder eine andere Erkennungssequenz ausgeschnitten werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das genetische Element eine Transkriptionsterminatorsequenz, die operabel mit dem 3'-Bereich der Polynucleotidsequenz verknüpft ist und sich strangabwärts zu diesem befindet. Ausdrücke wie "Promotor" und "Terminator" werden in deren breitestem Sinne verwendet und sind im folgenden detaillierter beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform codiert die rekonstituierte Polynucleotidsequenz für ein Intron, ein Spleißsignal oder eine andere Erkennungssequenz, die zwischen dem Promotorelement und der Codiersequenz lokalisiert ist. Gemäß dieser Ausführungsform wird die Erkennungssequenz während der Transkription nicht entfernt.
In einer noch weiteren alternativen Ausführungsform umfasst das genetische Element zwei modulare Komponenten eines Promotors und einer anderen regulatorischen Sequenz. Vorzugsweise bilden die modularen Komponenten nach der Zirkularisation eine Promotorsequenz. Wenn eine Intronsequenz, ein Spleißsignal oder eine andere Erkennungssequenz die modula ren Komponenten einer Promotorsequenz trennt, dann zerstört eine derartige Sequenz die Aktivität der Promotorsequenz nicht oder partiell nicht. Alternativ ist der Promotor ein RNA-Promotor, wie ein Promotor von TMV, AMV oder TEV.
Die Polynucleotidsequenz zeigt, wenn sie rekonstituiert ist, eine Aktivität oder Eigenschaft oder Fähigkeit, eine Aktivität oder Eigenschaft zu zeigen, die in den getrennten modularen Nucleotidsequenzen vor der Fusion nicht vorhanden ist, nach der Zirkularisation. Eine derartige Aktivität oder Eigenschaft umfasst die Fähigkeit zur Codierung für ein Peptid, Polypeptid oder Protein mit einer speziellen Funktion, die Fähigkeit zur Codierung für eine mRNA-Sequenz, die anschließend in ein Peptid, Polypeptid oder Protein translatiert werden kann oder die als Antisense- oder Sense-Molekül zur Herabregulation eines Wirtsgens oder einer anderen Gensequenz oder als Promotor oder andere regulatorische Sequenz wirken kann. Eine andere Eigenschaft, die bei Gensequenzen betrachtet werden kann, umfasst die Fähigkeit zur Bindung an ein Protein zur Interaktion mit nukleären regulatorischen Sequenzen oder zur Wirkung auf oder Codierung für Ribozym- und/oder Desoxyribozymmoleküle.
Von spezieller Bedeutung ist, dass die Gensequenz für Proteine mit enzymatischer Aktivität, regulatorischer Aktivität oder struktureller Aktivität codieren kann oder therapeutische Aktivität zeigen kann, wenn sie an Säuger, wie Menschen oder Nutztiere, verabreicht wird. Beispiele für die letztere Art von Molekülen umfassen Cytokine, Interferone und Wachstumsfaktoren. Proteine mit enzymatischer Aktivität sind besonders bevorzugt und derartige Proteine sind zur Aktivierung eines biochemischen Pfades, zur Erleichterung des Durchlaufens eines speziellen Pfades für Metaboliten, wodurch eine Eigenschaft wie Resistenz gegenüber einem Insektizid, Fungizid oder Herbizid verliehen wird oder Resis tenz gegenüber einem Pathogen, beispielsweise einem intrazellulären Pathogen, das Viren und intrazelluläre Mikroorganismen umfasst, verliehen wird, verwendbar. Zellen, die als Ziele für das Genkonstrukt der vorliegenden Erfindung betrachtet werden, umfassen Tierzellen, Pflanzenzellen, einzellige Organismen und Mikroorganismen. Tierzellen können von Primaten, Menschen, Nutztieren, Vogelarten, Fischen, Reptilien, Amphibien und Insekten und Spinnentieren stammen. Pflanzenzellen können von Monokotylen und Dikotylen stammen.
In einer besonders günstigen Ausführungsform induziert das durch die Polynucleotidsequenz codierte Peptid, Polypeptid oder Protein Apoptose oder eine andere Form des Zelltods. Dies ist besonders günstig als Mittel zur Erleichterung von genetischer Resistenz gegenüber beispielsweise Viren oder zur Vermittlung von Zelltod spezieller Zellarten.
In einer Ausführungsform wird das Konstrukt beispielsweise zum Ermöglichen von Resistenz gegenüber einem einzelsträngigen DNA (ssDNA)-Virus verwendet. Derartige Viren verursachen beträchtliche Schäden für die Agroindustrie und Gartenbauindustrie durch Infektion wichtiger Feldfrüchte und Schmuckpflanzen. Zwei Gruppen von ssDNA-Viren, die Pflanzen infizieren, sind die Gemini- und Nanoviren.
In einer Ausführungsform sind die flankierenden Sequenzen, die durch ein von einem Virus abgeleitetes, eine Replikation erleichterndes Protein oder dessen Derivaten oder prokaryotischen oder eukaryotischen Zellhomologa erkennbar sind, Stamm/Schleife-Nucleotidstrukturen. Vorzugsweise umfassen die Stamm/Schleife-Strukturen eine kurze Nucleotidsequenschleife von etwa 5 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 15 und noch besser etwa 9 Nucleotiden (d. h. ein Nonnucleotid) und diese ist der Ort des Strangbruchs und der Ligation durch das von einem Virus abgeleitete, eine Repl kation erleichternde Protein oder dessen Derivate oder prokaryotische oder eukaryotische Zellhomologa. In einer anderen Ausführungsform werden die flankierenden Sequenzen durch ein beliebiges Protein mit Spaltungs- und Ligationsaktivität erkannt. Ein Beispiel für ein derartiges Protein ist eine Topoisomerase. Alle diese Sequenzen werden hierin als "Erkennungssequenzen" bezeichnet. Am günstigsten werden die Erkennungssequenzen durch das "Rep"-Protein erkannt. Dieses Protein ist von Mitgliedern der Geminiviridae und Nanoviren abgeleitet und es bindet an eine 5'-Domäne an einer Stamm/Schleife-Struktur, die die Erkennungssequenz umfasst. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung einer Stamm/Schleife-Struktur beschränkt, obwohl eine derartige Verwendung hierin betrachtet wird. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf ein beliebiges REP-Prtein von einem Geminivirus oder Nanovirus sowie Derivate derseben oder Homologa von anderen Viren oder eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen. Beispiele für eukaryotische Zellen umfassen Säuger-, Insekten-, Reptilien-, Amphibien- und Hefezellen.
Beispiele für andere Erkennungssequenzen oder deren Äquivalente umfassen die intergenischen Regionen BBTV DNA 1–6, die kurzen und langen Repeats von TLCV oder TYDV. Eine "Intronsequenz" ist eine Sequenz von Nucleotiden, die nach der Transkription die Fähigkeit, herausgespleißt zu werden, aufweisen. Unter bestimmten Umständen wird die Intronsequenz nicht herausgespleißt, beispielsweise wenn das Vorhandensein der Intronsequenz die Funktion der Sequenz, in die die Intronsequenz insertiert ist, nicht nachteilig beeinflusst.
Das Konstrukt dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung kann die gleichen oder im wesentlichen gleichen Erkennungssequenzen als flankierende Sequenzen, d. h. die durch ein einzelnes Rep-Protein oder dessen Derivate oder Homologa erkennbaren Sequenzen, umfassen oder verschiedene Erkennungssequenzen, die von verschiedenen Rep-Proteinen erkannt werden können, umfassen. Ferner können die Erkennungssequenzen vollständige Sequenzen oder Teilsequenzen, beispielsweise zwei halbe Intronsequenzen, sein.
Das Rep-Protein kann in eine Zelle beispielsweise infolge einer Virusinfektion eingeführt werden oder durch Gensequenzen, die entwicklungsmäßig oder gewebespezifisch in dem Tier oder der Pflanze oder dem Organismus, der das Konstrukt trägt, codiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Konstrukt bereitgestellt, das ein genetisches Element umfasst, das von Rep-Protein-Erkennungssequenzen oder funktionalen Homologa von anderen Viren oder eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen flankiert ist, die die Erzeugung einer das genetische Element umfassenden zirkulären Nucleotidsequenz, in Gegenwart eines Rep-Proteins erleichtern, wobei die Rep-Protein-Erkennungssequenzen sich benachbart zu einem oder mehreren Erkennungssequenzen befinden oder in eine oder mehrere Erkennungssequenzen eingefügt sind, wobei das genetische Element eine Polynucleotidsequenz umfasst, die operabel mit Regulatorsequenzen verknüpft ist, die erforderlich sind, um eine Expression der Polynucleotidsequenz zu erlauben, wenn das genetische Element in einem zirkularisierten Molekül enthalten ist, wobei das genetische Element in linearer Form in 5'→3'-Reihenfolge die folgenden Bestandteile umfasst:
eine Polynucleotidsequenz und Regulatorsequenzen, die eine Expression der Polynucleotidsequenz bei Vorliegen in zirkulärer Form erlauben;
derart, dass bei Zirkularisieren das genetische Element die Regulatorsequenz umfasst, die von der Polynucleotidsequenz durch die gesamte Rep-Proteinerkennungssequenz oder ein Teil der Rep-Proteinerkennungssequenz getrennt ist, wobei bei Expression die Polynucleotidsequenz für ein Expressionsprodukt codiert.
Vorzugsweise enthalten oder umfassen die regulatorischen Sequenzen eine Promotorsequenz und optional einen Transkriptionsterminator. Wie oben angegeben, umfasst eine Erkennungssequenz eine Fremdsequenz, wie eine Intronsequenz oder ein anderes Spleißsignal.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Konstrukt bereitgestellt, das ein genetisches Element umfasst, das von Rep-Proteinerkennungssequenzen flankiert ist, die die Erzeugung einer das genetische Element umfassenden zirkulären Nucleotidsequenz in Gegenwart eines Rep-Proteins erleichtern, wobei die Rep-Proteinerkennungssequenzen sich benachbart zu oder eingefügt in eine oder mehrere Fremdsequenzen, die Intronsequenzen oder Teile hiervon oder ein anderes Spleißsignal umfassen, befinden, wobei das genetische Element einen 3'-Bereich und einen 5'-Bereich eines durch eine Länge einer Nucleotidsequenz getrennten Promotors umfasst, um im wesentlichen das Funktionieren des Promotors zu verhindern, wobei das genetische Element in linearer Form in 5'→3'-Reihenfolge die folgenden Bestandteile umfasst:
einen 3'-Bereich des Promotors;
optional eine Polynucleotidsequenz, die operabel mit dem 3'-Bereich des Promotors verbunden ist, und
einen 5'-Bereich des Promotors,
derart, dass beim Zirkularisieren das genetische Element die 5'- und 3'-Bereiche der Promotorsequenz umfasst, die durch die gesamte Rep-Proteinerkennungssequenz oder einen Teil einer Rep-Proteinerkennungssequenz getrennt sind, wobei jedoch die Aktivität des Promotors nicht inaktiviert ist, wobei das zirkuläre Molekül optional ferner den Promotor umfasst, der mit der Polynucleotidsequenz operabel verknüpft ist.
Alternativ ist der Promotor ein RNA-Promotor, beispielsweise von TMV, TEV oder AMV.
Der Vorteil eines derartigen Systems besteht darin, dass, wenn das Konstrukt in linearer Form vorliegt und beispielsweise in eine größere Nucleotidsequenz, wie ein Genom, integriert ist, die Promotorsequenz inaktiv ist. Jedoch wird bei der Zirkularisation die Promotorsequenz rekonstituiert, wodurch Promotoraktivität möglich wird. Die optional vorhandene, operabel verknüpfte Polynucleotidsequenz wird dann exprimiert.
Beispiele für geeignete Promotoren umfassen den Promotor des Cauliflower Mosaic Virus 35S. Ein anderer verwendbarer Promotor ist der Ubiquitin-Promotor. Generell erfordern Monokotylen-Promotoren wie der Ubiquitin-Promotor eine Intronsequenz zwischen dem Promotor und dem Startcodon des Expressionsexon. Bei Fehlen dieser Introsequenz ist die Expression des Promotors entweder sehr gering oder sie fehlt vollständig. Das Genkonstrukt der vorliegenden Erfindung kann derart gestaltet werden, dass bei der Zirkularisation die Intronsequenz, die die Stanmm/Schleife-Struktur umfasst, eine Intronsequenz strangabwärts des Ubiquitin-Promotors bildet, wodurch dessen Funktion möglich wird.
Andere geeignete Promotoren sind im folgenden beschrieben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das in 5'→3'-Reihenfolge erste, zweite, dritte, vierte, fünfte und sechste Nucleotidsequenzen umfasst, wobei:
die ersten und sechsten Nucleotidsequenzen gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Rep-Proteinerken nungssequenz mit der Fähigkeit von einem oder mehreren Rep-Proteinen derart erkannt zu werden, dass das durch die ersten und sechsten Sequenzen flankierte genetische Material, das die gesamten ersten und sechsten Sequenzen oder einen Teil der ersten und sechsten Sequenzen umfasst, wenn das Konstrukt in einer größeren Nucleotidsequenz wie einer Genomsequenz integriert ist, ausgeschnitten und zirkularisiert werden können, wenn die Rep-Proteinerkennungssequenzen sich benachbart zu einer oder mehreren, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder Spleißsignale umfassenden Fremdsequenzen befinden oder in eine oder mehrere, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassende Fremdsequenzen eingefügt sind, umfassen,
die zweite Nucleotidsequenz einen 3'-Bereich einer Polynucleotidsequenz umfasst;
die dritte Nucleotidsequenz ein Transkriptionsterminator oder ein funktionales Derivat oder Homolog hiervon ist, das mit der zweiten Sequenz operabel verknüpft ist;
die vierte Nucleotidsequenz eine Promotorsequenz ist, die mit der fünften Nucleotidsequenz operabel verknüpft ist; und
die fünfte Nucleotidsequenz ein 5'-Bereich einer Polynucleotidsequenz ist, wobei die 5'- und 3'-Bereiche der Polynucleotidsequenz eine vollständige Codiersequenz der Polynucleotidsequenz darstellen;
wobei in Gegenwart von einem oder mehreren Rep-Proteinen bei Integration des Konstrukts in eine größere Nucleotidsequenz wie eine Genomsequenz eine zirkularisierte genetische Sequenz getrennt von der größeren Nucleotidsequenz erzeugt wird, die in dieser Reihenfolge die Promotorsequenz, die operabel mit einer Polynucleotidsequenz verknüpft ist, die die gesamte Fremdsequenz oder das gesamte andere Spleißsignal, oder einen Teil der Fremdsequenz oder des andere Spleißsignals, umfasst, die gesamte erste und/oder sechste Nucleotidsequenz oder einen Teil der ersten und/oder sechsten Nucleotidsequenz umfasst, und eine Transkriptionstermi natorsequenz umfasst.
Gemäß dem oben genannten Aspekt der Erfindung stellen die erste und sechste Nucleotidsequenz Erkennungssequenzen für ein von einem Virus abgeleitetes, eine Replikation erleichterndes Protein, wie Rep, das sich angrenzend an eine Intronsequenz oder ein anderes Spleißsignal befindet oder in dieses eingefügt ist, dar. Die zweite bis fünfte Nucleotidsequenz stellen die zuvor definierten genetischen Elemente dar.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein genetisches Element zur Verwendung bei der Erzeugung eines Konstrukts gerichtet, wobei das genetische Element in 5'→3'-Richtung einen 3'-Bereich einer operabel mit einem Transkriptionsterminator verknüpften Polynucleotidsequenz, einen operabel mit einem 5'-Bereich einer Polynucleotidsequenz verknüpften Promotor, wobei bei Zirkularisierung der 5'-Bereich der Polynucleotidsequenz operabel mit dem 3'-Bereich der Polynucleotidsequenz, die durch eine ganze Fremdsequenz oder Intronsequenz oder ein anderes Spleißsignal oder ein Teil einer Fremdsequenz oder Intronsequenz oder eines anderen Spleißsignals getrennt ist, verknüpft ist, umfasst.
Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung weisen eine Reihe von Anwendungsmöglichkeiten auf. In einer Ausführungsform wird das Konstrukt zur Erzeugung genetischer Resistenz in Pflanzenzellen gegenüber ssDNA-Viren verwendet. Die speziellen Viren, gegen die Schutz gesucht wird, umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Geminiviren oder Nanoviren. In dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt ein "Suizidgen", d. h. ein Gen mit Codierung für ein Produkt, das Zellapoptose, Lyse, Tod oder den Zustand des biochemischen oder physiologischen Schlafens induziert. Das Konstrukt wird in eine Pflanzenzelle unter Bedingungen, die eine Integration in das Pflanzenzellgenom ermöglichen, eingeführt. Eine Pflanze wird aus der Pflanzenzelle regeneriert und vermehrt, wenn die Pflanzenzelle durch ein spezielles ssDNA-Virus mit einem Rep-Protein, das die das genetische Element des Konstrukts flankierenden Rep-Protein-Erkennungssequenzen erkennt, infiziert ist, das Konstrukt wird ausgeschnitten und es erfolgt eine Rezirkularisation, wodurch das "Suizidgen" rekonstituiert wird und dessen Expression ermöglicht wird. Die Zelle stirbt dann oder sie gelangt dann in anderer Weise in einen Schlafzustand, wodurch die Replikation und Freisetzung von ssDNA-Viren verhindert wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, wobei das Konstrukt die Nucleotidsequenz gemäß Darstellung in SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder eine Nucleotidsequenz mit einer 60%-igen Ähnlichkeit zu jeder von SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder einer Nucleotidsequenz mit der Fähigkeit zur Hybridisierung an eine oder mehrere von SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder eine komplementäre Form hiervon unter niedrigstringenten Bedingungen bei 42°C umfasst.
Demgemäß betrachtet ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze oder eines Nachkommens hiervon mit Resistenz gegenüber ssDNA-Virus, wobei das Verfahren das Einführen eines Konstrukts in das Genom der Pflanze umfasst, wobei das Konstrukt in 5'→3'-Reihenfolge eine Rep-Proteinerkennungssequenz, die sich benachbart zu oder in einer Intronsequenz oder einem anderen Spleißsignal befindet, einen 3'-Endbereich einer Polynucleotidsequenz, einen Transkriptionsterminator oder dessen funktinoales Äquivalent, eine Promotorsequenz, die mit einem 5'-Endbereich der Polynucleotidsequenz operabel verknüpft ist, wobei die 5'- und 3'-Be reiche der Polynucleotidsequenz den Codierbereich eines Peptids, Polypeptids oder Proteins mit der Fähigkeit zur Induktion eines Zelltods oder eines Schlafzustands darstellen, und gleiche oder unterschiedliche Rep-Proteinerkennungssequenzen umfasst, wobei bei Infektion der Pflanzenzellen durch ein ssDNA-Virus, das ein Rep-Protein mit der Fähigkeit zur Erkennung der flankierenden Rep-Proteinerkennungssequenzen aufweist, das Konstrukt ausgeschnitten wird und zirkularisiert, wodurch die Polynucleotidsequenz in einer Form wiederhergestellt wird, die zu einem Peptid, Polypeptid oder Protein exprimiert wird, das die Pflanzenzelle tötet oder die Pflanzenzelle in einen Schlafzustand versetzt.
Eine weitere Verwendung des vorliegenden Konstrukts ist die Produktion männlicher steriler Pflanzen. In dieser Ausführungsform wird ein Gen mit Codierung für ein Rep-Protein unter die Kontrolle eines pollenspezifischen Promotors gestellt. Ein Konstrukt, das das oben beschriebene "Suizidgen" umfasst, wird ebenfalls unter Verwendung von Rep-Protein-Erkennungssequenzen, die von dem Rep-Gen erkannt werden, unter der Kontrolle des pollenspezifischen Promotors erzeugt. Wenn Pollen gebildet wird, wird der pollenspezifische Promotor aktiviert, woduch das Suizidgen aktiviert wird. Pollenzellen werden dann selektiv zerstört oder in den Schlafzustand versetzt.
Andere Verwendungsmöglichkeiten des hierin beschriebenen Konstrukts umfassen die Einführung von eine Farbänderung ermöglichendem genetischem Material in Pflanzen oder spezifisches Gewebe oder Samen oder anderes Reproduktionsmaterial von Pflanzen. Ein Beispiel für eine eine Farbänderung ermöglichende Gensequenz ist ein Gen mit Codierung für ein Enzym des Anthocyaninpfades, wie Flavonal-3'-hydroxylase, Flavonal-3',5'-hydroxylase oder Flavon-3'-synthase.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Konstrukt von zwei verschiedenen Rep-Protein-Erkennungssequenzen flankiert sein, d. h. von zwei verschiedenen Rep-Proteinen erkannt werden. Ein Rep-Protein kann dann durch ein in das Pflanzengenom eingefügtes Gen codiert werden und das andere Rep-Protein kann durch ein infizierendes ssDNA-Virus eingeführt werden. Alternativ können die Rep-Proteine durch verschiedene Promotoren, die in bestimmten Entwicklungsstufen exprimiert werden, codiert werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung speziell in Bezug auf Pflanzen und ssDNA-Viren beschrieben wird, erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf homologe Exzisionsstrukture und andere Proteine mit ortsspezifischen Ausschneide- und Verbindungsaktivitäten aus anderen Quellen, wie Nicht-ssDNA-Viren und eukaryotische Zellen, wie Insekten-, Säuger- oder Reptilienzellen. Insofern die vorliegende Erfindung Pflanzen betrifft, können die Pflanzen Monokotyle oder Dikotyle sein.
Der hier verwendete Ausdruck "Pflanzenzelle" umfasst Protoplasten oder andere Zellen, die von Pflanzen abgeleitet sind, Gameten produzierende Zellen und Zellen, die sich zu ganzen Pflanzen regenerieren. Pflanzenzellen umfassen Zellen in Pflanzen sowie Protoplasten oder andere Zellen in Kultur.
Der hier verwendete Ausdruck "Polynucleotid" oder "Nucleinsäure" bezeichnet mRNA, RNA, cRNA, cDNA oder DNA.
"Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar derart verwendet, dass sie ein Polymer aus Aminosäureresten und Varianten derselben bezeichnen.
Ausdrücke, die zur Beschreibung von Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehreren Polynucleotiden oder Polypeptiden verwendet werden, umfassen "Referenzsequenz", "Vergleichsfenster", "Sequenzidentität", "Prozentsatz der Sequenzidentität" und "wesentliche Identität". Eine "Referenzsequenz" ist eine Strecke von mindestens 12, jedoch häufig 15 bis 18 und häufig mindestens 25 Monomereinheiten, die Nucleotide und Aminosäurereste umfassen. Da zwei Polynucleotide jeweils (1) eine Sequenz (d. h. nur einen Teil der vollständigen Polynucleotidsequenz) der zwei Polynucleotide umfassen können, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehreren) Polynucleotiden typischerweise durch Vergleichen von Sequenzen der zwei Polynucleotide über ein "Vergleichsfenster" zur Identifizierung und zum Vergleichen lokaler Regionen von Sequenzähnlichkeit durchgeführt. Ein "Vergleichsfenster" bezeichnet ein Konzeptsegment von mindestens 6 fortlaufenden Positionen, üblicherweise etwa 50 bis etwa 100, noch besser etwa 100 bis etwa 150 Positionen, über die eine Sequenz mit einer Referenzsequenz der gleichen Zahl fortlaufender Positionen nach optimaler Alignierung der zwei Sequenzen verglichen wird. Das Vergleichsfenster kann Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) von etwa 20% oder weniger im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für ein optimales Alingment der zwei Sequenzen umfassen. Ein optimales Alignment von Sequenzen zur Alignierung eines Vergleichsfensters kann durch computergestützte Implementierungen von Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) oder durch Inspektion und das beste Alignment (d. h. das zum höchsten Prozentsatz an Homologie über das gesamte Vergleichsfenster führt), das durch ein beliebiges der gewählten Verfahren erhalten wird, durchgeführt werden. Verwiesen werden kann auch auf die BLAST-Programmfamilie, beispielsweise gemäß der Offenbarung durch Altschul et al., 1997. Eine detaillierte Diskussion von Sequenzanalyse findet sich in der Einheit 19.3 von Ausubel et al., 1994–1998.
Der hier verwendete Ausdruck "Sequenzidentität" bezeichnet das Ausmaß, in dem Sequenzen auf einer Nucleotid-Nucleotid-Basis oder Aminosäure-Aminosäure-Basis über ein Vergleichsfenster identisch sind. Daher wird der "Prozentsatz der Sequenzidentität" durch Vergleichen von zwei optimal alignierten Sequenzen über das Vergleichsfenster, das Bestimmen der Zahl der Positionen, an denen die identische Nucleinsäurebase (beispielsweise A, T, C, G, I) oder der identische Aminosäurerest (beispielsweise Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys und Met) in beiden Sequenzen auftritt, wobei die Zahl der übereinstimmenden Positionen erhalten wird, Division der Zahl übereinstimmender Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster (d. h. die Fenstergröße) und Multiplikation des Ergebnisses durch 100, wobei der Prozentsatz der Sequenzidentität erhalten wird, berechnet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll "Sequenzidentität" den "Übereinstimmungsprozensatz", der durch das DNASIS-Computerprogramm (Version 2.5 für Windows, erhältlich von Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, Kalifornien, USA) unter Verwendung von Standardfehlern, die im der Software beigefügten Referenzhandbuch verwendet werden, berechnet wird, bedeuten.
Der Verweis auf niedrige Stringenz hierin enthält und umfasst mindestens etwa 0 bis mindestens etwa 15% (V/V) Formamid und mindestens etwa 1 M bis mindestens etwa 2 M Salz für die Hybridisierung und mindestens etwa 1 M bis mindestens etwa 2 M Salz für Waschbedingungen. Generell reicht niedrige Stringenz von etwa 25–30°C bis etwa 42°C. Die Temperatur kann geändert werden und höhere Temperaturen können verwendet werden, um Formamid zu ersetzen und/oder alternative Stringenzbedingungen zu liefern. Alternative Stringenzbedingungen können, falls nötig, verwendet werden, beispielsweise mittlere Stringenz, die mindestens etwa 16% (V/V) bis mindestens etwa 30% (V/V) Formamid und mindestens etwa 0,5 M bis mindestens etwa 0,9 M Salz zur Hybridisierung und mindestens etwa 0,5 M bis mindestens etwa 0,9 M Salz für Waschbedingungen enthält und umfasst, oder hohe Stringenz, die mindestens etwa 31% (V/V) bis mindestens etwa 50% (V/V) Formamid und mindestens etwa 0,01 M bis mindestens etwa 0,15 M Salz zur Hybridisierung und mindestens etwa 0,01 M bis mindestens etwa 0,15 M Salz für Waschbedingungen enthält und umfasst. Generell wird Waschen bei T_m = 69,3 + 0,41 (G + C)% durchgeführt (Marmur und Doty, 1926). Jedoch nimmt die T_m einer Doppelhelix-DNA mit jeder Zunahme der Zahl von nicht übereinstimmenden Basenpaaren um 1% um 1°C ab (Bonner und Laskey, 1974). Formamid ist bei diesen Hybridisierungsbedingungen optional. Entsprechend sind besonders bevorzugte Stringenzgrade wie im folgenden definiert: niedrige Stringenz bedeutet 6 × SSC-Puffer, 0,1% (Gew/V) SDS bei 25–42°C; mäßige Stringenz bedeutet 2 × SSC-Puffer, 0,1% (Gew/V) SDS bei einer Temperatur im Bereich von 20–65°C; hohe Stringenz bedeutet 0,1 × SSC-Puffer, 0,1% (Gew/V) SDS bei einer Temperatur von mindestens 65°C.
Der Ausdruck "Transformation" bedeutet eine Änderung des Genotyps eines Organismus, beispielsweise einer eukaryotischen Zelle, durch Einführung einer fremden oder endogenen Nucleinsäure.
"Vektor" bedeutet ein Nucleinsäuremolekül, vorzugsweise ein DNA-Molekül, das beispielsweise von einem Plasmid, Bakteriophagen oder Pflanzenvirus abgeleitet ist, in das eine Nucleinsäuresequenz insertiert oder kloniert sein kann. Ein Vektor enthält vorzugsweise eine oder mehrere singuläre Restriktionsstellen und er kann zur autonomen Replikation in einer definierten Wirtszelle, die eine Zielzelle oder ein Zielgewebe oder eine Vorläuferzelle oder ein Vorläufergewebe hierfür umfasst, fähig sein oder in das Genom des definierten Wirts derart integrierbar sein, dass die klonierte Sequenz reproduzierbar ist. Demgemäß kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomales Gebilde existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, beispielsweise ein lineares oder geschlossenes zirkuläres Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom, sein. Der Vektor kann beliebige Mittel, um selbst Replikation sicherzustellen, enthalten. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Zelle eingeführt ist, in das Genom der Empfängerzelle integriert und zusammen mit dem Chromosom bzw. den Chromosomen, in die er integriert ist, repliziert wird. Ein Vektorsystem kann einen einzelnen Vektor oder ein Plasmid, zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die gesamte, in das Genom der Wirtszelle einzuführende DNA enthalten, oder ein Transposon umfassen. Die Wahl des Vektors hängt typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Zelle, in die der Vektor eingeführt werden soll, ab. Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker, wie ein Antibiotikaresistenzgen, das zur Selektion geeigneter Transformanten verwendet werden kann, umfassen. Beispiele für derartige Resistenzgene sind dem Fachmann geläufig.
Der Ausdruck "Gen" wird in dessen breitestem Sinne verwendet und er umfasst den Exons eines Gens entsprechende cDNA. Demgemäß soll ein Verweis hierin auf ein "Gen" derart verstanden werden, dass er umfasst:

(i) ein klassisches Genomgen, das aus transkriptional und/oder translational regulatorischen Sequenzen und/oder einer codierenden Region und/oder nichttranslatierten Sequenzen (d. h. Introns, 5'- und 3'-nichttranslatierte Sequenzen) besteht oder
(ii) mRNA oder cDNA, die den codierenden Regionen (d. h. Exons) und 5'- und 3'-nichttranslatierten Sequenzen des Gens entspricht, und/oder
(iii) eine Strukturregion, die den codierenden Regionen (d. h. Exons) entspricht, die optional des weiteren nichttranslatierte Sequenzen und/oder eine heterologe Promotorsequenz, die aus transkriptional und/oder translational regulatorischen Regionen besteht, die Expressionseigenschaften der Strukturregion verleihen können, umfasst.

Der Ausdruck "Gen" wird auch zur Beschreibung von synthetischen oder Fusionsmolekülen mit Codierung für ein vollständiges funktionales Produkt oder ein Teil desselben, insbesondere ein Sense- oder Antisense-mRNA-Produkt oder ein Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid oder biologisch aktives Protein verwendet. Der Verweis auf ein "Gen" umfasst auch den Verweis auf ein "synthetisches Gen".
Der Ausdruck "synthetisches Gen" bezeichnet ein nicht natürlich vorkommendes Gen gemäß der vorhergehenden Definition, das vorzugsweise mindestens eine oder mehrere transkriptional und/oder translational regulatorische Sequenzen, die operabel mit einer Strukturgensequenz verknüpft sind, umfasst.
Der Ausdruck "Strukturgen" soll eine Nucleotidsequenz bezeichnen, die zur Übertragung unter Bildung von mRNA fähig ist und optional für ein Peptid, Oligopeptid, Polypeptid oder biologisch aktives Proteinmolekül codiert. Dem Fachmann ist klar, dass nicht die gesamte mRNA in ein Peptid, Oligopeptid, Polypeptid oder ein Protein translatiert werden kann, wenn beispielsweise der mRNA ein funktionales Translationsstartsignal fehlt oder wenn alternativ die mRNA Antisense-mRNA ist. Die vorliegende Erfindung umfasst klar syn thetische Gene, die Nucleotidsequenzen umfassen, die zur Codierung von Peptiden, Oligopeptiden, Polypeptiden oder biologisch aktiven Proteinen nicht fähig sind. Insbesondere ermittelten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass derartige synthetische Gene vorteilhaft zur Modifizierung der Expression eines Zielgens in Zellen, Geweben oder Organen eines eukaryotischen Organismus vorteilhaft sein können.
Der Ausdruck "Strukturgenregion" bezeichnet den Teil eines synthetischen Gens, der in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ unter der Kontrolle einer Promotorsequenz, mit der er operabel verbunden ist, exprimiert wird. Eine Strukturgenregion kann unter der Kontrolle einer einzelnen Promotorsequenz oder von mehreren Promotorsequenzen operabel sein. Demgemäß kann die Strukturgenregion eines synthetischen Gens eine Nucleotidsequenz umfassen, die zur Codierung einer Aminosäuresequenz fähig oder dazu komplementär ist. Im Hinblick darauf kann eine Strukturgenregion, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auch eine Nucleotidsequenz umfassen, die für eine Aminosäuresequenz codiert, der jedoch ein funktionales Translationsinitiationscodon und/oder ein funktionales Translationsstoppcodon fehlt und die infolgedessen kein vollständiges offenes Leseraster umfasst. Im vorliegenden Kontext erstreckt sich der Ausdruck "Strukturgenregion" auch auf nichtcodierende Nucleotidsequenzen, beispielsweise 5'-strangaufwärtige oder 3'-strangabwärtige Sequenzen eines Gens, die normalerweise in einer eukaryotischen Zelle, die das Gen exprimiert, nicht translatiert werden.
Entsprechend kann im Kontext der vorliegenden Erfindung eine Strukturgenregion auch eine Fusion zwischen zwei oder mehreren offenen Leserastern des gleichen Gens oder von verschiedenen Genen umfassen. In derartigen Ausführungsformen kann die Erfindung zur Modulation der Expression von einem Gen durch Zielrichtung auf verschiedene nicht fortlaufende Regionen desselben oder alternativ zur gleichzeitigen Modulation der Expression von mehreren verschiedenen Genen, die verschiedene Gene einer Multigenfamilie umfassen, verwendet werden. Im Falle eines Fusionsnucleinsäuremoleküls, das für eine eukaryotische Zelle nicht endogen ist und insbesondere zwei oder mehrere Nucleotidsequenzen, die von einem Viruspathogen abgeleitet sind, umfasst, kann die Fusion den zusätzlichen Vorteil, gleichzeitige Immunität oder Schutz gegenüber mehreren Pathogenen zu verleihen, durch die Zielausrichtung auf die Expression von Genen in den mehreren Pathogenen bereitstellen. Alternativ oder zusätzlich kann die Fusion eine wirksamere Immunität gegenüber einem beliebigen Pathogen durch Zielausrichtung auf die Expression von mehr als einem Gen des Pathogens bereitstellen.
Besonders bevorzugte Strukturgenregionen gemäß diesen Aspekt der Erfindung sind diejenigen, die mindestens ein translatierbares offenes Leseraster, noch günstiger des weiteren ein Translationsstartcodon, das am 5'-Ende des offenen Leserasters lokalisiert ist, obgleich nicht zwangsläufig am 5'-Terminus der Strukturgenregion, umfassen. Im Hinblick darauf wird ungeachtet dessen, ob die Strukturgenregion mindestens ein translatierbares offenes Leseraster und/oder ein AUG- oder ATG-Translationsstartcodon umfassen kann, durch den Einbau derartiger Sequenzen in keinster Weise nahegelegt, dass es für die vorliegende Erfindung erforderlich ist, dass die Translation des eingeführten Nucleinsäuremoleküls erfolgt, um die Expression des Zielgens zu modulieren. Ohne an eine Theorie oder einen Wirkmechanismus gebunden zu sein, kann der Einbau von mindestens einem translatierbaren offenen Leseraster und/oder einem Translationsstartcodon in dem vorliegenden Nucleinsäuremolekül zur Erhöhung der Stabilität des mRNA-Transkriptionsprodukts desselben dienen, wodurch die Wirksamkeit der Erfindung verbessert wird.
Die optimale Zahl an Strukturgensequenzen, die in dem synthetischen Gen der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann, variiert beträchtlich in Abhängigkeit von der Länge der einzelnen Strukturgensequenzen, deren Orientierung und dem Grad der Identität zueinander. Beispielsweise sind dem Fachmann die inhärente Instabilität palindromischer Nucleotidsequenzen in vivo und die Schwierigkeiten in Verbindung mit der Konstruktion langer synthetischer Gene, die invertierte wiederholte Nucleotidsequenzen umfassen, wegen der Tendenz derartiger Sequenzen zur Rekombination in vivo bekannt. Ungeachtet derartiger Schwierigkeiten kann die optimale Zahl an Strukturgensequenzen, die in die synthetischen Gene der vorliegenden Erfindung einzubauen sind, empirisch durch den Fachmann ohne übermäßigen Arbeitsaufwand und nach den im folgenden angegebenen Standardverfahren, beispielsweise die Konstruktion des synthetischen Gens gemäß der Erfindung unter Verwendung von Rekombinase-defizienten Zelllinien, Verringern der Zahl wiederholter Sequenzen auf ein Ausmaß, das Rekombinationsereignisse eliminiert oder minimiert, und durch Halten der Gesamtlänge der mehrfachen Strukturgensequenz unter einer akzeptablen Grenze, vorzugsweise einer Länge nicht mehr als 5–10 kb, noch günstiger nicht mehr als 2–5 kb und noch besser nicht mehr als 0,5–2,0 kb bestimmt werden.
Zur Expression in eukaryotischen Zellen umfasst das Konstrukt generell zusätzlich zu der Polynucleotidsequenz einen Promotor und optional andere regulatorische Sequenzen, die zur Erleichterung der Expression der Polynucleotidsequenz gestaltet sind.
Der Verweis hierin auf einen "Promotor" soll in dessen breitestem Kontext gesehen werden und er umfasst die trans kriptional regulatorischen Sequenzen eines klassichen Genomgens, umfassend die TATA-Box, die für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit einer oder ohne eine CCAAT-Box-Sequenz und zusätzliche regulatorische Elemente (d. h. strangaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression als Reaktion auf Entwicklungs- und/oder äußere Stimuli oder in gewebespezifischer Weise ändern. Ein Promotor ist üblicherweise, jedoch nicht zwangsläufig, strangaufwärts oder 5' zu einer Strukturgenregion, deren Expression er reguliert, positioniert. Ferner sind die einen Promotor umfassenden regulatorischen Elemente üblicherweise innerhalb von 2 kb des Transkriptionsstartpunkts des Gens positioniert.
Im vorliegenden Kontext wird der Ausdruck "Promotor" auch zur Beschreibung eines synthetischen oder Fusionsmoleküls oder eines Derivats, das die Expression eines Nucleinsäuremoleküls in einer Zelle bewirkt, aktiviert oder verstärkt, verwendet.
Bevorzugte Promotoren können zusätzliche Kopien von einem oder mehreren spezifischen regulatorischen Elementen enthalten, um die Expression des Sense-Moleküls weiter zu verstärken und/oder die räumliche Expression und/oder zeitliche Expression des Sense-Moleküls zu ändern. Beispielsweise können regulatorische Elemente, die Kupferinduzierbarkeit verleihen, angrenzend zu einer heterologen Promotorsequenz, die die Expression eines Sense-Moleküls antreibt, platziert sein, wodurch der Expression der Moleküle Induzierbarkeit durch Kupfer verliehen wird.
Das Platzieren eines Nucleinsäuremoleküls unter die regulatorische Kontrolle einer Promotorsequenz bedeutet die Positionierung des Moleküls derart, dass die Expression durch die Promotorsequenz kontrolliert wird. Promotoren sind ge nerell 5' (strangaufwärts) zu den Genen, die sie kontrollieren, positioniert. Bei der Konstruktion von heterologen Promotor/Strukturgen-Kombinationen ist es generell bevorzugt, den Promotor in einem Abstand von der Gentranskriptionsstartstelle zu positionieren, der näherungsweise gleich dem Abstand zwischen dem Promotor und dem Gen, das er kontrolliert, in der natürlichen Aufstellung, d. h. dem Gen, von dem der Promotor abgeleitet ist, ist. Wie einschlägig bekannt ist, kann mit einer gewissen Variation im Hinblick auf diesen Abstand ohne Verlust der Promotorfunktion umgegangen werden. In ähnlicher Weise ist die bevorzugte Positionierung eines regulatorischen Sequenzelements in Bezug auf ein heterologes Gen, das unter dessen Kontrolle gestellt werden soll, durch die Positionierung des Elements in dessen natürlicher Aufstellung, d. h. den Genen, von denen es abgeleitet ist, definiert. Erneut kann, wie einschlägig bekannt ist, eine gewisse Variation dieses Abstands ebenfalls erfolgen.
Beispiele für Promotoren, die zur Verwendung in den synthetischen Genen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen von Viren, Pilzen, Bakterien, Tieren und Pflanzen stammende Promotoren, die in Pflanzen-, Tier-, Insekten-, Pilz-, Hefe- oder Bakterienzellen funktionieren können. Der Promotor kann die Expression der Strukturgenkomponente konstitutiv oder differenziell in Bezug auf die Zelle, das Gewebe oder Organ, in der die Expression erfolgt, oder in Bezug auf die Entwicklungsstufe, in der die Expression erfolgt, oder als Reaktion auf äußere Reize, wie unter anderem physiologische Belastungen oder Pathogene oder Metallionen, regulieren.
Vorzugsweise ist der Promotor zur Regulation der Expression eines Nucleinsäuremoleküls in einer eukaryotischen Zelle, einem eukaryotischen Gewebe oder Organ, mindestens über den Zeitraum, über den das Zielgen darin exprimiert wird, und noch besser auch unmittelbar vor dem Beginn einer detektierbaren Expression des Zielgens in der Zelle, dem Gewebe oder Organ fähig.
Demgemäß sind starke konstitutive Promotoren oder Promotoren, die durch eine Virusinfektion oder den Beginn der Zielgenexpression induziert werden können, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders günstig.
Pflanzen-operable und Tier-operable Promotoren sind zur Verwendung im Konstrukt der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Beispiele für bevorzugte Promotoren umfassen Viruspromotoren, wie den Bakteriophagen-T7-Promotor, Bakteriophagen-T3-Promotor, SP6-Promotor, Bakterienpromotoren, wie den lac-Operator-Promotor, tac-Promotor, Viruspromotoren, wie den SV40-late-Promotor, SV40-early-Promotor, RSV-LTR-Promotor, CMV-IE-Promotor, oder Pflanzenviruspromotoren, wie CaMV 35S-Promotor, SCSV-Promotor, SCBV-Promotor und dgl.
Bei Berücksichtigung der bevorzugten Anforderung für eine hochgradige Expression, die mit der Expression des Zielgens zusammenfällt oder der Expression des Zielgens vorangeht, ist es sehr günstig, wenn die Promotorsequenz ein konstitutiver starker Promotor in dem interessierenden Wirt ist, wie u. a. die CMV-IE-Promotor- oder SV40-early-Promotorsequenz, die SV40-late-Promotorsequenz für Säugerzellen und der CaMV 35S-Promotor oder SCBV-Promotor in bestimmten Pflanzenzellen. Dem Fachmann sind zusätzliche andere Promotorsequenzen als die speziell beschriebenen ohne weiteres klar.
Im vorliegenden Kontext sollen die Ausdrücke "in operabler Verbindung mit" oder "operabel unter der Kontrolle" oder ähnliches angeben, dass die Expression der Strukturgenregion oder Mehrfachstrukturgenregion unter der Kontrolle der Pro motorsequenz, mit der sie räumlich verbunden ist, in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ oder einem ganzen Organismus, steht.
Das Konstrukt enthält vorzugsweise zusätzliche regulatorische Elemente für eine effiziente Transkription, beispielsweise eine Transkriptionsterminationssequenz.
Der Ausdruck "Terminator" bezeichnet eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit, die das Beenden der Transkription signalisiert. Terminatoren sind 3'-nichttranslatierte DNA-Sequenzen, die generell ein Polyadenylierungssignal enthalten, das die Addition von Polyadenylatsequenzen an das 3'-Ende eines Primärtranskripts ermöglicht. In Pflanzenzellen aktive Terminatoren sind bekannt und in der Literatur beschrieben. Sie können aus Bakterien, Pilzen, Viren, Tieren und/oder Pflanzen isoliert werden oder de novo synthetisiert werden.
Wie bei Promotorsequenzen kann der Terminator eine beliebige Terminatorsequenz sein, die in den Zellen, Geweben oder Organen, in denen sie verwendet werden soll, operabel ist.
Beispiele für Terminatoren, die insbesondere zur Verwendung bei den synthetischen Genen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen u. a. das SV40-Polyadenylierungssignal, das HSV TK-Polyadenylierungssignal, den CYC1-Terminator, ADH-Terminator, SPA-Terminator, Nopalinsynthase(NOS)genterminator von Agrobacterium tumefaciens, den Terminator des Gens des Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S, den Zeingenterminator von Zea mays, die Rubisco-Small Subunit-Gen (SSU)-Genterminatorsequenzen, Subclover Stunt Virus (SCSV)-Gensequenzterminatoren, einen beliebigen rhounabhängigen E. coli-Terminator oder den lacZ-alpha-Terminator.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Terminator das SV40-Polyadenylierungssignal oder das HSV TK-Polyadenylierungssignal, die in Tierzellen, -geweben und -organen operabel sind, der Octopinsynthase(OCS)- oder Nopalinsynthase(NOS)-Terminator, der in Pflanzenzellen, -gewebe oder -organen aktiv ist, oder der lacZ-alpha-Terminator, der in prokaryotischen Zellen aktiv ist.
Dem Fachmann sind zusätzliche Terminatorsequenzen, die zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können, bekannt. Derartige Sequenzen können ohne weiteres ohne übermäßigen Arbeitsaufwand verwendet werden.
Mittel zur Einführung der Konstrukte in Zellen (d. h. Transfektion oder Transformation von Zellen mit den Konstrukten) sind dem Fachmann geläufig.
Die im vorhergehenden beschriebenen Konstrukte können weiter modifiziert werden, beispielsweise durch den Einbau von Markernucleotidsequenzen mit Codierung für ein detektierbares Markerenzym oder ein funktionales Analogon oder Derivat desselben, um die Detektion des synthetischen Gens in einer Zelle, einem Gewebe oder Organ, in dem es exprimiert wird, zu ermöglichen. Gemäß dieser Ausführungsform sind die Markernucleotidsequenzen in einem translatierbaren Format vorhanden und sie werden beispielsweise als Fusionspolypeptid mit dem Translationsprodukt bzw. den Translationsprodukten von einem oder mehreren der Strukturgene oder alternativ als Nicht-Fusionspolypeptid exprimiert.
Dem Fachmann ist klar, wie die hierin beschriebenen synthetischen Gene hergestellt werden und welche Anforderungen notwendig sind, um die Expression derselben, wenn diese gewünscht wird, in einer spezifischen Zelle oder einem spe zifischen Zelltyp unter den gewünschten Bedingungen zu gewinnen. Insbesondere ist dem Fachmann bekannt, dass die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung erforderlichen Genmanipulationen die Vermehrung eines hierin beschriebenen Genkonstrukts oder eines Derivats desselben in einer prokaryotischen Zelle, wie einer E. coli-Zelle, oder einer Pflanzenzelle oder einer Tierzelle erfordern können.
Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung können in eine geeignete Zelle, ein geeignetes Gewebe oder Organ ohne Modifikation als lineare DNA, die optional in einem geeigneten Träger, wie u. a. einer Zelle, einem Virusteilchen oder einem Liposom enthalten ist, eingeführt werden. Zur Herstellung eines Genkonstrukts wird das synthetische Gen der Erfindung in einen geeigneten Vektor oder ein Opisommolekül, beispielsweise einen Bakteriophagenvektor, Virusvektor oder ein Plasmid, Cosmid oder einen synthetischen Chromosomenvektor, die in der Wirtszelle, dem Wirtsgewebe oder -organ, in das sie anschließend eingeführt werden, beibehalten und/oder repliziert und/oder exprimiert werden können, eingeführt.
Demgemäß stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Genkonstrukt bereit, das mindestens ein wie hierin beschriebenes genetisches Element und einen oder mehrere Replikationsursprünge und/oder selektierbare Markergensequenzen umfasst.
Genkonstrukte sind insbesondere geeignet zur Transformation einer eukaryotischen Zelle zur Einführung neuer Genmerkmale in diese zusätzlich zur Bereitstellung von Resistenzeigenschaften gegenüber Viruspathogenen. Derartige neue Merkmale können in ein getrenntes Genkonstrukt oder alternativ das gleiche Genkonstrukt, das das hierin beschriebene synthetische Gen umfasst, eingeführt werden. Der Fachmann erkennt die signifikanten Vorteile, insbesondere im Hinblick auf verringerte Genmanipulationen und Gewebekulturanforderungen und erhöhte Kosten-Wirksamkeit, des Einbaus von Gensequenzen, die für derartige zusätzliche Merkmale codieren, und der hierin beschriebenen synthetischen Gene in ein einziges Genkonstrukt.
Üblicherweise ist ein Replikationsursprung oder ein selektierbares Markergen, die zur Verwendung in Bakterien geeignet sind, von den in dem Genkonstrukt enthaltenen Gensequenzen, die exprimiert oder in eine eukaryotische Zelle übertragen oder in das Genom einer eukaryotischen Zelle integriert werden sollen, physikalisch getrennt.
Der hier verwendete Ausdruck "selektierbares Markergen" umfasst ein beliebiges Gen, das einer Zelle, an der es exprimiert wird, einen Phänotyp verleiht, der die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen, die mit einem Genkonstrukt der Erfindung oder einem Derivat desselben transfiziert oder transformiert sind, ermöglicht.
Hierin betrachtete geeignete selektierbare Markergene umfassen u. a. das Ampicillin-Resistenzgen (Amp^r), Tetracyclin-Resistenzgen (Tc^r), bakterielle Kanamycin-Resistenzgen (Kan^r), das Zeocin-Resistenzgen (Zeocin ist ein Wirkstoff der Bleomycinfamilie, eine Marke der InVitrogen Corporation), das AURI-C-Gen, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Aureobasidin A verleiht, das Phosphinothricin-Resistenzgen, Neomycin-Phosphotransferasegen (nptII), das Hygromycin-Resistenzgen, β-Glucuronidase(GUS)gen, das Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)gen, das das Green Fluorescent Protein codierende Gen oder das Luciferasegen.
Vorzugsweise ist das selektierbare Markergen das nptII-Gen oder Kan^r-Gen oder das das Green Fluorescent Protein (GFP) codierende Gen.
Dem Fachmann sind andere selektierbare Markergene, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, geläufig und die vorliegende Erfindung ist durch die Natur des selektierbaren Markergens nicht beschränkt.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf alle Genkonstrukte, die im wesentlichen hierin beschrieben sind, wobei diese ferner Gensequenzen umfassen, die für das Beibehalten und/oder die Replikation des Genkonstrukts in Prokaryoten oder Eukaryoten und/oder die Integration des Genkonstrukts oder eines Teils desselben in das Genom einer eukaryotischen Zelle oder eines Organismus geplant sind.
Im vorhergehenden beschriebene Standardmethoden können zur Einführung der Konstrukte in die Zelle, das Gewebe oder Organ verwendet werden, beispielsweise eine liposomenvermittelte Transfektion oder Transformation, Transformation von Zellen mit abgeschwächten Virusteilchen oder Bakterienzellen, Zellreifung, Transformations- oder Transfektionsverfahren, die dem Fachmann geläufig sind.
Weitere Mittel zur Einführung von rekombinanter DNA in Pflanzengewebe oder -zellen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine Transformation unter Verwendung von CaCl₂ und Variationen hiervon, die direkte DNA-Aufnahme in Protoplasten, eine PEG-vermittelte Aufnahme in Protoplasten, Mikroteilchenbeschuss, Elektroporation, Mikroinjektion von DNA, Mikroteilchenbeschuss von Gewebeexplantaten oder Zellen, Vakuuminfiltration von Gewebe mit Nucleinsäure oder im Falle von Pflanzen ein T-DNA-vermittelter Transfer von Agrobacterium in das Pflanzengewebe.
Für Mikroteilchenbeschuss von Zellen werden Mikroteilchen in eine Zelle zur Bildung einer transformierten Zelle getrieben. Jede geeignete ballistische Zelltransformationsmethodik und -vorrichtung kann bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielvorrichtungen und -verfahren sind bei Stomp et al. ( US-Patent 5 122 466 ) und Sanford und Wolf ( US-Patent 4 945 050 ) offenbart. Wenn ballistische Transformationsverfahren verwendet werden, kann das Genkonstrukt ein Plasmid enthalten, das zur Replikation in der zu transformierenden Zelle fähig ist.
Beispiele für Mikroteilchen, die zur Verwendung in derartigen Systemen fähig sind, umfassen Goldkügelchen von 1 bis 5 μm. Das DNA-Konstrukt kann auf dem Mikroteilchen durch jede geeignete Technik, beispielsweise durch Abscheidung, abgelagert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die hierin beschriebenen Genkonstrukte zur Integration in das Genom einer Zelle, in der sie exprimiert werden, angepasst. Dem Fachmann ist klar, dass, um eine Integration einer Gensequenz oder eines Genkonstrukts in das Genom einer Wirtszelle zu erreichen, bestimmte zusätzliche Gensequenzen erforderlich sein können. Im Falle von Pflanzen sind Sequenzen der linken und rechten Begrenzung der T-DNA des Agrobacterium tumefaciens-Ti-Plasmids generell erforderlich.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf eine isolierte Zelle, ein isoliertes Gewebe oder Organ, die die Konstrukte oder Teile derselben umfassen. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf regenerierte Gewebe, Organe und ganze Organismen, die von den Zellen, Geweben und Organen abgeleitet sind, und auf Brutkörper und Abkömmlinge derselben sowie Samen und anderes reproduktives Material.
Beispielsweise können Pflanzen aus transformierten Pflanzenzellen oder -geweben oder -organen auf hormonhaltigen Medien regeneriert werden und die regenerierten Pflanzen können eine Vielzahl von Formen, beispielsweise Chimären transformierter Zellen und nichttransformierter Zellen, Klontransformanten (beispielsweise alle Zellen, die derart transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Transplantate von transformiertem und nichttransformiertem Gewebe (beispielsweise ein transformierter Wurzelstock, der auf einen nichttransformierten Schössling gepfropft ist, in Zitrusarten), annehmen. Transformierte Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln, beispielsweise klonale Vermehrung oder klassische Zuchttechniken, vermehrt werden. Beispielsweise können transformierte Pflanzen einer ersten Generation (oder T1) selbst vermehrt werden, wobei homocygote transformierte Pflanzen der zweiten Generation (oder T2) erhalten werden und die T2-Pflanzen durch klassische Zuchttechniken weiter vermehrt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Konstrukt zur Induktion der Modulation der Expression einer Zielgensequenz verwendet. Beispielsweise umfasst ein Konstrukt, wenn es in linearer Form vorliegt, in 5'→3'-Richtung eine Antisense-Sequenz, einen Promotor und eine Sense-Sequenz. Diese Elemente werden dann durch von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein-Erkennungssequenzen (beispielsweise Stamm/Schleife) oder Säuger- oder Mikroorganismenhomologa flankiert. Eine Terminatorsequenz ist außerhalb der durch die Erkennungssequenz flankierten Region lokalisiert. Bei replikativer Freisetzung wird eine Polynucleotidsequenz, die Antisense- und Sense-Formen einer Zielgensequenz umfasst, produziert. Die erhaltene Polynucleotidsequenz kann dann eine Haarnadelschleife bilden. Das Konstrukt kann derart variiert werden, dass Tandem- oder Mehrfachrepeats, Inverts oder Kombinationen derselben produziert werden. Derartige Konstrukte sind zur Genstilllegung in Pflanzen- und Tierzellen verwendbar. Die Reihenfolge von Elementen in der linearen Form ist unkritisch.
Beispielsweise kann die Position der Sense- und Antisense-Sequenzen getauscht werden. Ein Beispiel für ein geeignetes Konstrukt ist in 27 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele weiter beschrieben.
BEISPIEL 1
Expressionsvektoren auf der Basis von BBTV
Eine Reihe von Expressionsvektoren wurde konstruiert, wobei diese den Promotor des Cauliflower Mosaic Virus 35S (35S) enthalten, der die Expression des Gens mit Codierung für Barnase antreibt, in die das Intron aus dem lichtinduzierbaren gewebespezifischen Kartoffel-ST-LS1-Gen eingeführt wurde (NT-INTRON-CT). Der Terminator stammte von entweder dem Gen mit Codierung für Nopalinsynthase (nos) oder dem größten Teil des offenen Leserasters (ORF) von BBTV DNA-6 (BT6).
Die Konstrukte wurden unter Verwendung von PCR mit überlappenden Primern (Tabelle 1) zusammengebaut und in pGEM-T-Vektoren unter Verwendung von einschlägig bekannten Standardtechniken kloniert. Der Expressionsvektor pTBN wurde konstruiert und ist in 1 gezeigt. pTBN (SEQ ID NO: 66) stellt das Rückgrat dar, auf dem andere Expressionsvektoren konstruiert wurden. Primernamen und Bindungsstellen sowie die Größe jeder Sequenz sind angegeben. pTBN (wie die anderen Konstrukte) wurde stufenweise amplifiziert. Zunächst wurden alle drei Fragmente getrennt amplifiziert (d. h. 35S, NT-INTRON-CT und nos). Die gesamte Sequenz wurde dann durch Mischen der einzelnen Fragmente in einer PCR mit den Primern +1 und –4 amplifiziert.
pTBN6 (SEQ ID NO: 67), das in 2 gezeigt ist, enthält eine 624-bp-Region, die CR-SL und CR-M von BBTV DNA-6 (6I) in das Intron eingefügt enthält.
pTBN1 (SEQ ID NO: 68), das in 3 gezeigt ist, enthält eine 163-bp-Region, die CR-SL und CR-M von BBTV DNA-1 (1I) in das Intron eingefügt, identisch zu pTBN6, enthält. Der nos-Terminator wurde durch den 126-bp-Terminator von BBTV DNA-6 large ORF ersetzt.
Rezirkularisationsvektoren beruhen auf pTBN6 und pTBN1. Sie sind von Rep-Erkennungssequenzen flankiert und derart gestaltet, dass sie nur in Gegenwart des BBTV Rep rezirkularisieren und anschließend transkriptional aktiv sind. Drei verschiedene Vektoren wurden hergestellt: pRTBN6, pRTBN1 und pRTBN1/6.
pRTBN6, das in 4 gezeigt ist, wurde ausgehend von pTBN6 konstruiert. Zwei Fragmente wurden unter Verwendung von +5 und –4 bzw. +1 und –6 amplifiziert. Diese wurden in pGEM-T kloniert und subkloniert, wobei pRTBN6 erzeugt wurde.
pRTBN1, das in 5 gezeigt ist, wurde ausgehend von pTBN1 auf ähnliche Weise wie pRTBN6 konstruiert.
pRTBN1/6, das in 6 gezeigt ist, war ein Hybrid von pRTBN1 und pRTBN6.
Nichttranslatierbare Vektoren wurden ebenfalls für jedes der oben genannten Konstrukte (mit Ausnahme von pTBN) konstruiert. In diesen Vektoren wurde das Startcodon des Barnasegens unter Verwendung des +11-Primers deletiert (siehe Tabelle 1). Die Konstrukte wurden pUBN6, pUBN1, pRUBN6 und pRUBN1 benannt. TABELLE 1 Oligonucleotidprimersequenzen
BEISPIEL 2
Expressionsvektoren auf der Basis von TYDV
(a) Konstruktion einer intronhaltigen GUS-Reportergen-Expressionskassette
Der Vektor pCAMBIA 2301 wurde von CAMBIA (Canberra, Australien) erhalten. Dieser Vektor enthält ein 189-bp-Katalaseintron innerhalb des 5'-Bereichs der uidA-Codierregion. Die CaMV 35S-Promotorregion (800 bp), uidA-Codierregion und der nos-Terminator wurden von pCAMBIA 2301 als HindIII/SphI'-Fragment entfernt und in den ähnlich verdauten pGEM-T (Promega)-Vektor insertiert. Das daraus folgende Konstrukt wurde als pGEM-2301 bezeichnet. Der 800-bp-CaMV 35S-Promotor wurde durch den stärkeren 530-bp-CaMV 35S-Promotor durch NotI/BglII-Verdau und Ligation ersetzt. Der daraus folgende Vektor wurde als p35S-2301 bezeichnet (7) und diente als Templat für alle folgenden Klonierungsstufen.
(b) Isolierung der großen intergenischen Region des Tobacco Yellow Dwarf Mastrevirus (TYDV) und Insertion in das Katalaseintron von p35S-2301
Ein 272-bp-Fragment, das die große intergenische Region (LIR) (nt +1 bis nt +272) des TYDV enthielt (Genbank Acc M81103), wurde ausgehend von TYDV-infiziertem Tabakblättergewebe durch PCR unter Verwendung der Primer LIR-F und LIR-R (siehe 1) amplifiziert. Dieses Fragment wurde als LIR bezeichnet. Primer:
Das Segment, das den CaMV 35S-Promotor (530 bp), das uidA 1^st-Exon (19 bp) und die 5'-Hälfte des Katalaseintrons (83 bp) umfasste, wurde ausgehend von der p35S-2301-Plasmid-DNA durch PCR unter Verwendung der Primer 35S-IE und CAT-A amplifiziert. Dieses Fragment wurde als CAT-A bezeichnet. Primer:
Das Segment, das die 3'-Hälfte des Katalaseintrons (106 bp) und das uidA 2^nd-Exon (1809 bp) umfasste, wurde ausgehend von der p35S-2301-Plasmid-DNA durch PCR unter Verwendung der Primer CAT-B und GUS-BstEII amplifiziert. Dieses Fragment wurde als CAT-B bezeichnet. Primer:
Die erhaltenen PCR-Produkte wurden in pGEM-T kloniert und die Nucleotidsequenz wurde verifiziert. Schließlich wurden die einzelnen Fragment aus pGEM-T ausgeschnitten (CAT-A unter Verwendung von EcoRI/PstI, LIR unter Verwendung von PstI/SalI und CAT-B unter Verwendung von SalI/BstEII) und zusammen in mit EcoRI/BstEII verdautes p35S-2301 ligiert, wobei das Plasmid pTEST1 erzeugt wurde (8).
(c) Bestimmung, ob die GUS-Expression durch Insertion der TYDV LIR in das Katalaseintron beeinflusst wird
Um zu bestimmen, ob die GUS-Expression und daher das Intronspleißing durch Insertion der TYDV LIR in das Katalaseintron von p35S-2301 beeinflusst wurde, wurden Konstrukte in embryogene Bananenzellen geschossen und die GUS-Aktivität transient getestet. Das Testplasmid pTEST1 und das Plasmid p35S-2301 zur positiven Kontrolle wurden auf Goldteilchen von 1 μm aufgetragen und biolistisch in embryogene Zellen von 5 Tage alten Bananen (Musa spp. cv. "Ladyfinger" AAA) gemäß Becker et al. (2000) eingeführt. Zwei Tage nach dem Beschuss wurden Zellen geerntet und die GUS-Aktivität histochemisch getestet (Jefferson et al., 1987).
Keine endogene GUS-Aktivität wurde in nicht-beschossenen Zellen beobachtet. Starke GUS-Aktivität, die als Herde stark blau gefärbter Zellen offensichtlich war, wurde bei mit dem Plasmid p35S-2301 zur positiven Kontrolle beschossenen Zellen beobachtet. Im Gegensatz dazu war die GUS-Expression von Zellen, die mit pTEST1 beschossen worden waren, (etwa 5-fach) niedriger, was durch die Zahl und Intensität der Herde blau gefärbter Zellen bestimmt wurde. Dieses Ergebnis legte nahe, dass die Insertion der TYDV LIR in das Katalaseintron von p35S-2301 die GUS-Expression nicht beseitigt, jedoch die Intronprozessierung in einem gewissen Grad beeinflussen kann.
(d) Identifizierung von verborgenen Intronspleißstellen innerhalb der TYDV LIR
Um zu bestimmen, ob die TYDV LIR potentielle verborgene Intronspleißstellen, die die Prä-mRNA-Prozessierung beeinflussen können, enthielt, wurde cDNA aus RNA-Extrakten, die von mit p35S-2301 und pTEST1 beschossenen Zellen stammten, synthetisiert. Die Gesamt-RNA wurde aus Bananenzellen zwei Tage nach dem Beschuss mit p35S-2301 und pTEST1 unter Verwendung des Verfahrens von Chang et al. (1993) isoliert. Komplementäre DNA wurde ausgehend von der Gesamt-RNA unter Verwendung des Primers uidA2 synthetisiert. Diese cDNA diente als Templat für eine Nested-PCR unter Verwendung der Primer uidA1 und uidA3. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden in pGEM-T kloniert und sequenziert. Die Sequenzierung identifizierte zwei potentielle Stellen innerhalb der TYDV LIR, die zu einem fehlerhaften Spleißing des Katalaseintrons ausgehend von der uidA-Codierregion-Prä-mRNA beitragen können. Die erste Sequenz, CTGCAG∇GC, die innerhalb des zur Isolierung der TYDV LIR verwendeten Primers LIR-F lokalisiert ist, zeigt starke Ähnlichkeit zur Konsensus-3'-Spleißstelle (T(10X)GCAG∇GT). Die zweite Sequenz, TA∇GTGAGT (nt +43 bis nt +50), zeigt eine gewisse Ähnlichkeit mit der Konsensus-5'-Spleißstelle (AG∇GTAAGT). Primer:
(e) Entfernung der verborgenen 3'-Intronspleißstelle von der TYDV LIR
Von den zwei identifizierten verborgenen Intronspleißstellen wurde die erste (CTGCAGGC) aufgrund ihrer Position in Bezug auf die 5'-Katalaseintron-Spleißstelle als am wichtigsten betrachtet. Um diese Sequenz von der TYDV LIR zu entfernen, wurde ein neuer Primer, LIR-Xho, konstruiert, der eine XhoI-Stelle anstelle der ursprünglichen PstI- und NotI-Restriktionsstellen enthielt.
Die TYDV LIR wurde aus der pTEST1-Plasmid-DNA durch PCR unter Verwendung der Primer LIR-Xho und LIR-R reamplifiziert. Dieses Fragment wurde als LIR-X bezeichnet. In ähnlicher Weise wurde das Fragment, das den CaMV 35S-Promotor (530 bp), das uidA 1^st-Exon (19 bp) und die 5'-Hälfte des Katalaseintrons (83 bp) umfasste, ausgehend von der pTEST1-Plasmid-DNA durch PCR unter Verwendung der Primer FUP und CAT-Xho reamplifiziert. Dieses Fragment wurde als CAT-X bezeichnet. Beide PCR-Produkte wurden in pGEM-T kloniert und deren Sequenzen wurden verifiziert. Schließlich wurden die PCR-Fragmente aus pGEM-T ausgeschnitten (LIR-X unter Verwendung von XhoI/SalI und CAT-X unter Verwendung von PstI/XhoI) und in das durch PstI/SalI verdaute pTEST1 ligiert, um die ursprünglichen Inserte zu ersetzen. Dieses Konstrukt wurde als pTEST2 bezeichnet (9). Die Entfernung der verborgenen Intronspleißstelle in pTEST2 erzeugte höhere Grade der GUS-Expression als pTEST1 aufgrund einer Verringerung von fehlerhaftem Spleißen und verbesserter mRNA-Prozessierung. Primer:
(f) Konstruktion des Rep-aktivierbaren GUS-Expressionsvektors
Ein 229-bp-Fragment, das die kleine intergenische Region (SIR) von TYDV enthielt (nt +1275 bis nt +1504), wurde ausgehend von TYDV-infiziertem Tabakblättergewebe durch PCR unter Verwendung der Primer SIR-F und SIR-R amplifiziert (siehe 2). Das erhaltene PCR-Produkt wurde in pGEM-T kloniert und die Nucleotidsequenz wurde verifiziert. Dieses Plasmid wurde als pGEM-SIR bezeichnet. Die TYDV SIR wurde aus pGEM-SIR als SphI-Fragment ausgeschnitten und in die singuläre SphI-Stelle strangabwärts des nos-Terminators in pTEST1 insertiert. Dieses Konstrukt wurde als pTEST1-SIR bezeichnet. Primer:
Der CaMV 35S-Promotor, das uidA 1^st-Exon, die 5'-Hälfte des Katalaseintrons und TYDV LIR wurden aus pTEST2 als NotI/SalI-Fragment ausgeschnitten und in einen auf ähnliche Weise verdauten pGEM-T-Vektor insertiert. Der daraus folgende Klon wurde als pGEM-CATX bezeichnet. Die TYDV LIR, die 3'-Hälfte des Katalaseintrons, das uidA 2^nd-Exon, der nos-Terminator und TYDV SIR wurden aus pTEST1-SIR als NotI-Frag ment ausgeschnitten und in die singuläre NotI-Stelle in pGEM-CATX insertiert. Dieses Konstrukt wurde als pTEST3 bezeichnet (10). Die aktivierbare GUS-Expressionskassette wurde anschließend aus pTEST3 durch SacI/ApaI-Verdau ausgeschnitten und in die SacI/ApaI-Restriktionsstellen, die strangaufwärts der nos-pro-NPTII-nos-ter-Kassette in dem binären Plasmid pART27 (Gleave 1992) lokalisiert sind, insertiert. Dieses Konstrukt wurde als pTEST4 bezeichnet (11). Der Vektor pTEST4 wurde in Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) durch Elektroporation unter Verwendung des Verfahrens von Singh et al. (1993) eingeführt.
(g) Konstruktion des infektiösen TYDV 1.1mer
Zwei überlappende Fragmente des TYDV-Genoms wurden ausgehend von TYDV-infiziertem Tabakblättergewebe durch PCR unter Verwendung der Primerpaare LIR-F/SIR-R (SEQ ID NO: 19/SEQ ID NO: 32) und LIR-R/TYD-3F (SEQ ID NO: 20/SEQ ID NO: 33) amplifiziert. Die erhaltenen PCR-Produkte TYD-R bzw. TYD-L) wurden in pGEM-T kloniert und deren Sequenzen wurden verifiziert. Diese Plasmide wurden als pGEM-TYD-R bzw. pGEM-TYD-L bezeichnet. Ein 1659-bp-Fragment des TYDV-Genoms wurde aus pGEM-TYD-L durch Verdau mit EcoRI ausgeschnitten und in die singuläre EcoRI-Stelle in pGEM-TYD-R insertiert. Dieses Konstrukt wurde als pGEM-TYDV1.1mer bezeichnet. Das TYDV 1.1mer wurde aus pGEM-TYDV1.1mer durch partiellen SalI/EcoRI-Verdau ausgeschnitten und in den ähnlich verdauten pBI101.3-Vektor (Clontech) insertiert, wobei das uidA-Gen und der nos-Terminator ersetzt wurden. Dieses Konstrukt wurde als pBI-TYDV1.1mer bezeichnet (12). Der Vektor pBI-TYDV1.1mer wurde in Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) durch Elektroporation unter Verwendung des Verfahrens von Singh et al. (1993) eingeführt. Primer:
(h) Konstruktion der CaMV 35S-TYDV-Rep-Fusion
Das vollständige Rep (RepA umfassende) Gen von TYDV (nt +2580 bis nt +1485) wurde ausgehend von TYDV-infiziertem Tabakblättergewebe durch PCR unter Verwendung der Primer TYDVRepF und TYDVRepR amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt wurde direkt in die SmaI-Stelle, die zwischen dem CaMV 35S-Promotor (530 bp) und dem CaMV 35S-Terminator (200 bp) in pDH51 (Pietrzak et al., 1986) lokalisiert ist, kloniert. Dieses Konstrukt wurde als p35S-Rep bezeichnet (13). Primer:
BEISPIEL 3
GUS-Expressionstests unter Verwendung von TYDV-Vektoren
(a) Transiente Rep-aktivierte Expression von GUS in Dikotylen- und Monokotylenzellen
Tabak(NT-1)zellen werden im wesentlichen gemäß der Beschreibung bei An (1985) gehalten und für Mikroteilchenbeschuss nach den detaillierten Angaben bei Dugdale et al. (1998) präpariert. Embryogene Zellsuspensionen von Bananen (Musa spp. cv. "Ladyfinger" AAA) wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Die Beschichtung mit Goldteilchen und die biolistischen Parameter waren im wesentlichen gemäß der Beschreibung bei Dugdale et al. (1998) oder Becker et al. (2000).
Die für diese Untersuchung verwendeten Plasmide umfassten:

(i) p35S-2301 als positive Kontrolle (7),
(ii) pTEST3 (10),
(iii) p35S-Re (13) und
(iv) pTEST3 und p35S-Rep.

Fünf Platten beider Zelllinien werden für jede der vier Plasmidkombinationen beschossen. Zellen werden drei Tage nach dem Beschuss geerntet und die GUS-Aktivität wird histochemisch und/oder fluorometrisch getestet (Jefferson et al., 1987).
Keine endogene GUS-Aktivität wird in nicht-beschossenen Zellen beobachtet. Starke GUS-Aktivität, die als Herde stark blau gefärbter Zellen offensichtlich ist, wird bei mit dem Plasmid p35S-2301 zur positiven Kontrolle beschossenen Zellen beobachtet. Keine GUS-Expression wird von mit entweder p35S-Rep oder pTEST3 beschossenen Zellen beobachtet. Im Gegensatz dazu sind Zellen, die mit sowohl p35S-Rep als auch pTEST3 beschossen wurden, intensiv blau gefärbt, stärker als die mit dem Plasmid p35S-2301 zur positiven Kontrolle erhaltenen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nur bei Addition von TYDV Rep unter trans-Bedingungen die GUS-Expressionskassette in pTEST3 aktiviert wird.
(b) Detektion von Rep-gestützter Strangbruchbildung, Verbindung und Replikation des GUS-Mehrfachkopiepflanzenepisoms (MPE)
Die Detektion der TYDV-basierten GUS-MPEs wird unter Verwendung eines PCR-Ansatzes erreicht. Die Primer uidA1 (SEQ ID NO: 25) und uidA3 (SEQ ID NO: 27) amplifizieren ein Fragment des uidA-Gens, das das Katalaseintron überspannt.
Nur bei Rep-gestützter Freisetzung des TYDV-basierten MPE aus dem Plasmid pTEST3 erzeugt diese Primerkombination ein 600-bp-Produkt (das 140 bp des uidA-Gens, 190 bp des Katalaseintrons und 270 bp der TYDV LIR umfasst) in einer PCR.
Tabak-NT-1- und Bananenzellen werden mit den einzelnen, oben aufgelisteten vier Plasmidkombinationen beschossen. Drei Tage nach dem Beschuss werden Zellen geerntet und die Gesamt-gDNA unter Verwendung des Verfahrens von Stewart und Via (1993) extrahiert. Die Gesamt-gDNA (1 μg) wird als Templat für eine PCR mit den Primern uidA1 (SEQ ID NO: 25) und uidA3 (SEQ ID NO: 27) verwendet. Die PCR-Produkte werden durch ein 1,5% (Gew/V) Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Ein 330-bp-Produkt wird aus der gDNA von Zellen, die mit dem Kontrollplasmid p35S-2301 beschossen wurden, erhalten (7). Dieses Produkt entsprach der uidA- und Katalseintronsequenz der zugeführten Plasmid-DNA. Kein PCR-Produkt wird aus gDNA von nicht-beschossenen Zellen oder Zellen, die mit pTEST3 oder p35S-Rep allein beschossen wurden, erhalten. Ein 600-bp-Produkt wird aus gDNA von Zellen, die mit sowohl pTEST3 als auch p35S-Rep beschossen wurden, erhalten. Dieses Ergebnis stützt frühere histochemische Tests von GUS und es legt nahe, dass die TYDV-basierten MPEs nur in Zellen, die mit sowohl pTEST3 als auch p35s-Rep beschossen wurden, erzeugt werden.
Die Replikation der TYDV-basierten MPEs wird durch Southern-Hybridisierung getestet. Unter Verwendung dieses Ansatzes werden Multimerformen des MPE, die eine Rolling-Circle-Replikation anzeigen, durch Hybridisierung detektiert. Gesamt-gDNA (20 μg) von Zellen, die mit den einzelnen vier Plasmidkombinationen beschossen wurden, werden durch ein 1,5% (Gew/V) Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. DNA wird durch das Verfahren von Southern (1975) auf eine Nylonmembran (Roche) übertragen. Eine DIG-markierte Sonde von 600 bp, die für das uidA- und Katalaseintron spezifisch ist, wird durch PCR unter Verwendung der Primer uidA1 (SEQ ID NO: 25) und uidA3 (SEQ ID NO: 27) amplifiziert. Die uidA-spezifische Sonde wird mit der Nylonmembran bei 42°C in DIG Easy-Hyb Solution (Roche) hybridisiert und ein Signal wird nach den Vorschriften des Herstellers unter Verwendung von CDP-Star Substrate (Roche) detektiert. Charakteristische Superknäuel-, lineare und offene zirkuläre Formen und Multimerformen mit höherem Molekulargewicht der TYDV-basierten MPEs werden nur in gDNA von Pflanzenzellen, die mit sowohl pTEST3 als auch p35S-2301 beschossen wurden, detektiert. Diese Ergebnisse zusammen bestätigen, dass TYDV Rep, wenn es in trans-Form bereitgestellt wird, zu Strangbruch, Verbindung und Replikation des TYDV-basierten MPE in sowohl Monokotylen- als auch Dikotylenzelltypen fähig ist. Ferner legen diese Ergebnisse nahe, dass die uidA-Expression ausgehend von dem Plasmid pTEST3 nur bei Addition des TYDV Rep aktiviert wird und die Addition zu einer signifikant höheren Expression als eine nicht-replizierende GUS-Expressionskassette (p35S-2301) führt.
BEISPIEL 4
Stabile Transformation einer Monokotylen- und einer Dikotylenpflanze mit der Rep-aktivierbaren Kassette
Suspensionen embryogener Zellen von Bananen (Musa spp. cv. "Ladyfinger" AAA) werden als Ziele für eine mikroprojektilbasierte stabile Transformation gewählt. Die Zellen werden mit pTEST3 wie zuvor beschrieben beschossen, wobei jedoch das Plasmid mit 1 μg pDHKAN (Pietrzak et al., 1986) co-transformiert wird. Dieses Plasmid enthält eine CaMV 35S pro-NPTII-CaMV 35S ter-Kassette, wobei die Expression des NPTII-Gens ausgehend von dieser Resistenz gegenüber den Antibiotika Kanamycin oder Geneticin verleiht. Die Selektion, Kultivierung und Regeneration transgener Bananen pflanzen erfolgen im wesentlichen gemäß der Beschreibung bei Becker et al. (2000). Für unabhängige transgene Pflanzen wird durch PCR unter Verwendung der Primerpaare NPT-F/NPT-R bzw. uidA4/uidA5 festgestellt, dass sie sowohl das NPTII- als auch das uidA-Gen enthalten. Zehn unabhängige Transformanten werden für weitere Untersuchungen selektiert. Primer:
Tabak (Nicotiana tabacum cv. "Samsun") wird durch eine Agrobacterium-vermittelte Infektion von Blattscheiben nach dem Verfahren von Horsch et al. (1988) transformiert. Zehn unabhängige Transformanten werden mit T-DNA von dem Plasmid pTEST4 transformiert. Für jede Linie wird durch PCR wie oben beschrieben gezeigt, dass sie die NPTII- und uidA-Codierregionen enthalten.
Blattstücke von den einzelnen zehn transgenen Bananen- und Tabaklinien, die mit der Rep-aktivierbaren GUS-Expressionskassette (d. h. pTEST3 [10] bzw. pTEST4 [11]) transformiert wurden, werden mit dem Plasmid p35S-Rep beschossen. Drei Tage nach dem Beschuss werden die Blattstücke histochemischen Tests von GUS unterzogen. Keine GUS-Expression ist in nicht-beschossenen Blattstücken von den einzelnen zehn Bananen- und Tabaklinien offensichtlich. Blattstücke, die mit dem Plasmid p35S-Rep beschossen wurden, zeigen mehrere Herde blauer GUS-Färbung. Eine Rep-dirigierte Strangbruchbildung, Verbindung und Replikation der TYDV-basierten MPEs wird wie zuvor beschrieben in diesen Blattstücken festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass TYDV Rep zur Aktivierung der GUS-Expression ausgehend von einer stabil integrierten Kopie von einem der beiden Plasmide und zur Strangbruchbildung, Verbindung und Replikation des TYDV-basierten MPE in vivo fähig ist.
BEISPIEL 5
Durch TYDV-Infektion aktivierte Expression in transgenem Tabak
In jede der 10 transgenen Tabaklinien werden Agrobacterium-Kulturen, die mit pBI-TYDV1.1mer (siehe Beispiel 2(f), 12) transformiert sind, unter Verwendung des Verfahrens von Boulton (1995) infiltriert. Über einen Zeitraum von zwei Monaten werden Proben vom Infektionspunkt und über die gesamte Pflanze genommen und die GUS-Expression unter Verwendung histochemischer Tests festgestellt. GUS-Aktivität (d. h. blau gefärbtes Gewebe) wird nur bei TYDV-infizierten Pflanzen im Vergleich zu scheingeimpften Kontrollen festgestellt. Über die Zeit verbreitet sich die GUS-Expression über das Gefäßsystem vom Anfangspunkt der Infektion in verschiedene Pflanzenteile. Die Rep-dirigierte Strangbruchbildung, Verbindung und Replikation der GUS-Expressionskassette wird wie zuvor beschrieben etabliert. Dieses Ergebnis legt nahe, dass eine TYDV-Infektion zur replikativen Freisetzung der GUS-Expressionskassette aus einer integrierten Chromosomenkopie ausreichend ist.
BEISPIEL 6
Transiente Zelltodassays unter Verwendung von Expressionsvektoren auf der Basis von BBTV
Um aufzuzeigen, dass Barnase zum Verursachen von Zelltod fähig war, wurden Assays mit den Expressionsvektoren (pTBN, pTBN6, pTBN1, 1, 2 und 3) durchgeführt. Negative Kontrollen waren pUBN6 und pUBN1 (siehe Beispiel 1 oben).
Jedes dieser Konstrukte wurde zusammen mit einem GUS-Vektor in Suspensionen embryogener Zellen von Bananen (Musa spp. cv. Bluggoe) im wesentlichen gemäß der Beschreibung bei Dugdale et al., 1998, geschossen. Der GUS-Vektor enthielt einen starken Promotor (Mais-Ubil, CaMV 35S oder Banana Act1), der die Expression des Reportergens β-Glucuronidase antreibt (Jefferson, 1987). Anschließende MUG-Assays für GUS-Aktivität zeigten, dass Zellen, die mit entweder pTBN, pTBN6 oder pTBN1 transformiert waren, eine niedrigere GUS-Aktivität als die negative Kontrolle (pUBN1 oder pUBN6) aufwiesen (14). Dies legt nahe, dass Intronspleißing immer noch erfolgt und mindestens im Falle von pTBN1 kein signifikanter Unterschied gegenüber dem ursprünglichen pTBN-Vektor besteht. Daher verringerte der Einbau der BBTV-Replikationselemente in das Intron die Spleißing-Wirksamkeit oder anschließende Aktivität von Barnase in Bezug auf pTBN nicht signifikant.

Experimente wurden durchgeführt, die zeigten, dass Rezirkularisation und Replikation von BBTV-basierten "1.1mers" in Gegenwart von Rep (Genprodukt von BBTV DNA-1) erfolgen. Es wurde auch ermittelt, dass die Replikation durch Einbau des Genprodukts von BBTV-DNA5 (ein vermutliches, einem an ein Retinoblastom bindenden ähnliches Protein) verstärkt war. Infolgedessen wurden jeder der Rezirkularisationsvektoren (pRTBN6 [4], pRTBN1 [5] pRUBN6, pRUBN1) mit BBTV-DNA-1 und 5 "1.1mers" und einem GUS-Expressionvektor beschossen. TABELLE 2 Plasmidkombinationen, die für Mikroprojektilbeschuss von Bananenzellen verwendet wurden

x-Achsen-Markierung (Figur 15)	RTBN6	RUBN6	RTBN1	RUBN1
BBTV1	⎷	⎷	⎷	⎷
BBTV5	⎷	⎷	⎷	⎷
GUS	⎷	⎷	⎷	⎷
RTBN6	⎷	-	-	-
RUBN6	-	⎷	-	-
RTBN1	-	-	⎷	-
RUBN1	-	-	-	⎷

Die in 15 gezeigten Ergebnisse stützten die früheren Expressionsvektor-Zelltod-Assays (14). Erneut wiesen die Konstrukte, die nichttranslatierbare Barnase enthielten, (pRUBN6 und pRUBN1) höhere GUS-Aktivität als die translatierbaren Konstrukte auf.

Experimente wurden durchgeführt, um zu belegen, dass Barnaseaktivität nur in Gegenwart des Rep-Gens induziert wurde. Infolgedessen wurden Assays +/– Rep (BBTV-DNA-1 "1.1mer") durchgeführt, um zu belegen, dass Expression erfolgt, wenn dieses vorhanden war (Tabelle 3). "Steifere" DNA wurde verwendet, um eine konstante DNA-Konzentration beizubehalten. TABELLE 3 Plasmidkombinationen, die für Mikroprojektilbeschuss von Bananenzellen verwendet wurden

x-Achsen-Markierung (Figur 16)	RTBN6+	RTBN6–	RUBN6+	RTBN1+	RTBN1–	RUBN1+
BBTV1	⎷	-	⎷	⎷	-	⎷
BBTV5	⎷	⎷	⎷	⎷	⎷	⎷
GUS	⎷	⎷	⎷	⎷	⎷	⎷
RTBN6	⎷	⎷	-	-	-	-
RUBN6	-	-	⎷	-	-	-
RTBN1	-	-	-	⎷	⎷	-
RUBN1	-	-	-	-	-	⎷
Steifer	-	⎷	-	-	⎷	-

Um zu beobachten, ob die Rezirkularisationskonstrukte zur Replikation in Gegenwart der BBTV-DNA-1- und -5-"1.1mers" fähig waren, wurden nicht translatierbare Konstrukte in transiente Bananenzellenreplikationsassays eingeschlossen. Zellen wurden 0, 4 und 8 Tage nach dem Beschuss geerntet, die gesamte zelluläre DNA wurde unter Verwendung von Southern Hybridisierung extrahiert und analysiert.
Zunächst wurden die Membranen mit einer DIG-markierten CaMV 35S-Sonde sondiert. Keine replikativen Formen waren in Zellen am Tag 4 oder 8 offensichtlich. Jedoch waren am Tag 0 potentielle replikative Formen in sehr niedrigen Konzentrationen in sowohl pRUBN6 als auch pURBN1 vorhanden. Die 35S-Sonde wurde abgezogen und die Membranen wurden erneut mit einer DIG-markierten BBTV-DNA-1-Sonde sondiert. Hohe Replikationsgrade wurden in Zellen beobachtet, die sowohl am Tag 4 als auch am Tag 8 geerntet wurden, und fast keine wurden in Zellen beobachtet, die am Tag 0 geerntet wurden.
BEISPIEL 7
Zelltodassays unter Verwendung von Expressionsvektoren auf der Basis von TYDV
(a) Rep-aktivierbarer Suizidgenvektor, der Resistenz gegenüber TYDV verleiht
Das Plasmid pRTBN (DNA Plant Technologies, Oakland, Kalifornien) enthält die Barnase-Codierregion (339 bp), in die das Kartoffel-ST-LS1-Intron (188 bp) eingearbeitet wurde. Das Barnasegen und Intron wurden insgesamt ausgehend von pRTBN durch PCR unter Verwendung der Primer BARN.EXP1 und BARN.EXP2 amplifiziert. Eine nichttranslatierbare Genkontrolle wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung der Primer BARN.UTR und BARN.EXP2 amplifiziert. Primer:
Die PCR-Produkte wurden in den pGEM-T-Vektor kloniert. Diese Klone wurden als pGEM-BTR bzw. pGEM-BUTR bezeichnet. Die TYDV LIR (LIR-X) wurde als EcoRI-Fragment aus pGEM-T ausgeschnitten und in die MfeI-Stelle, die innerhalb des Kartoffel-LRS-Introns von pGEM-BTR und pGEM-BUTR lokalisiert ist, insertiert. Diese Plasmide wurden als pBTR-LIR bzw. pBUTR-LIR bezeichnet. Die LIR enthaltenden Barnasegene in pBTR-LIR und pBUTR-LIR wurden als BamHI/PstI-Fragmente ausgeschnitten und in einen in ähnlicher Weise verdauten pGUS2-Vektor unter Ersetzen der ursprünglichen uidA-Codierregion insertiert.
Das Plasmid pGUS2 enthält ein CaMV 35S- pro (530 bp)-uidA-Gen-CaMV 35S ter (200 bp). Diese Konstrukte wurden als p35S-BTR-LIR bzw. p35S-BUTR-LIR bezeichnet (17). Zwei Kontrollplasmide wurden durch Auschneiden der Barnasegene aus pGEM-BTR und pGEM-BUTR mit BamHI/PstI und Insertion in auf ähnliche Weise verdautes pGUS2 konstruiert. Diese Kontrollplasmide wurden als p35S-BTR bzw. p35S-BUTR bezeichnet (18).
(b) Transiente Feststellung von durch TYDV Rep aktivierter Barnaseaktivität in Monokotylen- und Dikotylenzellen
Um Barnaseaktivität in vivo zu bestimmen, werden Suizidkonstrukte zusammen mit einer Expressionskassette mit Green Fluorescent Protein (gfp) beschossen. Das Auftreten einer Barnase-Expression und -Wirkung (d. h. Zelltod) wird angenommen, wenn eine signifikante Verringerung grün fluoreszierender Herde im Vergleich zu den nichttranslatierbaren Barnasekontrollen beobachtet wird.
Bananen (Musa spp. cv. "Ladyfinger")- und Tabak (Nicotiana tabacum NT-1)zellen werden mit den Plasmiden (i) p35S-BTR, (ii) p35S-BUTR, (iii) p35S-BTR-LIR und (iv) p35S-BUTR-LIR gemäß der Beschreibung in obigem Beispiel 3 beschossen (17 und 18). Jedes Plasmid wird gleichzeitig mit 1 μg pWORM beschossen. Das Konstrukt pWORM enthält eine CaMV 35S pro (530 bp)-gfp (750 bp)-CaMV 35S ter (200 bp)-Kassette und für dieses wurde früher gezeigt, dass es in transienten Assays mit beiden Zelltypen starke grüne Fluoreszenz ergibt (Dugdale et al., 1998).
Drei Tage nach dem Beschuss wird grüne Fluoreszenz unter Verwendung eines Leica MZ12-Stereomikroskops mit einem GFP-Plus Fluorescence Module (Anregung = 490, Emission = 510) sichtbar gemacht. Sowohl p35S-BTR als auch p35S-BTR-LIR verringern signifikant die gfp-Expression von pWORM (was durch die Zahl und Intensität grün fluoreszierender Herde bestimmt wird) im Vergleich zu p35S-BUTR und p35S-BUTR-LIR. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Insertion des TYDV LIR in das St LS1-Intron innerhalb von p35S-BTR weder die Intronprozessierung stört noch die Barnase-Expression hemmt.
(c) Konstruktion des durch TYDV Rep aktivierbaren Barnasevektors
Der CaMV 35S-Promotor, die Barnase-5'-Genhälfte, die ST LS1-5'-Intronhälfte und TYDV LIR werden ausgehend von p35S-BTR-LIR (17A) durch PCT unter Verwendung der Primer 35S-IE (SEQ ID NO: 21) und LIR-R (SEQ ID NO: 20) reamplifiziert. Das PCR-Produkt wird in den pGEM-T-Vektor kloniert und die Sequenz wird verifiziert. Dieses Plasmid wird als pGEMB5' bezeichnet. TYDV LIR, die ST LS1-3'-Intronhälfte, die Barnase-3'-Genhälfte und der nos-Terminator werden aus p35S-BTR-LIR als XhoI/SacI-Fragment ausgeschnitten, TYDV SIR wird aus pGEM-SIR als SacI/NcoI-Fragment ausgeschnitten und der CaMV 35S-Promotor, die Barnase-5'-Genhälfte, die ST LS1-5'-Intronhälfte und TYDV LIR werden aus pGEMB5' als partielles NcoI/SacII-Fragment ausgeschnitten. Die Inserts werden mit durch XhoI/SacII verdautem pBluescript II (Stratagene) zusammenligiert. Das erhaltene Konstrukt wird als pBTR.test1 bezeichnet (19A). Der nichttranslatierbare Kontrollvektor wird auf ähnliche Weise hergestellt und das erhaltene Konstrukt wird als pBUTR.test1 bezeichnet (19B).
(d) Transiente TYDV Rep-aktivierte Barnase-Expression in Monokotylen- und Dikotylenzellen

Bananen (Musa spp. cv. "Ladyfinger")- und Tabak (Nicotiana tabacum NT-1)zellen werden wie oben beschrieben mit den in der folgenden Tabelle 4 aufgelisteten Plasmidkombinationen beschossen: TABELLE 4 Plasmidkombinationen für transiente Transformationsassays in Bananen- und Tabakzellen und dabei erhaltene gfp-Expression (als + oder – festgestellt)

Plasmidkombination	p35S-BTR pWORM	p35S-BUTR pWORM	pBTR-test1 pWORM	pBUTR-test1 pWORM	pBTR-test1 pWORM p35S-Rep	pBUTR-test1 pWORM p35S-Rep
Grün fluoreszierende Herde 3 Tage nach dem Beschuss	nein	ja	ja	ja	nein	ja

Die Ergebnisse in Tabelle 4 legen nahe, dass die Barnase-Expression (und daher Zelltod) nur von pBTR-test1 aktiviert wird, wenn TYDV Rep in trans-Form geliefert wird. Die Repaktivierte Expression der nichttranslatierbaren Barnase-Genkassette (pBUTR-test1) führt zu keiner signifikanten Verringerung der gfp-Expression von pWORM. Die Rep-gestützte Strangbruchbildung, Verbindung und Replikation der MPEs von Zellen, die mit pBUTR-test1, pWORM und p35S-Rep beschossen wurden, wird wie zuvor beschrieben festgestellt, wobei jedoch die Primer BARN.UTR (SEQ ID NO: 40) und BARN.EXP2 (SEQ ID NO: 41) für PCR verwendet werden und eine DIG-markierte barnasespezifische Sonde unter Verwendung der zuvor genannten Primer synthetisiert wird.
(e) Konstruktion von binären Plasmiden, die die Rep-aktivierbaren Barnase-Genkassetten enthalten
Rep-aktivierbare Barnase-Kassetten werden aus pBTR-test1 und pBUTR-test1 als PvuII-Fragmente ausgeschnitten und in die singuläre EcoRI-Stelle (unter Verwendung des großen Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I stumpfendig gemacht), die strangabwärts der CaMV 35S pro-NPTII-CaMV 35S ter-Kassette in dem binären Plasmid pTAB5 (CSIRO, Canberra, Australien) lokalisiert ist, insertiert. Die erhaltenen Konstrukte werden als pTAB-BTR1 bzw. pTAB-BUTR1 bezeichnet. Beide Vektoren werden in Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) durch Elektroporation unter Verwendung des Verfahrens von Singh et al. (1993) eingeführt.
(f) Stabile Transformation von Monokotylen und Dikotylen mit den Rep-aktivierbaren Barnase-Kassetten
Die stabile Transformation von Banane (Musa spp. cv. "Ladyfinger" AAA) und Tabak (Nicotiana tabacum cv. "Samsun") erfolgt gemäß der Beschreibung in obigem Beispiel 4, wobei jedoch die Plasmide pBTR-test1 und pBUTR-test1 unabhängig voneinander zusammen mit pDHKAN zur stabilen Bananentransformation transformiert werden und Agrobacterium-Kulturen, die die Plasmide pTAB-BTR1 und pTAB-BUTR1 beherbergen, für eine Agrobacterium-vermittelte Transformation von Tabakblätterscheiben verwendet werden.
Dass transformierte Pflanzen die Barnase-Genkassetten und das NPTII-Gen enthalten, wird durch PCR unter Verwendung der Primerpaare LIR-F/LIR-R (SEQ ID NO: 19/SEQ ID NO: 20) bzw. NPT-F/NPT-R (SEQ ID NO: 36/SEQ ID NO: 37), festgestellt. Zehn unabhängige transgene Linien von sowohl Monokotylen- als auch Dikotylenarten werden für weiteren Untersuchungen ausgewählt.
(g) Rep-aktivierte hypersensitive Resistenz gegenüber TYDV in transgenem Tabak
Die Rep-Aktivierung der Barnase-Expression in den mit pTAB-BTR1 und pTAB-BUTR1 transformierten zehn unabhängigen Tabakpflanzen wird zunächst durch Teilchenbeschuss des p35S-Rep-Konstrukts in Blattstücke, wie beschrieben wurde, getestet. Zwei Tage nach dem Beschuss ist eine Nekrose beschossener Bereiche nur auf Blättern von Tabakpflanzen, die mit der Rep-aktivierbaren translatierbaren Barnase-Genkassette (pTAB-BTR1) transformiert wurden, im Vergleich zur nichttranslatierbaren Kontrolle (pTAB-BUTR1) offensichtlich. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Einführung von TYDV Rep in trans-Form zur replikativen Freisetzung der Barnase-Expressionskassette aus einer integrierten Chromosomenkopie ausreichend ist. Die Rep-gestützte Strangbruchbildung, Verbindung und Replikation wird in Blattstücken von Tabakpflanzen, die mit pTAB-BUTR1 transformiert sind, festgestellt, wie dies für die Transientenassays in NT-1-Zellen beschrieben ist.
Um hypersensitive Resistenz gegenüber TYDV in transgenem Tabak zu belegen, werden virenübertragende Zwergzikaden (Orosius argentatus) bis zu 2 Tage Pflanzen fressen gelassen. Über die folgende Woche werden die Pflanzen auf charakteristische TYDV-Symptome, die ursprünglich von Hill (1937) beschrieben wurden, inspiziert. Pflanzen, die mit der Rep-aktivierbaren, nichttranslatierbaren Barnase-Expressionskassette (pTAB-BUTR1) transformiert sind, rufen typische TYDV-Symptome, die Verzwergung, Vergilben, Herabbiegen von Rändern und Spitzen junger Blätter und Verkürzen der Internodi umfassen, hervor. Im Gegensatz dazu zeigen Tabakpflanzen, die mit der Rep-aktivierbaren, translatierbaren Barnase-Expressionskassette (pTAB-BTR1) transformiert sind, atypische nekrotische Läsionen an der Stelle des Fressens von Blattläusen (sehr wahrscheinlich das Ergebnis von Barnaseinduziertem Zelltod). Diese Pflanzen entwickeln sich über die folgenden drei Monate im Vergleich zu nicht infizierten Tabakpflanzen normal und sie entwickeln an keinem Punkt für eine TYDV-Infektion charakteristische Symptome.
Gesamt-gDNA wird von Blättern von jeder der 20 transgenen Tabakpflanzen und nicht infizierten Kontrollen zwei Wochen nach der Infektion unter Verwendung des Verfahrens von Stewart und Via (1993) isoliert. Die Gesamt-gDNA (1 μg) wird als Templat für eine PCR mit Primern, die für das TYDV-Hüllproteingen konstruiert wurden, (CP-F und CP-R) verwendet. Das 765-bp-Hüllproteingen und daher das Virusgenom wird nur in mit pTAB-BUTR1 transformiertem Tabak detektiert. Dieses Ergebnis legt nahe, dass mit pTAB-BTR1 transformierte Tabakpflanzen über längere Zeiträume gegenüber einer TYDV-Infektion resistent sind und frei von TYDV-induzierten Symptomen bleiben. Primer:
BEISPIEL 8
gfp-Vektorkonstruktionen – basierend auf BBTV
Eine ähnliche Reihe von Vektoren auf der Basis der Rep-aktivierbaren Barnase-Kassetten wurden unter Verwendung des Reportergens mit Codierung für Green Fluorescent Protein (GFP) und von intergenischen BBTV-Regionen konstruiert. Sowohl Expressions- als auch Rezirkularisationsvektoren wurden durch überlappende PCR in einer der pRTBV-Vektorreihe ähnlichen Weise konstruiert und in einen pUCl9-Vektor kloniert. Die bei der Konstruktion dieser Vektoren verwendeten Primer sind in Tabelle 5 angegeben. In einigen Fällen wurden die Plasmide pBN, pTBN6 und pTBN1 als Template für PCRs verwendet. TABELLE 5 Oligonucleotidsequenzen
Zunächst wurden die Plasmide pGI (SEQ ID NO: 69), pGI6 (SEQ ID NO: 70), pGI1 (SEQ ID NO: 71) konstruiert und diese sind in 20, 21 bzw. 22 angegeben. Schließlich wurden die Plasmide pRGI6, pRGI1, pRGI1/6 konstruiert und diese sind in 23, 24 bzw. 25 angegeben. In 20 bis 25 bezeichnet Intron das Kartoffel-ST-LS1-Intron, intergenische Regionen sind von entweder BBTV DNA-1 oder -6 abgeleitet und CT und NT bezeichnen die C-terminalen und N-terminalen Bereiche des GFP-Reportergens.
Die Effizienz dieser verschiedenen Konstrukte wird in Transientenassays über Mikroprojektilbeschuss von Bananenzellsuspensionen festgestellt. Die ersten Transientenassays ermitteln die GFP-Expression, um zu bestimmen, ob die verschiedenen Monomere replikativ freigesetzt und rezirkularisiert werden, und dass das GFP-Gen korrekt transkribiert, prozessiert und exprimiert wird. Ein BBTV DNA-1-1.1mer wird in äquimolare Mengen von entweder pGI1 oder pGI6 eingemischt und in Suspensionen embryogener Zellen von Bananen geschossen. Acht Tage nach dem Beschuss werden replikative Freiset zung und Zirkularlisation durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer GFP-spezifischen Sonde getestet. Die GFP-Expression wird unter Verwendung eines GFP-Mikroskops überwacht und unter Verwendung von Western-Blot-Analyse und GFP-spezifischen Antiseren quantitativ bestimmt.
Southern-Hybridisierung gibt das Vorhandensein von monomeren zirkulären Molekülen von entweder pGI1 oder pGI6P nur an, wenn das BBTV DNA-1-1.1mer in trans-Form geliefert wird. In ähnlicher Weise wird eine GFP-Expression nur detektiert, wenn das von Viren abgeleitete 1.1mer vorhanden ist.
BEISPIEL 9
Stabile Transformation von Bananen für Barnase-induzierte Resistenz gegenüber BBTV
Suspensionen embryogener Zellen von Bananen von sowohl der Art Bluggoe als auch Cavendish werden gemeinsam mit pRTBN6 und einem Plasmid, das das selektierbare Markergen trägt, unter Verwendung von Mikroprojektilbeschuss co-transformiert (Becker et al., 2000). Regenerierte Pflanzen werden durch PCR getestet, um zu bestimmen, ob eine vollständige Kopie der Rep-aktivierbaren Barnase-Kassette in das Bananengenom eingebaut ist. Positive Transformanten werden vermehrt und zunächst fünf Pflanzen von jeder Transformation werden mit 20 BBTV-virustragenden Blattläusen beimpft. Southern-Hybridisierung-Analysen werden zum Vergleich der Grade einer Virus-DNA-Ansammlung zwischen transformierten und nichttransformierten Pflanzen verwendet. Vielversprechende transgene Linien werden weiter vermehrt, erneut beimpft und getestet.
In nahezu allen Fällen zeigen transgene Bananenpflanzen keine Zeichen für eine Banana Bunchy Top-Erkrankung im Vergleich zu Kontrollen. Statt dessen wird eine atypische Nekrose an der Stelle des Fressens von Blattläusen beobachtet, was sehr wahrscheinlich Barnase-induzierten Zelltod widerspiegelt. Unter Verwendung von PCR und Southern-Hybridisierung kann das Hüllproteingen von BBTV in keinem getesteten Pflanzenteil detektiert werden, was nahelegt, dass diese Linien gegenüber einer Infektion, Replikation und Verbreitung von BBTV resistent sind.
BEISPIEL 10
Gewebespezifische und induzierbare, Rep-aktivierte Expression – auf der Basis von TYDV
Um den Ort einer Rep-Expression und daher die Transgenaktivierung/Replikation in planta zu steuern, wurden gewebespezifische Promotoren verwendet.
(a) Konstitutive Expression
Der Vektor pTAB16 enthält CaMV 35S pro-bar selection geneocs ter- und CaMV 35S pro-uidA-CaMV 35S ter-Kassetten, die zwischen der rechten und linken T-DNA-Grenze in pBIN16 lokalisiert sind. Die CaMV 35S-TYDV Rep-Genkassette wird aus p35S-Rep durch EcoRI/BamHI-Verdau ausgeschnitten und in ähnlich verdauten pTAB16-Vektor insertiert, um die ursprüngliche CaMV 35S-uidA-Kassette zu ersetzen. Dieses Konstrukt wird als pTAB-TYDV-Rep bezeichnet.
(b) Samenspezifische Expression
Es wurde gezeigt, dass der 1-kb-Reis-Glutelinpromotor (Genbank Accession X52153) die samenspezifische Reportergenexpression in Tabak dirigiert (Leisy et al., 1989). Der Reis-Glutelinpromotor wird aus dem Plasmid pGT3-JEFLK (Miller, 2001) durch NcoI-Verdau ausgeschnitten und in ähnlich verdauten pTAB-TYDV-Rep-Vektor ligiert, um den ur sprünglichen CaMV 35S-Promotor zu ersetzen. Dieses Konstrukt wird als pGL-TYDV-Rep bezeichnet.
(c) Wurzelspezifische Expression
Es wurde gezeigt, dass der 880-bp-Arabidopsis thaliana-wurzelspezifische-Kinasehomologon (ARSK1)-Promotor (Genbank Accession L22302) eine gewebespezifische uidA-Reportergenexpression in epidermalen, endoepidermalen und Kortexregionen von A. thaliana-Wurzeln dirigiert (Hwang und Goodman, 1995). Der ARSK1-Promotor wird ausgehend von A. thaliana-gDNA durch PCR unter Verwendung der Primer ARSK-F und ARSK-R amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt wird in pGEM-T kloniert und die Sequenz wird verifiziert. Der ARSK1-Promotor wird aus pGEM-T durch NcoI-Verdau ausgeschnitten und in auf ähnliche Weise verdautes pTAB-TYDV-Rep ligiert, um den ursprünglichen CaMV 35S-Promotor zu ersetzen. Dieses Konstrukt wird abs pAR-TYDV-Rep bezeichnet. Primer:
(d) Wundeninduzierbare Expression
Es wurde gezeigt, dass der 2032-bp-Asparagus officinalis-PR-Gen (AoPR1)-Promotor (Genbank Accession: A26573) eine starke Reportergenexpression in Wundzellarten und sich aktiv teilenden Zellarten, beispielsweise Kallus, dirigiert (Firek et al., 1993). Der AoPR1-Promotor wird ausgehend von A. officinalis-gDNA durch PCR unter Verwendung der Primer AoPR-F und AoPR-R amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt wird in pGEM- T kloniert und die Sequenz wird verifiziert. Der AoPR1-Promotor wird aus pGEM-T durch NcoI-Verdau ausgeschnitten und in auf ähnliche Weise verdautes pTAB-TYDV-Rep ligiert, um den ursprünglichen CaMV 35S-Promotor zu ersetzen. Dieses Konstrukt wird als pAo-TYDV-Rep bezeichnet. Primer:
(c) Alkoholinduzierbare Expression
Der ALC-Switch, der von Aspergillus nidulans abgeleitet ist, ist ein alkoholinduzierbares Promotorsystem, das auf dem AlcA-Promotor und AlcR-Rezeptor basiert. Unter Verwendung eines uidA-Reportergenmodells wurde gezeigt, dass der ALC-Switch in Pflanzensystemen funktioniert (Caddick et al., 1998). Das Plasmid pSRNAGS (BTI, Cornell University, Ithaca, New York) enthält eine CaMV 35S pro-AlcR-Gen-nos ter- und AlcA pro-uidA-Reportergen-CaMV 35S-ter-Kassette in pBIN16. Die CaMV 35S pro-AlcR-Gen-nos ter-AlcA pro-Kassette wird ausgehend von pSRNAGS durch PCR unter Verwendung der Primer 35S-IE (SEQ ID NO: 21) und Alc-R (SEQ ID NO: 61) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird in pGEM-T kloniert und die Sequenz wird verifiziert. Das Insert wird dann durch NocI-Verdau ausgeschnitten und in auf ähnliche Weise verdautes pTAB-TYDV-Rep ligiert, um den ursprünglichen CaMV 35S-Promotor zu ersetzen. Dieses Konstrukt wird als pAlc-TYDV-Rep bezeichnet. Primer:
Jedes der binären, TYDV Rep enthaltenden Plasmide wird in Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) durch Elektroporation unter Verwendung des Verfahrens von Singh et al. (1993) eingeführt.
(f) Gewebespezifische und induzierbare Rep-Expression dirigiert die Reportergenaktivierung in präzisen Gewebetypen
Blätter von Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid pTEST4 transformiert sind, werden mit Agrobacterium, das die Plasmide pTAB-TYDV-Rep, pGL-TYDV-Rep, pAR-TYDV-Rep, pAo-TYDV-Rep und pAlc-TYDV-Rep beherbergt, unter Verwendung des Verfahrens von Horsch et al. (1988) superinfiziert. In diesem Fall wird die Selektion transformierter Tabakpflanzen unter Verwendung des Herbizids Phosphoinothricinammonium (PPT) erreicht. Für transgene Pflanzen wird durch PCR unter Verwendung der Primer TYDV.RepF und TYDV.RepR bestätigt, dass sie das TYDV Rep-Gen enthalten. Zehn unabhängige Transformanten für jedes Plasmid werden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die Pflanzen werden bis zur Reife gezüchtet, blühen gelassen und der Samen wird gewonnen. Verschiedene Pflanzenorgane von unabhängigen Transformanten, die Blätter, Stängel, Wurzeln, Blüten und Samen umfassen, werden gesammelt und die GUS-Aktivität wird unter Verwendung histochemischer Assays detektiert.
Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid pTAB-TYDV-Rep supertransformiert sind, zeigen starke GUS-Expression über die gesamten getesteten Pflanzenteile. Der Grad der GUS-Expression in diesen Pflanzen ist beträchtlich höher als in Pflanzen, die mit der nichtreplizierenden Kontrolle pTAB16 transformiert sind.
Im Gegensatz dazu zeigen Pflanzen, die mit dem Plasmid pGL-TYDV-Rep supertransformiert sind, starke GUS-Expression nur in den Samen, Pflanzen, die mit dem Plasmid pAR-TYDV-Rep supertransformiert sind, starke GUS-Expression nur in den Wurzeln, Pflanzen, die mit dem Plasmid pAo-TYDV-Rep supertransformiert sind, starke GUS-Expression in Wund- und Meristemzellen und Pflanzen, die mit dem Plasmid pAlc-TYDV-Rep supertransformiert sind, starke konstitutive GUS-Expression nur, wenn sie in einer 1%-igen (V/V) Ethanollösung getränkt sind.
Eine Rep-gestützte Strangbruchbildung, Verbindung und Replikation der GUS-Expressionskassette wird (wie zuvor beschrieben) in allen Gewebetypen von Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid pTAB-TYDV-Rep supertransformiert sind, festgestellt. Im Gegensatz dazu wird diese Aktivität nur in den Samen von Pflanzen, die mit dem Plasmid pGL-TYDV-Rep supertransformiert sind, in den Wurzeln von Pflanzen, die mit dem Plasmid pAR-TYDV-Rep supertransformiert sind, an der Verletzungsstelle in Pflanzen, die mit dem Plasmid pAo-TYDV-Rep supertransformiert sind, und konstitutiv in ethanolinduzierten Pflanzen, die mit dem Plasmid pAlc-TYDV-Rep supertransformiert sind, detektiert. Dieses Ergebnis legt nahe, dass eine gewebespezifische oder induzierte Expression des TYDV Rep-Gens eine hochgradige Expression aufgrund der Rep-aktivierbaren GUS-Kassette nur in diesen Gewebetypen verleiht.
BEISPIEL 11
TMVp50- und hrmA-Gen-vermittelte Resistenz – auf der Basis von TYDV
(a) TYDV Rep-aktivierte Expression des TMV p50-Helicasefragments induziert systemische erworbene Resistenz (SAR) in Tabak
Frühere Untersuchungen (Erickson et al., 1999) zeigten, dass eine nichtvirale Expression des 50-kDa-Tabakmosaikvirus (TMV)-Helicase-Fragments (p50) zur Induktion der N-vermittelten hypersensitiven Reaktion (HR) in geeigneten Tabakarten (beispielsweise Nicotiana tabacum cv. "Petite Havana", SR1, homozygot für das N-Gen) ausreichend ist. Die Verteidigungsreaktion ist durch Zelltod am Ort der Virusinfektion und Induktion des systemischen erworbenen Resistenz(SAR)pfades mit folgender Hemmung der Virusreplikation und -bewegung gekennzeichnet.
Das p50-Genfragment wird durch PCR unter Verwendung der Primer p50-F und p50-R aus klonierter genomischer TMV-DNA (Plant Gene Expression Centre, University of California, USA) amplifiziert. Das PCR-Produkt wird in pGEM-T kloniert und die Sequenz wird verifiziert. Das Katalaseintron, das die TYDV LIR von pTEST3 enthält (10), wird technisch in frame in die singuläre EcoRI-Stelle in der p50-Codierregion eingebracht. Dieses Plasmid wird als pGEM50-LIR bezeichnet. Ein pUC-basiertes Rep-aktivierbares p50-Genplasmid wird anschließend gemäß der Beschreibung für pTEST3 in obigem Beispiel 2 konstruiert. Die Kassette wird in pART27 wie für pTEST4 beschrieben insertiert. Das erhaltene, Rep-aktivierbare binäre p50-Plasmid wird als pSAR1 bezeichnet. Das Plasmid pSAR1 wird zur Transformation von Agrobacterium wie zuvor beschrieben verwendet. Primer:
(b) Systemische erworbene Resistenz gegenüber TYDV in Tabak
Zehn Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. "Petite Havana", SR1, homozygot für das N-Gen), die mit T-DNA von dem Plasmid pSAR1 transformiert sind, werden durch Agrobacterium-vermit telte Transformation erhalten und es wird durch PCR wie oben beschrieben bestätigt, dass sie die Rep-aktivierbare Kassette und das NPTII-Gen enthalten. Die Pflanzen werden mit TYDV infiziert und auf Symptome wie zuvor beschrieben beobachtet. Tabakpflanzen, die mit dem Rep-aktivierbaren p50-Gen transformiert sind, zeigen atypische hypersensitive Nekrose an der Stelle des Fressens von Blattläusen zwei Tage nach der Infektion. Diese Pflanzen entwickeln sich über die folgenden 3 Monate im Vergleich zu infizierten, nichttransgenen Tabakpflanzen, die typische TYDV-induzierte Symptome zeigen, normal.
TYDV-Genom-DNA wird in beimpftem nichttransgenem Tabak, jedoch nicht in transgenen oder nichtinfizierten Kontrolllinien, wie zuvor beschrieben, detektiert. Dieses Ergebnis legt nahe, dass eine TYDV Rep-induzierte Expression des TMV p50-Gens zur Stimulation der hypersensitiven Reaktion auf das N-Gen in geeigneten Tabak-Kultivars ausreichend ist und Resistenz gegenüber einer TYDV-Infektion ergibt.
(c) Wundeninduzierbare TYDV Rep-Expression aktiviert eine TMV p50-Genexpression und löst SAR gegenüber einer Vielzahl von Pathogenen aus
Blätter von mit pSAR1 transformierten Tabakpflanzen werden mit Agrobacterium, das das Plasmid pAo-TYDV-Rep enthält (Beispiel 10), wie zuvor beschrieben superinfiziert. Zehn supertransformierte Linien, für die bestätigt wurde, dass sie das wundeninduzierbare Rep-Gen enthalten, werden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Transgene Pflanzen und geeignete Kontrollen werden einer Infektion mit einer Vielzahl von Viruspathogenen, beispielsweise (i) Blattlausübertragung des Tobacco Vein Mottling Virus, (ii) Tobacco Rattle Virus gegenüber dem Nematodenvektor Paratrichodorus pachydermus und (iii) biolistische Einführung eines infektiösen BeYDV 1.1mer, unterzogen. Über die Zeit werden die Pflanzen auf charakteristische virusinduzierte Symptome beobachtet. Alle transgenen Pflanzen zeigen atypische hypersensitive Nekrose am Ort der Virusinokulation im Vergleich zu Kontrollen.
(d) Eine wundeninduzierte Expression von TYDV Rep aktiviert eine hrmA-vermittelte breitbandige Pathogenresistenz in Tabak
Es wurde gezeigt, dass das hrmA-Genprodukt von Pseudomonas syringae pv. syringae pathogenbezogene Gene in einer Zahl von Tabak-Kultivars aktiviert und Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Pathogenen, die Viren, Pilze und Bakterien umfassen, verleiht (Shen et al., 2000).
Das hrmA-Gen wird ausgehend von einem Plasmid, das die Codiersequenz enthält, durch PCR unter Verwendung der Primer hrm-F und hrm-R amplifiziert. Ein pUC-basiertes Rep-aktivierbares hrmA-Plasmid wird anschließend gemäß der obigen Beschreibung in Beispiel 2 für pTEST3 konstruiert. Die Kassette wird in pART27 gemäß der Beschreibung für pTEST4 insertiert. Das erhaltene hrmA-aktivierbare binäre Plasmid wird als pSAR2 bezeichnet. Das Plasmid pSAR2 wird zur Transformation von Agrobacterium wie beschrieben verwendet.
Zehn Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum), die mit T-DNA von dem Plasmid pSAR2 transformiert sind, werden durch Agrobacterium-vermittelte Transformation erhalten und es wird durch PCR wie zuvor beschrieben bestätigt, dass sie die Rep-akti vierbare Kassette und das NPTII-Gen enthalten. Blätter von mit pSAR2 transformierten Tabakpflanzen werden mit Agrobacterium, das das Plasmid pAo-TYDV-Rep enthält, wie zuvor beschrieben superinfiziert. Zehn supertransformierte Linien, für die bestätigt wurde, dass sie das wundeninduzierbare Rep-Gen enthalten, werden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Transgene Pflanzen und geeignete Kontrollen werden einer Infektion mit einer Vielzahl von Pathogenen, beispielsweise Tobacco Vein Mottling Virus, Tobacco Etch Virus, des Blank Shank Fungus Phytophthora parasitica und des Wildfeuerbakteriums Pseudomonas syrinagae pv. tabaci, unterzogen. Über die Zeit werden die Pflanzen auf charakteristische, pathogeninduzierte Symptome beobachtet. Alle transgenen Pflanzen zeigen atypische hypersensitive Nekrosis an der Inokulationsstelle im Vergleich zu Kontrollen.
BEISPIEL 12
Überexpression von humanem Serumalbumin – auf der Basis von TYDV
(a) Rep-aktivierte Überexpression eines kommerziell wichtigen Proteins, von humanem Serumalbumin
Albumin ist ein lösliches monomeres Protein, das etwa eine Hälfte des Blutserumproteins umfasst. Albumin fungiert primär als Trägerprotein für Steroide, Fettsäuren und Schilddrüsenhormone und es spielt eine Rolle bei der Stabilisierung des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens.
Die 1831-bp-Codierregion von humanem Serumalbumin (HSA) (Lawn et al., 1981) wird ausgehend von einem das Gen enthaltenden Plasmid durch PCR unter Verwendung der Primer Alb-F und Alb-R amplifiziert. Ein pUC-basiertes, Rep-aktivierbares HSA-Plasmid wird anschließend gemäß der obigen Beschreibung in Beispiel 2 für pPEST3 konstruiert. Die Kassette wird in pART27 gemäß der Beschreibung für pTEST4 insertiert. Das erhaltene, HSA-aktivierbare binäre Plasmid wird als pHSA1 bezeichnet. Das Plasmid pHSA1 wird wie beschrieben zur Transformation von Agrobacterium verwendet.
Zehn Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum), die mit T-DNA von dem Plasmid pHSA1 transformiert sind, werden durch Agrobacterium-vermittelte Transformation erhalten und es wird durch PCR wie beschrieben bestätigt, dass sie die Rep-aktivierbare Kassette und das NPTII-Gen enthalten. Blätter von durch pHSA1 transformierten Tabakpflanzen werden mit Agrobacterium, das die Plasmide pTAB-TYDV-Rep, pGL-TYDV-Rep, pAo-TYDV-Rep, pAlc-TYDV-Rep enthält, wie beschrieben superinfiziert. Für zehn supertransformierte Linien von jeder Transformation wird festgestellt, dass sie das Rep-Gen enthalten und diese werden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Pflanzen werden bis zur Reife gezüchtet und der HSA-Gehalt wird unter Verwendung von ELISA und gegen das HSA-Genprodukt gebildeten Antikörpern festgestellt. Das HSA-Protein wird in hohen Konzentrationen, jedoch in verschiedenen Pflanzenteilen oder unter spezifischen Bedingungen, d. h. konstitutiv (pTAB-TYDV-Rep), nur in Samen (pGL-TYDV-Rep), Wundgeweben (pAo-TYDV-Rep) und konstitutiv in alkoholbehandelten Pflanzen (pAlc-TYDV-Rep) detektiert. Ein vorgeschlagenes Modell für eine Rep-aktivierte Expression des humanen Serumalbumingens ausgehend von dem Plasmid pHSA1 ist in 6 angegeben. Primer:
BIBLIOGRAPHIE

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Konstrukt, das ein genetisches Element umfasst, das operabel von Nucleotidsequenzen flankiert ist, die von einem von einem Virus abgeleiteten, eine Replikation erleichternden Protein erkannt werden können, wenn sie in das Genom einer eukaryotischen Zelle integriert sind, wobei das von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein das Ausschneiden und Zirkularisieren des genetischen Elements und der gesamten flankierenden Nucleotidsequenzen oder eines Teils der flankierenden Nucleotidsequenzen erleichtert und wobei die Nucleotidsequenzen, die durch das von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein erkannt werden, sich angrenzend zu einer oder mehreren, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassenden Fremdsequenzen befinden oder in eine oder mehrere, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassende Fremdsequenzen eingefügt sind, wobei das genetische Element und die anderen Nucleotidsequenzen in einer nichtzirkulären Form zwei modulare Nucleotidsequenzen umfassen, die beim Zirkularisieren eine genetische Sequenz bilden, die eine Eigenschaft oder eine Fähigkeit zum Zeigen einer Eigenschaft, die in den zwei modularen. Nucleotidsequenzen vor der Zirkularisierung oder vor der Zirkularisierung und Expression fehlt, zeigt.
Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein Rep ist.
Konstrukt nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein und/oder die flankierenden Nucleotidsequenzen von demgleichen Virus stammen.
Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2 oder 3, wobei das von einem Virus abgeleitete, eine Replikation erleichternde Protein und/oder die flankierenden Nucleotidsequenzen von unterschiedlichen Viren stammen.
Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die Fremdsequenzen eine Codiersequenz, ein Promotor und/oder ein oder mehrere Spleißsignale umfassen.
Konstrukt nach Anspruch 5, wobei die Codiersequenzen, wenn das Konstrukt in linearer Form vorliegt, zwei durch eine Intronsequenz getrennte modulare Sequenzen umfassen.
Konstrukt nach Anspruch 5 oder 6, wobei nach der Zirkularisierung des genetischen Elements eine vollständige Codiersequenz operabel mit dem Promotor verknüpft ist.
Konstrukt nach Anspruch 7, wobei die Codiersequenz für eine mRNA oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein, die (das) der Zelle oder einem die Zelle umfassenden Organismus oder einer die Zelle umfassenden Pflanze eine phänotypische oder genotypische Eigenschaft verleiht, codiert.
Konstrukt nach Anspruch 8, wobei das Peptid, Polypeptid oder Protein den Zelltod verursacht oder in anderer Weise erleichtert.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Konstrukt in eine eukaryotische Zelle eingebaut ist.
Konstrukt nach Anspruch 10, wobei die eukaryotische Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 10, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugetierzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 10, wobei die eukaryotische Zelle eine Vogelzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 1, das ein genetisches Element umfasst, das von Rep-Protein-Erkennungssequenzen flankiert ist, die die Erzeugung einer das genetische Element umfassenden zirkulären Nucleotidsequenz in Gegenwart eines Rep-Proteins erleichtern, wobei die Rep-Protein-Erkennungssequenzen sich benachbart zu einem oder mehreren Spleißsignalen befinden oder in ein oder mehrere Spleißsignale eingefügt sind, wobei das genetische Element eine Polynucleotidsequenz umfasst, die operabel mit Regulatorsequenzen verknüpft sind, die erforderlich sind, um eine Expression der Polynucleotidsequenz zu erlauben, wenn das genetische Element in einem zirkularisierten Molekül enthalten ist, wobei das genetische Element in linearer Form in 5'- zu 3'-Reihenfolge die folgenden Bestandteile umfasst: eine Polynucleotidsequenz und Regulatorsequenzen, die eine Expression der Polynucleotidsequenz bei Vorliegen in zirkulärer Form erlauben; derart, dass beim Zirkularisieren das genetische Element die Regulatorsequenz umfasst, die von der Poly nucleotidsequenz durch die gesamte Rep-Protein-Erkennungssequenz oder ein Teil der Rep-Protein-Erkennungssequenz getrennt ist, wobei bei Expression die Polynucleotidsequenz für ein Expressionsprodukt codiert.
Konstrukt nach Anspruch 14, wobei die Polynucleotidsequenz bei Vorliegen des Konstrukts in linearer Form 5'- und 3'-Bereiche einer Codiersequenz umfasst, die durch ein Spleißsignal derart getrennt ist, dass in zirkulrärer Form eine vollständige Codiersequenz gebildet wird.
Konstrukt nach Anspruch 14, wobei eine einzelne Rep-Protein-Erkennungssequenz verwendet wird.
Konstrukt nach Anspruch 14, wobei zwei Rep-Protein-Erkennungssequenzen verwendet werden, die von unterschiedlichen Viren stammen.
Konstrukt nach Anspruch 14 oder 15 oder 16 oder 17, wobei die Polynucleotidsequenz ferner eine Terminatorsequenz umfasst, die operabel mit dem 3'-Ende der Codiersequenz verknüpft ist.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Regulatorsequenz ein Promotor ist, der operabel mit dem 5'-Ende der Codiersequenz verknüpft ist.
Konstrukt nach Anspruch 19, wobei die Codiersequenz bei Vorliegen des genetischen Elements in zirkulärer Form für eine mRNA oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein codiert, die (das) der Zelle oder einem die Zelle umfassenden Organismus oder einer die Zelle umfassenden Pflanze eine phänotypische oder genotypische Eigenschaft verleiht.
Konstrukt nach Anspruch 20, wobei das Peptid, Polypeptid oder Protein den Zelltod verursacht oder in anderer Weise erleichtert.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei das Konstrukt in eine eukaryotische Zelle eingefügt ist.
Konstrukt nach Anspruch 22, wobei die eukaryotische Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 22, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugetierzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 22, wobei die eukaryotische Zelle eine Vogelzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 1, das in 5'- zu 3'-Reihenfolge erste, zweite, dritte, vierte, fünfte und sechste Nucleotidsequenzen umfasst, wobei: die ersten und sechsten Nucleotidsequenzen gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Rep-Protein-Erkennungssequenz mit der Fähigkeit, von einem oder mehreren Rep-Proteinen derart erkannt zu werden, dass das durch die ersten und sechsten Sequenzen, die die gesamten ersten und sechsten Sequenzen oder einen Teil der ersten und sechsten Sequenzen umfassen, wenn das Konstrukt in einer größeren Nucleotidsequenz wie einer Genomsequenz integriert ist, flankierte genetische Material ausgeschnitten und zirkularisiert werden kann, wenn die Rep-Protein-Erkennungssequenzen sich benachbart zu einer oder mehreren, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassenden Fremdsequenzen befinden oder in eine oder mehrere, Intronsequenzen oder Teile hiervon oder andere Spleißsignale umfassende Fremdsequenzen eingefügt sind, umfassen; die zweite Nucleotidsequenz einen 3'-Bereich einer Polynucleotidsequenz umfasst; die dritte Nucleotidsequenz ein Transkriptionsterminator oder ein funktionales Derivat oder Homolog hiervon ist, das mit der zweiten Sequenz operabel verknüpft ist; die vierte Nucleotidsequenz eine Promotorsequenz ist, die mit der fünften Nucleotidsequenz operabel verknüpft ist, und die fünfte Nucleotidsequenz ein 5'-Bereich einer Polynucleotidsequenz ist, wobei die 5'- und 3'-Bereiche der Polynucleotidsequenz eine vollständige Codiersequenz der Polynucleotidsequenz darstellen; wobei in Gegenwart von einem oder mehreren Rep-Proteinen bei Integration des Konstrukts in eine größere Nucleotidsequenz wie eine Genomsequenz eine zirkularisierte genetische Sequenz getrennt von der größeren Nucleotidsequenz erzeugt wird, wobei die größere Nucleotidsequenz in der Reihenfolge die Promotorsequenz, die operabel mit einer Polynucleotidsequenz verknüpft ist, die die gesamte Fremdsequenz oder das gesamte andere Spleißsignal, umfassend die gesamten ersten und/oder sechsten Nucleotidsequenzen oder einen Teil der ersten und/oder sechsten Nucleotidsequenz, oder einen Teil der Fremdsequenz oder des anderen Spleißsignals, umfassend die gesamten ersten und/oder sechsten Nucleotidsequenzen oder einen Teil der ersten und/oder sechsten Nucleotidsequenzen, und eine Transkriptionsterminatorsequenz umfasst.
Konstrukt nach Anspruch 26, wobei die vollständige Codiersequenz der Polynucleotidsequenz für eine mRNA oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein codiert, die (das) der Zelle oder einem die Zelle umfassenden Organismus oder einer die Zelle umfassenden Pflanze eine phänotypische oder genotypische Eigenschaft verleiht.
Konstrukt nach Anspruch 27, wobei das Peptid, Polypeptid oder Protein den Zelltod verursacht oder in anderer Weise erleichtert.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei das Konstrukt in eine eukaryotische Zelle eingefügt ist.
Konstrukt nach Anspruch 29, wobei die eukaryotische Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 29, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugetierzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 29, wobei die eukaryotische Zelle eine Vogelzelle ist.
Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze oder eines Nachkommens hiervon mit Resistenz gegenüber ssDNA-Virus, wobei das Verfahren das Einführen eines Konstrukts in das Genom der Pflanze umfasst, wobei das Konstrukt in 5'- zu 3'-Reihenfolge eine Rep-Protein-Erkennungssequenz, die sich benachbart zu oder eingebaut in eine Intronsequenz oder ein anderes Spleißsignal befindet, einen 3'-Endbereich einer Polynucleotidsequenz, einen Transkriptionsterminator, eine Promotorsequenz, die mit einem 5'-Endbereich der Polynucleotidsequenz operabel verknüpft ist, wobei die 5'- und 3'-Bereiche der Polynucleotidsequenz den Codierbereich eines Peptids, Polypeptids oder Proteins mit der Fähigkeit zur Induktion eines Zelltods oder eines Schlafzustands darstellen, und gleiche oder unterschiedliche Rep-Protein-Erkennungssequenzen umfasst, wobei bei Infektion der Pflanzenzellen durch ssDNA-Virus, das ein Rep-Protein mit der Fähigkeit zur Erkennung der flankierenden Rep-Protein-Erkennungssequenzen aufweist, das Konstrukt ausgeschnitten wird und zirkularisiert, wodurch die Polynucleotidsequenz in einer Form wiederhergestellt wird, die zu einem Peptid, Polypeptid oder Protein exprimiert wird, das die Pflanzenzelle tötet oder die Pflanzenzelle auf andere Weise in einen Schlafzustand versetzt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das ssDNA-Virus ein Mitglied der Geminiviridae oder der Nanovirusgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Geminiviridae-Virus ein Begomovirus oder Mastrevirus ist.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34 oder 35, wobei das Konstrukt die Nucleotidsequenz gemäß Darstellung in SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder eine Nucleotidsequenz mit einer 60%-igen Identität zu jeder von SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder eine Nucleotidsequenz mit der Fähigkeit zur Hybridisierung an eine oder mehrere von SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36 oder eine komplementäre Form hiervon unter niedrigstringenten Bedingungen bei 42°C umfasst.
Lineares genetisches Element zur Verwendung bei der Erzeugung eines kovalent geschlossenen zirkulären DNA-Konstrukts, wobei das genetische Element in 5'- zu 3'-Richtung einen 3'-Bereich einer operabel mit einem Transkriptionsterminator verknüpften Polynucleotidsequenz, einen operabel mit einem 5'-Bereich einer Polynucleotidsequenz verknüpften Promotor, wobei bei Zirkularisierung der 5'-Bereich der Polynucleotidsequenz operabel mit dem 3'-Bereich der Polynucleotidsequenz, die durch eine ganze Fremdsequenz oder Intronsequenz oder ein anderes Spleißsignal oder ein Teil einer Fremdsequenz oder Intronsequenz oder eines anderen Spleißsignals getrennt ist, verknüpft ist, umfasst.
Genetisches Element nach Anspruch 37, das ferner Nucleotidsequenzen umfasst, die von einem von einem Virus stammenden, eine Replikation erleichternden Protein erkennbar sind.
Genetisches Element nach Anspruch 38, wobei das von einem Virus stammende, eine Replikation erleichternde Protein Rep ist.
Genetisches Element nach Anspruch 38 oder 39, wobei zwei Nucleotidsequenzen, die von von einem Virus stammenden, eine Replikation erleichternden Proteinen, die verwendet werden, erkannt werden, von unterschiedlichen Viren stammen.
Genetisches Element nach Anspruch 37 oder 38 oder 39, wobei die Polynucleotidsequenz bei Vorhandensein in dem kovalent geschlossenen zirkulären Konstrukt für eine mRNA oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein codiert.
Genetisches Element nach Anspruch 40, wobei das Peptid, Polypeptid oder Protein den Zelltod verursacht oder in anderer Weise erleichtert.
Genetisches Element nach Anspruch 37, wenn es in eine eukaryotische Zelle eingefügt ist.
Genetisches Element nach Anspruch 42, wobei die eukaryotische Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Genetisches Element nach Anspruch 42, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugetierzelle ist.
Genetisches Element nach Anspruch 42, wobei die eukaryotische Zelle eine Vogelzelle ist.
Genetisch modifizierte Pflanze oder ein Teil hiervon, umfassend ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Genetisch modifizierte Pflanze oder ein Teil hiervon, umfassend ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 14 bis 21.
Genetisch modifizierte Pflanze oder ein Teil hiervon, umfassend ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 26 bis 28.
Genetisch modifizierte Pflanze oder ein Teil hiervon, umfassend ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 37 bis 43.
Genetisch modifizierte Vogelspezies, umfassend ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Genetisch modifizierte Vogelspezies, umfassend ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 14 bis 21.
Genetisch modifizierte Vogelspezies, umfassend ein genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 26 bis 28.
Genetisch modifizierte Vogelspezies, umfassend ein genetisches Element nach einem der Ansprüche 37 bis 43.
Konstrukt nach Anspruch 1, umfassend ein genetisches Element, das von Rep-Protein-Erkennungssequenzen flankiert ist, die die Erzeugung einer zirkulären Nucleotidsequenz, die das genetische Element umfasst, in Gegenwart eines Rep-Proteins oder seiner funktionellen Derivate oder Homologe erleichtern, wobei die Rep-Protein-Erkennungssequenzen sich benachbart zu oder eingefügt in eine oder mehrere Fremdsequenzen, die Intronsequenzen oder Teile hiervon oder ein anderes Spleißsignal umfassen, befinden, wobei das genetische Element einen 3'-Bereich und einen 5'-Bereich eines durch eine Länge einer Nucleotidsequenz getrennten Promotors umfasst, um im wesentlichen das Funktionieren des Promotors zu verhindern, wobei das genetische Element in linearer Form in 5'- zu 3'-Reihenfolge die folgenden Bestandteile umfasst: einen 3'-Bereich des Promotors; optional eine Polynucleotidsequenz, die operabel mit dem 3'-Bereich des Promotors verbunden ist, und einen 5'-Bereich des Promotors, derart, dass beim Zirkularisieren das genetische Element die 5'- und 3'-Bereiche der Promotorsequenz umfasst, die durch die gesamte Rep-Protein-Erkennungssequenz und/oder Intronsequenzen oder ein anderes Spleißsignal oder einen Teil einer Rep-Protein-Erkennungssequenz und/oder von Intronsequenzen oder ein anderes Spleißsignal getrennt sind, wobei das genetische Element jedoch nicht die Aktivität des Promotors inaktiviert, wobei das zirkuläre Molekül optional ferner den Promotor umfasst, der mit der Polynucleotidsequenz operabel verknüpft ist.