BRPI0109522B1

BRPI0109522B1 - construto genético linear e métodos para gerar planta transgênica ou progênie da mesma resistente a vírus ssdna e planta ou parte da mesma geneticamente modificada

Info

Publication number: BRPI0109522B1
Application number: BRPI0109522A
Authority: BR
Inventors: Benjamim Dugdale; Douglas Kenneth Becker; Greg John Fafner; James Langham Dale; Robert Maxwell Harding; Scott Richard Hermann; Srimek Chowpongpang
Original assignee: Farmacule Bioindustries Pty Ltd; Univ Queensland; Qutbluebox Pty Ltd
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2015-12-08
Also published as: AU4393901A; CN1426465B; EP1282697A1; CA2404471A1; BR0109522A; NZ521488A; ES2296736T3; PT1282697E; JP4797141B2; WO2001072996A1; EP1282697B1; US20110119782A1; DE60131075D1; BRPI0109522B8; JP2003528606A; US8829170B2; DE60131075T2; US7863430B2; ATE376589T1; CA2404471C

Abstract

"construto, método de geração de planta transgênica ou progenia da mesma resistente a vírus ssdna, elemento genético linear e espécie aviária e planta geneticamente modificadas ou parte da mesma". a presente invenção relaciona-se, em geral, a construtos e, em particular, a construtos genéticos que compreendem seqüências de polinucleotídeos capazes de liberar, em forma circular, covalentemente fechada, a partir de uma seqüência de nucleotídeos maior tal como, mas, sem limitação, um genoma de uma célula eucariótica. de preferência, uma vez liberada, uma seqüência de polinucleotídeos é reconstituída numa forma que permite a expressão da seqüência de polinucleotídeos. numa modalidade, a seqüência de polinucleotídeos reconstituída compreende uma seqüência de codificação com todo ou parte de um nucleotídeo estranho tal como, mas, sem limitação, uma seqüência intrônica ou outro sinal de junção nela inserido. a expressão e, em particular, a transcrição de seqüência da codificação envolve junção ã seqüência estranha. a liberação e circularização é geralmente em resposta a um estímulo tal como um estímulo mediado por proteína. mais particularmente, a proteína é uma proteína derivada de vírus ou de célula procariótica ou eucariótica ou proteína desenvolvimentalmente e/ou regulada especifica de tecido. o construto da presente invenção é particularmente útil para conferir resistência contra patógenos ou indução de apoptose ou outros mecanismos de morte celular úteis, por exemplo, no tratamento do câncer ou indução da esterilidade masculina ou feminina em plantas. os construtos permitem, portanto, a expressão específica do sítio e/ou expressão desenvolvimentalmente regulada de seqüências genéticas selecionadas.

Description

“CONSTRUTO GENÉTICO LINEAR E MÉTODOS PARA GERAR PLANTA TRANSGÊNICA OU PROGÊNIE DA MESMA RESISTENTE A VÍRUS ssDNA E PLANTA OU PARTE DA MESMA GENETICAMENTE MODIFICADA” RELATÓRIO DESCRITIVO Campo da Invenção A presente invenção refere-se, em geral, a construtos e, em particular, a construtos genéticos que compreendem sequências de polinucleotídeos capazes de liberação em forma circular covalentemente fechada a partir de uma sequência de nucleotídeos maior, tal como, mas sem limitação, um genoma de célula eucariótica. De preferência, uma vez liberada, uma sequência de polinucleotídeos é reconstituída numa forma que permite a expressão da sequência de polinucleotídeos. Numa modalidade, a sequência de polinucleotídeos reconstituída compreende uma sequência de codificação com toda ou parte de um nucleotídeo estranho tal como, mas, sem limitação, uma sequência intrônica ou outro sinal de junção nela inserido. A expressão e, em particular, a transcrição da sequência de codificação envolve a junção externa da sequência estranha. De acordo com esta modalidade, a sequência de codificação pode codificar um peptídeo, polipeptídeo ou proteína, uma molécula de ácido nucleico de sentido ou anti-sentido ou uma ribozima. Noutra modalidade, a sequência de polinucleotídeos reconstituída compreenderá a uma ribozima. Noutra modalidade, a sequência de polinucleotídeos reconstituída compreenderá a sequência de polinucleotídeos estranha localizada entre um elemento promotor e a sequência de codificação. Nesta modalidade, a expressão da sequência de codificação não é substancialmente afetada de modo adverso pela presença da sequência estranha. Ainda numa modalidade adicional, a sequência reconstituída forma um promotor de RNA ou outra sequência genética reguladora que compreende a sequência estranha que não afeta a função do promotor. A liberação e circulação é geralmente em resposta a um estímulo tal como um estímulo mediado por proteína. Mais particularmente, a proteína é uma proteína derivada viral ou procariótica ou eucariótica ou proteína regulada de modo desenvolvimental e/ou proteína regulada específica para tecido. O construto da presente invenção é particularmente útil para conferir resistência genética contra patógenos ou induzir apoptose ou outros mecanismos de morte celular úteis, por exemplo, no tratamento do câncer ou indução de esterilidade masculina ou feminina em plantas. Os construtos permitem, portanto, a expressão específica do sítio e/ou expressão desenvolvimentalmente regulada de sequências genéticas selecionadas.

Antecedentes da invenção A referenciação a qualquer técnica anterior neste Relatório Descritivo não é e não deve ser tomada como um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que esta técnica anterior faz parte do conhecimento geral comum na Austrália ou em qualquer outro país. A sofisticação crescente da tecnologia do DNA recombinante está facilitando grandemente a pesquisa e o desenvolvimento numa faixa de campos tecnológicos tais como as indústrias médica, hortícola e agrícola. É de particular importância a exploração dos mecanismos genéticos de ocorrência natural, por exemplo, em patõgenos, para induzir mudanças fenotípicas úteis nas células, tais como as células de plantas. Isto fica particularmente evidente no campo hortícola em relação a mecanismos de indução de resistência em plantas a uma faixa de patógenos de plantas.

Tem havido progresso considerável no desenvolvimento da resistência a vírus em colheitas, por exemplo, através da transformação com transgenes derivados dos vírus alvo. O uso de transgenes com o maior sucesso tem sido com vírus de RNA de plantas. Contudo, apesar de um certo número de tentativas para controlar vírus de plantas de cepa única de DNA (ssDNA) através da resistência transgênica, as estratégias que têm sido exitosas para vírus de plantas de RNA não têm sido tão efetivas para vírus de plantas de ssDNA. Os vírus de plantas de DNA e, particularmente, os vírus de plaptas de cepa única de DNA (ssDNA) são responsáveis por perdas comerciais significativas numa ampla faixa de colheitas de frutas, vegetais, grãos e fibras nos trópicos e sub trópicos.

Tem havido dois grupos de vírus ssDNA que infectam as plantas. Estes são os Geminiviridae e o grupo recentemente descrito dos nanovírus. Os membros dos Geminiviridae têm virions geminares e ou um genoma ssDNA circular monopartido ou bipartido. ^Cada molécula é de cerca de 2,7kb de comprimento. Dos gêneros Geminiviridae, os begomovírus e os mastrevírus são os mais importantes. Os begomovírus são transmitidos pela vuhitefly (mosca da família da Aleyrodidae) e têm genomas monopartidos ou bipartidos. Os membros deste gênero incluem alguns dos vírus economicamente mais devastadores da moderna agricultura tais como o vírus da folha enrolada (leaf curl) do tomate (amarelo) (consistindo numa faixa de diferentes vírus espalhados através da maioria das regiões tropicais e subtropicais, o cassava mosaico africano da mandioca (África), o mosaico dourado do feijão (América do Sul e Central), o mosaico amarelo da munguba (índia) e a folha enrolada do algodão (Sul e Sudeste da Ásia). O impacto de muitos dos begomovírus aumentou intensamente nos anos recentes como resultado da introdução espalhada do agressivo "biotipo B" do vetor ujhitefly, Bemesia tabaci. Os mastrevírus têm tido menor impacto sobre a agricultura, mas, são responsáveis por perdas significativas em algumas colheitas. Estes vírus são transmitidos pelas cigarras cicadúlidas e têm genoma monopartido. Os membros deste gênero incluem os vírus da estria do milho (rrtaize streak) (África), do trigo anão {vuheat dujcLrf) (Europa) e do anão amarelo do tabaco (tobacco yelloiv dvuarf) (Austrália).

Os nanovírus têm virions isométricos e genomas ssDNA circulares, mas, estes genomas são multicomponentes com, pelo menos, seis componentes genômicos integrais diferentes, cada um dos quais é de aproximadamente 1 kb. Estes vírus são transmitidos por afídios exceto para um nanovírus de tentativa, o vírus da queda foliar do coco (coconvit foliar decay uirus) que é transmitido por uma cigarra de árvore e apenas foi reportado de Vanuatu. O nanovírus economicamente mais importante é o vírus da parte superior do cacho (bunchy top) da banana (BBTV), que quase destruiu a indústria da banana da Austrália na década de 1920 e causa perdas pesadas no Sul do Pacífico, Ásia e África. Os vírus clover stunt (trevo murcho) subterrâneo (Austrália), faba beans necrotic yellovus (Mediterrâneo) e da queda da folha do coco (Vanuatu) causam todos significativas perdas de rendimento. A organização do genoma dos begomo-vírus, mastrevírus e nanovírus tem diferenças significativas incluindo o número e tamanho dos componentes genômicos e número e tamanho de genes, o processamento dos transcritos, a orientação dos genes e similares. Há, contudo, semelhanças notáveis que sugerem que estes vírus têm estratégias de replicação e de infecção muito similares. Todos os geminivírus e nanovírus codificam (i) uma proteína Rep que tem atividade de corte e junção e dirige a rotação de replicação do círculo do genoma viral; (ii) uma proteína de recobrimento do virion; (iii) uma proteína que está envolvida na ligação das proteínas semelhantes a retinoblastoma da célula do hospedeiro resultando no movimento da célula para a fase S; (iv) uma proteína de movimento de célula para célula; e (v) uma proteína de transporte nuclear. Além disso, os vírus têm regiões intergênicas funcionalmente semelhantes (IR). Por exemplo, a IR do begomovírus, a LIR do mastrevírus e o CR-SL dos nanovírus bunchy top da banana contêm todos (i) uma estrutura de caule/alça, cuja sequência de alça de nanonucleotídeo é altamente conservada entre todos os gemini e nanovírus e é o sítio de corte e ligação pela proteína Rep; e (ii) um domínio dentro desta região que reconhece a proteína Rep. O SIR dos mastrevírus e o CR-M dos nanovírus bunchy top da banana são os sítios de ligação de um primário endógeno, responsável por iniciar a conversão do virion ssDNA em dsDNA transcricionalmente ativo. O sucesso no desenvolvimento da resistência transgênica a vírus RNA em colheitas e a demanda crescente por esta resistência a vírus ssDNA resultou na investigação de uma ampla faixa de estratégias para que os vírus ssDNA visem vários genes virais incluindo o gene de proteína de recobrimento, gene de proteína do movimento e o gene de proteína Rep. Além disso, têm sido investigadas estratégias que usam DNA interferentes defeituosos e um gene suicida. A maior parte do trabalho nesta área envolveu begomovírus preferencialmente a mastrevírus ou nanovírus.

No desenvolvimento do trabalho que conduziu à presente invenção, os inventores exploraram os mecanismos de replicação dos vírus ssDNA, a fim de induzir a resistência genética nas plantas. Contudo, a presente invenção tem aplicações amplas na modulação de atividades genéticas, tas como a expressão de sequências de polinucleotídeos para efetuar um fenótipo particular em resposta a um estímulo.

Sumário da invenção Ao longo deste Relatório Descritivo, a menos que o contexto exija de outro modo, a palavra “compreendem” ou variações como “compreende” ou “que compreende” serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento afirmado ou inteiro ou grupo de elementos ou inteiros, mas, não a exclusão de qualquer outro elemento ou inteiro ou grupo de elementos ou inteiros.

As sequências de nucleotídeos e aminoácidos são referidas por um número identificador de sequência (SEQ ID NO:). Os SEQ ID NOs: correspondem numericamente aos identificadores <400>1, <400>2 etc.

Provê-se uma listagem de sequências após as Reivindicações.

Um aspecto da presente invenção proporciona um construto que compreende um elemento genético operavelmente flanqueado por sequências de nucleotídeos reconhecíveis por uma proteína , de facilitação de replicação derivada de vírus ou seus derivados ou homólogos de células procarióticas ou eucarióticas, quando integradas no genoma de uma célula eucariótica cuja proteína de facilitação de replicação derivada de vírus ou seus derivados ou homólogos de células procarióticas ou eucarióticas facilita a excisão e circularização do elemento genético e toda ou parte das sequências de nucleotídeos flanqueadoras e em que as referidas sequências de nucleotídeos reconhecíveis pela citada proteína de facilitação de replicação derivada de vírus ou seus derivados ou homólogos de células eucarióticas ou procarióticas são adjacentes ou inseridas em uma ou mais sequências estranhas, incluindo sequências intron ou partes das mesmas ou outros sinais de junção em que o elemento genético e outras sequências de nucleotídeos, numa forma não circular, compreendem duas sequências de nucleotídeos modulares que, após circularização, formam uma sequência genética que exibe uma propriedade ou uma capacidade de exibição de uma propriedade ausente nas duas sequências de nucleotídeos modulares antes da circularização ou antes da circularização e expressão.

Outro aspecto da presente invenção proporciona um construto que compreende um elemento genético flanqueado por sequências de reconhecimento de proteína Rep ou homólogos funcionais a partir de outros vírus ou células eucarióticas ou procarióticas que facilitam a geração de uma sequência de nucleotídeos circular que compreende o referido elemento genético na presença de uma proteína Rep ou seus derivados ou homólogos funcionais em que as citadas sequências de reconhecimento de proteína Rep ficam adjacentes ou inseridas em uma ou mais sequências de reconhecimento, compreendendo dito elemento genético uma sequência de polinucleotídeo operavelmente ligada a sequências reguladoras exigidas para permitir a expressão da referida sequência de nucleotídeos, quando o citado elemento genético está contido numa molécula de circularização em que o elemento genético de forma linear compreende na ordem de 5’ para 3’: uma sequência de polinucleotídeo; e uma sequência reguladora para permitir a expressão de dita sequência de nucleotídeos quando na forma circular, de tal modo que, após circularização, o elemento genético compreende a sequência reguladora separada da sequência de polinucleotídeos por toda ou parte de uma sequência de reconhecimento de proteína Rep em que, após a expressão, a citada sequência de polinucleotídeos codifica um produto de expressão.

Um aspecto adicional da presente invenção proporciona um construto que compreende na ordem de 5’ para 3’, primeira, segunda, terceira, quarta, quinta e sexta sequências de nucleotídeos em que: a primeira e a sexta sequências de nucleotídeos podem ser a mesma ou diferente e cada uma compreende uma sequência de reconhecimento de proteína Rep capaz de ser reconhecida por uma ou mais proteínas Rep ou derivados ou homólogos da mesma de tal modo que o material genético flanqueado pelas referidas primeira e sexta sequências incluindo toda ou parte das citadas primeira e sexta sequências, quando dito construto está integrado numa sequência de nucleotídeos maior tal como uma sequência genômica, é capaz de ser excisado e circularizado em que as referidas sequências de reconhecimento de proteína Rep ficam adjacentes ou inseridas em uma ou mais sequências estranhas incluindo sequências intrônicas ou partes das mesmas ou outros sinais de junção; a segunda sequência de nucleotídeos compreende uma parte 3' de uma sequência de nucleotídeos; a terceira sequência de nucleotídeos é um terminador de transcrição ou derivado ou homólogo funcional do mesmo ligado operavelmente à citada segunda sequência; a quarta sequência de nucleotídeos é uma sequência promotora operavelmente ligada à quinta sequência de nucleotídeos; e a quinta sequência de nucleotídeos é uma parte 5' de uma sequência de polinucleotídeos em que as partes 5' e 3' de dita sequência de polinucleotídeos representa uma sequência de codificação completa da referida sequência de nucleotídeos; em que, na presença de uma ou mais proteínas Rep, quando o construto é integrado numa sequência de nucleotídeos maior, tal como uma sequência genômica, é gerada uma sequência genética circularizada separada da citada sequência de nucleotídeos maior compreendendo, na ordem, dita sequência promotora operavelmente ligada a uma sequência de polinucleotídeos compreendendo toda ou parte da sequência estranha ou outro sinal de junção compreendendo toda ou parte das referidas primeira e/ou sexta sequências de nucleotídeos e uma sequência de terminadora de transcrição.

Ainda outro aspecto da presente invenção é dirigido a um elemento genético para uso na geração de um construto, compreendendo o citado elemento genético na direção 5’ para 3% uma parte 3’ de uma sequência de polinucleotídeos operavelmente ligada a um terminador de transcrição; um promotor operavelmente ligado a uma parte 5’ de uma sequência de polinucleotídeos em que, após circularização, a parte 5’ da sequência de polinucleotídeos é operavelmente ligada a dita parte 3’ da sequência de polinucleotídeos separada por toda ou parte de uma sequência estranha ou sequência intron ou outro sinal de junção.

Ainda outro aspecto da presente invenção proporciona um construto que compreende a sequência de nucleotídeos substancialmente conforme descrito na SEQ ID NO:31 a SEQ ID NO:36 ou uma sequência de nucleotídeos tendo 60% de similaridade a cada uma de SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO:36 ou uma sequência de nucleotídeos capaz de hibridizar em uma ou mais de SEQ ID NO: 3 1 a SEQ ID NO:36 ou uma forma complementar das mesmas sob condições de baixa severidade a 42°C.

Ainda outro aspecto da presente invenção contempla um método de geração de planta transgênica ou progenia da mesma resistente a vírus ssDNA, compreendendo o referido método introduzir no genoma da citada planta um construto compreendendo, na ordem 5' para 3', uma sequência de reconhecimento de proteína Rep adjacente ou dentro de uma sequência intrônica ou outro sinal de junção, uma parte de extremidade 3’ de uma sequência de polinucleotídeos, um terminador de transcrição ou seu equivalente funcional, uma sequência promotora ligada operavelmente a uma parte terminal 5’ da sequência de polinucleotídeos em que as partes 5' e 3' da sequência de polinucleotídeos representam a região de codificação de peptídeo, polipeptídio ou proteína capaz de induzir a morte ou dormência da célula e as mesmas ou diferentes sequências de reconhecimento de proteína Rep; em que, após infecção das referidas células da planta por vírus ssDNA tendo uma proteína Rep que é capaz de reconhecer as sequências de reconhecimento de proteína Rep flanqueado-ras, o construto é excisado e circulariza, reconstituindo, assim, a citada sequência de polinucleotídeos numa forma que é expressa num peptídeo, polipeptídio ou proteína que mata a célula da planta ou torna de outra maneira a célula da planta dormente.

Ainda outro aspecto da presente invenção proporciona um construto que compreende um elemento genético flanqueado por sequências de reconhecimento de proteína Rep que facilitam a geração de uma sequência de nucleotídeos circular que compreende o referido elemento genético na presença de uma proteína Rep ou seus derivados ou homólogos funcionais em que as referidas sequências de reconhecimento de proteína Rep ficam adjacentes ou inseridas numa ou mais sequências estranhas incluindo sequências intrônicas ou partes das mesmas ou outros sinais de junção, compreendendo o citado elemento genético uma parte 3' e uma parte 5' de um promotor separado por um comprimento de uma sequência de nucleotídeo de modo a impedir substancialmente o funcionamento do citado promotor, dito elemento genético em forma linear compreende na ordem 5' para 3’: uma parte 3’ do referido promotor; opcionalmente,uma sequência de polinucleotídeo ligada operavelmente à citada parte 3' de dito promotor; e uma parte 5' do referido promotor, de tal forma que, após circularização, o elemento genético compreende as partes 5' e 3' da sequência promotora separadas por toda ou parte de uma sequência de reconhecimento de proteína Rep e/ou sequências intron ou outros sinais de junção, mas, que não inativa a atividade do promotor, compreendendo ainda, opcionalmente,a citada molécula circular o promotor operavelmente ligado a sequência de polinucleotídeo. O promotor pode ser um promotor de DNA ou um promotor de RNA.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 é uma representação diagramãtica de pTBN. A Figura 2 é uma representação diagramãtica de pTBN6. A Figura 3 é uma representação diagramãtica de pTBNl. A Figura 4 é uma representação diagramãtica de pRTBN6. A Figura 5 ê uma representação diagramãtica de pRTBN 1. A Figura 6 é uma representação diagramãtica de pRTBNl/6. A Figura 7 é uma representação esquemãtica do plasmídeo p35S-2301. A Figura 8 é uma representação esquemãtica do plasmídeo pTESTl. A Figura 9 é uma representação esquemãtica do plasmídeo pTEST2. A Figura 10 é uma representação esquemãtica do plasmídeo pTEST3. A Figura 11 é uma representação esquemãtica do plasmídeo pTEST4. A Figura 12 é uma representação esquemãtica do plasmídeo pBI-TYDVl.lmer. A Figura 13 é uma representação esquemãtica do plasmídeo p35S-Rep. A Figura 14 é uma representação gráfica dos resultados de um ensaio de morte celular usando vetores de expressão. As barras de erros mostram intervalos de confiança de 95%. A Figura 15 é uma representação gráfica dos resultados de ensaio de morte celular de recirculação usando vetores de expressão. As barras de erros mostram intervalos de confiança de 95%. A Figura 16 é uma representação gráfica dos resultados de ensaio de morte celular de recirculação induzível usando vetores de expressão. As barras de erros mostram intervalos de confiança de 95%. A Figura 17 é uma representação esquemática de plasmídeos (A) p35S-BTR-LIR e (B) p35S-BUTR-LIR. A Figura 18 é uma representação esquemática de plasmídeos (A) p35S-BTR e (B) P35S-BUTR. A Figura 19 é uma representação esquemática de plasmídeos (A) pBTR.testl e (B) pBUTRtest 1. A Figura 20 é uma representação diagramãtica de pGI. A Figura 2 1 é uma representação diagramãtica de pGI6. A Figura 22 é uma representação diagramãtica de pGIl. A Figura 23 é uma representação diagramãtica de pRGI6. A Figura 24 é uma representação diagramãtica de pRGIl. A Figura 25 é uma representação diagramãtica de pRGI 1/6. A Figura 26 é uma representação esquemática de um modelo proposto para a expressão ativada por Rep da albumina do soro humano a partir do plasmídeo pHSAl. A Figura 27 é uma representação diagramática de um construto para uso na modulação de sentido/anti-sentido de expressão genética.

Apresenta-se um sumário dos identificadores de sequência.

Sumário dos identificadores de sequência Descrição detalhada das modalidades preferidas A presente invenção é afirmada em parte sobre o reconhecimento de que pode ser usada uma proteína de facilitação de replicação derivada de vírus para excisar e circularizar sequências específicas visadas a partir do genoma de uma célula eucariõtica. O termo “excisar” inclui neste caso sequências de liberação e, mais particularmente, liberação replicativa de sequências visadas. As proteínas de facilitação de replicação derivadas de vírus iniciam o corte, excisão e circularização de elementos genéticos flanque-ados por sequências particulares específicas e reconhecidas pela proteína de facilitação de replicação derivada de vírus. A presente invenção estende-se a derivados das proteínas de facilitação derivadas de vírus e homólogos eucarióticos e procarióticos das mesmas. A presente invenção estende-se, portanto, a quaisquer sequências capazes de facilitar a quebra e ligação de sequências de polinucleotídeos e são referidas daqui por diante como “sequências de reconhecimento” e podem também ser aqui consideradas como “sequências estranhas”. As sequências de reconhecimento são adjacentes ou inseridas em sequências estranhas incluindo sequências intrónicas ou outros sinais de junção.

Numa modalidade, o processo de circularização permite a formação de uma sequência genética particular a partir de dois componentes modulares separados por uma sequência estranha agregável após expressão. Antes da circularização, os componentes modulares são separados geneticamente e, daí, não operavelmente ligados. A ligação operável é mostrada de modo conveniente, por exemplo, numa modalidade, pela capacidade de que a sequência genética englobe os componentes modulares a serem expressos. O termo “expresso”, neste exemplo, inclui a transcrição para uma sequência mRNA e, opcionalmente,translação da sequência mRNA para um produto de translação. A expressão, contudo, não é o único critério de constituição de uma sequência genética a partir de componentes modulares. Noutra modalidade, a sequência genética produzida a seguir à circularização pode ter outras funções úteis que não exigem expressão. Por exemplo, a sequência genética resultante pode compreender uma seqúência de reconhecimento de ligação de proteína visando, desse modo, proteínas citoplãsmicas ou nucleares particulares. Alternativamente, a seqúência de polinucleotídeos reconstituída compreende uma seqúência estranha entre os elementos promotores e uma seqúência de codificação. No caso do primeiro, o promotor é preferivelmente um promotor de RNA tal como a partir um vírus TMV, AMV ou TEV. Alternativamente, o promotor é um promotor DNA onde a inserção do reconhecimento não afeta a sua atividade de modo substancialmente adverso.

Conseqúentemente, um aspecto da presente invenção proporciona um construto que compreende um elemento genético operavelmente flanqueado por sequências de nucleotídeos reconhecíveis por uma proteína de facilitação de replicação derivada de vírus ou seus derivados ou homólogos de células eucarióticas e procarióticas, quando integra- dos no genoma de uma célula eucariõtica cuja proteína de facilitação de replicação derivada de vírus ou seus derivados ou homólogos de células eucariõticas ou procarióticas facilitem a excisão e circularização do elemento genético e toda ou parte das sequências de nucleotídeos flanqueadoras e em que as referidas sequências de nucleotídeos reconhecíveis pela citada proteína de facilitação de replicação derivada de vírus ou seus derivados ou homólogos de células eucarióticas e procarióticas são adjacentes ou inseridos em uma ou mais sequências estranhas incluindo sequências intron ou partes das mesmas ou outros sinais de junção em que o elemento genético e outras sequências de nucleotídeos, numa forma não circular, compreendem duas sequências de nucleotídeos modulares que, após circularização, formam uma sequência genética que exibe uma propriedade ou uma capacidade de exibir uma propriedade ausente nas duas sequências de nucleotídeos modulares antes da circularização ou antes da circularização e expressão. O termo “construto” é usado no seu sentido mais amplo e inclui um construto genético, molécula de ácido nucleico, vetor, plasmídeo ou qualquer outra sequência de nucleotídeos compreendendo, pelo menos, duas sequências heterólogas. O construto, portanto, é uma molécula recombinante projetada de modo a compreender duas ou mais sequências de nucleotídeos a partir de diferentes fontes genéticas. Numa modalidade, o construto está numa forma isolada. O termo “isolado” inclui biologicamente puro, substancialmente puro ou em outra condição em que, pelo menos, uma etapa de purificação tenha sido executada sobre uma amostra que compreenda o construto. Uma “etapa de purificação” inclui, por exemplo, uma precipitação, centrifugação e/ou uma separação cromatográfica ou eletroforética. Noutra modalidade, o construto genético é integrado no genoma de uma célula hospedeira. O construto pode compreender sequências de nucleotídeos que sejam perdidas, removidas ou re-dispostas a seguir à integração. Ainda noutra modalidade, o construto é de forma circular quer gerado in vitro, quer a seguir à excisão a partir do genoma da célula hospedeira. O termo “elemento genético” é usado no seu sentido mais amplo e inclui uma série de duas ou mais sequências de nucleotídeos projetadas numa ordem particular com relação às orientações 5’ para 3’ ou 3’ para 5’ do elemento genético. Na essência, o elemento genético compreende duas sequências de nucleotídeos na forma modular. O termo “modular” não deve conferir nenhuma limitação à montagem ou estrutura das sequências de nucleotídeos, mas, enfatiza que uma sequência genética singular é dividida em dois componentes, isto é, componentes modulares. Após circularização, os dois componentes modulares são orientados em conjunto de modo a constituir, após remoção de quaisquer sequências estranhas incluindo intrônicas e sequências de junção ou outras sequências de reconhecimento, uma sequência genética singular que exibe uma atividade ou propriedade particular não presente, quando a sequência genética está em forma modular separada. Em certas circunstâncias, as sequências estranhas que intervenham nos dois componentes modulares, quando em forma circular, podem não precisar de ser removidas se a sua presença não afetar de modo substancialmente adverso a função dos componentes modulares, quando constituídos na orientação correta em relação a cada um após circularização. Geralmente, os componentes modulares são referidos com partes 5’ e partes 3’ de uma sequência de nucleotídeos. Uma parte compreende desde alguns nucleotídeos (isto é, desde cerca de 2 até cerca de 500) a muitos (isto é, desde cerca de 501 a cerca de 10.000). As partes 5’ e 3’ podem compreender uma parte central.

Numa modalidade preferida, o elemento genético compreende, quando em forma circular, um promotor operavelmente ligado à sequência genética que compreende as duas sequências modulares. As duas sequências modulares podem ser separadas por uma sequência intrônica, sinal de junção ou outra sequência de reconhecimento. O elemento genético compreende, portanto, em forma linear na direção 5’ para 3’, uma primeira sequência de nucleotídeos modular compreendendo a parte 3’ de uma sequência de polinucleotídeos, uma sequência promotora operavelmente ligada ã parte 5’ da sequência de polinucleotídeos acima mencionada. Após circularização, a parte 3’ da sequência de polinucleotídeos fica, agora, orientada e fundida pela ligação de base à parte 5’ da sequência de polinucleotídeos, reconstituindo, assim, uma sequência de polinucleotídeos funcional operavelmente ligada a um promotor. Dependendo do construto, uma sequência intrônica, sinal de junção ou outra sequência de reconhecimento pode separar as parte 5’ e 3’ da sequência de polinucleotídeos reconstituída. Após processamento durante a expressão, a sequência intrônica, o sinal de junção ou outra sequência de reconhecimento pode ser excisada. Numa modalidade particularmente preferida, o elemento genético compreende uma sequência de terminação de transcrição operavelmente ligada e a jusante da parte 3’ da sequência de polinucleotídeos. Os termos tais como “promotor” e “de terminação” são usados no seu sentido mais amplo e são descritos abaixo com maior detalhe.

Noutra modalidade, a sequência de polinucleotídeos reconstituída codifica uma sequência intrônica, sinal de junção ou outra sequência de reconhecimento localizada entre o elemento promotor e a sequência de codificação. De acordo com esta modalidade, a sequência de reconhecimento não seria removida durante a transcrição.

Ainda noutra modalidade alternativa, o elemento genético compreende dois componentes modulares de um promotor ou outra sequência reguladora. De preferência, os componentes modulares formam uma sequência promotora após circularização. Se uma sequência intrônica, sinal de junção ou outra sequência de reconhecimento separa os componentes modulares de uma sequência promotora, então, essa sequência não destrói nem destrói parcialmente a atividade da sequência promotora. Alternativamente, o promotor é um promotor RNA tal como um promotor de TMV, AMV ou TEV. A sequência de polinucleotídeos, quando reconstituída, exibe uma atividade ou propriedade ou capacidade de exibir uma atividade ou propriedade não presente nas sequências de nucleotídeos modulares separadas antes da fusão seguinte à circularização. Essa atividade ou propriedade inclui a capacidade de codificar um peptídeo, polipeptídio ou proteína com uma função particular, a capacidade de codificar uma sequência mRNA que pode subsequente mente ser transladada para um peptídeo, polipeptídio ou proteína ou que pode atuar como uma molécula de anti-sentido ou sentido para regulação inferior de um gene hospedeiro ou outra sequência genética ou atuar como um promotor ou outra sequência de regulação. Outra propriedade contemplada pelas sequências genéticas inclui a capacidade de ligar a proteína para atuar com sequências reguladoras nucleicas ou para atuar ou codificar ribozimas e/ou moléculas de deoxiribozima.

De particular importância, a sequência genética pode codificar proteínas com atividade enzimática, atividade reguladora ou atividade estrutural ou exibir uma atividade terapêutica se administrada a um mamífero tal como uma pessoa ou animal de criação. Exemplos do último tipo de molécula incluem citocinas, interferons e fatores de crescimento. As proteínas com atividade enzímica são particularmente preferidas e essas proteínas são úteis na ativação de um percurso bioquímico, facilitando o fluxo de metabólitos num percurso particular, conferindo uma propriedade tal como resistência a um inseticida, fungicida ou herbicida ou conferindo resistência a um patógeno tal como um patógeno intracelular incluindo vírus e microrganismos intracelulares. As células contempladas como alvo do construto genético da presente invenção incluem células animais, células de plantas, organismos unicelulares e microrganismos. As células de animais podem ser de primatas, pessoas, animais de criação, espécies aviárias, peixes, répteis, anfíbios e insetos e aracnídeos. As células de plantas podem ser de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas.

Numa modalidade particularmente útil, o peptídeo, polipeptídio ou proteína codificada pela sequência de polinucleotídeos induz a apoptose ou outra forma de morte celular. Isto é particularmente útil como meio de facilitar a resistência genética a vírus, por exemplo, ou para mediar a morte celular de tipos particulares de células.

Numa modalidade, por exemplo, o construto é usado para facilitar a resistência a um vírus de DNA de cepa singular (ssDNA). Esses vírus causam danos consideráveis às indústrias agrícolas e hortícolas infectando importantes plantas de colheita e ornamentais. Dois grupos de vírus ssDNA que infectam as plantas são os gemini . e nanovírus.

Numa modalidade, as sequências flanqueadoras reconhecíveis por uma proteína de facilitação de replicação derivada de vírus ou seus derivados ou homólogos de células procarióticas ou eucarióticas são estruturas nucleotídeas de caule/alça. De preferência, as estruturas de caule/alça compreendem uma alça curta de seqúência de nucleotídeos desde cerca de 5 a cerca de 20, preferentemente desde cerca de 6 a cerca de 15 e, com maior preferência, cerca de 9 nucleotídeos (isto é, nanonucleotídeo) e que é o sítio de corte e ligação pela proteína de facilitação de replicação derivada de vírus ou seus derivados ou homólogos de células eucarióticas e procarióticas. Noutra modalidade, as sequências de flanqueamento são reconhecidas por qualquer proteína com atividade de divagem e ligação. Um exemplo dessa proteína é a topoisomerase. Todas estas sequências são aqui referidas como “sequências de reconhecimento”. Com maior preferência, as sequências de reconhecimento são reconhecidas pela proteína “Rep”. Esta proteína é derivada de membros dos geminivírus e nanovírus e ligam-se a um domínio 5’ sobre uma estrutura de caule/alça compreendendo a sequência de reconhecimento. A presente invenção, contudo, não fica limitada ao uso de uma estrutura de caule alça, embora esse uso seja aqui contemplado. A presente invenção estende-se a qualquer proteína Rep a partir de um geminivírus ou nanovírus, assim como seus derivados ou homólogos de outros vírus ou a partir de células eucarióticas ou procarióticas. Exemplos de células eucarióticas incluem células de mamíferos, insetos, répteis, anfíbios e fermentos.

Exemplos de outras sequências de reconhecimento ou seus equivalentes incluem as regiões intergênicas da BBTV DNA 1-6, as repetições curtas e longas de TLCV ou TYDV. Uma “sequência intrônica” é uma sequência de nucleotídeos que, a seguir à transcrição, têm a capacidade de se juntarem fora. Em certas circunstâncias, a sequência intrônica não se junta tal como quando a presença de sequência intrônica não afeta adversamente o funcionamento da sequência na qual a sequência intrônica é inserida. O construto deste aspecto da presente invenção pode compreender as mesmas ou substancialmente as mesmas sequências de reconhecimento que as sequências de flanqueamento, ou seja, as sequências reconhecíveis por uma proteína Rep singular ou seus derivados ou homólogos ou pode compreender diferentes sequências de reconhecimento reconhecíveis por diferentes proteínas Rep ou derivados das mesmas ou homólogos de células eucarióticas ou proca-rióticas das mesmas. Além disso, as sequências de reconhecimento podem ser sequências completas ou partes de sequências tais como duas metades de sequências intrônicas. A proteína Rep pode ser introduzida numa célula tal como uma infecção viral seguinte ou ser codificada por sequências genéticas expressas de modo desenvolvimental ou especificamente tecidular no animal ou planta ou organismo que porta o construto.

Noutra modalidade preferida, proporciona-se um construto que compreende um elemento genético flanqueado por sequências de reconhecimento de proteína Rep ou homólogos funcionais a partir de outros vírus ou células eucarióticas ou procarióticas que facilitam a geração de uma sequência de nucleotídeos circular que compreende o referido elemento genético na presença de uma proteína Rep ou seus derivados ou homólogos funcionais em que as citadas sequências de reconhecimento de proteína Rep são adjacentes ou inseridas em uma ou mais sequências de reconhecimento, compreendendo dito elemento genético uma sequência de polinucleotídeos ligada operavelmente a sequências reguladoras exigidas para permitir a expressão da referida sequência de polinucleotídeos, quando o citado elemento genético está contido numa molécula circularizada em que o elemento genético de forma linear compreende na ordem de 5’ para 3’: uma sequência de polinucleotídeos; è sequências reguladoras para permitir a expressão da citada sequência de polinucleotídeos quando em forma circular; de tal forma que, após circularização, o elemento genético compreende a sequência reguladora separada da sequência de polinucleotídeos por toda ou parte de uma sequência de reconhecimento de proteína Rep em que, após expressão, a referida sequência de nucleotídeos codifica um produto de expressão.

De preferência, as sequências reguladoras incluem ou compreendem uma sequência promotora e, opcionalmente, um terminador de transcrição. Conforme acima afirmado, uma sequência de reconhecimento inclui uma sequência estranha tal como uma sequência intrônica ou outro sinal de junção.

Noutra modalidade, proporciona-se um construto que compreende um elemento genético flanqueado por sequências de reconhecimento de proteína Rep que facilitam a geração de uma sequência de nucleotídeos circular compreendendo o referido elemento genético na presença de uma proteína Rep ou seus derivados ou homólogos funcionais em que as citadas sequências de reconhecimento de proteína Rep são adjacentes ou inseridas em uma ou mais sequências estranhas incluindo sequências intrônicas ou partes das mesmas ou outros sinais de junção, compreendendo o referido elemento genético uma parte 3’ e uma parte 5’ de um promotor separado por um comprimento de uma sequência de nucleotídeos de modo a impedir sub stancialm ente o funcionamento do citado promotor, dito elemento genético de forma linear compreende na ordem 5’ para 3’: uma parte 3’ do referido promotor; opcionalmente, uma sequência de polmucleotídeos operavelmente ligada à citada parte 3’ de dito promotor; e urna parte 5’ do referido promotor, de tal forma que, após circularização, o elemento genético compreende as partes 5’ e 3 da sequência promotora separada por toda ou parte de uma sequência de reconhecimento de proteína Rep, mas, que não inativa a atividade do promotor, compreendendo ainda a referida molécula circular, opcionalmente,o promotor operavelmente ligado à sequência de polinucleotídeos.

Alternativamente, o promotor é um promotor RNA tal como TMV, TEV ou AMV.

Uma vantagem desse sistema é que, quando o construto é de forma linear e, por exemplo, integrado numa sequência de nucleotídeos maior tal como o genoma, a sequência promotora fica inativa. Contudo, após circularização, a sequência promotora é reconstituída, permitindo, assim, a atividade promotora. A sequência de polinucleotídeos operavelmente ligada, opcionalmente, presente é, então, expressa.

Exemplos de promotores adequados incluem o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor. Outro promotor útil é o promotor ubiquitina. Geralmente, os promotores monocot tais como o promotor ubiquitina exigem uma sequência intrônica entre o promotor e o codon de início do exon expresso. Ausente esta sequência intrônica, a expressão do promotor é ou muito baixa ou completamente ausente. O construto genético da presente invenção pode ser projetado de tal forma que, após circularização, a sequência intrônica que compreende a estrutura de caule e alça forma uma sequência intrônica a jusante do promotor ubiquitina, permitindo, assim, a sua operação.

Outros promotores adequados são descritos abaixo.

Noutra modalidade preferida, a presente invenção proporciona um construto que compreende, na ordem de 5’ para 3’, primeira, segunda, terceira, quarta, quinta e sexta sequências de nucleotídeos em que: a primeira e a sexta sequências de nucleotídeos podem ser a mesma ou diferentes e cada uma compreende uma sequência de reconhecimento de proteína Rep capaz de ser reconhecida por uma ou mais proteínas Rep ou derivados ou homólogos da mesma de tal modo que o material genético flanqueado pelas referidas primeira e sexta sequências, incluindo toda ou parte das citadas primeira e sexta sequências, quando dito construto está integrado numa sequência de nucleotídeos maior tal como uma sequência genômica, é capaz de ser excisado e circularizado em que as referidas sequências de reconhecimento de proteína Rep ficam adjacentes ou inseridas em uma ou mais sequências estranhas incluindo sequências intrônicas ou partes das mesmas ou outros sinais de junção; a segunda sequência de nucleotídeos compreende uma parte 3' de uma sequência de polinucleotídeos; a terceira sequência de nucleotídeos é um terminador de transcrição ou derivado ou homólogo funcional da mesma ligada operavelmente à citada segunda sequência; a quarta sequência de nucleotídeos é uma sequência promotora operavelmente ligada à quinta sequência de nucleotídeos; e a quinta sequência de nucleotídeos é uma parte 5' de uma sequência de nucleotídeos em que as partes 5' e 3' de dita sequência de nucleotídeos representa uma sequência de codificação completa da referida sequência de nucleotídeos; em que, na presença de uma ou mais proteínas Rep, quando o construto está integrado numa sequência de nucleotídeos maior, tal como uma sequência genômica, é gerada uma sequência genética circularizada separada da citada sequência de nucleotídeos maior compreendendo, na ordem, dita sequência promotora operavelmente ligada a uma sequência de polinucleotídeos compreendendo toda ou parte das referidas primeira e/ou sexta sequências de nucleotídeos e uma sequência terminadora de transcrição.

De acordo com o aspecto acima mencionado da presente invenção, a primeira e sexta sequências de nucleotídeos representam sequências de reconhecimento para uma proteína de facilitação de replicação derivada de vírus tal como Rep ou seus derivados ou derivados eucarióticos ou procarióticos das mesmas adjacentes ou inseridos numa sequência intrônica ou outro sinal de junção. A segunda até a quinta sequências de nucleotídeos representam os elementos genéticos previamente definidos.

Ainda outro aspecto da presente invenção é dirigido a um elemento genético para uso na geração de um construto, compreendendo o referido elemento genético, na direção 5’ para 3’, uma parte 3’ de uma sequência de polinucleotídeos operavelmente ligada a um terminador de transcrição; um prmotor operavelmente ligado a uma parte 5’ de uma sequência de polinucleotídeos em que, após circularização, a parte 5’ da sequência de polinucleotídeos fica operavelmente ligada à referida parte 3’ da sequência de polinucleotídeos separada por toda ou parte de uma sequência estranha ou sequência intron ou outro sinal de junção.

Os construtos da presente invenção têm uma faixa de aplicações. Numa modalidade, o construto é usado para gerar resistência genética em células de plantas a vírus ssDNA. Os vírus particulares contra os quais é buscada proteção incluem, mas, não ficam a eles limitados, os geminivírus ou nanovírus. Nesta modalidade, o construto compreende um “gene suicida”, isto é, um gene codificante de um produto que induz a apoptose celular, a lise, a morte ou um estado de dormência bioquímica ou fisiológica. O construto é introduzido numa célula de planta sob condições que permitam a integração no genoma da célula da planta. Uma planta é regenerada a partir da célula da planta e propagada, quando a planta é infectada por um vírus ssDNA particular com uma proteína Rep que reconhece as sequências de reconhecimento de proteína Rep que flanqueiam o elemento genético do construto, o construto é excisado e recirculariza, reconstituindo, assim, o “gene suicida” e facilitando a sua expressão. A célula, então, morre ou fica de outro modo dormente, impedindo, assim, a replicação e liberação de vírus ssDNA.

Numa modalidade particularmente preferida, a presente invenção proporciona um construto que compreende a sequência de nucleotídeos substancialmente conforme descrita na SEQ ID NO:31 a SEQ ID NO:36 ou uma sequência de nucleotídeos tendo 60% de similaridade a cada uma de SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO:36 ou uma sequência de nucleotídeos capaz de hibridizar em uma ou mais de SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO:36 ou uma forma complementar das mesmas sob condições de baixa severidade a 42°C.

Consequentemente, ainda outro aspecto da presente invenção contempla um método de geração de planta transgênica ou progenia da mesma resistente a vírus ssDNA, compreendendo o referido método introduzir no genoma da citada planta um construto compreendendo, na ordem 5' para 3', uma sequência de reconhecimento de proteína Rep adjacente ou dentro de uma sequência intrônica ou outro sinal de junção, uma parte de extremidade 3' de uma sequência de polinucleotídeos, um terminador de transcrição ou seu equivalente funcional, uma sequência promotora ligada operavelmente a uma parte terminal 5' da sequência de polinucleotídeos em que as partes 5' e 3' da sequência de polinucleotídeos representam as regiões de codificação de peptídeo, polipeptídio ou proteína capaz de induzir a morte ou dormência da célula e as mesmas ou diferentes sequências de reconhecimento de proteína Rep em que, após infecção das referidas células da planta por vírus ssDNA tendo uma proteína Rep que é capaz de reconhecer as sequências de reconhecimento de proteína Rep flanqueadoras, o construto é excisado e circulariza, reconstituindo, assim, a citada sequência de polinucleotídeos numa forma que é expressa num peptídeo, polipeptídio ou proteína que mata a célula da planta ou torna de outra maneira a célula da planta dormente.

Outro uso do presente construto é produzir plantas estéreis do sexo masculino. Nesta modalidade, um gene codificante de uma proteína Rep é colocado sob o controle de um promotor específico de pólen. Um construto compreendendo o “gene suicida” acima descrito é também gerado usando sequências de reconhecimento de proteína Rep reconhecidas pelo gene Rep sob o controle do promotor específico de pólen. Quando se forma pólen, o promotor específico de pólen é ativado, ativando, assim, o gene suicida. As células de pólen são, então, destruídas seletivamente ou tornadas dormentes.

Outros usos do construto aqui descrito incluem introduzir o material genético que facilita uma mudança de cor em plantas ou tecidos ou sementes específicos ou outros materiais de reprodução de plantas. Um exemplo de uma sequência genética que facilita uma mudança de cor é um gene codificante de uma enzima de um percurso de antocianina tal como flavonal 3’-hidroxilase, flavonal S^ó^hidroxilase ou flavona 3’-sintase.

Noutra modalidade, o construto pode ser flanqueado por duas sequências de reconhecimento de proteína Rep diferentes, isto é, reconhecidas por duas proteínas Rep diferentes. Uma proteína Rep pode ser, então, codificada por um gene inserido no genoma da planta e a outra proteína Rep pode ser introduzida por um vírus ssDNA infectante. Alternativamente, as proteínas Rep podem ser codificadas por diferentes promotores que são expressos e certos estágios de desenvolvimento.

Se bem que a presente invenção seja descrita particularmente em relação a plantas e vírus ssDNA, a presente invenção estende-se a estruturas de excisão homólogas e outras proteínas com excisão e atividades de junção específicas de sítio a partir de outras fontes, tais como vírus não-ssDNA e células eucarióticas tais como células de insetos, mamíferos ou répteis. Na medida em que a presente invenção se refere a plantas, as plantas podem ser monocotiledôneas ou dicotiledôneas. O termo “célula de planta”, conforme aqui usado, inclui protoplastos ou outras células derivadas de plantas, células produtoras de gametas e células que se regeneram em plantas integrais. As células de plantas incluem células em plantas, assim como protoplastos ou outras células de cultura. O termo “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, conforme aqui usado, designa mRNA, RN A, cRNA, cDNA ou DNA. “Polipeptídio”, “peptídeo” e “proteína” são aqui usados de modo intercambiável como referência a um polímero de resíduos de aminoácidos e variantes dos mesmos.

Os termos usados para descrever relações de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídios incluem “sequência de referência”, “janela de comparação”, “identidade de sequência”, “percentagem de identidade de sequência” e “identidade substancial”. Uma “sequência de referência” é de pelo menos 12, mas, frequentemente de 15 a 18 e frequentes vezes de, pelo menos, 25 unidades monoméricas de comprimento, inclusive de resíduos de nucleotídeos e de aminoácidos. Porque dois polinucleotídeos podem compreender cada um (1) uma sequência (isto é, apenas uma parte da sequência de polinucleotídeo completa) em que os dois polinucleotídeos, comparações de sequências entre dois (ou mais) polinucleotídeos são tipicamente realizadas comparando sequências dos dois polinucleotídeos sobre uma “janela de comparação” para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma “janela de comparação” refere-se a um segmento conceituai de, pelo menos, 6 posições contíguas, geralmente cerca de 50 a cerca de 100, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência é comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas, após as duas sequências ficarem alinhadas de modo ótimo. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) de cerca de 20% ou menos em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições nem deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. O alinhamento ótimo de sequências para alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido por implementações computadorizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EUA) ou por inspeção e o melhor alinhamento (isto é, que resulta na homologia de maior percentagem sobre a janela de comparação) gerado por qualquer dos vários métodos selecionados. Pode ser feita também referência à família BLAST de programas tais como, por exemplo, descritos por Altschul e colaboradores, 1997. Uma discussão detalhada de análise de sequências pode ser encontrada na Unit 19.3 de Ausubel e colaboradores, 1994-1998. O termo “identidade de sequência”, conforme aqui usado, refere-se â extensão em que as sequências são iguais sobre uma base nucleotídeo-a-nucleotídeo ou uma base aminoãcido-a-aminoãcido sobre uma janela de comparação. Assim, é calculada uma “percentagem de identidade de sequência” comparando duas sequências otimamente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições em que a base de ácido nucleico idêntico (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Vai, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências de modo a produzir o número de posições casadas, dividindo o número de posições casadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência. Para as finalidades da presente invenção, a “identidade de sequência” será entendida significar a “percentagem de casamento” calculada pelo programa de computador DNASIS (Versão 2.5 para Windows; disponível a partir de Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, Califórnia, EUA) usando defeitos (default) padrão conforme usados em manual de referência que acompanha o software. A referência aqui a baixa severidade inclui e engloba desde, pelo menos, cerca de O a, pelo menos, cerca de 15% v/v de formamida e desde, pelo menos, cerca de sal 1M a, pelo menos, cerca de 2M para hibridização e, pelo menos, sal de cerca de 1M a, pelo menos, cerca de 2M para condições de lavagem. Geralmente, a baixa severidade é desde cerca de 25-30°C a cerca de 42°C. A temperatura pode ser alterada e usadas temperaturas mais altas para substituir a formamida e/ou dar condições de severidade alternativas. As condições de severidade alternativas podem ser aplicadas onde necessário, tal como a severidade de meio, que inclui e engloba desde, pelo menos, cerca de 16% v/v a, pelo menos, cerca de 30% v/v de formamida e sal desde, pelo menos, cerca de 0,5M a, pelo menos, cerca de 0,9 M para hibridização e, pelo menos, 0,5M a, pelo menos, cerca de 0,9M para condições de lavagem, ou severidade elevada, que inclui e engloba desde, pelo menos, 31% v/v a, pelo menos, cerca de 50% v/v de formamida e sal desde, pelo menos, cerca de 0,01M a, pelo menos, cerca de 0,15 M para hibridização e, pelo menos, cerca de 0,01 M a, pelo menos, cerca de 0,15M para condições de lavagem. Em geral, a lavagem é realizada a Tm=69,3 + 0,4 1(G + C)% (Marmur e Doty, 1962). Contudo, o Tm de um DNA duplex diminui de 1°C com cada aumento de 1% no número de pares de base que não casam (Bonner e Laskey, 1974). A formamida é opcional nestas condições de hibridização. Consequentemente, os níveis particularmente preferidos de severidade são definidos como se segue: baixa severidade é tampão 6 x SSC, 0,1% p/v SDS a 25-42°C; severidade moderada é tampão 2 x SSC, 0,1% p/v SDS a uma temperatura na faixa de 20°C a 65°C; severidade elevada é tampão 0,1 x SSC, 0,1% p/v SDS a uma temperatura de, pelo menos, 65°C. O termo “transformação” significa alteração do genótipo de um organismo, por exemplo, uma célula eucariótica, pela introdução de um ácido nucleico estranho ou endógeno.

Por “vetor” significa-se uma molécula de ácido nucleico, preferencialmente uma molécula de DNA derivada, por exemplo, de um plasmídeo, bacteriófago ou vírus de planta no qual pode ser inserida ou clonada uma sequência de ácido nucleico. Um vetor contém preferentemente um ou mais sítios únicos de restrição e pode ser capaz de replicação autônoma numa célula hospedeira definida incluindo uma célula ou tecido alvo ou uma célula ou tecido progenitor da mesma ou ser integrável com o genoma do hospedeiro definido de tal forma que a seqúência clonada seja reprodutível. Consequentemente, o vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, um vetor que existe como entidade extra-cromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo circular linear ou fechado, um elemento extra-cromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio de assegurar a auto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser tal que, quando introduzido numa célula, é integrado no genoma da célula recipiente e replicado em conjunto com o cromossomo(s) no qual(ais) foi integrado. Um sistema de vetores pode compreender um vetor singular ou plasmídeo, dois ou mais vetores ou plasmídeos, que contêm em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon. A escolha do vetor dependerá de modo característico da compatibilidade do vetor com a célula na qual o vetor deve ser introduzido. O vetor pode incluir também um marcador de seleção tal como um gene de resistência a antibiótico que pode ser usado para seleção de transforman-tes adequados. Exemplos desses genes de resistência são bem conhecidos dos especialistas na técnica. O termo “gene” é usado no seu sentido mais amplo e inclui cDNA correspondentes aos exons de um gene. Consequentemente, a referência aqui a um “gene” deve ser tomada como incluindo: (i) um gene genômico clássico consistindo em sequências reguladoras transcricionais e/ou translacionais e/ou uma região de codificação e/ou sequências não transladadas (isto é, sequências intron, 5’ e 3’ não transladadas); ou (ii) mRNA ou cDNA correspondentes às regiões de codificação (isto é, exons) e sequências 5’ e 3’ não transladadas; e/ou (iii) uma região estrutural correspondente às regiões de codificação (isto é, exons) opcionalmente, ainda compreendendo sequências não transladadas e/ou uma sequência promotora heteróloga que consiste em regiões reguladoras transcricionais e/ou translacionais capazes de conferir características de expressão sobre a referida região estrutural. O termo “gene” é também usado para descrever moléculas sintéticas ou de fusão codificando todo ou parte de um produto funcional, em particular, um produto de sentido ou anti-sentido mRNA ou um peptídeo, oligopeptídio ou polipeptídio ou uma proteína biologicamente ativa. A referência a um “gene” inclui a referência a um “gene sintético”. O termo “gene sintético” refere-se a um gene de ocorrência não natural, conforme até aqui definido, que preferencialmente compreende, pelo menos, uma ou mais sequências reguladoras transcricionais e/ou translacionais ligadas operavelmente a uma sequência de gene estrutural. O termo “gene estrutural” deve ser considerado referir-se a uma sequência de nucleotídeos que é capaz de ser transmitida para produzir mRNA e, opcionalmente, codifica um peptídeo, oligopeptídio, polipeptídio ou molécula de proteína biologicamente ativa. Os especialistas na técnica serão sabedores de que nem todo o mRNA é capaz de ser transladado para um peptídeo, oligopeptídio, polipeptídio ou proteína, por exemplo, se faltar ao mRNA um sinal de início de translação funcional ou, alternativamente, se o mRNA for mRNA de anti-sentido. A presente invenção engloba claramente os genes sintéticos que compreendem sequências de nucleotídeos que não são capazes de codificar peptídeos, oligopeptídios, polipeptídios ou proteínas biologicamente ativas. Em particular, os presentes inventores apuraram que esses genes sintéticos podem ser vantajosos na modificação da expressão do gene alvo nas células, nos tecidos ou órgãos de um organismo eucariótico. O termo “região de gene estrutural” refere-se àquela parte de um gene sintético que está expressa numa célula, tecido ou órgão sob o controle de uma sequência promotora singular ou sequências promotoras múltiplas. Consequentemente, a região de gene estrutural de um gene sintético pode compreender uma sequência de nucleotídeos que seja capaz de codificar uma sequência de aminoácido, ou seja, complementar a ela. A este respeito, uma região de gene estrutural que é usada na consecução da presente invenção pode compreender também uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácido, embora lhe falte um codon de iniciação de translação funcional e/ou um codon de parada de translação funcional e, como consequência, não compreende uma estrutura completa de leitura aberta. No presente contexto, o termo “região de gene estrutural” também se estende a sequências de nucleotídeos não codificantes, tais como sequências 5’ a montante ou 3’ a jusante de um gene que normalmente não seria transladado numa célula eucariótica que expresse o referido gene.

Consequentemente, no contexto da presente invenção, uma região de gene estrutural pode compreender também uma fusão entre duas ou mais estruturas de leitura aberta dos mesmos ou de diferentes genes. Nessas modalidades, a invenção pode ser usada para modular a expressão de um gene, visando diferentes regiões não contíguas do mesmo ou, alternativamente, para modular ao mesmo tempo a expressão de vários genes diferentes, incluindo diferentes genes de uma família multigenes. No caso de uma molécula de fusão de ácido nucleico que seja não endógena a uma célula eucariótica e, em particular, compreenda duas ou mais seqüên- cias de nucleotídeos derivadas de um patógeno viral, a fusão pode proporcionar a vantagem adicional de conferir simultaneamente imunidade ou proteção contra vários patógenos, visando a expressão de genes nos referidos vários patógenos. Alternativa ou adicionalmente, a fusão pode proporcionar imunidade mais efetiva contra patógeno visando a expressão de mais do que um gene desse patógeno. São particularmente preferidas as regiões de genes estruturais de acordo com este aspecto da invenção que incluem, pelo menos, uma estrutura de leitura aberta transladãvel, ainda com maior preferência que incluem um codon de início translacional localizado na extremidade 5’ da citada estrutura de leitura aberta, se bem que não necessariamente no término 5’ de dita região de gene estrutural. A este respeito, apesar de que a região de gene estrutural possa compreender, pelo menos, uma estrutura de leitura aberta transladãvel e/ou codon de início translacional AUG ou ATG, a inclusão dessas sequências não sugere de modo nenhum que a presente invenção exija que ocorra a translação da molécula introduzida de ácido nucleico, a fim de modular a expressão do gene alvo. Embora não ligado a nenhuma teoria ou modo de ação, a inclusão de, pelo menos, uma estrutura de leitura aberta transladãvel e/ou codon de início translacional na molécula de ácido nucleico sujeita pode servir para incrementar a estabilidade do produto de transcrição de mRNA do mesmo, melhorando, desse modo, a eficiência da invenção. O número ótimo de sequências de genes estruturais que podem estar envolvidas no gene sintético da presente invenção variará consideravelmente, dependendo do comprimento de cada uma das referidas sequências de genes estruturais, a sua orientação e grau de identidade de uma com a outra. Por exemplo, os especialistas na técnica serão sabedores da instabilidade inerente de sequências de nucleotídeos palindrômicas in vivo e as dificuldades associadas com a montagem de genes sintéticos longos que compreendem sequências de nucleotídeos repetidas invertidas, em razão da tendência dessas sequências a se re-combinarem in vivo. Apesar dessas dificuldades, o número ótimo de sequências de genes estruturais a serem incluídas nos genes sintéticos da presente invenção pode ser determinado empiricamente pelos especialistas na técnica, sem qualquer experimentação desnecessária e seguindo os procedimentos padrão tais como a montagem do gene sintético da invenção usando linhas de células deficientes em recombinase, reduzindo o número de sequências repetidas a um nível que elimine ou minimize os eventos de recombinação e mantendo o comprimento total da sequência múltipla de gene estrutural num limite aceitável, preferentemente, não mais do que 5-10 kb, com maior preferência, não mais de 2-5 kb e mesmo com maior preferência não mais de 0,5-2,0 kb de comprimento.

Para expressão em células eucarióti-cas, o construto compreende geralmente, além da sequência de polinucleotídeos, um promotor e, opcionalmente, outras sequências reguladoras projetadas para facilitar a expressão da sequência de polinucleotídeos. A referência aqui a um “promotor” deve ser tomada no seu contexto mais amplo e inclui as sequências reguladoras transcricio-nais de um gene genômico clássico, incluindo a caixa TATA que se exige para a iniciação transcricional precisa, com ou sem uma sequência de caixa CCAAT e elementos reguladores adicionais (isto é, sequências de ativação a montante, intensificadores e silenciadores) que alteram a expressão do gene em resposta a estímulos desenvolvimentais e/ou externos ou de uma maneira específica do tecido. Um promotor está geralmente, mas, não necessariamente, posicionado a montante ou 5’ ou uma região de gene estrutural, cuja expressão ele regula. Além disso, os elementos reguladores que compreendem um promotor ficam geralmente posicionados dentro de 2kb do sítio de início da transcrição do gene.

No presente contexto, o termo “promotor” é também usado para descrever uma molécula sintética ou de fusão ou derivado, que confere, ativa ou intensifica a expressão de uma molécula de ácido nucleico numa célula.

Promotores preferenciais podem conter cópias adicionais de um ou mais elementos reguladores específicos, para intensificar mais a expressão da molécula de sentido e/ou alterar a expressão espacial e/ou a expressão temporal da referida molécula de sentido. Por exemplo, elementos de regulação que conferem induzibilidade ao cobre podem ser colocados adjacentes a uma sequência de promotor heterõloga acionando a expressão de uma molécula de sentido, conferindo, desse modo, induzibilidade do cobre sobre a expressão das citadas moléculas.

Colocar uma molécula de ácido nucleico sob o controle de regulação de uma sequência promotora significa posicionar dita molécula de tal forma que a expressão seja controlada pela sequência promotora. Os promotores ficam geralmente posicionados em 5’ (a montante) para o gene que eles controlam. Na montagem de combinações de promotores heterólogos/ genes estruturais, prefere-se, em geral, posicionar o promotor a uma distância do sítio de início da transcrição do gene que seja aproximadamente a mesma que a distância entre esse promotor e o gene que ele controla no seu estabelecimento natural, isto é, o gene a partir do qual o promotor é derivado. Conforme é conhecido na técnica, algumas variações nesta distância podem ser acomodadas sem perda da função promotora. Do mesmo modo, o posicionamento preferido de um elemento da sequência promotora com respeito a um gene heterólogo a ser colocado sob o seu controle é definida pelo posicionamento do elemento no seu estabelecimento natural, isto é, o gene a partir dso qual ele é derivado. Novamente, conforme é conhecido na técnica, podem também ocorrer algumas variações nesta distância.

Exemplos de promotores adequados para uso nos genes sintéticos da presente invenção incluem promotores derivados virais, fúngicos, bacterianos, de animais e plantas capazes de funcionar em células de plantas, animais, insetos, fungos, fermentos ou bactérias. O promotor pode regular a expressão do componente de gene estrutural constitutivamente ou diferencialmente com respeito à célula, tecido ou órgão em que ocorre a expressão ou com respeito ao estágio do desenvolvimento em que ocorre a expressão ou em resposta a estímulos externos tais como esforços fisiológicos ou patógenos ou íons metálicos, entre outros.

Preferencialmente, o promotor é capaz de regular a expressão de uma molécula de ácido nucleico numa célula eucariótica, tecido ou órgão, pelo menos, durante o período de tempo no qual o gene alvo é nele expresso e, com maior preferência, também precedendo imediatamente o começo de expressão detec- tável do gene alvo na referida célula, tecido ou órgão.

Consequentemente, os promotores constitutivos fortes são particularmente úteis para as finalidades da presente invenção ou promotores que podem ser induzidos por infecção viral ou o começo de expressão de gene alvo.

Os promotores operáveis de plantas e operáveis de animais são particularmente preferidos para uso no construto da presente invenção. Exemplos de promotores preferidos incluem os promotores virais tais como o promotor T7 bacteriófago, o promotor T3 bacteriófago, o promotor SP6, os promotores bacterianos tais como promotor operador lac, promotor tac, promotores virais tais como promotor tardio SV40, promotor cedo SV40, promotor RSV-LTR, promotor CMV IE ou promotores virais de plantas tais como CaMV 35S, promotor SCSV, promotor SCBV e similares.

Em consideração à exigência preferida de expressão de alto nível que coincide com a expressão do gene alvo ou precede a expressão do gene alvo, é altamente desejável que a sequência promotora seja um promotor constitutivo forte no hospedeiro de interesse tal como o promotor CMV-IE ou a sequência de promotor antecipada SV40, a sequência de promotor tardio SV40 para células de mamíferos e o promotor CaMV 35S ou o promotor SCBV em certas células de plantas, entre outros. Os especialistas na técnica serão prontamente sabedores das sequências promotoras adicionais além daquelas especificamente descritas.

No presente contexto, os termos "em conexão operãvel com” ou "operãvel sob o controle" ou similares devem ser tomados como indicando que a expressão da região de gene estrutural ou região de gene estrutural múltiplo estã sob o controle da sequência promotora com a qual ela estã espacialmente ligada; numa célula, tecido, órgão ou organismo inteiro. O construto contém preferentemente elementos reguladores adicionais para transcrição eficiente, por exemplo, uma sequência de terminação de transcrição. O termo “terminador” refere-se a uma sequência de DNA na extremidade de uma unidade transcricional que assinala terminação de transcrição. Os terminadores são sequências de DNA 3’ não transladadas contendo geralmente um sinal de poliadenilação, que facilita a adição de sequências de poliadenilato à extremidade 3’ de um transcrito primário. São conhecidos e descritos na literatura terminadores ativos em células de plantas. Podem ser isolados a partir de bactérias, fungos, vírus, animais e/ou plantas ou sintetizados de novo.

Tal como com sequências de promotores, o terminador pode ser qualquer sequência terminadora que seja operãvel nas células, tecidos ou órgãos em que se pretenda que sejam usados.

Exemplos de terminadores particularmente adequados ao uso nos genes sintéticos da presente invenção incluem o sinal de poliadenilação SV40, o sinal de poliadenilação HSV TK, o terminador CYC1, o terminador ADH, o terminador SPA, o terminador de gene da sintase de nopalina (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, o terminador do gene (CaMV) 35S do vírus do mosaico da couve-flor, o terminador de gene zeína da Zea mays, as sequências de terminador de gene (SSU) do gene da pequena subunidade do Rubisco, os terminadores de sequência de gene (SCSV) do vírus stunt subclover, qualquer terminador B. coli independente de rho ou o terminador alfa lucZ, entre outros.

Numa modalidade particularmente preferida, o terminador é o sinal de poliadenilação SV40 ou o sinal de poliadenilação HSV TK que são operáveis em células, tecidos e órgãos de animais, o terminador da sintase de octopina (OCS) ou sintase de nopalina (NOS) ativo em células, tecidos ou órgãos de plantas ou o terminador IclcZ alfa que é ativo em células procarióticas.

Os especialistas na técnica serão sabedores das sequências terminadoras adicionais que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Essas sequências podem ser prontamente usadas sem qualquer experimentação desnecessária. São bem conhecidos dos especialistas na técnica os meios de introdução dos construtos nas células (isto é, transfecção ou transformação).

Os construtos descritos acima são capazes de serem mais modificados, por exemplo, pela inclusão de sequências de nucleotídeos marcadoras codificantes de uma enzima marcadora detectável ou um análogo ou derivado funcional da mesma, para facilitar a detecção do gene sintético numa célula, tecido ou órgão em que está expresso. De acordo com esta modalidade, as sequências de nucleotídeos marcadoras estarão presentes num formato transladável e expressas, por exemplo, como um polipeptídio de fusão com o(s) produto(s) de translação de qualquer um ou mais dos genes estruturais ou, alternativamente, como um polipeptídio de não fusão.

Os especialistas na técnica serão sabedores de como produzir os genes sintéticos aqui descritos e das exigências para obtenção da expressão dos mesmos, quando pretendido, numa célula específica ou tipo de célula sob as condições pretendidas. Em particular, será conhecido dos especialistas na técnica que as manipulações genéticas necessárias para realizar a presente invenção podem exigir a propagação de um construto genético aqui descrito ou um derivado do mesmo numa célula procariótica tal como uma célula B. coli ou uma célula de planta ou uma célula de animal.

Os construtos da presente invenção podem ser introduzidos numa célula, tecido ou órgão adequados sem modificação como DNA linear, opcionalmente, contido num veículo adequado, tal como uma célula, partícula de vírus ou lipossoma, entre outros. Para produzir um construto genético, o gene sintético da invenção é introduzido num vetor ou molécula de opissoma adequados, tal como um vetor bacteriófago, vetor viral ou um plasmídeo, cosmídio ou vetor cromossômico artificial que seja capaz de ser mantido e/ou replicado e/ou expresso na célula, tecido ou órgão hospedeiros no qual foi subsequentemente introduzido.

Em consequência, um aspecto adicional da invenção proporciona um construto genético que, pelo menos, compreenda um elemento genético conforme aqui descrito e uma ou mais origens de replicação e/ou sequências de gene marcador selecionáveis.

Os construtos genéticos são particularmente adequados para a transformação de uma célula eucariótica de modo a introduzir nela traços genéticos novos, além do provimento de características de resistência a patógenos virais. Esses traços novos adicionais podem ser introduzidos num construto genético separado ou, alternativamente, no mesmo construto genético que compreende os genes sintéticos aqui descritos. Os especialistas na técnica reconhecerão as vantagens significativas, em particular, em termos de manipulações genéticas reduzidas e exigências de culturas de tecidos e efetividade de custos aumentada de incluir sequências genéticas que codifiquem esses traços adicionais e os genes sintéticos aqui descritos num construto genético singular.

Geralmente, uma origem de replicação ou um gene marcador selecionável adequado ao uso em bactéria é fisicamente separado daquelas sequências genéticas contidas no construto genético que se pretende sejam expressas ou transferidas para uma célula eucariôtica ou integradas no genoma de uma célula eucariôtica.

Conforme aqui usado, o termo “gene marcador selecionável” inclui qualquer gene que confira um fenótipo a uma célula sobre a qual ele é expresso de modo a facilitar a identificação e/ou seleção de células que são transfectadas ou transformadas com um construto genético da invenção ou um derivado do mesmo.

Genes marcadores selecionáveis adequados aqui contemplados incluem o gene de resistência à ampicilina (Amp1), o gene de resistência à tetraciclina (Tc1), o gene bacteriano de resistência à canamicina (Kan1) e o gene de resistência à zeocina (Zeocina é uma droga da família da bleomicina que é marca da InVitrogen Corporation), o gene AURI-C que confere resistência ao antibiótico aureobasidina A, o gene resistente à fosfinotricina, o gene (npíll) da fosfotrans- ferase da neomicina, o gene da resistência à higromicina, o gene da β-glucuronidase (GUS), o gene da acetiltransferase de cloranfenicol (CAT), gene codificante da proteína verde fluorescente ou o gene da luciferase, entre outros.

Preferivelmente, o gene marcador selecionãvel é o gene nptll ou o gene Kanr ou o gene codificante da proteína verde fluorescente (GFP).

Os especialistas na técnica serão sabedores de outros genes marcadores selecionáveis úteis na execução da presente invenção e esta invenção não é limitada pela natureza do gene marcador selecionãvel. A presente invenção estende-se a todos os construtos genéticos essencialmente conforme aqui descrito, os quais incluem sequências genéticas adicionais pretendidas para a manutenção e/ou replicação do referido construto genético em células procariotas ou eucariotas e/ou a integração do citado construto genético ou parte do mesmo no genoma de uma célula eucariótica ou organismo.

Podem ser usados métodos padrão descritos acima para introduzir os construtos genéticos na célula, no tecido ou órgão, por exemplo, por transfecção ou transformação mediada por lipossoma, transformação de células com partículas de vírus atenuados ou células bacterianas, casamento de células, procedimentos de transformação ou transfec-ção conhecidos dos especialistas na técnica.

Meios adicionais de introdução de DNA recombinante em tecidos ou células de plantas incluem, mas, sem limitação, a transformação usando CaCb e suas variações, a captura direta do DNA nos protoplastos, a captura mediada por PEG para os protoplastos, o bombardeamento de micro-partículas, a eletroporação, a micro-injeção de DNA, o bombardeamento de micro-partículas de explantes tecidulares ou celulares, a infiltração a vácuo de tecido com ácido nucleico ou, no caso de plantas, a transferência mediada por T-DNA a partir da Agrabacterium para o tecido da planta.

Para o bombardeamento de células por micro-partículas, uma micro-partícula é propelida para uma célula para produzir uma célula transformada. Podem ser usados quaisquer metodologia balística de transformação celular e equipamento adequados na execução da presente invenção. Equipamentos e procedimentos exemplificativos são descritos por Stomp e colaboradores (Patente Americana 5.122.466) e Sanford e Wolf (Patente Americana 4.945.050). Quando se usa procedimentos de transformação balística, o construto genético pode incorporar um plasmídeo capaz de replicar na célula a ser transformada.

Exemplos de micro-partículas adequadas para uso nesses sistemas incluem esferas de ouro de 1 a 5 pm de. O construto de DNA pode ser depositado sobre a micro-partícula por qualquer técnica adequada, tal como por precipitação.

Numa modalidade adicional da presente invenção, os construtos genéticos aqui descritos estão adaptados para integração no genoma de uma célula em que ele estã expresso. Os especialistas na técnica serão sabedores de que, a fim de conseguir a integração de uma sequência genética ou construto genético no genoma de uma célula hospedeira, podem ser exigidas certas sequências genéticas adicionais. No caso de plantas, as sequências do limite esquerdo e direito do T-DNA do plasmídeo Ti da Agrobacterizim tumefadens serão geralmente exigidas. A presente invenção estende-se ainda a uma célula, tecido ou órgão isolado compreendendo os construtos ou partes dos mesmos. A presente invenção estende-se ainda a tecidos, órgãos e organismos inteiros regenerados derivados das referidas células, tecidos e órgãos e a propãgulos e sua progenia, assim como sementes e outro material reprodutivo.

Por exemplo, podem ser regeneradas plantas a partir de células ou tecidos ou órgãos de plantas sobre meios contendo hormônios e as plantas regeneradas podem assumir uma variedade de formas, tais como quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas de modo a conter a expressão cassete); enxertos de tecido transformado e não transformado (por exemplo, uma população de raízes transformadas enxertadas num broto não transformado na espécie citrus). As plantas transformadas podem ser propagadas por uma variedade de meios, tais como por técnicas de propagação clonal ou de criação clássicas. Por exemplo, plantas transformadas de primeira geração (ou Tl) podem ser propagadas para dar plantas transformadas de segunda geração (ou T2) homozigóticas e as plantas T2 propagadas adicionalmente através de técnicas de criação clássica.

Noutra modalidade, o construto é usado para induzir modulação de expressão de uma sequência genética de alvo. Por exemplo, um construto, quando na forma linear, compreende, na direção 5’ para 3’, uma sequência de anti-sentido, um promotor e uma sequência de sentido. Estes elementos são, então, flanqueados por sequências de reconhecimento de proteína facilitadoras de replicação (por exemplo, alça e caule) ou homólogos mamíferos ou microbianos. Uma sequência terminadora fica localizada fora da região flanqueada por sequência de reconhecimento. Após liberação por replicação, é produzida uma sequência de polinucleotídeos que compreende formas de anti-sentido e de sentido de uma sequência genética alvo. A sequência de polinucleotídeos resultante pode, então, formar uma alça de alfinete capilar (hair-pin). O construto pode ser variado para produzir repetições em tandem ou múltiplas, invertidos ou combinações dos mesmos. Esses construtos são úteis para o silenciamento de genes em células de plantas e animais. A ordem dos elementos na forma linear não é crítica. Por exemplo, a localização das sequências de sentido e de anti-sentido pode ser permutada. Um exemplo de um construto adequado é mostrado na Figura 27. A presente invenção é ainda descrita pelos Exemplos seguintes, não limitativos.

Exemplo 1 Vetores de expressão baseados em BB TV

Uma série de vetores de expressão foi montada a qual contém a expressão de acionamento (35S) do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor do gene codificante barnase, no qual o intro do gene ST-LS1 específico de tecido indutor ligeiro da batata foi introduzido (NT-INTRON-CT). O termina-dor foi derivado quer da sintase de nopalina (nos) do gene codificante quer da estrutura principal de leitura aberta (ORF) do BBTV DNA-6 (BT6).

Os construtos foram montados usando PCR com primários de sobreposição (Tabela 1) e clonados em vetores pGEM-T usando técnicas padrão conhecidas. O vetor de expressão pTBN foi montado e está mostrado na Figura 1. pTBN (SEQ ID NO:66) representa o esqueleto sobre o qual foram montados outros vetores de expressão. Estão indicados os nomes e sítios de ligação dos primários, tal como o tamanho de cada sequência. pTBN (tal como os outros construtos) foi amplificado de uma maneira gradual. De início, todos os três fragmentos foram separadamente amplificados (isto é, 35S, NT-INTRON-CT e nos). A sequência inteira foi, então, amplificada por mistura de cada um dos fragmentos num PCR com primários +1 e —4. pTBN6 (SEQ ID NO:67) mostrado na Figura 2 contém uma região de 624 bp contendo o CR-SL e CR-M de BBTV DNA-6 (61), inserido no intron. pTBN 1 (SEQ ID NO:68) mostrado na Figura 3 contém uma região de 163 bp contendo o CR-SL e CR-M de BBTV DNA-l(lI), inserido no intron, de modo idêntico a pTBN6. O terminador nos foi substituído pelo terminador de 126 bp a partir de BBTV DNA-6 grande OPF.

Os vetores de recircularização são baseados no pTBN6 e pTBNl. São flanquea-dos por sequências de reconhecimento Rep e projetados para recircularizar e subsequentemente ficarem ativos transcricionalmente, apenas na presença do Rep BBTV. Foram feitos três vetores diferentes: pRTBNõ, pRTBNl e pRTBNl/6. O pRTBNõ mostrado na Figura 4 foi montado a partir do pTBN6. Dois fragmentos foram amplificados usando +5 e —4 e +1 e —6, respectivamente. Estes foram clonados em pGEM-T e subclonados para criar pRTBNõ. O pRTBNl mostrado na Figura 5 foi montado a partir de pTBNl de modo semelhante a pRTBNõ. O pRTBNl/õ mostrado na Figura õ era um híbrido de pRTBNl e pRTBNõ.

Foram também montados vetores não transladáveis para cada um dos construtos mencionados acima (exceto pTBN). Nestes vetores, o codon de início do gene barnase foi deletado usando o primário +11 (referir-se à Tabelai). Os construtos foram nomeados pUBN6, pUBN1, pRUBNÕ e pRUBNl.

Tabela 1 — Sequências primárias de oligonucleotídeos Exemplo 2 Vetores de expressão baseados em *TYJ>V (a.) Montagem cie um cassete de expressão de gene repórter GUS contendo intron O vetor pCAMBIA 2301 foi obtido a partir de CAMBIA (Canberra, Austrália). Este vetor contém um intron de catalase de 189 bp dentro da parte 5’ da região codificante uidA. A região promotora 35S CaMV (800 bp), região codificante uidA e o terminador nos foram removidos de pCAMBIA 2301 na forma de um fragmento Hindlll / Sphl e inseridos no vetor (Promega) pGEM-T digerido de modo similar. O construto subsequente foi designado pGEM-230 1. O promotor 35S CaMV de 800 bp foi substituído pelo promotor mais forte 35S CaMV de 530 bp por digestão e ligação Notl / Bglll. O vetor subsequente foi designado p35S-2301 (Figura 7) e serviu de gabarito para todas as etapas de clonagem subsequentes. (b) Isolamento da grande região intergênica do mastrevirus anão amarelo do tabaco (TYDV) e inserção no intron de catalase de p35S-'2301 Foi amplificado um fragmento de 272 bp incorporando a grande região intergênica (LIR) (nt+1 a nt+272) do TYDV (Genback Acc M81103) a partir de tecido de folha do tabaco infectada por TYDV por PCR usando primários LIR-F e LIR-R (ver Figura 1). Este fragmento foi designado LIR.

Primários: UR-F 5’-GCTCITCCTGCAGGCGGCCGCATTAAGGCTCAAGTACCGTA3’ [SEQ ID NO: 19] LIR-R 5’- GCTCTTCGTCGACGAATTCATTTTCAACTTTGGGATGTCAC-3’ [SEQ ID N0:20] O segmento compreendendo o promotor (530 bp) 35S CaMV, uidK Io exon (19bp) e a metade 5’ do intron de catalase (83 bp) foi amplificado a partir do DNA do plasmídeo de p35S-2301 por PCR, usando primários 35S-IE e CAT-A. Este fragmento foi designado CAT-A.

Primários: 35S-IE 5’-GAATTCCATGGAGTCAAAGATTGA-l1 [SEQIDN0:21] CAT-A 5’-GCCCGCTGÇAGAGTTTAAAGAAAGATCAAAGC-3’ [SEQ ID NO:22] O segmento compreendendo a metade 3’ do intron de catalase (106 bp) e uid/A 2o exon (1809 bp) foi amplificado a partir do DNA do plasmídeo p35S-2301 por PCR, usando primários CAT-B e GUS-BsíEII. Este fragmento foi designado CAT-B.

Primários: CAT-B 5 ’-GCCCCGGTCGACGATCTATTTTTTAATTGATTGG-3 ’ [SEQ ID N0:23] GUS-ΛίΕΠ 5 ’-TTCGAGCTGGTCACCTGTAATTC AC ACGT GGT G-3 ’ [SEQ ID NO:24] Os produtos PCR resultantes foram clonados em pGEM-T e verificada a sequência de nucleotídeos. Por fim, cada fragmento foi excisado (CAT-A usando EcoRl/Pstl, LIR usando Pstl / Sall e CAT-B usando Sa.ll / BstEII) a partir de pGEM-T e ligados em conjunto em EcoRI / BstEIl digerido p35S-230 1 de modo a criar o plasmídeo pTESTl (Figura 8). (c) Determinar se a expressão GUS é afetada pela inserção do TYDV LIR no intron de catalase A fim de determinar se a expressão GUS e, portanto, a junção do intron, foi afetada pela inserção do TYDV LIR no intron de catalase dos construtos p35S-2301, bombardearam-se os construtos em células de banana embriogênicas e ensaiada a atividade GUS de modo transiente.O plasmídeo de teste pTESTl e o plasmídeo de controle positivo p35S-2301 foram revestidos sobre partículas de ouro de 1 pm e biolisticamente introduzidos em células embriogênicas da banana (Musa spp cv. “Ladyfinger” AAA) de 5 dias de idade de acordo com Becker e colaboradores (2000). Dois dias após o bombardeamento, as células foram coletadas e a atividade GUS ensaiada histoquimicamente (Jefferson e colaboradores, 1987). Não foi observada nenhuma atividade endógena GUS nas células não bombardeadas. Observou-se forte atividade GUS, evidenciada na forma de focos de células coradas de azul brilhante, bombardeadas com o plasmídeo de controle positivo p35S-230 1. Em contraste, a expressão GUS a partir de células bombardeadas com pTESTl foi menor (cerca de 5 vezes) conforme determinado pelo número e intensidade dos focos de células de coloração de azul brilhante. Este resultado sugeriu que a inserção do TYDV LIR no intron de catalase do p35S-2301 não abole a expressão GUS, mas, pode afetar em algum grau o processamento do intron. (d) Identificação de sítios de junção de intron críptico dentro do TYDV LIR A fim de determinar se o TYDV LIR continha sítios de junção de intron críptico potenciais, que pudessem afetar o processamento pre-mRNA, sintetizou-se cDNA a partir de extratos RNA derivados de células bombardeadas com p35S-2301 e pTESTl. O RNA total foi isolado a partir de células da banana dois dias após bombardeamento com p35S-2301 e pTESTl usando o método de Chang e colaboradores (1993). Sintetizou-se DNA complementar a partir do RNA total usando o primário uidA2. Este cDNA serviu de gabarito para um PCR aninhado usando primários uidAl e uidA3. Os produtos PCR resultantes foram clonados em pGEM-T e seqüenciados. A seqüenciação identificou dois sítios potenciais dentro do TYDV LIR, que podem contribuir para junção aberrante do intron de catalase a partir da região codificante uidA pre-mRNA. A primeira sequência, CTGCAGVGC, localizada dentro do primário LIR-F usado para isolar o TYDV LIR, apresenta grande semelhança com o sítio de junção 3’ de consenso (T(IOX)GCAGVGT). A segunda sequência, TAVGTGAGT (nt+43 a nt+50) compartilha alguma similaridade com o sítio de junção 5’ de consenso (AGVGTAAGT). Primários: uidAl 5CCATGGTAGATCTGAGGG-35 [SEQID NO:25] uidA2 5 ’ -TACGTACACTTTTCCCGGC AATAAC-3 ’ [SEQ ID NO:26] uidA3 5’-GTAACGCGCTTTCCCACCAACGC-3’ [SEQIDNO:27] (e) Remoção do sítio de junção de intron críptico 3’ a partir do TYDV LIR

Dos dois sítios de junção intron crípticos identificados, o primeiro (CTGCAGGC) foi considerado o mais significativo devido à sua localização em relação ao sítio de junção intron de catalase 5’. A fim de remover esta sequência do TYDV LIR, um novo primário, LIR-Xho, foi projetado incorporando um sítio Xhol no lugar dos sítios original Psíl e Notl de restrição. O TYDV LIR foi re-amplificado a partir do DNA do plasmídeo pTESTl por PCR usando primários LIR-Xho e LIR-R. Este fragmento foi designado LIR-X. De modo semelhante, o fragmento compreendendo o promotor 35S CaMV (530 bp), uidA Io exon (19 bp) e a metade 5’ do intron de catalase (83 bp) foi re-amplificado a partir do DNA do plasmídeo pTESTl por PCR usando primários FUP e CAT-Xho. Este fragmento foi designado CAT-X. Ambos os produtos PCR foram clonados em p-GEM-T e verificadas as suas sequências. Por fim, foram excisados fragmentos PCR a parti de pGEM-T (LIR-X usando XTioI/SalI e CAT-X usando PstI/Xhol) e ligados em Pstl / Sall digerido por pTESTl, para substituir os insertos originais. Este construto foi designado pTEST2 (Figura 9). A remoção do sítio de junção de intron críptico em pTEST2 gerou níveis mais elevados de expressão GUS do que pTESTl devido a uma redução na junção aberrante e processamento melhorado de mRNA.

Primários: LIR-Xho 5 ’-CTCGAGATTAAGGCTCAAGTACCGTA-3 ’ [SEQIDNO:28] CAT-Xho 5 ’ - AGTTT AAAGAAAGATC AAAGC-3 ’ [SEQIDNO:29] FUP 5 AATTAACCCTC ACTAAAGGG-3 ’ [SEQID NO:30] (f) Montagem do vetor de expressão GUS ativável por Rep Um fragmento de 229 bp incorporando a pequena região intergênica TYDV (SIR) (nt+1275 a nt+1504) foi ampliado a partir de tecido de folha do tabaco infectada por TYDV por PCR usando primários SIR-F e SIR-R (veja-se Figura 2). O produto PCR resultante foi clonado em pGEM-T e a sequência de nucleotídeos verificada. Este plasmídeo foi designado pGEM-SIR. O TYDV SIR foi excisado a partir de pGEM-SIR como fragmento Sphl e inserido no único sítio Sphl, a jusante do terminador nos, em pTESTl.

Este construto foi designado pTESTl-SIR. Primários: SIR-F 5 ’-GC ATGCAAGAGTTGGCGGTAGATTCCGC ATGT-3 ’ [SEQ ID N0:31] SIR-R 5 ’ -GCTCTTCGCGGCCGCGCTCCTGAATCGTCGAGTCA-3 ’ [SEQ ID NO:32] O promotor 35S CaMV, o uidA Io exon, a metade 5’ do intron de catalase e o TYDV LIR foram excisados a partir do pTEST2 como fragmento Notl/Sall e inseridos num vetor pGEM-T digerido de modo semelhante. O clone subsequente foi designado pGEM-CATX. O TYDV LIR, a metade 3’ do intron de catalase, o uidA 2o exon, o terminador nos e o TYDV SIR foram excisados a partir do pTESTl-SIR como fragmento Notl e inseridos no único sítio iVoíI em pGEM-CATX. Este construto foi designado pTEST3 (Figura 10). O cassete de expressão GUS ativável foi subsequentemente excisada a partir de pTEST3 por digestão Saci / Apal e inserido nos sítios de restrição Sacl/Apal localizados a montante do cassete ter · pro-NPTII-nos nos plasmídeo binário pART27 (Gleave 1992). Este construto foi designado pTEST4 (Figura 11)- O vetor pTEST4 foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) por eletroporação usando o método de Singh e colaboradores (1993). (g) Montagem do TYOVl.lmer infeccioso Dois fragmentos de sobreposição do genoma do TYDV foram amplificados a partir de tecido da folha do tabaco infectado por TYDV por PCR usando pares primários LIR-F/SIR-R (SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:32) e LIR-R/TYD-3F (SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:33). Os produtos PCR resultantes (TYD-R e TYD-L, respectivamente) foram clonados em pGEM-T e verificadas as suas sequências. Estes plasmídeos foram designados pGEM-TYD-R e pGEM-TYD-L, respectivamente. Um fragmento de 1659 bp do genoma TYDV foi excisado a partir do pGEM-TYD-L por digestão com BcoRl e inserido no único sítio BcoRl em pGEM-TYD-R. Este construto foi designado pGEM-TYDVl.lmer. O TYDVl.lmer foi excisado a partir do pGEM-TYDV 1.1 mer por digestão parcial por Sall / BcoRl e inserido no vetor digerido de modo similar pBI 101.3 (Clontech) para substituir o gene uidA e terminador nos. Este construto foi designado pBI-TYDV. 1 mer (Figura 12). O vetor pBI-TYDV 1.1 mer foi introduzido em Agrobacterium tumefczciens (LBA4404) por eletroporação usando o método de Singh e colaboradores (1993).

Primários: TYD-3F 55 -TTT AAACGTTT AGGGGTTAGC A-3 ’ [SEQIDNO:33] (h) Montagem da fusão Rep 35S-7'Y£)V CaMV O gene completo Rep (incluindo RepA) do TYDV (nt+2580 a nt+148 1) foi amplificado a partir do tecido da folha do tabaco infectado por TYDV por PCR usando primários TYDVRepF e TYDVRepR. O produto PCR resultante foi diretamente clonado no sítio Smal localizado entre o promotor 35S CaMV (530bp) e o terminador 35S CaMV (200 bp) em pDH5 1 (Pietrzak e colaboradores, 1986). Este construto foi designado p35S-Rep (Figura 13). TYDVRepF 5’-TCAGTGACTCGACGATTC-3 ’ [SEQIDNO:34] TYDYRepR 5 ’-TTAATATGCCTTCAGCCC-3 ’ [SEQ1DN0:35] Exemplo 3 Ensaios de expressão GUS

usando vetores TYDV

(a) Expressão transiente de GUS ativada, por Rep em células dicot e monocot Células de tabaco (NT-1) são mantidas basicamente como descrito por An (1985) e são preparadas para bombardeamento de micro-partículas, conforme detalhado por Dugdale e colaboradores (1998). Prepararam-se suspensões de células embriogênicas de banana (Musa spp. Cv. “Ladyfinger” AAA), conforme previamente descrito. O recobrimento de partículas de ouro e os parâmetros biolísticos foram basicamente conforme descrito por Dugdale e colaboradores (1998) ou Becker e colaboradores (2000).

Os plasmídeos usados para este estudo incluíam: (i) p35S-230 1 como controle positivo (Figura 7), (ii) pTEST3 (Figura 10), (iii) p35S-Rep (Figura 13) e (iv) pTEST3 e p35S-Rep.

Bombardeiam-se cinco placas de ambas as linhas de células para cada uma das quatro combinações de plasmídeos. As células são coletadas três dias após bombardeamento e a atividade GUS ensaiada histoquimicamente e/ou fluormetricamente (Jefferson e colaboradores, 1987). Não se observa atividade endõgena GUS nas células não bombardeadas. Observa-se forte atividade GUS, evidenciada como focos de células coradas de azul brilhante, a partir de células bombardeadas com o plasmídeo positivo de controle p35S-2301. Nenhuma expressão GUS é observada a partir de células bombardeadas quer com p35S-Rep, quer com pTEST3. Em contraste, as células bombardeadas tanto com p35S-Rep como com pTEST3 ficam intensamente coradas de azul, mais do que aquelas obtidas com o plasmídeo p35S-2301 de controle positivo. Este resultado sugere que apenas após adição do TYDV Rep em trans o cassete de expressão GUS no pTEST3 se torna ativado. (d) Detecção de corte, junção e replicação assistido, por Rep do epissoma de planto de multicópia GUS (MPR) A detecção dos MPEs GUS baseada em TYDV é realizada usando uma abordagem PCR. Os primários uidAl (SEQ ID NO:25) e uidA3 (SEQ ID NO:27) amplificam um fragmento do gene uidA percorrendo o intron de catalase. Apenas após liberação do MPE baseado em TYDV assistida por Rep a partir do plasmídeo pTEST3 esta combinação de primário gera um produto de 600 bp (incluindo 140 bp do gene uidA, 190 bp do intron de catalase e 270 bp do TYDV LIR) num PCR.

Bombardeiam-se células do tabaco NT-1 e da banana com cada uma das quatro combinações de plasmídeos listadas acima. Três dias após bombardeamento, as células são coletadas e o gDNA total extraído usando o método de Stewart e Via (1993). Usa-se o gDNA (1 |ig) para PCR com primários uidAl (SEQ ID NO:25) e uidA3 (SEQ ID NO:27) como gabarito. Os produtos PCR são sujeitos à eletroforese através de gel de agarose de 1,5% p/v. Obtém-se um produto de 330 bp a partir de gDNA de células bombardeadas com o plasmídeo de controle p35S-2301 (Figura 7). Este produto correspondeu à sequência uidA e o intron de catalase a partir do DNA do plasmídeo de entrada. Não se obtém nenhum produto PCR a partir de gDNA de células não bombardeadas ou células bombardeadas com pTEST3 ou p35S-Rep apenas. Obtém-se um produto 600 bp a partir de gDNA de células bombardeadas tanto com pTEST3 como com p35S-Rep. Este resultado suporta ensaios histoquí-micos GUS prévios e sugere que os MPEs baseados em TYDV são apenas gerados em células bombardeadas tanto com pTEST3 como com p35S-Rep. A replicação dos MPEs baseados em TYDV é avaliada por hibridização Southern. Usando esta abordagem, as formas multiméricas do MPE, indicativas de replicação giratória em círculo, são detectadas por hibridização. O gDNA total (20 pg) a 9 partir das células bombardeadas com cada uma das quatro combinações de plasmídeos é sujeito à eletroforese através de gel de agarose a 1,5% p/v. O DNA é transferido para uma membrana de nylon (Roche) pelo método de Southern (1975). Uma sonda etiquetada DIG de 600bp, específica para o uidA e o intron de catalase, é amplificada por PCR usando primários uidAl (SEQ ID NO:25) e uidA3 (SEQ ID NO:27). A sonda específica de uidA é hibridizada com a membrana de nylon a 42°C em solução DIG Easy-Hib (Roche) e o sinal detectado usando substrato CDP-STar (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. Formas características superenroladas, lineares e circulares abertas e formas multiméricas de peso molecular mais elevado dos MPEs baseados em TYDV são apenas detectadas em gDNA a partir de células de plantas bombardeadas tanto com pTEST3 como com p35S-2301. Juntos, estes resultados confirmam que, quando suprido em trans, o TYDV Rep é capaz de cortar, juntar e replicar o MPE baseado em TYDV tanto nos tipos de células monocotiledôneas como dicotiledôneas. Além disso, estes resultados sugerem que a expressão uidA a partir do plasmídeo pTEST3 somente é ativada por adição do TYDV Rep e a adição resulta em expressão significativamente maior do que um cassete de expressão GUS não replicante (p35S-230 1).

Exemplo 4 Transformação estável de uma planta monocotiledônea e dicotiledônea com o cassete ativável por Rep Suspensões de células embriogênicas de banana (Musa spp. Cv. “Ladyfinger” AAA) são alvejadas para transformação estável baseada em microprojéteis. As células são bombardeadas com pTEST3, conforme previamente descrito, exceto que o plasmídeo é co-transformado com 1 pg de pDHKAN (Pietrzak e colaboradores, 1986). Este plasmídeo contém um cassete ter pro-NPTII-CaMV 35S CaMV, a partir do qual a expressão do gene NPTII confere resistência aos antibióticos canamici-na ou geneticina. A seleção, a cultura e a regeneração de plantas de banana transgênica são feitas basicamente conforme descrito por Becker e colaboradores (2000). Confirma-se que as plantas transgênicas independentes contêm tanto genes NPTII como uidA por PCR, usando pares primários NPT-F/NPT-R e uidA4/uidA5, respectivamente. Selecionam-se dez transformantes independentes para estudos adicionais.

Primários: NPT-F 5 ’ -AT GATT GAAC AAGAT GGATT-3 ’ [SEQID NO:36] NPT-R 5 ’-TGAGAAGAACTCGTCAAGA-3 ’ [SEQEDNO:37] uidA4 5 ’-GTTATTGCCGGGAAAAGTGTACGTA-3 ’ [SEQIDN0:3S] uidA5 5 ’-CTAGCTTGTTTGCCTCCCTGCTGCG-3 ’ [SEQ ED NO:39] O tabaco (Nicotia.no. ta.ba.cum cv. "Samsun") é transformado por infecção mediada por Agrobacterium de discos foliares de acordo com o método de Horsch e colaboradores (1988). Dez plantas transgêni-cas independentes são transformadas com T-DNA a partir do plasmídeo pTEST4. Mostra-se que cada linha contém as regiões codificantes NPTII e uidA por PCR, como acima descrito.

Peças foliares de cada uma das dez linhas transgênicas de banana e tabaco transformadas com o cassete de expressão GUS ativável por Rep (isto é, pTEST3 [Figura 10] e pTEST4 {Figura 11}, respectivamente) são bombardeadas com o plasmídeo p35S-Rep. Três dias após bombardeamento, as peças foliares são sujeitas a ensaios histoquímicos GUS. Nenhuma expressão GUS é evidente em peças foliares não alvejadas a partir de cada uma das dez linhas de banana e tabaco. As peças folieares, bombardeadas com o plasmídeo p35S-Rep, exibem múltiplos focos GUS de coloração azul. O corte, junção e replicação dos MPEs baseados em TYDV são confirmados nestas peças foliares, conforme descrito previamente. Estes resultados indicam que o TYDV Rep é capaz de ativar a expressão GUS a partir de uma cópia estavelmente integrada de cada plasmídeo e capaz de cortar, juntar e replicar o MPE baseado em NYTV in vivo.

Exemplo 5 Expressão ativada por infecção por TYDV em tabaco transgênico Cada uma das 10 linhas de tabaco transgênico é infiltrada com culturas de Agrobacterium transformadas com pBI-TYDVl.lmer (referir-se ao Exemplo 2(f), Figura 12) usando o método de Boulton (1995). Durante um período de dois meses, recolhem-se amostras a partir do ponto de infecção e através da planta e a expressão GIJS é avaliada usando ensaios histoquímicos. A atividade GUS (isto é, o tecido corado de azul) é apenas notada em plantas infectadas por TYDV, em comparação com controles inoculados por simulação. Durante o tempo, a expressão GUS espalha-se, via vasculatura, a partir do ponto inicial da infecção para várias partes da planta. O corte, junção e replicação dirigida por Rep do cassete de expressão GUS é estabelecido conforme previamente descrito. Este resultado sugere que a infecção TYDV é suficiente para a liberação por replicação do cassete de expressão GUS a partir de uma cópia cromossômica integrada.

Exemplo 6 Ensaios de morte celular transiente usando vetores de expressão baseados em BBTV

Para demonstrar que a barnase era capaz de causar a morte celular, realizaram-se ensaios com vetores de expressão (pTBN, ρΒΤΝ6, pBTNl, Figuras 1, 2 e 3). Os controles negativos foram pUBN6 e pUBNl (referir-se ao Exemplo 1, acima). Cada um destes construtos foi co-bombardeado com um vetor GUS em suspensões de células embriogênicas de banana (Musa spp. cv. Bluggoe), conforme descrito por Dugdale e colaboradores, 1998. O vetor GUS continha um promotor forte (milho Ubil, CaMV 35S ou banana Actl direcionando a expressão do gene repórter β-glucuronidase (Jefferson, 1987). Ensaios subsequentes MUG para a atividade GUS mostraram que as células que foram transformadas quer com pTBN, pTBNô ou pTBNl tinham atividade GUS mais baixa do que o controle negativo (pUBNl ou pUBNô) (Figura 14). Isto sugere que a junção intron estã ainda ocorrendo e, pelo menos, no caso de pTBN 1, não difere significativamente do vetor pTBN original. Assim, a inclusão dos elementos de replicação BBTV no intron não diminuiu significativamente a eficiência de junção ou atividade subsequente da barnase, em relação ao pTBN.

Efetuaram-se experimentos que mostraram que a recircularização e replicação do BBTV baseada em "1.1 mers" ocorre na presença do Rep (produto genético a partir de BBTV DNA-1). Verificou-se também que a replicação era intensificada pela inclusão do produto genético de BBTV DNA-5 (uma proteína de ligação semelhante a retinoblastoma putativa). Consequentemente, cada um dos vetores de recircularizaçao (pRBTNó [Figura 4], pRTBNl [Figura 5], pRUBNô, pRUBN 1) foi bombardeado com BBTV DNA-1 e 5 "1.1 mers” e um vetor de expressão GUS.

Tabela. 2 - Combinações de plasmídeos usados para bombardeamento de microprojéteis de células da banana Os resultados mostrados na Figura 15 suportaram os ensaios de morte celular do vetor de expressão anterior (Figura 14).

Novamente, os construtos contendo barnase não transladável (pRUBNó e pRUBN 1) tinham atividade GUS mais elevada do que os construtos transladáveis.

Efetuaram-se experimentos para demonstrar que a atividade da barnase era induzida apenas na presença de proteínas Rep. Consequentemente, efetuaram-se ensaios +/- o Rep (BBTV DNA-1 "1.1 mer”) para demonstrar que a expressão ocorrería apenas quando ela estivesse presente (Tabela 3). DNA "mais substancioso" foi usado para manter uma concentração de DNA constante.

Tabela 3 - Combinações de plasmídeos usados para bombardeamento de microprojéteis de células da banana Para observar se · os construtos de recircularização eram capazes de replicar na presença de BBTV DNA-1 e 5 "1.1 mers", incluíram-se construtos não transladáveis em ensaios de replicação transiente de células de banana. As células foram coletadas a O, 4 e 8 dias após o bombardeamento, o DNA celular total foi extraído e analisado usando a hibridização de Southern.

Inicialmente, as membranas foram sondadas com uma sonda DIG-etiquetada CaMV 35S. Não estavam evidentes nenhumas formas replicativas nas células nos dias 4 nem 8. Contudo, no dia O, estavam presentes formas replicativas potenciais em concentrações muito baixas tanto em pRUBNõ como pURBNl. A sonda 35S foi separada em tiras e as membranas sondadas de novo com uma sonda DIG etiquetada BBTV DNA-1. Observaram-se elevados níveis de replicação nas células coletadas tanto no dia 4 como no dia 8 e quase nada em células coletadas no dia O.

Exemplo 7 Ensaios de morte celular usando vetores de expressão baseados em TYDV (a) Vetor de gene suicida ativável por Rep para conferir resistência contra TYDV O plasmídeo pRTBN (DNA Plant Technologies, Oakland, Califórnia) contém a região codificante da barnase (339 bp) dentro da qual foi incorporado o intron ST LS1 da batata (188 bp). O gene barnase e intron inteiro foi amplificado a partir do pRTBN por PCR usando primários BARN.EXP1 e BARN.EXP2. Um controle de gene não trans-ladável foi amplificado de modo semelhante usando primários BARN.UTR e BARN.EXP2. Primários: BARN.EXP1 5’-GGATCCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGACG-3’ [SEQJDNO:40] BARN.EXP2 5 ’-CT AGAGTTATCTGATTTTTGTAAAGGTC-3 ’ [SEQ ED N0:41] BARN.UTR 5 ’-GGATCCGCACAGGTTATCAACACGTTTGACG-3 ’ [SEQ ED NO:42] Os produtos PCR foram clonados num vetor pGEM-T. Estes clones foram designados pGEM-BTR e pGEM-BUTR, respectivamente. O TYDV LIR (LIR-X) foi excisado como fragmento EcoRl a partir do pGEM-T e inserido no sítio MfeI localizado dentro do intron LTS da batata do pGEM-BTR e pGEM-BUTR. Estes plasmídeos foram designados pBTR-LIR e pBUTR-LIR, respectivamente. Os genes da barnase contendo LIR em pBTR-LIR e pBUTR-LIR foram excisados como fragmentos BamHl / PstI e inseridos no vetor digerido de modo semelhante pGUS2 para substituir a região codificante do uidA original. O plasmídeo pGUS2 contém um gene CaMV35S pro (530 bp)-uidA CaMV 35S ter (200 bp). Estes construtos foram designados p35S-BTR-LIR e P35S-BLTTR-LIR, respectivamente (Figura 17). Dois plasmídeos de controle foram montados por excisão dos genes barnase a partir da pGEM-BTR e pGEM-BUTR com BamBl / Pstl e inserção em pGUS2 digerido de modo similar. Estes plasmídeos de controle foram designados p35S-BTR e p35S-BUTR, respectivamente (Figura 18). (b) Avaliação transiente da atividade TYDV da barnase ativada por Rep em células monocotíledôneas e dicotiledôneas A fim de determinar a atividade da barnase in vivo, bombardeiam-se construtos suicidas com um cassete de expressão (gfp) de proteína verde fluorescente. A expressão e ação da barnase (isto é, a morte celular) é considerada ocorrer, quando é observada uma redução significativa nos focos de verde fluorescente em comparação com os controles de barnase não transladáveis. Células da banana (Musa spp. Cv. "Ladyfinger") e tabaco (Nicotia.no. tabacum NT-1) são bombardeadas com plasmídeos (i) p35S-BTR, (ii) p35S-BUTR, (iii) p35S-BTR-LIR e (iv) p35S-BUTR-LIR (Figuras 17 e 18), conforme descrito no Exemplo 3 acima. Cada plasmídeo é co-bombardeado com 1 pg de pWORM. O construto pWORM contém um cassete CaMV 35S pro (530 bp)-gfp (750 bp)-CaMV 35S ter (200 bp) e mostrou-se anteriormente que proporciona forte fluorescência verde em ensaios transientes com ambos os tipos de células (Dugdale e colaboradores, 1998).

Três dias após bombardeamento, a fluorescência verde é visualizada usando um microscópio estéreo Leica MZ12 com módulo de fluorescência GFP-Plus (excitação = 490, emissão = 510). Ambos os p35S-BTR e p35S-BTR-LIR reduzem significativamente a expressão gfp a partir de pWORM (conforme determinado pelo número e intensidade dos focos de fluorescência verde) em comparação com p35S-BUTR e p35S-BUTR-LIR. Este resultado sugere que a inserção do TYDV LIR no intron ST LSI não interfere com o processamento do intron nem inibe a expressão barnase. (c) Montagem do vetor Barri ase TYDV ativável por Rep O promotor CaMV, a metade do gene barnase 5', a metade de intron ST LSI 5' e TYDV LIR são re-amplificados a partir de p35S-BTR-LIR (Figura 17A) por PCR usando primários 35S-IE (SEQ ID NO: 2 1) e LIR-R (SEQ ID N0:20). O produto PCR é clonado no vetor pGEM-T a sequência verificada. Este plasmídeo é designado pGEMB5'. O TYDV LIR, a metade de intron ST LSI 3', a metade do gene barnase 3' e o terminador nos é excisado a partir de p35S-BTR-LIR como um fragmento Xhol / Saci, o TYDV SIR é excisado a partir de pGEM-SIR como um fragmento Sacl/Ncol e o promotor CaMV 35S, a metade de gene barnase 5', a metade de intron ST LSI 5' e TYDV LIR são excisados a partir de pGEMB5' como fragmento parcial Ncol / Sacll. Os insertos são ligados em conjunto com Xhol / Sacll digerido por pBluescript II (Stratagene). O construto resultante é designado pBTR.tesl (Figura 19A). O vetor de controle não transladãvel é preparado de modo semelhante e o construto resultante designado por pBUTR.testl (Figura 19B). (d) Expressão Barnase TYDV transiente ativada por Rep em células monocot e dicot Células da banana (Musa spp. Cv. "Lad3^finger") e tabaco (Nicotiana tabacum NT-1) são bombardeadas, conforme acima descrito, com as combinações de plasmídeos listadas na Tabela 4, abaixo: Tabela 4 - Combinações de plasmídeos para ensaios de transformação transiente em células da banana e do tabaco e expressão gfp delas resultante Os resultados na Tabela 4 sugerem que a expressão barnase (e, portanto, a morte celular) é apenas ativada a partir do pBTR-testl, quando o TYDV Rep é suprido em trans. A expressão ativada por Rep do cassete do gene do barnase não transladável (pBUTR-testl) não resulta em nenbuma redução significativa na expressão gfp a partir de pWORM. O corte, junção e replicação assistida por Rep dos MPEs a partir de células bombardeadas com pBUTR-testl, pWORM e p35S-Rep é confirmada conforme previamente descrito, exceto que os primários BARN.UTR (SEQ ID NO:40) e BARN.EXP2 (SEQ ID NO:41) são usados para PCR e uma sonda DIG etiquetada específica da barnase é sintetizada usando os primários anteriormente mencionados. (e) Montagem de plasmídeos binários contendo cassetes de gene barnase ativáveis por Rep Cassetes de barnase ativáveis por Rep são excisados a partir de pBTR-testl e pBUTR-testel como fragmentos Puull e inseridos no sítio único RcoRl (extremidade cega usando fragmento Klenow grande de polimerase I de DNA) localizado a jusante do cassete CaMV 35S pro-NPTII-CaMV 35S no plasmídeo binário pTAB5 (CSIRO, Canberra, Austrália). Os construtos resultantes são designados pTAB-BTRl e pTAB-BUTR 1, respectivamente. Ambos os vetores são introduzidos em Agrobacteriam tumefadens (LBA4404) por eletroporação usando o método de Singb e colaboradores (1993). (f) Transformação estável de uma planta monocotiledônea e dicotiledônea com os casstes de barnase ativáveis por Rep Ê feita a transformação estável de banana (Musa spp. Cv. "Ladyfinger") e tabaco (Nicotiana tabacum cv. "Samsun") como descrito no Exemplo 4, acima, exceto que os plasmídeos pBTR-testl e pBUTR-testl são independentemente co-transformados com pDHKAN para a transformação estável da banana e são usadas culturas de Agrobacterium alojando os plasmídeos pTAB- BTR1 e pTAB-BUTRl para a transformação mediada por Agrobacterium de discos de folhas do tabaco.

Confirma-se que as plantas transformadas contêm os cassetes de gene barnase e o gene NPTII por PCR usando pares primários LIR-F/LIR-R (SEQ ID NO:19/SEQ ID N0:20) e NPT-F/NPT-R (SEQ ID NO:36/SEQ ID NO: 37), respectivamente. Dez linhas transgênicas independentes de ambas as espécies monoco-tiledôneas e dicotiledôneas são selecionadas para estudos adicionais. (g) Resistência hipersensitiva a TYDV ativada por Rep em tabaco transgênico A ativação Rep da expressão barnase nas dez plantas de tabaco independentes transformadas com pTAB-BTRl e pTAB-BUTRl é inicialmente testada por bombardeamento de partículas do construto p35S-Rep nas peças de folhas, conforme descrito. Dois dias após bombardeamento, a necrose das áreas bombardeadas é apenas evidente sobre as folhas de plantas do tabaco transformadas com o cassete de gene de barnase transladável ativável por Rep (pTAB-BTRl) em comparação com o controle não transladável (pTAB-BUTR-1). Este resultado sugere que a introdução do TYDV Rep in trans é suficiente para a liberação replicativa do cassete de expressão de barnase a partir de uma cópia cromossômica integrada. O corte, junção e replicação assistida por Rep é confirmada em folhas de plantas de tabaco transformadas com pTAB-BUTRl, conforme foi descrito para os ensaios transientes em células NT-1.

Para demonstrar a resistência hipersensível ao TYDV no tabaco transgênico, deixa-se que cigarras cicadulidas virulíferas (Orosius cirgentcítzis) se alimentem sobre as plantas por até 2 dias. Na semana seguinte, as plantas são inspecionadas quanto a sintomas de características TYDV, conforme descrito originalmente por Hill (1937). As plantas transformadas com o cassete de expressão de barnase não transladável ativável por Rep (pTAB-BUTRl) produzem sintomas TYDV típicos, incluindo formação de anões, amarelecimento, dobramento para baixo das margens e pontas das folhas novas e encurtamento dos internõdios. Em contraste, as plantas do tabaco transformadas com o cassete de expressão de barnase transladável, ativável por Rep (pTAB-BTRl) exibem lesões necróticas atípicas no sítio de alimentação dos afídios (provavelmente, o resultado da morte de células induzida por barnase). Estas plantas desenvolvem-se normalmente durante os três meses seguintes, em comparação com as plantas de tabaco não infectadas e em nenhum ponto desenvolvem sintomas característicos da infecção TYDV. O gDNA total é isolado das folhas de cada uma das 20 plantas do tabaco transgênicas e controles não infectados, duas semanas após a infecção, usando o método de Stewart e Via (1993). O gDNA total (1 pg) é usado como gabarito para PCR com primários designados para o gene de proteína de revestimento do TYDV (CP-F e CP-R). O gene de proteína de revestimento de 765 bp e, portanto, o genoma do vírus é apenas detectado em tabaco transformado com pTAB-BUTR1. Este resultado sugere que as plantas do tabaco transformadas com pTAB-BTRl são resistentes à infecção TYDV e permanecem livres de sintomas de infecção por TYDV durante períodos prolongados de tempo. Primários: CP-F 5 ’-ATGGCGGGCCGGTATAAGGGTTTGG-3 ’ [SEQIDNO:433 CP-R 5 ’-TTATTGATTGCCAACTGArTTGAAAT-3 ’ [SEQ ID NO:44] Exemplo 8 Montagens de vetor gfp baseados em BBTV

Uma série similar de vetores, baseados nos cassetes de barnase ativáveis por Rep, foram montados usando as regiões de proteína (GFP) verde fluorescente e BBTV intergênica codificantes do gene repórter. Ambos os vetores de expressão e recircularização foram montados por sobreposição PCR de uma maneira semelhante à das séries pRTBN de vetores e clonados num vetor pUC19. Os primários usados na montagem destes vetores estão indicados na Tabela 5. Nalguns casos, os plasmídeos pBN, pTBNó e pTBN 1 foram usados como gabaritos para PCRs.

Tabela 5 - Sequências cligonucleotídeas Iniciaimente, os plasmídeos pGI (SEQ ID NO:69), pGI6 (SEQ ID N0:70), pGII (SEQ ID NO:7 1) foram montados e são mostrados nas Figuras 20, 2 1 e 22, respectivamente. Por fim, os plasmídeos pRGIô, pRGIl, pRGIl/6 foram montados e estão mostrados nas Figuras 23, 24 e 25, respectivamente. Nas Figuras 20 a 25, o intron refere-se ao intron ST-LS1 da batata, as regiões intergênicas são derivadas quer do BBTV DNA-1 ou 6 e CT e NT referem-se às partes terminal C e terminal N do gene repórter GFP. A eficácia destes vários construtos é avaliada em ensaios transientes via bombardeamento de microprojéteis de suspensões de células da banana. Os primeiros ensaios transientes medem a expressão GFP para determinar se os vários monômeros são liberados de modo replicante e recircularizados e que o gene GFP é corretamente transcrito, processado e expresso. Um BBTV DNA-1 1.1 mer é misturado em quantidades equimolares quer no pGIl quer no pGI6 e bombardeado em suspensões de células embriogênicas da banana. Oito dias após o bombardeamento, são ensaiadas a liberação e recircularização replicante pela hibridização de Soutbern, usando uma sonda GFP específica. A expressão . GFP é monitorada usando um microscópio GFP e quantificada usando a análise de mancha de Western e uma antisera específica da GFP. A hibridização Southern indica a presença de moléculas circulares monoméri-cas quer a partir de pGIl quer pGI6P apenas quando o BBTV DNA-1 1.1 mer é fornecido em trans. De modo semelhante, a expressão GFP é apenas detectada, quando está presente o 1.1 mer derivado de vírus.

Exemplo 9 'Transformação estável da. banana para resistência induzida por barnase a BBTV

Suspensões de células embriogênicas de banana tanto de Bluggoe como Cavendish são co-transformadas com pRTBNõ e um plasmídeo portando o gene marcador selecionável usando bombardeamento de microprojéteis (Becker e colaboradores, 2000). Plantículas regeneradas são ensaiadas por PCR para determinar se uma cópia completa do cassete de barnase ativável por Rep foi incorporada no genoma da banana. Os transformantes positivos são multiplicados e, inicialmente, cinco plantas de cada transformação são provocadas com afídios virulíferos 20 BBTV. Usam-se análises de hibridização de Southern para comparar níveis de acumulação de DNA viral entre plantas transformadas e não transformadas. Linhas transgênicas promissoras são ainda multiplicadas, provocadas de novo e ensaiadas.

Em quase todos os casos, as plantas transgênicas de banana não mostram evidência da doença da parte superior dos cachos, em comparação com os controles. Em vez disso, é observada necrose atípica no ponto de alimentação dos afídios, refletindo provavelmente a morte celular induzida por barnase. Usando PCR e hibridização de Southern, o gene da proteína de recobrimento do BBTV não pode ser detectado em nenhuma parte de planta testada, sugerindo que estas linhas são resistentes à infecção, replicação e propagação de BBTV.

Exemplo ΙΟ Expressão ativada por Rep específica de tecido e induzível baseada em TYDV A fim de controlar o sítio de expressão Rep e, portanto, ativação/replicação transgê-nica na planta, empregaram-se promotores específicos de tecidos. (a) Expressão constitutiva, O vetor pTABlõ contém um gene ocs ter de seleção pro-bar 35S CaMV e cassetes CaMV 35S pro-uidA-CaMV 35S ter localizados entre os limites direito e esquerdo de T-DNA em pBINlõ. O cassete de gene Rep CaMV 35S-TYDV é excisado a partir do p35S-Rep por digestão EcoRI/BamHI e inserido no vetor digerido de modo semelhante pTAB 16 para substituir o cassete CaMV35S-uidA original. Este construto é designado pTAB-TYDV-Rep. (b) Expressão específica cie semente Mostrou-se que o promotor glutelina do arroz de 1 kb (Genbank Accession X52 153) dirige a expressão de gene repórter específico da semente do tabaco (Leisy e colaboradores, 1989). O promotor da glutelina do arroz é excisado a partir do plasmídeo pGT3-JEFLK (Miller, 2001) por digestão Ncol e ligado ao vetor digerido de modo semelhante pTAB-TYDV-Rep para substituir o promotor CaMV 35S original. Este construto é designado pGL-TYDV-Rep. (c) Expressão específica cia raiz O promotor (ARSK1) homólogo da cinase específico das raizes da Arabidopsis thaliana (Genbank Accession L22302) foi mostrado dirigir a expressão do gene repórter uidA específica de tecido em regiões epidérmicas, endoepidérmicas e de córtex de raízes da A. thaliana (Hwang e Goodman, 1995). O promotor ARSK1 é amplificado a partir de A. thaliana gDNA por PCR usando primários ARSK-F e ARSK-R. O produto PCR resultante é clonado em pGEM-T e a sequência verificada. O promotor ARSK1 é excisado a partir de pGEM-T por digestão Ncol e ligado no pTAB-TYDV-Rep digerido de modo semelhante para substituir o promotor original CaMV 35S. Este construto é designado pAR-TYDV-Rep.

Primários: ARSK-F 5 ’-CCATGGAT CT C ATT CTCCTTC AAC AAGGCG-3 ’ [SEQ TD NO: 57] ARSK-R 5 ’ -CÇATGGTTTCAACTTCTTCTTTTGTGTTATTTG-3 ’ [SEQ ID NO:58] (d) Expressão induzível em lesões O promotor de gene PR Asparagus officinalis de 2032 bp (AoPRl) (Genbank Accession: A26573) foi mostrado dirigir forte expressão de gene repórter em tipos de células lesionadas e em divisão ativa tais como, por exemplo, calos (Firek e colaboradores, 1993). O promotor AoPRl é amplificado a partir do gDNA de A. officinalis por PCR usando primários AoPR-F e AoPR-R. O produto PCR resultante é clonado em pGEM-T e verificada a sequência. O promotor AoPRl é excisado a partir de pGEM-T por digestão IVcol e ligado ao pTAB-TYDV-Rep digerido de modo semelhante para substituir o promotor original CaMV 35S. Este construto é designado por pAo-TYDV-Rep.

Primários: AoPR-F 5 ’-GAATTCAGGGGTAAGTTTGCAAATATC-3 ’ [SEQIDNO:59] AoPR-R 5 ’ -CGAGGTTGTGCCAGTCGAGCATTGCC-3 ’ [SEQIDNO:60] (e) Expressão induzível por álcool O desviador ALC, derivado da Aspergillus nidulans, é um sistema promotor induzível por álcool baseado no promotor AlcA e no receptor AlcR. O desviador ALC foi mostrado funcionar em sistemas de plantas usando um modelo de gene repórter uidA (Caddick e colaboradores, 1998). O plasmídeo pSRNAGS (BTI, Cornell University, Itbaca, New York) contém um gene ter nos pro-AlcR35S CaMV e um cassete ter 35S gene-CaMV repórter pro-uidA AlcA no pBIN16. O cassete pro ter-AlcA gene-nos pro-AlcR 35S CaMV é amplificado a partir de pSRNAGS por PCR usando primários 35S-IE (SEQ ID NO:2 1) e Alc-R (SEQ ID NO:61). O produto PCR é clonado em pGEM-T e a sequência verificada. O inserto é, então, excisado por digestão IVcol e ligado no pTAB-TYDV-Rep digerido de modo semelhante para substituir o promotor CaMV 35S original. Este construto é designado pAlc-TYDV-Rep.

Primário: Alc-R 5 ’-ÇÇATGGTTTGAGGCGAGGTGATAGGATTGG-3 ’ [SEQIDNO:61] Cada um dos plasmídeos binários contendo Rep TYDV são introduzidos em Agrobacteríum tumefcxciens (LBA4404) por eletroporação usando o método de Singh e colaboradores (1993). (f) Expressão induzível por Rep e específica, de tecido dirige a ativação de gene repórter em tipos de tecidos precisos As folhas de plantas de tabaco com o plasmídeo pTEST4 são superinfectadas com Agrobacteríum que alojam os plasmídeos pTAB-TYDV-Rep, pGL-TYDV-Rep, pAR-TYDV-Rep, pAo-TYDV-Rep e pAlc-TYDV-Rep usando o método de Horsch e colaboradores (1988). Neste caso, a seleção das plantas de tabaco transformadas é realizada usando o herbicida fosfoinotricin amônio (PPT). Confirma-se que as plantas transgênicas contêm o gene Rep TYDV por PCR usando os primários TYDV.RepF e TYDV.RepR. Dez transformantes independentes para cada plasmídeo são selecionados para estudos adicionais. As plantas crescem até a maturidade, são deixadas florir e as sementes, coletadas.

Diferentes órgãos de plantas a partir de transformantes independentes, incluindo foltias, caules, raízes, flores e sementes são coletados e detectada a atividade GUS usando ensaios bistoquímicos.

As plantas de tabaco supertransfor-madas com o plasmídeo pTAB-TYD V-Rep exibem forte expressão GUS através de todas as partes de planta testadas. O nível de expressão GUS nestas plantas é consideravelmente mais elevado do que as plantas transformadas com o controle não replicante, pTABlõ.

Em contraste, as plantas supertrans-formadas com o plasmídeo pGL-TYDV-Rep mostram forte expressão GUS apenas nas sementes, as plantas supertransformadas com o plasmídeo pAR-TYDV-Rep mostram forte expressão GUS apenas nas raízes, as plantas supertransformadas com o plasmídeo pAo-TYDV-Rep mostram forte expressão GUS em células lesionadas e meristemãticas e plantas supertransformadas com o plasmídeo pAlc-TYDV-Rep mostram forte expressão GUS constitutiva apenas quando embebidas numa solução a 1% v/v de etanol. O corte, junção e replicação assistidos por Rep do cassete de expressão GUS é confirmado (conforme acima descrito) em todos os tipos de tecidos de plantas de tabaco supertransformadas com o plasmídeo pTAB-TYDV-Rep. Em contraste, esta atividade só é detectada nas sementes das plantas supertransformadas com o plasmídeo pGL-TYDV-Rep, nas raízes de plantas supertransformadas com o plasmídeo pAR_TYDV-Rep, no ponto de lesionamento de plantas supertransformadas com o plasmídeo pAO-TYDV-Rep e constitutivamente em plantas supertransformadas com o plasmídeo pAlc-TYDV-Rep induzidas por etanol. Este resultado sugere que a expressão induzida ou específica de tecidos do gene TYDV Rep confere expressão de elevado nível a partir do cassete GUS ativãvel por Rep naqueles tipos de tecidos apenas.

Exemplo 1 1 Resistência, mediada pelo gene TMV pSO e hrtnA com base em TYDV (a) A expressão TYDV ativada por Rep do fragmento da helicase p50 TMV induz resistência adquirida sistêmica (SAR) no tabaco Estudos anteriores (Erickson e colaboradores, 1999) demonstraram que a expressão não viral do fragmento de helicase (p50) do vírus do mosaico do tabaco (TMV) 50 kDa é suficiente para induzir a resposta hipersensível N-mediada (HR) em variedades adequadas do tabaco (por exemplo, Nicotiana tabacum cv. "Petite Havana" SR1 homozigótico para o gene N). A resposta de defesa é caracterizada pela morte celular no local da infecção virótica e indução do percurso da resistência adquirida sistêmica (SAR) com a inibição resultante da replicação e movimento viral. O fragmento de gene p50 é amplificado por PCR usando primários p50-F e p50-R a partir de TMV DNA genômico clonado (Plant Gene Expression Centre, University of Califórnia, EUA). O produto PCR é clonado em pGEM-T e a sequência verificada. O intron de catalase contendo o TYDV LIR a partir de pTEST3 (Figura 10) é projetado em estrutura no único sítio EcoRI na região codificante p50. Este plasmídeo é designado pGEM50-LIR. Um plasmídeo de gene Rep ativável p50 pUC-baseado é subsequentemente montado, conforme descrito para pTEST3 no Exemplo 2, acima. O cassete é inserido em pART27, como foi descrito para pTEST4. O plasmídeo binário p50 ativável por Rep é designado pSARl. O plasmídeo pSARl é usado para transformar Agrobacterium, conforme anteriormente descrito.

Primários: p50-F 5 ’ -CÇATGGAG AT AG AGTCTTT AGAGC AGTTTC-3 ’ [SEQID NO:62] p50-R 5 ’-GGAT CCTATT GTGTTCCTGC ATCG A CCTT A-3 » [SEQ ID NO:63] (b) Resistência sistêmica adquirida contra TYDV no tabaco Dez plantas de tabaco (Nicotiana tabacu m cv. "Petite Havana" SR1 homozigóticas para o gene N] transformadas com T-DNA a partir do plasmídeo pSARl são obtidas por transformação mediada por Agrobacterium e confirmadas conterem o cassete ativável por Rep e gene NPTII por PCR como descrito acima. As plantas são infectadas com TYDV e observadas quanto a sintomas, conforme previamente descrito. As plantas do tabaco transformadas com o gene p50, ativâvel por Rep, exibem necrose hipersensível atípica no ponto de alimentação dos afídios, dois dias após infecção. Estas plantas desenvolvem-se normalmente durante os três meses seguintes, em comparação com plantas do tabaco infectadas não transgê-nicas, que exibem sintomas típicos induzidos por TYDV. O DNA genômico do TYDV é detectado em tabaco não transgênico inoculado, mas, não em linhas de controle transgênicas nem não infectadas, conforme previamente descrito. Este resultado sugere que a expressão induzida por Rep TYDV do gene TMV p50 é suficiente para estimular a resposta hipersensível do gene N em cultivares de tabaco adequados e proporcionar resistência à infecção TYDV. (c) Expressão Rep TYDV induzível por lesão ativa a expressão do gene TMV p50 e aciona SAR para uma variedade de patógenos Folhas de plantas do tabaco transformadas por pSARl são superinfectadas com Agrobacterium contendo o plasmídeo pAo-TYDV-Rep (Exemplo IO), conforme previamente descrito. Dez linhas supertrans-formadas, confirmadas conter o gene Rep induzível por lesão, são selecionadas para estudos adicionais. Plantas transgênicas e controles adequados são sujeitos à infecção com uma variedade de patõgenos virais, por exemplo (i) transmissão por afídios do vírus moteante da veia do tabaco (vein mottiing virus) (ii) vírus rattle do tabaco via o vetor nemátodo Paratríchodorus pachydermus e (iii) introdução biolística de um BeYDV l.lmer infeccioso. Com o tempo, as plantas são observadas quanto a sintomas característicos induzidos por vírus. Todas as plantas transgênicas exibem necrose hipersensível atípica no ponto da inoculação virótica em comparação com os controles. (d) Expressão induzível por le si o n cimento de TYDV Rep atina ampla faixa de resistência patógena mediada por hrmA no tabaco O produto de gene hrmA as partir de Pseudo m o n a s syringae pv. syringae foi mostrado ativar genes relacionados a patógenos num certo número de cultivares do tabaco e conferir resistência a uma variedade de patógenos, incluindo vírus, fungos e bactérias (Sben e colaboradores, 2000).

O gene hrmA é amplificado a partir de um plasmídeo contendo a sequência de codificação por PCR usando primários hrm-F e hrm-R. Um plasmídeo hrmA baseado em pUC ativável por Rep é subsequentemente montado, conforme descrito no Exemplo 2, acima, por pTEST3. O cassete é inserido em pART27, conforme descrito para pTEST4. O plasmídeo binário resultante ativável por hrm-A é designado pSAR2. O plasmídeo pSAR2 é usado para transformar Agrobacterium, como descrito.

hrm-F 5’-ÇÇATGGGCATGCACGCTTCTCCAGCGTAGAAGCG-3’ [SEQ ID NO:64] hrm-R 5’-GGArÇÇTCAGTTTCGCGCCCTGAGCGCCGG-3’ [SEQ ID NO:65] Dez plantas de tabaco (Nicotiana to.ba.cum) transformadas com T-DNA a partir do plasmídeo pSAR2 são obtidas por transformação mediada por Agrobacterium. e confirmadas conterem o cassete ativável por Rep e o gene NPTII por PCR, conforme previamente descrito. As folhas de plantas de tabaco transformadas por pSAR2 são superinfectadas com Agrobacterium contendo o plasmídeo pAo-TYDV-Rep, conforme previamente descrito. Dez linhas supertransformadas, confirmadas conterem o gene Rep induzível por lesionamento, são selecionadas para estudos adicionais. As plantas transgênicas e os controles adequados são sujeitos a infecção com uma variedade de patógenos, por exemplo, o vírus moteante de veia do tabaco, o vírus cáustico do tabaco, fungo do pedúnculo branco Phytophthora parasitica e bactéria do fogo selvagem Pseud.omon.as syringae pv. tabaci. Ao longo do tempo, as plantas são observadas quanto a sintomas característicos induzidos por patógenos. Todas as plantas transgênicas exibem necrose atípica hipersensível no ponto de inoculação, em comparação com os controles.

Exemplo 12 Sobre expressão da albumina do soro humano com base no TYDV (o.) Sobreexpressão, ativada, por Rep, de uma proteína comercialmente importante, albumina do soro humano A albumina é uma proteína solúvel monomérica que compreende cerca de metade da proteína do soro sanguíneo. A albumina funciona primariamente como uma proteína de transporte para esteróides, ácidos graxos e hormônios da tiróide e desempenha um papel na estabilização do volume fluido extracelular. A região codificante da albumina do soro humano de 1831 bp (HSA) (Lawn e colaboradores, 198 1) é amplificada a partir de um plasmídeo contendo o gene por PCR usando primários Alb-F e Alb-R. É montado subsequentemente um plasmídeo HSA ativável por Rep baseado em pUC, conforme descrito no Exemplo 2, acima, para pTEST3. O cassete é inserido no pART27, como descrito para pTEST4. O plasmídeo binário resultante ativável por HSA é designado pHSAl. O plasmídeo pHSAl é usado para transformar Agrobacterium, conforme descrito.

Dez plantas de tabaco (Nícotiana tabczcum) transformadas com T-DNA a partir do plasmídeo pHSAl são obtidas por transformação mediada por Agrobacterium e confirmadas conterem o cassete ativãvel por Rep e o gene NPTII por PCR, como descrito. Folhas de plantas de tabaco transformadas por pHSAl são superinfectadas com Agrobacterium contendo plasmídeos pTAB-TYDV-Rep, pGL-TYDV-Rep, pAo-TYDV-Rep, pAlc-TYDV-Rep, como descrito. Dez linhas supertransformadas a partir de cada transformação são confirmadas conterem o gene Rep e selecionadas para estudos adicionais. As plantas crescem até a maturidade e o conteúdo de HSA avaliado usando ELISA e anticorpos criados para o produto do gene HSA. A proteína HSA é detectada em níveis elevados, mas, em diferentes partes da planta ou sob condições específicas; isto é, constitutivamente (pTAB-TYDV-Rep), apenas sementes (pGL-TYDV-Rep), tecidos lesionados (pAo-TYDV-Rep) e constitutivamente em plantas tratadas com álcool (pAlc-TYDV-Rep). Um modelo proposto para a expressão ativada por Rep do gene da albumina do soro humano a partir do plasmídeo pHSAl é delineado na Figura 26.

Primários: Mb-F 5 ’-CC ATGGAGATGAAGTGGGTAACCTTT ATTTCC-3 ’ [SEQIDNO:72] ALb-R 5 ’ -GG ATCCTT AT AAGCCT AAGGC AGCTTG ACT-3 ’ [SEQIDNO:73] Os especialistas na técnica observarão que a invenção aqui descrita é suscetível de variações e modificações, além daquelas especificamente descritas. Deve ficar entendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste Relatório Descritivo, individual ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações de quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou características. 108Α/108 bibliografia Altschul et al. (1997)Nucl. AcidsRes. 25:3389. 1997.

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Claims

1 - Construto Genético Linear, caracterizado por que compreende na forma linear de 5’ para 3’ uma primeira sequência de reconhecimento de proteína Rep reconhecível por uma proteína Rep de geminivírus, a extremidade 3’ de um intron, a parte da extremidade 3’ de um gene de interesse operacionalmente ligada a um terminador, um promotor operativamente ligado à parte de extremidade 5’ do gene de interesse, a extremidade 5’ do intron e uma segunda sequência de reconhecimento de proteína Rep reconhecível pela proteína Rep de geminivírus; em que as sequências de reconhecimento de Rep são compatíveis umas com as outras para promover a circularização, em que as sequências de intron de extremidades 3’ e 5’ são capazes de splicing (junção); em que as partes de extremidades 3’ e 5’ do gene de interesse em conjunto constituem a região de codificação do gene de interesse; em que a expressão do gene de interesse não é permitida, quando o construto está na forma linear, em que, após a circularização, a extremidade 3’ do intron e a extremidade 5’ do intron formam uma sequência intrônica e a parte da extremidade 5’ do gene de interesse é separada a partir da referida parte da extremidade 3’ do gene de interesse pela sequência intrônica; em que após a excisão da sequência intrônica, a parte da extremidade 5’ do gene de interesse está ligada operativamente à parte da extremidade 3’ do gene de interesse; em que a circularização permite a expressão do gene de interesse e em que, quando da expressão do gene de interesse, o gene de interesse exibe uma atividade ou propriedade ou uma capacidade para exibir uma atividade ou propriedade ausente nas partes separadas do gene de interesse antes da circularização do construto e antes da excisão da sequência intrônica.

2 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a proteína Rep para a circularização do construto é fornecida por outro construto, que compreende uma sequência de nucleotídios que codifica a proteína Rep de geminivírus opecionalmente ligada a um promotor.

3 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 1 ou a Reivindicação 2, caracterizado por que o gene de interesse codifica um mRNA ou um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína.

4 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por que o peptídeo, o polipeptídeo ou a proteína causa ou de outro modo facilita a morte celular.

5 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por que o peptídeo, o polipeptídeo ou a proteína tem atividade enzimática.

6 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 1 ou a Reivindicação 2, caracterizado por que o construto é introduzido numa célula eucariótica.

7 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por que a célula eucariótica é uma célula de planta.

8 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o promotor é um promotor regulável.

9 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que o promotor é um promotor induzível.

10 - Construto Genético Linear, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por que o promotor é um promotor indutível por álcool.

11 - Método Para Gerar Planta Transgênica ou Progênie da Mesma Resistente a Vírus ssDNA, caracterizado por que o referido método compreende introduzir no genoma de uma planta um construto genético linear, conforme definido na Reivindicação 1, em que, após a infecção de uma célula da planta ou progenia da mesma por um vírus ssDNA que tem a proteína Rep do geminivírus, o gene de interesse é expresso em um. peptídeo, polipeptideo ou proteína que mata a célula da planta ou de outra forma torna a célula da planta dormente

12 - Método Para Gerar Planta Transgênica ou Progênie da Mesma Resistente a Vírus ssDNA, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que o vírus ssDNA é um membro do grupo Geminiviridae,

13 - Método Para Gerar Planta Transgênica ou Progênie da Mesma Resistente a Vírus ssDNA, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que o vírus do Geminiviridae é um begomovírus ou mastrevírus,

14 - Método Para Gerar Planta ou Parte da Mesma Geneticamente Modificada, caracterizado por que compreende introduzir no genoma de uma planta ou parte da planta um construto genético linear, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 10.