DE69533037T2

DE69533037T2 - Pflanzentraskriptionsregulator von circovirus

Info

Publication number: DE69533037T2
Application number: DE69533037T
Authority: DE
Inventors: Petra Christina Boevink; Brian Peter Surin; Paul Konrad Keese; Paul Wing Gay Chu; Peter Michael Waterhouse; Rafiqul Islam Khan; Philip John Larkin; William Clark Taylor; Jerry Stuart Marshall
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1994-08-30
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2015-08-31
Also published as: MX9701601A; EP0785999B1; DE69533037D1; NZ291734A; ATE266734T1; US6211431B1; WO1996006932A1; JPH10505233A; EP0785999A1; ES2220935T3; EP0785999A4; CN1164869A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein einen neuen Bereich von Transkriptionsregulatoren und transkriptionsregulatorähnlichen Sequenzen, die in Pflanzen arbeiten können. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf Transkriptionsregulatoren und transkriptionsregulatorähnliche Sequenzen viraler Herkunft und noch spezieller von Circovirus-Herkunft gerichtet. Die Transkriptionsregulatoren und transkriptionsregulatorähnlichen Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind zur gentechnischen Veränderung von Pflanzen und insbesondere Leguminosen, beispielsweise zum Ermöglichen oder zur Kontrolle der Expression fremder Gene, verwendbar. Die Transkriptionsregulatoren und transkriptionsregulatorähnlichen Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch zum Ermöglichen unterschiedlicher Grade der Expression in unterschiedlichen Pflanzengewebearten verwendbar.
Bibliografische Einzelheiten der Veröffentlichungen, die in dieser Beschreibung durch einen Autor bezeichnet sind, sind am Ende der Beschreibung gesammelt angegeben. Die Sequenzidentitätsnummern (SEQ ID NOs) für die in der Beschreibung angegebenen Nucleotidsequenzen sind anschließend an die Bibliografie definiert.
Durchgängig durch diese Beschreibung sollen, falls der Zusammenhang nicht etwas anderes erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfasssend" so verstanden werden, dass ein angegebenes Element oder eine angegebene Zahl oder eine angegebene Gruppe von Elementen oder Zahlen eingeschlossen sind, jedoch irgendein anderes Element oder eine andere Zahl oder irgendeine andere Gruppe von Elementen oder Zahlen nicht ausgeschlossen sind.
Transkriptionsregulatoren sind Moleküle und allgemein Moleküle auf Nucleotidbasis, die die Expression von Gensequenzen auf der Ebene der Transkription ermöglichen und modulieren. Transkriptionsregulatoren umfassen Promotoren und Terminations- und Polyadenylierungssequenzen unter anderen Effektoren und Mitteln zur Durchführung der Transkription.
Promotoren sind spezifische Nucleotidsequenzen, an die RNA-Polymerase bindet, um die RNA-Synthese in Zellen zu initiieren. Sie enthalten die Startstelle für die RNA-Synthese und die genetischen Signale zur Initiation der durch Polymerase vermittelten RNA-Synthese. Außerdem wird angenommen, dass sequenzspezifische DNA bindende Proteine die Initiation der RNA-Synthese entweder hemmen oder stimulieren, indem sie benachbart zu dem Promotor binden und die Bindung der Polymerase an den Promotor beeinflussen. Terminatorsequenzen bezeichnen Terminations- und Polyadenylierungssequenzen, und sie sind zur Transkription von funktionellen mRNAs erforderlich. Terminationssequenzen sind stromabwärts (d. h. am 3'-Ende) eines Gens lokalisiert und werden von RNA-Polymerase als Signal zum Stoppen der Synthese von mRNA erkannt. Polyadenylierungssequenzen sind Signale, die zur Polyadenylierung von eukaryotischen mRNA-Molekülen nach der Transkription erforderlich sind.
Ein viraler Promotor, der in breitem Umfang zum Ermöglichen einer Fremdgenexpression in Pflanzen verwendet wird, ist der 35S-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) (Odell et al., 1985), der von einem Pflanzenvirus mit doppelsträngiger DNA stammt. Die Verwendung dieses Promotors in Pflanzen und Pflanzenzellen ist gut dokumentiert (Benfey und Chua, 1990; Higgins und Spencer, 1991). Trotz der offensichtlichen Verwendbarkeit dieses Promotors ist er jedoch nicht in allen Pflanzen funktionsfähig und besonders schlecht in Leguminosen funktionsfähig. Daher besteht Bedarf an der Identifizierung anderer Promotoren, beispielsweise viraler Herkunft, die in Pflanzen und insbesondere in Leguminosen funktionsfähig sind. Es besteht auch Bedarf an einer Modulation der Expressionsgrade von Genen und anderen Gensequenzen in Pflanzenzellen.
Daher ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung auf ein Genkonstrukt gerichtet, das einen Circoviruspromotor oder eine promotorähnliche Sequenz umfasst und in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist.
In einem verwandten Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Genkonstrukts, das einen Circoviruspromotor oder eine promotorähnliche Sequenz und eine Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz umfasst, wobei diese Sequenzen in einer Pflanzenzelle funktionsfähig sind.
Ein Circovirus ist ein Pflanzenvirus mit nicht-paariger einzelsträngiger (ss) DNA (Tabelle 1), das verschieden ist von Caulimoviren, die ein doppelsträngiges Genom besitzen, und Geminiviren, den einzigen anderen bekannten ssDNA-Pflanzenviren, die paarige Teilchen besitzen (Chu et al., 1994). Die hier verwendete Circovirusgruppe soll das Subterranean Clover Stunt Virus (SCSV) (Chu und Helms, 1988), Coconut Foliar Decay Virus (CFDV) (Rohde et al., 1990), Banana Bunchy Top Virus (BBTV) (Thomas und Dietzgen, 1991; Harding et al., 1991; 1993; Burns et al., 1993) und das Milk-Vetch Dwarf Virus (MDV) (Isogai et al., 1992; Sano et al., 1993) und Faba Bean Necrotic Yellows Virus (FBNYV) (Katul et al., 1993) umfassen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung betrachtete Circovirus mehr als zwei DNA-Komponenten oder -Segmente.
Die vorliegende Erfindung ist besonders auf das Subterranean Clover Stunt Virus (im folgenden als "SCSV" abgekürzt) als Repräsentant der Circovirusgruppe gerichtet und im folgenden unter Bezugnahme darauf beschrieben. Dies erfolgt jedoch in dem Verständnis, dass eine Bezugnahme auf SCSV eine Bezugnahme auf alle anderen geeigneten Mitglieder der Circovirusgruppe, auf die sich die vorliegenden Erfindung erstreckt, umfasst. Bevorzugte Mitglieder der Circovirusgruppe, wie SCSV, umfassen mehr als zwei DNA-Komponenten oder -Segmente. Eine Bezugnahme auf "SCSV" umfasst im folgenden auch alle natürlich vorkommenden oder künstlich induzierten Mutanten, Derivate, Teile, Fragmente, Homologe oder Analoga des Virus, die noch mindestens einen geeigneten Promotor und/oder Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenzen beibehalten, und sie erstreckt sich auf diese.
Daher betrachtet eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Genkonstrukt, das einen Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz von SCSV umfasst und in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist.
Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Genkonstrukt gerichtet, das einen SCSV-Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz und eine Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz, wobei diese Sequenzen in einer Pflanzenzelle funktionsfähig sind, umfasst.
Der Ausdruck "Genkonstrukt" wird im breitesten Sinne verwendet, so dass er jedes rekombinante Nucleinsäuremolekül, wie ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, einen Vektor, Expressionsvektor oder binären Vektor, umfasst. Er kann nur den Circoviruspromotor umfassen oder er kann einen oder mehrere Promotoren in Verbindung mit Regulator- und/oder Reportersequenzen enthalten.
Das Genkonstrukt kann doppelsträngige oder einzelsträngige DNA in linearer oder kovalent geschlossener ringförmiger Form sein. Wie im vorhergehenden angegeben, kann es nur den Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz umfassen oder andere heterologe oder homologe Transkriptionsregulatorsequenzen und/oder heterologe Strukturgensequenzen einschließlich von Promotoren, die mit SCSV verbunden sind, tragen. "Homolog" bedeutet eine Gensequenz, die von Natur aus mit dem SCSV-Promotor verbunden ist. "Heterolog" bedeutet ein "fremdes" Gen in Bezug auf den Promotor oder ein Gen, das sonst normalerweise nicht mit dem SCSV-Promotor verbunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fremdgen auch fremd für SCSV. Beispiele für Fremdgene umfassen Gene, die Resistenz gegenüber Insekten oder einer anderen Schädlingsplage fördern, Resistenz gegenüber Insektiziden oder Herbiziden verstärken, Frostbeständigkeit fördern, die Blüten- oder Blattfarbe ändern, die Alterungsgeschwindigkeit, besonders bei Schnittblumen, verringern, die Konzentrationen bestimmter Proteine und/oder Ribozyme erhöhen oder verstärken. Insbesondere umfassen die Fremdgene:

a) ein Resistenzgen gegenüber Pflanzenviren, Bakterien, Pilzen, Nematoden und anderen Pathogenen;
b) ein Pflanzenvirusresistenzgen, das ein synthetisches Gen von und gegen Alfalfa Mosaic Virus, Subterranean Clover Stunt Virus, Subterranean Clover Mottle Virus, Subterranean Clover Red Leaf Virus, Potato Leafroll Virus, Tomato Spotted Wilt Virus, Bean Yellow Mosaic Virus, White Clover Mosaic Virus, Clover Yellow Vein Virus, Potato Viruses x, y, s, m und a, Cucumber Mosaic Virus, Rice Ragged Stunt Virus und Barley Yellow Dwarf Virus umfasst;
c) ein Gen zur Verbesserung des Nährwerts von Pflanzen, wie das Sunflower High Sulphur-Gen SF8;
d) ein Blähresistenzgen;
e) ein Antikörpergen;
f) ein Getreide-Thionin- und Ribosomeninaktivierungsproteingen;
g) ein Insektenresistenzgen, das ein BT-Toxingen und ein Proteinaseinhibitorgen von Nicotiana alata umfasst;
h) ein Gen eines selektierbaren Markers, wie diejenigen, die Resistenz gegenüber Kanamycin, Phosphinothricin, Spectinomycin und Hygromycin verleihen;
i) ein Reportergen, wie GUS-, CAT- und Pigmentgene;
j) ein Gen mit Codierung für ein regulatorisches Protein, das die Expression eines Gens in Pflanzenzellen moduliert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Genkonstrukt, das zwei heterologe Gene umfasst, die funktionell an den gleichen oder unterschiedliche, in einer Pflanzenzelle funktionsfähigen Circoviruspromotoren gebunden sind. Vorzugsweise stammen der Promotor oder die unterschiedlichen Promotoren von einem Circovirus mit einem Genom, das mehr als zwei Komponenten oder Segmente umfasst. Am stärksten bevorzugt stammen der Promotor oder die unterschiedlichen Promotoren von SCSV und insbesondere sind sie aus den Segmenten 1 bis 7 von SCSV, die durch SEQ ID NO: 1 bis 7 definiert sind (siehe im folgenden), ausgewählt. Die Genkonstrukte können auch eine Terminations- oder Polyadenylierungssequenz umfassen, die funktionsfähig an eines oder beide der heterologen Gene gebunden ist. In einer Ausführungsform ist die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz für jedes Gen die gleiche. In einer alternativen Ausführungsform ist die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz für jedes Gen unter schiedlich. In am stärksten bevorzugter Weise wird die Terminations- und Polyadenylierungssequenz aus den Segmenten 1 bis 7 von SCSV, die durch SEQ ID NO: 1 bis 7 (siehe im folgenden) definiert sind, ausgewählt. In noch einer weiteren Ausführungsform stammt mindestens eine Terminations- und Polyadenylierungssequenz aus dem MeA 3-Gen von Flaveria bidentis (siehe im folgenden).
Der Ausdruck "Transkriptionsregulator" wird im breitesten Sinne verwendet, so dass er Promotoren, Terminations- und Polyadenylierungssequenzen und andere Effektoren und "Facilitatoren" der Transkription von Gensequenzen umfasst. Bei den durch die vorliegende Erfindung betrachteten Promotoren können die Terminations- und Polyadenylierungssequenzen von SCSV-Herkunft sein und von Natur aus mit einem entsprechenden Promotor von SCSV verbunden sein oder mit einem anderen Promotor von SCSV verbunden sein. Alternativ können die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenzen von Nicht-SCSV-Quellen stammen. Ein besonders bevorzugter Terminator umfasst die 3'-Nucleotidsequenz des MeA3-Gens von Flaveria bidentis, das für ein NADP-Äpfelsäureenzym der C4-Photosynthese codiert (Hatchi, 1987). Die Nucleotidsequenz der Terminatorregion des MeA-Gens ist in 15 angegeben. Die Kombination eines SCSV-Promotors mit beispielsweise der F. bidentis MeA-Gen-Terminatorsequenz führt zu einem hohen Expressionsgrad insbesondere bei monocotylen Pflanzen im Vergleich zu Konstrukten ohne die Terminatorsequenz.
Das Fremdgen kann auch in Antisense-Orientierung vorhanden sein, um verringerte Konzentrationen von endogenen Pflanzengenprodukten zu ermöglichen. Im Hinblick darauf kann ein "Gen" eine Länge von zehn Basenpaaren, eine Länge von mehreren zehn Basenpaaren, eine Länge von hunderten Basenpaaren oder ein Gen einer vollen Länge oder nahezu vollen Länge, jedoch in umgekehrter Orientierung in Bezug auf den Promotor bedeuten. Das Fremdgen kann auch in der "Sense"-Orientierung zur Kosuppression eines Targetgens platziert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Genkonstrukts, das einen SCSV-Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz, die in einer Pflanzenzelle funktionsfähig sind, und mindestens eine Restriktionsendonucleasenstelle stromabwärts des Promotors zum Ermöglichen der Einführung eines heterologen Gens derart, dass das Gen funktionsfähig mit dem Promotor verbunden ist, umfasst. In einer alternativen Ausführungsform umfasst das Genkonstrukt einen SCSV-Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz, die in einer Pflanzenzelle funktionsfähig sind, und ein funktionsfähig mit dem Promotor verbundenes heterologes Gen. In beiden Ausführungsformen umfasst der Ausdruck "Gen" diejenigen, die die Synthese von Oligonucleotiden dirigieren, wie diejenigen, die bei Antisense-Verfahren sowie Ribozymen verwendbar sind.
In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Genkonstrukt betrachtet, das einen SCSV-Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz, die in einer Pflanzenzelle funktionsfähig sind, und mindestens eine Restriktionsendonucleasestelle stromabwärts des Promotors zum Ermöglichen der Einführung eines heterologen Gens derart, dass das Gen funktionsfähig mit dem Promotor verbunden ist, und eine Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz, die so positioniert ist, dass sich diese Sequenz am 3'-Ende in Bezug auf das heterologe Gen zum Ermöglichen der Expression des heterologen Gens befindet, umfasst. Vorzugsweise stammt die Terminationssequenz von SCSV. Alternativ stammt die Terminatorsequenz von dem F. bidentis MeA3-Gen.
Die durch die vorliegende Erfindung betrachteten Pflanzen umfassen sowohl monocotyle als auch dicotyle Arten. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf Leguminosen und Nicht-Leguminosen, obowhl Leguminosen bevorzugt sind.
Das SCSV-Genom umfasst mindestens sieben verschiedene ringförmige ssDNA-Komponenten, die als Segmente 1–7 beschrieben werden. Die Größe dieser Segmente reicht von etwa 988 bis etwa 1022 Nucleotiden. Jede der sieben DNA-Komponenten von SCSV enthält ein dominierendes offenes Leseraster des Virus-Sense und eine nichtcodierende Region unterschiedlicher Länge, die eine konservierte potentielle Stamm-und-Schleife-Struktur enthält (1 und 2; Tabelle 2). Jede Transkriptionseinheit enthält eine typische TATA-Box und ein Polyadenylierungssignal für den Start bzw. das Ende der Transkription (2, Tabelle 2).
Da die DNAs ringförmig sind, umfassen die Sequenzen in den nichtcodierenden Regionen die Promotoren und die Terminatorsignale, die bei unterschiedlichen DNA-Komponenten variieren (Tabelle 2). Die TATA-Boxen und Stamm-Schleifen der zwei Replicase-assoziierten Proteingene in den Segmenten 2 und 6 sind von denen der anderen Gene ganz verschieden. Im Gegensatz dazu sind Stamm-Schleifen und TATA-Boxen in den Segmenten 1, 3, 4, 5 und 7 die gleichen. Alle DNAs mit Ausnahme derjenigen der Segmente 2 und 6 teilen auch eine gemeinsame Sequenz (die als die gemeinsame Region bekannt ist) in der nichtcodierenden Region (1 und 2).
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich daher auf jeden der sieben Promotoren und die Terminations- und Polyadenylierungssequenzen auf den Segmenten 1–7 von SCSV. Die Nucleotidsequenzen der Segmente 1–7 sind in 6 angegeben und in SEQ ID NO: 1–7 jeweils definiert.
Das Segment 5 wurde als das Hüllproteingen auf der Basis von Daten der N-terminalen Aminosäuresequenz und der Aminosäurezusammensetzung identifiziert (Chu et al., 1993a). Die Segmente 2 und 6 codieren für Proteine, die die charakteristischen NTP-Bindungsmotive enthalten, und sie werden daher als die vermutlichen Gene des Virusreplikation-assoziierten Proteins (RAP) angesehen. Die übrigen vier DNA-Komponenten sind auf der Basis ihrer verschiedenen abgeleiteten Aminosäuresequenz miteinander oder mit Segment 2, 5 und 6 nicht verwandt. Die SCSV-DNAs besitzen keine signifikante Nucleotidsequenzhomologie mit den Genomen von Geminiviren, obwohl auf der abgeleiteten Aminosäureebene eine gewisse Homologie existiert.
Die replikative Kompetenz von SCSV wurde gezeigt (Chu et al., 1993b). Da die SCSV-Virion-DNA einzelsträngig ist und die Transkripte von Virus-Sense sind, ist das erste wahrscheinliche Biosyntheseereignis nach dem Entfernen der Hülle wahrscheinlich die Synthese der DNA der replikativen Form unter Verwendung von Wirts-DNA-Polymerase. (Die DNAs von SCSV besitzen die Fähigkeit zum Selbstpriming bei dsDNA-Synthese [Chu und Helms, 1988]). Es wird angenommen, dass Wirts-RNA-Polymerase an die Promotoren bindet, wobei die RNA-Transkription initiiert wird, worauf die Synthese der zur Virusmultiplikation erforderlichen Virusproteine folgt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden ein SCSV-Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz, der bzw. die eine aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 ausgewählte Nucleotidsequenz umfasst, und/oder diese(n) enthaltende Genkonstrukte betrachtet.
Die hier verwendete "promotorähnliche Sequenz" umfasst jede funktionsfähige Mutante, jedes funktionsfähige Derivat, jeden funktionsfähigen Teil, jedes funktionsfähige Fragment, Homologe oder Analogon eines natürlich vorkommenden SCSV-Promotors. Hier betrachtete promotorähnliche Sequenzen umfassen Einzel- oder Mehrfachnucleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen bei einem SCSV-Promotor, vorausgesetzt, die promotorähnlichen Sequenzen behalten mindestens 35%, zweckmäßigerweise mindestens 45%, noch zweckmäßiger mindestens 55%, vorzugsweise mindestens 65–70% und noch bevorzugter mindestens 85–95% oder mehr der Promotoraktivität im Vergleich zum entsprechenden Promotor des SCSV-Wildtyps bei.
In einer noch weiteren Ausführungsform erfolgt die Bereitstellung eines Genkonstrukts, das einen SCSV-Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz umfasst und in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist, wobei der Promotor oder die promotorähnliche Sequenz der gesamten oder einem Teil von einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 7 entspricht oder mit mindestens einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 1 bis 7 in einem Bereich von Stringenzbedingungen, die von der Bedingung hoher Stringenz bis zur Bedingung niedriger Stringenz reichen, hybridisieren kann. Praktischerweise wird eine Mutante, ein Derivat, ein Teil, ein Fragment, ein Homologes oder Analogon eines SCSV-Promotors so definiert, dass sie bzw. es in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist und in einem Bereich von Bedingungen von zumindest hoher bis niedriger Stringenz mit mindestens einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 1 bis 7 hybridisieren kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Genkonstrukt ferner eine Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz von SCSV oder von einer Nicht-SCSV-Quelle, die die Expression eines funktionsfähig mit dem Promotor verbundenen Gens verstärkt oder in anderer Weise erleichtert.
Zum Zwecke der Definition des Stringenzniveaus kann bequemerweise auf Sambrook et al. (1989) Bezug genommen werden, der hier als Bezug aufgenommen ist, worin die Waschstufen auf den Seiten 9.52–9.57 als von hoher Stringenz angesehen werden. Eine niedrige Stringenz wird hier als in 0,1–0,5% (Gew/V) SDS bei 37–45°C während 2–3 h definiert. In Abhängigkeit von der Quelle und der Konzentration der an der Hybridisierung beteiligten Nucleinsäure können alternative Stringenzbedingungen verwendet werden, beispielsweise mittlere stringente Bedingungen, die hier als 0,25–0,5 (Gew/V) SDS bei ≥ 45°C während 2–3 h betrachtet werden, oder hochstringente Bedingungen, die bei Sambrook et al. (1989) offenbart sind.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrachtet ein Verfahren zur Expression eines Fremdgens in einer Pflanzenzelle, wobei das Verfahren das Einführen eines Genkonstrukts, das einen SCSV-Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz, der bzw. die in der Pflanzenzelle funktionsfähig sind und funktionell mit dem Fremdgen verbunden sind, umfasst, in die Pflanzenzelle umfasst. In einer weiteren Ausführungsform werden mehrere SCSV-Promotoren zu Antreiben von einem oder mehreren Transgenen ohne Antagonismus verwendet. In einer noch weiteren Ausführungsform ist der SCSV-Promotor mit dem SCSV-Segment-2-Gen assoziiert, um die Expression des Fremdgens zu verstärken. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Genkonstrukt ferner eine oder mehrere Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenzen, die am 3'-Ende des Fremdgens positioniert sind. Diese Sequenzen verstärken oder erleichtern in sonstiger Weise die Expression des Fremdgens. Das Terminations- und/oder Polyadenylierungssegment kann von SCSV oder einer anderen Quelle, wie dem F. bidentis MeA-Gen, stammen.
In einer noch weiteren Ausführungsform betrachtet die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanze, die einen SCSV-Promotor oder eine promotorähnliche Sequenz, der bzw. die im vorhergehenden definiert wurde, und optional eine Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz zur Verstärkung der Expression eines Gens stromabwärts des Promotors in deren Genom trägt. Vorzugsweise zeigt die transgene Pflanze aufgrund der Expression einer Gensequenz, beispielsweise eines Gens, Oligonucleotids oder Ribozyms stromabwärts des SCSV-Promotors, veränderte Eigenschaften.
Die vorliegende Erfindung wird ferner unter Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Figuren und/oder Beispiele beschrieben. Hierbei wird der Verweis auf eine Promotorregion von SCSV mit "S" für SCSV, mit der Genomsegmentnummer (beispielsweise 1, 3, 4, 5 und 7) und "nc" für eine nichtcodierende Region abgekürzt. Beispielsweise wird der Promotor von dem Segment 1 des SCSV-Genoms als "S1nc" definiert. Terminatorsequenzen für spezielle SCSV-Genomsegmente werden beispielsweise wie folgt: "SC1Tr" oder "SC5Tr" für die Terminatorsequenzen für Segment 1 bzw. 5 angegeben. Genkonstrukte, die einen SCSV-Promotor, ein Reportergen, wie GUS, und eine Terminatorsequenz, beispielsweise von SCSV, umfassen, werden als "SCSV:GUS:SCTr" oder "SCSV:GUS:SCSVTr" abgekürzt. Spezielle Promotoren und Terminationssequenzen sind wie oben definiert, beispielsweise S4nc:GUS:SC1Tr oder S4nc:GUS:Me3", "S4nc:GUS:Me3". In dem letzteren Konstrukt wird die Terminatorsequenz aus dem MeA-Gen von Flaveria bidentis verwendet, die hier als "Me3" bezeichnet wird.
In den Figuren:
1 zeigt die Strukturen und Transkriptionseinheiten, die in einer repräsentativen DNA-Komponente von einem typischen Geminivirus und SCSV, die beide ein ssDNA-Genom enthalten, gefunden werden.
2 zeigt die sieben DNA-Segmente, die im Genom von SCSV gefunden werden, in linearer Form, wobei die Positionen der Stamm-Schleife-Struktur, der gemeinsamen Region, des offenen Leserasters (ORF), der TATA-Box und der Terminations- und Polyadenylierungssignale auf jeder DNA angegeben sind.
3 zeigt die Konstruktion der sieben SCSV-DNA-Nichtcodierregion: β-Glucuronidase(GUS)-Fusionsexpressionsvektoren zur Transformation in Tabakpflanzen. Die amplifizierten PCR-Fragmente wurden getrennt vor das GUS-Gen in pHW9 an den angegebenen BamHI (B)- und NcoI (N)-Stellen kloniert. Die gebildeten rekombinanten pHW9-Vektoren wurden an der EcoRI-Stelle geschnitten und in die EcoRI-Stelle des aufnehmenden binären Vektors PGA470 kloniert.
4 zeigt die Konstruktion der Segment-5- und -7-Promotor:GUS-Fusionsexpressionsvektoren und deren Deletionsderivaten für Protoplastenstudien. DNAs, die den nichtcodierenden Regionen voller Länge entsprachen, wurden mittels PCR erhalten und in pKGO vor GUS durch Ligation der stumpfen Enden an der angegebenen SalI-Stelle kloniert. Die Deletionsderivate wurden durch Verdauen der die Sequenz voller Länge enthaltenden pKGO-Klone mit HindIII oder PstI am Vektor und den entsprechenden Restriktionsenzymen an der SCSV-Sequenz wie angegeben erhalten. Die deletierten pKGO-Konstrukte wurden nach dem Auffüllen der Enden wie erforderlich religiert.
5 zeigt die Konstruktion des rekombinanten binären pTAB10-Vektors (pBS150), der das Segment-7-Promotor(57nc):GUS-Fusionsgen zur Transformation in Acker- Kleegras-Pflanzen enthält. Die 57nc:GUS-Expressionskassette wurde aus dem pKGO-Konstrukt (4) durch Verdauen mit HindIII und BamHI ausgeschnitten und nach dem Auffüllen der Enden der DNAs stumpfendig an pTAB10 an der EcoRI-Stelle ligiert.
6 zeigt die vollständigen Sequenzen der sieben SCSV-DNA-Ringe. Die Sequenz der nichtcodierenden Region bei jeder DNA, die bei der Konstruktion der Expressionskassetten verwendet wird, ist unterstrichen.
7 zeigt die durch histochemische Anfärbung nachgewiesene GUS-Expression auf Blättern von transgenem Tabak und Acker-Kleegras, die mit der SCSV-Segment-7-Promotor(S7nc):GUS-Fusionsexpressionskassette transformiert wurden.
8A bis 8F sind photographische Darstellungen der histochemischen Anfärbung bezüglich GUS-Aktivität in transgenen Pflanzen – Hellfeld. Hellfeldbelichtungen von angefärbten Blattstücken (L), Stängelschnitten (S), Wurzeln (R) und Pollen (P) von Tabakpflanzen, die mit den GUS-Fusionskonstrukten, die die SCSV-Promotorregionen von den Segmenten 1, 3, 4, 5 und 7, die als S1nc-, S3nc-, S4nc-, S5nc- und S7nc-Promotorregionen bezeichnet werden, enthalten, transformiert wurden, und von nicht-transformierten Pflanzen (NT). Eine blaue Färbung zeigt eine GUS-Expression an. Jedes Blatt, jeder Stängel oder jedes Wurzelstück repräsentiert eine unabhängige Transformante (mit Ausnahme der zwei oberen Wurzelstücke von S5nc, die nicht ohne weiteres getrennt werden konnten), und die Pollenproben waren Gemische von zwei oder mehr Transformanten. 8a zeigt die differenzielle Expression von GUS in Pflanzen, die mit entweder S4nc- oder S5nc-Regionen transformiert wurden, im Vergleich zu einer nicht-transformierten Pflanze (NT).
9A bis 9E sind photographische Darstellungen, die eine histochemische Anfärbung hinsichtlich GUS-Aktivität in transgenen Pflanzen zeigen – Dunkelfeld. Transversale (T) und longitudinale (L) Dünnschnitte von angefärbten eingebetteten Stängelteilen von Tabakpflanzen, die mit den GUS-Fusionskonstrukten, die die Promotorregionen von Komponente 1 (S1nc), 3 (S3nc), 4 (S4nc), 5 (S5nc) und 7 (S7nc) enthalten, transformiert wurden, werden mit einem Dunkelfeld betrachtet. Pinkfarbene Kristalle geben eine GUS-Expression an. Die für die transversalen und longitudinalen Schnitte verwendeten Stängelteile repräsentieren unabhängige Transformanten. Die Vergrößerungen sind: 375X bei S1nc T und L, S3nc L, S4nc T, S5nc T und L und S7nc L; 480X bei S3nc T; 200X bei S4nc L; und 300X bei S7nc T.
10 ist eine grafische Darstellung eines fluorimetrischen Tests bezüglich GUS-Expression. Ergebnis eines fluorimetrischen Tests von Blattextrakten von Tabakpflanzen, die mit den GUS-Fusionskonstrukten, die die Promotorregionen von Komponente 1 (S1nc), 3 (S3nc), 4 (S4nc), 5 (S5nc) und 7 (S7nc) enthalten, transformiert wurden. Jeder Balken repräsentiert eine unabhängige Transformante. Die GUS-Aktivitäten wurden mit einem Labsystems Fluoroskan in Abständen von 5 oder 10 min während 60 min (oder 30 min für S4nc) unter Verwendung von 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) als Substrat gemessen. Die Raten der GUS-Aktivität sind als fluorimetrische Einheiten (Fl. U.) pro Minute pro mg Protein angegeben. 1000 Fl. U. sind etwa gleich 825 pmol 4-Methylumbelliferon (MU).
11 ist eine Diagrammdarstellung des SCSV-Segment-2-Promotor(S2nc)-Konstrukts, das die GUS-Expression in Tabakprotoplasten steuern kann. Ein Fragment von Segment-2-DNA von NcoI-XbaI wurde an den promotorlosen GUS-Vektor pKGO fusioniert. Pr, Promotor, seg 2, Segment 2 von SCSV.
12a und 12b sind Diagrammdarstellungen, die Konstrukte von SCSV:GUS:SCSV Tr-Expressionsvektoren zeigen. Die Terminations/Polyadenylierungssequenzen für Segment 3 von SCSV (SC3Tr) und Segment 5 (SCSTr) wurden mittels PCR amplifiziert und mit den jeweiligen Restriktionsenzymen geschnitten und dann wie angegeben in rekombinanten pKGO-Vektor kloniert. Das SC3Tr-Konstrukt wurde als EcoRI-XhoI-Fragment in den pKGO-Vektor, der S1nc:GUS:OCS3' enthielt, kloniert, wobei S1nc:GUS:SC3Tr erhalten wurde. Das SSC5TR-Konstrukt wurde als EcoRV-Fragment in den Vektor pKGO, der S4nc:GUS:OCS3' enthielt, gebracht, wobei S4nc:GUS:S5Tr hergestellt wurde.
13A bis 13G sind photographische Darstellungen, die die durch den SCSV-Segment-4-Promotor (S4nc) gesteuerte GUS-Expression in Kartoffelpflanzengeweben zeigen. A. Stängel; B., Blatt; C. Stolo; und D. Knolle.
14 ist eine photographische Darstellung der durch den SCSV-Segment-7-Promotor (S7nc) gesteuerte GUS-Expression in einem Baumwollblatt.
15 ist eine Darstellung der MeA3'-Terminatorsequenz des Flaveria bidentis MeA-Gens (Me3). Das Stopkodon ist fettgedruckt am Anfang der Sequenz angegeben. Diese Sequenz wurde in dem chimären Konstrukt so gentechnisch verändert, dass es eine EcoR1-Stelle umfasst: GAATTCGTTTAG .... Die chimären Konstrukte enthielten daher eine Sequenz mit dem Anfang AATTCGTTTAG.
16 ist eine Diagrammdarstellung der GUS-Expressionsvektoren (ME20 und ME29), die die angegebenen regulatori schen Elemente des Flaveria bidentis MeA-Gens enthalten.
17 ist eine Diagrammdarstellung der Konstruktion des S4nc-Plasmids pBS237, das die Expressionskassette S4nc:GUS:Me3' enthält. Das Plasmid pBS218 wurde mit EcoR1 zur Entfernung der OCS3'-Region verdaut und mit EcoR1 ligiert.
18 ist eine Diagrammdarstellung der Konstruktion des Plasmids pBS246, das die S1nc:nptII:SC3Tr-Expressionskassette enthält. Das SalI-SalI-Fragment sind etwa 8,5–9 kbp; B_L sind etwa 0,5 kbp; B_R sind etwa 0,6 kbp; SC1nc:nptII:SC3Tr sind etwa 1,7 kbp.
19a–c sind Diagrammdarstellungen der Konstruktion des Plasmids pKHAN4 aus pKHAN2 und pKSB.bar1. pKHAN4: Ein HindIII-EcoR1-Segment, das S7nc (572 bp), die nptII-Codierungsregion (978 bp) und das Vicillin-3'-Ende (276 bp) von pKHAN2 enthielt, wurde in das binäre Plasmid pKSB.bar1 insertiert, wobei pKHAN4 erhalten wurde; pKHAN2. Die nptII-Codierungsregion (978 bp, BamHI-Sma1-Fragment) aus p35SKN wurde in die Asp718-Stelle (die mit Klenow-Fragment stumpfendig gemacht wurde) von pKHAN1 kloniert, wobei pKHAN2 erzeugt wurde. SCSV Pro = S7nc. pKSB.Bar1: pTAB10.MCSori1B verdaut mit EcoR1 wie zusammen ligiert.
20 ist eine photographische Darstellung einer Selektion von kanamycinresistenten Tabakpflanzen auf Regenerationsmedium, die mit binären Vektoren transoformiert wurden, die entweder die 35S-Promotor:NPTII:35S-Terminatorsequenz (35SPrm:NPTII:35STrm) oder die S1nc:NPTII:SC3Tr-Expressionskassette enthielten (In den Figuren sind die Abkürzungen 35S Prm NPTII35STrm bzw. SC1 Prm NPTII Sc3 Trm).
21 ist eine Diagrammdarstellung eines Klonierungsvektors, der regulatorische Signale der Transkription von SCSV-DNA verwendet.
22 ist eine Diagrammdarstellung des SCSV-Segment-2-Dimer-Konstrukts pBS2. Dieses Konstrukt wurde durch Klonieren eines Tandemrepeats der SCSV-Segment-2-DNA (die eine ganze funktionsfähige Segment-2-Transkriptionseinheit enthielt) in die Polylinkerstelle von pGEM7, die dann in eine reduzierte Version des binären Vektors pMCP3 kloniert wurde, erzeugt (Khan et al., 1994).
Eine Zusammenfassung der durch die Transkriptionsregulatorelemente von SCSV ermöglichten Transkriptionsaktivitäten ist in Tabelle 19 angegeben.
BEISPIEL 1
Sequenzbestimmung der SCSV-DNA
Das F-Isolat von SCSV (Chu et al., 1993a) wurde zur Sequenzbestimmung verwendet. Klone von voller Länge der SCSV-Genomkomponenten wurden aus der DNA der replikativen Form (RF) gemäß der Beschreibung von Chu et al. (1993a) erzeugt. Andere Klone wurden aus der RF mittels PCR mit aus bekannten Sequenzen gestalteten SCSV-spezifischen Primern erzeugt.
Das Didesoxykettenabbruchverfahren (Sanger et al., 1977) wurde zur Sequenzierung von entweder M13-ssDNA-Templaten (Sambrook et al., 1989) oder dsDNA-Templaten, die nach dem CTAB-Verfahren (Del Sal et al., 1989) aus den oben beschriebenen Klonen hergestellt wurden, verwendet. Die Sequenzanalyse wurde unter Verwendung des University of Wisconsin Genetics Computer Group Sequence Analysis Software Package (Devereaux et al., 1984) durchgeführt.
BEISPIEL 2
Plasmidkonstruktion
DNA-Manipulationstechniken wurden gemäß der Beschreibung von Sambrook et al. (1989) verwendet. Die gesamten nichtcodierenden Regionen von allen 7 DNA-Segmenten von SCSV wurden mittels PCR unter Verwendung spezifischer Primer (siehe Tabelle 8) mit zur Klonierung in die Plasmidvektoren geeigneten Restriktionsenzymerkennungsstellen amplifiziert. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden getrennt in die jeweiligen Expressionsvektoren stromaufwärts eines promotorlosen GUS-Reportergens in der passenden Orientierung zur Bildung der SCSV-Promotor-GUS-Fusionskonstrukte, die in 3 und 4 angegeben sind, kloniert. Der Expressionsvektor pHW9 (3) und die anschließende Klonierung in den binären Vektor pGA470 (An et al., 1985) wurden für die Tabaktransformation verwendet. Der Expressionsvektor pKGO wurde für die GUS-Expression in Protoplasten verwendet (4), und der binäre Vektor pTAB10 wurde für die Transformation von Acker-Kleegras verwendet (5). pKGO wurde konstruiert, indem das XhoI-Fragment von pKIWI101 (Janssen und Gardner, 1989), das das GUS-Gen und die OCS-Terminatorsequenz enthielt, in die SalI-Stelle von pJKKm (Kirschman und Cramer, 1988) kloniert wurde. Entsprechende Plasmide, die den 35S-Promotor an GUS fusioniert enthielten, wurden als Kontrollen verwendet. Die Verbindungen der Klone wurden durch Sequenzierung überprüft. Ein promotorloses GUS-Konstrukt wurde als Kontrolle verwendet.
Deletionsderivate der SCSV-Segment-5- und -7-Promotoren wurden durch Verdauen der nichtcodierenden Sequenz von voller Länge mit einem zum Hervorrufen der gewünschten Deletion geeigneten Enzym hergestellt (4).
Zur Untersuchung des Phänomens der Transaktivierung wurde die S5nc:GUS-Expressionskassette aus rekombinanten pKGO-Konstrukten herausgeschnitten und in ein pGEM-Plasmid, das die von dem 35S-Promotor exprimierte Segment-2-RAP-Codierungsregion enthielt, kloniert. Das gebildete Plasmid, das sowohl die SCSV-Promotor:GUS- als auch die 35S-Promotor:Segment-2-RAP-Expressionskassette enthielt, wurde durch Elektroporation in Protoplasten eingeführt.
BEISPIEL 3
Protoplastenisolation und transiente Genexpression
Rekombinante Plasmide wurden aus E. coli durch alkalische Lyse und anschließende Reinigung über Qiagen-Säulen gemäß der Beschreibung im Qiagen Plasmid Handbook extrahiert.
Suspensionszellkulturen wurden zur Isolierung von Nicotiana plumbaginifolia (Last et al., 1991) und Acker-Kleegras cv. Woogenellup-Protoplasten (Chu et al., 1993b) verwendet. Gereinigte Plasmide wurden durch Elektroporation in Protoplasten von Acker-Kleegras oder Nicotiana plumbaginifolia gemäß der Beschreibung von Taylor und Larkin (1988) eingeführt. Die Protoplasten wurden 3 Tage später geerntet und fluorimetrisch auf transiente GUS-Aktivität unter Verwendung von 4-Methyl-umbelliferyl-β-glucuronid als Substrat getestet (siehe im folgenden). Alle Experimente wurden unter Verwendung von zweifachen Proben pro Behandlung durchgeführt.
BEISPIEL 4
Transformation von Tabak mit SCSV-Promotor-GUS-Fusionskonstrukten
Die rekombinanten binären Konstrukte von pGA470, die die verschiedenen SCSV-Promotor:GUS-Expressionskassetten ent hielten, wurden getrennt durch Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens, Stamm LBA4404 (Hoekema et al., 1983) gemäß der Beschreibung von Nagel et al. (1990) transformiert. Nicotiana tobacum cv. Wisconsin 38 wurden gemäß der Beschreibung von Ellis et al. (1987) transformiert und regeneriert.
BEISPIEL 5
Transformation von Acker-Kleegras mit SCSV-Promotor-GUS-Fusionskonstrukt
Der rekombinante binäre Vektor von pTAB10, der das S7nc:GUS-Fusionskonstrukt (pBS150) enthielt, wurde in Agrobacterium tumefaciens, Stamm AGL1 (Lazo et al., 1991) durch Dreifachpaarung (Ditta et al., 1980) transformiert. Acker-Kleegras cv. Larisa wurde durch Agrobacteriumvermittelte Transformation transformiert und gemäß der Beschreibung von Khan et al. (1994) regeneriert.
BEISPIEL 6
GUS-Tests
Protoplasten wurden durch Ultraschallbehandlung in Gegenwart von 0,3% (V/V) Triton X-100 unmittelbar nach dem Ernten lysiert. Die GUS-Aktivität des löslichen Extrakts wurde in einem fluorimetrischen Test unter Verwendung des Substrats 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) (Jefferson et al., 1987) bestimmt. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Labsystem Fluoroskan II-Spektrophotometers ermittelt.
Die GUS-Expression in intakten transgenen Geweben wurde durch histochemische Anfärbung in 5-Brom-4-chlor-3-indolylβ-glucuronsäure (X-gluc) (Jefferson et al., 1987) und durch fluorimetrischen Test des löslichen Extrakts unter Verwen dung von MUG nachgewiesen.
BEISPIEL 7
Sequenz der nichtcodierenden Region von SCSV
Die vollständigen Sequenzen aller 7 bekannten SCSV-DNA-Ringe wurde bestimmt (6). Jede DNA enthält eine nichtcodierende Region mit Signalen (TATA-Boxen) für die Promotoraktivität (Tabelle 2). Diese Sequenzen wurden bisher nicht beschrieben oder isoliert. Ein Sequenzvergleich der nichtcodierenden Regionen, die diese Promotoren umfassen, zeigte, dass die Segmente 3 und 5 am ähnlichsten sind, wobei sie 258 konservierte Nucleotide aus durchschnittlich 491 Nucleotiden in den nichtcodierenden Regionen der DNAs teilen. Die Segmente 3, 4, 5 und 7 enthalten zusammen 170 konservierte Basen, während nur 152 Basen durch die Segmente 1, 3, 4, 5 und 7 konserviert sind. Die Sequenzvariationen in den nichtcodierenden Regionen der SCSV-DNAs legen nahe, dass die Transkription und Replikation der verschiedenen SCSV-Gene unterschiedlich geregelt sein können.
BEISPIEL 8
Transiente Aktivität von SCSV-Promotoren in Protoplasten
Die Promotoraktivitäten der zwei nichtcodierenden Regionen von SCSV-DNA wurden direkt durch die transiente Expression von GUS unter Verwendung von SCSV-Promotor:GUS-Fusionskonstrukten in Protoplasten von Acker-Kleegras (Tabelle 3) und Tabak (Tabelle 4) belegt. Diese Ergebnisse zeigten, dass sowohl der Segment-5- als auch der Segment-7-Promotor in Abwesenheit anderer SCSV-DNA-Komponenten funktionsfähig sind. Die SCSV-Promotoren sind auch in Protoplasten von entweder einem natürlichen Wirt (Acker-Kleegras) oder einem Nichtwirt (Tabak) funktionsfähig. In Tabakprotoplasten hatte der Segment-7-Promotor eine ähnliche Aktivität wie der 35S-Promotor, während der Segment-5(Hüllprotein)-Promotor konsistent eine Aktivität von etwa der Hälfte der des CaMV-35S-Promotors zeigte (Tabelle 4). Jedoch war die Aktivität beider Promotoren in Protoplasten von Acker-Kleegras höher, wobei die Aktivität des Segment-7-Promotors bis zu mehrere Male höher als die des 35S-Promotors war (Tabelle 3), was nahelegt, dass SCSV-Promotoren in bestimmten Gemüsearten besser arbeiten als der in weitem Umfang verwendete 35S-Promotor. Die Aktivität des Segment-7-Promotors schien ferner in Protoplasten von Acker-Kleegras variabler als die anderen getesteten zu sein.
Plasmide, die verschiedene Deletionsderivate der nichtcodierenden Sequenz der Segmente 5 und 7 an GUS fusioniert enthielten, wurden ebenfalls konstruiert (4) und durch Elektroporation in Protoplasten eingeführt (Tabelle 5). GUS-Tests der mit diesen Konstrukten transfizierten Protoplasten zeigten, dass weder Stamm-Schleife noch die gemeinsame Region für die Promotoraktivität notwendig waren, obwohl die letztere für die vollständige Aktivität erforderlich war (Tabelle 5). Die für eine hochgradige Promotoraktivität erforderliche DNA-Sequenz scheint weniger als 300 bp aufzuweisen, was weniger ist als für andere Promotoren, beispielsweise den 35S-Promotor (Odell et al., 1985), erforderlich ist.
BEISPIEL 9
Transaktivierung der SCSV-Promotoraktivität durch das SCSV-Segment-2-Genprodukt
Bei einer Co-Elektroporation mit einem 35S-Promotor:Segment-3-RAP-Genkonstrukt schienen die durch den Segment-5-Promotor getriebenen Aktivitäten von GUS bei Protoplasten von sowohl Acker-Kleegras als auch Tabak um das Zweifache erhöht (Tabelle 6). Die Segment-7-Promo toraktivität kann auch bei einer Co-Elektroporation mit dem 35S:Segment-2-RAP-Konstrukt erhöht sein, doch sind weitere Experimente zur Bestätigung hierfür notwendig.
Eine Transaktivierung der GUS-Aktivität wurde offensichtlich auch beobachtet, wenn das S5nc:GUS-Konstrukt mit einem binären Vektorplasmid (pBS2), das ein Tandemrepeat (Dimer) der Segment-2-DNA enthielt, durch Co-Elektroporation eingeführt wurde (Tabelle 6). Eine Karte von SCSV-Segment-2-Dimer-Konstrukt-pBS2 ist in 22 angegeben. Dieses Konstrukt wurde durch Klonieren eines Tandemrepeats der SCSV-Segment-2-DNA (die eine ganze funktinosfähige Segment-2-Transkriptionseinheit enthielt) in die Polylinkerstelle von pGEM7, die dann in eine reduzierte Version des binären Vektors pMCP3 (Khan et al., 1994) kloniert wurde, erzeugt. Die Ergebnisse legen nahe, dass beide SCSV-Promotoren gleichzeitig exprimiert werden. Daher können unterschiedliche SCSV-Promotoren entweder in Kombination mit einem 35S-Promotor verwendet werden oder gleichzeitig verwendet werden, um eine gleichzeitige Expression mehrfacher Transgene in Pflanzen zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu wurde eine reduzierte Transgenaktivität beobachtet, wenn der 35S-Promotor in mehrfachen Transgenen oder Transgenen mit Mehrfachkopien verwendet wurde (Linn et al., 1990; Matzke und Matzke, 1991; Scheid et al., 1991; Carvalho et al., 1992).
BEISPIEL 10
Aktivität von SCSV-Promotoren in transgenen Pflanzen
Es wurde gezeigt, dass alle SCSV-Promotoren mit Ausnahme derjenigen von den Segmenten 2 und 6 fähig sind, die Expression von Transgenen in Tabakpflanzen anzutreiben (7). Der durch den MUG-Test ermittelte Aktivitätsgrad der Promotoren variierte von Pflanze zu Pflanze und von einem Promotor zum anderen, er ist jedoch allgemein niedriger als der des 35S-Promotors (Tabelle 7).
Die histochemische Anfärbung von intakten transgenen Tabakgeweben zeigte, dass die Aktivität des S4nc-Promotors konstitutiv zu sein scheint, und GUS-Aktivität wurde in allen Pflanzenorganen nachgewiesen. Die anderen sind allgemein auf die Gefäßgewebe beschränkt, obwohl eine Expression auch in Pollen nachgewiesen wird.
Bei transgenen Pflanzen von Acker-Kleegras, die das S7nc:GUS-Genkonstrukt exprimierten, zeigte eine histochemische Anfärbung, dass die GUS-Aktivität in Blättern, Stängeln und Blattstielen gefunden wird. Die Verteilung der GUS-Aktivität ist meist konstitutiv, obwohl in einigen Geweben die Aktivität hauptsächlich in den Gefäßgeweben stattfindet (7). In diesen Pflanzen variiert der Grad der Promotoraktivität auch von Pflanze zu Pflanze, doch ist die Aktivität allgemein mit der des 35S-Promotors vergleichbar.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die SCSV-Promotoren eine Wahl von Promotoren ergeben, die unabhängig voneinander oder gleichzeitig zur Kontrolle der Expression von einem oder mehreren Fremdgenen in einem breiten Bereich von Pflanzen und Gewebearten verwendet werden können. Gemüsearten sind ein Hauptziel der Anwendung. Die Aktivität dieser Promotoren kann auch durch das Vorhandensein des Segment-2-Genprodukts verstärkt werden. Daher scheinen diese Promotoren signifikante Vorteile gegenüber dem CaMV-35S-Promotor sowohl hinsichtlich der Grade der Expression, der Größe und der Überwindung einiger negativer Merkmale des 35S-Promotors zu besitzen. Sie sind in einem breiten Bereich von transgenen Anwendungen verwendbar.
TABELLE 1 Eigenschaften von Pflanzenviren mit kleinen und mehrfach verkapselten ringförmigen ssDNAs (Pflanzencircoviren)
Zusammenfassung von Daten, die während des Sixth International Congress of Plant Pathology, Montreal, Juli 1993, präsentiert wurden. FBNYV = Faba Bean Necrotic Yellow Virus, MDV = Milk Vetch Dwarf Virus, SCSV = Subterranean Clover Stunt Virus, BBTV = Banana Bunchy Top Virus, CFDV = Coconut Foliar Decay Virus.
TABELLE 3 SCSV-Promotor-dirigierte GUS-Aktivität in Protoplasten von Acker-Kleegras
Alle Experimente wurden unter Verwendung von zweifachen Proben pro Behandlung durchgeführt. Die GUS-Aktivität wurde unter Verwendung eines Labsystem Fluoroskan II-Spektrophotometers ermittelt und ist sowohl als absolute Aktivität (Act) als auch als Prozentsatz der 35S:GUS-Aktivität (%35S) angegeben.
Die Konstrukte sind als "Promotor:Reportergen" angegeben. Beispielsweise bedeutet "35S:GUS" den 35S-Promotor und das GUS-Reportergen. "S5nc" und "S7nc" sind die Promotoren für die Segmente 5 bzw. 7 von SCSV.
TABELLE 4 SCSV-Promotor-dirigierte GUS-Aktivität in Tabakprotoplasten
Alle Experimente wurden unter Verwendung von zweifachen Proben pro Behandlung durchgeführt. Die GUS-Aktivität wurde unter Verwendung eines Labsystem Fluoroskan II-Spektrophotometers ermittelt und ist sowohl als absolute Aktivität (Act) als auch als Prozentsatz der 35S:GUS-Aktivität (%35S) angegeben.
TABELLE 5 Promotoraktivitäten (GUS-Expressionsgrade) von Deletionsderivaten der nichtcodierenden Regionen von Segment 5 und 7 in Protoplasten Die Grade sind als Prozentsatz der Aktivität der jeweiligen nichtcodierenden Sequenz von voller Länge angegeben
TABELLE 6 Transaktivierung der Segment-5-Promotoraktivität (GUS-Expression) in Protoplasten von Tabak und Acker-Kleegras durch das Genprodukt von Segment 2
TABELLE 7 Relative GUS-Aktivität in Blattextrakten von unabhängigen transgenen Tabakpflanzen, die unterschiedliche Promotor:GUS-Konstrukte enthalten, die durch fluorimetrische Tests bestimmt wurde^a
BEISPIEL 11
Weitere Charakterisierung der SCSV-Promotoraktivitäten in transgenen Pflanzen
Transgene Tabakpflanzen, die mit den fünf (Segment 1, 3, 4, 5 und 7)-SCSV-Promotor:GUS-Fusionskassetten transformiert wurden, wurden durch sowohl histochemische (8 und 9) als auch fluorimetrische Tests (10) auf GUS-Aktivität getestet. Proben, die von gewebegezüchteten und jungen im Treibhaus gezogenen Pflanzen genommen wurden, ergaben das gleiche GUS-Expressionsmuster. GUS-Aktivität wurde in allen Pflanzenteilen, die Wurzeln, Stängel, Blätter, Blattstiele und alle Blütenteile umfassten, beobachtet. Das Promotor-5-Konstrukt ergab in Pollen eine relativ niedrigere GUS-Expression als andere Promotoren. Die Ergebnisse von fluorimetrischen Tests bestätigten frühere Daten, die zeigten, dass der Segment-4-Promotor der stärkste Expressor mit einer 10-fachen oder größeren Aktivität als der Rest war (10), jedoch immer noch niedriger als der des 35S-Promotors war. Die Expressionsgrade der Segment-1-, -3-, -5- und -7-Promotoren waren mit denjenigen des Phloemspezifischen Promotors rolC in Tabak vergleichbar (Schmulling et al., 1989; Sugaya et al., 1989). Pflanzen, die mit dem promotorlosen GUS-Konstrukt transformiert waren, exprimierten GUS nach keinem der beiden Testverfahren. Histochemische Tests zeigten, dass die Expression aller Promotorkonstrukte am höchsten in Gefäßgeweben war, wobei starke Expressoren konstitutiver als schwache Expressoren, die stärker gefäßbeschränkt sind, waren (8). Im allgemeinen werden Promotor-1-, -3-, -5- und -7-Konstrukte am stärktsten in den Gefäßgeweben exprimiert. Insbesondere ist die GUS-Expression durch Promotor-1- und -3-Konstrukte hauptsächlich auf Phloemgewebe beschränkt. Jedoch zeigte eine histochemische Anfärbung von Blättern für alle Promotoren, dass die GUS-Expression in diesen Geweben häufig fleckig (konstitutiv und gefäßbeschränkt) und variabel zwischen Blättern der gleichen Pflanze ist. Dunkelfeldmikroskopie (Jacobsen-Lyon et al., 1995) zeigte auch, dass keine streng gefäßbeschränkt ist (9).
Zwanzig primäre transgene Pflanzen von Acker-Kleegras, die das Seg-7-Promotor:GUS-Gen exprimierten, wurden ferner durch histochemische Tests charakterisiert (Tabelle 9). Diese Tests zeigten, dass GUS-Aktivität in allen Pflanzenteilen beobachtet wurde, wobei dies Wurzeln, Stängel, Blätter und Blattstiele umfasst. Die GUS-Expression war am höchsten in Gefäßgeweben, wobei einige Blätter stärker konstitutiv und fleckig als andere Organe sind und stark GUS-exprimierende Pflanzen stärker konstitutiv als schwach exprimierende sind. Proben, die von gewebegezüchteten und im Treibhaus gezogenen Pflanzen genommen wurden, ergaben das gleiche GUS-Expressionmuster.
BEISPIEL 12
Nachweis der Promotoraktivität in SCSV-Segment-2-DNA
Experimente zeigten, dass die nichtcodierenden Regionen von den SCSV-Segment-2- und -6- DNAs unfähig waren, die Expression des GUS-Gens in transgenem Tabak anzutreiben. Diese Regionen sind nur 179 bzw. 159 Nucleotide lang, und es ist wahrscheinlich, dass weitere Sequenzen für eine Promotoraktivität erforderlich sind. Zum Testen dieser Hypothese wurde eine neue Segment-2-Promotorsequenz konstruiert, die aus dem DNA-Fragment von den Nucleotiden 526 bis 46 bestand, das an den promotorlosen GUS-Vektor pKGO fusioniert wurde (11). Das Fusionskonstrukt wurde durch Elektroporation in Tabakprotoplasten eingeführt. Die GUS-Aktivität wurde in durch Elektroporation behandelten Tabakprotoplasten in ähnlich hohen Graden wie die des Segment-5-Promotor:GUS-Konstrukts, nachgewiesen (Tabelle 10).
Ein binärer Vektor, der die obige SRnc-Promotor:GUS-Fusions-DNA enthielt, wurde ebenfalls wie in Beispiel 4 beschrieben in Tabakpflanzen transformiert. Die histochemische Anfärbung von mehreren transformierten Tabakpflanzen zeigte, dass die GUS-Expression hauptsächlich vaskulär war. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine weitere Sequenz aus der SCSV-Segment-2-DNA-Codierungsregion für die Promotorfunktion notwendig ist. Da das SCSV-Segment 6 eine Variante des Segments 2 ist, wird erwartet, dass ein ähnliches Konstrukt, das die nichtcodierende und einen Teil der codierenden Region dieser DNA umfasst, einen aktiven Promotor ergibt. Daher sind vermutlich alle SCSV-Promotoren zum Treiben der Genexpression in Pflanzen geeignet.
BEISPIEL 13
Verstärkung der Genexpression durch SCSV-Transkriptionsterminations- und -polyadenyliserungssignale
Eine wirksame Genexpression erfordert nicht nur einen Promotor, sondern auch spezifische Nucleotidsequenzen am 3'-Ende der Codierungsregion des Gens, die als die Terminations- und Polyadenylierungssignale bekannt sind (Messing et al., 1983; Joshi 1987b; Gil und Proudfoot, 1984; Rothnie et al., 1994). Diese speziellen Sequenzen sind erforderlich, um der RNA-Polymerase das Stoppen der Transkription zu signalisieren und eine weitere Prozessierung des RNA-Transkripts zu ermöglichen. Die Aktivität der Terminations- und Polyadenylierungssignale kann die Transkriptionseffizienz und Stabilität der transkribierten RNA beeinflussen. Einige weit verbreitet verwendete Terminations/Polyadenylierungssequenzen umfassen diejenigen von den NOS-(Depicker et al., 1982), OCS-(Janssen und Gardner, 1989) und CaMV-35S-(Pietrzak et al., 1986)Genen.
Jedes der SCSV-DNA-Segmente (oder Komponenten) enthielt eine Terminatorsequenz, die eine Terminations- und eine Polyadenylierungssignalsequenz, in der nichtcodierenden Region umfasste (Tabelle 11; 2). Zur Demonstrierung der Aktivität der Terminations/Polyadenylierungssignale in SCSV-DNA wurden GUS-Expressionsvektoren, die das Polyadenylierungs- und Terminationssignal von entweder Segment 3 oder Segment 5 enthielten (12), konstruiert und einer transienten Expression in Tabakprotoplasten unterzogen. Die jeweilige Terminatorsequenz wurde mittels PCR mit mehreren Restriktionsstellen, die in die Primer eingearbeitet waren, amplifiziert (12). Die amplifizierten Terminatorfragmente wurden mit den angegebenen Restriktionsenzymen geschnitten und in das rekombinante pKGO-Plasmid, das entweder das S1nc- oder S4nc-Promotor:GUS:OSC3'-Konstrukt enthielt, aus dem die OCS3'-Sequenz deletiert worden war, kloniert (12). Das gebildete S1nc:GUS:SC3Tr (der Segment-1-Promotor trägt hier eine Deletion des HindIII-Fragments der Nucleotide 641–782, die keine Wirkung auf die GUS-Aktivität hat) und S4nc:GUS:S5Tr-Konstrukte wurden in Tabakprotoplasten durch Elektroporation eingeführt und auf GUS-Aktivität getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die GUS-Aktivität 2- bis 3-fach erhöht war, wenn die SCSV-Terminations/Polyadenylierungssequenz anstelle der üblicherweise verwendeten OCS-Terminations/Polyadenylierungssequenz in dem gleichen Konstrukt verwendet wurde (Tabelle 12). In dem gleichen Experiment produzierte das Konstrukt S1nc:GUS:S3Tr eine mehr als zweifach höhere Aktivität als das 35S:GUS:OCS3'-Konstrukt (Tabelle 12). Diese Ergebnisse zeigen, dass jede der SCSV-DNA-Komponenten eine unterschiedliche Terminations- und Polyadenylierungssignalsequenz enthält, die in verschiedenen Kombinationen mit den SCSV-Promotoren zur Regulation und/oder Verstärkung der Expression von Fremdgenen in Pflanzen verwendet werden kann. Wie die SCSV-Promotorsequenzen sind die SCSV-Termina tions/Polyadenylierungssequenzen vorteilhaft gegenüber derzeit verfügbaren Terminations/Polyadenylierungssequenzen im Hinblick auf deren geringe Größen (160–170 Nucleotide) und die Verfügbarkeit eines breiten Bereichs von Transkriptionsregulatoren mit unterschiedlichen Stärken und Gewebespezifitäten zur Genmanipulation. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Verwendung eines SCSV-Promotors in Kombination mit einer SCSV-Terminatorsequenz höhere Grade der Genexpression als Konstrukte unter Verwendung des 35S-Promotors in Verbindung mit einer der üblichen Transkriptionsterminatorsequenzen ergibt.
BEISPIEL 14
Aktivität von SCSV-Promotoren in transgenen Kartoffelpflanzen
Der binäre Vektor pGA470, der das S4nc:GUS:NOS-Fusionskonstrukt in pHW9 kloniert enthielt (3), wurde zur Transformation von Kartoffelpflanzen verwendet. pHW9 stammt von pHW8 (Dolferus et al., 1994), in das der Polylinker von pGEM3zf(+) insertiert wurde. Der rekombinante binäre Vektor wurde in Agrobacterium tumefaciens, Stamm LBA4404, durch Elektroporation transformiert (Nagel et al., 1990). Die Kartoffelzuchtvarietäten Atlantic und Sebago wurden im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Wenzler et al. (1989) mit Ausnahme der folgenden Modifikationen transformiert und regeneriert. Stängelteile wurden anstelle von Blattteilen zur Transformation verwendet und 10 mg/l Benzylaminopurin (BAP) wurden anstelle von 2,24 mg/l während der Co-Kultivierung verwendet. Nach der Co-Kultivierung wurde Stufe-1-Medium mit 100 mg/l Cefotaxim und nicht Kanamycin oder Carbenicillin ergänzt. Das Stufe-II-Medium enthielt 2 mg/l BAP, 5 mg/l GA3, 100 mg/l Kanamycin und 100 mg/l Cefotaxim.
Sechs transformierte Pflanzen, die 5 der Zuchtvarietät Atlantic und 1 der Zuchtvarietät Sebago umfassten, wurden übertragen und im Treibhaus 10–11 Wochen gezüchtet, bis sich kleine Knollen bildeten. Gewebe von verschiedenen Teilen der Pflanzen wurden durch histochemische GUS-Anfärbung getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass GUS in allen Pflanzenteilen, die Wurzeln, Stolons, Knollen, Stängel und Blätter umfassten, stark exprimiert wurde, die Expression jedoch vorwiegend vaskulär war, was Cambium, Phloemelemente und einige Xylemelemente umfasste (13). Wie bei anderen transgenen Wirten war die GUS-Expression in nicht-vaskulären Geweben von stark GUS-aktiven Pflanzenmaterialien, insbesondere jungen Knollen, offensichtlicher als in weniger aktiven Geweben, wobei bei einem Vergleich mit einem 35S:GUS:NOS-Konstrukt die SCSV-Promotor-dirigierte GUS-Expression in Knollen mindestens so hoch wie die des 35S:GUS-Konstrukts war.
BEISPIEL 15
Aktivität des SCSV-Segment-7-Promotors in transgenen Baumwollpflanzen
Der binäre Vektor pGA470, der das S7nc:GUS:NOS-Fusionskonstrukt in pHW9 kloniert enthielt, wurde zur Transformation von Baumwollpflanzen verwendet. Der rekombinante binäre Vektor wurde in Agrobacterium tumefaciens, Stamm AGL1, durch Dreifachpaarung transformiert. Baumwolle (Gossypium hirsutum) cv. Coker 315 wurde gemäß der Beschreibung von Cousins et al. (1991) transformiert und regeneriert.
Transformierte Pflanzen wurden im Treibhaus gezüchtet und Blattgewebe von 18 unabhängigen transgenen Pflanzen wurde durch histochemische Anfärbung auf GUS-Aktivität getestet. Die GUS-Aktivität variierte zwischen Pflanzen. Fünf dieser Pflanzen zeigten eine starke GUS-Expression in einem ähnli chen Bereich wie die 35S-Promotor-getriebene GUS-Expression, die in den Gefäßgeweben vorherrschend war (14). Die GUS-Aktivität war in den Gossypoldrüsen besonders stark. Wie in anderen transgenen Wirten war die GUS-Anfärbung in stark exprimierten Geweben ebenfalls konstitutiv.
Eine Vielzahl von Geweben aus diesen Pflanzen wurde dann angefärbt und eine Gefäßexpression wurde in allen Organen, einschließlich Wurzeln, Stängeln, Blattstielen, Blättern und anderen vaskularisierten Blütenteilen, beobachtet. Die Expression scheint besonders hoch in jungen Blütenknospen zu sein. Sämlinge von einer der Linien wurden auf GUS-Aktivität durchmustert. Alle 10 Nachkömmlinge zeigten eine starke Färbung in Wurzeln und Blättern, was anzeigt, dass das Gen vererbt wurde und dass die Linie wahrscheinlich mehr als eine unabhängige Insertionsstelle enthielt.
BEISPIEL 16
Stabilität der transformierten SCSV-Promotor:GUS-Expressionskassette in transgenen Pflanzen
Die Stabilität der durch die verschiedenen SCSV-Promotoren getriebenen GUS-Expression in transgenem Tabak und Subclover wurde weiter in Sämlingen der T1-Generation von Acker-Kleegras- und Tabakpflanzen charakterisiert.
Bei Tabak wurden T1-Sämlinge von 10 unabhängigen transgenen Linien durch histochemische Anfärbung getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die durch alle fünf Promotoren (der Segmente 1, 3, 4, 5 und 7) getriebene Expression des GUS-Gens in den T1-Sämlingen stabil war, wobei das Expressionsmuster in allen Fällen zwischen T0- und T1-Pflanzengeweben des gleichen Alters beibehalten wurde. In sehr jungen Stängeln, worin die Gefäßgewebe nicht gut differenziert sind, war die Expression von allen Promotoren sehr hoch und in den gesamten Stängelgeweben nachweisbar. Eine allmähliche vaskuläre Einschränkung erfolgte mit dem Alter und mit zunehmender Differenzierung der Gefäßbündel. Bei T0-Pflanzen war die durch den Segment-4-Promotor vermittelte GUS-Expression konstitutiver als bei anderen.
Fünfzig 2–3 Monate alte T1-Sämlinge von 15 unabhängigen transgenen Subclover-Pflanzen, die das S7nc:GUS-Fusionskonstrukt exprimierten, wurden durch histochemische und fluorimetrische Tests auf GUS-Aktivität getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression des durch den Segment-7-Promotor getriebenen GUS-Gens in T1-Sämlingen stabil war, wobei das Expressionsmuster zwischen T0- und T1-Pflanzengeweben des gleichen Alters beibehalten wurde. Es wurde ermittelt, dass die GUS-Expression sich allgemein im erwarteten Verhältnis von 3 : 1 auftrennt. Die Vorergebnisse von fluorimetrischen Tests bestätigten die histochemischen Daten, was nahelegt, dass dieses Segment-7-Promotorkonstrukt eine etwas niedrigere GUS-Aktivität als die des 35S-Promotors in Blättern und Blattstielen aufwies (Tabelle 13). Die GUS-Aktivität in Stängeln von Acker-Kleegras war jedoch 3-fach höher als in Blattstielen und 6-fach höher als in Blättern (Tabelel 14). Das Alter der Pflanzen zum Zeitpunkt des Tests betrug 2 bis 3 Monate.
BEISPIEL 17
Transiente Aktivität des SCSV-Promotors in Sojabohnenblättern
Das verwendete SCSV-Promotor:GUS-Konstrukt (Tabelle 15) stammte von dem früher beschriebenen promotorlosen GUS-Plasmid pKGO (4; pJKKmf(–) K1W1 GUS:OCS), während das 35S-Promotor:GUS-Konstrukt pGUS war. pGUS wird durch Klonieren des GUS-Gens von pKIWI101 in den Pflanzenexpressionsvektor pDH51 abgeleitet (Pietrzak et al., 1986).
Zur transienten GUS-Expression in Sojabohnengeweben wurden die GUS-Konstrukte in Gewebe durch Teilchenbeschuss unter Verwendung des Bio-Rad Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery Systems wie oben eingeführt. 50 μl Suspension, die 3 mg von 1 μm und 5 μm Goldteilchen in einem Verhältnis von 1 : 1 plus 6 μg DNA enthielt, wurde auf Platten, die jeweils 3 Blätter enthielten, geschossen. Die in diesen Experimenten verwendeten vollständig ausgebreiteten Blätter wurden aus 24 Tage alten Sojabohnenpflanzen cv. Wayne zubereitet. Nach dem Teilchenbeschuss wurde die GUS-Aktivität 24 h später durch Vakuuminfiltration der Blätter mit X-Gluc (Craig, 1992) getestet.
Die Ergebnisse (Tabelle 15) zeigten, dass bei der transienten Expression in Sojabohnenblättern der SCSV-Segment-4-Promotor stärker aktiv (25–35 Flecken/Blatt) als der 35S-Promotor (10–15 Flecken/Blatt) war, wenn die jeweiligen Plasmide in Sojabohnenblätter geschossen wurden.
BEISPIEL 18
Testen von SCSV-Promotoren für callusspezifische Expression
Alle sieben nichtcodierenden Sequenzen von SCSV wurden in den promotorlosen GUS-Vektor pHW9 kloniert. Binäre Vektoren, die jeweils eines der sieben SCSV-Promotor:GUS-Fusionskonstrukte enthielten, wurden durch Agrobacteriumvermittelten Gentransfer in Tabakgewebe transformiert. 2–3 Wochen nach der Transformation wurden Calli, die Primodia der Transformationsschösslinge enthielten, einer histochemischen GUS-Anfärbung unterzogen. Die beste Expression wurde in mit Segment 1 transformierten Calli beobachtet, worauf die S4nc:GUS:OCS-Konstrukte folgten. Dieses Ergebnis legt nahe, dass der Segment-1-Promotor für die Expression eines Gens eines selektierbaren Markers am besten geeignet ist und dass der Segment-4-Promotor am besten für die Genexpression ist.
BEISPIEL 19
Charakterisierung von regulatorischen Sequenzen des Flaveria bidentis MeA-Gens
In Flaveria bidentis (Chitty et al., 1994) ist das MeA-Gen das Gen, das für das NADP-Äpfelsäure-Enzym codiert, das für die C4-Photosynthese angepasst ist. Die Struktur und die vermutlichen Promotor- und Transkriptionsterminations/Polyadenylierungssignalsequenzen dieses Gens wurden isoliert und die Terminatorsequenz wurde bestimmt (15). Die potentiellen Aktivitäten des vermutlichen Promotorelements (MeA-5'-Sequenzen [MeA 5'] und die Terminator-MeA-3'-Sequenzen [MeA 3']) des F. bidentis MeA-Gens wurden in transgenen F. bidentis-Pflanzen unter Verwendung von GUS-Expressionsvektoren untersucht (16). Eine lange Version der MeA-3'-Terminatorsequenz (MeA 3'-L = 5,5 kb ausgehend vom Stoppcodon) wurde in diesen Experimenten verwendet. In 16 ist die GUS-Expressionskassette ME20 mit dem binären Vektor pGA470 ligiert (An et al., 1985), während ME29 in pGA482 (An, 1986) kloniert wurde. Die Pflanzen wurden mit diesen Vektoren gemäß der Beschreibung von Chitty et al. (1994) transformiert.
Die Untersuchung der GUS-Aktivität der transformierten Pflanzen durch histochemische Anfärbung und fluorimetrische Tests zeigte, dass die MeA-3'-Sequenz des Gens für eine hochgradige Expression von GUS in Blättern von transgenen F. bidentis-Pflanzen erforderlich ist (Tabelle 16). Die 5'-Sequenzen des Gens scheinen nicht zur Genexpression in Blättern beizutragen, scheinen jedoch die Expression in Meristemen und Stängeln in Gegenwart einer geeigneten Transkriptionterminations/Polyadenylierungssignalsequenz, wie OCS 3', zu dirigieren (Tabelle 16).
BEISPIEL 20
Verwendung der MeA-3'-Terminations/Polyadenylierungssignalsequenzen in SCSV-Promotorkonstrukten zur Verstärkung der Genexpression in monocotylen Pflanzen
Da die meisten Genkontrollelemente am 5'-Ende lokalisiert sind, wird die Aktivität der MeA-3'-Sequenz in Verbindung mit dem S4nc-SCSV-Promotor im Hinblick auf eine Verstärkung der durch die SCSV-Promotoren dirigierten Genexpression getestet. Für diese Experimente wurde eine kurze Version der MeA-3'-Terminatorsequenz (MeA 3'S; 900 Basen ausgehend vom Stoppcodon) verwendet, um GUS-Expressionsvektoren herzustellen, die den S4nc-Promotor mit entweder der OCS-3'-, SCSV-Segment-5-3'- (SC5Tr) oder der MeA-3'-Transkriptionsterminations/Polyadenylierung-Signalsequenz enthalten. Diese Konstrukte wurden von dem bereits beschriebenen promotorlosen GUS-Plasmid pKGO abgeleitet, und das rekombinante Plasmid pBS237, das das S4nc:GUS:MeA3'-Konstrukt enthält, ist in 17 dargestellt. Die durch diese Konstrukte verliehene GUS-Aktivität wurde in Japonica-Reis-Callus cv. Taipei 309 getestet. Die Konstrukte wurden in Reiscalli durch Teilchenbeschuss unter Verwendung des Bio-Rad Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System (Bio-Rad Laboratories) eingeführt und mit Ergebnissen, die in Dicotylengeweben, wie Sojabohnenblättern und Tabakprotoplasten, erhalten wurden, verglichen (Tabelle 17). Für Reis-Teilchenbeschussexperimente wurden 4 mg von 1 μm und 5 μm Goldteilchen im Verhältnis von 1 : 1 plus 5 μg DNA in einem Volumen von insgesamt 50 μl auf sechs Calliplatten geschossen. Die DNA wurde in einem Molverhältnis von 4 : 1 von jedem der das GUS-Gen enthaltenden Vektoren zu dem das selektierbare Markergen enthaltenden Vektor hergestellt. Der den selektierbaren Marker enthaltende Vektor war pTRA151 (Zheng et al., 1991). Jede Platte enthielt 50–100 von reifen Embryos stammende frische Sekundärcalli. 40 h nach dem DNA-Beschuss wurde die GUS-Aktivität durch Plazieren der Calli in 0,3% (Gew/V) X-Gluc-Lösung, in 100 mM Phosphatpuffer, erfasst. Blaue Flecken wurden nach einer Inkubation über Nacht gezählt.
Für die transiente GUS-Expression in Tabak und Sojabohnen wurden nur die GUS-Konstrukte in Protoplasten bzw. Blattgewebe eingeführt. Nach der Elektroporation wurden die Tabakprotoplasten wie bereits beschrieben auf GUS-Aktivität getestet. Die Konstrukte wurden in Sojabohnengewebe durch Teilchenbeschuss, wie im vorhergehenden beschrieben, eingeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass in den monocotylen Reisgeweben mit dem MeA-3'-Konstrukt im Vergleich zum SCSV-Terminator eine 16-fach höhere Aktivität erhalten wurde (Tabelle 17). In ähnlichen Experimenten besitzt ein stark exprimiertes GUS-Konstrukt, das die Ubiquitin-Promotor:GUS:NOS-Kassette (Christensen et al., 1992) enthält, eine etwa 4-fach höhere Aktivität als das SC4:GUS:MeA3'-Konstrukt.
Bei den dicotylen Geweben wurden ähnliche Aktivitäten mit beiden dieser Konstrukte in Tabakprotoplasten und Sojabohnenblättern erhalten. Jedoch zeigten beide eine 2-fach höhere Aktivität als die mit dem OCS-Terminator in Tabakprotoplasten erhaltene (Tabelle 17).
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die MeA3'-Sequenz zum Ermöglichen der durch SCSV-Promotoren dirigierten Genexpression in Monocotyledonen verwendet werden kann.
BEISPIEL 21
Verwendung von SCSV-Promotoren und Terminatoren enthaltenden neuen Vektoren zum Treiben eines selektierbaren Markergens in transgenen Pflanzen
Die Eignung der Verwendung von SCSV-Promotoren zum Treiben eines selektierbaren Markergens als Basis der Selektion transgener Pflanzen nach der Transformation und Regeneration wurde in Tabakpflanzen getestet. Der verwendete selektierbare Marker ist das Kanamycin-Resistenzgen nptII. Binäre Vektoren, die entweder ein SCSV-Segment 1 (pBS246) (18) oder einen SCSV-seg-7-Promotor (pKHAN4) (19) an das nptII-Gen fusioniert enthielten, wurden aus pART27 (Gleave, 1992) bzw. pKSB.Bar1 (19) konstruiert. Diese wurden getrennt in Tabakpflanzen transformiert (Ellis et al., 1987), und vermutliche transgene Pflanzen wurden unter Kanamycinselektion unter Verwendung von 100 μg/ml Kanamycin selektiert (20). Die Kanamycinresistenz wurde in den transgenen Pflanzen durch Dot-Blot-Test der nptII-Genaktivität (McDonnell et al., 1987) und Überleben der transgenen Pflanzen unter 100 μg/ml Kanamycin in einem Wurzelbildungsmedium festgestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass das gebildete SCSV-Segment-Promotor-Konstrukt mindestens so viele Kanamycin-resistente Pflanzen wie die Verwendung des 35S-Promotor-Konstrukts in dem gleichen Experiment ergab und daher ebenso wirksam wie der 35S-Promotor für die Selektion transgener Tabakpflanzen auf der Basis der Kanamycinresistenz ist (Tabelle 18). Mit pKHAN4 transformierter Tabak ist gegenüer 100 μg/ml Kanamycin in Regenerationsmedium und 50 μg/ml Kanamycin in Wurzelbildungsmedium resistent. Die Restriktionskarten von pKSB.Bar1 und pKHAN2, die zur Herstellung von pKHAN4 verwendet wurden, sind in 19 angegeben.
BEISPIEL 22
Entwicklung eines neuen Pflanzengenexpressionsvektorsystems
Ein neuer Expressionsvektor, der einen SCSV-Segment-4-Promotor und einen SCSV-Segment-5-Terminator umfasst, der jedes interessierende verwendbare Gen treibt, (pICAN 1) (21) wurde aus einem pGEM-Derivat konstruiert, und die gebildete Expressionskassette kann in die binären Vektoren pBS246 und pKHAN4 insertiert werden. Die gebildeten binären Vektoren können dann zur Transformation von Pflanzen von wirtschaftlicher Bedeutung, insbesondere Baumwolle, Kleegras (Subclover), Kartoffeln und Weißklee unter Kanamycinselektion verwendet werden. Andere binäre Vektoren können aus unterschiedlichen Kombinationen von SCSV-Promotoren und -Terminatoren konstruiert werden, wobei ein gesamter Bereich eines binären Vektorsystems zur Pflanzengenexpression erhalten wird.
TABELLE 9 GUS-Aktivität des SCSV-Segment-7-Promotor: GUS-Konstrukts in primären transgenen Acker-Kleegras-Pflanzen (To)
Die Pflanzen wurden zwei Monate nach der Übertragung der Pflanzen von der Gewebekultur ins Treibhaus analysiert. Die Basta (Phosphinothricin – [PPT])-Resistenz wurde durch Aufstreichen von Basta mit 1 g PPT/l auf vollständig entfaltete junge Blätter und Feststellen der Reaktion nach einer Woche getestet.
R Keine Schädigung;
MR Mäßige Schädigung des Blatts;
S Totes Blatt
N. d. Nicht bestimmmt
TABELLE 10 Durch den SCSV-Segment-2-Promotor gesteuerte GUS-Aktivität bei Tabakprotoplasten im Vergleich zum 35S-Promotor
TABELLE 11 Vermutliche Polyadenylierungs- und Terminationssignale in SCSV-DNA-Komponenten
TABELLE 13 Fluorimetrischer GUS-Test einer unabhängigen T1-Generation von transgenen Acker-Kleegras-Pflanzen, die entweder das S7nc:GUS- oder das 35S:GUS-Konstrukt exprimieren
Die Pflanzen waren beim Test 2–3 Monate alt.
Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Expression in verschiedenen Geweben.
TABELLE 14 Verteilung der GUS-Aktivität in einer transgenen Acker-Kleegras-Pflanze der T1-Generation, die das S7nc:GUS-Konstrukt exprimiert
Die Pflanzen waren beim Test 2–3 Monate alt.
Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Expression in verschiedenen Geweben. TABELLE 15 Durch einen SCSV-Promotor dirigierte transiente Expression von GUS in Sojabohnenblättern

Konstrukte GUS-Expression in Sojabohnenblättern (Zahl der Flecken/Blatt)

S4nc:GUS:SC5Tr 25–35

35S:GUS:35STr 10–15
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Sequenzprotokoll

Claims

Genkonstrukt, das einen Circoviruspromotor von einem Circovirus, das ein Mehrkomponenten-DNA-Genom umfasst, wobei der Promotor in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist, und ein heterologes Gen, das funktionell mit dem Promotor verbunden ist, umfasst.
Genkonstrukt nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen an einer Endonuclease-Schnittstelle stromabwärts des Promotors insertiert ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Circovirusgenom mehr als zwei DNA-Komponenten oder -Segmente umfasst.
Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Circovirus aus der aus Subterranean Clover Stunt Virus (SCSV), Banana Bunchy Top Virus (BBTV), Milk-Vetch Dwarf (MDV) und Fuba Bean Necrotic Yellow Virus (FBNYV), bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 4, wobei das Circovirus Subterranean Clover Stunt Virus (SCSV) ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 5, wobei der Promotor aus einem der SCSV-Segmente 1 bis 7 (SEQ ID NO: 1 bis 7) ausgewählt ist oder mit diesem unter wenig stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
Genkonstrukt nach Anspruch 6, wobei der Promotor aus einem der SCSV-Segmente 1, 3–5 und 7 (SEQ ID NO: 1, 3–5 und 7) ausgewählt ist oder mit diesem unter wenig stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das ferner eine Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz umfasst, wobei die Sequenz mit dem heterologen Gen funktionell verbunden ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 8, wobei die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz von SCSV-Herkunft ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz aus einem der SCSV-Segmente 1 bis 7 (SEQ ID NO: 1 bis 7) ausgewählt ist oder mit diesem unter wenig stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
Genkonstrukt nach Anspruch 8, wobei die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz aus dem Flaveria bidentis-MeA-Gen stammt.
Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Konstrukt zwei heterologe Gene, die funktionell mit dem gleichen oder unterschiedlichen Circoviruspromotoren verbunden sind, umfasst.
Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei das Konstrukt zwei heterologe Gene, von denen jedes mit dem gleichen oder einem unterschiedlichen Circoviruspromotor funktionell verbunden ist, und eine Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz, die gleich oder unterschiedlich sein kann, die funktionell mit einem oder beiden der heterologen Gene verbunden ist, umfasst.
Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das oder jedes heterologe Gen ausgewählt ist aus: a) einem Resistenzgen gegenüber Pflanzenviren, Bakterien, Pilzen, Nematoden und anderen Pathogenen; b) einem Pflanzenvirusresistenzgen, das Resistenz gegenüber einem Virus verleiht, das aus Alfalfa Mosaic Virus, Subterranean Clover Stunt Virus, Subterranean Clover Mottle Virus, Subterranean Clover Red Leaf Virus, Potato Leafroll Virus, Tomato Spotted Wilt Virus, Bean Yellow Mosaic Virus, White Clover Mosaic Virus, Clover Yellow Vein Virus, Potato Viruses x, y, s, m und a, Cucumber Mosaic Virus, Rice Ragged Stunt Virus und Barley Yellow Dwarf Viruses ausgewählt ist; c) einem Gen zur Verbesserung des Nährwerts von Pflanzen; d) einem Blähresistenzgen; e) einem Antikörpergen; f) einem Getreide-Thionin- und Ribosomeninaktivierungsproteingen; g) einem Insektenresistenzgen; h) einem Gen eines selektierbaren Markers; i) einem Reportergen; j) einem Gen mit Codierung für ein regulatorisches Protein, das die Expression eines Gens in Pflanzenzellen moduliert.
Genkonstrukt nach Anspruch 14, wobei: (i) das Gen zur Verbesserung des Nährwerts von Pflanzen das Sunflower High Sulphur-Gen SF8 ist; (ii) das Insektenresistenzgen ein BT-Toxingen oder Proteinaseinhibitorgen von Nicotiana alata ist; (iii) das Gen eines selektierbaren Markers ein Resis tenz gegenüber Kanamycin, Phosphinothricin, Spectinomycin und Hygromycin verleihendes Gen ist; (iv) das Reportergen ein GUS-, CAT- und Pigmentgen ist.
Genkonstrukt, das zwei oder mehrere heterologe Gene umfasst, die funktionell mit den gleichen oder unterschiedlichen in einer Pflanzenzelle funktionsfähigen Circoviruspromotoren verbunden sind, wobei jeder Cicoviruspromotor aus einem Circovirus stammt, das ein Mehrkomponenten-DNA-Genom umfasst und in einer Pflanzenzelle funktionsfähig ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 16, wobei der Promotor wie ferner in einem der Ansprüche 3 bis 7 definiert ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 16 oder 17, das ferner eine Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz, die funktionell mit einem oder mehreren der heterologen Gene verbunden ist, umfasst.
Genkonstrukt nach Anspruch 18, wobei die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenz wie in einem der Ansprüche 9 bis 11 definiert ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenzen für jedes Gen die gleichen sind.
Genkonstrukt nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Terminations- und/oder Polyadenylierungssequenzen für jedes Gen unterschiedlich sind.
Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei die heterologen Gene ausgewählt sind aus der Gruppe von: a) einem Resistenzgen gegenüber Pflanzenviren, Bakterien, Pilzen, Nematoden und anderen Pathogenen; b) einem Pflanzenvirusresistenzgen, das Resistenz gegenüber einem Virus verleiht, das aus Alfalfa Mosaic Virus, Subterranean Clover Stunt Virus, Subterranean Clover Mottle Virus, Subterranean Clover Red Leaf Virus, Potato Leafroll Virus, Tomato Spotted Wilt Virus, Bean Yellow Mosaic Virus, White Clover Mosaic Virus, Clover Yellow Vein Virus, Potato Viruses x, y, s, m und a, Cucumber Mosaic Virus, Rice Ragged Stunt Virus und Barley Yellow Dwarf Viruses ausgewählt ist; c) einem Gen zur Verbesserung des Nährwerts von Pflanzen; d) einem Blähresistenzgen; e) einem Antikörpergen; f) einem Getreide-Thionin- und Ribosomeninaktivierungsproteingen; g) einem Insektenresistenzgen; h) einem Gen eines selektierbaren Markers; i) einem Reportergen; j) einem Gen mit Codierung für ein regulatorisches Protein, das die Expression eines Gens in Pflanzenzellen moduliert.
Genkonstrukt nach Anspruch 22, wobei: (i) das Gen zur Verbesserung des Nährwerts von Pflanzen das Sunflower High Sulphur-Gen SF8 ist; (ii) das Insektenresistenzgen ein BT-Toxingen oder Proteinaseinhibitorgen von Nicotiana alata ist; (iii) das Gen eines selektierbaren Markers ein Resistenz gegenüber Kanamycin, Phosphinothricin, Spectinomycin und Hygromycin verleihendes Gen ist; (iv) das Reportergen ein GUS-, CAT- und Pigmentgen ist.
Verfahren zur Expression eines Fremdgens in einer Pflanzenzelle, das das Einführen eines Genkonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 23 in die Pflanzenzelle umfasst.
Transgene Pflanze, die das Genkonstrukt von einem der Ansprüche 1 bis 23 umfasst.