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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue induzierbare Promotoren von
Pflanzen sowie ihre Verwendung bei der gesteuerten Expression von
heterologen Genen.
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Das
Ziel gentechnischer Arbeiten bei Kulturpflanzen besteht darin, ein
Gen, das die Eigenschaften einer Pflanze verändert (bzw. mehrere Gene, die
die Eigenschaften einer Pflanze verändern), zu insertieren, ohne
daß andere,
wünschenswerte
Elemente des Genotyps der ursprünglichen
Pflanze verändert
werden. Auf diese Weise läßt sich
das Erbgut von Kulturpflanzen vergrößern, so daß es auch Gene beinhaltet,
die nicht Bestandteil des ursprünglichen
Gen-Pools sind und die mit traditionellen Pflanzenzüchtungsmethoden
nicht verfügbar
sind. Ein wichtiger Aspekt von solch einer Modifikation ist die
Wahl des Promotors. Im Prinzip ermöglicht die Identifikation und
Charakterisierung von Promotoren, chimäre Gene zu konstruieren, in
denen ein Promotor von einem Gen für das Vorantreiben der Expression
eines von einem anderen Gen codierten Proteins unter Bedingungen
und an Orten innerhalb der Pflanze, die vom Promotor bestimmt werden,
verwendet werden kann.
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Promotoren
enthalten häufig
Elemente, die von induzierbaren Faktoren, welche die zeit- und gewebespezifischen
Expression von Genen regulieren, erkannt werden. Bei diesen Elementen
handelt es sich typischerweise um kurze Sequenzen, die in den Promotoren
von vielen, ja vielleicht sogar allen, Genen, die auf das gleiche
Signal reagieren, vorkommen. So wurde in Pflanzen dadurch, daß Promotoren
von Genen, die durch das Pflanzenhormon Abszillinsäure hinauf
reguliert werden, analysiert wurden, ein Element CCACGTT identifiziert,
das diesen Promotoren gemeinsam ist (Marcotte et al., Plant Cell
1 969–976
(1989) und Pla et al., Plant Mol. Biol. 21 259–266 (1993)). Ähnlich enthalten
Promotoren, die auf Ethylen reagieren, die PR-Box AGCCGCC (Broglie
et al., Plant Cell 1 599–607
(1989) und Deickman et al., Plant Physiol. 100 2013–2017 (1992)).
Weiterhin kann man dadurch, daß man über eine
Auswahl von solchen Reaktionselementen verfügt, einem Promotor entweder
die Fähigkeit,
die Genexpression als Reaktion auf ein beliebiges Signal von mehreren
Signalen voranzutreiben, oder das Vorliegen einer synergistischen
Verstärkung
der Expression als Reaktion auf mehrere Signale verleihen. In Tabelle
1 sind verschiedene Consense-Reaktionselementsequenzen, die
bei Pflanzen identifiziert wurden, angeführt. Promotor-Reaktionselemente Tabelle
1
![Figure 00020001](https://patentimages.storage.***apis.com/3f/82/12/0d9f783c0cdd2a/00020001.png)
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Es
ist daher aus der DNA-Sequenz von Promotoren möglich, die Umstände, unter
denen ein Promotor exprimiert werden wird, dadurch vorherzusagen,
daß man
nach bereits identifizierten Reaktionselementen innerhalb der Sequenz
sucht. Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit solchen induzierbaren
Promotoren.
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Bis
jetzt wurde die Expression von Fremdproteinen in transgenen Pflanzen
von einem "konstitutiven" Promotor, wie Cauliflower
mosaic virus 35S (CaMV 35S), vorangetrieben. Die Verwendung solch
eines Promotors für
kommerzielle Zwecke ist dann eingeschränkt, wenn der Promotor für das Vorantreiben
der Synthese eines toxischen Proteins oder von Proteinen, die die
Pflanze stoffwechselmäßig stark
belasten, verwendet wird. Diese Probleme können dann überwunden werden, wenn sich
die Expression des Zielproteins unter der Kontrolle eines induzierbaren
Promotors befindet, und zwar entweder kurz vor oder kurz nach der
Ernte.
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Es
sind bereits verschiedene pflanzliche Promotoren vorgeschlagen worden,
die sich für
die chemisch regulierte Expression von Transgenen eignen sollen
(Gatz, C (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 48,
89–108).
Diese Promotoren können
durch Safener oder Elizitoren oder Chemikalien, die eine Wundreaktion
vermitteln, oder Chemikalien, die die systemische erworbene Resistenz
(systemic acquired resistance, SAR) induzieren, induziert werden.
Am intensivsten untersucht sind Promotoren, die durch Safener oder
durch Chemikalien, die die SAR induzieren, induziert werden. So
beschreiben z.B. WO 93/01 294 und Jepson et al., (1994) Plant Mol.
Biol. 26, 1855–1866
die Isolation eines Glutathion-S-Transferasegens (GST-27), das durch den
Safener N,N-Diallyl-2,2-dichloracetimid
induziert werden kann. Die Anwendungen dieses Promotors sind jedoch
insofern beschränkt,
als der Promotor konstitutiv in Wurzeln exprimiert wird.
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Das
Phänomen
der systemischen erworbenen Resistenz (SAR) nach Infektion einer
Pflanze mit pathogenen Mikroorganismen ist seit langem anerkannt.
Wird eine Pflanze von einem möglichen
Pathogen, das von der Pflanze erkannt werden kann, befallen, so
wird eine Resistenzreaktion aktiviert. Bei dieser Reaktion, die
als inkompatible Interaktion bekannt ist, treten typischerweise
durch Hypersensitivität
verursachter Zelltod an der Stelle des Eindringens des Pathogens,
Phytoalexinsynthese, die Produktion aktiver Sauerstoffspezies, Verstärkung der
Zellwand, lokale Induktion von Abwehrgenen sowie die Anhäufung von
Salicylsäure
(SA) auf. Ausgehend von dieser lokalen Reaktion etabliert sich die
SAR überall
in der Pflanze. Die SAR ermöglicht
es nichtinfiziertem Gewebe, rascher auf weitere Infektionen zu reagieren,
und diese Resistenz wirkt gegen verschiedene mögliche Pathogene. Das erste
Auftreten und die Etablierung der SAR werden von der Synthese mehrerer
relativ unverwandter Proteine, die unter der Bezeichnung PR-Proteine
(pathogenesis-related proteins) bekannt sind, begleitet.
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Es
ist seit langem bekannt, daß die
Behandlung von Pflanzen mit SA oder Acetyl-SA (Aspirin) eine Resistenz
gegen Pathogene induzieren kann (White, R.F. (1979), Virology 99,
410–412).
Die neuesten Forschungsergebnisse haben gezeigt, daß die SA
sowohl bei der lokalen als auch bei der systemischen Induktion von
PR-Proteinen und
der Etablierung der SAR eine Schlüsselrolle spielt (Malamy et
al., (1990) Science 250, 1002–1004;
Metraux et al., (1990) Science 250, 1004–1006; Yalpani et al., (1991):
Plant Cell 3, 809–818).
Außerdem
sind die SAR und die Anhäufung
von PR-Protein bei Pflanzen kompromittiert, die eine bakterielle
Salicylat-Hydroxylase (die SA in Catechol umwandelt) konstitutiv
exprimieren, was ebenfalls für
eine Rolle der endogenen SA bei diesen Vorgängen spricht (Gaffney et al.,
(1993) Science 261, 754–756).
Die Spritzbehandlung, Injektion oder Ernährung von Pflanzen über das
Wurzelsystem mit SA induziert die Expression von PR-Gen-Promotoren
stark über
das 50–1000-fache
der Basalaktivität
(z.B. Mur et al., (1996) Plant J. 9, 559–571). Da die für diese
Untersuchungen verwendete SA-Konzentration jedoch cytotoxisch ist
(typischerweise 1–2
mM), wurden zahlreiche Versuche unternommen, um weniger schädigende
Verbindungen zu identifizieren, die die SA nachahmen.
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Eine
bestimmte Verbindung, nämlich
BTH (Benzo(1,2,3)thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester), ist bereits
als "Kulturpflanzen-Enhancer" im Handel erhältlich und
für die
großflächige Ausbringung
auf dem Feld verfügbar
(Gorlach et al., (1996) Plant Cell 8, 629–643). Eine wäßrige Lösung von
1,2 μm BTH
reicht aus, um die PR-Gen-Expression zu induzieren (Friedrich et
al., (1996) Plant J. 10, 61–70).
Im Handel erhältliche BTH-Präparate reichen
aus, um bei allen geprüften
Pflanzen, darunter auch Arabidopsis und Weizen, eine sehr starke
PR-Gen-Expression zu induzieren.
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Die
Geninduktion nach BTH-Spritzung erreicht zwei Tage nach der Ausbringung
ein Maximum und hält mindestens
10 Tage lang an. Obwohl dadurch eine verstärkte Resistenz in dem behandelten
Gewebe induziert wird, ist der Wirkungsmechanismus unbekannt, und
man weiß auch
nicht, ob diese Verbindung alle Auswirkungen der SA, wie Potenzierung
der Geninduktion oder den pathogeninduzierten "oxidative burst" nachahmen kann.
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Eine
mögliche
Quelle für
induzierbare Promotoren ist daher die mit der Pathogenese in Zusammenhang
stehende (pathogenesis-related, PR) "Familie" von mit der Abwehr in Zusammenhang
stehenden Genen. Bei den PR-Genen handelt es sich um eine vielfältige Gruppe
von Proteinen, von denen einige (z.B. die Klassen PR-2 und PR-3)
bekante Funktionen als Chitinasen oder Beta-1,3-glucanase ausüben. Andere (z.B. die Klassen
PR-1 und PR-5) werden während
der Pflanzen-Pathogen-Reaktion induziert, üben jedoch keine klar identifizierbare
Funktion aus. Typischerweise gehören
zu den PR-Proteinen
von jeder Klasse solche mit saurem pH und solche mit basischem pH.
Obwohl es Ausnahmen zu dieser Regel gibt, sind die basischen PR-Proteine
tendenziell an einer Stelle innerhalb der Zelle lokalisiert (z.B.
der Vakuole), während
die sauren PR-Proteine sezerniert werden.
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Pflanzen
müssen
auch auf verschiedene andere Arten von Umweltstreß reagieren,
darunter Wasserstreß,
mechanische Verwundung und Verwundung durch Pflanzenfresser, UV-Licht-
und Oxidationsstreß sowie
hohe und niedrige Temperaturen. Bei manchen dieser Bedingungen werden
die PR-Gene hinauf reguliert. So wird die Expression des Tabak-Osmotins
(eines basischen, in der Vakuole lokalisierten PR-5-Gens) nicht nur
durch Provokation durch Pathogene induziert, auch durch Salzstreß (Grillo
et al., Physiologia Plantarum 93 498–504 (1995)). Die Expression
von PR-1a wird im Anschluß an
Behandlung mit Wasserstoffperoxid (das Oxidationsstreß induziert)
und in Pflanzen, die unter UV-Streß leiden, induziert (Yalpani
et al., Planta 193 372–376
(1994)). Den Reaktionen auf Verwundung und auf Provokation durch
Pathogene sind mehrere ähnliche
Merkmale gemeinsam, darunter die Expression von Abwehrgenen und
das Auftreten einer systemischen Reaktion, die durch bewegliche
Signale vermittelt wird. Im allgemeinen reagieren die basischen
PR-Proteine auch auf Reize, die durch Verwundung ausgeübt werden.
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Es
wurden verschiedene Elemente, die in den PR-Gen-Promotoren vorliegen, identifiziert.
Das PR-2d-Gen (das für
eine b-1,3-Glucanase codiert) aus Tabak wird nach Provokation des
Tabakmosaikvirus (TMV) in Gewebe, in dem eine Hypersensitivitätsreaktion
(HR) stattfindet, exprimiert und wird durch exogene SA induziert
(Shah et al., Plant J. 10 1089–1101
(1996)). Die Region –364
bis –288
in dem PR-2d-Promotor vermittelt Ansprechen auf SA, und ein 25 Bp
Element in dieser Region wird von Zellkernfaktoren des Tabaks erkannt.
Ein auf SA reaktionsfähiges
Element wurde auch vom CaMV-35S-Promotor
in Position –90
bis –46 isoliert.
Das Element entspricht einer as-l1-Stelle (Qin et al., Plant Cell
6 863–874
(1994)). Im β-1,3-Glucanasepromotor
der Gerste ist die Sequenz TCATCTTCTT mehrmals wiederholt; sie liegt
in über
30 streßinduzierten
Genen vor (Goldsbrough et al., Plant J., 3(4):563–571 (1993b)).
Diese Region bindet 40 kDa Zellkernproteine des Tabaks, deren Bindung
in mit SA behandelten Pflanzen erhöht ist. Von Buttner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 5961–5966 (1997) haben gezeigt,
daß Arabidopsis-Proteine, die ein
auf Ethylen reaktionsfähiges
Element binden, an die PR-Box binden und daß die PR-Box und die G-Box
synergistisch wirken.
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Die
PR-1-Gene wurden ziemlich genau untersucht, und der Promotor eines
dieser Gene, nämlich PR-1a
aus Tabak, wurde als geeigneter induzierbarer Promotor vorgeschlagen
(EP 0 332 104-A2). Tabak-PR-1a wird sowohl in lokal infiziertem
Gewebe als auch später
während
des Auftretens der SAR exprimiert. Die Infektion von Tabakpflanzen
der Sorte Samsun NN führt
daher zur Anhäufung
von endogenen PR-1-Proteinen, und zwar sowohl in inokulierten Blättern (ungefähr 4 Tage
nach der Infektion) als auch später (ungefähr 8 Tage
später)
in oberen, nicht infizierten Blättern
an der gleichen Pflanze. Es wurde auch über die lokale (ungefähr 12 Stunden
nach der Inokulation) und systemische (3–7 Tage) Induktion der PR-1a-GUS-Expression in mit
Pseudomonas syringae p.v. syringae infiziertem Tabak berichtet (Bi
et al., (1995) Plant J. 8:235-245; Mur et al., (1996) Plant J. 9:559–571). Die
direkte Behandlung mit SA induziert eine starke PR-1a-Promotor GUS-Expression
in transgenem Tabak (Bi et al., supra). Die SAR-Induktoren BTH und
INA induzieren ebenfalls eine starke endogene PR-1a- sowie PR-1a-GUS-Expression.
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Verwunden
induziert ebenfalls eine leichte Steigerung der PR-1a-GUS-Expression
(Darby, R., Unpublished observations. Ohshima et al., (1990) Plant
Cell 2, 95–106).
Wie auch bei anderen PR-1-Proteinen der Fall findet bei PR-1a eine
entwicklungsregulierte Expression statt. So wird die PR-1a-GUS also
in den Blättern, Petiolen,
der Stengelrinde, den Pollen und den Sepalen von blühendem Tabak
exprimiert (Uknes et al., Plant Cell 5(2):159–169 (1993)). Die PR-1a-GUS
wird auch in Wurzeln exprimiert (Kenton, P; persönliche Mitteilung).
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Der
PR-1a-Promotor wurde intensiv untersucht. Van de Rhee und Bol (Plant
Mol. Biol., 21(3):451–461 (1993b))
haben vier Regulationselemente im PR-1a-Promotor identifiziert,
die alle für
eine maximale Aktivität erforderlich
waren und von denen kein Element allein fähig war, eine Promotoraktivität zu vermitteln.
Der PR-1a-Promotor enthält
mehrere Elemente, die GT-1-artige
sowie Mybl-Transkriptionsfaktoren binden (Buchel et al., Plant Mol.
Biol., 30(3):493–504
(1996)). Außerdem
induzieren die SA und aktive Analoga nicht nur die Expression von
PR-Genen, sondern auch von mybl.
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Die
Tatsache, daß das
PR-1a-Gen stark auf SA anspricht und daß eine Behandlung oder eine
Infektion mit SA zu sehr hohen PR-1α-GUS-Expressionsniveaus führt, könnte zur
unerwünschten
Expression einer Fusion zwischen einem PR-1a-Promotor und einem
Gen führen,
und zwar deshalb, weil die endogenen SA-Spiegel gestört werden,
(z.B. durch eine Veränderung
im Redox-Status). Das könnte
seine Nützlichkeit
für das
Vorantreiben von Genen, deren Produkte entweder in großen Mengen
toxisch sind oder den pflanzlichen Stoffwechsel stark belasten,
einschränken.
Schließlich
weisen die PR-1-Gene im allgemeinen und PR-1a im besonderen eine
starke konstitutive/entwicklungsregulierte Expression auf, insbesondere
während
der Blüte. Auch
hier könnte
dies zu einer starken unplanmäßigen Expression
von Transgenen, die von PR-1a-Promotor vorangetrieben werden, führen.
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Die
PR5-Proteine, eine weitere Klasse der PR-Proteine, lassen sich in
zwei Gruppen unterteilen, nämlich
die sauren extrazellulären
thaumatinartigen Proteine und die basischen intrazellulären Osmotine.
Traditio nellerweise sind die Osmotine mit abiotischem Streß assoziiert
worden. Diese osmotisch induzierte Expression ist jedoch typischerweise
zusätzlich
zu einer starken konstitutiven Expression (Stintzi et al., Biochimie, 75:687–706 (1993);
Leone et al., Plant Physiol., 106:703–712 (1994); Van Kan et al.,
Plant Mol. Biol., 27:1205–1213
(1995)) und einer starken entwicklungsregulierten Expression (Linthorst,
Crit. Rev. Plant Sci., 10:123–150
(1991); Stintzi et al., Physiol. Mol. Plant Pathol. 38 137–146 (1991);
Raghothama et al., Plant Mol. Biol. 34:393–402 (1997)). Die Expression
der Osmotine ist ebenfalls als Reaktion auf Streß wie Austrocknen, Verwunden,
niedrige Temperaturen (Raghothama et al., Plant Mol. Biol. 23:1117–1128 (1993);
Grillo et al., (1995) supra; Zhu et al., Plant Mol. Biol., 28:17–26 (1995b))
sowie chemische Faktoren wie Ethylen (beim Tabak, Raghothama et
al., 1993, supra; Chang et al., Physiologia-Plantarum, 100:341–352 (1997))
und Cytokinine (Thomas & Bohnert,
Plant Physiol., 103:1299–1304
(1993)) erhöht.
Eine Provokation durch Pathogene induziert ebenfalls die Expression
von Osmotinen (Zhu et al., Plant Physiol., 108:929–937 (1995a);
(1995b), supra; Chang et al., (1997), supra), die bei einigen Osmotinen
systemisch (Zhu et al., (1995b), supra) bzw. für andere lokal sein kann (Zhu
et al., (1995a), supra). Bei den Osmotingenen handelt es sich offenbar
nicht um ideale Ausgangsmaterialien für induzierbare Promotoren.
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Im
Gegensatz zu den Osmotinen, die in der Vakuole lokalisiert sind,
werden die sauren PR-5s (aPR-5) sezerniert, und es fehlt ihnen die
Verlängerung
am C-terminalen
Ende, bei der es sich um ein Targeting-Signal für die Vakuole handeln kann
(Linthorst, (1991), supra; Stintzi et al., (1993), supra). Es wurde
gezeigt, daß die aPR5-Proteine
bei Angriff durch Pathogene angehäuft werden, so z.B. bei der
Gerste (Bryngelsson & Green, Plant
Mol. Plant Path., 35:45–52 (1989):
Boyd et al., Plant Mol. Plant Path., 45:47–58 (1994); Reiss & Bryngelsson,
Physiol. Mol. Plant Path., 43:331–341 (1996); Schweizer et al.,
Plant Physiol., 114:73–88
(1997); Vale et al., Physiol. Mol. Plant Path., 44:207–215 (1994))
und beim Weizen (Rebmann et al., Plant Mol. Biol., 17:283–285 (1991)).
Mit Western-Blots
konnten Stintzi et al. (1991) keine aPR-5 an gesunden Tabakblättern nachweisen,
während
Osmotin quantitativ exprimiert wurde. Nach Provokation mit TMV tritt
aPR-5 nach 4–6 Stunden
auf, während
Osmotin 2–4
Stunden nach der Inokulation in Mengen über dem Basalniveau angehäuft wird
(Stintzi et al., 1991). Bei mit TMV infiziertem Tabak wurde aPR-5
in extrazellulären
taschenartigen Strukturen zwischen den Mesophyllzellen nahe der
Infektionsstelle lokalisiert (Dore et al., Arch. Virol., 120:97–107 (1991)).
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Auch
mit zahlreichen anderen Behandlungen wurde die Expression von extrazellulären aPR-5-Proteinen
induziert. Bei der Sonnenblume werden extrazelluläre aPR-5-Proteine
in Blattscheiben durch 5 mM Aspirin, 10 mM Ethephon, 10 mM NAA,
10 mM 2,4-D, UV-Licht, 5 mM MnCl2, 5 mM
HgCl3, 5 mM Citronensäure und 5 mM Oxalsäure induziert
(Jung et al., Journal of Plant Physiol., 145:153–160 (1995)). 1 ppm INA induziert Expression
eines Gersten-Homologs des thaumatinartigen Proteins aus Reis und
JA die Expression einer Gerste-aPR5 (Schweizer et al., (1997), supra).
aPR-5s werden auch in gegen niedrige Temperaturen abgehärtetem Winterroggen
exprimiert, wo sie eventuell eine Rolle bei der Vorbeugung von Eisschädigung spielen (Hon
et al., Plant Physiol., 109:879–889
(1995)).
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Es
gibt jedoch nur wenige Informationen über die Entwicklungsregulierungsexpression
von aPR-5s. Beim Mais ist die konstitutive Expression hauptsächlich auf
nichtembryonales Gewebe des sich entwickelnden Samens beschränkt und
erreicht 2 bis 4 Wochen nach der Bestäubung ein Maximum, ist jedoch
noch in ausgetrocknetem Samen nachweisbar. In Maisblättern wurde
nur eine leichte Expression nachgewiesen (Malehorn et al., Plant
Physiol., 106:1471–1481
(1994)). Ein thaumatinartiges Protein mit einer Größe von 29
kDa wurde in reifen Kirschenfrüchten
nachgewiesen (Fils-Lycaon et al., Plant Physiol., 111:269–273 (1996)).
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Über aPR-5-Promotoren
ist nur wenig bekannt, da nur ein Tabak-aPR-5-Promotor vom E2-Gen
isoliert, mit dem GUS-Reportergen
fusioniert und analysiert worden ist (Albrecht et al., (1992) Plant
Mol. Biol. 18, 155–158).
In dieser Untersuchung wurde gezeigt, daß TMV sowohl eine lokale als
auch eine systemische GUS-Aktivität induzierte, wobei die lokale
Reaktion die systemische Reaktion übertraf. Das bzw. die für die TMV-Induktion
dieses aPR-5 verantwortliche(n) Element(e) wurde(n) in der Promotorregion –1364 bis –718 entdeckt.
Mittels Nukleinsäure-Hybridisierung
wurde keine signifikante Homologie zwischen diesem PR-5-Promotor
von Tabak und PR-1a-Promotor gefunden.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung von neuen, nützlichen
induzierbaren Promotoren, mit denen manche oder alle Probleme des
Stands der Technik überwunden
werden, und zwar dadurch, daß ein
induzierbarer Promotor bereitgestellt wird, der auf niedrige Mengen
eines umweltfreundlichen nichtcytotoxischen Induktionsmittels, welches
sowohl unter Feldbedingungen als auch unter in-vitro-Bedingungen verwendet
werden kann, anspricht und der im Vergleich zu ähnlichen Promotoren auch nur
eine schwache umwelt- oder
entwicklungsinduzierte Expression und eine schwache pathogeninduzierte
systemische Aktivierung aufweist.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird also ein rekombinantes
oder isoliertes DNA-Molekül
bereitgestellt, das einen induzierbaren Genpromotor enthält, der
- i) durch Induktion mit pflanzlichen Regulatoren
die Expression eines 21,3 kDa großen Proteins in Asparagus officinalis
auf natürliche
Weise vorantreibt; oder
- ii) die Expression von Proteinen, die dem 21,3 kDa großen Protein
von Asparagus officinalis, von den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae
entsprechen, auf natürliche
Weise vorantreibt; oder
- iii) die Expression von Proteinen, die den Proteinen von i)
oder ii) im wesentlichen homolog sind, auf natürliche Weise vorantreibt; oder
- iv) unter stringenten Bedingungen mit einem beliebigen der Promotoren
i), ii) oder iii) hybridisiert.
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Der
in i) definierte Promotor stammt von einem thaumatinartigen mit
PR-5 verwandten Gen aus Asparagus officinalis (AoPRT-L) und ist
fähig,
die Expression von heterologen Genen in ein- und zweikeimblättrigen Pflanzen
voranzutreiben. pAoPRT-L weist über
die Verwendung der zuvor beschriebenen Promotoren bei der Expression
von heterologen Genen verschiedene Vorteile auf. In Tabelle 2 werden
die Eigenschaften des AoPRT-L Promotors mit den Eigenschaften von
PR1a und Osmotin verglichen. Tabelle
2 - Vergleich der Expressionsmuster von PR-1a, Osmotin und AoPRT-L
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Aus
diesen Werten sowie in den Beispielen angeführten Werten sieht man, daß
- 1) pAoPRT-L eine minimale entwicklungsregulierte
Expression aufweist,
- 2) pAoPRT-L im Gegensatz zu Tabak-pPR1a und aPR5-E2, durch Pathogeninfektion
nichtsystemisch aktiviert wird,
- 3) pAoPRT-L nicht auf ABA, Ethylen, Oxidationsstreß und osmotischen
Streß sowie
Verwundung anspricht,
- 4) pAoPRT-L-Expression durch SA und BTH (Novartis), einer Chemikalie,
die für
die Verwendung im Feld freigegeben ist, induziert wird.
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Aufgrund
dieser Eigenschaften ist der pAoPRT-L-Promotor eine aussichtsreiche
Möglichkeit
für die Expression
von Fremdproteinen in transgenen Pflanzen. Außerdem können auch geeignete Promotoren
gemäß ii) oder
iii) identifiziert werden, die die Expression von PR-Proteinen auf äquivalente
oder homologe Art und Weise wie das pAoPRT-L-Protein von Asparagus
officinalis in der Familie Liliaceae oder Amaryllidaceae oder überhaupt
in anderen Pflanzenfamilien vorantreiben.
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Der
Fachmann kann mit fachbekannten Techniken, wie z.B. im vorliegenden
Text beschrieben, leicht Proteine identifizieren, die zu dem AoPRT-L-Protein
von Asparagus officinalis oder äquivalenten
Proteinen von den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae im wesentlichen
homolog sind. Bei solchen Proteinen handelt es sich um Proteine,
die dem AoPRT-L-Protein funktionell äquivalent sind. Im wesentlichen
homologe Proteine sind daher vorzugsweise induzierbare PR-Proteine, die im
wesentlichen frei von systemisch aktivierter Expression und entwicklungsregulierter
Expression sind.
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Ein
wichtiger Vorteil der induzierbaren Promotoren der vorliegenden
Erfindung besteht darin, daß sie keine
entwicklungsregulierte und systemisch aktivierte Expression aufweisen.
Dies steht im Gegensatz zu den konstitutiven Promotoren, die üblicherweise
zum Vorantreiben der Expression von heterologen Genen in transgenen
Pflanzen verwendet werden, bzw. den induzierbaren Promotoren, die
ebenfalls entwicklungsmäßig oder aufgrund
von Pathogenbefall in der ganzen Pflanze aktiviert werden. Die Verwendung
eines induzierbaren Promotors, der nicht entwicklungsmäßig oder
systemisch aktiviert wird, ist ganz besonders für die Produktion von transgenen
Genprodukten von Pflanzen unter Feldbedingungen nützlich,
da dadurch das gewünschte
Produkt auf kontrollierte Art und Weise geerntet werden kann. Ein
Promotor, der nicht entwicklungsmäßig reguliert ist, ermöglicht nämlich die
Expression von Genen, deren Produkte für die Pflanze schädlich sein
können
bzw. die Wüchsigkeit
der Pflanze verringern. Würden
solche Produkte konstitutiv exprimiert werden, und zwar entweder in
der gesamten Pflanze oder in einem Großteil der Pflanze, oder zu
wichtigen Entwicklungsstadien, so kann dann die Pflanze Schaden
nehmen, sich abnormal entwickeln oder absterben. So existiert z.B.
bei Promotoren wie GST 27 und PR1a eine beträchtliche entwicklungsregulierte
Expression, die die Reihe der Transgene, die mit Hilfe dieser Promotoren
exprimiert werden können,
einschränkt.
Wo jedoch ein indizierbarer Promotor der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, kann jedoch ein beliebiges Gen exprimiert werden,
da die Gefahr der Genexpression zu ungünstigen Entwicklungsstadien
vermieden wird. Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Promotors,
der weiterhin nicht durch Pathogenbefall systemisch aktiviert wird,
vergrößert auch
das Spektrum der Gene, die von diesem Promotor aus exprimiert werden
können,
da eine ungeeignete Expression, die für die Pflanze schädigend sein
kann, unter Freilandbedingungen, wo die Pflanzen einem starken Befallsdruck durch
Pathogene ausgesetzt sind, vermieden wird. Kurz gesagt, und zusätzlich auch
aufgrund mangelnder Aktivierung als Reaktion auf Reize wie Oxidationsstreß und osmotischem
Streß,
ABA, Ethylen und Verwundung, ermöglicht
der AoPRT-L-Promotor eine verbesserte Kontrollierbarkeit der Expression
im Vergleich zu derzeit vorhandenen, von Pflanzen stammenden Promotoren,
die für
die chemisch induzierte Expression von Transgenen derzeit verwendet
werden bzw. eventuell in der Zukunft verwendet werden. Die Induzierbarkeit
des Promotors mit einer Chemikalie, die für die Verwendung in Freiland
freigegeben ist, ist ein weiteres Indiz für die Eignung des AoPRT-L-Promotors
für die
Expression von heterologen Genen in Freilandpflanzen.
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PR-Proteine
(pathogenesis related proteins) können im Rahmen der vorliegenden
Erfindung als diejenigen Proteine definiert werden, die in Pflanzen
als Reaktion auf Pathogene exprimiert werden. Eine Hypersensitivität gegenüber einem
Pathogen ist durch eine Lokalreaktion gekennzeichnet, zu der auch
die Nekrose der Gewebe, die die Infektionsstelle unmittelbar umgeben,
beinhaltet. Zu weiteren Merkmalen einer lokalen Hypersensitivitätsreaktion
zählen
die Synthese von Phytoalexinen, die Produktion von aktiven Sauerstoffspezies,
die Stärkung
der Zellwand, die lokale Induktion von Abwehrgenen sowie die Anhäufung von
Salicylsäure. Dies
steht im Gegensatz zu einer Sensitivitätsreaktion, bei der sich das
Pathogen in der ganzen Pflanze ausbreitet. Auf die lokale Hypersensitivitätsreaktion
kann sich die Induktion einer systemischen erworbenen Resistenz
(SAR) anschließen.
Diese Reaktion ermöglicht
es nicht-infiziertem
Gewebe, rasch auf erneute Invasion eines Pathogens zu reagieren.
PR-Proteine können
während
der Hypersensitivitätsreaktion
und zu Beginn der SAR exprimiert werden. Zu den Pathogenen, die
zur Expression von einem oder mehreren der PR-Proteine führen können, zählen z.B.
Viren oder Viroide, z.B. das Tabak- oder Gurkenmosaikvirus, Ringspotvirus,
Nekrosevirus, Pelargonium-Blattrollvirus, Rotklee-Mottle-Virus und ähnliche
Viren, Pilze, z.B. Phythopophthora parasitica oder Peronospora tabacina,
Bakterien wie z.B. Pseudomonas syringae oder Pseudomonas tabaci, oder
Blattläuse
wie Mycus persicae. Diese Aufzählung
ist jedoch nicht als vollständig
anzusehen, und die Hypersensitivitätsreaktion und SAR können durch
verschiedene andere Pathogene, die hier nicht erwähnt wurden,
induziert werden.
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Ein
PR-Protein kann mit Hilfe von beliebigen bekannten Vorgehensweisen
identifiziert werden. So kann z.B. ein PR-Protein dadurch identifiziert
werden, daß man
Proteine, die vor bzw. während
unterschiedlichen Stadien sowie nach der Infektion mit einem Pathogen isoliert
werden, vergleicht. PR-Proteine können auch aufgrund ihrer Homologie
mit bekannten PR-Proteinen, durch Promotoranalyse oder durch Funktionsanalyse
der Expressionsprodukte einer cDNA-Bibliothek identifiziert werden.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wäre
mit diesen Techniken sowie mit anderen geeigneten Techniken vertraut.
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Für die vorliegende
Erfindung kann die systemische Aktivierung eines Gens als Aktivierung
eines Gens vor oder während
der systemischen erworbenen Resistenzreaktion einer Pflanze zur
Pathogenresistenz definiert werden. Wie oben diskutiert werden solche
Gene typischerweise in nichtinfizierten Teilen einer Pflanze exprimiert,
genauer gesagt überall
in der Pflanze infolge der lokalen Reaktion einer Pflanze aufgrund
einer Infektion mit einem Pathogen. Solche Gene codieren üblicherweise
für Produkte,
die an der systemisch erworbenen Resistenz einer Pflanze gegen Pathogenbefall
beteiligt sind, z.B. PR-Proteine. Im Gegensatz dazu wird sich ein
Gen, das im wesentlichen frei von systemischer Aktivierung ist,
unter der Kontrolle eines Promotors befinden, der keine Expression
des Gens innerhalb der ganzen Pflanze in nichtinfizierten Geweben,
die weit von der Befallsstelle mit dem Pathogen entfernt liegen,
aktiviert. Die Expression solcher Gene ist auf die Infektionsstelle
oder die unmittelbare Umgebung der Infektionsstelle beschränkt. Promotoren,
die im wesentlichen frei von einer systemisch aktivierten Expression
sind, führen
nicht zu Expressionsniveaus innerhalb der ganzen Pflanze, während oder
nach der systemischen erworbenen Resistenzreaktion, die wesentlich
oberhalb der Basalexpression liegen und führen nicht zu einer Expression
innerhalb der ganzen Pflanze, die einer. beträchtlichen Teil des lokal bei
oder in der Umgebung der Infektionsstelle erreichten Expressionsniveaus
ausmacht. Diese Basalniveaus können von
Pflanze zu Pflanze schwanken, sollten jedoch im Idealfall Null oder
ungefähr Null
ausmachen.
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Alle
Zellen einer bestimmten Pflanze enthalten das gleiche Genom und
verhalten sich daher gleich. Die Zellen einer Pflanze können jedoch
in verschiedenen unterschiedlichen Zuständen vorliegen, je nach dem Entwicklungsweg,
den sie eingeschlagen haben. An der Kontrolle der Entwicklungsmöglichkeiten,
die von den Pflanzenzellen gewählt
werden, sind verschiedene Gene beteiligt. Diese Gene, die als Entwicklungskontrollgene
bekannt sind, werden entwicklungsmäßig reguliert und typischerweise
nur in einem bestimmten Pflanzengewebe oder Organ zu einem bestimmten
Entwicklungsstadium exprimiert. So wird z.B. ein Gen, das an der
Kontrolle der Entwicklung der Blütenorgane
einer Pflanze beteiligt ist, nur in denjenigen Geweben exprimiert
werden, aus denen sich die Blütenorgane
vor oder während
der Blüte
entwickeln. Ein Gen, das im wesentlichen frei von einer entwicklungsregulierten
Expression ist, kann als Gen definiert werden, das nicht nur in
einem bestimmten Organ oder Gewebe zu einem bestimmten Entwicklungsstadium
exprimiert wird oder das in solchen Geweben zu diesen Zeitpunkten
nur auf dem Basalniveau exprimiert wird. Gene, die im wesentlichen
frei von einer entwicklungsregulierten Expression sind, können in
den meisten Geweben während
der gesamten Lebenszeit der Pflanze exprimiert werden, z.B. diejenigen
Gene, die an der Produktion, am Transport und an der Speicherung
von Nährstoffen
beteiligt sind. Andere Gene, die im wesentlichen frei von einer
entwicklungsregulierten Expression sind, können nur als Reaktion auf externe
Reize, wie Umweltreize und chemische Reize exprimiert werden. Entwicklungsregulierte
Gene und ihre Promotoren können
auf unterschiedliche Art und weise identifiziert werden. So ermöglicht z.B.
eine Mutationsanalyse die Identifikation von Mutationen, die die
Entwicklung eines bestimmten Organs oder Gewebes einer Pflanze,
und daher die entsprechenden Promotoren und Gene, die an der Regulationsentwicklung
beteiligt sein müssen,
verhindern oder hemmen. Solche Promotoren und Gene können auch
aus cDNA-, genomischen DNS- oder mRNA-Bibliotheken oder aufgrund von Nukleotid-
oder Aminosäuresequenzhomologien
mit bekannten entwicklungsregulierten Genen, oder aufgrund von Homologie
zwischen den stromaufwärts
gelegenen Regulationssequenzen identifiziert werden.
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Ein
erfindungsgemäßer Promotor,
der im wesentlichen frei von entwicklungsregulierter Expression
ist, kann auf verschiedene Art und Weise identifiziert werden. So
führt z.B.
die Mutation oder Deletion eines Promotors, der im wesentlichen
frei von entwicklungsregulierter Expression ist, zu keiner Hemmung
oder Hinderung der Entwicklung oder Störung der pflanzlichen Anatomie.
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Vorzugsweise
codiert die rekombinante oder isolierte DNA der vorliegenden Erfindung
für einen
Promotor, der des weiteren im wesentlichen frei von Aktivierung
als Reaktion auf Umweltreize und hormonale Reize, wie ABA, Ethylen,
Oxidationsstreß,
osmotischen Streß und
Verwundung ist. Aufgrund dessen wird eine ungünstige Expression eines Gens
unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors als Reaktion
auf die oben genannten Reize vermieden. Auf diese Weise wird eine
kontrollierte Expression eines Gens ermöglicht. Promotoren, die im
wesentlichen frei von Aktivierung als Reaktion auf Umweltreize oder
hormonale Reize sind, können
auf verschiedene Art und Weise identifiziert werden, z.B. durch
Verknüpfung
der interessierenden Promotorsequenzen mit einem Reportergen, Transfektion
einer Pflanze mit dem Promotor/Reportergen-Konstrukt und Analyse
der Expression des Reportergens nach Ausübung eines hormonellen Reizes
oder eines Umweltreizes. Promotoren, die keine Expression des Reportergens
als Reaktion auf die oben genannten Reize aktivieren, oder die nur
niedrige Niveaus bzw.
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Basalniveaus
des Reportergens verursachen, können
als im wesentlichen frei von chemischer Stimulation oder Umweltstimulation
identifiziert werden. Ob niedrige Niveaus bzw. Basalniveaus annehmbar
sind, hängt
völlig
von dem exprimierten Gen ab. Codiert das Gen für ein harmloses Produkt, so
wird ein niedriges konstitutives Expressionsniveau kaum eine große Stoffwechselbelastung
der Pflanze darstellen. Ist das Produkt jedoch cytotoxisch, so kann
auch nur ein geringes Expressionsniveau schädlich sein.
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Vorzugsweise
codiert die erfindungsgemäße rekombinante
oder isolierte DNA für
einen Promotor, der als Reaktion auf Pflanzenregulatoren induzierbar
ist. Bei den Pflanzenregulatoren handelt es sich vorzugsweise um
SAR-Induktoren, die natürlich
oder synthetisch sein können.
Zu solchen SAR-Induktoren zählen
z.B. Salicylsäure
(SA) und BTH (Novartis) sowie die Analoge wie 4-Chlor-SA, 5-Chlor-SA
und 3,5-Chlor-SA, Benzoesäure
(BA), 2,3-Dihydro-BA, Dichlorisonikotinsäure (INA) und verschiedene
Halogenide dieser Verbindung (Sanchez-Casas & Klessig, Plant Physiol. 106 1675–1679 (1994);
Conrath et al., PNAS 92 7143–7147
(1995)).
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In
der vorliegenden Erfindung wird das Gen, das für das 21,3 kDa große PR-Protein
in Asparagus officinalis und äquivalente
Proteine in den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae codiert,
als AoPRT-L-Gen bezeichnet werden. Dem AoPRT-L ist eine gewisse
Homologie mit anderen PR-Proteinen gemeinsam, insbesondere mit denjenigen
der PR-5-Familie, wie Tabak-Osmotin und osmotinartiges Protein.
Verschiedene Proteine der PR-5-Familie
sind charakterisiert worden, und bei manchen, z.B. bei Osmotin,
hat sich gezeigt, daß bei Pathogenbefall
eine lokale und systemische Aktivierung und eine entwicklungsregulierte
Expression stattfindet. Im Gegensatz dazu scheinen die sauren PR-5-Genprodukte
eine lokale Aktivierung als Reaktion auf Pathogene aufzuweisen.
Bezüglich
der entwicklungsregulierten Expression dieser Gene sind sehr wenig
Informationen verfügbar,
obwohl es Hinweise darauf gibt, daß auch sie entwicklungsmäßig reguliert
werden. So wurde z.B. eine konstitutive Expression in nichtembryonalem
Gewebe des sich entwickelnden Samens bei Mais beobachtet (Malehorn
et al., 1994 Plant Physiol., 106: 1471–1481), und die Anhäufung eines
thaumatinartigen Proteins wurde in reifenden Kirschenfrüchten beobachtet
(Fils-Lycaon et al., 1996). Das Transkriptionsprofil des AoPRT-L-Gens
unterscheidet sich von diesen Genen insofern, als es bei der systemischen
Reaktion auf Pathogenbefall nicht aktiviert wird und eine minimale
entwicklungsregulierte Expression aufweist. Weiterhin wird im Gegensatz
zu den PR-5-Genen AoPRT-L nicht als Reaktion auf verschiedenste
Reize wie ABA und Ethylen induziert. Sowohl Salicylsäure als
auch ihr synthetisches Analog BTH sind fähig, eine Expression vom AoPRT-L-Promotor
aus zu induzieren.
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Das
im vorliegenden Text angegebene Molekulargewicht des AoPRT-L-Proteins
ist lediglich mutmaßlich
und beruht auf der Anzahl der Aminosäuren, die in dem Protein vorkommen.
Das von dem AoPRT-L-Gen codierte 21,3 kDa große Protein weist 223 Aminosäuren auf.
Die Molekulargewichte beziehen sich auf das nichtmodifizierte Protein
und berücksichtigen
keine Veränderungen
aufgrund von Modifikationen nach der Translation.
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Das
oben angegebene Molekulargewicht bezieht sich nur auf dasjenige
des AoPRT-L-Gens von Asparagus officinalis. Der Fachmann wird mit
fachbekannten Standardmethoden leicht äquivalente Proteine aus den
Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae identifizieren können. So
können
z.B. Gene, die für
die Proteine, die AoPRT-L äquivalent
sind, codieren, durch Nukleinsäure-Hybridisierungsstudien,
Kartierung mit Hilfe des "Restriction
Fragment Length Polymorphism",
PCR-Clonierung und
andere bekannte Verfahren identifiziert werden. Das AoPRT-L-Gen
oder dessen Fragmente können
als Sonde für
die Identifikation von Genen oder DNA-Sequenzen, die für äquivalente Proteine codieren,
verwendet werden. Ein Fragment des AoPRT-L-Gens kann 10, 20, 30,
50, 75 oder 100 Nukleotide sein. Vorzugsweise wird ein Fragment
von 15 bis 20 Nukleotiden als Sonde verwendet. Typischerweise wird
die Sonde für
die Hybridisierung von Genen, die für äquivalente Proteine codieren,
unter stringenten Bedingungen verwendet werden. Bei den geeigneten
Bedingungen kann es sich um diejenigen handeln, die in Plant Genetic
Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual, Hrsg. Draper,
J et al., 1988, Blackwell Scientific Publications, S. 252–255 beschrieben
sind und die folgendermaßen
abgewandelt werden: Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen
bei 55–65°C, letzte Waschschritte
mit 0,5X SSC, 0,1% SDS wird weggelassen.
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Bevorzugte
erfindungsgemäße Promotoren
sind solche, die die Expression des 21,3 kDa schweren Proteins oder
von äquivalenten
Proteinen der Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae vorantreiben.
Die Sequenz des A. officinalis-Promotors ist in 6 dargestellt.
Es wird vorgesehen, daß die
gesamte in 6 gezeigte Promotorsequenz bzw.
Fragmente davon verwendet werden kann/können. Die Fragmente können 20, 50,
100 oder 150 Nukleotide lang sein. Bei diesen Fragmenten handelt
es sich um Fragmente, die die Eigenschaften der nativen Promotorsequenz
beibehalten, nämlich,
im wesentlichen frei von einer systemisch aktivierten oder entwicklungsregulierten
Expression sind. vorzugsweise werden solche Fragmente auch durch
SA oder BTH induzierbar sein. Die Isolation der in den Figuren gezeigten
Promotorsequenzen wird in den Beispielen beschrieben werden.
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Der
Promotor des AoPRT-L-Gens aus Asparagus officinalis kann nach fachbekannten
Techniken aus einer Pflanze isoliert werden. So kann der Promotor
z.B. dadurch isoliert werden, daß man i) cDNA aus der in kulturbefindlichen
mechanisch isolierten Asparagus officinalis-Zellen isolierten mRNA
synthetisiert, ii) die cDNA differentiell durchmustert, um diejenigen
Klone zu identifizieren, die bei Adaptierung an Zellkulturbedingungen
induziert werden, iii) eine differentiell exprimierte cDNA, die
für ein
interessierendes Gen codiert, isoliert, iv) mit dieser cDNA als
Probe genomische DNA von Asparagus officinalis auf die Sequenz,
die für
das intressierende Gen codiert, behandelt, v) die stomaufwärts gelegenen
Regulationsregionen des interessierenden Gens, darunter den Promotor
des Gens, identifiziert. Die Promotoren von äquivalenten Proteinen aus den Familien
Liliaceae oder Amaryllidaceae sowie Promotoren von Proteinen, die
zu den Proteinen des ersten Aspekts der Erfindung im wesentlichen
homolog sind, können
nach fachbekannten Standardtechniken identifiziert werden. So kann
der Promotor z.B. dadurch isoliert werden, daß man i) cDNA aus der mRNA
einer interessierenden Pflanzenzelle synthetisiert; ii) die cDNA-Bibliothek
durchmustert, um Klone mit dem entsprechenden Expressionsmuster
zu identifizieren; iii) den interessierenden cDNA-Klon isoliert;
iv) mit dieser cDNA das Gen durch Durchmustern einer genomischen
Bibliothek isoliert; v) die stromaufwärts gelegenen Regulationselemente
des Gens identifiziert.
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Die
bei den oben genannten Schritten genannten Techniken sind fachbekannt.
Die Isolation von lebensfähigen
Zellen aus einer Pflanze gemäß Schritt
i) ist in der internationalen Patentanmeldung WO 93/05164 beschrieben.
Kurz gesagt können
lebende Zellen von einer beliebigen ein- oder zweikeimblättrigen Pflanze
abgeschabt werden. Zellen, die auf diese Art und Weise von Asparagus
officinalis isoliert werden und in Wachstumsmedium gegeben werden,
werden, wenn sie in Zellkultur gegeben werden, entdifferenzieren
und mit der Zellteilung beginnen. Die Anpassung an die Kulturbedingungen
führt zur
Expression von vielen Genen, die üblicherweise vielleicht nicht
exprimiert werden. Da bei zweikeimblättrigen Pflanzen die Induktion
der Zellteilung und die Entdifferenzierung üblicherweise mit der Wundreaktion
assoziiert sind, wird vorgesehen, daß die erfindungsgemäßen, aus
der einkeimblättrigen
Pflanze Asparagus officinalis isolierten Promotoren für die Induktion
der Genexpression sowohl bei zweikeimblättrigen als auch bei einkeimblättrigen
Pflanzen verwendet werden können.
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Die
veränderte
Genexpression bei der Kultivierung der mechanisch isolierten Zellen
macht diese zu einer reichhaltigen Quelle an Gentranskripten und
daher geeignet für
die Erstellung einer cDNA-Bibliothek. Die Herstellung und das differentielle
Durchmustern einer cDNA-Bibliothek ist in WO 93/05164 beschrieben.
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Die
Eignung von Promotoren, die zu den oben genannten Promotoren der
vorliegenden Erfindung hybridisieren, kann gegebenenfalls noch weiter
mittels Funktionsanalyse beurteilt werden. Beliebte Promotoren, die
mit den oben genannten Promotoren hybridisieren, sind also solche,
bei denen keine wesentliche systemische oder entwicklungsregulierte
Aktivierung stattfindet. Promotorsequenzen, die unter stringenten
Bedingungen zu allen oder einem Teil der Promotorsequenzen von pAoPRT-L aus Asparagus officinalis, äquivalenten Proteinen
aus den Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae oder Proteinen, die
dazu im wesentlichen homolog sind, hybridisieren, fallen ebenfalls
unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
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Für die Identifikation
von im wesentlichen homologen Proteinen und Promotoren kann man
Spezial-Computerprogramme
verwenden. So kann man z.B. die Grundeinstellung der Parameter des
GAP-Programms des GCG-Pakets verwenden, das von der SEQNET Computational Molecular
Biology Facility, SERC, Daresbury, Großbritannien, verfügbar ist.
Bei diesem Programm gibt es "Treffer" für %-Identität und %-Ähnlichkeit.
Vorzugsweise fallen Sequenzen mit 60% oder mehr Identität bzw. 65%
oder mehr Ähnlichkeit
unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. So fallen z.B. Sequenzen
mit 70%, 80%, 90%, 95% oder sogar 99% Identität unter den Umfang der vorliegenden
Erfindung. Dem Fachmann wird klar, daß diese Grenzen sowohl auf Nukleinsäuresequenzen
als auch auf Aminosäuresequenzen
zutreffen (wenn man z.B. ein Protein identifiziert, das zu dem in
der vorliegenden Erfindung identifizierten Protein analog ist).
Betrachtet man Sequenzen auf Nukleinsäureebene, ist der Normalfall
die Beurteilung der Identität/Ähnlichkeit
der Codiersequenz und/oder des Promotors.
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Solche
Promotorsequenzen können
nach fachbekannten Standardtechniken identifiziert werden. So können z.B.
der pAoPRT-L-Promotor oder Promotoren von äquivalenten Proteinen aus den
Familien Liliaceae oder Amaryllidaceae oder Fragmente davon als
Sonden für
die Identifikation von Promotoren, die damit hybridisieren, verwendet
werden. Typischerweise umfaßt
ein geeignetes Fragment 20, 30 oder 40 Nukleotide. Geeignete stringente
Bedingungen sind oben diskutiert.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Promotor bereitgestellt,
der mindestens das auf SA ansprechende Element von –247 Bp
bis –132
Bp in 6 umfaßt.
Insbesondere können chimäre Promotoren
hergestellt werden, die die gewünschten
Expressionseigenschaften des nativen Pflanzenpromotors sowie die
Fähigkeit,
die Expression als Reaktion auf SA aufgrund des Vorhandenseins des
auf SA ansprechenden Elements von 6 zu induzieren,
aufweisen.
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Solche
chimären
Promotoren können
nach Standardtechniken oder in DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden.
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Gemäß einem
dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden zwei oder mehr
induzierbare PR-Proteinpromotorsequenzen gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung
bereitgestellt, die hintereinander geschaltet sind. Das erhaltene
Promotor-Multimer kann eine Kombination von zwei oder mehr der bevorzugten
Promotorsequenzen des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung
umfassen. Es können
je nach den Größen- und Stabilitätsbeschränkungen
des Expressionssystems sowie dem gewünschten Niveau der Genexpression
eine beliebige Anzahl von Promotorsequenzen in Serie geschaltet
werden, um zu einem Multimer zu gelangen. Vorzugsweise umfaßt das Multimer
mindestens 2, mindestens 5 bzw. am stärksten bevorzugt mindestens
7 Promotorsequenzen. Die Promotorsequenzen des Multimers können direkt
oder durch dazwischen liegende Linkersequenzen miteinander verbunden
sein. Die dazwischen liegenden Linkersequenzen können eine beliebige Länge aufweisen,
so daß ein
wirksames Funktionieren des Multimers ermöglicht wird, und können von Fremd-DNA
stammen. Das Multimer beinhaltet vorzugsweise mindestens eine Promotorsequenz,
die die –132 Bp
Minimalpromotorsequenz, die in 6 dargestellt
ist, umfaßt.
Umfaßt
nur eine der zwei oder mehr Promotorsequenzen die in 6 dargestellte –132 Bp-Minimalsequenz, so
wird bevorzugt, daß diese
Sequenz am nächsten
zu dem zu exprimierenden Gen zu liegen kommt. In einer am stärksten bevorzugten
Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung wird eine Reihe von Fragmenten der
in 6 gezeigten Promotorsequenz in operativer Verknüpfung mit
der –132
Bp Minimalpromotorsequenz von 6 dargestellt.
In der am stärksten bevorzugten
Ausführungsform
beinhalten die Fragmente das auf SA ansprechende Element von –247 bis –132 Bp.
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Gemäß einem
vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Amplifikationssystem
bereitgestellt, das eine PR-Proteinpromotorsequenz gemäß dem ersten
Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt. Vorzugsweise ist der Promotor
der vorliegenden Erfindung operativ mit einer Transaktivatorsequenz
und einer zweiten Promotorsequenz, bei der es sich vorzugsweise
um den Angriffspunkt der Transaktivatorsequenz handelt und die mit
der DNA, die für
das interessierende Produkt codiert, verbunden ist, verbunden. Systeme,
die für
die Amplifikation der Genexpression verwendet werden können, sind
in WO 98/05 789 und Moore et al., PNAS 95, 379–381 (1997) beschrieben worden.
Zu den Amplifikationssystemen, die keine Transaktivatoren beinhalten, zählen z.B.
das System auf mRNA-Virusreplicase-Grundlage (Mori et al., FEBS Letters,
336:171–174
(1993)), bei dem der erfindungsgemäße Promotor operativ mit einer
Virusreplicase und einem zweiten Gen verknüpft ist, wobei das Gentranskript
von der Replicase amplifiziert wird. Das zweite Gen kann ein Antisense-Gen
sein. Umfaßt
das Amplifikationssystem eine Transaktivatorsequenz, so wird es
vorzugsweise stromabwärts
der erfindungsgemäßen Promotorsequenz
plaziert, und die Transkriptionsrichtung des erfindungsgemäßen Promotors
und der zweiten Promotorsequenz ist vorzugsweise in Serie oder divergierend.
Ein bevorzugtes Konstrukt ist in 16 dargestellt,
obwohl dem Fachmann klar ist, daß Variationen solch eines Konstrukts
möglich
sind, die dahingehend wirken, daß die Expression des erfindungsgemäßen Promotors
amplifiziert wird. Bei dem Amplifikationskonstrukt dieses Aspekts
der vorliegenden Erfindung wird vorgesehen, daß der Promotor nach dem ersten
Aspekt der vorliegenden Erfindung die Expression des Transaktivators
vorantreibt. Das Transaktivatorprodukt kann dann über den
zweiten Promotor mehrfache Transkriptionszyklen des gewünschten
Gens initiieren. Auf diese Weise wird eine Amplifikation des ursprünglichen
Signals, das den erfindungsgemäßen PR-Proteinpromotor aktiviert
hat, stattfinden. Ein Amplifikationskonstrukt kann daher die Verwendung
von geringeren Mengen an Aktivatorsubstanzen wie SA oder BTH unter
Beibehaltung der starken Expression des gewünschten Gens ermöglichen.
Bei einer weiteren Ausführungsform
ist vorgesehen, daß das
Multimer gemäß dem zweiten
Aspekt der Erfindung einen Teil eines Amplifikationssystems umfaßt.
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Transaktivatorsequenzen
sind in der Fachwelt bekannt; für
die vorliegende Erfindung können
beliebige geeignete Transaktivatorsequenzen verwendet werden. Die
Transaktivatorsequenzen können
natürlich
oder künstlich
sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Transaktivator LhG4, der aus dem mutierten Lac I Gen aus
E. coli in Fusion mit der Transkriptionsaktivatordomäne von Gal4
aus der Hefe besteht. Bei der zweiten Promotorsequenz kann es sich
um eine beliebige von dem Transaktivator aktivierbare Promotorsequenz handeln.
Ist der Transaktivator LhG4, so ist der bevorzugte Promotor pOP910.
Dabei handelt es sich um einen CaMV-Minimalpromotor mit zwei Rundungen von
Bindungsstellen für
das LhG4-Protein. Zu weiteren Transaktivatoren zählen der Tet-Transaktivator
in Kombination mit dem pTop10-Promotor (Wienmann et al., Plant Journal
5 559–569
(1994)).
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Gemäß einem
fünften
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Promotor, ein Multimer
oder ein Amplifikationssystem nach den vorhergehenden Aspekten bereitgestellt,
das operativ mit einer DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Produkt
codiert, verbunden sind. Die DNA kann für ein interessierendes Protein
oder für
ein Produkt, das die Produktion eines interessierenden Proteins
regulieren kann, codieren. Zu interessierenden Proteinen zählen Produkte,
die von einer Pflanze oder von Pflanzenzellen in Kultur geerntet
werden sollen, Produkte, die in der Pflanze exprimiert werden können und
die die Eigenschaften der Pflanze oder der Pflanzenzellen in Kultur
verändern,
Produkte, die an der Regulation von gewissen Merkmalen von Pflanzen beteiligt
sind, sowie Produkte wie Markergene. Insbesondere bevorzugt sind
Produkte, die für
DNA codieren, die ein positives Merkmal der transgenen Pflanze bereitstellen
oder verstärken.
So kann z.B. die Nukleinsäure für Proteine
oder Antisens-RNA-Transkripte
codieren, durch die verbesserte ernährungsphysiologische Eigenschaften,
höhere
Ernten, Schädlingsresistenz,
Krankheitsresistenz, künstliche
Pollensterilität
(z.B.: Barnase oder PR-Glucanase), weibliche Sterilität oder eine
Kontrolle der Blüten- und Fruchtreifung
gefördert
werden. Zu typischen interessierenden Nukleinsäuren zählen z.B. ein bakterielles
dap-A-Gen für
erhöhten
Lysingehalt; ein Bt-Endotoxin-Gen oder Proteasehemmer für Insektenresistenz;
Gene für
lysierende Peptide für
Krankheitsresistenz, bakterielle oder pflanzliche EPSP für Resistenz
gegen das Herbizid Glyphosate (
US
4 940 835 ;
US 5 188
642 ;
US 4 971 908 ;
US 5 145 783 ;
US 5 312 910 ;
US 5 633 435 ,
US 5 627 061 ,
US 5 310 667 ; WO 97/04 103), bakterielle
oder pflanzliche HPPD (WO 96/38 567, WO 98/02 562) für Resistenz
gegen HPPD-Hemmer-Herbizide (z.B. Diketol oder Isoxazole), Chitinase
oder Glucan-Endo-1,3-B-glucosidase
für fungizide
Eigenschaften. weiterhin kann eine DNA-Sequenz eingebracht werden,
die als genetisches Werkzeug für
die Erzeugung von Mutanten oder für die Unterstützung der
Identifikation, der genetischen Markierung oder der Isolation von
Gensequenzen dient. Nukleinsäuren,
die sich für
die Modifikation der Qualität
eignen, beinhalten z.B. Gene für
die Stärkebiosynthese
oder für
abbauende Enzyme (z.B. Stärkesynthasen,
Stärkeverzweigungsenzyme),
Kornspeicherproteingene (z.B. Proteinuntereinheiten von Glutenin,
Gliadinen oder Hordeinen) oder Gene, die mit der Kornhärte in Zusammenhang
stehen.
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Das
Promotor/Genkonstrukt des fünften
Aspekts der Erfindung kann weiterhin ein Markergen umfassen, das
die Verfolgung der Expression der heterologen DNA ermöglicht.
Ein Markergen ist vorzugsweise mit dem Promotor, Multimer oder Amplifikationssystem
der Erfindung operativ in Serie mit der heterologen DNA, die für ein interessierendes
Produkt codiert, verknüpft.
Die Induktion des Promotors, Multimers oder Amplifikationssystems
führt zur
Expression des Markergens in der transformierten Zelle oder Pflanze,
wodurch man das Induktionsniveau des interessierenden Produkts einfach
beurteilen kann, ohne daß die
ganze Pflanze oder ein Teil davon oder eine Kultur von Pflanzenzellen
geerntet oder zerstört
werden braucht. Es kann jedes geeignete Markergen verwendet werden.
Dazu zählen
z.B. die beta-Glucurnidase, Luciferase oder das "Green Fluorescent Protein".
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Das
Promotor-Gen-Konstrukt kann auch noch weitere Regulationssequenzen
umfassen, die für
die wirksame Expression oder Zielsteuerung des Genprodukts erforderlich
sind. So können
z.B. 3'-Transkriptionsregulationssignale
wie Polyadenylierungssignale bereitgestellt werden, ebenso beliebige
andere Regulationssequenzen, wie z.B. Enhancer. Bevorzugte 3'-Polyadenylierungssignale stammen vom
Blumenkohlmosaikvirus-35S-Gen ab, obwohl dem Fachmann klar sein
wird, daß auch
andere 3'-Polyadenylierungssignale
verwendet werden könnten.
Soll das Produkt aus der Zelle sezerniert werden, so kann die Hinzufügung einer Übergangspeptidsequenz
erwünscht
sein.
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Die
rekombinante oder isolierte DNA nach einem der Aspekte der vorliegenden
Erfindung kann in Form eines Vektors vorliegen. Bei dem Vektor kann
es sich um ein Plasmid, ein Cosmid oder einen Phagen handeln. Die
Vektoren können
nach fachbekannten Methoden direkt in Pflanzenzellen eingeführt werden
oder zuerst in Bakterien wie E. coli kloniert werden und erst dann
in die Pflanzenzelle eingeführt
werden. Sollen die Vektoren in Mikrorganismen/Wirtszellen kloniert
werden, so umfaßt
der Vektor vorzugsweise weiterhin ein oder mehrere Markergene, die
die Selektion von transformierten oder transfizierten Mikroorganismenzellen,
die das Vektorkonstrukt mit der heterologen DNA umfassen, ermöglichen.
Ausreichende Start- und Stopp-Signale
sowie Regulationssequenzen für
die Expression der heterologen DNA und/oder der Markergene in der
Mikroorganismenzelle können
ebenfalls mitverwendet werden.
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Gemäß einem
sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle
bereitgestellt, die mit der oben beschriebenen DNA transfiziert
oder transformiert ist. Bei der Wirtszelle kann es sich um eine
Pflanzenzelle oder eine Mikroorganismenzelle handeln. Die vorliegende
Erfindung stellt auch eine transgene Pflanzenzellkultur einer ein-
oder zweikeimblättrigen
Pflanze bereit, die mit einem Promotor, Multimer oder Amplifikationssystem
der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit
einem heterologen Gen, transformiert ist. Transformationsmethoden
werden unten beschrieben. Mit der transgenen Pflanzenzellkultur
können
ganze Pflanzen erzeugt werden, und gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung können
transgene Pflanzen, Samen und Vermehrungsmaterial, z.B. vermehrte
Sprosse, die erfindungsgemäße DNA umfassen,
bereitgestellt werden. Zu für
die Transformation bevorzugten Pflanzen oder Teilen oder Zellen
davon zählen
Reis, Mais, Weizen, Gerste, Sorghum, Zuckerrohr, Tabak, Raps, Sonnenblume,
Sojabohne, Baumwolle, Klee und Bohnen sowie Zuckerrübe, Kartoffel,
Gemüse
wie Tomate, Melone, Kohlarten, Salat, Karotte, Bohnen, Paprika und
Pfefferschoten.
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Die
erfindungsgemäße DNA kann
nach einem beliebigen bequemen Verfahren hergestellt werden, bei dem
aufeinanderfolgende Nukleotide miteinander verknüpft werden und/oder Oligo-
und/oder Polynukleotide ligiert werden, wobei diese Verfahren in-vitro-Verfahren
beinhalten. Das Verfahren der Wahl ist die DNA- Rekombinationstechnik.
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Die
erfindungsgemäße DNA kann
nach üblichen
fachbekannten Verfahren in Pflanzenzellen eingeführt werden. Vorzugsweise wird
die DNA in die Pflanzenzellen mit einem entwaffneten Ti-Plasmid-Vektor
und mit Agrobacterium-Träger
nach fachbekannten Verfahren hineintransformiert. Die Fremd-DNA
kann jedoch auch in die Pflanzenzellen direkt mit der Genkanone
oder mit einem beliebigen anderen physikalischen Abgabesystem eingeführt werden.
Die zuletzt genannten Techniken werden dann bevorzugt, wenn Agrobacterium für eine stabile
Transformation unwirksam ist, z.B. bei der Transformation von Getreidepflanzenzellen.
Vorzugsweise umfaßt
der Transformationsvektor eine einfache oder mehrfache Klonierungsstelle
für die
Insertion von Genen oder sonstiger DNA (die im vorliegenden Zusammenhang
als Passagier-Gene bezeichnet werden), die in die Pflanzenzellen
einzuführen
sind. Die Passagier-Gene oder die sonstige DNA können unter der Kontrolle eines
Promotors stehen, dessen Expressionseigenschaften sich von dem erfindungsgemäßen Promotor unterscheiden.
So kann es sich bei dem Passagier-Gen z.B. um ein Markergen unter
der Kontrolle eines Promotors, der sich von dem erfindungsgemäßen Promotor
unterscheidet, handeln, so daß,
wenn das Konstrukt in der Pflanze exprimiert wird, das Markergen
entsprechend den Eigenschaften des Promotors, mit dem es verbunden
ist, exprimiert werden kann und nicht auf das Expressionsmuster
des erfindungsgemäßen Promotors beschränkt ist.
Jegliche geeignete Technik, mit der die erfindungsgemäße DNA stabil
in die Zellkern-DNA einer Pflanzenzelle eingebaut werden kann, würde sich
ebenfalls eignen.
-
Gemäß einem
siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Identifikation
eines Mittels bereitgestellt, das zur Regulation der Expression
von heterologen Genen, die operativ mit dem AoPRT-L- Promotor verbunden
sind, fähig
ist. Das Verfahren kann die Schritte umfassen, daß man ein
mutmaßliches
Mittel auf eine DNA-Probe, die den AoPRT-L-Promotor in operativer
Verknüpfung
mit einem heterologen Genanteil umfaßt, einwirken läflt, das
Expressionsniveau des Gens bestimmt und die Expressionsniveaus mit einem
Kontrollsystem vergleicht. Hierdurch erhält man einen Hinweis auf die
Fähigkeit
des Mittels, die Genexpression mit Hilfe des AoPRT-L-Promotors zu
regulieren. Mutmaßliche
Mittel von Interesse können
auf eine transformierte Pflanze, Zellkultur, Gewebeprobe oder ein
in-vitro-System, die bzw. das die DNA-Probe enthält, aufgetragen werden. Auf
diese Art und Weise identifizierte Mittel von Interesse sind vorzugsweise
solche, die die Expression eines Gens, das operativ mit dem AoPRT-L-Promotor
verknüpft
ist, induzieren.
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Bei
dem Mittel kann es sich um ein beliebiges natürliches oder synthetisches
Produkt handeln, z.B. um Chemikalien wie Proteine, Peptide, DNA-
oder RNA-Sequenzen
oder Hormone und deren Analoge. Das heterologe Gen, mit dem der
Promotor verknüpft
ist, kann ein beliebiges Gen sein, vorzugsweise ein Gen, das ein
quantitativ bestimmbares Produkt exprimiert. Zu bevorzugten heterologen
Genen für
diesen Zweck zählen Gene,
die für
Durchmusterungsmarker codieren, z.B. für die beta-Glucoronidase des "Green Fluorescent
Protein".
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Mittel,
die nach dem oben genannten Verfahren identifiziert wurden, können auch
bei der Regulation der Expression des AoPRT-L-Gens selbst oder von
Genen, die für
PR-Proteine codieren, die dem AoPRT-L-Protein von Asparagus officinalis äquivalent
sind bzw. dazu homolog sind, wirksam sein. Zu den letztgenannten
Proteinen können
auch die PR-Proteine der Familie Liliaceae oder Amaryllidaceae,
ja sogar von anderen Pflanzenfamilien, gehören. Diese Mittel können bei
der Regulation oder Induktion einer vollen oder teilweisen SAR-Reaktion
wirksam sein, wodurch sie zu nützlichen "Pflanzenschutzmitteln" für die Anwendung im
Freiland werden.
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Die
vorliegende Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht
werden, in denen auf die beigelegten Zeichnungen verwiesen wird.
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1 ist
eine Darstellung der Nukleotidsequenz der AoPRT-L-cDNA mit der vorhergesagten
Aminosäuresequenz
von AoPRT-L. Die Sequenzen und Positionen, an denen die Primer für die IPCR
gebunden werden, sind oberhalb der cDNA-Sequenz eingezeichnet, und
entsprechende Enzymrestriktionsstellen sind unterstrichen.
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2 ist
eine Darstellung der Homologien zwischen AoPRT-L und anderen PR-5-Proteinen.
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3 ist eine Darstellung der Anhäufung der
mRNA für
AoPRT-L in Asparagus. In 3(a) ist
die Induktion der AoPRT-L-Expression nach mechanischer Isolation
von Mesophyllzellen aus den Kladodien von Asparagus dargestellt.
In 3(b) ist die Induktion der AoPRT-L-Expression in zerschnittenen
etiolierten Asparagus-Keimlingen
dargestellt, und in 3(c) ist die Expression
von AoPRT-L in mit SA behandeltem Asparagus dargestellt.
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4 ist
eine Darstellung der Expression der AoPRT-L-mRNA nach Infektion von Asparagus mit Stemphyllium
versicarium.
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5 ist
eine Darstellung einer Strategie für die Isolation des AoPRT-L-Promotors
mittels IPCR.
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6 ist
eine Darstellung der Nukleotidsequenz des AoPRT-L-Promotors. Sequenzen
mit Homologie zu den charakterisierten Promotorelementen sind eingerahmt.
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7 ist
eine Darstellung der Konstruktion von AoPRT- L-GUS-Konstrukten.
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8 ist
eine Darstellung der Expression von AoPRT-L-GUS in der Sproßachse von transgenem Tabak
im Vergleich zu PR-1a-GUS.
-
9 ist
eine Darstellung der Expression von pAoPRT-L-GUS in lokalen und systemischen Geweben von
transgenem Tabak, der mit dem Tabakmosaikvirus (TMV) oder mit Pseudomonas
syringae pv. phaseolicola infiziert ist. Die GUS-Aktivität wurde
fluorimetrisch anhand der Menge an 4-Methylumbellifernon (4-MU), das
pro Minute pro mg Proteinextrakt gebildet wurde, gemessen.
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10 ist
eine Darstellung der Induktion der pAoPRT-L-GUS- und PR-1a-GUS-Expression in transgenen
Tabak, der mit exogenarer SA bzw. expgenem BTH behandelt wurde.
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11 ist
eine Darstellung der Expression von (a) pAoPRT-1-GUS und (b) pAoPRT-L-GUS
in verwundetem transgenem Tabak bzw. (c) der Expression von pAoPRT-L-GUS in transgenen
Tabak-Blattscheibchen nach Behandlung mit exogenem Jasmonat.
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12 ist
eine Darstellung der pAoPRT-L-GUS-Expression in den Blättern von transgenem Tabak,
der über
die Wurzeln entweder mit NaCl oder mit PEG 8000 versorgt wurde der
Wasserstreß ausgesetzt
wurde bzw. von Blattscheibchen, die mit ABA behandelt wurden.
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13 ist
eine Darstellung der pAoPRT-L-GUS-Expression in transgenen Tabakblättern, die
mit Wasserstoffperoxid oder mit t-Butylhydroperoxid infiltriert
wurden.
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14 ist
eine Darstellung der Expression von pAoPRT-L-GUS und PR1a-GUS in transgenen T0-Blattscheibchen
B. napus, die drei Tage lang auf Wasser 1 mM SA oder 250 μM BTH schwimmen
gelassen wurden. Die Werte sind der Durchschnitt von 6 unabhängigen Transformanten/Transgen.
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15(a) ist eine schematische Darstellung
der AoPRT-L-Promotordeletionen
der Fusion mit dem GUS-Reportergen,
und 15(b) zeigt ihre Reaktion auf
exogene SA in transgenem T0-Tabak. 15(c) ist eine
schematische Darstellung, die die Anordnung von mutmaßlichen
auf SA ansprechenden Elementen im pMultiAoPRT-L-Promotor zeigt.
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16 ist
eine schematische Darstellung des pAoPRT-L-Expressionsamplifikationskonstrukts pGB24.
-
In
den Beispielen wurden, falls nicht anders erwähnt, alle Vorgehensweisen für die Herstellung
und Handhabung von rekombinanter DNA gemäß den in Sambrook J., Fritsch
EF & Maniatis
T et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold
Spring Harbor Laboratory 1989 beschriebenen Standardtechniken und
-protokollen durchgeführt.
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BEISPIELE
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Beispiel 1 - Isolation
einer AoPRT-L-cDNA und Charakterisierung der Expression von AoPRT-L
in Asparagus officinalis
-
Aus
Asparagus officinalis isolierte Mesophyll-Einzelzellen sind in einem geeigneten
Kulturmedium zu Entdifferenzierung und Initiierung der Zellteilung
fähig (Harikrishna
et al., (1991) J. Exp. Bot. 42:791–799). In diesen isolierten
Zellen treten während
der Anpassung an die Zellkulturbedingungen starke Veränderungen bezüglich der
Genexpression auf, und mit Hilfe von aus solchen Zellen isolierter
mRNA kann man Gene erhalten, die spezifisch während dieser Anpassung induziert
werden. Zu diesen Genen zählen
Gene, die durch Verwundung und Streß hinauf reguliert werden.
Die Konstruktion und das Durchmustern einer cDNA-Bibliothek aus
mechanisch isolierten A. officinalis-Zellen ist bereits beschrieben
(WO 93/05 164: Warner et al., (1992) Plant Molecular Biology 19:555–561). Es
wurde gefunden, daß ein
cDNA-Klon, der eine differentiell exprimierte mRNA darstellte, bis
zu 0,2% der cDNA-Bibliothek
ausmachte. Die DNA-Sequenzanalyse (1) zeigte,
daß die
mRNA für
ein mutmaßliches
Protein mit einer prognostizierten Masse von 21,3 kDa codiert, die
zu den thaumatinartigen Genen homolog ist (2) und es
sich daher um ein Mitglied der PR5-Genfamilie handelt. Dieses Gen
wurde also AoPRT-L genannt.
-
Eine
Analyse der mutmaßlichen
AoPRT-L-Proteinsequenz zeigte, daß es am nächsten mit sauren sezernierten
PR5 (a-PR5) Proteinen verwandt ist. Das AoPRT-L-Genprodukt wird
von einem polyklonalen Antiserum gegen PR-5 erkannt und wird sezerniert,
da es in Kulturmedium von Asparagus-Zellen vorkommt.
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Durch
Northern-Hybridisierungsanalyse mit aus mechanisch isolierten A.
officinalis-Zellen isolierter RNA erhielt man Hinweise darauf, daß AoPRT-L
in mechanisch isolierten Kladodienzellen hinauf reguliert wird (3a).
In zerschnittenen etiolierten A. officinalis-Keimlingen (Länge < = 0,5 cm) war das AoPRT-L-Transkript ab
3 Tage nach der Verwundung nachweisbar (3b).
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AoPRT-L
verhält
sich jedoch nicht wie das durch Verwundung induzierbare Gen AoPR1
(WO 93/05 164; Warner et al., (1992) Plant Molecular Biology 19:555–561), und
zwar insofern, als seine Expression nicht in Abschnitten von zerschnittenen
etiolierten Keimlingen mit einer Länge von mehr als 0,5 cm beobachtet
wird und daß sich
die Expression von AoPRT-L in Abschnitten mit einer Länge von < = 0,5 cm über den
gesamten Abschnitt erstreckt und nicht auf die Verwundungsstelle
begrenzt ist (3b).
-
Nach
Behandlung mit SA (3c) und nach Infektion mit dem
pilzlichen Pathogen Stemphyllium versicarium (4)
wurde die Anhäufung
von AoPRT-L-mRNA beobachtet, diese wurde jedoch durch die ethylenerzeugende
Verbindung Ethephon nicht induziert.
-
Beispiel 2 - Isolation
der stromaufwärts
gelegenen Promotorregionen des AoPRT-L-Gens mittels inverser Polymerase-Kettenreaktion
(IPCR)
-
Aus
A. officinalis wurde eine AoPRT-L-Promotorregion mittels inverser
Polymerase-Kettenreaktion (IPCR) isoliert (5). Man
ging im wesentlichen wie bei (WO 93/05 164; Warner et al., (1993)
Plant Journal 3:191–201)
beschrieben vor.
-
Die
genomische DNA aus A. officinalis wurde mit EcoRI verdaut, anschließend erneut
ligiert, um die Restriktionsfragmente zu einem Ring zusammenzuschließen, und
mit den AoPRT-L-spezifischen Primern
P1 5'-CGCGGAATTCGGTGTAGGTGCATTTGTTGG-3' (105-86 Bp)
EcoRI
und
P2
5'-CGCCTGCAGCCAATCCTGGACCCTCACCG-3' (152-172 Bp)
PstI
wurde
eine PCR durchgeführt.
Man erhielt ein 0,8 kB DNA-Fragment, das mit der dem 5'-Ende am nächsten liegenden
Region der AoPRT-L-cDNA hybridisierte. Dieses PCR-Produkt wurde
nach den Vorschriften, die mit dem TA-Kloning Kit von Invitrogen
bereitgestellt wurden, direkt in Vektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert.
Das erhaltene Konstrukt wurde pIPCR-TA genannt. Mittels DNA-Sequenzanalyse
des PCR-Produkts wurde bestätigt, daß das Fragment
tatsächlich
die korrekte stromaufwärts gelegene
Promotorsequenz enthielt (6).
-
Bei
einer Untersuchung der AoPRT-L-Promotorsequenz (6)
gelangt man zu Regionen mit Homologie zu anderen PR-Promotoren sind
identifiziert worden, darunter eine Tabak-PR-2 und Karotten-PR-3
und PR-4-artige
Sequenzen. Außerdem
scheint eine c-myc-Konsensussequenz
bei –344
bis –339
aufzutreten. Der Promotor enthält
jedoch keine Konsensus-G-Box, PR-Box oder ABRE, was ein Hinweis
darauf ist, daß pAoPRT-L
nicht durch ABA oder Ethylen induziert werden wird.
-
Beispiel 3 - Konstruktion
eines chimären
AoPRT-L-Promotor/GUS-Gens
-
Der
AoPRT-L-Promotor wurde aus pIPCR-TA mittels PCR unter Verwendung
von Primern gegen sowohl das 5'-
als auch das 3'-Ende
des Promotors mit Verlängerungen
für geeignete
Restriktionsstellen für
weitere Klonierungsschritte erhalten:
5'-GGGTACCAAGCTTCTTATTGCGACCTGACTCTC-3'
KpnI HindIII
5'-CGCGGATCCGTCGACCTGCAGGATTGGTTGTGTGTTGTTTT-3'
BamHI SalI
PstI
-
Dieses
PCR-Produkt wurde anschließend
mit KpnI und PstI verdaut und in den Vektor pJIT60 (identisch mit
pJIT30 (Guerineau et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15, 127–136), jedoch
mit einem doppelten, nicht einfachen, 35S-CaMV-Promotor), der mit
dem gleichen Enzym verdaut worden war, ligiert. Das Produkt wurde p22-JIT60
genannt. Die Sequenz, die für
das β-Glucuronidase-Reporterenzym, mit
einem Intron (GUS(INT) in pBluescript SK- (Firek et al., (1993)
Plant Mol. Biol. 22: 129–142:
Jefferson et al., (1987) EMBO J. 6:397–3907; Vancanneyt et al., (1990)
Mol. Gen. Genet. 220: 245–250)
codiert, wurde durch Restriktionsspaltung mit BamHI und EcoRI in
p22-JIT60 hinter die AoPRT-L-Promotorsequenz
kloniert, wodurch man das Konstrukt p22-GUS(INT)JIT60 erhielt. Schließlich wurde
das gesamte AoPRT-L-Promotor/GUS-Fragment mittels KpnI und XhoI
aus p22-GUS(INT)JIT60 herausgeschnitten und in den binären Vektor
pBIN 19 (Bevan (1984) NUC. Acids RES. 22:8711–8721), der mit KpnI und SalI
verdaut worden war, ligiert, wodurch man p22-GUS(INT)Binl9 erhielt
(7).
-
Das
GUS-Gen ist ein bequemes Reportergen, dessen Expression leicht verfolgt
werden kann. Es ist anzumerken, daß in diesem Beispiel sowie
in den folgenden Beispielen GUS durch ein beliebiges Gen von Interesse
ersetzt werden kann, um eine chemische Induktion des interessierenden
Gens zu ermöglichen.
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Beispiel 4 - Entwicklungsregulierte
Expression des AoPRT-L-Promotors in transgenem Tabak
-
Das
AoPRT-L-Promotorkonstrukt (p22-GUS(INT)Binl9) wurde nach üblichen
Techniken der Agrobacterium tumefaciensvermittelten Transformation
in Nicotiana tabacum der Sorte Samsun hineintransformiert (Draper
et al., (1988): Plant Genetic Transformation and Gene Expression – A Laboratory
Manual, Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK). Die Expression
des vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebenen GUS-Gens wurde unter Verwendung
bereits beschriebener Assays analysiert (Draper et al., (1988) supra).
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Eine
histochemische Analyse zeigte, daß das vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebene
GUS nur in Sepalen und an der Übergangszone
zwischen Petiolen und Stengel (Blattachseln) exprimiert wird (8).
Außerdem
wird gelegentlich eine histochemische Färbung der Wurzeln in der Nähe der Krone
(Stengelbasis) beobachtet. Der Promotor weist daher im Vergleich
zu anderen veröffentlichten
Promotoren eine minimale entwicklungsregulierte Aktivität auf.
-
Beispiel 5 - Nichtsystemische
Induktion der vom AoPRT-L-Promotor
vorangetriebenen GUS-Expression in transgenem Tabak mit Pathogenprovokation
-
Mit
AoPRT-L-GUS transformierte Samsun-Tabakpflanzen wurden mit dem Tabakmosaikvirus
(TMV) infiziert, und zwar dadurch, daß man die Oberfläche eines
einzelnen Blattes mit einer Mischung aus Virus und Verwundung wie
beschrieben (Bi et al., (1995) Plant J. 8:235–245) abrieb. Das TMV induziert
eine N-Gen-abhängige
Hypersensitivitätsreaktion,
die durch das Auftreten von Läsionen
(Zonen mit auf Hypersensitivität
beruhendem Zelltod) aus dem infizierten Blatt gekennzeichnet ist.
Die Inokulation von Samsun-Tabak mit TMV induziert auch die SAR
und die systemische Anhäufung
von endogenem PR-1a (Bi et al., (1995), supra). Zu verschiedenen
Zeitpunkten nach der Infektion wurden Blattscheibchen von den Läsionen ausgestanzt
(diese ausgestanzten Scheibchen enthielten auch direkt an die Läsion angrenzendes
Nicht-HR-Gewebe, Nicht-HR-Gewebe von nicht infiziertem Gewebe zwischen
den Läsionen
aus demselben Blatt sowie von einem nicht infizierten systemischen
Blatt an derselben Pflanze). Die GUS-Aktivität in diesen Scheibchen wurde
fluorimetrisch gemessen. Es wurde gefunden, daß GUS-Aktivität im inokulierten
Blatt in Gewebe, das gerade eine HR durchmacht (oder Gewebe direkt
neben den HR-Läsionen),
erhöht
ist, jedoch in Gewebe zwischen den Läsionen bzw. systemischem Gewebe
nicht erhöht
ist (9).
-
Samsun-Tabakpflanzen,
die die Fusion zwischen dem AoPRT-L-Promotor und GUS bergen, wurden mit
Pseudomonas syringae pv phaseolicola (2 × 108 pro
ml) infiziert, und zwar dadurch, daß man die interzellulären Blatträume in einem
einzelnen Blatt wie oben beschrieben inokulierte (Bi et al., (1995),
supra). Pseudomonas syringae pv phaseolicola induziert an der Infiltrationsstelle
eine Nicht-Host-Hypersensitivitätsreaktion.
Diese Behandlung induziert auch die systemische Anhäufung von
endogenen PR-1-Proteinen (Bi et al., (1995), supra). Zu unterschiedlichen
Zeitpunkten nach der Infektion wurden Blattscheibchen aus infizierten Blättern und
aus nichtinfizierten systemischen Blättern an derselben Pflanze
herausgestanzt. Zu den Proben aus den infizierten Blättern zählten auch
Proben von der Infiltrationsstelle (die durch Hypersenstivität hervorgerufenen
Zelltod erleiden sollten bzw. im Absterben begriffen waren) sowie
von nicht infiltriertem Gewebe nahe der Inokulationsstelle am selben
Blatt. Es wurde die GUS-Aktivität
an diesen Scheibchen gemessen. Hier wurde eine GUS-Aktivität nur in
Proben von Gewebe neben der HR-Läsion
nachgewiesen (9). Innerhalb des Gewebes, das
eine HR durchmachte, bzw. in systemischem Gewebe wurde keine Aktivität nachgewiesen. Hieraus
läßt sich
schließen,
daß die
in mit TMV infizierten Tabak beobachtete Aktivität nicht auf die Läsion selbst,
sondern auf das Gewebe, das die TMV-Läsionen umgibt, zurückzuführen ist.
Die höhere
Aktivität,
die im Anschluß an
TMV-Infektion beobachtet
wurde, beruht möglicherweise
auf den ungefähr
zehnmal höheren SA-Spiegeln,
die nach TMV-Provokation
im Vergleich zu Pseudomonas syringae pv phaseolicola beobachtet wurden.
-
Aus
diesen Daten kann geschlossen werden, daß der AoPRT-L-Promotor im Gegensatz
zu PR-1a nur in Gewebe in der Nähe
der Hypersensitivitätsreaktion-Läsionen aktiviert
wird und nicht systemisch induziert wird.
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Beispiel 6 - Induktion
der vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebenen GUS-Expression in mit
SA und BTH behandeltem transgenem Tabak
-
Mit
AoPRT-L-GUS-transformierte Samsun-Tabakpflanzen wurden drei Tage
lang über
die Wurzeln mit ansteigenden SA-Konzentrationen versorgt, wonach
Blattkerne ausgestanzt wurden und die GUS-Aktivität fluorimetrisch
gemessen wurde. Bei 1 mM SA wurde eine beträchtliche Induktion der AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion
beobachtet und bei 0,1 mM SA wenig (10a).
Die AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion ist daher um eine Größenordnung
weniger gegenüber
SA empfindlich als PR-1a-GUS, die bei 10–100 μM SA deutlich induziert wird
(Bi et al., (1995), supra; Mur et al., (1996) Plant J. 9:559–571). Eine
Behandlung mit 1 mM SA zeigte eine deutliche zeitabhängige Induktion
der AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusionen im Vergleich zu dem inaktiven
SA-Analog 4-Hydroxybenzoesäure
(4hBA), die einen Tag nach Beginn der Behandlung einsetzte (10b). Die Induktion von mit AoPRT-L-GUS
transformierten Pflanzen mit SA ergibt ungefähr 1/3 der bei mit pPR-1a-GUS
transformiertem Tabak beobachteten GUS-Aktivität (10c).
-
Mit
AoPRT-L-GUS transformierte Samsun-Tabakpflanzen wurden mit 1 mM
SA oder 20 μM
BTH besprüht
(Ausbringung in 0,01%iger Sapogenat-Lösung als Netzmittel). Die Pflanzen
wurden einmal besprüht, trocknen
gelassen und anschließend
nochmals am selben Tag besprüht
(Tag 0). Nach 3 oder 6 Tagen wurden Blattkerne entnommen und die
GUS-Aktivität
wurde mit Hilfe eines fluorimetrischen Standard-Assays gemessen.
BTH erwies sich als gleich wirksam wie SA als Induktionsmittel für die vom
AoPRT-L-Promotor
vorangetriebene GUS-Expression (10d).
Blattkerne von Tabak, der die Fusion des AoPRT-L-Promotors mit GUS barg, wurden 3 oder
6 Tage lang auf Wasser mit ansteigenden BTH-Konzentrationen schwimmen
gelassen, wonach die GUS-Aktivität
in den Blattscheibchen fluorimetrisch gemessen wurde. Bei Verwendung
von 1,25 μM
BTH wird eine BTH-induzierte GUS-Aktivität beobachtet (10e).
-
Aus
diesen Daten geht folgendes hervor:
- 1) die
AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion ist in transgenem Tabak durch SA induzierbar.
- 2) die pAoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion ist um eine Größenordnung
weniger empfindlich gegen SA-Konzentration
und weist im Vergleich einen PR-1a-Promotor/GUS-Konstrukt ungefähr 1/3 der
Induktion auf.
- 3) BTH als Blattspray oder in vitro ist ein wirksames Induktionsmittel
für die
AoPRT-L-Promotor/GUS-Fusion.
-
Beispiel 7 - Reine Induktion
der vom AoPRT-L-Promotor angetriebenen GUS-Expression in transgenem
Tabak durch Verwundung oder das Wundsignal Jasmonsäure, ABA
und osmotischen Streß
-
Tabakpflanzen,
die entweder die AoPRT-L-Promotorfusion mit GUS oder ein AoPRT-1-GUS-Konstrukt bargen,
wurden mit Hilfe von einer von drei Methoden verbunden. Entweder
wurde die Blattspreite mit einer Zange zerdrückt, oder sie wurde mit einer
Schere zerschnitten oder sie wurde durch eine Kombination von Zerdrücken und
Durchlöchern
dadurch, daß das
Blatt mit einem Fleischhammer geschlagen wurde, behandelt. Nach
1, 2, 3, 6 oder 8 Tagen wurden von dem beschädigten Gewebe Blattkerne entnommen
und die GUS-Aktivität
wurde gemessen. Bei AoPR-1 handelt es sich um ein wundinfiziertes
Gen, das in zerschnittenen etiolierten A. officinalis-Keimlingen
an den Verwundungsstellen exprimiert wird. Wird das AoPR-1-Promotor/GUS-Konstrukt
in Tabak eingebracht, so ist es ebenfalls durch Verwundung infizierbar
(Warner et al., (1994) Plant J. 6:31–43; Mur et al., (1996) Plant
J. 9:559–571).
Die vom AoPR-1-Promotor vorangetriebene GUS-Aktivität ist bei
allen drei Verwundungsbehandlungen erhöht, wobei eine verstärkte GUS-Aktivität 1–2 Tage
nach der Behandlung beobachtet werden kann (11a).
Im Gegensatz dazu wurde bei der vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebenen
GUS-Expression bei keiner Verwundungs behandlung eine Erhöhung beobachtet,
außer einem
schwachen Anstieg am B. Tag nach dem Unterdrücken mit einer Zange, was wahrscheinlich
nicht auf Verwundung beruht, da das Gewebe zu diesem Zeitpunkt äußerst ausgetrocknet
ist (11b).
-
Die
Verwundung von Tabakblättern
(mit der Hammermethode) bzw. die Infektion von Tabak mit Pseudomonas
syringae p.v. phaseolicola induziert eine lokale Anhäufung des
mit Verwundung in Zusammenhang stehenden Cytohormons Jasmonsäure (JA)
(Kenton et al., submitted; Mar et al., (1997) Trends in Microbiol. 5:297–300). Blattkerne
von Tabak, die die AoPRT-L-Promotorfusion
zusammen mit GUS bargen, wurden 3 Tage lang auf Wasser, das ansteigende
JA-Konzentrationen enthielt, schwimmen gelassen, wonach die GUS-Aktivität in den
Blattscheibchen mit einem fluorimetrischen Standard-Assay gemessen
wurde. Im Vergleich mit dem Schwimmenlassen auf 1 mM SA konnte JA
in keiner der geprüften
Konzentrationen irgendeinen Anstieg in der vom AoPRT-L-Promotor
vorangetriebenen GUS-Aktivität
induzieren (11c).
-
Aus
diesen Werten geht hervor, daß im
Vergleich zu einer durch Verwundung induzierbaren Promotor-GUS-Fusion (AoPR-1-Promotor/GUS),
das AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukt
im wesentlichen unempfindlich gegen mechanische Schädigung ist.
Außerdem
wird AoPRT-L-Promotor/GUS
nicht durch das bekannte Verwundungssignal JA und nicht durch Ethylen
induziert.
-
Beispiel 8 – Bei transgenem
Tabak wird durch Salz- und Wasserstreß sowie durch das mit Wasserstreß in Zusammenhang
stehende Hormon Abscisinsäure
(ABA) keine wesentliche Expression der AoPRT-L-Promotor/GUS-Aktivität induziert
-
Da
AoPRT-L zu der PR.-Proteinfamilie der Klasse 5 zählt, die auch trockenheitsindizierte
Gene wie solche, die für
Osmotine codieren, enthält,
wurde die Reaktion auf verschiedene Arten von Wasserstreß untersucht.
Bei transgenem Tabak führte
weder eine hohe Salzkonzentration noch 20% PEG 8000, die beide in mehreren
Pflanzenarten die Expression von Osmitingenen bzw. osmotinartigen
Genen induzieren, zu einer Induktion einer Expression des AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukts
(12a und 12b).
Wurde Tabak, der das AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukt
barg, 20 Tage lang nicht mit Wasser versorgt, wurde ein leichter
Anstieg der Expression beobachtet, zu diesem Zeitpunkt waren die
Pflanzen jedoch bereits stark verwelkt (12c). Ähnlich induzierte
eine hohe ABA-Konzentration in Blattscheibchen in transgenem Tabak
einen leichten Anstieg des AoPRT-L-Promotor/GUS (12d).
Es sind zweierlei Dinge zu betonen. 1) Das Niveau der Induktion durch
Trockenheit oder ABA ist typischerweise um eine Größenordnung
niedriger als bei der Verwendung von SA. 2) Sowohl Wasserarmut als
auch Behandeln mit ABA induzieren beim Tabak einen beträchtlichen
Proteinverlust, und der scheinbare Anstieg der GUS-Aktivität könnte ein
Artefakt eines differentiellen Ansprechens der GUS (im Vergleich
zu anderen wichtigen Blattproteinen) auf den Mechanismus des Proteinverlusts
sein.
-
Aus
diesen Werten kann geschlossen werden, daß der AoPRT-L-Promotor im wesentlichen
nicht auf verschiedene Arten von Wasserstreß anspricht und daß eine gegebenenfalls
auftretende schwache Expression nur in schwer geschädigten Pflanzen
auftreten dürfte.
-
Beispiel 9 - Das AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukt
spricht nicht auf Prooxidantien an
-
Die
Beobachtung, daß die
vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebene GUS-Aktivität in Gewebe in der Nähe des Orts
der Pathogenprovokation erhöht
ist, legt nahe, daß der
SA eine Rolle als induktionsverursachendem Agens zukommt. In den
letzten Jahren hat man sich jedoch sehr für die Produktion von reaktionsfähigen Sauerstoffspezies
(reactive oxygen species, ROS) während
Pflanzen-Pathogen-Interaktionen interessiert. Kurz gesagt führt die
Erkennung eines Pathogens zur Produktion eines H2O2-"Burst". Das Modell für diesen "oxidativen Burst", das zur Zeit am
beliebtesten ist, ist, daß H2O2 von der Dismutation
von von einer Zelloberflächen-NADPH-Oxidase
produziertem Superoxid stammt. Mehrere mit der Abwehr in Zusammenhang stehende
Gene (darunter auch AoPR1) sprechen direkt auf das H2O2 an (Bi et al., (1995) supra). Außerdem können große H2O2-Mengen die SA-Synthese
induzieren (Neuenschwander et al., (1995) Plant Journal 8:227–233; Summermatter
et al., (1995) Plant Physiology 108:1379–1385). Schließlich und
endlich ist die Anhäufung
von ROS auch ein Phänomen
von Kälte-,
Ozon- und UV-Streß,
und erhöhte
ROS-Spiegel finden sich auch in alterndem Gewebe.
-
Um
die Wahrscheinlichkeit, daß Oxidationsstreß eine starke
vom AoPRT-L-Promotor vorangetriebene Genexpression induziert, zu
prüfen,
wurden Blattabschnitte von transgenem Tabak, der das AoPRT-L-Promotor/GUS-Konstrukt barg, mit
H2O2 infiltriert
(13a). Es ist bereits gezeigt worden,
daß die
verwendeten H2O2-Konzentrationen die
AoPR1-GUS-Expression in Tabak induzieren (Bi et al., (1995) – siehe
Beispiel 5). In dem geprüften
Konzentrationsbereich konnte H2O2 keine AoPRT-L-Promotor/GUS-Expression induzieren. H2O2 weist jedoch
im Apoplasten nur eine begrenzte Halbwertzeit auf (nur ungefähr 10 min.-Levine
et al., (1994) Cell 79: 583–593),
daher wurde der Versuch mit einem stabilen Peroxid, nämlich t-Butyl-hydroperoxid, wiederholt
(13b). Wiederum war trotz der schweren
sichtbaren Gewebeschädigung,
die bei höheren
t-Butyl-hydroperoxidkonzentrationen
(im Gegensatz zu H2O2,
der keine sichtbaren Symptome verursachte) auftrat, keine GUS-Expression
nachzuweisen.
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Diese
Daten legen nahe, daß es
im Gegensatz zu PR-1a (Bi et al., (1995) – siehe Beispiel 5: Neuenschwander
et al., (1995) Plant Journal 8:227–233) unwahrscheinlich ist,
daß eine
von AoPRT-L-Promotor vorangetriebene Genexpression auftreten wird,
nicht einmal unter hohen ROS-Streßbedingungen oder bei Vorliegen
von ROS-vermittelter Gewebeschädigung.
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Beispiel 10 - In Brassica
napus wird der AoPRT-L-Promotor
durch SA und BTH induziert
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Die
AoPRT-L-GUS-Fusion in pJIT60-P22-GUS-int wurde als SstI-XhoI-Fragment
in das mit SstI, SalI geschnittene Plasmid pTZl9 (Pharmacia) übertragen,
wodurch man pGB4 erhielt. Dann wurde das AoPRT-L-GUS-Gen als HindIII-Fragment in die HindIII-Restriktionsstelle
des binären
Vektors SCV-nos nptII (WO 96/30 529) kloniert, wodurch man zu pGB4-SCV
gelangte, in dem die Transkriptionsrichtung vom AoPRT-L gleich ist
wie diejenige des nptII-Gens. pGB4-SCV wurde in den Agrobakterienstamm
pGV2260 übertragen, und
transformierte B. napus Pflanzen wurden durch Agrobakterien-Transformation
hergestellt, wobei im wesentlichen wie bei Moloney et al., (1989)
Plant Cell Reports 8:238–242
beschrieben vorgegangen wurde. Wurden die transformierten Pflanzen
mit 1 mM SA oder 250 μM
BTH behandelt, so traten ähnliche
GUS-Aktivitätsniveaus
auf (14). AoPRT-L-GUS-
und PR1a-Pflanzen wiesen ebenfalls bei Induktion mit SA oder BTH ähnliche
GUS-Aktivitätenniveaus
auf (14).
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Beispiel 11 - Bei Zea
mays wird der AoPRT-L-Promotor durch SA und BTH induziert
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Maispflanzen,
die AoPRT-L-GUS enthielten, wurden durch biolistische Transformation
von Callusmaterial mit pJIT60-P22-GUS hergestellt. Wurden die transformierten
Pflanzen mit SA oder BTH behandelt, so trat eine GUS- Aktivität auf.
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Beispiel 12 - Identifikation
und Multimerisation eines auf SA/BTH ansprechenden Elements im AoPRT-L-Promotor
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Eine
Reihe von 3 AoPRT-L-5'-Promotordeletion-GUS-Fusionskonstrukte
wurden mit den folgenden Primern, die für Regionen des AoPRT-L-Promotors
entwickelt wurden, konstruiert, (15a):
5'-GCGAAGCTTCCATGTCATGRGAGAAGCAC-3' (–361 Bp)
HindIII
5'-GCGAAGCTTTTGGAAACTGAATACCTACA-3' (–247 Bp)
HindIII
5'-GCGAAGCTTACAAAGGCTTRGACTTTCCA-3' (–132 Bp)
HindIII
-
Mit
jedem der genannten Primer wurde zusammen mit dem unten angeführten Primer
eine PCR-Reaktion mit p22-JIT60
als Matrize durchgeführt:
5'-GGGATCCGTCGACCTGCAGATTGGTTGTGTGTTGTTTTTG-3'
BamHI SalI
PstI
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Die
PCR-Produkte wurden in Form von HindIII-, BamHI-Fragmenten in das mit HindIII, BamHI
geschnittene Plasmid p22-GUS-(INT)-JIT60 kloniert. Die erhaltenen
chimären
pAoPRT-L-GUS-CaMV polyA-Gene wurden als KpnI, XhoI-Fragmente in
das mit KpnI, SalI geschnittene Plasmid pBin19 kloniert und in Samsun-Tabak
hineintransformiert. Die GUS-Aktivität der Transformanten wurde
nach Induktion von Blattscheibchen mit 1 mM SA bestimmt. Nach Deletion
von bis zu –132
Bp wurde eine wesentliche Aktivitätsverringerung beobachtet (15b). Das auf SA ansprechende Element liegt also
zwischen –247
Bp und der mutmaßlichen
CAT (–50 –47) und
TATA-Box bei –64
bis –57
Bp.
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Um
einen AoPRT-L-Promotor mit höherer
Expression zu konstruieren, wurde die Region –247 Bp bis –133 Bp
aus p22-JIT60 amplifiziert und zweimal vor einen AoPRT-L-Promotor bei –247 Bp
gestellt. Dieser AoPRT-Lx3-Promotor
wurde folgendermaßen
konstruiert: mit den unten angeführten
Primern wurde mit dem AoPRT-L-Promotor
aus 22p-JIT60 von 0 Bp bis –247
Bp eine PCR durchgeführt.
5'-TCTAGGTACCCTTTGCGTGGTCGACTTGGAAACTGAATACCTAC-3'
KpnI SalI
5'-GGGATCCGTCGACCTGCAGATTGGTTGTGTGTTGTTTTTG-3'
BamHI SalI
PstI
-
Dieses
Produkt wurde als KpnI, PstI-Fragment in pUCl9 kloniert. Die pAoPRT-L-Region
von –133
Bp bis –247
Bp wurde mit den Primern
5'-TCTAGGTACCCTTTGCGTGGTCGACTTGGAAACTGAATACCTAC-3'
KpnI SalI
5'-GAAAGTCTAAGCCTCGAGGGAATAAGGTACGAGTTCGTGGAC-3'
XhoI
amplifiziert.
Dieses Fragment wurde als KpnI, XhoI-Fragment zwischen die KpnI- und die
SalI-Restriktionsstelle
des von pUC19 abgeleiteten Plasmids kloniert, wodurch man zu pAoPRT-Lx2
gelangte. Das pAoPRT-L-Fragment von –133 Bp bis –247 BP
wurde anschließend
als KpnI-, XhoI-Fragment zwischen die KpnI- und die SalI-Restriktionsstellen
von pAoPRT-Lx2 kloniert, wodurch man pAoPRT-Lx3 erhielt (15c). Als nächstes
wurde der AoPRT-Lx3-Promotor in Form eines KpnI, PstI-Fragments
in das mit KpnI, PstI geschnittene Plasmid p22-JIT60 kloniert, wodurch
man zu pAoPRT-Lx3-JIT60
gelangte. pAoPRT-Lx3 wurde von pAoPRT-L-x-JIT60 in Form eines KpnI,
BamHI-Fragments in das mit KpnI, BamHI geschnittene Plasmid p22-GUS-(INT)-JIT60 übertragen.
Schließlich
wurde das erhaltene chimäre
pAoPRT-Lx3-GUS-CaMV-polyA Gen in Form von KpnI, XhoI-Fragmenten
in das mit KpnI, SalI geschnittene Plasmid pBin19 kloniert und in Samsun-Tabak
hineintranformiert. Die entstandenen Pflanzen wiesen bei Induktion
mit SA oder BTH eine signifikant höhere GUS-Aktivität auf als
die entsprechenden AoPRT-L-GUS-Pflanzen.
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Beispiel 13 - Amplifikation
des AoPRT-L-Promotors mit Hilfe eines Transaktivierungssystems
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Eine
Möglichkeit,
die Aktivität
des AoPRT-L-Promotors zu erhöhen
und trotzdem eine enge Regulation des Promotors beizubehalten, besteht
darin, daß ein
System verwendet wird, das die Expression des AoPRT-L-Promotors amplifiziert.
Es wurde ein Amplifikationssystem mit einem Transaktivator erzeugt
(beschrieben in WO 98/05 789 und Moore et al., (1997) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95, 379–381).
Der AoPRT-L-Promotor
wird mit einem synthetischen Transaktivator (LhG4) und der Zielpromotor
des Transaktivators (pOP) wird mit dem zu exprimierenden Gen gekoppelt.
LhG4 besteht aus einem mutierten lacI-Gen aus E. coli in Fusion mit
der Transkriptionsaktivatordomäne
von GAL4 aus der Hefe. pOP910 ist ein CaMV-35S-Minimalpromotor mit
zwei Bindungsstellen des LhG4-Proteins. Da der Transaktivator multiple
Transkriptionszyklen von pOP aus initieren kann, findet eine Amplifikation
des ursprünglichen
Signals, das den AoPRT-L-Promotor aktivierte, statt.
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Das
Amplifikationssystem wurde mit Hilfe der folgenden Schritte konstruiert.
Der pOP910-Promotor wurde aus pX-910TAG (K. Palme, Max Planck Institut
für Züchtungsforschung,
Köln, Deutschland)
in Form eines SstI-NcoI-Fragments herausgeschnitten und in das mit
SstI, NcoI geschnittene Plasmid pDH68 kloniert (pDH68 besteht aus
einem Plastocyaninpromotor aus der Erbse (Pwee und Gray (1993) Plant
J. 3, 437–449), der
mit einem Intron-GUS-Gen gekoppelt ist (D. Twell, Leicester University)
und zwischen die SstI- und EcoRI-Stelle des Vektors pJIT30 kloniert
wurde (Guerineau et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15, 127–136)).
Das erhaltene chimäre
pOP-GUS int-CaMV polyA Gen wurde als (stumpfendig gemachtes) SstI,
XhoI-Fragment in den mit EcoRV, XhoI geschnittenen Klonierungsvektor
pIC19H (Marsh et al., (1984) Gene 32, 481–485) übertragen. Von diesem Plasmid
wurde das chimäre
Gen in Form eines SalI, XhoI-Fragments
gewonnen und in das mit SalI geschnittene Plasmid pNos nptII-SCV
kloniert, wodurch man pWP320-SCVA
erhielt. Um eine Fusion von pAoPRT-L mit LhG4 zu konstruieren, wurde
der AoPRT-L-Promotor erst in Form eines HindIII, PstI-Fragments
aus pGB4 in das mit HindIII, PstI geschnittene Plasmid pBluescript
KS+ übertragen,
wodurch man pGB21 erhielt. pGALA (I. Moore, Universität Oxford,
GB) enthält
das LhG4-Gen in Verknüpfung
mit einem polyA-Terminator aus CaMV. Dieses Gen wurde in Form eines
KpnI, PstI-Fragments herausgeschnitten und zwischen die KpnI und
die PstI-Restriktionsstelle
des Vektors pT7Blue2 (Novagen) kloniert, wodurch man zu pGB22 gelangte.
Das (stumpfendig gemachte) Kpn, NotI-Fragment von pGB22 wurde anschließend in
die SmaI, NotI-Restriktionsstellen
von pGB21 kloniert, wodurch man pGB23 erhielt. Die erhaltene pAoPRT-L-LhG4-Fusion
wurde als Sal-Fragment in das mit SalI geschnittene Plasmid pWP320-SCVA übertragen, wodurch
man zu pGB24 gelangte (16).
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Tabak-
und B. napus-Pflanzen, die die pGB24-T-DNA-Region enthalten, weisen bei Induktion
mit SA oder BTH eine signifikant höhere GUS-Aktivität als äquivalente
AoPRT-L-GUS-Pflanzen auf. SEQUENZPROTOKOLL