DE602004004070T2

DE602004004070T2 - Verwendung der regulatorischen sequenz des gos2-gens aus reis für die genexpression in dikotyledonen pflanzen oder pflanzenzellen

Info

Publication number: DE602004004070T2
Application number: DE602004004070T
Authority: DE
Inventors: Yves Hatzfeld; Dirk Inze
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2003-01-21
Filing date: 2004-01-21
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2024-01-22
Also published as: EP1585820B1; ATE350481T1; ES2279339T3; WO2004065596A2; US7235710B2; EP1585820A2; US20060053507A1; DE602004004070D1; WO2004065596A3; US20080301833A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der pflanzlichen Molekularbiologie. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer regulatorischen Sequenz des GOS2-Reisgens zur Regulierung der Genexpression in Pflanzenzellen von nichtmonokotylen Pflanzen.
Gentechnik bei Pflanzen bietet die Möglichkeit, die Produktion von Pflanzen mit den verschiedensten wünschenswerten Merkmalen, wie erhöhte Resistenz gegenüber Pathogenen und Herbiziden, gesteigerte Ausbeute, erhöhte Stressschwelle usw., zu ermöglichen. Dies wird in der Regel durch Insertion geeigneter DNA-Stücke aus einer heterologen Quelle oder derselben Quelle in eine Pflanze erreicht. Die Expression heterologer DNA-Sequenzen in einem pflanzlichen Wirt ist von der Gegenwart eines operativ verknüpften Promotors abhängig, der innerhalb des Pflanzenwirts funktionsfähig ist.
Promotor sind DNA-Elemente, die die Transkription in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen regulieren, und befinden sich in der 5'-benachbarten oder stromaufwärts gelegenen Region eines transkribierten Gens. Länge und Basenpaarzusammensetzung einer Promotorsequenz sind von Gen zu Gen unterschiedlich. Innerhalb einer Promotorsequenz können zahlreiche Elemente der regulatorischen Sequenz vorhanden sein. Diese Elemente der regulatorischen Sequenz, die mit den DNA-Bindungsproteinen (die Teil des Komplexes der Transkriptionseinleitung sind) in Wechselwirkung treten, sind im Allgemeinen in eine Promotorsequenz eingebettet. Spezifische Elemente, DNA-Boxen genannt, steuern bestimmte Merkmale oder ein bestimmtes Aktivierungsmuster zum Promotor bei. Viele dieser Boxen sind Erkennungsorte, an die regulatorische Transkriptionsfaktoren binden können, und sind Teil eines stringenten Steuermechanismus des Promotors. Pflanzliche Promotor-DNA-Boxen sind in großer Anzahl beschrieben, wie gewebespezifi sche Boxen (Chaubet et al., Plant J. 10 (3), 425–435, 1996), Pyrimidin-Boxen (Gubler & Jacobsen, Plant Cell 4 (11), 1435–1441, 1992), die das Expressionsniveau beeinflussen, oder G-Boxen (Dolferus et al., Plant Physiol. 105 (4), 1075–1087, 1994), die die Promotoraktivität nach Kälte- oder Dehydratisierungsexposition senken.
Es hat sich herausgestellt, dass die rekombinante DNA-Technologie zahlreiche Anwendungen in Forschung und Produktentwicklung bietet. In der Molekularbiologie, werden häufig spezifische Promotortypen zur Expression heterologer Nukleinsäuren oder Proteine in Organismen verwendet, in denen die Expression konstitutiv (d. h. kontinuierliche Expression in allen Zellen eines Organismus) oder auf bestimmte Teile eines Organismus begrenzt (d. h. Expression in bevorzugtem Gewebe oder bevorzugten Zellen) oder auf bestimmte Entwicklungsstadien oder bestimmte Umweltbedingungen oder physiologische Bedingungen begrenzt ist (d. h. induzierbare Expression).
In verschiedenen industriellen Anwendungen besteht ein Bedarf nach Transkriptionssteuerelementen, die zum Vorantreiben einer Genexpression in Pflanzen fähig sind. Um die gewünschte Genexpression zu erhalten, die abhängig von den jeweiligen Bedürfnissen fein abgestimmt werden kann, ist es wünschenswert, ein breites Spektrum an Promotoren bereitzustellen, von denen einer ausgewählt werden kann. Dem Fachmann müssen eine Vielfalt von Promotoren mit unterschiedlichen Expressionsmustern oder mit unterschiedlichen Merkmalen der zeitlichen Steuerung zur Auswahl stehen. In vielen industriellen und landwirtschaftlichen Anwendungen, in denen das Ziel darin besteht, ein bestimmtes Merkmal während der gesamten Entwicklung der Pflanze und unter jedem umweltbezogenen und physikalischen Zustand der Pflanze zu verleihen, ist ein konstitutiver Promotor erforderlich. Ein konstitutiver Promotor kann zum Vorantreiben der Expression ausgewählter Markergene geeignet sein oder dann verwendet werden, wenn das Genprodukt eines bestimmten Gens für kommerzielle Zwecke aus der Pflanze isoliert und gereinigt werden soll.
Häufig ist es auch wünschenswert, Promotoren zu verwenden, deren Regelung auf vergleichbare Weise erfolgt, was in einem breiten Spektrum von Wirtsarten zu ähnlichen Expressionsmustern führt. Bis heute wurden sehr wenige konstitutive Pflanzenpromotoren isoliert, die bei einem breiten Spektrum an Arten aktiv sind (Callis et al., J. Biol. Chem. 265, 12486–12493, 1990; Zhang et al., Plant Cell 3, 1155–1165, 1991; de Pater et al., Plant J. 2, 837–844, 1992; Mandel et al. Plant Mol. Biol. 29, 995–1004, 1995; Baszczynski et al., Maydica 42, 189–201, 1997). Demzufolge ist das Blumenkohl-Mosaikvirus 35S (CaMV 355; Odell et al., Nature 313, 653–660, 1985) der derzeit am meisten verwendete konstitutive Promotor in der Pflanzenwissenschaft. Seine Regulierung ist gut bekannt und es wurde nachgewiesen, dass es in zahlreichen monokotylen und dikotylen Pflanzenarten und sogar in einigen Pilzarten wirksam ist. Der Hauptnachteil eines solchen Promotors ist jedoch sein viraler Ursprung. Pflanzen, die mit dem CaMV35S-Promotor transformiert werden, zeigen häufig mehrere unerwünschte Eigenschaften, wie eine wirksame Inaktivierung der Transgene oder eine erhöhte Rekombination, was im Laufe der Zeit über mehrere Generationen hinweg zu Instabilität führt (Kohli et al., Plant J. 17 591–601, 1999; Al-Kaff et al., Nature Biotechnology 18 995–999, 2000). Ferner sind virale Elemente in transgenen Produkten sowohl aus regulatorischen Gründen als auch aus Gründen der allgemeinen Akzeptanz häufig unerwünscht.
GOS2-cDNA von Reis wurde im Rahmen eines Screening-Programms für Gene, die in vielen unterschiedlichen Reisgeweben exprimiert wurden, isoliert und beschrieben (de Pater et al., Plant J. 2, 837–844, 1992). GOS2 ist ein einmalig im Genom vorkommendes Gen, das eine Isoform des Translationsinitiationsfaktors elF1 kodiert. Eine Expressionsanalyse ergab hohe mRNA-Niveaus in grünen Trieben, etiolierten Trieben und in den Wurzeln von Keimlingen. Ein ähnliches Expressionsmuster wurde in ausgereiften Pflanzen nachgewiesen, obwohl die Expression in den Wurzeln etwas geringer war. In Pflanzen oder Zellsuspensionskulturen einer anderen Reisart wurden ebenfalls hohe Expressionsniveaus nachgewiesen. Die GUS-Expression in Reiskeimlingen (Blatt-, Wurzelgewebe und Keimblattscheide) und in Reiszellsuspensionskulturen konnte durch ein isoliertes Promotorfragment vorangetrieben werden. Der Promotor war auch in Mais-, Gersten- und Roggengras aktiv (de Pater et al., Plant J. 2, 837–844, 1992; Hensgens et al., Plant Mol. Biol. 22, 1101–1127, 1993). Es konnte auch gezeigt werden, dass er in anderen monokotylen Pflanzen aktiv war, wobei die Expressionsniveaus denen von CaMV 35S ähnlich waren. Barbour et al. (WO0020571) schlagen die Verwendung eines GOS2-Promotors aus Mais in dikotylen Pflanzen vor, konnten dies aber nicht nachweisen. Zwischen dem GOS2-Promotor in Mais und dem GOS2-Promotor in Reis, dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung, besteht jedoch nur eine geringe Homologie.
Es hat sich herausgestellt, dass eine regulatorische Sequenz für GOS2 aus Reis in nichtmonokotylen Pflanzen aktiv ist und ein ähnliches Expressionsmuster und eine ähnliche Stärke wie die des CaMV 35S-Promotors zeigt. Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer regulatorischen Sequenz für GOS2 zum Vorantreiben der Expression von Nukleinsäuren in nichtmonokotylen Pflanzen. Die vorliegende Erfindung stellt somit eine gute Alternative zum CaMV 35S-Promotor bereit. Die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz ermöglicht, wenn sie an ein nützliches Gen gekoppelt und in eine nichtmonokotyle Pflanze oder Pflanzenzelle transferiert wurde, die Expression dieses nützlichen Gens. Da die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz eine konstitutive Expression ermöglicht, ist es darüber hinaus möglich, sie als eine regulatorische Sequenz zum Vorantreiben der Expression des transferierten nützlichen Gens in allen Geweben während jedes Entwicklungsstadiums zu nutzen. Da diese regulatorische Sequenz von einer monokotylen Pflanze stammt, ist sie außerdem wahrscheinlich weniger anfällig gegenüber Inaktivierung als eine dikotyle regulatorische Sequenz oder der CaMV 35S-Promotor, wenn sie zum Exprimieren eines transferierten nützlichen Gens in dikotylen Pflanzen, wie Arabidopsis thaliana, verwendet wird.
Dem Fachmann ist bewusst, dass die hier beschriebene Erfindung über die hier beschriebenen hinaus weitere Abwandlungen und Modifikationen aufweisen kann. Es ist offensichtlich, dass die beschriebene Erfindung alle derartigen Abwandlungen und Modifikationen einschließt. Die Erfindung umfasst auch alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, die in dieser Beschreibung einzeln oder insgesamt genannt oder angedeutet werden, und jede beliebige Kombination aus jedem oder mehreren dieser Schritte oder Merkmale.
In der gesamten Beschreibung bedeutet das Wort "umfassen" und Abwandlungen davon, wie "umfasst" und "umfassend" im Sinne der Erfindung den Einschluss einer genannten Einheit oder eines genannten Schritts oder einer Gruppe Einheiten oder Schritte, wobei jedoch keine andere Einheit oder kein anderer Schritt oder keine Gruppe Einheiten oder Schritte ausgeschlossen ist, sofern der Kontext nichts anderes verlangt.
Der Begriff "abgeleitet von" im Sinne der Erfindung ist so zu verstehen, dass eine bestimmte Einheit oder Gruppe Einheiten von der genannten Art stammt, aber nicht unbedingt direkt von der genannten Quelle erhalten wurde. Die ganze Zahl kann durch bewusste menschliche Manipulation wesentlich von der ursprünglichen Form der Zusammensetzung und/oder Umgebung abweichen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer isolierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz, die eine Regulationssequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten umfasst, zum Vorantreiben der Expression einer assoziierten Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanze oder Pflanzenzelle bereitgestellt.
Der Begriff "regulatorische Sequenz" bezieht sich im Sinne der Erfindung auf DNA-Sequenzen, die zur Bewirkung der Expression von Sequenzen, an die sie ligiert sind, erforderlich sind. Die regulatorischen Sequenzen können sich in Abhängigkeit von dem vorgesehenen Wirtsmechanismus und der Art der zu exprimierenden Sequenz unterscheiden. Der Begriff "regulatorische Sequenz" schließt zumindest alle die Komponenten ein, die zur Expression erforderlich sind und fakultativ zusätzliche vorteilhafte Komponenten. Gemäß einem bevorzugten Merkmal ist die isolierte regulatorische Nukleinsäuresequenz eine Promotorsequenz. Im Sinne der Erfindung bedeutet ein "Promotor" eine DNA-Region stromaufwärts vom Beginn der Transkription, die an der Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen zur Einleitung der Transkription beteiligt ist. Der Verweis auf einen "Promotor" ist im weitesten Sinn zu verstehen und umfasst die regulatorischen Sequenzen für die Transkription, die von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen abgeleitet sind, einschließlich der TATA-Box, die zur präzisen Transkriptionsinitiation mit oder ohne CCAAT-Boxsequenz und zusätzliche Regulationselemente (d. h. Aktivierungssequenzen, Enhancer und Silencer stromaufwärts) erforderlich ist, was die Genexpression als Reaktion auf Entwicklungsreize und/oder externe Reize oder auf eine gewebespezifische Art ändert. Folglich nimmt die Transkriptionsgeschwindigkeit eines reprimierbaren Promotors als Reaktion auf ein Repressionsmittel ab. Die Transkrip tionsgeschwindigkeit eines induzierbaren Promotors nimmt als Reaktion auf ein Induktionsmittel zu. Die Transkriptionsgeschwindigkeit eines konstitutiven Promotors wird nicht besonders geregelt, kann aber unter dem Einfluss allgemeiner Stoffwechselbedingungen schwanken. Der Begriff "Promotor" schließt auch die regulatorischen Sequenzen für die Transkription eines klassischen prokaryontischen Gens ein, wobei es eine -35-Boxsequenz und/oder regulatorische -10-Box-Transkriptionssequenz umfassen kann. Der Begriff "Promotor" wird auch zur Beschreibung eines synthetischen Moleküls oder eines Fusionsmoleküls oder eines Derivats verwendet, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ möglich macht, aktiviert oder verstärkt.
Die vorliegende Erfindung umfasst somit die Verwendung von Fragmenten oder Varianten von SEQ ID NO: 1, die unter Bildung von regulatorischen Hybridsequenzen, umfassend Mischungen aus Teilen der Regulationselemente aus verschiedenen entweder natürlichen oder synthetischen Quellen, durch jede im Fachgebiet bekannte Weise verbunden sein können, z. B. durch In-vitro-Ligation. Aus diesem Grund stellt die Erfindung auch eine regulatorische Hybrid-Nukleinsäuresequenz bereit, die die Regulationssequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer Fragmente oder eine ihrer Varianten umfasst, welche funktionell mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen oder ihren Fragmenten kombiniert sind.
Regulatorische Sequenzen oder Promotoren können zusätzliche Kopien von einem oder mehreren bestimmten regulatorischen Elementen enthalten, um die Expression weiter zu verstärken und/oder die räumliche Expression und/oder die zeitliche Expression eines Nukleinsäuremoleküls, mit dem sie operativ verknüpft sind, zu verändern. Derartige regulatorische Elemente können neben einer heterologen Promotorsequenz angeordnet sein, um die Expression eines Nukleinsäuremoleküls als Reaktion auf z. B. Kupfer, Glukokortikoide, Dexamethason, Tetracyclin, Gibberellin, cAMP, Abscisinsäure, Auxin, Verwundung, Ethylen, Jasmonat oder Salicylsäure voranzutreiben, oder um in bestimmten Zellen, Geweben oder Organen, wie Meristem, Blättern, Wurzeln, Embryos, Blüten, Samen oder Früchten, die Expression einer Nukleinsäure zu möglich zu machen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die regulatorische Sequenz in nichtmonokotylen Pflanzen aktiv und wird durch SEQ ID NO: 1, eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten dargestellt. Der Begriff "funktionell" in Verbindung mit einer Nukleinsäure oder einem Teil davon bedeutet eine im Wesentlichen ähnliche biologische Aktivität wie die natürlich vorkommende Nukleinsäure und die Fähigkeit, die Expression in nichtmonokotylen Pflanzen voranzutreiben.
"Expression" bedeutet die Produktion eines Proteins oder einer Nukleinsäuresequenz in einer Zelle oder in einem zellfreien System. Dazu gehört die Transkription in ein RNA-Produkt, eine posttranskriptionale Modifikation und/oder Translation in ein Proteinprodukt oder Polypeptide aus einer DNA, die dieses Produkt kodiert, sowie mögliche posttranslationale Modifikationen. Eine Kodiersequenz kann in Sense- oder Antisense-Richtung transkribiert werden.
Der Begriff "Nukleinsäuresequenz(en)", "Nukleinsäuremolekül(e)", "Polynukleotid(e)", "Nukleotidsequenz(en)", "DNA-Sequenz(en)" oder "Gen(e)", beziehen sich im Sinne der Erfindung auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide (RNA) oder Desoxyribonukleotide (DNA) oder eine Kombination von beidem in einer polymeren Form beliebiger Länge. Die Begriffe schließen ferner doppelsträngige und einzelsträngige DNA und RNA ein. Die Begriffe schließen auch auf dem Fachgebiet bekannte Nukleotidmodifikationen, wie Methylierung, Cyclisierung, "Endkappen", Substitution eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, wie Inosin, und Modifizierungen der Polynukleotid-Hauptkette ein. Der Begriff "isoliert" bedeutet im Sinne der Erfindung entfernt von der ursprünglichen Umgebung. Beispielsweise ist eine Nukleinsäure, die in ihrem natürlichen Zustand in einem Organismus vorhanden ist, nicht isoliert, während dieselbe Nukleinsäure, wenn sie von den benachbarten Nukleinsäuren, mit denen sie natürlich vorkommt, getrennt ist, als "isoliert" betrachtet wird.
Eine assoziierte Nukleinsäuresequenz kann Kodiersequenzen umfassen oder sie kann nicht kodierende Sequenzen enthalten. Eine "Kodiersequenz" oder ein "offener Leserahmen" oder "ORF" ist als eine Nukleotidsequenz definiert, die zu mRNA transkribiert und/oder in ein Polypeptid translatiert werden kann, wenn sie bzw. er von geeigneten regulatorischen Sequenzen gesteuert wird, d. h., wenn die Kodiersequenz oder der ORF in exprimierbarer Form vorliegen. Die Kodiersequenz oder der ORF wird von einem 5'-Translationsstartcodon und eine 3'-Translationsstoppcodon begrenzt. Eine Kodiersequenz oder ein ORF können, ohne darauf beschränkt zu sein, RNA, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen, synthetisch hergestellte Nukleotidsequenzen oder genomische DNA enthalten. Die Kodiersequenz oder der ORF können durch dazwischen liegende Nukleinsäuresequenzen unterbrochen sein.
Kodiersequenzen, oder Gene, die im Wesentlichen dasselbe Protein kodieren, aber aus verschiedenen Quellen isoliert sind, können aus erheblich voneinander abweichende Nukleinsäuresequenzen bestehen. Umgekehrt können erheblich voneinander abweichenden Nukleinsäuresequenzen derart entwickelt werden, dass die Expression des im Wesentlichen gleichen Proteins bewirkt wird. Diese Nukleinsäuresequenzen ergeben sich z. B. aus dem Vorhandensein verschiedener Allelen eines bestimmten Gens oder aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder aus Unterschieden der Codonverwendung. So werden Aminosäuren, wie Methionin und Tryptophan, von einem einzigen Codon kodiert, wohingegen andere Aminosäuren, wie Arginin, Leucin und Serin, jeweils von bis zu sechs unterschiedlichen Codons translatiert werden können. Die bevorzugte Codonverwendung verschiedener Organismen ist unter http://www.kazusa.or.jp/codon zu finden. Allele Varianten werden ferner derart definiert, dass sie einfache nukleotide Polyphormismen (SNP) sowie kleine Insertion/Deletionspolymorphismen (INDEL; die Größe von INDEL beträgt üblicherweise weniger als 100 bp) umfassen. SNP und INDEL bilden die größte Gruppe Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Der Begriff "assoziiert" oder "operativ verknüpft" bezieht sich im Sinne der Erfindung auf eine Nebeneinanderstellung einer regulatorischen und einer kodierenden Sequenz, wobei die derart beschriebenen Komponenten ein Verhältnis eingehen, das ihnen ermöglicht, auf die vorgesehene Weise zu funktionieren. Eine operativ mit einer Kodiersequenz verknüpfte regulatorische Sequenz ist derart ligiert, dass die Expression der Kodiersequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit denen der Kontrollsequenzen kompatibel sind. Falls die regulatorische Sequenz ein Promotor ist, ist dem Fachmann bekannt, dass eine doppelsträngige Nukleinsäure bevorzugt ist. Die assoziierte Nukleinsäure umfasst heterologe Nukleinsäuren. Als heterologe Nukleinsäuren werden Nukleinsäuren bezeichnet, die aus einer getrennten genetischen Quelle abgeleitet sind, beispielsweise Nukleinsäuren, die aus der Zelle stammen, dort aber nicht natürlich vorkommen, oder die sich an einer anderen Stelle des Chromosoms der Zelle befinden. Heterologe Nukleinsäuren lassen sich auch von anderen Arten ableiten und können beispielsweise mittels Transformation als Transgen eingeführt werden. Dieses Transgen kann durch bewusste menschliche Manipulation wesentlich von der ursprünglichen Form der Zusammen setzung und/oder genomischen Umgebung abweichen. Auch die Expression der natürlichen Nukleinsäuresequenzen kann durch die Einführung von erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen in die Pflanze, sodass die regulatorischen Sequenzen operativ mit der natürlichen Nukleinsäure verknüpft sind, modifiziert werden. Eine natürliche Nukleinsäure bezieht sich auf eine Nukleinsäure an ihrer natürlichen Stelle im Genom des Organismus.
Der Begriff "Fragment einer Sequenz" oder "Teil einer Sequenz" bedeutet eine verkürzte Sequenz der fraglichen Originalsequenz. Die Länge der verkürzten Nukleinsäuresequenz kann beträchtlich schwanken, wobei die Mindestlänge eine Sequenz ist, deren Länge ausreicht, eine Sequenz mit mindestens einer mit der ursprünglichen fraglichen Sequenz vergleichbaren Funktion und/oder Aktivität bereitzustellen, während die Höchstlänge nicht kritisch ist. In einigen Anwendungen ist die Höchstlänge nicht wesentlich größer als die Länge, die zur Bereitstellung der gewünschten Aktivität und/oder Funktion(en) der ursprünglichen Sequenz erforderlich ist. Diese Begriffe beschränken sich nicht auf den Inhalt des DNA-Fragments oder -Segments, welche jede DNA mit jeder Funktionalität enthalten kann. Das DNA-Fragment oder -Segment kann beispielsweise aus einem Promotor bestehen, kann aber auch zahlreiche Gene mit oder ohne zusätzliche Steuerelemente umfassen, es kann auch nur Spacer-Sequenzen enthalten. Ein funktionelles Fragment eines Promotors kann durch Deletion von Teilen am 5'- und/oder 3'-Ende und/oder durch Deletion von Teilen im Inneren und Prüfung des restlichen Fragments auf seine Fähigkeit, die Expression eines Reportergens voranzutreiben, konstruiert werden. Das Expressionsniveau und -muster dieses Reportergenkonstrukts kann dann mit dem desselben Reportergens verglichen werden, das über den ursprünglichen Promotor, von dem das Fragment abgeleitet wurde, gesteuert wird.
Ferner umfasst eine Variante eines DNA-Fragments eine Sequenz, die Homologie mit der fraglichen Sequenz zeigt, und fähig ist, die Expression einer assoziierten DNA-Sequenz voranzutreiben, wenn sie erneut in eine Pflanze eingeführt und mit der fraglichen Sequenz oder einem Abschnitt davon unter stringenten Bedingungen hybridisiert wird. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass in diesem Fall Reaktionen unter stringenten Bedingungen für die Hybridisierung in der Regel bei einer Temperatur von zwischen 60°C und 65°C in citratgepufferter Kochsalzlösung der Konzentration 0,3 mit 0,1% SDS mit anschließendem Spülen bei derselben Temperatur mit citratgepufferter Kochsalzlösung der Konzentration 0,3 mit 0,1% SDS durchgeführt werden. Zur Definition des Stringenzniveaus sei zweckmäßig verwiesen auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989).
Eine "nichtmonokotyle Pflanze" umfasst alle Pflanzenarten, die zum Pflanzenreich gehören, wie durch ITIS [Integrated Taxonomic Information System (http://www.itis.usda.gov/index.html)] definiert, einschließlich der Klasse Magnoliopsida, aber ohne die Klasse Liliopsida (Liliatae, Monocotyledonae). Die Klassen Magnoliopsida und Liliopsida gehören zur Abteilung Magnoliophyta, die wiederum zum Unterreich Tracheobionta gehören. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann zum Vorantreiben der Genexpression in jeder beliebigen nichtmonokotylen Pflanze verwendet werden, insbesondere ist sie für eine dikotyle Pflanze geeignet, einschließlich einer Futter- oder Weidenleguminose, einer Zierpflanze, einer als Nahrung dienenden Kulturpflanze, eines Baums oder eines Strauchs. Zu bevorzugten Pflanzenarten gehören Baumwolle, Kartoffel, Tomate, Kohl, Zuckerrübe, Sojabohne, Bohne, Sonnen blume, Erbsen.
Vorteilhaft ist die Regulationssequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten fähig, die Expression einer assoziierten Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanze voranzutreiben. Bei einer derartigen assoziierten Nukleinsäure kann es sich um jede heterologe DNA-Sequenz handeln, die von einem Organismus abgeleitet ist, dessen Sequenz in einer nichtmonokotylen Pflanze exprimiert werden soll. Die heterologe DNA-Sequenz kann aus jedem beliebigen Organismus erhalten werden, einschließliche Pflanzen, wobei es sich bei der Pflanzenart um dieselbe Pflanzenart handeln kann, in die die Sequenz eingeführt werden soll, oder um eine andere. Darüber hinaus oder als Alternative kann die assoziierte Nukleinsäuresequenz eine endogene Nukleinsäure sein, die operativ mit der erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenz verknüpft ist.
Aus diesem Grund stellt die Erfindung auch die Verwendung einer isolierten regulatorischen Nukleinsäure wie vorstehend definiert zum Vorantreiben der Expression einer assoziierten Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanze oder Pflanzenzelle bereit, wobei es sich bei der assoziierten Nukleinsäuresequenz um eine isolierte Nukleinsäure oder um eine Nukleinsäure, die in Bezug auf die Wirtszelle, in die die isolierte regulatorische Nukleinsäuresequenz eingeführt wird, endogen ist, handelt.
Die rekombinante Nukleinsäure schließt jede Möglichkeit zum Klonen und/oder Transfer von einer Nukleinsäure in eine Wirtszelle ein, einschließlich "Vektoren" oder "Vektorsequenzen", die durch Transformation oder Transfektion in einen Organismus eingeführt werden können und die entweder in das Genom der Wirtszelle integriert werden oder in einer Form extrachromosomal erhalten bleiben. Vektorsequenzen umfassen im Allgemeinen einen Satz einzigartiger Stellen, die von Restriktionsenzymen erkannt werden, die multiplen Klonierungsstellen (MCS), worin eine oder mehrere Nichtvektorsequenzen insertiert werden können.
Unter "Nichtvektorsequenz" oder "Insert" ist demzufolge das gewünschte DNA-Segment zu verstehen, das an einer oder mehreren der Stellen der MCS, die in einem Vektor vorhanden sind, geklont werden soll. Das Insert kann ein oder mehrere Gene aufweisen.
"Expressionsvektoren" bilden eine Untergruppe der Vektoren, die aufgrund der Tatsache, dass sie die passenden regulatorischen Sequenzen umfassen, die Schaffung eines exprimierbaren Formats für die insertierte(n) Nichtvektorsequenz(en) ermöglichen, wodurch die Transkription und/oder Translation einer darin insertierten Nukleinsäure möglich ist. Expressionsvektoren sind im Fachgebiet bekannt und ermöglichen die Proteinexpression in Organismen, einschließlich Bakterien (z. B. Escherichia coli), Pilzen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris), Insektenzellen (z. B. Baculovirus-Expressionsvektoren), Tierzellen (z. B. COS- oder CHO-Zellen) und Pflanzenzellen (z. B. Expressionsvektoren auf Basis des Kartoffelvirus X, siehe z. B. Vance et al. 1998-WO9844097). Expressionsvektoren können beispielsweise Klonierungsvektoren, binäre Vektoren oder Integrationsvektoren sein.
Regulatorische Sequenzen, die die Expression in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen, insbesondere in nichtmonokotylen Pflanzen, gewährleisten, sind dem Fachmann gut bekannt. Eine bevorzugte regulatorische Sequenz ist die in SEQ ID NO: 1 angegebene regulatorische Sequenz, eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten. Bei Verwendung in eukaryontischen Zellen können die Vektoren auch Terminatoren umfassen, die Polyadenylations signale enthalten, welche einen 3'-Verlauf und die Polyadenylation eines primären Transkripts und die Beendigung der Transkription sichern. In Pflanzenzellen stammen die üblicherweise verwendeten Terminationssignale vom Nopalinsynthase-Gen oder dem CaMV 355-Terminator. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- und Translationsenhancer enthalten. Ein häufig bei Pflanzen verwendeter Translationsenhancer ist die CaMV-Omega-Sequenz. Es hat sich gezeigt, dass der Einschluss eines Introns Expressionsniveaus in bestimmten Pflanzen bis auf den Faktor 100 erhöht (Maiti et al., Transgenic Research 6, 143–156, 1997; Ni, Plant Journal 7 (1995), 661–676).
Vorteilhaft umfassen in der Erfindung verwendete Vektoren einen selektierbaren und/oder nachweisbaren Marker. Selektierbare Markergene, die bei der Selektierung von transformierten Pflanzenzellen, Kallus, Pflanzengewebe und Pflanzen nützlich sind, sind dem Fachmann gut bekannt. Resistenz gegen Antimetabolite ist als Grundlage für die Selektion nützlich: beispielsweise verleiht das dhfr-Gen Resistenz gegen Methotrexat (Reiss et al., Plant Physio. (Life Sci. Adv.) 13, 143–149, 1994); das npt-Gen verleiht Resistenz gegen die Aminoglycoside Neomycin, Kanamycin und Paromomycin (Herrera-Estrella et al., EMBO J. 2, 987–995, 1983); oder das hpt-Gen verleiht Resistenz gegen Hygromycin (Marsh, Gene 32, 481–485, 1984). Weitere selektierbare Markergene sind beschrieben, wie trpB, das die Nutzung von Indol anstatt Tryptophan in Zellen ermöglicht; hisD, das die Nutzung von Histinol anstatt Histidin in Zellen ermöglicht (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8047, 1988); Mannose-6-Phosphatisomerase, die die Nutzung von Mannose ermöglicht (WO 94/20627) und Ornithindecarboxylase, die Resistenz gegen den Ornithindecarboxylase-Hemmer 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin oder DFMO verleiht (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) oder das Deaminase-Gen aus Aspergillus terreus, das Resistenz gegen Blasticidin S verleiht (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 2336–2338, 1995). Nützliche nachweisbare Marker sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und im Handel erhältlich. Vorteilhaft handelt es sich bei dem Marker um eine genkodierende Luciferase (Giacomin, Pl. Sci. 116, 59–72, 1996; Srikantha, J. Bact. 178, 121, 1996), ein grün fluoreszierendes Protein (Gerdes, FEBS Lett. 389, 44–47, 1996; Haseloff et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 94, 2122–2127, 1997) oder β-Glucuronidase (Jefferson, EMBO J. 6, 3901–3907, 1987). Vektoren können ferner Primer-Stellen bereitstellen, z. B. für PCR-, Transkriptions- und/oder Translationsinitiations- und/oder regulatorische Stellen, Rekombinationsstellen, Replions usw.
Die vorliegende Erfindung umfasst eindeutig jede rekombinante Nukleinsäure, jeden Vektor oder Expressionsvektor, die bzw. der die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz und/oder eine wie vorstehend definierte Nichtvektorsequenz umfasst.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine nichtmonokotyle Pflanzenzelle, die eine wie vorstehend beschriebene rekombinante Nukleinsäure umfasst. Die rekombinante Nukleinsäure kann stabil in das Genom der nichtmonokotylen Pflanzenzelle integriert sein. Die Erfindung stellt auch eine Pflanzenzellenkultur, einen Kallus, eine Pflanze oder einen Pflanzenteil bereit, die bzw. der von diesen Pflanzenzellen abgeleitet ist. In den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fällt auch ein erntebares Teil, Organ, Gewebe oder Vermehrungsmaterial einer erfindungsgemäßen Pflanze, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, umfassend eine regulatorische Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten.
Ferner wird ein Verfahren zum Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanzenzelle bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in diese Pflanzenzelle eine regulatorische Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten einführt und wobei die regulatorische Sequenz fähig ist, die Expression der Nukleinsäuresequenz, bei der es sich entweder um eine isolierte oder um eine endogene Nukleinsäuresequenz handelt, voranzutreiben.
Zu Mitteln zum Einführen rekombinanter DNA in Pflanzengewebe gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Transformation unter Verwendung von CaCl₂ und Variationen davon (Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (4), 557–580, 1983), direkte DNA-Aufnahme in Protoplasten (Krens et al., Nature 296, 72–74, 1982; Paszkowski et al., EMBO J. 3, 2717–2722, 1984), PEG-vermittelte Aufnahme in Protoplasten (Armstrong et al., Plant Cell Reports 9, 335–339, 1990), Bombardierung mit Mikroteilchen, Elektroporation (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5824–5826, 1985) Mikroinjektion von DNA (Crossway et al., Mol. Gen. Gen. 202, 179–185, 1986; Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5824–5826, 1985), Bombardierung von Gewebeexplantaten oder Zellen mit Mikroteilchen (Christou et al., Plant Physiol. 87, 671–674, 1988), Vakuuminfiltration von Gewebe mit Nukleinsäure oder, im Falle von Pflanzen, T-DNA-vermittelter Transfer von Agrobacterium in das Pflanzengewebe, im Wesentlichen wie beschrieben (An et al., EMBO J. 4, 277–284, 1985; Dodds, Plant genetic engineering, 1985; Herrera-Estrella et al., EMBO J. 2, 987–995, 1983; Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209–213, 1983).
Beim Bombardieren von Zellen mit Mikroteilchen wird ein Mikroteilchen unter Bildung einer transformierten Zelle in eine Zelle geschleudert. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung kann jede geeignete Methodik und Vorrichtung für die ballistische Zelltransformation verwendet werden. Beispielhafte Vorrichtungen und Verfahren sind von Stomp et al. (US-Patent Nr. 5122466) und Sanford und Wolf (US-Patent Nr. 4945050) offenbart. Bei der Verwendung von Verfahren für die ballistische Zelltransformation kann das Genkonstrukt ein Plasmid einschließen, das zur Replikation in der zu transformierenden Zelle fähig ist. Zu Beispielen für Mikroteilchen, die zur Verwendung in derartigen Systemen geeignet sind, gehören Goldkügelchen mit einem Durchmesser von 1–5 μm. Das DNA-Konstrukt kann mithilfe jeder geeigneten Technik, wie Ausfällen, auf dem Mikroteilchen abgeschieden werden.
Die wie vorstehend erfindungsgemäß definierte Nukleinsäure oder ein genetisches Konstrukt, das diese umfasst, kann unter Verwendung jedes bekannten Transfektions- oder Transformationsverfahren in eine Zelle eingeführt werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von nichtmonokotylen transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben, umfassend das Einführen eines ersten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls in operativer Verknüpfung mit einer assoziierten Nukleinsäuresequenz, wobei die assoziierte Nukleinsäuresequenz heterolog zur ersten Nukleinsäure ist, in eine nichtmonokotyle Pflanze, Pflanzenzelle oder ein derartiges Pflanzengewebe. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine nichtmonokotyle transgene Pflanzenzelle oder Pflanze, wie hier vorstehend beschrieben, wobei die erfindungsgemäße Nukleinsäure stabil in das Genom der nichtmonokotylen transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze integriert ist.
Nach der Transformation einer Zelle mit dem erfindungsgemäßen genetischen Konstrukt kann daraus eine vollständige Pflanze erzeugt werden. Pflanzengewebe, das zu einer anschließenden klonalen Vermehrung fähig ist, ob mittels Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert und daraus eine vollständige Pflanze erzeugt werden. Das gewählte Gewebe ist von den Systemen für klonale Vermehrung abhängig, die für die fragliche zu transformierende Art zur Verfügung stehen und am besten geeignet sind. Zu beispielhaften Zielgeweben gehören Blattscheiben, Pollen, Embryos, Keimblätter, Keimachsen, Megagametophyte, Kallusgewebe, vorhandenes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristem) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Keimblattmeristem und Keimachsenmeristem). Der Begriff "Organogenese" bedeutet im Sinne der Erfindung ein Verfahren, mit dem Triebe und Wurzeln sequenziell aus Meristemazentren entwickelt werden. Der Begriff "Embryogenese" bedeutet im Sinne der Erfindung ein Verfahren, mit dem Triebe und Wurzeln gemeinsam auf konzertierte Weise (nicht sequenziell) aus somatischen Zellen oder Gameten entwickelt werden.
Die gebildeten transformierten nichtmonokotylen Pflanzen lassen sich mittels einer Vielfalt von Möglichkeiten, wie klonale Vermehrung oder klassische Zuchttechniken, vermehren. Eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) kann sich selbst befruchten, was zu homozygoten Transformanden der zweiten Generation (oder T2) führt, und die T2-Pflanzen können mittels klassischer Zuchttechniken vermehrt werden. Die im Sinne der Erfindung denkbaren gebildeten transformierten Pflanzen können eine Vielfalt von Formen annehmen. Beispielsweise können sie Chimären transformierter Zellen und nichttransformierte Zellen; klonale Transformanden (z. B. alle Zellen, die derart transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten); Pfropfreis transformierter und nichttransformierter Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein nichttransformiertes Reis aufgepfropft ist) sein.
Die Erfindung betrifft nicht nur eine transgene nichtmonokotyle Pflanze oder ein transgenes nichtmonokotyles Pflanzengewebe, die bzw. das hier beschriebene Pflanzenzellen umfasst, sondern erstreckt sich auch auf die erntebaren Teile der transgenen Pflanze, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Samen, Blättern, Blüten, Früchten, Stammkulturen, Wurzeln, Knollen, Rhizomen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft auch die Nachkommen, die von diesen transgenen Pflanzen und Pflanzenteilen abgeleitet sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung einer wie vorstehend gekennzeichneten isolierten Nukleinsäuresequenz, die eine regulatorische Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten umfasst zum Vorantreiben der konstitutiven Expression einer assoziierten Sequenz in einer nichtmonokotylen Pflanzenzelle oder Pflanze. Ebenfalls eingeschlossen ist die Verwendung einer regulatorischen Hybrid-Nukleinsäure, wie vorstehend definiert, zum Vorantreiben der konstitutiven Expression einer assoziierten Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanzenzelle oder Pflanze.
Beschreibung der Zeichnungen
1: Typisches GUS-Expressionsmuster in einer Pflanze Arabidopsis thaliana, die mit einem p2203-Konstrukt transformiert wurde, und einer Kontrollpflanze. Die regulatorische GOS2-Sequenz zeigt eine kräftige konstitutive Expression in dem Triebgewebe, einschließlich der Blattstiele, dem Gefäßsystem, Trichomen und in Wurzelspitzen. Die Expression in anderen Wurzelgeweben ist geringer, aber immer noch ohne weiteres bemerkbar.
2: GUS-Expression gesteuert von der regulatorischen GOS2-Sequenz (Linien AT0476-09 und AT0476-11) verglichen mit der GUS-Expression gesteuert von dem 35S-Promotor (Linie WS35S:GUS). Mit jeder Linie wurden 5 Kopien getestet. Die gezeigten Pflanzen haben 2 Keimblätter und 2 echte Blätter und wurden 1 Stunde (Platte a) oder über Nacht (Platte b) gefärbt.
3: GUS-Expression gesteuert von der regulatorischen GOS2-Sequenz (Linien AT0476-09 und AT0476-11) verglichen mit der GUS-Expression gesteuert von dem 35S-Promotor (Linie WS35S:GUS). Mit jeder Linie wurden 5 Kopien getestet. Die gezeigten Pflanzen sind im Stadium mit 10 Blättern und wurden 1 Stunde (Platte a) oder über Nacht (Platte b) gefärbt.
4: GUS-Expression gesteuert von der regulatorischen GOS2-Sequenz (Linien AT0476-09 und AT0476-11) verglichen mit der GUS-Expression gesteuert von dem 35S-Promotor in Linie WS35S:GUS. Mit jeder Linie wurden 5 Kopien getestet. Die gezeigten Pflanzen sind im adulten Stadium mit einem Blütenstand und wurden 1 Stunde (Platte a) oder über Nacht (Platte b) gefärbt.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird anschließend anhand der nachfolgenden Beispiele ausführlich beschrieben.
DNA-Manipulation
Alle DNA-Prozeduren wurde gemäß Standardprotokolls (Maniatis T et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) durchgeführt.
Beispiel 1: Klonieren von GUS mit einer für Introns kodierenden Sequenz
Das β-Glucuronidase-Gen von E. coli, das durch das zweite Intron des lichtinduzierbaren gewebespezifischen ST-LS1-Gens der Kartoffel unterbrochen war, wurde mit dem Vektor pTHW136 (der eine Kassette enthielt, die mit der von pMOG553, MOGEN international n.v, LEIDEN, NIEDERLANDE, identisch ist) amplifiziert. Die cDNA wurde mittels PCR mit Platin-Pfx-DNA-Polymerase (Invitrogen) und unter Verwendung eines Sense-Primers mit attB1 (SEQ ID NO: 2) und eines Antisense-Primers mit attB2 (SEQ ID NO: 3) amplifiziert.
Bedingungen für PCR: 2 Minuten Denaturieren bei 94°C (1 Zyklus); 35 Zyklen mit 1 Minute Denaturieren bei 94°C, 1 Minute Annealing bei 58°C und 2 Minuten Amplifizieren bei 68°C und schließlich 1 Zyklus mit 5 Minuten Verlängern bei 68°C. Ein hervorstechendes Fragment mit der erwarteten Größe von 2 kb wurde aus dem Gel isoliert und mithilfe des Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, Orange, Kalifornien) gereinigt.
Das gereinigte PCR-Fragment wurde in einer üblichen Gateway^TM BP-Reaktion (Invitrogen) mit pDONR201 als Empfängervektor verwendet. Die Identität und die Basenpaarzusammensetzung des Inserts wurden durch Sequenzieren bestätigt. Die Integrität des gebildeten Plasmids wurde unter Verwendung von Restriktionsverdau bestätigt und das Plasmid erhielt die Bezeichnung p0604 (Entry Clone). pDONR201 wurde von Invitrogen geliefert.
p0604 ist ein Gateway^TM "Entry Clone" und wurde derart in einer üblichen Gatewa^TM-LR-Reaktion mit p0640 als "Zielvektor" verwendet. Der gebildete Vektor war p02203, dessen Integrität wurde ebenfalls mittels Restriktionsverdauanalyse bestätigt. Der Vektor, der als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Region ein selektierbares Markergen und eine "Gateway-Kassette" enthielt, die für das LR-Klonieren der betreffenden Sequenzen gedacht war, wurde zur Transformation von Arabidopsis thaliana verwendet. Die Expression der betreffenden Sequenzen nach Rekombination in p0640 wurde von der unter SEQ ID NO: 1 angegebenen regulatorischen Sequenz vorangetrieben.
Beispiel 2: Transformation von Pflanzen
Anbau der Elternpflanzen
Für die Elternpflanzen wurden ungefähr 12 mg Samen von Wildtyp Arabidopsis thaliana (Ökotypus Kolumbien) in 27,5 ml 0,2% Agarlösung suspendiert. Die Samen wurden 2 bis 3 Tage lang bei einer Temperatur von 4°C inkubiert und dann gesät. Die Pflanzen keimten unter standardisierten Bedingungen: tagsüber 22°C, nachts 18°C, mit einer relativen Feuchtigkeit von 65–70%, 12 Stunden Lichtzeit und 15 min lange Bewässerung von unten mit Wasser alle 2 oder 3 Tage. Die Keimlinge wurden dann in Töpfe mit einem Durchmesser von 5,5 cm umgetopft, die eine Mischung aus Sand und Torf im Verhältnis 1 zu 3 enthielten. Die Pflanzen wurden dann weiter unter denselben Standardbedingungen wie oben beschrieben gezüchtet.
Wachstumsbedingungen für und Herstellung von Agrobacterium
Der Agrobacterium-Stamm C58C1RIF mit Helferplasmid pMP90 und Vektor p2203 wurde in ein 50-ml-Kunststoffröhrchen mit 1 ml LB (Luria-Bertani-Bouillon) ohne Antibiotika gegeben. Die Kultur wurde 8–9 h lang bei 28°C gerüttelt. Dann wurden 10 ml LB ohne Antibiotika in das Kunststoffröhrchen eingebracht und dieses über Nacht bei 28°C gerüttelt. Danach wurde die OD bei 600 nm ermittelt. Bei einer optischen Dichte von ungefähr 2,0 wurden 40 ml 10% Saccharose und 0,05% Silwet L-77 (eine Mischung aus 84% mit Polyalkylenoxid modifiziertem Heptamethyltrisiloxan und 16% Allyloxypolyethylenglycolmethylether, OSI Specialties Inc) zur Kultur gegeben. Die so erhaltene Agrobacterium-Kultur wurde zur Transformation der Pflanzen verwendet.
Blütentauchbad
Sobald jede parentale Blüte einen Blütenstand mit einer Höhe von 7–10 cm hatte, wurden die Blütenstände in die Agrobacterium-Kultur eingetaucht und 2–3 Sekunden lang vorsichtig geschwenkt. Für jede Transformation wurden 2 Pflanzen verwendet. Dann wurden die Pflanzen wieder unter den vorstehend beschriebenen Zuchtbedingungen gehalten.
Sammeln von Samen
5 Wochen nach dem Eintauchen der Blüten in Agrobacterium-Kultur wurde das Wässern der Pflanzen eingestellt. Die Pflanzen wurden weiter bei 25°C mit einer Lichtzeit von 20 Stunden inkubiert. Eine Woche später wurden die Samen geerntet und eine Woche lang in einen Samentrockner gegeben. Die Samen wurden dann gereinigt, in 15-ml-Kunststoffröhrchen gesammelt und bis zur weiteren Verarbeitung bei 4°C aufbewahrt.
T1-Samengeneration
Transgene T0-Samen wurden entsprechend ihrer Markerexpression selektiert und zum Keimen gebracht. Pflanzen wurden wie vorstehend beschrieben gezüchtet, bis die T1-Samen geerntet wurden. Die unterschiedlichen Linien erhielten die Bezeichnung AT0476-xx, wobei xx eine Zahl ist.
Beispiel 3: Vergleich der regulatorischen GOS2-Sequenz und des 35S-Promotors in Arabidopsis:
Die Expressionsmuster des β-Glucuronidase-Gens und die Stärke der regulatorischen GOS2-Sequenz wurden mit denen des 35S-Promotors in Arabidopsis verglichen.
Verwendetes Pflanzenmaterial:

AT0476-11: Kassette GOS2-GUS und screeningfähige Markerkassette (Vektor p2203) (T1-Samen)
AT0476-09: Kassette GOS2-GUS und screeningfähige Markerkassette (Vektor p2203) (T1-Samen)
WS35S:GUS: Kassette 35S-GUS, keine Markerselektion, homozygote Linie von Versailles (homozygote T2-Samen), Wassilewskija-Hintergrund (WS).

Verfahren:
Ungefähr 100 Samen wurden nach Aufbewahrung bei einer Temperatur von 4°C über mindestens 2 Tage, in Erde gesät und die Pflanzen unter Standardbedingungen gezüchtet: tagsüber 22°C, nachts 18°C, relative Feuchtigkeit 65–70%, 12 Stunden Lichtzeit und 15 min lange Bewässerung von unten mit Wasser alle 2 oder 3 Tage.
Sobald die Pflanzen 2 Keimblätter und 2 echte Blätter aufwiesen, wurde die Markerexpression in den AT0476-Linien überwacht und die Pflanzen mit einheitlichen Markerexpressionsmustern behalten.
Dann wurden 10 Pflanzen jeder GOS2-Linie oder der 355-Linie vorsichtig aus der Erde entfernt und zu Identifikationszwecken gekennzeichnet. 5 der Pflanzen wurden 1 Stunde lang für GUS gefärbt, die anderen 5 Pflanzen über Nacht gefärbt. Die kurze Färbezeit war notwendig, um die relative Stärke der Promotoren qualitativ zu beurteilen. Wenn die Färbungsreaktion in weniger als 1 Stunde gesättigt war, musste die Inkubationszeit verkürzt werden. War die Färbung nach einer Stunde sehr leicht blau, kann die Inkubationszeit auf 2–3 Stunden verlängert werden. Schließlich wurden die gefärbten Pflanzen fotografiert. 20 weitere Pflanzen jeder Linie wurden vorsichtig aus der Erde entfernt und zur weiteren Zucht in kleine Einzeltöpfe umgetopft. Wenn die Pflanzen das Stadium mit 10 Blättern erreicht hatten, wurden erneut 10 Pflanzen jeder Linie isoliert, ge kennzeichnet und wie vorstehend beschrieben gefärbt. Die die gefärbten Pflanzen wurden fotografiert. Zur Blüte wurden 10 Pflanzen jeder Linie mit Schoten in verschiedenen Reifestadien isoliert und wie vorstehend beschrieben verarbeitet.
GUS-Färbeverfahren für Pflanzen
Das Material wurde mit 90% eiskaltem Aceton bedeckt und 30 min bei 4°C inkubiert. Nach 3 Wäschen von 5 Minuten mit Tris-Puffer [15,76 g Trizma HCl (Sigma T3253) + 2,922 g NaCl in 1 l zweifach destilliertem Wasser, pH mit NaOH eingestellt auf 7,0], wurde das Material in eine Tris/Hexacyanoferrat(III)/X-Gluc-Lösung [9,8 ml Tris-Puffer + 0,2 ml Hexacyanoferrat(III)-Stammlösung (0,33 g Kaliumferricyanat (Sigma P3667) in 10 ml Tris-Puffer) + 0,2 ml X-Gluc-Stammlösung (26,1 mg X-Gluc (Europa Bioproducts ML 113A) in 500 μl DMSO)] eingetaucht. Vakuuminfiltration wurde 15 bis 30 Minuten lang durchgeführt. Dann wurden die Proben für einen passenden Zeitraum (bis zu 16 Stunden) bei 37°C zur Entwicklung der blauen Farbe inkubiert. Die Proben wurden innerhalb von 5 Minuten dreimal mit Tris-Puffer gewaschen. Chlorophyll wurde in einer Serie mit 50%, 70% und 90% Ethanol (jeweils 30 Minuten) extrahiert, wobei die 90%ige Lösung wenn erforderlich aufgefrischt wurde.
Ergebnisse
Die regulatorische GOS2-Sequenz zeigt eine kräftige konstitutive Expression in Triebgewebe, einschließlich der Blattstiele, dem Gefäßsystem und Trichomen. Mit Ausnahme der Wurzelspitzen ist die Expression im Wurzelgewebe geringer, aber noch ohne weiteres nachweisbar (1).
Bei allen Pflanzen mit derselben Inkubationszeit während der Färbung (1 h oder über Nacht) war das Muster der GUS-Expression ähnlich. Die Färbung von GOS2-Pflanzen war in allen geprüften Stadien (2 Blätter + 2 Keimblätter, 10-Blätter-Stadium und Blütenstadium) genauso ausgeprägt wie bei 35S-Pflanzen. Die GOS2-Expression scheint in Arabidopsis genauso kräftig und genauso konstitutiv zu sein wie die 35S-Expression (2, 3 und 4).
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung einer isolierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz, die eine Regulationssequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten umfaßt, zum Vorantreiben der Expression einer assoziierten Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanze oder Pflanzenzelle, wobei die funktionelle Variante fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren.
Verwendung einer isolierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, wobei es sich bei der assoziierten Nukleinsäuresequenz um eine isolierte Nukleinsäuresequenz oder um eine Nukleinsäuresequenz, die in bezug auf die Wirtszelle, in die die isolierte regulatorische Nukleinsäuresequenz eingeführt wird, endogen ist, handelt.
Nichtmonokotyle Pflanzenzelle, die in ihr(em) Genom eine rekombinante Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante davon, wobei die funktionelle Variante fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren, umfaßt bzw. stabil integriert hat.
Nichtmonokotyle Pflanzenzelle nach Anspruch 3, wobei die nichtmonokotyle Pflanzenzelle von einer Futter- oder Weidenleguminose, von einer Zierpflanze, von einer als Nahrung dienenden Kulturpflanze, von einem Baum oder von einem Strauch, vorzugsweise von Baumwolle, von der Kartoffel, von der Tomate, von Kohl, von der Zuckerrübe, von der Sojabohne, von der Bohne, von der Sonnenblume oder von Erbsen, stammt.
Pflanzenzellkultur, Kallus oder Pflanze, die bzw. der im wesentlichen oder teilweise aus Pflanzenzellen nach Anspruch 3 oder 4 besteht.
Erntebares Teil, Organ, Gewebe oder Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach Anspruch 5, umfassend eine Nukleinsäuresequenz umfassend eine regulatorische Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten, zum Vorantreiben der Expression einer assoziierten Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanze oder Pflanzenzelle, wobei die funktionelle Variante fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren.
Verfahren zum Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanze oder Pflanzenzelle, wobei das Verfahren umfaßt, daß man in diese Pflanze oder Pflanzenzelle eine regulatorische Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines ihrer funktionellen Fragmente oder eine ihrer funktionellen Varianten, zum Vorantreiben der Expression einer assoziierten Nukleinsäuresequenz in einer nichtmonokotylen Pflanze oder Pflanzenzellen, wobei die funktionelle Variante fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren, einführt und wobei die regulatorische Sequenz fähig ist, die Expression der Nukleinsäuresequenz, bei der es sich entweder um eine isolierte oder um eine endogene Nukleinsäuresequenz handelt, voranzutreiben.
Verfahren zur Herstellung einer/eines nichtmonokotylen transgenen Pflanze, Pflanzenzelle, Pflanzengewebes, umfassend das Einführen eines ersten Nukleinsäuremoleküls in operativer Verknüpfung mit einer assoziierten heterologen Nukleinsäuresequenz in diese(s) nichtmonokotyle Pflanze, Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe, wobei es sich bei der ersten Nukleinsäure um die regulatorische Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante davon handelt, wobei die funktionelle Variante fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren, und wobei das erste Nukleinsäuremolekül fähig ist, die Expression der assoziierten heterologen Nukleinsäuresequenz voranzutreiben.