KR20030047880A - 선택된 유전자 서열의 부위 특이적 발현 및/또는 발달조절된 발현을 허용하는 대형 뉴클레오티드 서열로부터폐환형으로 방출될 수 있는 구조물 - Google Patents

선택된 유전자 서열의 부위 특이적 발현 및/또는 발달조절된 발현을 허용하는 대형 뉴클레오티드 서열로부터폐환형으로 방출될 수 있는 구조물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 비제한적이지만, 진핵생물 세포의 게놈과 같은 대형 뉴클레오티드 서열로부터 공유결합 폐환형으로 방출할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 구조물, 특히 유전자 구조물에 관한 것이다. 바람직하게는, 일단 방출되면, 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 형태로 재구성된다. 일개 구체예로서, 재구성된 폴리뉴클레오티드 서열은 그속에 삽입된 비제한적인 인트론 서열 또는 기타 스플라이스(splice) 시그널과 같은 외인성 뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 함께 코딩 서열을 포함한다. 코딩 서열의 발현 및 특히 전사는 이러한 외인성 서열의 스플라이싱 제거를 포함한다. 방출 및 환형화는 일반적으로 단백질-매개된 자극과 같은 자극에 대한 반응이다. 보다 자세하게는, 단백질은 바이러스 또는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유도된 단백질이거나 또는 발달상 및/또는 조직특이적으로 조절된 단백질이다. 본 발명의 구조물은 병원체에 대한 유전자 내성을 전달하거나 또는 암을 치료하거나 식물에서 우성 또는 자성 불임을 유도하는데 유용한 세포자살 또는 기타 세포 치사 메카니즘을 유도하는데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명의 구조물은 선택된 유전자 서열의 부위 특이적 발현 및/또는 발달상 조절된 발현을 허용한다.

Description

선택된 유전자 서열의 부위 특이적 발현 및/또는 발달 조절된 발현을 허용하는 대형 뉴클레오티드 서열로부터 폐환형으로 방출될 수 있는 구조물{A construct capable of release in closed circular form from a larger nucleotide sequence permitting site specific expression and/or developmentally regulated expression of selected genetic sequences}
본 명세서에 기재된 종래기술에 대한 참조는 이 종래기술이 호주나 다른 나라에서 일반적인 통상의 지식의 일부를 구성한다는 승인이나 어떤 형태의 제시로 간주되어서는 안된다.
재조합 DNA 기술이 점점 정교해짐에 따라서 의약, 원예 및 농업과 같은 다양한 기술분야에서 연구와 진보를 촉진시켜왔다. 특히 식물 세포와 같은 세포에서의 유용한 표현형 변화를 유발하는 병원체에서의 천연산출 유전자 메카니즘의 이용이 중요하다. 다양한 식물 병원체에 대한 식물에서의 내성을 유도하기 위한 메카니즘과 관련하여서는 원예분야에서 특히 뚜렷하다.
표적 바이러스로부터 유도된 트랜스진(transgene)과의 형질전환을 통하여 작물에서 바이러스 내성을 발생시키는데 있어서 상당한 진보가 있었다. 그러나, 트랜스진 내성을 통한 단쇄 DNA(ssDNA) 식물 바이러스를 제어하기 위한 수많은 시도에도 불구하고, RNA 식물 바이러스에 대하여 성공적이었던 전략은 ssDNA 식물 바이러스에 대해서는 효과적이지 못하였다. DNA 식물 바이러스 및 특히 단쇄 DNA(ssDNA) 식물 바이러스는 열대지방 및 아열대지방에서의 광범위한 과일, 채소, 알곡 및 섬유 작물에서 중요한 상업적 손실에 책임이 있다.
식물을 감염시키는 2그룹의 ssDNA가 있다. 이들은 제미니비리다애(Geminivirade) 및 최근 알려진 나노바이러스 그룹이다. 제미니비리다애의 구성원은 쌍을 이룬 비리온 및 1분열 또는 2분열 환상 ssDNA 게놈을 갖는다. 각 분자의 길이는 약 2.7 kb 이다. 제미니비리다애 속중에서, 베고모바이러스(begomoviruses) 및 마스트레바이러스(mastreviruses)가 가장 중요하다. 베고모바이러스는 백파리-유전전달되며 1분열 또는 2분열 게놈을 갖는다. 이러한 속에 속하는 구성원은 토마토(황화)잎 뒤틀림병 바이러스(대부분의 열대 및 아열대 지역을 통하여 널리 퍼진 다양한 상이한 바이러스로 구성), 아프리칸 카사바 모자이크(아프리카), 콩 골든 모자이크(남아메리카 및 중앙 아메리카), 뭉빈(mungbean) 황화 모자이크(인디아) 및 목화 잎 뒤틀림병(남아시아 및 남동 아시아) 바이러스와 같은 현대 농업에 있어서 가장 경제적으로 피해를 주는 바이러스들을 포함한다. 백파리 벡터, 베미시아 타바씨(Bemisia tabaci)의 공격적인 "B 생물형"의 광범위한 도입의 결과로 최근 다수의 베고모바이러스의 영향은 현저히 증가되었다. 마스트레바이러스는 농업분야에서 그 영향이 적지만 일부 작물에서 중요한 손실에 관련되어 있다. 이들 바이러스는 매미충에 의해 전달되며 1분열 게놈을 갖는다. 이 속(genus)에 속하는 구성원은 옥수수 스트리이크(아프리카), 밀 왜소증(유럽) 및 담배 황화 왜소증(호주) 바이러스를 포함한다.
나노바이러스는 등척 비리온과 환형 ssDNA 게놈을 갖지만, 이들 게놈은 각기 약 1 kb의 상이한 완전한 게놈 성분을 적어도 6개 갖는 다성분이다. 이들 바이러스는 나무호퍼에 의해 전달되며 바누아투(Vanuatu)에서만 보고된 1개 시험 나노바이러스, 코코넛 잎 부식 바이러스를 제외하고는 진디에 의해 전달된다. 경제적으로 가장 중요한 나노바이러스는 190년대 호주 바나나 산업을 거의 파괴시켰고 남태평양, 아시아 및 아프리카에서 주요 손실을 유발하는 바나나 송이모양 상부 바이러스(BBTV)이다. 지하 클로버 왜화병(호주), 파바 콩 괴사 황화(지중해) 및 코코넛 잎 부식(바누아투) 바이러스 모두는 현저한 수율 손실을 초래한다.
베고모바이러스, 마스트레바이러스 및 나노바이러스의 게놈 조직은 게놈 성분의 개수와 크기 및 유전자의 개수와 크기, 전사물의 가공, 유전자의 배향 등을 비롯한 중요한 차이를 갖는다. 그러나, 이들 바이러스는 매우 유사한 복제 및 감염 전략을 갖는 것을 보여주는 현저한 유사점이 있다. 모든 제미니바이러스 및 나노바이러스는 (i) 닉 생성(nicking) 및 결합 활성을 갖고 바이러스성 게놈의 회전 환상 복제를 지시하는 Rep 단백질; (ii) 비리온 피복 단백질; (iii) S 상으로 세포 이동을 초래하는 숙주 세포 망막모세포종(retinoblastoma)-유사 단백질 결합에 관여하는 단백질; (iv) 세포-대-세포 이동 단백질; 및 (v) 핵 셔틀 단백질을 암호화한다. 또한, 이들 바이러스는 인터제닉 영역(intergenic regions: IR)과 유사한 작용을갖는다. 예컨대 , 베고모바이러스의 IR, 마스트레바이러스의 LIR 및 바나나 송이모양 상부 나노바이러스의 CR-SL 모두는 (i) 모든 제미니바이러스 및 나노바이러스 사이에 고도로 보존되며 Rep 단백질에 의해 닉생성 및 결찰되는 부위인 노나뉴클레오티드(nonanucleotided) 루프 서열인 머리핀 구조; 및 (ii) Rep 단백질을 인식하는 영역내의 도메인을 함유한다. 마스트레바이러스의 SIR 및 바나나 송이모양 상부 나노바이러스의 CR-M은 비리온 ssDNA를 전사적으로 활성인 dsDNA로 전환하는 것을 유도하는데 관여하는 내인성 프라이머의 결합부위이다.
작물에서 RNA 바이러스에 대한 형질감염 내성 개발의 성공과 ssDNA 바이러스에 대한 이러한 내성의 필요성의 증가로 인하여 피복 단백질 유전자, 이동 단백질 유전자 및 Rep 단백질 유전자를 비롯한 다양한 바이러스 유전자를 표적으로 하는 ssDNA 바이러스에 대한 광범위한 전략 개발에 이르게되었다. 또한, 결함있는 방해DNA 및 자살 유전자를 이용한 전략도 조사되었다. 이 분야에서의 대부분의 작업은 마스트레바이러스 또는 나노바이러스 보다는 베고모바이러스와 관련되었다.
본 발명으로 이끄는 작업에 있어서, 본 발명자들은 식물에서 유전자 내성을 유도하기 위하여 ssDNA 바이러스의 복제 메카니즘을 이용하였다. 그러나, 본 발명은 자극에 대응하여 특정 표현형에 영향을 주도록 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 같은 유전자 활성 변형에서 다양한 적용을 갖는다.
본 발명은 일반적으로, 비제한적이지만, 진핵생물 세포의 게놈과 같은 대형 뉴클레오티드 서열로부터 공유결합 폐환형으로 방출할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 구조물, 특히 유전자 구조물에 관한 것이다. 바람직하게는, 일단 방출되면, 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 형태로 재구성된다. 일개 구체예로서, 재구성된 폴리뉴클레오티드 서열은 그속에 삽입된 비제한적인 인트론 서열 또는 기타 스플라이스(splice) 시그널과 같은 외인성 뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 함께 코딩 서열을 포함한다. 코딩 서열의 발현 및 특히 전사는 이러한 외인성 서열의 스플라이싱 제거를 포함한다. 상기 구체예에 따르면, 코딩서열은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 안티센스 또는 센스 핵산 분자 또는 리보자임(ribozyme)을 암호화할 수 있다. 다른 구체예로서, 재구성된 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 요소와 코딩서열 사이에 위치한 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 이 구체예에서, 코딩서열의 발현은 외인성 서열의존재에 의해 실질적으로 악영향을 받지 않는다. 다른 구체예로서, 재구성된 서열은 RNA 프로모터 또는 프로모터의 작용에 영향을 주지 않는 외인성 서열을 포함하는 기타 조절 유전자 서열을 형성한다. 방출 및 환형화는 일반적으로 단백질-매개된 자극과 같은 자극에 대한 반응이다. 보다 자세하게는, 단백질은 바이러스 또는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유도된 단백질이거나 또는 발달상 및/또는 조직특이적으로 조절된 단백질이다. 본 발명의 구조물은 병원체에 대한 유전자 내성을 전달하거나 또는 암을 치료하거나 식물에서 우성 또는 자성 불임을 유도하는데 유용한 세포자살 또는 기타 세포 치사 메카니즘을 유도하는데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명의 구조물은 선택된 유전자 서열의 부위 특이적 발현 및/또는 발달상 조절된 발현을 허용한다.
도1은 pTBN의 다이아그램을 도시
도2는 pTBN6의 다이아그램을 도시,
도3은 pTBN1의 다이아그램을 도시,
도4는 pRTBN6의 다이아그램을 도시,
도5는 pRTBN1의 다이아그램을 도시,
도6은 pRTBN 1/6의 다이아그램을 도시,
도7은 플라스미드 p35S-2301의 개략적 도시,
도8은 플라스미드 pTEST1의 개략적 도시,
도9는 플라스미드 pTEST2의 개략적 도시,
도10은 플라스미드 pTEST3의 개략적 도시,
도11은 플라스미드 pTEST4의 개략적 도시,
도12는 플라스미드 pBI-TYDV1.1mer의 개략적 도시,
도13은 플라스미드 p35S-Rep의 개략적 도시,
도14는 발현 벡터를 이용한 세포 치사 분석 결과의 그래프 표시. 에러 막대는 95% 신뢰구간을 도시한다.
도15는 발현 벡터를 이용한 재환형화 세포 치사 분석 결과의 그래프 표시. 에러 막대는 95% 신뢰구간을 도시한다.
도16은 발현 벡터를 이용한 유도성 재환형화 세포 치사 분석 결과의 그래프 표시. 에러 막대는 95% 신뢰구간을 도시한다.
도17은 플라스미드(A)p35S-BTR-LIR 및 (B) p35S-BUTR-LIR의 개략적 도시,
도18은 플라스미드(A)p35S-BTR 및 (B) p35S-BUTR의 개략적 도시,
도19는 플라스미드(A)pBTR.test1 및 (B) pBUTRtest1의 개략적 도시,
도20은 pGI의 다이아그램을 도시,
도21은 pGI6의 다이아그램을 도시,
도22는 pGI1의 다이아그램을 도시,
도23은 pRGI6의 다이아그램을 도시,
도24는 pRGI1의 다이아그램을 도시,
도25는 pRGI 1/6의 다이아그램을 도시,
도26은 플라스미드 pHSA1로부터의 인간 혈청 알부민의 Rep-활성화된 발현에 대해 제안된 모델의 개략적 도시,
도27은 유전자 발현의 센스/안티센스 모듈레이션에 사용하기 위한 구조물의 다이아그램을 도시.
발명의 요약
본 명세서를 통하여, 특별히 언급하지 않는 한 단어 "포함한다"는 기재된 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹을 포함하지만 다른 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹은 제외하는 것으로 이해된다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열확인번호(SEQ ID NO:)로 나타낸다. SEQ ID NOs:는 <400>1, <400>2 등과 같은 서열 확인번호에 숫자적으로 상응한다. 서열목록은 특허청구범위 뒤에 제공되어 있다.
본 발명의 제1 요지는, 진핵생물 세포의 게놈으로 통합되면, 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체에 의해 인식될 수 있는 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 인접한 유전자 요소를 포함하는 구조물을 제공함에 있어서, 상기 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체는 상기 유전자 요소 및 상기 인접 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부의 절단 및 환형화를 촉진시키며, 또 상기 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체에 의해 인식될 수 있는 뉴클레오티드 서열은 인트론 서열 또는 그의 일부 또는 기타 스플라이스 시그널을 비롯한 한 개 이상의 외인성 서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 비-환형의 상기 유전자 요소 및 기타 뉴클레오티드 서열은, 환형화되면, 환형화 이전에 또는 환형화 및 발현 이전에, 2개 모듈 뉴클레오티드 서열에는 존재하지 않는 특성을 나타내기 위한 특성 또는 능력을 나타내는 유전자 서열을 형성하는 2개 모듈 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로하는 구조물을 제공한다.
본 발명의 다른 요지는, Rep 단백질 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체의존재하에서 유전자 요소를 포함하는 환형 뉴클레오티드 서열의 생성을 촉진하는 Rep-단백질 인식서열 또는 다른 바이러스 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포로부터의 기능적 상동체와 인접하는 유전자 요소를 포함하는 구조물에 있어서,
상기 Rep-단백질 인식서열은 1개 이상의 인식서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 상기 유전자 요소는, 환형 분자내에 함유되어 있으면, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는데 필요한 조절서열과 기능적으로 결합된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 선형의 상기 유전자 요소는 5'에서 3' 순으로 폴리뉴클레오티드 서열 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 환형일 때 그의 발현을 허용하는 조절서열을 포함하며,
환형화 될 때, 상기 유전자 요소는 발현될 때 Rep 단백질 인식서열의 전부 또는 일부에 의해 상기 폴리뉴클레오티드 서열로부터 분리된 조절서열을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 발현산물을 암호화하는 것을 특징으로하는 구조물을 제공한다.
본 발명의 다른 요지는, 5'에서 3' 순으로 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구조물에 있어서,
상기 제1 및 제6 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이하며 각각 하나 이상의 Rep 단백질 또는 그의 유도체 또는 상동체에 의해 인식될 수 있는 Rep 단백질 인식서열을 포함하고 있어서, 상기 구조물이 게놈 서열과 같은 대형 뉴클레오티드 서열에 통합되면, 상기 제1 및 제6 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 상기 제1 및 제6 서열과 인접한 유전물질은 절단되어 환형화될 수 있으며, 상기 Rep 단백질 인식서열은 인트론 서열 또는 그의 일부 또는 다른 스플라이스 시그널을 비롯한 하나 이상의 외인성 서열과 인접하거나 그속에 삽입되며;
상기 제2 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분을 포함하고;
제3 뉴클레오티드 서열은 상기 제2 서열과 기능적으로 연결된 전사 터미네이터 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체이며;
제4 뉴클레오티드 서열은 제5 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 프로모터 서열이고;
제5 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분이며 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 부분은 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 코딩 서열을 나타내며;
1개 이상의 Rep 단백질 존재하에서, 상기 구조물이 게놈 서열과 같은 대형 뉴클레오티드 서열에 통합되면, 환형화된 유전자 서열은 상기 제1 및/또는 제6 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 외인성 서열 또는 기타 스플라이스 시그널의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 상기 프로모터 및 전사 터미네이터 서열을 순서대로 포함하는 상기 대형 뉴클레오티드 서열로부터 분리되게 생성되는 것을 특징으로하는 구조물을 제공한다.
본 발명의 다른 요지는 구조물을 생성하는데 사용하기 위한 유전자 요소에 있어서, 상기 유전자 요소는 5'에서 3' 방향으로 전사 터미네이터에 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분; 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하고, 환형화되면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5'부분은 외인성 서열 또는 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널의 전부 또는 일부에 의해 분리된 폴리뉴클레오티드 서열의 상기 3' 부분에 기능적으로 연결되는 것을 특징으로하는 유전자 요소에 관한 것이다.
본 발명의 다른 요지는 서열 31 내지 서열 36에 실질적으로 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 31 내지 서열 36과 60% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 31 내지 서열 36의 하나 이상과 하이브리드를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃에서 낮은 긴축(stringency) 조건하에서 상기의 상보적 형태를 포함하는 구조물을 제공한다.
본 발명의 다른 요지는, 5'에서 3' 순으로 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널과 인접하거나 그 속에 존재하는 Rep 단백질 인식서열, 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 부분, 전사 터미네이터 또는 그의 기능적 등가물, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단 부분에 기능적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는 구조물을 식물의 게놈에 도입하는 것을 포함하며,
상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 부분은 세포 치사 또는 잠복성을 유도할 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 코딩 영역 및 동일하거나 상이한 Rep 단백질 인식서열을 나타내며; 상기 식물 세포가, 인접하는 Rep 단백질 인식 서열을 인식할 수 있는 Rep 단백질을 갖는 ssDNA 바이러스에 의해 감염되면, 상기 구조물은 절단되어 환형화되므로 식물세포를 치사시키거나 아니면 식물세포를 잠복성으로 만드는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 발현될 형태의 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 재구성하는 것을 특징으로하는, ssDNA 바이러스에 대한 내성을 트랜스제닉 식물 또는 그의 후대에서 발생시키기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 요지는, Rep 단백질 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체의 존재하에서 유전자 요소를 포함하는 환형 뉴클레오티드 서열의 생성을 촉진하는 Rep-단백질 인식서열과 인접하는 유전자 요소를 포함하는 구조물에 있어서,
상기 Rep-단백질 인식서열은 인트론 서열 또는 그의 부분 또는 기타 스플라이스 시그널을 비롯한 1개 이상의 외인성 서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 상기 유전자 요소는 프로모터의 작용을 실질적으로 방해하는 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된 프로모터의 3' 부분 및 5' 부분을 포함하며, 선형의 상기 유전자 요소는 5'에서 3' 순으로,
상기 프로모터의 3' 부분;
경우에 따라 상기 프로모터의 3' 부분과 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드; 및
상기 프로모터의 5' 부분을 포함하며;
환형화될 때, 상기 유전자 요소는 Rep 단백질 인식 서열 및/또는 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널의 전부 또는 일부에 의해 분리되지만 프로모터의 활성을 불활성화시키지 않는 프로모터 서열의 5' 및 3' 부분을 포함하며, 상기 환형분자는 경우에 따라 폴리뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로하는 구조물을 제공한다.
프로모터는 DNA 프로모터 또는 RNA 프로모터일 수 있다.
서열 확인의 개요는 다음과 같다.
서열확인의 개요
서열확인 설명
서열 1 내지 서열 18 합성 올리고뉴클레오티드
서열 19 내지 서열 44 프라이머
서열 45 내지 서열 52 합성 올리고뉴클레오티드
서열 66 바르나제 pTBN
서열 67 바르나제 pRTBN6
서열 68 바르나제 pRTBN1
서열 69 GFP pGI
서열 70 GFP pGI6
서열 71 GFP pGI1
서열 72 프라이머
서열 73 프라이머
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 진핵생물 세포의 게놈으로부터 특정의 표적 서열을 절단 또는 환형화하기 위해 바이러스 유도된 복제 촉진 단백질을 사용할 수 있다는 인지를 기초로 일부 예상되었다. 용어 "절단"은 이 경우 표적 서열의 방출, 보다 자세하게는 표적 서열의 복제 방출을 포함한다. 바이러스 유도된 복제촉진 단백질은 바이러스 유도된 복제촉진 단백질에 특이적이고 그에 의해 인식되는 특정 서열과 인접하는 유전자 요소의 닉 생성, 절단 및 환형화를 개시한다. 본 발명은 바이러스 유도된 복제촉진 단백질의 유도체 및 그의 진핵생물 및 원핵생물 상동체에도 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열의 분해와 결찰을 촉진시킬 수 있고 이후 "인식 서열"로 지칭되며 "외인성 서열"로도 간주될 수 있는 임의 서열에도 관한 것이다.
일개 구체예로서, 환형화 과정은 발현시 스플라이싱될 수 있는 외인성 서열에 의해 분리된 2개 모듈 성분으로부터의 특정 유전자 서열의 형성을 허용한다. 환형화 하기 전에, 모듈 성분들은 유전적으로 분리되므로 기능적으로 연결되어 있지 않다. 기능적 연결은 예컨대 일개 구체예로서 발현될 모듈 성분을 포함하는 유전자 서열능에 의해 효과적으로 나타난다. 본 명세서에서 용어 "발현된다"는 것은 mRNA 서열로의 전사 및 경우에 따라 mRNA 서열의 번역산물로의 번역을 포함한다. 그러나, 발현은 모듈 성분으로부터 유전자 서열의 구성을 위한 유일한 기준은 아니다. 다른 구체예로서, 이후의 환형화에 의해 생성된 유전자 서열은 발현에 필요하지 않은 기타 유용한 기능을 가질 수 있다. 예컨대, 생성한 유전자 서열은 단백질 결합 인식 서열을 포함할 수 있으므로, 특정 세포질 또는 핵 단백질을 표적으로 할 수 있다. 다르게는, 재구성된 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 요소 및 코딩 서열 사이에 외인성 서열을 포함한다. 전자의 경우, 프로모터는 바람직하게는 TMV, AMV 또는 TEV 바이러스와 같은 RNA 프로모터이다.
다르게는, 프로모터는 인식의 삽입이 그의 활성에 실질적으로 나쁜 영향을 주지 않는 DNA 프로모터이다.
따라서, 본 발명의 제1 요지는 진핵생물 세포의 게놈으로 통합되면, 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체에 의해 인식될 수 있는 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 인접한 유전자 요소를 포함하는 구조물을 제공함에 있어서, 상기 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체는 상기 유전자 요소 및 상기 인접 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부의 절단 및 환형화를 촉진시키며, 또 상기 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물또는 원핵생물 세포 상동체에 의해 인식될 수 있는 뉴클레오티드 서열은 인트론 서열 또는 그의 일부 또는 기타 스플라이스 시그널을 비롯한 한 개 이상의 외인성 서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 비-환형의 상기 유전자 요소 및 기타 뉴클레오티드 서열은, 환형화되면, 환형화 이전에 또는 환형화 및 발현 이전에, 2개 모듈 뉴클레오티드 서열에는 존재하지 않는 특성을 나타내기 위한 특성 또는 능력을 나타내는 유전자 서열을 형성하는 2개 모듈 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로하는 구조물을 제공한다.
용어 "구조물"은 그의 가장 넓은 의미로 이용되며 유전자 구조물, 핵산 분자, 벡터, 플라스미드 또는 2개 이상의 이종 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 상기 구조물은 상이한 유전자 공급원으로부터의 2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 처리된 재조합 분자이다. 일개 구체예로서, 상기 구조물은 분리된 형태이다. 용어 "분리된"은 생물학적으로 순수, 실질적으로 순수 또는 상기 구조물을 포함하는 샘플에 대한 적어도 1번의 정제 단계를 실시한 조건을 포함한다. "정제 단계"는 예컨대 석출, 원심분리 및/또는 크로마토그래피법 또는 전기영동분리법을 포함한다. 다른 구체예에서, 유전자 구조물은 숙주 세포의 게놈으로 통합된다. 상기 구조물은 통합에 이어 상실되거나, 제거되거나 재배열되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예로서, 상기 구조물은 생체내에서 생성되거나 또는 숙주세포의 게놈으로부터 절단된 다음 생성된 환형이다.
용어 "유전자 요소"는 그의 가장 넓은 의미로 사용되며 유전자 요소의 5'에서 3' 또는 3'에서 5' 방향에 대하여 특정 순서로 처리된 2개 이상의 뉴클레오티드서열을 포함한다. 본질적으로, 유전자 요소는 모듈 형태의 2개 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용어 "모듈"은 뉴클레오티드 서열의 작성 또는 구조에 어떠한 제한을 주는 것은 아니지만 단일 유전자 서열이 2개 성분, 즉 모듈 성분으로 나누어지는 것을 의미한다. 환형화 되면, 2개 모듈 성분은 함께 작용하여 인트론 및 스플라이스 서열 또는 기타 인식 서열을 포함한 외인성 서열을 제거한 후, 유전자 서열이 분리된 모듈 형태일 때는 존재하지 않는 특정 활성 또는 특성을 나타내는 단일 유전자 서열을 구성하게된다. 특정환경에서, 환형일 때 2개 모듈 성분을 개재하는 외인성 서열은, 환형화후 서로에 대하여 정확한 방향으로 구성되면 이들의 존재가 모듈 성분의 작용에 나쁜 영향을 주지 않는 한 제거될 필요가 없을 수 있다. 일반적으로, 모듈 성분은 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분 및 3' 부분으로 지칭한다. 한 부분은 소수의 뉴클레오티드(즉 약 2 내지 약 500) 내지 다수(즉, 약 501 내지 약 10,000)의 뉴클레오티드를 포함한다. 5' 및 3' 부분은 중앙 부분을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예로서, 유전자 요소는, 환형일 때, 2개 모듈 서열을 포함하는 유전자 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 상기 2개 모듈 서열은 인트론 서열, 스플라이스 시그널 또는 기타 인식 서열에 의해 분리될 수 있다. 따라서 유전자 요소는 환형형태의 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분을 포함하는 제1 모듈 뉴클레오티드 서열, 상술한 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분에 기능적으로 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 환형화되면, 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분은 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분에 대한 염기 연결에 의해배치 융합된다. 구조물에 따라서, 인트론 서열, 스플라이스 시그널 또는 기타 인식 서열은 재구성된 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 부분을 분리시킬 수 있다. 발현하는 동안 처리되면, 인트론 서열, 스플라이스 시그널 또는 기타 인식 서열은 절단될 수 있다. 특히 바람직한 구체예로서, 유전자 요소는 기능적으로 연결되고 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분의 하류에 존재하는 전사 터미네이터 서열을 포함한다. 이러한 "프로모터" 및 "터미네이터"와 같은 용어는 이들의 가장 넓은 의미로 이용되며 이하에 상세하게 설명되어 있다.
다른 구체예로서, 재구성된 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 요소와 코딩 서열 사이에 배치된 인트론, 스플라이스 시그널 또는 기타 인식서열을 암호화한다. 본 구체예에 따르면, 인식서열은 전사되는 동안은 제거되지 않을 것이다.
본 발명의 다른 구체예로서, 유전자 요소는 프로모터 또는 기타 조절 서열의 2개 모듈 성분을 포함한다. 바람직하게는, 모듈 성분은 환형화후 프로모터 서열을 형성한다. 인트론 서열, 스플라이스 시그널 또는 기타 인식서열이 프로모터 서열의 모듈 성분을 분리하면, 이러한 서열은 프로모터 서열의 활성을 전혀 또는 부분적으로 파괴하지 않는다. 다르게는, 프로모터는 TMV, AMV 또는 TEV로부터의 프로모터와 같은 RNA 프로모터이다.
폴리뉴클레오티드 서열은, 재구성되면, 환형화에 이은 융합 전에 분리된 모듈 뉴클레오티드 서열에는 존재하지않는 활성 또는 특성을 나타내는 활성 또는 특성 또는 능력을 나타낸다. 이러한 활성 또는 특성은 특정 기능을 갖는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 능력, 펩티드, 폴리페티드 또는 단백질로 번역될 수 있거나 숙주 유전자 또는 기타 유전자 서열의 다운-조절을 위한 안티센스 또는 센스 분자로서 작용할 수 있거나 프로모터 또는 기타 조절서열로 작용하는 mRNA 서열을 암호화하는 능력을 포함한다. 유전자 서열로써 숙고할 수 있는 다른 특성은 단백질과 결합하여 핵산 조절 서열과 상호작용하는 능력 또는 리보자임 및/또는 데옥시리보자임 분자로 작용하거나 이를 암호화하는 능력을 포함한다.
특히 중요한 것은, 유전자 서열이 효소 활성, 조절 활성 또는 구조적 활성을 갖는 단백질을 암호화할 수 있거나 또는 인간 또는 가축과 같은 포유동물에 투여되면 치료활성을 나타낼 수 있다. 이런 유형의 분자의 예는 시토킨, 인터페론 및 성장인자를 포함한다. 효소활성을 갖는 단백질이 특히 바람직하고 이러한 단백질은 생화학적 경로에 작용하고, 대사물질의 흐름을 특정 경로로 내려보내는 작용을 하며, 살충제, 살균제 또는 제초제에 대한 내성과 같은 특성을 부여하거나 바이러스를 비롯한 세포내 병원체 및 세포내 미생물과 같은 병원체에 대한 내성을 부여하는데 효과적이다. 본 발명의 유전자 구조물에 대한 표적으로 고려되는 세포는 동물세포, 식물세포, 단세포 생물 및 미생물을 포함한다. 동물 세포는 척추동물, 인간, 가축, 조류, 물고기, 파충류, 양서류 및 곤충과 거미류로부터 얻은 것일 수 있다. 식물세포는 단자엽 또는 쌍자엽 식물로부터 얻은 것일 수 있다.
특히 유용한 일개 구체예로서, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 세포자살 또는 기타 형태의 세포 치사를 유도한다. 이것은 예컨대 바이러스에 대한 유전자 내성을 촉진하는 수단 또는 특정 유형의 세포의 세포 치사를 매개하는데 유용하다.
일개 구체예로서, 예컨대, 본 발명의 구조물은 단쇄 DNA(ssDNA) 바이러스에 대한 내성을 유도하기 위해 사용된다. 이러한 바이러스는 중요한 작물 및 관상식물을 감염시키는 것에 의해 농업 및 원예 산업에 심각한 손상을 유발한다. 식물을 감염시키는 ssDNA 바이러스의 2개 그룹은 제미니바이러스 및 나노바이러스이다.
일개 구체예로서, 바이러스 유도된 복제촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 상동체에 의해 인식될 수 있는 측면 서열은 머리핀 뉴클레오티드 구조이다. 바람직하게는, 이러한 머리핀 구조는 바이러스 유도된 복제촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 상동체에 의한 닉(nick) 생성 및 결찰을 위한 부위인 약 5 내지 약 20개, 바람직하게는 약 6 내지 약 15개, 가장 바람직하게는 약 9개 뉴클레오티드(즉, 노나뉴클레오티드)의 짧은 뉴클레오티드 서열 루프를 포함한다. 다른 구체예로서, 상기 측면 서열은 분해 및 결찰 활성을 갖는 단백질에 의해 인식된다. 이러한 단백질의 예는 토포아이소머라제(topoisomerase)이다. 이들 모든 서열은 본 명세서에서 "인식서열"로 지칭한다. 가장 바람직하게는, 이들 인식서열은 "Rep" 단백질로 칭한다. 이 단백질은 제미니비리다애 및 나노바이러스의 구성원으로부터 유도되며 인식서열을 포함하는 머리핀 구조상의 5' 도메인에 결합된다. 그러나, 본 발명은 머리핀 구조의 사용이 포함되어 있긴 하지만, 머리핀 구조의 사용에만 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 제미니바이러스 또는 나노바이러스로부터의 Rep 단백질 뿐만 아니라 그의 유도체 또는 다른 바이러스 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포로부터의 상동체에도 관한 것이다. 진핵생물 세포의 예는 포유동물, 곤충, 파충류, 양서류 및 효모 세포를 포함한다.
기타 인식 세포 또는 이들의 등가물의 예는 TLCV 또는 TYDV의 ??고 긴 반복체인 BBTV DNA 1-6의 유전자내 영역을 포함한다. "인트론 서열"은 전사 이후에는 스플라이싱되는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 환경에서, 인트론 서열은 인트론 서열의 존재가 인트론 서열이 삽입된 서열의 작용에 아무런 나쁜 영향을 주지 않을 경우 스플라이싱되지 않는다.
본 발명이 상기 요지에 따른 구조물은 측면서열과 동일하거나 실질적으로 동 일한 인식서열, 즉 단일 Rep 단백질 또는 그의 유도체 또는 상동체에 의해 인식될 수 있는 서열을 포함할 수 있거나 또는 상이한 Rep 단백질 또는 그의 유도체 또는 그의 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체에 의해 인식될 수 있는 상이한 인식서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 인식서열은 전체 서열이거나 2개의 절반 인트론 서열과 같은 부분 서열일 수 있다.
Rep 단백질은 바이러스성 감염과 같이 세포에 도입되거나 또는 상기 구조물을 갖고 있는 동물 또는 식물 또는 생물에서 발달상 또는 조직 특이적으로 발현되는 유전자 서열에 의해 암호화될 수 있다.
다른 바람직한 구체예로서, Rep 단백질 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체의 존재하에서 유전자 요소를 포함하는 환형 뉴클레오티드 서열의 생성을 촉진하는 Rep-단백질 인식서열 또는 다른 바이러스 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포로부터의 기능적 상동체와 인접하는 유전자 요소를 포함하는 구조물에 있어서,
상기 Rep-단백질 인식서열은 1개 이상의 인식서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 상기 유전자 요소는, 환형 분자내에 함유되어 있으면, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는데 필요한 조절서열과 기능적으로 결합된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 선형의 상기 유전자 요소는 5'에서 3' 순으로 폴리뉴클레오티드 서열 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 환형일 때 그의 발현을 허용하는 조절서열을 포함하며,
환형화 될 때, 상기 유전자 요소는 발현될 때 Rep 단백질 인식서열의 전부 또는 일부에 의해 상기 폴리뉴클레오티드 서열로부터 분리된 조절서열을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 발현산물을 암호화하는 것을 특징으로하는 구조물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조절서열은 프로모터 서열 및 경우에 따라 전사 터미네이터를 포함한다. 상술한 바와 같이, 인식서열은 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널과 같은 외인성 서열을 포함한다.
다른 구체예로서, Rep 단백질 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체의 존재하에서 유전자 요소를 포함하는 환형 뉴클레오티드 서열의 생성을 촉진하는 Rep-단백질 인식서열과 인접하는 유전자 요소를 포함하는 구조물에 있어서,
상기 Rep-단백질 인식서열은 인트론 서열 또는 그의 일부 또는 기타 스플라이스 시그널을 비롯한 1개 이상의 외인성 인식서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 상기 유전자 요소는 프로모터의 작용을 실질적으로 방해하기 위하여 뉴클레오티드 서열의 길이로써 분리된 프로모터의 3' 부분 및 5' 부분을 포함하며, 선형의 상기 유전자 요소는 5' 내지 3' 순으로 상기 프로모터의 3' 부분, 경우에 따라 상기 프로모터의 상기 3' 부분과 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열 및 상기 프로모터의 5' 부분을 포함하며,
환형화 될 때, 상기 유전자 요소는 Rep-단백질 인식 서열의 전부 또는 일부에 의해 분리되지만 프로모터의 활성을 불활성화시키지 않은 프로모터 서열의 5' 및 3' 부분을 포함하며, 상기 환형 분자는 경우에 따라 폴리뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 구조물이 제공된다.
다르게는, 상기 프로모터는 TMV, TEV 또는 AMV와 같은 RNA 프로모터이다.
이러한 시스템의 이점은 상기 구조물이 선형일 때 또 예컨대 게놈과 같은 대형 뉴클레오티드 서열에 통합될 때, 상기 프로모터 서열이 불활성이라는 점이다. 그러나, 환형일 때, 상기 프로모터는 재구성되어서 프로모터 활성을 갖는다. 경우에 따라 존재하는 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열이 발현된다.
적합한 프로모터의 예는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 포함한다. 다른 유용한 프로모터는 유비퀴틴 프로모터이다. 일반적으로, 유비퀴틴 프로모터와 같은 단자엽 프로모터는 프로모터와 발현 엑손의 출발 코돈 사이에 인트론 서열을 필요로한다. 이러한 인트론 서열이 존재하지 않으면, 프로모터의 발현이 아주 낮거나 완전히 부족하다. 본 발명의 유전자 구조물은, 환형화되면, 머리핀 구조를 포함하는 인트론 서열이 유비퀴틴 프로모터의 하류에 인트론 서열을 형성함으로써 작용하게한다.
다른 적합한 프로모터는 이하에 기재한 바와 같다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 5'에서 3' 순으로 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구조물에 있어서,
상기 제1 및 제6 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이하며 각각 하나 이상의 Rep 단백질 또는 그의 유도체 또는 상동체에 의해 인식될 수 있는 Rep 단백질 인식서열을 포함하고 있어서 상기 구조물이 게놈 서열과 같은 대형 뉴클레오티드 서열에 통합되면 상기 제1 및 제6 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 상기 제1 및 제6 서열과 인접한 유전물질은 절단되어 환형화될 수 있으며, 상기 Rep 단백질 인식서열은 인트론 서열 또는 그의 일부 또는 다른 스플라이스 시그널을 비롯한 하나 이상의 외인성 서열과 인접하거나 그속에 삽입되며;
상기 제2 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분을 포함하고;
제3 뉴클레오티드 서열은 상기 제2 서열과 기능적으로 연결된 전사 터미네이터 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체이며;
제4 뉴클레오티드 서열은 제5 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 프로모터 서열이고;
제5 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분이며 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 부분은 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 코딩 서열을 나타내며;
1개 이상의 Rep 단백질 존재하에서, 상기 구조물이 게놈 서열과 같은 대형 뉴클레오티드 서열에 통합되면, 환형화된 유전자 서열은 상기 제1 및/또는 제6 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 외인성 서열 또는 기타 스플라이스 시그널의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 상기 프로모터 및 전사 터미네이터 서열을 순서대로 포함하는 상기 대형 뉴클레오티드 서열로부터 분리되게 생성되는 것을 특징으로하는 구조물을 제공한다.
상술한 본 발명의 요지에 따르면, 제1 및 제6 뉴클레오티드 서열은 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널과 인접하거나 그속에 삽입된 Rep 또는 그의 유도체 또는 그의 진핵생물 또는 원핵생물 유도체와 같은 바이러스 유도된 복제 촉진 단백질에 대한 인식서열을 나타낸다. 제2 내지 제5 뉴클레오티드 서열은 앞서 정의한 바와 같은 유전자 요소를 나타낸다.
본 발명의 다른 요지는 구조물 생성에 사용하기 위한 유전자 요소에 있어서, 상기 유전자 요소는 5'에서 3' 방향으로 전사 터미네이터에 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분; 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하고, 환형화되면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5'부분은 외인성 서열 또는 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널의 전부 또는 일부에 의해 분리된 폴리뉴클레오티드 서열의 상기 3' 부분에 기능적으로 연결되는 것을 특징으로하는 유전자 요소에 관한 것이다.
본 발명의 구조물은 다양한 용도를 갖는다. 일개 구체예로서, 상기 구조물은 식물세포에서 ssDNA 바이러스에 대한 유전자 내성을 생성하는데 사용된다. 특히 보호받고자하는 특정 바이러스는 제미니바이러스 또는 나노바이러스이며 이들에 한정되지 않는다. 본 구체예에서, 상기 구조물은 "자살 유전자", 즉 세포 자살, 용균,치사 또는 생화학적 또는 생리학적 잠복 상태를 유도하는 물질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 상기 구조물은 식물 세포 게놈으로 통합을 허용하는 조건하에서 식물 세포내로 도입된다. 상기 식물 세포로부터 식물이 재생되고 또 그 식물이 상기 구조물의 유전자 요소와 접하는 Rep 단백질 인식 서열을 인식하는 Rep 단백질을 갖는 특정 ssDNA 바이러스에 의해 감염되면 증식하며, 상기 구조물은 절단되고 재환형화됨으로써 "자살 유전자"를 재구성하며 그의 발현을 촉진한다. 이어 상기 세포는 죽거나 아니면 잠복하므로 ssDNA 바이러스의 복제와 방출을 방지한다.
특히 바람직한 구체예로서, 본 발명은 서열 31 내지 서열 36에 실질적으로 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 31 내지 서열 36과 60% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 31 내지 서열 36의 하나 이상과 하이브리드를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃에서 낮은 긴축(stringency) 조건하에서 상기의 상보적 형태를 포함하는 구조물을 제공한다.
따라서, 본 발명의 다른 요지는, 5'에서 3' 순으로 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널과 인접하거나 그속에 존재하는 Rep 단백질 인식서열, 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 부분, 전사 터미네이터 또는 그의 기능적 등가물, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단 부분에 기능적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는 구조물을 상기 식물의 게놈에 도입하는 것을 포함하며,
상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 부분은 세포 치사 또는 잠복성을 유도할 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 코딩 영역 및 동일하거나 상이한 Rep 단백질 인식서열을 나타내며; 상기 식물 세포가 인접하는 Rep 단백질 인식 서열을 인식할 수 있는 Rep 단백질을 갖는 ssDNA 바이러스에 의해 감염되면, 상기 구조물은 절단되어 환형화되므로 식물세포를 치사시키거나 아니면 식물세포를 잠복성으로 만드는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 발현될 형태의 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 재구성하는 것을 특징으로하는 ssDNA 바이러스에 대한 내성을 트랜스제닉 식물 또는 그의 후대에서 발생시키기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 구조물을 사용하면 웅성 불임 식물이 생성된다. 본 구체예에서, Rep 단백질을 암호화하는 유전자를 화분 특이적 프로모터의 제어하에 둔다. 상술한 "자살 유전자"를 포함하는 구조물은 화분 특이적 프로모터의 제어하에 Rep 유전자에 의해 인식되는 Rep 단백질 인식 서열을 이용하여 만든다. 화분이 형성되면, 화분 특이적 프로모터가 활성화되며, 따라서 자살 유전자도 활성화된다. 화분 세포는 선택적으로 파괴되거나 잠복성으로 된다.
본 명세서에 기재된 구조물의 다른 이용 방법은 색 변화를 촉진하는 유전물질을 식물 또는 특정 조직 또는 종자 또는 식물의 다른 증식 물질에 도입하는 것을 포함한다. 색 변화를 촉진하는 유전자 서열의 예는 플라보날 3'-히드록실라제, 플라보날 3',5'-히드록실라제 또는 플라본 3'-합성효소와 같은 안토시아닌 경로의 효소를 암호화하는 유전자이다.
다른 구체예로서, 상기 구조물은 2개의 상이한 Rep 단백질 인식서열과 인접할 수 있고, 즉 2개의 상이한 Rep 단백질에 의해 인식될 수 있다. 1개 Rep 단백질은 식물 게놈에 삽입된 유전자에 의해 암호화될 수 있고 나머지 Rep 단백질은 ssDNA 바이러스를 감염시키는 것에 의해 도입될 수 있다. 다르게는, Rep 단백질은발현되고 특정 발단 단계에 있는 상이한 프로모터에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명은 식물 및 ssDNA 바이러스와 관련하여 특히 기재하였지만, 본 발명은 곤충, 포유동물 또는 파충류 세포 등의 비-ssDNA 바이러스 및 진핵생물 세포와 같은 다른 공급원으로부터의 부위 특이적 절단 및 결합 활성을 갖는 상동성 절단 구조물 및 기타 단백질에도 관한 것이다. 본 발명은 식물에 관한 것인 한, 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽 식물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "식물 세포"는 식물로부터 유도된 원형질 또는 기타 세포, 배우자 생성 세포 및 전체 식물로 재생되는 세포를 포함한다. 식물 세포는 식물에서의 세포 뿐만 아니라 배양액중의 원형질 또는 기타 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, cRNA, cDNA 또는 DNA를 나타낸다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호 아미노산 잔기의 중합체 및 그의 변형물을 지칭하는 것으로 사용된다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 관계를 설명하기 위해 사용된 용어는 "참고 서열", "대조 창", "서열 동일성", "서열 동일 %" 및 "실질적으로 동일"을 포함한다. "참고 서열"은 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기 모두의 길이로 12개 이상이지만, 흔히 15 내지 18개, 일반적으로 적어도 25개 단량체 유닛이다. 2개 폴리뉴클레오티드는 (1) 2개(또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드간의 2개 폴리뉴클레오티드 서열 대조는 서열 유사성을 확인하고 국지 영역을 비교하기 위해 "대조 창"을 통하여 2개 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하는 것에 의해실시되는 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 부분)을 포함한다. "대조 창"은 6개 이상의 연속 위치의 개념적인 절편으로서, 2개 서열을 최적으로 정렬시킨 후 한 개 서열을 동일 개수의 연속하는 위치의 참조 서열과 비교한 약 50 내지 약 100개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150 길이의 절편을 지칭한다. 대조 창은 2개 서열의 최적 정렬을 위하여 참고 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 약 20% 이하의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 대조 창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 컴퓨터화된 연산(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩케이지 릴리이스 7.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹, 미국 위스콘신 사이언스 드라이브 매디슨 소재)에 의하거나 또는 다양한 선택방법에 의해 생성한 조사 및 최상의 정렬(즉, 대조 창에 걸쳐 최고의 % 상동성을 가짐)에 의해 실시할 수 있다. 알츌 등, 1997에 의해 기재된 프로그램의 BLAST 패밀리도 참조할 수 있다. 서열분석에 대한 자세한 논의는 오수벨 등, 1994-1998의 유닛 19.3에서 볼 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "서열동일성"은 서열들이 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 기준 또는 아미노산 대 아미노산 기준으로 대조창을 통하여 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 %"는 대조창을 통하여 2개의 최적 정렬된 서열을 대조하고, 동일 핵산 염기(예컨대 A, T, C, G, I) 또는 동일 아미노산 잔기(예컨대 Ala, Pro. Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 양쪽 서열에서 생기는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 얻고, 일치된 위치의 수를 대조창에 있는 위치의 전체 수(즉,창 크기)로 나누어서 얻은 값에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 얻는다. 본 발명을 위하여, "서열 동일성"은 참고 매뉴얼을 첨부한 소프트웨어에서 사용된 표준 생략성 값(standard default)을 이용하여 DNASIS 컴퓨터 프로그램(윈도우용 버전 2.5; 히타치 소프트웨어 엔지니어링 컴패니 리미티드 제조, 미국 캘리포니아 싸우쓰 샌 프란시스코 소재)에 의해 산출된 "일치 %"를 의미하는 것으로 이해된다.
낮은 스트린젠시(stringency)는 하이브리드화에 대하여 적어도 약 0 내지 적어도 약 15% v/v 포름아미드 및 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염을 포함하고 세척 조건으로는 적어도 약 1M 내지 적어도 약 2M 염을 포함한다. 일반적으로, 낮은 스트린젠시는 약 25 내지 30℃ 내지 약 42℃이다. 상기 온도는 변경될 수 있고 더 높은 온도가 이용되어 포름아미드를 대체하거나 및/또는 다른 스트린젠시 조건을 생성할 수 있다. 다른 스트린젠시 조건, 예컨대 하이브리드 형성을 위해서는 적어도 약 16% v/v 내지 적어도 약 30% v/v 포름아미드 및 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9M 염을 포함하고 세척 조건으로는 적어도 약 0.5M 내지 적어도 약 0.9 M 염을 포함하는 중간정도의 스트린젠시; 또는 하이브리드 형성을 위해서는 적어도 약 31% v/v 내지 적어도 약 50% v/v 포름아미드 및 적어도 약 0.01 M 내지 적어도 약 0.15M 염을 포함하고 세척 조건으로는 적어도 약 0.01M 내지 적어도 약 0.15 M 염을 포함하는 높은 스트린젠시를 필요한 경우 이용할 수 있다. 일반적으로, 세척은 Tm = 69.3 + 0.41 (G+C)% (마르무르 및 도티, 1962)에서 실시한다. 그러나, 이중쇄 DNA의 Tm은 일치하지 않는 염기쌍의 수가 1% 증가함에 따라 1℃ 씩 감소한다(보너 및 라스키, 1974). 포름아미드는 이들 하이브리드화 조건에서 임의적이다. 따라서,특히 바람직한 스트린젠시 수준은 다음과 같이 정의할 수 있다: 낮은 스트린젠시는 6 x SSC 완충액, 0.1% w/v SDS, 25 내지 42℃; 중간정도의 스트린젠시는 2 x SSC 완충액, 0.1% w/v SDS, 20℃ 내지 65℃의 온도; 높은 스트린젠시는 0.1 x SSC 완충액, 0.1% w/v SDS, 65℃ 이상의 온도.
용어 "형질전환"은 외래 또는 내인성 핵산을 도입하는 것에 의해 생물, 예컨대 진핵생물 세포의 유전형을 변경하는 것을 의미한다.
"벡터"는 내부로 핵산 서열이 삽입되거나 클로닝될 수 있는 플라스미드, 박테리오파아지 또는 식물 바이러스로부터 유도된 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 바람직하게는 1개 이상의 독특한 제한 부위를 함유하며 표적 세포 또는 조직 또는 원시세포 또는 그의 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있거나, 또는 소정 숙주의 게놈으로 통합되어 클로닝된 서열이 재생될 수 있다. 따라서, 벡터는 자동 복제 벡터, 즉 염색체외 부분으로 존재하며, 그의 복제가 염색체 복제와는 관계가 없는 벡터, 즉 선형 또는 환형 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가 복제가가능한 수단을 함유할 수 있다. 다르게는, 벡터는 세포로 도입되어 수용 세포의 게놈으로 통합되어 통합된 염색체와 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 숙주 세포의 게놈으로 도입될 전체 DNA를 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드 또는 트랜스포손을 포함할 수 있다. 벡터의 선택은 벡터가 도입될 세포와 벡터의 적합성에 따라 선택한다. 벡터는 적합한 형질전환체의 선발에 이용될 수 있는 항생물질 내성 유전자와 같은 선택 마커를 포함할 수 있다.이러한 내성 유전자의 예는 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에서 말하는 용어 "유전자"는 그의 가장 넓은 의미로 이해되며 유전자의 엑손에 상응하는 cDNA도 포함한다. 따라서, "유전자"는 다음을 포함하는 것으로 이해되어야한다:
(i) 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 코딩 영역 및/또는 비-번역 서열(즉, 인트론, 5'- 및 3'-비번역 서열)로 구성된 전형적인 게놈 유전자; 또는
(ii) 코딩 영역(즉, 엑손)에 상응하는 mRNA 또는 cDNA 및 유전자의 5'- 및 3'- 비번역 서열; 및/또는
(iii) 구조 영역상에 발현 특징을 부여할 수 있는 전사 및/또는 번역 조절 영역으로 구성된 비번역 서열 및/또는 이종 프로모터 서열을 경우에 따라 더 포함하는 코딩 영역(즉, 엑손)에 상응하는 구조 유전자.
용어"유전자"는 기능적 산물의 전체 또는 일부, 특히 센스 또는 안티센스 mRNA 산물 또는 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단백질을 암호화하는 합성 또는 융합 분자를 설명하는 것으로 이용된다. "유전자"라는 것은 "합성 유전자"를 포함한다.
용어 "합성 유전자"는 바람직하게는 구조 유전자 서열에 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사 및/또는 번역 조절 서열을 포함하는 비-천연산출 유전자로 칭한다.
용어 "구조 유전자"는 mRNA를 생성하도록 전달되고 경우에 따라 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단백질 분자를 암호화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 당업자라면 mRNA가 기능적 번역 개시 신호를 결여하고 있는 경우 또는 다르게는 mRNA가 안티센스 mRNA이면 mRNA라 해도 펩티드, 올리펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 것은 아니다는 것을 익히 알고 있을 것이다. 본 발명은 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단백질을 암호화할 수 없는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 유전자도 분명히 포함하는 것이다. 특히, 본 발명자들은 이러한 합성 유전자가 진핵생물의 세포, 조직 또는 기관에서 표적 유전자 발현을 변형하는데 유리할 수 있다는 것을 밝혀내었다.
용어 "구조 유전자 영역"은 기능적으로 연결된 프로모터 서열 제어하의 세포, 조직 또는 기관에서 발현되는 합성 유전자의 일부를 지칭한다. 구조 유전자 영역은 단일 프로모터 서열 또는 다수 프로모터 서열 제어하에 기능적으로 작용할 수 있다. 따라서, 합성 유전자의 구조 유전자 영역은 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 그와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이렇게하여, 본 발명을 실시하기 위해 사용된 구조 유전자 영역은 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있지만 기능적 번역 개시코돈 및/또는 기능적 번역 중지코돈이 부족하기 때문에 완전한 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다. 본 발명에서, 용어 "구조 유전자 영역"은 또한 상기 유전자가 발현되는 진핵생물 세포에서 정상적으로 번역되지 않는 유전자의 5'-상류 또는 3'-하류와 같은 비-코딩 뉴클레오티드 서열에도 관한 것이다.
따라서, 본 발명과 관련하여, 구조 유전자 영역은 동일하거나 상이한 유전자의 2개 이상의 오픈 리딩 프레임 사이의 융합을 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 본 발명은 상이한 비-연속적 영역을 1개 유전자의 발현을 조절하거나 또는 다르게는 다수유전자 패밀리의 상이한 유전자를 비롯한 몇 개의 상이한 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위해 사용될 수 있다. 진핵생물 세포에 대해 비-내인성이고 특히 바리어스성 병원체로부터 유도된 2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 융합 핵산 분자의 경우, 상기 융합은 상기 몇 개 병원체에서 유전자의 발현을 표적으로 함으로써 몇 개 병원체에 대한 면역성 또는 보호를 동시에 부여하는 이점을 제공한다. 다르게는, 상기 융합은 병원체의 유전자의 1개 이상의 유전자의 발현을 표적으로 하는 것에 의해 임의 병원체로부터 보다 효과적인 면역성을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 구조 유전자 영역은 적어도 1개의 번역가능한 오픈 리딩 프레임, 보다 바람직하게는 상기 구조 유전자 영역의 5'-말단에 반드시 존재할 필요는 없지만 상기 오픈 리딩 프레임의 5'-말단에 위치한 번역 개시코돈을 포함하는 유전자이다. 이렇게하여, 구조 유전자 영역은 하나 이상의 번역가능한 오픈 리딩 프레임 및/또는 AUG 또는 ATG 번역 개시코돈을 포함할 수 있으며, 이러한 서열은 본 발명이 표적 유전자의 발현을 조절하기 위하여 도입 핵산 분자의 번역을 반드시 필요로 한다는 것을 제시하는 것은 아니다. 이론이나 작용모드에 얽매이지 않고, 본 발명의 핵산 분자에 하나 이상의 번역가능한 오픈 리딩 프레임 및/또는 번역 개시코돈을 삽입하는 것은 그의 mRNA 전사 산물의 안정성을 증가시켜 본 발명의 효율을 증대시킨다.
본 발명의 합성 유전자에 포함될 수 있는 구조 유전자 서열의 최적 개수는상기 구조 유전자 서열 각각의 길이, 이들의 배향 및 상호간 동일정도에 따라 현저히 다를 수 있다. 예컨대, 당업자라면 생체내에서 팔린드롬 뉴클레오티드 서열의 고유한 불안정성과 이러한 서열이 생체내에서 재조합하는 경향으로 인하여 반전된 반복 뉴클레오티드 서열을 포함하는 긴 합성 유전자를 구성하는 것과 관련한 어려움들을 익히 잘 알고 있다. 이러한 어려움에도 불구하고, 본 발명의 합성 유전자에 포함될 구조 유전자 서열의 최적 개수는 과도한 실험의 부과없이 재조합효소-부족세포주를 사용하여 본 발명의 합성 유전자를 합성하고, 재조합 발생을 제거하거나 최소화하는 수준으로 반복 서열의 개수를 감소시키며, 복수 구조 유전자 서열의 전체 길이를 허용되는 범위, 바람직하게는 5 내지 10 kb 이하, 보다 바람직하게는 2 내지 5 kb, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2.0 kb 길이로 유지시키는 것과 같은 표준 과정을 따라 당업자가 용이하게 실험적으로 결정할 수 있다.
진핵생물 세포에서 발현하는 경우, 상기 구조물은 일반적으로 폴리뉴클레오티드 서열 이외에, 프로모터 및 경우에 따라 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 촉진하기 위해 고안된 기타 조절서열을 포함한다.
"프로모터"라는 것은 그의 가장 넓은 의미로 해석되며 정확한 전사 개시를 위해 필요한 TATA 박스를 비롯한 전통적인 게놈 유전자의 전사 조절 서열과 경우에 따라, 발달상 및/또는 외부 자극에 반응하여 또는 조직 특이적 방식으로 유전자 발현을 변경시키는 CCAAT 박스 서열 및 부가적인 조절 요소[즉, 상류 활성화 서열, 인헨서(enhancer) 및 사일런서(silencers)]를 포함한다. 프로모터는 통상 반드시 그런 것은 아니지만, 상류 또는 5' 또는 프로모터가 그 발현을 조절하는 구조 유전자 영역에 위치한다. 또한, 프로모터를 포함하는 조절 요소는 통상 유전자의 전사 개시 부위의 2kb 내에 위치한다.
본 발명에서, 용어 "프로모터"는 또한 세포에서 핵산 분자의 발현을 제공, 활성화 또는 향상시키는 합성 또는 융합 분자 또는 그의 유도체를 의미하는 것으로 사용된다.
바람직한 프로모터는 센스 분자의 발현을 더욱 향상시키고 및/또는 상기 센스 분자의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경하기 위해 1개 이상의 특이적 조절 요소의 카피(copies)를 추가적으로 함유할 수 있다. 예컨대, 구리 유도성을 부여하는 조절요소는 센스분자의 발현을 유발하는 이종 프로모터 서열과 인접하게 배치됨으로써 상기 분자의 발현시 구리 유도성을 부여한다.
프로모터 서열의 조절 제어하에 핵산 분자를 둔다는 것은 발현이 프로모터 서열에 의해 조절되도록 상기 분자를 위치시킨다는 것을 의미한다. 프로모터들은 일반적으로 이들이 제어하는 유전자의 5' (상류)에 위치한다. 이종 프로모터/구조 유전자 조합물을 작성하는 경우, 프로모터와 천연 세팅에서 그것이 조절하는 유전자, 즉 프로모터가 유도되는 유전자 간의 거리와 거의 동일한 유전자 전사 개시 부위로부터의 거리로 프로모터를 위치시키는 것이 바람직하다. 당분야에 공지된 바와 같이, 프로모터 작용 손실없이 상기 거리의 일부 변화도 가능하다. 유사하게, 제어하에 배치될 이종 유전자에 관한 조절서열 요소의 바람직한 배치는 천연 세팅, 즉 상기 요소가 유도되는 유전자에서 상기 요소의 위치를 조정하는 것에 의해 정의된다. 다시말해, 당분야에 공지된 바와 같이, 거리에서 일부 변화가 또한 가능하다.
본 발명의 합성 유전자에 사용하기에 적합한 프로모터의 예는 식물, 동물, 곤충, 진균, 효모 또는 세균 세포에서 작용할 수 있는 바이러스, 진균, 세균, 동물 및 식물 유래 프로모터를 포함한다. 이 프로모터는 구성적으로, 또는 발현이 생기는 세포, 조직 또는 기관에 대하여 특이적으로, 또는 발현이 생기는 발달 단계에 대해, 또는 생리학적 스트레스와 같은 외부 자극 또는 병원체 또는 금속 이온에 반응하여 구조 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다.
바람직하게는, 프로모터는 적어도 표적 유전자가 발현되는 시간 동안, 보다 바람직하게는 진핵생물 세포, 조직 또는 기관에서 표적 유전자의 검출가능한 발현이 개시되기 바로 직전에, 진핵생물 세포, 조직 또는 기관에서 핵산분자의 발현을 조절할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적을 위해서는 강한 구성적 프로모터 또는 바이러스 감염 또는 표적 유전자 발현의 개시에 의해 유도될 수 있는 프로모터가 특히 바람직하다.
식물 작용성 및 동물 작용성 프로모터는 본 발명의 구조물에 사용하기에 특히 바람직하다. 바람직한 프로모터의 예는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터와 같은 바이러스성 프로모터;lac오퍼레이터-프로모터,tac프로모터와 같은 세균성 프로모터; SV 40 후기 프로모터, SV 40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터와 같은 바이러스성 프로모터; 또는 CaMV 35S 프로모터, SCSV 프로모터, SCBV 프로모터 등과 같은 식물 바이러스성 프로모터를 포함한다.
표적 유전자의 발현과 일치하거나 표적 유전자의 발현을 선행하는 고 발현에 필요한 사항으로서, 프로모터 서열은 포유동물 세포의 경우 CMV-IE 프로모터 또는 SV 초기 프로모터 서열, SV40 후기 프로모터 서열; 특정 식물 세포의 경우 CaMV 35S 프로모터 또는 SCBV 프로모터와 같이, 관심을 갖고 있는 숙주에서 구성적으로 강한 프로모터인 것이 아주 바람직하다. 당업자들은 상술한 내용 이외의 부가적인 프로모터 서열을 아주 잘 숙지하고 있을 것이다.
본 발명에서, 용어 "기능적으로 결합된" 또는 "기능적인 제어하" 또는 그와 유사한 표현은 구조 유전자 영역 또는 다수 구조 유전자의 발현이 그 유전자가 세포, 조직, 기관 또는 전체 생물내에서 거리를 두고 연결된 프로모터 서열의 제어하에 있다는 것을 의미한다.
용어 "터미네이터"는 전사 종결을 신호하는 전사 유닛의 말단에 있는 DNA 서열을 지칭한다. 터미네이터는 일차 전사물의 3'-말단에 폴리아데닐화 서열의 부가를 촉진하는 폴리아데닐화 시그널을 일반적으로 함유하는 3'-비-번역 DNA 서열이다. 식물 세포에서 활성인 터미네이터는 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있다. 이들은 세균, 진균, 바이러스, 동물 및/또는 식물로부터 분리될 수 있거나 또는 신규 합성될 수 있다.
프로모터 서열과 마찬가지로, 터미네이터는 사용하고자하는 세포, 조직 또는 기관에서 작용가능한 임의의 터미네이터 서열일 수 있다.
본 발명의 합성 유전자에 사용하기에 특히 적합한 터미네이터의 예는 SV40 폴리아데닐화 시그널, HSV TK 폴리아데닐화 시그널, CYC1 터미네이터, ADH 터미네이터, SPA 터미네이터, 아그로박테륨 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 노팔린 합성효소(NOS) 유전자 터미네이터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 유전자의 터미네이터, 제아 메이즈(Zea mays)로부터의 제인(zein) 유전자 터미네이터, 루비스코(Rubisco) 소형 서브유닛 유전자(SSU) 유전자 터미네이터 서열, 서브클로버 발육부진 바이러스(SCSV) 유전자 서열 터미네이터, 임의의rho-독립적 대장균(E.coli) 터미네이터, 또는lacZ알파 터미네이터를 포함한다.
특히 바람직한 구체예로서, 터미네이터는 동물 세포, 조직 및 기관에서 작용가능한 SV40 폴리아데닐화 시그널 또는 HSV TK 폴리아데닐화 시그널; 식물 세포, 조직 또는 기관에서 활성인 옥토핀 합성효소(OCS) 또는 노팔린 합성효소(NOS) 터미네이터; 또는 원핵생물 세포에서 활성인lacZ알파 터미네이터이다.
당업자들은 본 발명을 실시하기 위해 사용하기에 적합할 수 있는 추가의 터미네이터 서열을 익히 잘 알고 있을 것이다. 이러한 서열은 과도한 실험의 부담없이 용이하게 사용될 수 있다.
세포를 구조물에 도입하는 수단(즉, 형질감염 또는 형질전환)은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
상술한 구조물들은 합성유전자가 발현된 세포, 조직 또는 기관에서 합성 유전자의 검출을 용이하게 하기 위해, 검출가능한 마커 효소 또는 그의 기능적 유사체 또는 유도체를 암호화하는 마커 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 것에 의해 더욱 변형될 수 있다. 본 구체예에 따르면, 상기 마커 뉴클레오티드 서열은 형질전환가능한 포맷으로 존재하며 예컨대 1개 이상의 구조 유전자의 번역산물과 함께 융합폴리펩티드로서 또는 비-융합 폴리펩티드로서 발현된다.
당업자들은 필요한 경우 소정 조건하의 특정 세포 또는 세포 유형에서 상술한 합성유전자를 어떻게 얻는지 그리고 상기 유전자의 발현을 위한 요건에 대해 잘 숙지하고 있다. 특히, 당업자들은 본 발명을 실시하기 위해 필요한 유전자 조작이 본 발명의 유전자 구조물 또는 그의 유도체를 대장균 세포와 같은 원핵생물세포 또는 식물 세포 또는 동물 세포에서 증식시키는 것을 필요로 할 수 있다는 것을 숙지하고 있다.
본 발명의 구조물은 변형없이 선형 DNA로 적합한 세포, 조직 또는 기관에 도입될 수 있고, 경우에 따라 세포, 바이러스 입자 또는 리포좀과 같은 적합한 캐리어내에 함유될 수 있다. 유전자 구조물을 제조하기 위하여, 본 발명의 합성 유전자는 이어 도입될 숙주세포, 조직 또는 기관에서 유지되고 및/또는 복제되며 및/또는 발현될 수 있는 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 또는 플라스미드, 코스미드 또는 인공 염색체 벡터와 같은 적합한 벡터 또는 오피좀 분자에 삽입된다.
따라서, 본 발명의 다른 요지는 상술한 바와 같은 유전자 요소 및 하나 이상의 복제 기점 및/또는 선택마커 유전자 서열을 적어도 포함하는 유전자 구조물을 제공하는 것이다.
유전자 구조물은 바이러스성 병원체에 대한 내성 특징을 제공하는 이외에, 신규 유전자 특징이 도입되는 진핵생물 세포의 형질전환에 특히 적합하다. 이러한 부가되는 신규 특징은 별도의 유전자 구조물에 도입되거나, 또는 다르게는 상술한 합성 유전자를 포함하는 동일한 유전자 구조물에 도입될 수 있다. 당업자들은 이러한 부가적인 특징과 합성 유전자를 암호화하는 유전자 서열이 단일 유전자 구조물에 포함되는 것에 의한 유전자 조작과 조직배양 요건의 감소 및 비용 효율의 증가 면에서의 특히 중요한 이점을 잘 알고 있을 것이다.
보통, 세균에 사용하기 적합한 복제 기점 또는 선택마커 유전자는 진핵생물 세포로 표현 또는 전달하기 위한 유전자 구조물에 함유되거나, 또는 진핵생물 세포의 게놈에 통합된 상기 유전자 서열로부터 물리적으로 분리되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "선택 마커 유전자"는 본 발명의 유전자 구조물 또는 그의 유도체로 형질감염되거나 형질전환된 세포의 확인 및/또는 선택을 용이하기 위해 발현된 세포상에 표현형을 부여하는 임의 유전자를 포함한다.
예상할 수 있는 적합한 선택 마커 유전자는 암피실린 내성 유전자(Ampr), 테트라시클린 내성 유전자(Tcr), 세균 카나마이신 내성 유전자(Kanr), 제오신 내성 유전자(제오신은 인비트로겐 코포레이션사의 상표명인 블레오마이신 계열의 약물임), 항생물질 아우레오바시딘 A에 대한 내성을 부여하는AURI-C유전자, 포스피노트리신 내성 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(nptII), 하이그로마이신 내성 유전자, β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자, 녹색 형광 단백질 암호화 유전자 또는 루시페라제 유전자를 포함한다.
바람직하게는, 선택 마커 유전자는nptII 유전자 또는 Kanr유전자 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 암호화 유전자이다.
당업자들은 본 발명을 실시하는데 유용한 기타 선택 마커 유전자를 잘 알고 있으며 또 본 발명은 선택 마커 유전자의 성질에 의해 한정되지 않는다.
본 발명은 원핵생물 또는 진핵생물에서 상기 유전자 구조물의 유지 및/또는 복제 및/또는 상기 유전자 구조물 또는 그의 일부를 진핵생물 세포 또는 기관의 게놈으로 통합시키기 위한 추가의 유전자 서열을 포함하는 상술한 바와 같은 모든 유전자 구조물에 관한 것이다.
상기 구조물을 세포, 조직 또는 기관으로 도입하기 위해서는 상술한 표준방법, 예컨대 리포좀 매개 형질감염 또는 형질전환법, 약화된 바이러스 입자 또는 세균 세포를 사용한 세포의 형질감염, 세포 짝짓기, 당업자에게 공지된 형질전환법 또는 형질감염법이 이용될 수 있다.
재조합 DNA를 식물 조직 또는 세포로 도입하기 위한 추가의 수단은 이것에 한정되는 것은 아니나, CaCl2및 그의 변형물을 사용한 형질전환, 원형질로 직접적으로 DNA 흡수, PEG-매개된 원형질로의 흡수, 미립자 충격법, 엘렉트로포레이션, DNA의 미량주입법, 조직 외식체 또는 세포의 미립자 충격법, 핵산을 사용한 조직의 진공-침윤법, 또는 식물의 경우, 아그로박테륨(Agrobacterium)으로부터 식물조직으로 T-DNA 매개 전달법을 포함한다.
세포를 미립자로 충격을 주는 방법의 경우, 미립자를 세포로 향하게 추진시켜 형질전환된 세포를 생성한다. 임의의 적합한 탄도(ballastic) 세포 형질전환 방법 및 장치가 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다. 예시 장치 및 과정은 스톰프등(미국특허 5,122,466호) 및 산포드 및 울프(미국특허 4,945,050호)에 의해 개시되었다. 탄도 형질전환법을 사용하는 경우, 유전자 구조물은 형질전환될 세포에서 복제될 수 있는 플라스미드를 포함할 수 있다.
이러한 시스템에 사용하기에 적합한 미립자의 예는 1 내지 5 ㎛ 금구를 포함한다. DNA 구조물은 석출과 같은 적합한 수법에 의해 미립자상에 퇴적될 수 있다.
본 발명의 구체예로서, 상술한 유전자 구조물은 발현될 세포의 게놈으로 통합되도록 개작될 수 있다. 당업자들은 유전자 서열 또는 유전자 구조물을 숙주 세포의 게놈으로 통합시키기 위해서는, 특정의 추가의 유전자 서열이 필요할 수 있다는 것을 잘 알고 있다. 식물의 경우, 아그로박테륨 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) Ti 플라스미드의 T-DNA로부터 얻은 좌우 경계 서열이 일반적으로 필요할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 구조물 또는 그의 일부를 포함하는 분리된 세포, 조직 또는 기관에도 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 세포, 조직 및 기관으로부터 유도된 재생된 조직, 기관 및 전체 기관 및 이들의 영양번식체 및 후대 뿐만 아니라 종자와 기타 번식물질에도 관한 것이다.
예컨대, 형질전환된 식물 세포 또는 조직 또는 기관으로부터 호르몬 함유 매질상에서 식물을 재생할 수 있으며, 재생된 식물은 예컨대 형질전환된 세포 및 비-형질전환 세포의 키메라; 클론성 형질전환체(예컨대 모든 세포는 발현 카세트를 함유하도록 형질전환된다); 형질전환된 조직 및 형질전환되지 않은 조직의 식피편(graft)(예컨대 감귤종에서 형질전환되지 않은 접수에 형질전환된 뿌리 스톡을 접붙임)과 같은 다양한 형태를 취할 수 있다. 형질전환된 식물은 클론성 증식 또는 전통적인 육종 수법과 같은 다양한 수단에 의해 증식될 수 있다. 예컨대, 형질전환된 식물의 제1 세대(또는 T1)는 자가교배되어 형질전환된 식물의 동형접합성 제2 세대(또는 T2)를 생성하며, 또 이 T2 식물은 전통적인 육종 수법을 통하여 더 증식된다.
다른 구체예로서, 상기 구조물은 표적하는 유전자 서열의 발현조절을 유도하기 위해 사용된다. 예컨대, 구조물은 선형일 때 5'에서 3' 방향으로 안티센스 서열, 프로모터 및 센스 서열을 포함한다. 이들 요소는 바이러스 유도된 복제촉진 단백질 인식서열(예컨대 머리핀) 또는 포유동물 또는 미생물 상동체와 측면을 접하고 있다. 터미네이터 서열은 상기 인식서열 측면 영역 밖에 존재한다. 복제 방출되면, 표적 유전자 서열의 안티센스 및 센스 형태를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 생성된다.
생성된 폴리뉴클레오티드 서열은 머리핀 루프를 형성할 수 있다. 이 구조물은 2중 또는 다중 반복체, 전화물 또는 그의 조합물을 생성하도록 변형될 수 있다. 이러한 구조물은 식물 및 동물 세포에서 유전자 침묵(silencing)을 유발하는데 유용하다. 선형에서 성분의 순서는 그리 중요하지 않다. 예컨대 센스 및 안티센스 서열의 위치는 서로 바뀔 수 있다. 적합한 구조물의 예를 도27에 도시한다.
본 발명을 하기 비제한적인 실시예에 의해 더욱 자세하게 설명한다.
실시예 1
BBTV를 기초한 발현벡터
감자 광 유도성 조직 특이적 ST-LS1 유전자의 인트론이 도입된(NT-INTRON-CT) 바르나제(barnase)를 암호화하는 유전자의 발현을 유발하는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터(35S)를 함유하는 일련의 발현 벡터를 작성하였다. 터미네이터는 노팔린 합성효소(nos)을 암호화하는 유전자 또는 BBTV DNA-6 (BT6)의 주요 오픈 리딩 프레임(ORF)으로부터 유도되었다.
중복 프라이머(표 1)를 사용한 PCR에 의해 구조물을 작성하고 당분야에 공지된 표준 수법을 이용하여 pGEM-T 벡터에 클로닝하였다. 발현벡터 pTBN을 작성하고 도 1에 도시한다. pTBN(서열 66)은 다른 발현벡터가 작성되었을 때의 주쇄를 나타낸다. 프라이머 명칭 및 결합부위를 나타내고, 각 서열의 크기도 나타내었다. pTBN(기타 구조물과 마찬가지로)을 점차적으로 증폭시켰다. 먼저, 모든 세 개의 단편을 별도로 증폭시켰다(즉, 35S, NT-INTRON-CT 및 nos). PCR중의 각 단편들을 프라이머 +1 및 -4와 혼합하는 것에 의해 전체 서열을 증폭시켰다.
도2에 도시된 pTBN6(서열 67)은 인트론에 삽입된 BBTV DNA-6(6I)의 CR-SL 및 CR-M을 함유하는 624 bp 영역을 함유한다.
도3에 도시된 pTBN1(서열 68)은, pTBN6과 동일하게, 인트론에 삽입된 BBTV DNA-1(1I)의 CR-SL 및 CR-M을 함유하는 163 bp 영역을 함유한다. nos 터미네이터는 BBTV DNA-6 대형 ORF로부터의 126 bp 터미네이터에 의해 교체된다.
재환형화 벡터는 pTBN6 및 pTBN1을 기본으로 한다. 이들은 Rep 인식서열과 접하고 있고 재환형화하기 위한 고안된 것으로서 BBTV Rep 존재하에서만 전사적으로 활성이다. 세 개의 상이한 벡터를 제조하였다: pRTBN6, pRTBN1 및 pRTBN1/6.
도4에 도시된 pRTBN6은 pTBN6으로부터 작성하였다. +5 및 -4 및 +1 및 -6 각각을 사용하여 2개 단편을 증폭시켰다. 이들을 pGEM-T에 클로닝한 다음 서브클로닝하여 pRTBN6을 생성하였다.
도5에 도시된 pRTBN1은 pRTBN6과 유사한 방식으로 pTBN1로부터 작성하였다.
도6에 도시된 pRTBN1/6은 pRTBN1 및 pRTBN6의 하이브리드였다.
상술한 각 구조물(pTBN 제외)에 대하여 번역될 수 없는 벡터도 또한 작성하였다. 이들 벡터에서, 바르나제 유전자의 개시코돈은 +11 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 결실시켰다. 이들 구조물을 pUBN76, pUBN1, pRUBN6 및 pRUBN1으로 명명하였다.
실시예 2
TYDV를 기초한 발현벡터
(a) 인트론-함유 GUS 리포터 유전자 발현 카세트의 작성
CAMBIA(호주 캔버라 소재)로부터 벡터 pCAMBIA2301를 구입하였다. 이 벡터는uidA 코딩 영역의 5' 부분내에 189 bp 카탈라제 인트론을 함유한다. CaMV 35S 프로모터 영역(800 bp),uidA 코딩 영역, 및 nos 터미네이터를 pCAMBIA 2301로부터HindIII/SphI 단편으로 제거하고, 또 유사하게 분해된 pGEM-T (프로메가 제조) 벡터에 삽입하였다. 이어 상기 구조물을 pGEM-2301로 나타내었다. 800 bp CaMV 35S 프로모터를NotI/BglII 분해 및 결찰에 의해 더 강한 530 bp CaMV 35S 프로모터로 교체하였다. 이어 상기 벡터를 p35S-2301 (도7)로 표시하고 후속하는 모든 클로닝 단계에 대한 주형으로 사용하였다.
(b) 담배 황화 왜소증 마스트레바이러스(TYDV) 대형 인터제닉 영역의 분리 및 p35S-2301의 카탈라제 인트론에 삽입
TYDV(진뱅크 입수번호 M81103)의 대형 인터제닉 영역(LIR)(nt +1 내지 nt +272)를 포함하는 272 bp 단편을 프라이머 LIR-F 및 LIR-R을 사용한 PCR에 의해 TYDV-감염된 담배 잎 조직으로부터 증폭시켰다(도1 참조). 이 단편을 LIR로 나타내었다.
프라이머:
CaMV 35S 프로모터(530 bp),uidA 1st엑손(19 bp) 및 카탈라제 인트론(83 bp)의 5' 절반을 포함하는 절편은, 프라이머 35S-IE 및 CAT-A를 사용한 PCR에 의해 p35S-2301 플라스미드 DNA로부터 증폭시켰다. 이 단편을 CAT-A로 나타내었다.
프라이머:
카탈라제 인트론(106 bp)의 3' 절반 및uidA 1nd엑손(1809 bp)를 포함하는 절편을 프라이머 CAT-B 및 GUS-BstEII를 사용한 PCR에 의해 p35S-2301 플라스미드 DNA로부터 증폭시켰다.
프라이머:
생성한 PCR 산물을 pGEM-T에 클로닝하고 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 궁극적으로, 각 단편을 pGEM-T로부터 절단(EcoRI/PstI을 사용하여 CAT-A,PstI/SalI을 사용하여 LIR 및SalI/BstEII를 사용하여 CAT-B)하고EcoRI/BstEII로 분해된 p35S-2301에 결찰시켜 플라스미드 pTEST1를 생성하였다(도8).
(c) TYDV LIR을 카탈라제 인트론에 삽입하는 것에 의해 GUS 발현이 나쁜 영향을 받는지에 대한 여부를 결정
TYDV LIR를 p35S-201의 카탈라제 인트론에 삽입하는 것에 의해 GUS 발현 및 따라서 인트론 스플라이싱이 영향을 받는지에 대한 여부를 결정하기 위하여, 구조물을 배발생 바나나 세포에 충격을 주고 GUS 활성을 일시적으로 평가하였다. 베커 등(2000)에 따라 시험 플라스미드 pTEST1 및 양성 대조용 플라스미드 p35S-2301을 1 ㎛ 금 입자상에 피복하고, 5일된 바나나(무사(Musa)종. "레이디핑거" AAA 품종)의 배발생세포에 생물분해적으로 도입하였다. 충격을 가한 지 2일 후, 세포를 수집하고 GUS 활성을 조직화학적으로 평가하였다(제퍼슨 등, 1987).
충격을 받지 않은 세포에서는 내인성 GUS 활성은 관찰되지 않았다. 밝은 청색 착색된 세포 초점으로 분명하게 나타나는 강한 GUS 활성은 양성 대조용 플라스미드 p35S-2301을 사용하여 충격을 받은 세포로부터 관찰되었다. 대조적으로, pTEST1로 충격을 받은 세포로부터의 GUS 발현은 청색 착색된 세포 초점의 개수와 강도에 의해 측정되는 바와 같이 낮았다(약 5배). 이 결과는 TYDV LIR를 p35S-2301의 카탈라제 인트론에 삽입하는 것은 GUS 발현을 제거하지 않지만 인트론 가공에 어느 정도로 영향을 줄 수 있다는 것을 제시한다.
(d) TYDV LIR내의 은밀한 인트론 스플라이스 부위의 확인
TYDV LIR가 예비-mRNA 후처리에 영향을 줄 수 있는 강력한 비밀 인트론 스플라이스 부위를 함유하는지 여부를 결정하기 위하여, p35S-2301 및 pTEST1로 충격을 받은 세포로부터 유도된 RNA 추출물로부터 cDNA를 합성하였다. 창(Chang) 등(1993)의 방법을 이용하여 p35S-2301 및 pTEST1로 충격을 받은 지 2일 후 바나나 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. 프라이머 uidA2를 사용하여 전체 RNA로부터 상보적인 DNA를 합성하였다. 이 cDNA를 프라이머 uidA1 및 uidA3을 사용한 PCR에 대한 주형으로 사용하였다. 생성한 PCR 산물을 pGEM-T에 클로닝하고 서열결정화하였다. 서열결정화에 의해 TYDV LIR내에 2개의 강력한 부위가 확인되었는데, 이것은uidA 코딩 영역 예비-mRNA로부터 카탈라제 인트론의 이상(異常) 스플라이싱에 관여할 수 있다. TYDV LIR을 분리하기 위해 사용된 프라이머 LIR-Fso에 위치하는 제1 서열, CTGCAGVGC는 콘센서스 3' 스플라이스 부위(T(10X)GCAGVGT)와 강한 유사성을 갖는다. 제2 서열, TAVGTGAGT(nt + 43 내지 nt+50)는 콘센서스 5' 스플라이스부위(AGVGTAAGT)와 일부 유사성을 공유한다.
프라이머:
(e) TYDV LIR로부터 3' 은밀한 인트론 스플라이스 부위의 제거
확인된 2개의 은밀한 인트론 스플라이스 부위중, 제1 (CTGCAGGC)는 5' 카탈라제 인트론 스플라이스 부위에 대한 위치로 볼 때 가장 중요한 것으로 보인다. TYDV LIR로부터 상기 서열을 제거하기 위하여, 원래의PstI 및NotI 제한부위 대신XhoI 부위를 포함시킨 신규 프라이머를 LIR-Xho로 나타내었다.
프라이머 LIR-Xho 및 LIR-R를 사용한 PCR에 의해 pTEST1 플라스미드 DNA로부터 TYDV LIR를 다시 증폭시켰다. 이 단편을 LIR-X로 나타내었다. 유사하게, CaMV 35S 프로모터(530 bp),uidA 1st엑손(19bp) 및 카탈라제 인트론의 5' 절반(83 bp)를 포함하는 단편을 프라이머 FUP 및 CAT-Xho를 사용한 PCR에 의해 pTEST1 플라스미드 DNA로부터 재증폭시켰다. 이 단편을 CAT-X로 나타내었다. 양쪽 PCR 산물을 pGEM-T에 클로닝하고 이들의 서열을 확인하였다. 궁극적으로, PCR 단편들을 pGEM-T (XhoI/SalI를 사용하여 LIR-X 및PstI/XhoI를 사용하여 CAT-X)로부터 절단해내고PstI/SalI으로 분해된 pTEST1에 결찰시켜 원래의 삽입물을 교체하였다. 이 구조물을 pTEST2로 나타내었다(도9). pTEST2내의 은밀한 인트론 스플라이스 부위를 제거하면 이상 스플라이싱이 감소되어 mRNA 가공이 향상됨으로 인하여 pTEST1에 비하여고수준의 GUS 발현을 생성하였다.
프라이머:
(f) Rep-활성화될 수 있는 GUS 발현 벡터의 작성
TYDV 소형 인터제닉 영역(SIR) (nt +1275 내지 nt+1504)를 포함하는 229 bp 단편을 프라이머 SIR-F 및 SIR-R을 사용한 PCR에 의해 TYDV-감염된 담배 잎 조직으로부터 증폭시켰다(도2 참조). 생성한 PCR 산물을 pGEM-T에 클로닝하고 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 이 플라스미드를 pGEM-SIR로 나타내었다. TYDV SIR을 pGEM-SIR로부터SphI 단편으로서 절단시켜서 pTEST1내의 nos 터미네이터의 하류에 있는 독특한SphI 부위에 결찰시켰다. 이 구조물을 pTEST1-SRI로 나타내었다.
프라이머:
CaMV 35S 프로모터,uidA 1st엑손, 카탈라제 인트론 5' 절반 및 TYDV LIR을 pTEST2로부터NotI/SalI 단편으로 절단하고, 유사하게 분해된 pGEM-T 벡터에 삽입하였다. 이 클론을 pGEM-CATX로 나타내었다. TYDV LIR, 카탈라제 인트론 3' 절반,uidA 2nd엑손, nos 터미네이터 및 TYDV SIR을 pTEST1-SIR로부터NotI 단편으로 절단해내고 pGEM-CATX내의 독특한NotI 부위에 삽입하였다. 이 구조물을 pTEST3으로나타내었다(도10). 활성화된 GUS 발현 카세트는SacI/ApaI 분해에 의해 pTEST3로부터 절단해내어 바이너리 플라스미드 pART27에 있는 nos pro-NPTII-nos ter 카세트의 상류에 존재하는SacI/ApaI 제한부위에 삽입된다(글리이브 1992). 이 구조물을 pTEST4로 나타내었다(도11). Singh 등(1993)의 방법을 이용한 엘렉트로포레이션에 의해 벡터 pTEST4를 아그로박테륨 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) (LBA4404)에 도입하였다.
(g) 감염성 TYDV1.1mer의 작성
TYDV 게놈의 2개의 중첩 단편을 프라이머쌍 LIR-F/SIR-R (서열 19/서열 32) 및 LIR-R/TYD-3F(서열 20/서열 33)를 사용한 PCR에 의해 TYDV-감염된 담배 잎 조직으로부터 증폭시켰다. 생성한 PCR 산물(TYD-R 및 TYD-L)을 pGEM-T에 클로닝하고 이들의 서열을 확인하였다. 이들 플라스미드를 pGEM-TYD-R 및 pGEM-TYD-L로 나타내었다. TYDV 게놈의 1659 bp 단편을EcoRI을 사용한 분해에 의해 pGEM-TYD-L로부터 절단해내서 pGEM-TYD-Rso의 독특한EcoRI 부위에 삽입하였다. 이 구조물을 pGEM-TYDV1.1mer로 명명하였다.SalI/EcoRI 부분 분해에 의해 pGEM-TYDV1.1mer로부터 TYDV1.1mer를 절단해내어 유사하게 분해된 pBI101.3 벡터(클론테크사 제조)에 삽입시켜uidA 유전자 및 nos 터미네이터를 교체하였다. 이 구조물을 pBI-TYDV1.1mer로 명명하였다(도12). Singh 등(1993)의 방법을 이용한 엘렉트로포레이션에 의해 벡터 pBI-TYDV1.1mer를 아그로박테륨 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(LBA4404)에 도입하였다.
프라이머:
(h) CaMV 35S-TYDV Rep 융합물의 작성
TYDV(nt +2580 내지 nt +1481)의 완전한 Rep(RepA 포함) 유전자를 프라이머 TYDVRepF 및 TYDVRepR을 사용한 PCR에 의해 TYDV-감염된 담배 잎 조직으로부터 증폭시켰다. 생성한 PCR 산물을 pDH51(피에트르자크 등, 1986)내의 CaMV 35S 프로모터(530 bp) 및 CaMV 35S 터미네이터(200 bp) 사이에 위치하는SmaI 부위에 직접적으로 클로닝하였다. 이 구조물을 p35S-Rep로 명명하였다(도13).
프라이머:
실시예 3
TYDV 벡터를 사용한 GUS 발현 분석
(a) 쌍자엽 및 단자엽식물 세포에서 GUS의 일시적인 Rep-활성화 발현
An (1985)에 의해 기재된 바와 같이 담배(NT-1) 세포를 유지시키고 더그데일 등(1998)에 의해 상세히 설명된 바와 같이 미립자 충격용으로 제조하였다. 바나나(무사종, "레이디핑거" AAA 품종)의 배발생세포 현탁액을 상술한 바와 같이 제조하였다. 금입자 피복 및 생물분해 변수는 더그데일 등(1998) 또는 베커 등(2000)에 의해 기재되었다.
이 연구에 사용될 플라스미드는 다음을 포함한다:
(i) 양성 대조용인 p35S-2301 (도7),
(ii) pTEST3 (도10),
(iii) p35S-Rep (도13), 및
(iv) pTEST3 및 p35S-Rep.
4개 플라스미드 조합에 대하여 양쪽 세포주의 5개 플레이트에 충격을 가한다. 충격받은지 3일 후 세포를 수집하고 GUS 활성을 조직화학적으로 및/또는 형광량적으로 분석하였다(제퍼슨 등, 1987).
충격을 받지 않은 세포에서는 내인성 GUS 활성이 관찰되지 않았다. 밝은 청색 착색된 세포 초점으로 분명하게 나타나는 강한 GUS 활성은 양성 대조용 플라스미드 p35S-2301을 사용하여 충격을 받은 세포로부터 관찰되었다. p35S-Rep 또는 pTEST3으로 충격을 받은 세포로부터는 GUS 발현이 관찰되지 않는다. 대조적으로, p35S-Rep 및 pTEST3으로 충격을 받은 세포는 강한 청색 착색을 나타내며, 이것은 양성 대조용 플라스미드 p35S-2301에서 관측된 것 보다 높았다. 이 결과는 트랜스의 TYDV Rep을 부가할 때에만 pTEST3내의 GUS 발현 카세트가 활성화된다는 것을 나타낸다.
(b) GUS 복수카피 식물 에피솜(MPE)의 Rep-보조 닉생성, 결합 및 복제의 검출
TYDV-기제 GUS MPE의 검출은 PCR법을 이용하여 실시한다. 프라이머 uidA1 (서열 25) 및 uidA3 (서열 27)은 카탈라제 인트론에 걸쳐 uidA 유전자의 단편을 증폭시킨다. 플라스미드 pTEST3으로부터 TYDV-기제 MPE를 Rep-보조로 방출하면 상기프라이머 조합은 PCR로 600 bp의 생성물(uidA 유전자의 140 bp, 카탈라제 인트론의 190 bp 및 TYDV LIR의 270 bp를 포함)을 생성한다.
상술한 4개의 플라스미드 조합을 사용하여 담배 NT-1 및 바나나 세포를 충격처리시켰다. 충격처리 3일 후, 세포를 수집하고 스튜워트 및 비아(1993)의 방법을 이용하여 전체 gDNA를 추출하였다. 전체 gDNA(1 ㎍)을 프라이머 uidA1 (서열 25) 및 uidA3 (서열 27)을 사용한 PCR에 대한 주형으로 사용하였다. PCR 산물을 1.5% w/v 아가로오스 겔을 통한 전기영동처리시켰다. 대조용 플라스미드 p35S-2301(도7)로 충격을 받은 세포의 gDNA로부터는 330 bp 생성물을 얻었다. 이 생성물은 투입 플라스미드 DNA로부터의 uidA 및 카탈라제 인트론 서열에 상응하였다. 충격을 받지 않은 세포의 gDNA 또는 pTEST3 또는 p35S-Rep으로 충격을 받은 세포의 gDNA로부터는 PCR 산물이 얻어지지 않았다. pTEST3 및 p35S-Rep로 충격을 받은 세포의 gDNA로부터는 600 bp의 생성물이 얻어졌다. 이 결과는 앞서의 GUS 조직화학 분석을 지지해주며 pTES3 및 p35S-Rep로 충격을 받은 세포에서만 TYDV-기제 MPE가 생성됨을 제시한다.
TYDV-기제 MPE의 복제는 서던 하이브리다이제이션법(Southern hybridization)으로 평가한다. 이 방법을 이용함으로써, 회전하는 써클 복제를 나타내는 멀티머 형태의 MPE가 하이브리드화에 의해 검출된다. 4개 플라스미드 조합으로 각기 충격을 받은 세포로부터 전체 gDNA(20 ㎍)를 1.5% w/v 아가로오스 겔을 통하여 전기영동시켰다. DNA를 서던에 의한 방법(1975)에 의해 나일론 막(로체)으로 옮겼다. uidA 및 카탈라제 인트론에 특이적인 600 bp DIG-표지 프로브(probe)는프라이머 uidA1(서열 25) 및 uidA3 (서열27)를 사용한 PCR에 의해 증폭하였다. uidA-특이적 프로브를 DIG Easy-Hyb 용액(로체)중 42℃에서 나일론막과 하이브리화시키고 제조자의 추천에 따라 CDP-스타 기질(로체)을 사용하여 시그널을 검출하였다. 특징적인 초나선형, 직선 및 개환형 및 고분자량 멀티머 형태의 TYDV-기제 MPE는 pTEST3 및 p35S-2301로 충격을 받은 식물세포로부터의 gDNA에서만 검출되었다. 이들 결과는 트랜스 형태로 제공되면, TYDV Rep는 단자엽식물 및 쌍자엽 식물 세포 형식 모두에서 TYDV-기제 MPE를 닉생성, 결합 및 복제할 수 있다는 것을 확인해준다. 또한 이들 결과는 플라스미드 pTEST3으로부터의 uidA 발현은 TYDV Rep을 부가할 때에만 활성화된다는 것과 이러한 부가가 비복제성 GUS 발현 카세트(p35S-2301)보다 훨씬 높은 발현을 초래한다는 것을 나타낸다.
실시예 4
Rep-활성화 카세트를 사용한 단자엽식물 및 쌍자엽 식물의 안정한 형질전환
바나나(무사(Musa)종, "레이디핑거"AAA 품종) 배발생세포 현탁액을 미량주입을 기본한 안정한 형질전환의 타겟으로 하였다. 1 ㎍의 pDHKAN(피에트르자크 등, 1986)으로 플라스미드를 공동형질전환시키는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이, 세포를 pTEST3으로 충격처리시켰다. 이 플라스미드는 CaMV 35S pro-NPTII-CaMV 35S ter 카세트를 함유하며, 이것으로부터 NPTII 유전자의 발현이 항생물질 카나마이신 또는 제네티신에 대한 내성을 부여한다. 트랜스제닉 바나나 식물의 선택, 배양 및 재생은 베커 등(2000)에 의해 기재된 바와 같이 실시한다. 독립적인 트랜스제닉 식물은 프라이머쌍 NPT-F/NPT-R 및 uidA4/uidA5를 각각 사용한 PCR에 의해 NPTII 및uidA 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 10개의 독립적인 형질전환체를 선택하여 다음 연구에 사용하였다.
프라이머:
담배(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabcum) "Samsun" 품종)를 호슈 등(1988)의 방법에 따라 잎 디스크의 아그로박테륨-매개된 감염에 의해 형질전환시켰다. 10개의 독립적인 트랜스제닉 식물을 플라스미드 pTEST4로부터의 T-DNA로 형질전환시켰다. 각 세포주는 상술한 바와 같은 PCR에 의해 NPTII 및uidA 코딩 영역을 함유하는 것으로 드러났다.
Rep-활성화 GUS 발현 카세트[즉, pTEST3(도10) 및 pTEST4(도11)]에 의해 형질전환된 각 10개의 트랜스제닉 바나나 및 담배주로부터의 잎 조각을 플라스미드 p35S-Rep으로 충격처리시켰다. 충격처리 3일 후, 잎 조각을 GUS 조직화학 분석처리시켰다. 10개의 바나나 및 담배주로 부터의 충격을 받지 않은 잎 조각에서는 GUS 발현이 보이지 않았다. 플라스미드 p35S-Rep으로 충격을 받은 잎 조각은 다수의 청색 GUS-착색 초점을 나타내었다. TYDV-기제 MPE의 Rep-관련 닉 생성, 결합 및 복제가 전술한 바와 같이 이들 잎 조각에서 확인되었다. 이들 결과는 TYDV Rep이 플라스미드의 안정하게 통합된 카피로부터 GUS 발현을 활성화시킬 수 있고 생체내 TYDV-기제 M)PE를 닉 생성, 결합 및 복제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5
트랜스제닉 담배에서 TYDV-감염 활성화된 발현
10개의 트랜스제닉 담배주 각각에 보울톤의 방법(1995)을 사용하여 pBI-TYDV1.1mer(실시예2(f) 참조, 도12)로 형질전환된 아그로박테륨 배양액을 침투시켰다. 2개월간에 걸쳐, 감염 지점 및 식물로 부터 샘플을 취하고, 조직화학적 분석법을 이용하여 GUS 발현을 평가하였다. GUS 활성(즉, 청색 착색 조직)은 모의 접종된 대조용과 비교하여 TYDV-감염된 식물에서만 확인되었다. 시간이 흐름에 따라, GUS 발현은 감염 개시점부터 맥관구조를 통하여 다양한 식물 부위로 확대된다. GUS 발현 카세트의 Rep에 의한 닉 생성, 결합 및 복제는 상술한 바와 같이 확립된다. 이 결과는 TYDV 감염이 통합된 염색체 카피로부터 GUS 발현 카세트의 복제 방출에 충분하다는 것을 제시한다.
실시예 6
BBTV를 기본한 발현 벡터를 사용한 일시적 세포치사 분석
바르나제가 세포 치사를 유발할 수 있다는 것을 증명하기 위해, 발현벡터(pTBN, pTBN6, pTBN1, 도1, 2 및 3)을 사용하여 분석을 실시하였다. 음성 대조용은 pUBN6 및 pUBN1(실시예 1 참조)이었다. 이들 구조물 각각은 더그데일 등(1998)에 의해 기재된 바와 같이 GUS 벡터와 함께 공동충격을 받아 바나나(무사 종, 블루고에 품종) 배발생세포 현탁액으로 삽입된다. GUS 벡터는 강한 프로모터(리포터 유전자 β-글루쿠로니다제(제퍼슨, 1987)의 발현을 유발하는 옥수수Ubil, CaMV 35S 또는 바나나ActI)를 함유하였다. 이어 GUS 활성에 대한 MUG 분석을 실시하면 pTBN, pTBN6 또는 pTBN1으로 형질전환된 세포는 음성 대조용(pUBN1 또는 pUBN6)(도14)으로 형질전환된 세포에 비하여 낮은 GUS 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 이것은 인트론 스플라이싱이 여전히 일어나고 있으며 적어도 pTBN1의 경우 원래의 pTBN 벡터와 현저히 다르지 않다는 것을 제시한다. 따라서, BBTV 복제 요소를 인트론으로 삽입하는 것은 pTBN과는 대조적으로 바르나제의 스플라이싱 효율 또는 바르나제 활성을 현저히 감소시키지 않았다.
BBTV 기제 "1.1 mer"의 재환형화 및 복제는 Rep(BBTV DNA-1로부터의 유전자 산물)의 존재하에서 생긴다는 것을 보여주는 실험을 실시하였다. 복제는 BBTV DNA-5(가상의 망막모세포종 결합 유사 단백질)의 유전자 산물의 삽입에 의해 복제가 향상된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 재환형화된 벡터(pRTBN6 (도4), pRTNB1(도5), pRUBN6, pRUBN1) 각각은 BBTV DNA-1 및 5 "1.1mer" 및 GUS 발현 벡터에 의해 충격을 받았다.
도15에 도시된 결과는 앞의 발현 벡터 세포 치사 분석(도14)을 지지하였다. 또한, 번역될 수 없는 바르나제(pRUBN6 및 pRUBN)를 함유하는 구조물은 번역될 수있는 구조물에 비하여 더 높은 GUS 활성을 가졌다.
바르나제 활성이 Rep 단백질의 존재하에서만 유도된다는 것을 설명하기 위해 실험을 실시하였다. 따라서, 발현은 Rep 존재할 때에만 생긴다는 것을 설명하기 위해 +/- Rep (BBTV DNA-1 "1.1mer")로 분석을 실시하였다(도3). DNA 농도를 일정하게 유지하기 위하여 스터퍼(stuffer) DNA를 사용하였다.
재환형화되면 구조물이 BBTV DNA-1 및 5 "1.1 mer" 존재하에서 복제할 수 있는지를 관찰하기 위하여, 번역될 수 없는 구조물을 일시적인 바나나 세포 복제분석에 포함시켰다. 세포에 충격을 준지 0, 4 및 8일 후 세포를 수집하고, 전체 세포성 DNA를 추출하여 서던 하이브리드화를 이용하여 분석하였다.
먼저, 막에 DIG-표지된 CaMV 35S 프로브를 표지시켰다. 4일 또는 8일후 세포에서 아무런 복제형태도 보이지 않았다. 그러나, 0일에서, pRUBN6 및 pURBN1 모두에서 아주 저 농도이 강력한 복제 형태가 존재하였다. 35S 프로브를 빼내고 막을 DIG-표지된 BBTV DNA-1 프로브로 다시 표지시켰다. 4일 및 8일 후 수집된 세포에서고수준의 복제가 관찰되었고 0일에서 수집된 세포에서는 복제는 관찰되지 않았다.
실시예 7
TYDV를 기본한 발현 벡터를 사용한 세포치사 분석
(a) TYDV에 대한 내성을 부여하기 위한 Rep-활성화 자살 유전자 벡터
플라스미드 pRTBN(DNA 플랜트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아 오크랜드 소재)는 감자 ST LS1 인트론(188 bp)이 삽입된 바르나제 코딩영역(339 bp)를 함유한다. 전제 바르나제 유전자 및 인트론은 프라이머 BARN.EXP1 및 BARN.EXP2를 사용한 PCR에 의해 pRTBN으로부터 증폭시켰다. 번역될 수 없는 유전자 대조용은 프라이머 BARN.UTR 및 BARN.EXP2를 사용하여 유사하게 증폭하였다.
프라이머:
PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 클로닝하였다. 이들 클론을 pGEM-BTR 및 pGEN-BUTR로 각각 명명하였다. TYDV LIR (LIR-X)를 pGEM-T로부터EcoRI 단편으로 절단하고 이를 pGEM-BTR 및 pGEM-BUTR의 감자 LTS 인트론내에 위치한MfeI 부위로 삽입하였다. 이들 플라스미드를 pBTR-LIR 및 pBUTR-LIR로 명명하였다. pBTR-LIR 및 pBUTR-LIR 내의 LIR-함유 바르나제 유전자를BamHI/PstI 단편으로 절단해내고 유사하게 분해된 pGUS2 벡터에 삽입하여 원래의uidA 코딩 영역을 교체하였다. 플라스미드 pGUS2는 CaMV35S pro (530 bp)-uidA 유전자-CaMV 35S ter (200 bp)를 함유한다. 이들 구조물을 p35S-BTR-LIR 및 p35S-BUTR-LIR로 각각 명명하였다(도17).BamHI/PstI을 사용하여 pGEM-BTR 및 pGEM-BUTR로부터 바르나제 유전자를 절단하는 것에 의해 2개의 대조용 플라스미드를 작성하고, 유사하게 분해된 pGUS2에 삽입하였다. 이들 대조용 플라스미드를 p35S-BTR 및 p35S-BUTR로 각각 명명하였다(도18).
(b) 단자엽식물 및 쌍자엽식물 세포에서 TYDV Rep-활성화된 바르나제 활성의 일시 평가
생체내에서 바르나제 활성을 측정하기 위하여, 녹색 형광 단백질(gfp) 발현 카세트로 자살 구조물에 공동충격을 가하였다. 바르나제 발현 및 작용(즉 세포 치사)는 녹색 형광 초점에서 현저한 감소가 번역되지 않는 바르나제 대조용과 대조적으로 관찰될 때 일어나는 것으로 간주된다.
바나나(무사 종, "레이디핑거" 품종) 및 담배 (니코티아나 바타쿰(Nicotiana tabacum) NT-1) 세포를 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 플라스미드 (i) p35S-BTR, (ii) p35S-BUTR, (iii) p35S-BTR-LIR 및 (iv) p35S-BUTR-LIR (도 17 및 18)를 사용하여 충격을 가하였다. 각 플라스미드에 1 ㎍의 pWORM으로 공동 충격을 가하였다. 구조물 pWORM은 CaMV 35S pro (530 bp)-gfp (750 bp)-CaMV 35S ter (200 bp) 카세트를 함유하며 양쪽 세포 유형을 사용한 과도 분석에서 강한 녹색 형광을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
충격을 가한지 3일 후, GFP-Plus 형광 모듈(여기 = 490, 방출 = 510)을 갖는 Leica MZ12 스테레오 현미경을 사용하여 관찰하였다. p35S-BTR 및 p35S-BTR-LIR은모두 p35S-BUTR 및 p35S-BUTR-LIR과 대조적으로 pWORM으로부터 gfp 발현을 현저하게 감소시켰다(녹색 형광 초점의 개수 및 강도로 측정). 이 결과는 TYDV LIR를 p35S-BTR내의 ST LS1 인트론에 삽입하면 인트론 가공을 방해하지 않을 뿐만 아니라 바르나제 발현을 억제하지도 않는다.
(c) TYDV Rep-활성화 바르나제 벡터의 작성
프라이머 35S-IE (서열 21) 및 LIR-R (서열 20)을 사용한 PCR에 의해 p35S-BTR-LIR(도17A)로부터 CaMV 35S 프로모터, 바르나제 5' 유전자 절반, ST LS1 5' 인트론 절반 및 TYDV LIR을 재증폭시켰다. PCT 산물을 pGEM-T 벡터에 클로닝하고 서열을 확인하였다. 이 플라스미드를 pGEMB 5'로 명명하였다. TYDV LIR, ST LS 1 3' 인트론 절반, 바르나제 3' 유전자 절반 및 nos 터미네이터를 p35S-BTR-LIR로부터XhoI/SacI 단편으로 절단해내고, TYDV SIR을 pGEM-SIR로부터SacI/NcoI 단편으로 절단해내며 또 CaMV 35S 프로모터, 바르나제 5' 유전자 절반, ST LS1 5' 인트론 절반 및 TYDV LIR를 pGEMB5'로부터NcoI/SacII 부분 단편으로 절단해내었다. 삽입물들을XhoI/SacII 분해된 pBluescript II (스트라타진 제조)와 함께 결찰시켰다. 생성한 구조물을 pBTR.test1(도19A)로 명명하였다. 번역될 수 없는 대조용 벡터를 유사하게 제조하고 생성한 구조물을 pBURT.test1(도19B)로 명명하였다.
(d) 단자엽식물 및 쌍자엽 식물 세포에서 일시적 TYDV Rep-활성화된 바르나제 발현
바나나 (무사 종, "레이디핑거" 품종) 및 담배(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) NT-1)를 상술한 바와 같이 하기 표 4에 수록된 플라스미드 조합으로 충격을 가하였다.
표 4에 수록된 결과는 바르나제 발현(및 따라서 세포 치사)은 TYDV Rep이 트랜스로 공급될 때에만 pBTR-test1로부터 활성화된다는 것을 제시한다. 번역될 수 없는 바르나제 유전자 카세트(pBUTR-test 1)의 Rep-활성화된 발현은 pWORM으로부터 gfp 발현에서 현저한 감소를 초래하지 않는다. 프라이머 BARN.UTR (서열 40) 및 BARN.EXP2 (서열 41)가 PCR에 사용되고 DIG-표지된 바르나제 특이적 프로브를 전술한 프라이머를 사용하여 합성한 이외에는, pBUTR-test1, pWORM 및 p35S-Rep으로 충격이 가해진 세포로부터의 PME의 Rep-보조 닉생성, 결합 및 복제가 앞서 기재한 바와 같이 확인되었다.
(e) Rep-활성화 바르나제 유전자 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드의 작성
Rep-활성화 바르나제 카세트를 pBTR-test1 및 pBUTR-test1로부터 PvuII 단편으로 절단하여 바이너리 플라스미드 pTAB5 (CSIRO제조, 호주 캔버라 소재)내의CaMV 35S pro-NPTII-CaMV 35S ter 카세트의 하류에 존재하는 독특한EcoRI 부위(DNA 폴리머라제 I 대형 클레노 단편을 사용한 무딘 말단)에 삽입하였다. 생성한 구조물을 pTAB-BTR1 및 pTAB-BUTR1로 각기 명명한다. 양쪽 벡터를 Singh 등(1993)의 방법을 이용하여 엘렉트로포레이션에 의해 아그로박테륨 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(LBA4404)에 도입하였다.
(f) Rep-활성화된 바르나제 유전자 카세트를 사용한 단자엽식물 및 쌍자엽식물의 안정한 형질전환
플라스미드 pBTR-test1 및 pBUTR-test1은 독립적으로 안정한 바나나 형질전환을 위한 pDHKAN으로 공동형질전환되고 또 플라스미드 pTAB-BTR1 및 pTAB-BUTR1을 포함하는 아그로박테륨 배양액을 담배 잎 디스크의 아그로박테륨 매개 형질전환에 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 바나나(무사 종, "레이디핑거" 품종) 및 담배(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabcum) "Samsun" 품종)의 안정한 형질전환을 실시하였다.
형질전환된 식물은 프라이머쌍 LIR-F/LIR-R (서열19/서열20) 및 NPT-F/NPT-R (서열36/서열37)을 사용한 PCR에 의해 바르나제 유전자 카세트 및 NPTII 유전자를 함유하는 것으로 확인되었다. 단자엽식물 및 쌍자엽식물 종의 10개의 독립적인 트랜스제닉 주를 다음 연구를 위해 선택하였다.
(g) 트랜스제닉 담배에서 TYDV에 대한 Rep-활성화 과민성 내성
pTAB-BTR1 및 pTAB-BUTR1로 형질전환된 10개의 독립적인 담배 식물에서 바르나제 발현의 Rep-활성화는 상술한 바와 같이 p35S-Rep 구조물의 입자 충격에 의해먼저 시험되었다. 충격을 가한지 2일 후, 충격 영역의 괴사는 번역될 수 없는 대조용(pTAB-BUTR-1)과는 대조적으로, Rep-활성화 번역가능한 바르나제 유전자 카세트(pTAB-BTR1)로 형질전환된 담배 식물의 잎상에서만 뚜렷하였다. 이 결과는 트랜스제닉 TYDV Rep의 도입이 통합된 염색체 카피로부터 바르나제 발현 카세트의 복제성 방출에 충분하다는 것을 제시한다. Rep-보조 닉 생성, 결합 및 복제는 NT-1 세포에서 일시적 분석에 대해 기재한 바와 같이 pTAB-BUTR1로 형질전환된 담배 식물의 잎 조각에서 확인되었다.
트랜스제닉 담배에서 TYDV에 대한 과민성 내성을 측정하기 위하여, 유독성 매미충(오로시우스 아르젠타투스(Orosius argentatus))에게 식물상에서 2일까지 음식물을 제공하였다. 다음 주일에 걸쳐, Hill(1937)에 의해 맨처음 기재된 특징적인 TYDV 증후에 대해 식물을 조사하였다. Rep-활성화, 번역될 수 없는 바르나제 발현 카세트(pTAB-BUTR1)로 형질전환된 식물은 왜소증, 황화, 어린 잎의 가장자리와 선단의 굽힘, 및 인터모드의 단축을 비롯한 전형적인 TYDV 징후를 나타낸다. 대조적으로, Rep-활성화, 번역가능한 바르나제 발현 카세트(pTAB-BTR1)로 형절전환된 담배 식물은 진디가 서식하는 부위에서 부정형 괴사 병반(바르나제 유도된 세포 치사의 결과)을 나타낸다. 이들 식물은 보통 감염되지 않은 담배 식물과 대조적으로 3개월에 걸쳐 성장하며 어떤 지점에서도 TYDV 감염의 특징적 징후를 나타내지 않는다.
20개의 트랜스제닉 담배 식물 및 감염되지 않은 대조용 각각의 잎으로부터 감염된 지 2주후, 스튜워트 및 비아(1993)의 방법을 이용하여 전체 gDNA를 분리한다. 전체 gDNA(1 ㎍)를 TYDV 피복 단백질 유전자(CP-F 및 CP-R)로 명명된 프라이머를 사용한 PCR에 대한 주형으로 사용한다. 765 bp 피복 단백질 유전자 및 바이러스 게놈은 pTAB-BUTR1로 형질전환된 담배에서만 검출되었다. 이 결과는 pTAB-BTR1로 형질전환된 담배식물은 TYDV 감염에 대해 내성을 가지며 장기간에 걸쳐 TYDV-유도된 징후를 나타내지 않는다는 것을 제시한다.
프라이머:
실시예 8
BBTV를 기본한 gfp 벡터 작성
녹색 형광 단백질(GFP) 및 BBTV 인터제닉 영역을 암호화하는 리포터 유전자를 사용하여 Rep-활성화 바르나제 카세트를 기본한 일련의 유사한 벡터를 작성하였다. pRTBN 시리즈 벡터와 유사한 방식으로 중첩 PCR에 의해 발현 및 재환형화 벡터를 작성하고 pUC19 벡터에 클로닝하였다. 이들 벡터의 작성에 사용된 프라이머를 하기 표 5에 나타낸다. 일부 경우 플라스미드 pBN, pTBN6 및 pTBN1을 PCR용 주형으로 사용하였다.
먼저, 플라스미드 pGI(서열 69), pGI6(서열70), pGI1 (서열 71)을 작성하고 도20, 21 및 22에 각각 나타내었다. 궁극적으로, 플라스미드 pRGI6, pRGI1, pRGI1/6을 작성하고 도 23, 24 및 25에 각기 도시하였다. 도 20 내지 25에서, 인트론은 감자 ST-LS1 인트론을 지칭하며, 인터제닉 영역은 BBTV DNA-1 또는 -6로부터 유도되며 CT 및 NT는 GFP 리포터 유전자의 C-말단 및 N-말단 부분을 지칭한다.
이들 다양한 구조물의 효율은 바나나 세포 현탁액의 미량-투사체 충격법을 통하여 일시 분석으로 평가하였다. 제1 일시분석은 다양한 단량체가 복제 방출되어 재환형화되는지 및 GFP 유전자가 정확하게 전사, 가공 및 발현되는지를 결정하기 위해 GFP 발현을 측정한다. BBTV DNa-1 1.1 mer를 동량의 pGI1 또는 pGI6과 혼합하고 바나나 배발생세포 현탁액에 충격을 주었다. 충격을 가한지 8일 후, GFP-특이적 프로브를 사용한 서던 하이브리드화에 의해 복제방출 및 환형화를 분석하였다. GFP 발현은 GFP 현미경을 이용하여 모니터링하며 웨스턴 블럿 분석법 및 GFP-특이적 항혈청을 사용하여 정량하였다.
서던 하이브리드화는 BBTV DNA-1 1.1mer가 트랜스제닉으로 전달될 때에만 pGI1 또는 pGI6P로부터 단량체성 환형 분자가 존재한다는 것을 나타낸다. 유사하게, GFP 발현은 바이러스 유도된 1.1 mer가 존재할 때에만 검출되었다.
실시예 9
BBTV에 대한 바르나제 유도 내성을 유도하기 위한 바나나의 안정한 형질전환
블루고에(Bluggoe) 및 카벤디쉬(Cavendish)의 바나나 배발생세포 현탁액을 미량투사체 충격법(베커 등, 2000)을 사용하여 pRTBN6 및 선택마커 유전자를 갖는 플라스미드와 함께 공동 형질전환시켰다. 재생된 어린식물을 PCR로 분석하여 Rep-활성화 바르나제 카세트의 완전한 카피가 바나나 게놈에 통합되었는지에 대해 결정한다. 양성 형질전환체를 증대시키고, 각 형질전환체로부터의 처음 5개 식물을 20 BBTV 유독성 진디로 감염처리시켰다. 서던 하이브리드화 분석을 이용하여 형질전환된 식물과 형질전환되지 않은 식물 사이의 바이러스성 DNA 축적 수준을 비교하였다. 유망한 트랜스제닉 주는 증식시키고 다시 감염처리하고 분석한다.
거의 모든 경우에서, 트랜스제닉 바나나 식물은 대조용과 비교하여 바나나 송이 상부 질병의 증거를 나타내지 않는다. 오히려, 진디가 서식한 지점에서의 비정상적인 괴사가 관측되며, 이는 바르반제 유도 세포 치사를 반영한다. PCR 및 서던 하이브리드화를 이용하여서는 시험한 어떤 식물 부분에서도 BBTV의 피복 단백질 유전자를 확인할 수 없으며, 이는 이들 식물주가 BBTV 감염, 복제 및 확산에 내성을 갖는다는 것을 제시한다.
실시예 10
TYDV를 기본한 조직 특이적 및 유도성 Rep-활성화 발현
Rep 발현 부위 및 식물계(planta)에서 트랜스진 활성화/복제를 제어하기 위하여 조직 특이적 프로모터를 적용하였다.
(a) 구성적 발현
벡터 pTAB16은 pBIN16내의 좌우 T-DNA 경계 사이에 위치한 CaMV 35S pro-bar 선택 유전자-ocs ter 및 CaMV 35S pro-uidA-CaMV 35S ter 카세트를 함유한다. 이 CaMV 35S-TYDV Rep 유전자 카세트를EcoRI/BamHI 분해에 의해 p35S-Rep으로부터 절단해내서 유사하게 분해된 pTAB16 벡터에 삽입하여 원래의 CaMV 35S-uidA 카세트를 교체하였다.
(b) 종자 특이적 발현
1 kb 벼 글루테린 프로모터(진뱅크 수탁번호 X52153)는 담배에서 종 특이적 리포터 유전자 발현을 이끈다고 알려져있다(레이시 등, 1989). 벼의 글루테린 프로모터를NcoI 분해에 의해 플라스미드 pGT3-JEFLK (밀러, 2001)로부터 절단해내어 유사하게 분해된 pTAB-TYDV-Rep 벡터에 결찰시켜 원래의 CaMV 35S 프로모터를 교체하였다. 이 구조물을 pGL-TYDV-Rep으로 명명하였다.
(c) 뿌리 특이적 발현
880 bp의 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 뿌리 특이적 키나제 상동체(ARSK1) 프로모터(진뱅크 수탁번호 L22302)는 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 표피, 내피 및 피질 영역에서 조직 특이적 uidA리포터 유전자 발현을 이끈다고 알려져있다(황 및 굳맨, 1995). 프라이머 ARSK-F 및 ARSK-R을 사용한 PCR에 의해 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) gDNA로부터 ARSK1 프로모터를 증폭시켰다. 생성한 PCR 산물을 pGEM-T에 클로닝하고 서열을 확인하였다. ARSK1 프로모터를NcoI 분해에 의해 pGEM-T로부터 절단해내고 유사하게 분해된 pTAB-TYDV-Rep에 결찰시켜 원래의 CaMV 35S 프로모터를 교체하였다. 이 구조물을 pAR-TYDV-Rep으로 명명하였다.
프라이머:
(d) 상처 유도성 발현
2032 bp 아스파라구스 오피시날리스(Asparagus officinalis) PR 유전자(AoPR1) 프로모터(진뱅크 수탁번호: A26573)는 상처 및 활발하게 분열되는 세포유형, 예컨대 캘러스에서 강한 리포터 유전자 발현을 지시하는 것으로 밝혀졌다(피렉 등, 1993). AoPR1 프로모터는 프라이머 AoPR-F 및 AoPR-R를 사용한 PCR에 의해 에이. 오피시날리스(A. officinalis) gDNA로부터 증폭되었다. 생성한 PCR 산물을 pGEM-T에 클로닝시키고 서열을 확인하였다.NcoI 분해로부터 pGEM-T로부터 AoPR1 프로모터를 절단해내서 유사하게 분해된 pTAB-TYDV-Rep에 결찰시켜 원래의 CaMV 35S 프로모터를 교체하였다. 이 구조물을 pAo-TYDV-Rep로 명명하였다.
프라이머:
(e) 알코올 유도성 발현
아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)로부터 유도된 ALC 스위치(switch)는 A1cA 프로모터 및 A1cR 리셉터를 기본으로 한 알코올 유도성 프로모터 시스템이다. 이 ALC 스위치는uidA 리포터 유전자 모델을 사용하여 식물 시스템에서 작용하는 것으로 밝혀졌다(캐딕 등, 1998). 플라스미드 pSRNAGS(BTI, 코넬 유니버시티, 뉴욕 이타카 소재)는 pBIB16에 CaMV 35S pro-A1cR 유전자-nos ter 및 AlcA pro-uidA 리포터 유전자-CaMV 35S ter 카세트를 함유한다. 이 CaMV 35S pro-A1cR 유전자-nos ter-AlcA pro 카세트는 프라이머 35S-IE (서열 21) 및 Alc-R (서열 61)을 사용한 PCR에 의해 pSRNAGS로부터 증폭되었다. 이 PCR 산물을 pGEM-T에 클로닝시키고 서열을 확인하였다. 삽입물을NcoI 분해에 의해 절단해내어 유사하게 분해된 pTAB-TYDV-Rep에 결찰시켜 원래의 CaMV 35S 프로모터를 교체하였다. 이 구조물을 pAlc-TYDV-Rep로 명명하였다.
프라이머:
바이너리 TYDV Rep-함유 플라스미드 각각을 싱(Singh) 등 (1993)의 방법을 이용한 엘렉트로포레이션법에 의해 아그로박테륨 튜메파시엔스(LBA4404)에 도입하였다.
(f) 정확한 조직 형태에서 조직 특이적 및 유도성 Rep 발현 지시 리포터 유전자 활성화
호슈 등(1988)의 방법을 이용하여 플라스미드 pTAB-TYDV-Rep, pGL-TYDV-Rep, pARTYDV-Rep, pAo-TYDV-Rep 및 pAlc-TYDV-Rep을 갖는 아그로박테륨(Agrobacterium)으로 플라스미드 pTEST4로 형질전환된 담배 식물로부터의 잎을 초감염시켰다. 이 경우, 형질전환된 담배 식물의 선택은 제초제 포스포이노트리신 암모늄(PPT)을 사용하여 달성하였다. 트랜스제닉 식물은 프라이머 TYDV.REpF 및 TYDV.RepR을 사용한 PCR에 의해 TYDV Rep 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 각 플라스미드에 대한 10개의 독립적인 형질전환체를 다음 연구를 위해 선택하였다. 식물을 성숙시키고 꽃을 맺게하여 종자를 얻었다. 독립적인 형질전환체로부터 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 종자를 비롯한 상이한 식물 기관을 수집하고 조직화학적 분석을 이용하여 GUS 활성을 검출하였다.
플라스미드 pTAB-TYDV-Rep로 초 형질전환된 담배식물은 시험한 모든 식물 부분을 통하여 강한 GUS 발현을 나타낸다. 이들 식물에서 GUS 발현양은 비복제 대조용 pTAB16으로 형질전환된 식물에서 보다 훨씬 높았다.
대조적으로, 플라스미드 pGL-TYDV-Rep으로 초 형질전환된 식물은 종자에서만 강한 GUS 발현을 나타내고, 플라스미드 pAR-TYDV-Rep으로 초 형질전환된 식물은 뿌리에서만 강한 GUS 발현을 나타내며, 플라스미드 pAo-TYDV-Rep로 초 형질전환된 식물은 상처 및 분열세포에서 강한 GUS 발현을 나타내며 또 플라스미드 pAlc-TYDV-Rep로 초 형질전환된 식물은 1% v/v 에탄올 용액에 적셔질때에만 구성적 GUS 발현을 나타낸다.
GUS 발현 카세트의 Rep-보조 닉 생성, 결합 및 복제는 플라스미드 pTAB-TYDV-Rep로 초 형질전환된 담배식물의 모든 조직형태에서 확인되었다(상술한 바와 같이). 대조적으로, 이 활성은 플라스미드 pGL-TYDV-Rep으로 초 형질전환된 식물의 종자에서만 검출되고, 플라스미드 pAR-TYDV-Rep으로 초 형질전환된 식물의 뿌리에서만 검출되며, 플라스미드 pAo-TYDV-Rep으로 초 형질전환된 식물의 상처부위에서만 검출되고 또 플라스미드 pAlc-TYDV-Rep으로 초 형질전환된 에탄올 유도된 식물에서 구성적으로 검출된다. 이 결과는 TYDV Rep 유전자의 조직 특이적 또는 유도된 발현이 상술한 조직 유형에서만 Rep-활성화 GUS 카세트로부터 고수준의 발현을 제공한다는 것을 제시한다.
실시예 11
TYDV를 기본한 TMV p50 및 hrmA 유전자 매개 내성
(a) TMV p50 헬리카제(helicase) 단편의 TYDV Rep 활성화 발현은 담배에서 전신적 획득 내성(SAR)을 유도한다.
먼저의 연구(에릭슨 등, 1999)는 50 kDa 담배 모자이크 바이러스(TMV) 헬리카제 단편(p50)의 비-바이러스성 발현이 적합한 담배 변종(예컨대 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabcum,"쁘티트 하나바" 품종, N 유전자에 대한 SR1 동형접합체)에서 N-매개 과민성 반응(HR)을 유발하기에 충분하다. 방어 반응은 바이러스 감염 부위에서 세포 치사 및 바이러스성 복제 및 이동의 억제로써 전신 획득 내성(SAR) 경로의 도입을 특징으로 한다.
클로닝된 게놈 TMV DNA(식물 유전자 발현 센터, 미국 유니버시티 오브 캘리포니아)로부터의 프라이머 p50-F 및 p50-R을 사용한 PCR에 의해 p50 유전자 단편을 증폭시켰다. 이 PCR 산물을 pGEM-T에 클로닝하고 서열을 확인하였다. pTEST3(도10)으로부터의 TYDV LIR을 함유하는 카탈라제 인트론을 프레임 처리하여 p50 코딩 영역내에 독특한 EcoRI 부위로 만들었다. 이 플라스미드를 pGEM50-LIR로 명명하였다. pUC-기제 Rep 활성화 p50 유전자 플라스미드를 실시예 2에서 pTEST3에 대해 기재한 바와 같이 작성하였다. 이 카세트를 pTEST4에 기재된 바와 같이 pART27에 삽입하였다. 생성한 p50 Rep-활성화 바이너리 플라스미드를 pSAR1로 명명하였다. 이 플라스미드 pSAR1을 사용하여 상술한 아그로박테륨((Agrobacterium)을 형질전환시켰다.
프라이머:
(b) 담배에서 TYDV에 대한 전신 획득 내성
아그로박테륨(Agrobacterium)-매개 형질전환에 의해 플라스미드 pSAR1으로부터의 T-DNA로 형질전환된 10개의 담배식물(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabcum) "쁘티트 하바나"품종 N 유전자에 대한 SR1 동형접합체)을 얻고 상술한 바와 같은 PCR에 의해 Rep-활성화 카세트와 NPT II 유전자를 함유하는 것을 확인하였다. 식물을 TYDV로 감염시키고 상술한 바와 같이 증상을 관찰하였다. Rep-활성화, p50 유전자에 의해 형질전환된 담배 식물은 감염 2일 후 진디가 서식하는 부위에서 이상 과민성 괴사를 나타낸다. 이들 식물은 감염된 비-트랜스제닉 담배식물과는 대조적으로 3개월에 걸쳐 정상으로 발달하며 전형적인 TYDV-유도 증상을 나타낸다.
TYDV 게놈 DNA는 접종된 비-트랜스제닉 담배에서는 검출되지만 전술한 바와 같이 트랜스제닉 또는 비감염 대조용 주(line)에서는 검출되지 않는다. 이 결과는 TMV p50 유전자의 TYDV Rep-유도 발현이 적합한 담배 배양물에서 N 유전자 과민반응을 자극하여 TYDV 감염에 대한 내성을 제공하기에 충분하다는 것을 나타낸다.
(c) 상처유도성 TYDV Rep 발현은 TMV p50 유전자 발현을 활성화하고 다양한 병원체에 내성 SAR을 유발한다.
pSAR1-형질전환된 담배 식물로부터의 잎을 전술한 바와 같이 플라스미드 pAo-TYDV-Rep (실시예 10)을 함유하는 아그로박테륨(Agrobacterium)으로 초 감염시킨다. 상처유도성 Rep 유전자를 함유하는 것으로 확인된 10개의 초 형질전환된 주(line)를 다음 연구를 위해 선택하였다. 트랜스제닉 식물 및 적합한 대조용을 다양한 병원체, 즉 (i) 담배 잎맥 반점 바이러스, (ii) 선충 벡터 파라트리코도루스 파키데르무스(Paratrichodorus pachydermus)를 통한 담배 래틀(rattle) 바이러스, 및 (iii) 감염성 BeYDV 1.1mer의 생물분해성 도입으로 감염시켰다. 시간이 경과함에 따라 식물에 대해 특징적인 바이러스 유도된 증상을 관찰하였다. 모든 트랜스제닉 식물은 대조용과 대조적으로 바이러스 접종 부위에서 이상적인 과민반응성 괴사를 나타낸다.
(d) TYDV Rep의 상처유도성 발현은 담배에서 hrmA-매개 광범위 병원체 내성을 활성화한다
슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringaepv. 시린가에(syringae))로부터의 hrmA 유전자 산물은 다수의 담배 배양물에서 병원체 관련 유전자를 활성화시켜서 바이러스, 진균 및 세균을 비롯한 다양한 병원체에 대한 내성을 부여한다(쉔 등, 2000)는 것이 알려져있다.
hrmA 유전자를 프라이머 hrm-F 및 hrm-R을 사용한 PCR에 의해 코딩 서열을 함유하는 플라스미드로부터 증폭시켰다. pTEST3에 대한 실시예 2에 기재된 바와 같이 pUC-기제 Rep 활성화 hrmA 플라스미드를 작성하였다. pTEST4에 대해 상술한 바와 같이 이 카세트를 pART27에 삽입하였다. 생성한 hrmA-활성화 바이너리 플라스미드를 pSAR2로 명명하였다. 이 플라스미드 pSAR2를 사용하여 상술한 바와 같이 아그로박테륨(Agrobacterium)을 형질전환시켰다.
아그로박테륨(Agrobacterium) 매개 형질전환에 의해 플라스미드 pSAR2로부터의 T-DNA로 형질전환된 10개의 담배식물(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabcum)을 얻고 상술한 바와 같이 PCR에 의해 Rep-활성화 카세트 및 NPTII 유전자를 함유하는 것을 확인하였다. pSAR2 형질전환된 담배식물로부터의 잎을 상술한 바와 같이 플라스미드 pAo-TYDV-Rep을 함유하는 아그로박테륨(Agrobacterium)으로 초 감염시켰다. 상처 유도성 Rep 유전자를 함유하는 것으로 확인된 이러한 초 형질전환된 주(line)를 다음 연구를 위해 선택하였다. 트랜스제닉 식물 및 적합한 대조용을 당양한 병원체, 예컨대 담배 잎맥 반점 바이러스, 담배 부식 바이러스, 블랭크 줄기 진균피토프토라 파라지티카(Phytophtora parasitica) 및 야생 불꽃 박테륨 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)pv. 타바치(tabaci)로 감염처리시켰다. 시간이 경과함에 따라서, 특징적인 병원체 유도된 증상에 대해 식물을 관찰하였다. 모든 트랜스제닉 식물은 대조용과 대조적으로 접종 부위에서 이상적인 과민반응성 괴사를 나타낸다.
실시예 12
TYDV를 기본한 인간의 혈청 알부민의 과발현
(a) 상업적으로 중요한 단백질인 인간 혈청 알부민의 Rep-활성화된 과발현
알부민은 혈액 혈청 단백질의 약 1/2을 포함하는 용해성, 단량체성 단백질이다. 알부민은 주로 스테로이드, 지방산 및 흉선 호르몬에 대한 캐리어 단백질로 작용하며 세포외 체액 부피에 중요한 역할을 한다.
프라이머 Alb-F 및 Alb-R를 사용한 PCR에 의해 상기 유전자를 함유하는 플라스미드로부터 1831 bp의 인간 혈청 알부민(HSA) 코딩 영역(론 등, 1981)을 증폭시켰다. pTEST3에 대한 실시예 2에서 기재한 바와 같이 pUC-기제 Rep-활성화 HSA 플라스미드를 작성하였다. 생성한 HSA-활성화 바이너리 플라스미드를 pHSA1으로 명명하였다. 이 플라스미드 pHSA1를 사용하여 상술한 바와 같이 아그로박테륨(Agrobacterium)을 형질전환시켰다.
아그로박테륨(Agrobacterium) 매개 형질전환에 의해 플라스미드 pHSA1으로부터의 T-DNA로 형질전환된 10개의 담배 식물(니코티아나 타바쿰)(Nicotiana tabcum)을 얻고 또 상술한 바와 같이 Rep-활성화 카세트 및 NPTII 유전자를 함유하는 것을확인하였다. pHSA1 형질전환된 담배식물로부터의 잎을 상술한 바와 같이 플라스미드 pTAB-TYDV-Rep, pGL-TYDV-Rep, pAo-TYDV-Rep, pAlc-TYDV-Rep를 함유하는 아그로박테륨으로 초 감염시켰다. 각 형질전환체로부터 10개 초 형질전환된 주(line)은 Rep 유전자를 함유하는 것으로 확인되며 다음 연구를 위해 선택하였다. 식물을 성숙시키고 ELISA법을 이용하여 HSA 함량을 평가하고 또 HSA 유전자 산물에 대한 항체를 생성하였다. HSA 단백질은 고 수준으로 검출되지만, 상이한 식물 부분에서 또는 특정 조건하에서 구성적으로(pTAB-TYDV-Rep), 종자에서만(pGL-TYDV-Rep), 상처 조직(pAo-TYDV-Rep) 및 알코올 처리된 식물(pAlc-TYDV-Rep)에서 구성적으로 검출되었다. 플라스미드 pHSA1로부터의 인간 혈청 알부민 유전자의 Rep 활성화 발현에 대한 제시된 모델은 도26에 도시되어 있다.
프라이머:
본 명세서에 기재된 발명은 특별히 기재하지 않는 한 변화 및 변형이 가능함을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 또한 본 발명은 모든 그러한 변화와 변형을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 지칭되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성 및 화합물을 개별적으로 또는 종합적으로 포함하며 상기 단계 또는 특징의 2개 이상의 모든 조합도 포함한다.
참고도서목록

Claims (40)

  1. 진핵생물 세포의 게놈으로 통합되면, 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체에 의해 인식될 수 있는 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 인접한 유전자 요소를 포함하는 구조물에 있어서, 상기 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체는 상기 유전자 요소 및 상기 인접 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부의 절단 및 환형화를 촉진시키며, 또 상기 바이러스 유도된 복제-촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포 상동체에 의해 인식될 수 있는 뉴클레오티드 서열은 인트론 서열 또는 그의 일부 또는 기타 스플라이스 시그널을 비롯한 한 개 이상의 외인성 서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 비-환형의 상기 유전자 요소 및 기타 뉴클레오티드 서열은, 환형화되면, 환형화 이전에 또는 환형화 및 발현 이전에, 2개 모듈 뉴클레오티드 서열에는 존재하지 않는 특성을 나타내기 위한 특성 또는 능력을 나타내는 유전자 서열을 형성하는 2개 모듈 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로하는 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 유도된 복제 단백질은 Rep 또는 그의 유도체 또는 기능적 등가물 또는 상동체인 구조물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 바이러스 유도된 복제 단백질이 Rep인 구조물.
  4. 제1항 또는 제2항 또는 제3항에 있어서, 외인성 서열이 코딩 서열, 프로모터 및 하나 이상의 스플라이스 시그널을 포함하는 구조물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 구조물이 선형일 때 상기 코딩서열은 인트론 서열에 의해 분리된 2개 모듈 서열을 포함하는 구조물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 유전자 요소의 환형화후, 전체 코딩 서열은 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 구조물.
  7. 제6항에 있어서, 코딩서열은 세포 또는 상기 세포를 포함하는 생물 또는 식물에 대하여 표현형 또는 유전형 특성을 부여하는 mRNA 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 구조물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 세포치사를 유도하거나 촉진하는 구조물.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조물은 진핵생물 세포에 도입되는 구조물.
  10. 제9항에 있어서, 진핵생물 세포가 식물세포인 구조물.
  11. Rep 단백질 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체의 존재하에서 유전자 요소를 포함하는 환형 뉴클레오티드 서열의 생성을 촉진하는 Rep-단백질 인식서열 또는 다른 바이러스 또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포로부터의 기능적 상동체와 인접하는 유전자 요소를 포함하는 구조물에 있어서,
    상기 Rep-단백질 인식서열은 1개 이상의 인식서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 상기 유전자 요소는, 환형 분자내에 함유되어 있으면, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는데 필요한 조절서열과 기능적으로 결합된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 선형의 상기 유전자 요소는 5'에서 3' 순으로 폴리뉴클레오티드 서열 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 환형일 때 그의 발현을 허용하는 조절서열을 포함하며,
    환형화 될 때, 상기 유전자 요소는 발현될 때 Rep 단백질 인식서열의 전부 또는 일부에 의해 상기 폴리뉴클레오티드 서열로부터 분리된 조절서열을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 발현산물을 암호화하는 것을 특징으로하는 구조물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 구조물이 선형일 때, 폴리뉴클레오티드 서열은 스플라이스 시그널에 의해 분리된 코딩 서열의 5' 부분 및 3' 부분을 포함함으로써 환형으로 될 때 전체 코딩 서열이 구성되도록 하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 코딩서열의 3' 말단에 기능적으로 연결된 터미네이터 서열을 더 포함하는 구조물.
  14. 제11항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서, 조절서열이 코딩서열의 5' 말단에 기능적으로 연결된 프로모터인 구조물.
  15. 제14항에 있어서, 유전자 요소가 환형일 때 코딩서열은 세포 또는 상기 세포를 포함하는 생물 또는 식물상에 표현특성 또는 유전특성을 부여하는 mRNA 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  16. 제15항에 있어서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 세포치사를 유발하거나 촉진하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  17. 제11항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조물이 진핵생물 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 구조물.
  18. 제17항에 있어서, 진핵생물 세포가 식물세포인 구조물.
  19. 5'에서 3' 순으로 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구조물에 있어서,
    상기 제1 및 제6 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이하며 각각 하나 이상의 Rep 단백질 또는 그의 유도체 또는 상동체에 의해 인식될 수 있는 Rep 단백질 인식서열을 포함하고 있어서 상기 구조물이 게놈 서열과 같은 대형 뉴클레오티드 서열에 통합되면 상기 제1 및 제6 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 상기 제1 및 제6 서열과 인접한 유전물질은 절단되어 환형화될 수 있으며, 상기 Rep 단백질 인식서열은 인트론 서열 또는 그의 일부 또는 다른 스플라이스 시그널을 비롯한 하나 이상의 외인성 서열과 인접하거나 그속에 삽입되며;
    상기 제2 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분을 포함하고;
    제3 뉴클레오티드 서열은 상기 제2 서열과 기능적으로 연결된 전사 터미네이터 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체이며;
    제4 뉴클레오티드 서열은 제5 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 프로모터 서열이고;
    제5 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분이며 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 부분은 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 코딩 서열을 나타내며;
    1개 이상의 Rep 단백질 존재하에서, 상기 구조물이 게놈 서열과 같은 대형 뉴클레오티드 서열에 통합되면, 환형화된 유전자 서열은 상기 제1 및/또는 제6 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 외인성 서열 또는 기타 스플라이스 시그널의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된상기 프로모터 및 전사 터미네이터 서열을 순서대로 포함하는 상기 대형 뉴클레오티드 서열로부터 분리되게 생성되는 것을 특징으로하는 구조물.
  20. 제19항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 코딩서열은 상기 세포를 포함하는 생물 또는 식물상에 표현특성 또는 유전특성을 부여하는 mRNA 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  21. 제20항에 있어서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 세포치사를 유발하거나 촉진하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  22. 제19항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조물이 진핵생물 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 구조물.
  23. 제22항에 있어서, 진핵생물 세포가 식물세포인 것을 특징으로 하는 구조물.
  24. 5'에서 3' 순으로, 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널과 인접하거나 그 속에 존재하는 Rep 단백질 인식서열, 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 부분, 전사 터미네이터 또는 그의 기능적 등가물, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단 부분에 기능적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는 구조물을 식물의 게놈에 도입하는 것을 포함하며,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 부분은 세포 치사 또는 잠복성을 유도할 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 코딩 영역 및 동일하거나 상이한 Rep 단백질 인식서열을 나타내며; 상기 식물 세포가, 인접하는 Rep 단백질 인식 서열을 인식할 수 있는 Rep 단백질을 갖는 ssDNA 바이러스에 의해 감염되면, 상기 구조물은 절단되어 환형화되므로 식물세포를 치사시키거나 아니면 식물세포를 잠복성으로 만드는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 발현될 형태의 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 재구성하는 것을 특징으로하는, ssDNA 바이러스에 대한 내성을 트랜스제닉 식물 또는 그의 후대에서 발생시키기 위한 방법.
  25. 제24항에 있어서, ssDNA 바이러스가 제미니바이러스 또는 나노바이러스 그룹의 구성원인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제미니바이러스가 베고모바이러스 또는 마스트레바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제24항 또는 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 구조물이 서열 31 내지 서열 36에 실질적으로 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 31 내지 서열 36과 60% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 31 내지 서열 36의 하나 이상과 하이브리드를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃에서 낮은 스트린젠시 조건하에서 상기의 상보적 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 공유결합 폐환형 DNA 구조물을 생성하는데 사용하기 위한 유전자 요소에 있어서,
    상기 유전자 요소는 5'에서 3' 방향으로 전사 터미네이터에 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 부분; 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하고, 환형화되면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 부분은 외인성 서열 또는 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널의 전부 또는 일부에 의해 분리된 폴리뉴클레오티드 서열의 상기 3' 부분에 기능적으로 연결되는 것을 특징으로하는 유전자 요소.
  29. 제28항에 있어서, 바이러스 유도된 복제촉진 단백질 또는 그의 유도체 또는 진핵생물 또는 원핵생물 상동체에 의해 인식될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 유전자 요소.
  30. 제29항에 있어서, 상기 바이러스 유도된 복제촉진 단백질이 Rep 또는 그의 유도체 또는 그의 기능적 등가물 또는 그의 상동체인 유전자 요소.
  31. 제30항에 있어서, 상기 바이러스 유도된 복제촉진 단백질이 Rep인 유전자 요소.
  32. 제28항 또는 제29항 또는 제30항 또는 제31항에 있어서, 공유결합 밀폐형 구조물인 경우 상기 폴리펩티드는 mRNA 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전자 요소.
  33. 제32항에 있어서, 상기 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 세포치사를 유도하거나 촉진하는 것을 특징으로 하는 유전자 요소.
  34. 제28항에 있어서, 진핵생물 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 유전자 요소.
  35. 제34항에 있어서, 진핵생물 세포가 식물세포인 유전자 요소.
  36. 제28항 내지 제35항중 어느 한 항에 따른 유전자 요소를 포함하는 유전적으로 변형된 식물 또는 그의 부위.
  37. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 유전자 구조물을 포함하는 유전적으로 변형된 식물 또는 그의 부위.
  38. 제11항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 유전자 구조물을 포함하는 유전적으로 변형된 식물 또는 그의 부위.
  39. 제19항 내지 제33항중 어느 한 항에 따른 유전자 구조물을 포함하는 유전적으로 변형된 식물 또는 그의 부위.
  40. Rep 단백질 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체의 존재하에서 유전자 요소를 포함하는 환형 뉴클레오티드 서열의 생성을 촉진하는 Rep-단백질 인식서열과 인접하는 유전자 요소를 포함하는 구조물에 있어서,
    상기 Rep-단백질 인식서열은 인트론 서열 또는 그의 부분 또는 기타 스플라이스 시그널을 비롯한 1개 이상의 외인성 서열과 인접하거나 그 속에 삽입되며, 상기 유전자 요소는 프로모터의 작용을 실질적으로 방해하는 길이의 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된 프로모터의 3' 부분 및 5' 부분을 포함하며, 선형의 상기 유전자 요소는 5'에서 3' 순으로,
    상기 프로모터의 3' 부분;
    경우에 따라 상기 프로모터의 3' 부분과 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 프로모터의 5' 부분을 포함하며;
    환형화될 때, 상기 유전자 요소는 Rep 단백질 인식 서열 및/또는 인트론 서열 또는 기타 스플라이스 시그널의 전부 또는 일부에 의해 분리되지만 프로모터의 활성을 불활성화시키지 않는 프로모터 서열의 5' 및 3' 부분을 포함하며, 상기 환형분자는 경우에 따라 폴리뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 더포함하는 것을 특징으로하는 구조물.
KR1020027012740A 2000-03-28 2001-03-28 선택된 유전자 서열의 부위 특이적 발현 및/또는 발달조절된 발현을 허용하는 대형 뉴클레오티드 서열로부터폐환형으로 방출될 수 있는 구조물 KR20030047880A (ko)

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