DE69635221T2

DE69635221T2 - Pflanzenpromoter und seine Verwendung

Info

Publication number: DE69635221T2
Application number: DE69635221T
Authority: DE
Inventors: Fumiharu Toyonaka-shi Ishige; Nam-Hai Chua; Kenji Takarazuka-shi Oeda
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; Rockefeller University
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; Rockefeller University
Priority date: 1995-07-14
Filing date: 1996-07-12
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2016-07-13
Also published as: JP3761628B2; CA2181204A1; EP0754757B1; CA2181204C; EP0754757A2; JPH09131187A; DE69635221D1; US6187996B1; EP0754757A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Pflanzenpromotor und seine Verwendung.
Für die Expression eines exogenen Strukturgens von Interesse in einer Pflanze oder Pflanzenzellen ist Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotor (nachstehend als „35S-Promotor" bezeichnet), der aus etwa 0,8 kb besteht, verwendet worden, aber die Minimalregion des 35S-Promotors (z.B. –90-Region des 35S-Promotors, die aus 98 Nucleotidbasen (–90 bis +8) besteht, ist auf Grund der niedrigen Transkriptionsaktivität der Region nicht zufriedenstellend für praktische Expression eines Gens von Interesse gewesen (Odell et al., Nature 313: 810–812 (1985), Jensen et al., Nature 321: 669–674 (1986), Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901–3907 (1987), Kay et al., Science 236: 1299–1302 (1987), Sanderset et al., Nucl. Acid. Res. 4: 1543–1558 (1987), usw.), Benfey et al., EMBO J. 8: 2195–2202 (1988).
Im Stand der Technik werden Promotorelemente beschrieben, die, wenn sie mit einem Minimalpromotor kombiniert sind, die Transkription verstärken. Ein Typ solcher Promotorelemente sind G-Box-Motive, die im Allgemeinen das Hexanucleotid CACGTG und einige flankierende Nucleotide enthalten. Zum Beispiel beschriebt WO 94/12015 einige spezifische G-Box-Motive, von denen gezeigt wurde, dass sie hohe Expressionsmengen in Wurzeln, niedrige Expressionsmengen in Blättern und wenig oder keine Expression in Samen vermitteln.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Aufgabe, die effiziente Expression eines exogenen Strukturgens von Interesse in einer Pflanze oder Pflanzenzellen zu ermöglichen. Dieses Problem wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen, die in den Ansprüchen charakterisiert werden, gelöst.
Es ist nämlich gefunden worden, dass eine kompakte spezifische Nucleotidsequenz die Expression eines Gens von Interesse verstärken kann, wenn sie stromaufwärts mit einem Promotor, einschließlich der Minimalregion, wie oben beschrieben, verbunden ist.
Daher betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Promotor, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist und der die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthält.
Zusätzlich zu den spezifischen Nucleotiden, wie in Sequenz ID NR: 1 oder 2 gezeigt, kann der Promotor zusätzliche Nucleotide am 5'- und/oder 3'-Ende der Sequenz einschließen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante DNA-Moleküle, die einen Promotor umfassen, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist und der die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, und gegebenenfalls ein Transkriptionsterminationssignal, das in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, enthält.
Darüber hinaus betrifft vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist und der die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthält, ein Strukturgen von Interesse und einen Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, umfasst.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Plasmid pGbox10, wie in 4 gezeigt, und auf pGbox11, wie in 5 gezeigt.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Pflanzenzelle, die einen Promotor, wie oben beschrieben, umfasst, und ein Strukturgen von Interesse unter der Kontrolle dieses Promotors exprimiert, so wie eine Pflanze, die solche Pflanzenzellen umfasst, und Vermehrungsmaterial von solchen Pflanzen.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression eines Strukturgens von Interesse in Pflanzenzellen, wobei die Expression durch den oben beschriebenen Promotor gesteuert wird, und ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids, wobei das Verfahren das Verbinden des Promotors der vorliegenden Erfindung, eines Strukturgens von Interesse und eines Terminators, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, in dieser Reihenfolge umfasst.
1 zeigt die Konstruktion von Plasmid –90/GUS aus pBI101.
2 zeigt die Konstruktion des Plasmids Gbox10/–90/GUS aus Plasmid –90/GUS.
3 zeigt die Konstruktion des Plasmids Gbox11/–90/GUS aus Plasmid –90/GUS.
4 zeigt die Konstruktion von pGbox10 aus dem Plasmid Gbox10/–90/GUS.
5 zeigt die Konstruktion von pGbox11 aus dem Plasmid Gbox11/–90/GUS.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann effiziente Expression eines Gens von Interesse durch den kompakten Promotor erreicht werden.
Die Gentechnik-Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, folgen Standard-Verfahren, wie in J. Sambrook, E. F., Frisch, T. Maniatis „Molecular Cloning, 2. Aufl.", Verl. Cold Spring Harbor Laboratory (1989), D. M. Glover, „DNA Cloning", Verl. IRL (1985) und anderswo beschrieben.
Zuerst wird eine Beschreibung des Promotors, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist und der die Nucleotidsequenz, wie gezeigt in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2, enthält, gemacht. Der Promotor enthält üblicherweise die Sequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, und er enthält vorzugsweise multiple Kopien, besonders in der Form von Tandemwiederholungen. Der Promotor enthält vorzugsweise vier oder mehr solche Kopien.
Die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, kann entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein.
Synthese der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, kann durch chemische Standard-DNA-Syntheseverfahren erreicht werden.
Der Promotor der vorliegenden Erfindung enthält üblicherweise ein zum Transkriptiosstart notwendiges Minimalelement, das anders ist als die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt.
Das Transkriptionselement betrifft eine Sequenzregion, die für den Transkriptionsstart notwendig ist, wie eine Transkriptionsstartstelle allein, eine Transkriptionsstartstelle und eine TATA-Sequenz, eine Transkriptionsstartstelle und CAAT-Sequenz, alternativ eine Transkriptionsstartstelle und TATA-Sequenz und CAAT-Sequenz, usw.
Ein typisches Beispiel einer solchen Sequenzregion schließt eine Sequenz ein, in der das 5'-Ende einer Nucleotidsequenz entspricht, die mindestens etwa 30 Nucleotide stromaufwärts der Transkriptonsstartstelle lokalisiert ist und in der die 3'-End-Sequenz der Region von der Transkriptionsstartstelle bis zur Translationsstartstelle entspricht. Die Transkriptionsaktivität einer solchen Basenregion ist im Allgemeinen niedrig.
Spezifische Beispiele solcher Regionen schließen die 98-Nucleotidbasenregion des 35S-Promotors ein, die die Transkriptionsstartstelle (+8 bis –90) (nachstehend als die „–90-Region" bezeichnet), die –204 bis +8-Region des Tomatengens, das die kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase-Oxidase (rbcS-3A) codiert (Plant Cell, 1: 217–227 (1989)), die –287 bis +29-Region des PR1a-Genpromotors (Plant Cell 2: 357–366 (1990)) und die –195 bis +32-Region des Kartoffel-Proteaseinhibitorgens (PI-II) (Plant Cell 2: 61–70 (1990)) einschließt. Die oben beschriebenen Regionen, die ein zum Transkriptionsstart notwendiges Minimalelement enthalten, werden gewöhnlich durch deren Insertion stromabwärts der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, genutzt.
Die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, und die Sequenz, die ein Minimalelement zum Transkriptionsstart enthält, kann durch Restriktionsenzymverdau von genomischer DNA, deren Sequenz bekannt ist, oder durch Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifikation einer Region einer DNA-Nucleotidsequenz, die Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 oder die Sequenz, die ein Minimalelement zum Transkriptionsstart enthält, unter Verwendung genomischer DNA als eine Matrize und geeigneter Oligonucleotide als Primer oder durch chemische DNA-Synthese hergestellt werden.
Wenn die –90-Region des 35S-Promotors genutzt wird, kann der Promotor der vorliegenden Erfindung durch Synthese und Aneinanderlagerung von Oligonucleotiden, die den +Strang (siehe Sequenz ID NR: 4) und den –Strang (siehe Sequenz ID NR: 5) der –90-Region darstellen, konstruiert werden.
In Bezug auf den 35S-Promotor, kann ein Deletionspromotor, der kürzer ist als die –90-Region, erhalten werden, und er wird gewöhnlich durch Verdau mit Restriktionsenzymen, durch PCR-Amplifikation unter Verwendung genomischer DNA als eine Matrize und Oligonucleotidprimern, die Sequenzen aufweisen, die geeignet sind, um die Deletionspromotor-Region zu amplifizieren, oder durch chemische DNA-Syntheseverfahren konstruiert.
Der Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist und der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, schließt zum Beispiel von Pflanzen stammende Terminatoren wie den Terminator des von T-DNA stammenden Nopalin-Synthasegens (NOS) oder von Viren abstammende Terminatoren, die gewöhnlich in Pflanzen-Gentechnikverfahren verwendet werden, wie die Terminatoren der Knoblauchvirus-GV1- und -GV2-Gene ein.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus rekombinante DNA-Moleküle, die einen Promotor gemäß der Erfindung umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst solch ein rekombinantes DNA-Molekül darüber hinaus einen Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist. Stärker bevorzugt umfasst das rekombinante DNA-Molekül ein Strukturgen, das funktionell mit dem Promotor gemäß der Erfindung verbunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das rekombinante DNA-Molekül ein Vektor, nämlich ein Plasmid.
Das rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise so konstruiert, dass es mindestens eine Clonierungsstelle stromaufwärts des Terminators und stromabwärts des Promotors enthält, um das erwünschte Strukturgen zu beherbergen. Stärker bevorzugt ist das rekombinante DNA-Molekül so konstruiert, dass es multiple Clonierungsstellen enthält. Der Ausdruck „Clonierungsstelle" betrifft hier eine DNA-Region, die durch Restriktionsenzyme, die gewöhnlich in Gentechnikverfahren genutzt werden, erkannt und verdaut werden kann.
Ein Beispiel eines solchen rekombinanten DNA-Moleküls, das Clonierungsstellen enthält, ist das Plasmid pGbox10, wie in 4 gezeigt, oder das Plasmid pGbox11, wie in 5 gezeigt.
Beispiele von nützlichen Strukturgenen, die unter der Kontrolle des Promotors gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert werden können, sind Pflanzenabwehrgene wie das Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen (PAL), das Chalcon-Synthetasegen (CHS), das Chitinasegen (CHT), das Lysozymgen, das PR-Proteingen, usw., Krankheitsresistenzgene wie Pto und Gene, die die Widerstandskraft gegen Bakterien, Pilze, Viren und Insekten in allen Pflanzengeweben erhöhen, wie das Viruskapselproteingen, BT (Bacillus thuringiensis)-Toxinproteingen, usw.
Andere nützliche Gene schließen jene ein, die den Proteingehalt von Futtergetreide erhöhen, wie Gene, die Speicherproteine codieren, das Sojabohnen-Glyciningen und das β-Conglyciningen, usw., Gene, die den Methionin- und Lysingehalt von Futtergetreide erhöhen, wie das Paranuss-2S-Albumingen, die 10 kDa- oder 15 kDa-Proteingene von Mais und Reis, usw. und Gene, die den Biotingehalt von Futtergetreide erhöhen- wie die Bakteriengene von Escherichia coli, usw., die die bioA-, bioB-, bioC-, bioD-, bioF- und bioH-Enzyme, die in die Synthese von Biotin involviert sind, codieren.
Andere nützliche Gene schließen jene ein, die die Qualität von Lipiden durch Liefern von Stabilität gegen Oxidierung, Senken des Phospholipidgehalts und Steigern des Ölsäure- und Linolsäuregehalts erhöhen, wie die Stearosly-ACP-Desaturase-, Acyl-ACP-Thioesterase- und 3-Phosphat-Acyltransferasegene, Gene, die die Widerstandskraft gegen niedrige Temperaturen durch Erhöhen des Gehalts an ungesättigten Fettsäuren erhöhen, wie das Acetyltransferasegen und Gene, die die Herstellung von Herbizid-resistenten Feldfrüchten ermöglichen, wie durch die Expression des Gens, das L-Phosphinothricin-Acetyltransferase, 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimatsynthase codiert, oder andere Gene, die sich auf Herbizidresistenz beziehen.
Das Strukturgen im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann auch ein DNA-Abschnitt. sein, der eine Anti-sense-RNA zu einem Gen codiert, das in einer Pflanzenzelle exprimiert wird. Darüber hinaus kann das Strukturgen ein DNA-Abschnitt sein, der ein Ribozym codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus Wirtszellen, die einen Promotor gemäß der Erfindung oder ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß der Erfindung umfassen, so wie Wirtszellen, die mit solchen Promotoren oder Molekülen transformiert worden sind. Diese Wirtszellen können prokaryontischen, nämlich bakteriellen, oder eukaryontischen Ursprungs sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch Pflanzenzellen, die einen Promotor gemäß der Erfindung umfassen oder ein Strukturgen unter der Kontrolle eines solchen Promotors exprimieren. Der Promotor oder das rekombinante DNA-Molekül gemäß der Erfindung ist vorzugsweise stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen, die Pflanzenzellen gemäß der Erfindung umfassen. Solche Pflanzen können zum Beispiel durch Regeneration der Pflanzenzellen gemäß der Erfindung produziert werden.
Nachdem die Pflanzen der vorliegenden Erfindung gezüchtet wurden, können die ganzen Pflanzen oder Teile der Pflanzen geerntet und verkauft werden. Teile der Pflanzen, besonders Teile, die Expressionsprodukte des Strukturgens von Interesse enthalten, können von den Pflanzen durch konventionelle Verfahren getrennt, extrahiert und/oder konzentriert werden. Gleichermaßen können Pflanzenzellen geerntet oder als ein kommerzielles Produkt an sich (wie eine Nahrungsmittelquelle oder Nahrungszusätze) verkauft werden, und/oder Teile der Pflanzenzellen, im besonderen Teile, die Expressionsprodukte der Strukturgene von Interesse enthalten, können von den Pflanzenzellen durch konventionelle Verfahren getrennt, extrahiert und/oder konzentriert werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Vermehrungsmaterial von Pflanzen gemäß der Erfindung, die Pflanzenzellen gemäß der Erfindung umfasst. Beispiele für Vermehrungsmaterial sind Samen, Keimlinge, Früchte, Knollen, Stecklinge, usw.
Der Vektor der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel durch das folgende Verfahren konstruiert werden. Der Promotor, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist und der die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthält, wird in die Multiclonierungsstelle des Vektors inseriert, der den Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, wie pBI101 (Clontech Inc.; Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901–3907 (1987)) enthält.
Darüber hinaus kann ein exogenes Markergen wie β-Glucuronidase ggl. ausgeschnitten und durch ein erwünschtes Strukturgen ersetzt werden. Ein anderes mögliches Verfahren ist, einen binären Vektor wie pBIN19 (Nuc. Acid. Res. 12: 8711–8721 (1984)) zu verwenden, und den Promotor, nach Bedarf das erwünschte Strukturgen und den Terminator, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, in dieser räumlichen Anordnung in die Multiclonierungsstelle zu inserieren.
Für die Verfahren zum Einbringen des Plasmids in Pflanzenzellen gibt es konventionelle Verfahren wie das Agrobacterium-Infektionsverfahren (d.h. Infektion von Pflanzengewebe mit dem Erdbakterium Agrobacterium), elektrisch-basierende Einbringungsverfahren (elektrisch-basierendes Verfahren zum Einbringen in Protoplasten: Elektroporation) oder direktes Einbringen durch eine Partikelpistole (direktes Einbringen in Pflanzengewebe oder gezüchtete Zellen: Partikelpistolen-Verfahren). Pflanzenzellen, die das Plasmid der vorliegenden Erfindung beherbergen, können durch konventionelle Pflanzengewebe-Zuchtverfahren, wie zum Beispiel in S. B. Gelvin, R. A. Schilperoot und D. P. S. Verma, Plant Molecular Biology/Manual, Kluwer Academic Publishers Press, 1988 beschrieben, erhalten werden, und in der Folge können Pflanzen oder deren Teile, die von diesen Pflanzenzellen abstammen, durch Regenerierung gemäß den darin beschriebenen Protokollen erhalten werden.
Darüber hinaus kann das hierin beschriebene Verfahren für die Pflanzenarten angewendet werden, die Monokotyledone wie Reis, Mais, Gerste, Weizen und Zwiebel, Dikotyledone wie die Mitglieder der Leguminosae, d.h. Sojabohnen, Erbsen, Bohnen, Alfalfa, Mitglieder der Solanaceae wie Tabak, Tomate und Kartoffel, Mitglieder der Cruciferae wie Kraut, Raps, Senfpflanze, Mitglieder der Cucurbitaceae (Kürbisfamilie) wie Melone, Kürbis, Gurken, Mitglieder der Ammiaceae wie Karotte und Sellerie und Mitglieder der Compositae wie Salat enthalten.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines Promotors gemäß der Erfindung für die Expression eines Strukturgens in Pflanzenzellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Pflanzenzellen (transformierte Pflanzenzellen) und Pflanzen (transformierte Pflanzen), die ein Strukturgen von Interesse exprimieren, effizient durch die Verwendung des kompakten Promotors oder Plasmids der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele ausführlicher veranschaulicht.
Beispiel 1 – Konstruktion der GUS-Expressionsplasmide Gbox10/–90/GUS, Gbox11/–90/GUS und –90/GUS
Das Plasmid –90/GUS wurde durch Insertion der –90-Region, hergestellt durch chemische DNA-Synthese, in die Multiclonierungsstelle stromaufwärts des GUS-Gens, enthalten im kommerziell erhältlichen Plasmid pBI101 (Clontech Inc.; Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901–3907 (1987)), das auch einen Terminator enthält, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, konstruiert. Das Plasmid Gbox10/–90/GUS und Plasmid Gbox11/–90/GUS wurden weiter durch Insertion eines Multimers, enthaltend 4 Tandemwiederholungen der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 beziehungsweise NR: 2 gezeigt, stromaufwärts der –90-Region von –90/GUS konstruiert. Das Verfahren der Konstruktion ist unten im Detail erklärt (vgl. 1, 2 und 3).
Schritt 1: Synthese und Aufreinigung von komplementären Oligonucleotiden, enthaltend 4 Tandemwiederholungen von G-box10 oder G-box11, und komplementären Oligonucleotiden, enthaltend die –90-Region
Zwei komplementäre Oligonucleotide (+Strang und –Strang, jedes 46 Basen, vgl. Sequenz ID NR: 6, 7, 8 und 9), die ein Multimer, bestehend aus Tandemwiederholungen der Oligonucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthalten und eine HindIII-Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine XbaI-Stelle am 3'-Ende haben, wenn sie aneinandergelagert sind, wurden chemisch synthetisiert.
Darüber hinaus wurden zwei komplementäre Oligonucleotide (+Strang und –Strang, jedes 102 Basen, vgl. Sequenz ID NR: 4 und 5), enthaltend die –90-Region, die die zum Transkriptionsstart notwendigen Minimalelemente und BamHI-Restriktionsstellen an beiden Enden einschließt, wenn sie aneinandergelagert sind, chemisch synthetisiert.
Von diesen chemisch synthetisierten Oligonucleotiden wurden mit Ammoniak-Behandlung (55°C, 5 h) die Schutzgruppen entfernt, und in der Folge wurden sie durch Umkehrphasen-HPLC (YMC GEL ODS S-5) aufgereinigt. Das zur Aufreinigung verwendete Lösungsmittel war 0,1 M Triethylamin (TEAA), und die Oligonucleotide wurden unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten von 5–100% Methylcyanid (CH₃CN) extrahiert. Die extrahierten Oligonucleotide wurden gewonnen, der Rest getrocknet, in 80% Essigsäure (3 ml) für 20 min wieder gelöst und in der Folge wieder getrocknet. Der getrocknete Rest wurde in destilliertem Wasser (3 ml) wieder gelöst und wieder getrocknet, und diese Vorgehensweise wurde insgesamt dreimal wiederholt, bevor die Probe schließlich in 100 μl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst wurde. Die so erhaltene Oligonucleotidprobe wurde durch Elektrophorese mit einem 5% Polyacrylamidgel (80 V, 1 h) weiter aufgereinigt.
Das Paar der komplementären Oligonucleotide, enthaltend das Multimer, das aus 4 Tandemwiederholungen der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt (jede 42 Basenpaare), besteht, so wie das Paar der komplementären Oligonucleotide, enthaltend die –90-Region (jedes 102 Basenpaare), wurden aus dem Polyacrylamidgel extrahiert und durch elektrophoretischen Transfer (180 V, 40 min) aus dem Gel in Dialyseschläuche (SPECTRA/POR, molecularporöser Membranschlauch MG 3500) gewonnen.
Schritt 2: Aneinanderlagerung der komplementären Stränge
0,5 μg eines Paars von komplementären Oligonucleotiden, die das Multimer, bestehend aus 4 Tandemwiederholungen der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthalten, und ein Paar von komplementären Oligonucleotiden, die die –90-Region (102 Basen) enthalten, wurden für 3 min in 10 μl wässriger Lösung auf 100°C erhitzt, in ein 65°C Wasserbad überführt, langsam auf Raumtemperatur abkühlen lassen und schließlich schnell in Eiswasser gekühlt. Durch dieses Verfahren wurden ein DNA-Fragment, das ein Multimer, bestehend aus 4 Tandemwiederholungen der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthält, und ein DNA-Fragment, das die –90-Region (102 Basen) enthält, hergestellt.
Schritt 3: Konstruktion des –90/GUS-Plasmids
2 μg pBI101 wurden mit 10 Einheiten BamHI verdaut, und 0,1 μg der –90-Region (102 Basen), hergestellt in Schritt 2, und 0,5 μg des BamHI-verdauten pBI101 wurden gemischt und unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (DNA-Ligierungskit, Takara Shuzo Ltd.) ligiert. Dieses Gemisch wurde verwendet, um den E. coli-Stamm HB101 (Takara Shuzo Ltd) gemäß dem Protokoll von Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110–2114 (1972)) zu transformieren. Von den resistenten Kolonien, die auf LB-Agar Platten, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet wurden, wurden Plasmid-DNAs durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und deren Strukturen wurden durch Restriktionsenzymverdau analysiert. Isolierte Plasmide, die nach dem Verdau mit SmaI und XbaI ein etwa 100 bp-DNA-Fragment erbrachten, wurden selektiert. Die Sequenzen der in diese selektierten Plasmide inserierten DNA wurden durch das Didesoxy-Verfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977)) bestimmt, und Clone, in die die –90-Region in der richtigen Orientierung inseriert worden ist, wurden ausgewählt, wobei die richtige Orientierung die gleiche Orientierung der –90-Region, wie sie im 35S-Promotor gefunden wird, bedeutet. Auf diese Weise wurde das –90/GUS-Plasmid konstruiert (siehe 1).
Schritt 4: Konstruktion des Gbox10/–90/GUS-Plasmids und des Gbox11/–90/GUS-Plasmids
2 μg des –90/GUS-Plasmids, das in Schritt 3 hergestellt wurde, wurden mit 10 Einheiten XbaI und HindIII (37°C, 2 h) verdaut, und die Verdauungsprodukte wurden durch Elektrophorese in 0,8% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (80 V, 1,5 h) fraktioniert.
Das HindIII-XbaI-Fragment wurde unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchens mit einem DNA-Auffangfilter (Takara Shuzo Ltd.) gewonnen und aufgereinigt.
0,1 μg des DNA-Fragments, das in Schritt 2 hergestellt wurde, enthaltend ein Multimer, bestehend aus 4 Tandemwiederholungen der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 beziehungsweise NR: 2 gezeigt, und 0,5 μg des HindIII-XbaI-verdauten –90/GUS-Plasmids wurden gemischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (DNA-Ligierungskit, Takara, Shuzo Ltd.) ligiert. Dieses Gemisch wurde verwendet, um den E. coli-Stamm HB101 (Takara Shuzo Ltd.) gemäß dem Protokoll von Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110–2114 (1972)) zu transformieren.
Von den resistenten Kolonien, die auf LB-Agar-Platten, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet wurden, wurden Plasmid-DNAs durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und deren Strukturen wurden durch Restriktionsenzymverdau analysiert. Isolierte Plasmide, die nach dem Verdau mit HindIII und XbaI etwa 50 bp-DNA-Fragmente erbrachten, wurden selektiert. Die Strukturen der Plasmide wurden durch das Didesoxy-Verfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977)) bestätigt, und die Sequenzen der DNA-Insertionen wurden bestimmt. Auf diese Weise wurden das Gbox10/–90/GUS-Plasmid beziehungsweise das Gbox11/–90/GUS-Plasmid konstruiert (siehe 2 und 3).
Beispiel 2 – Konstruktion von pGbox10 und pGbox11
2 μg von Plasmid Gbox10/–90/GUS beziehungsweise Plasmid Gbox11/–90/GUS wurden mit je 10 Einheiten SmaI verdaut (37°C, 2 h). 0,1 μg des Verdauungsprodukts wurden mit 0,05 μg des kommerziell erhältlichen SacI-Linkers (5'-CGAGCTCG-3') (Takara Shuzo Ltd.) gemischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (DNA-Ligierungskit, Takara Shuzo Ltd.) ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden in der Folge mit 10 Einheiten SacI verdaut, mit T4-DNA-Ligase (DNA-Ligierungskit (Takara Shuzo)) wieder ligiert und verwendet, um den E. coli-Stamm HB101 (Takara Shuzo) gemäß dem Verfahren von Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110–2114 (1972)) zu transformieren. Von den resistenten Kolonien, die auf LB-Agar Platten, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet wurden, wurden Plasmid-DNAs durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und deren Strukturen wurden durch Restriktionsenzymverdau analysiert. Isolierte Plasmide wurden SmaI- und SacI-Verdau unterzogen und einzelne lineare DNA-Fragmente wurden selektiert. Auf diese Weise wurden das Plasmid pGbox10 beziehungsweise Plasmid pGbox11 konstruiert (siehe auch 4 und 5).
Beispiel 3 – Herstellung von Plasmid-DNA zur Gen-Einbringung
Die Plasmide Gbox10/–90/GUS, Gbox11/–90/GUS bzw. –90/GUS, hergestellt in Beispiel 1, wurden weiter durch das Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren aufgereinigt. Diese DNA-Plasmide wurden durch Zufügen von 1 g Cäsiumchlorid und 80 μl von 10 mg/ml Ethidiumbromid pro 1 ml DNA-Lösung aufgereinigt. Versiegeln der resultierenden Lösung in Zentrifugationsröhrchen (Quick-Seal, Beckman Co.) und Aussetzen der Lösung einer Zentrifugation in einem NVT65-Rotor bei 60 000 VpM für 24 h erbrachte das aufgereinigte Plasmid.
Beispiel 4 – Erzeugung einer transformierten Tabakpflanze durch ein indirektes Einbringungsverfahren
Jedes in Beispiel 3 beschriebene aufgereinigte Plasmid wurde durch Hitzebehandlung (37°C, 5 min) in Agrobakterium (Agrobacterium tumefaciens LBA4404; Streptomycin-resistent, Rifampicin-resistent; Hoekma et al., Nature 303: 179–180 (1983)), mit 20 mM CaCl₂ behandelt, um es kompetent zu machen, eingebracht. Transformanten wurden durch Ausnutzen der Kanamycin-Resistenz, die durch das Plasmid NPTII-Gen verliehen wurde (Trien-Cout et al., Gene 23: 331–341 (1983)), erhalten und auf L-Agar-Platten, enthaltend 300 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Rifampicin und 100 μg/ml Kanamycin, selektiert.
Die auf diese Weise erhaltenen Agrobakterium-Transformanten wurden bei 20°C für einen Tag in L-Brühenmedium, enthaltend 300 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Rifampicin und 100 μg/ml Kanamycin, gezüchtet, und diese Bakteriensuspension wurde dann verwendet, um eine Scheibe einer Tabakpflanze gemäß dem Standardprotokoll, beschrieben in S. B. Gelvin, R. A. Schilperoort und D. P. S. Verma, Plant Molecular Biology Manual, Verl. Kluwer Academic Publishers, 1988, zu infizieren.
Die infizierten Tabakblattscheiben (SR-1) wurden für 4 Tage in MS-NB-Agarmedium gezüchtet und dann in MS-NB-Agarmedium, enthaltend 500 μg/ml Cefotaxim, überführt, um die Agrobakterien zu töten. 11 Tage später wurden die Blattscheiben in MS-NB-Agarmedium, enthaltend 500 μg/ml Cefotaxim und 100 μg/ml Kanamycin, überführt, auf diese Weise wurde die Selektion von transformierten Pflanzen begonnen. Ungefähr 4 Wochen später wurden junge Pflanzen, bei denen sich grüne Stämme und Blätter entwickelt hatten, von der Blattscheibe abgetrennt und weiter in MS-Agarmedium, enthaltend 500 μg/ml Cefotaxim und 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet, wonach junge Pflanzen, die Wurzeln erbrachten, selektiert wurden. Die selektierten jungen Pflanzen wurden in Erde überführt und in einem Glashaus gezüchtet, um transformierte Pflanzen zu produzieren.
Beispiel 5 – Erzeugung von transformierter Karotte durch indirektes Einbringen
G-box10/–90/GUS, aufgereinigt in Beispiel 3, wurde in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 gemäß dem Verfahren, wie in Beispiel 4 beschrieben, eingebracht, und das erhaltene Agrobakterium wurde verwendet, um Hypocotyl einer Karottenart, Nantes Scarlet, zu infizieren.
Das infizierte Karotten-Hypocotyl wurde auf LS-D-Agarmedium, enthaltend 500 μg/ml Cefotaxim, platziert. Selektion der transformierten Pflanze wurde nach 10 Tagen durch Platzieren der Pflanze auf LS-D-Agarmedium, enthaltend 100 μg/ml Cefotaxim und 50 μg/ml Kanamycin, begonnen. Der nach einem Monat erzeugte Kallus wurde wiederholt alle vier Wochen in ein LS-D-Agarmedium, enthaltend 100 μg/ml Cefotaxim und 50 μg/ml Kanamycin, überfährt. Der nach 2 Monaten selektierte Kallus wurde in LS-Agarmedium überführt, und eine ganze Pflanze wurde aus einem zufälligen Embryo regeneriert.
Beispiel 6 – Produktion einer transformierten Pflanze durch direktes Einbringen
G-box10/–90/GUS, aufgereinigt, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde in unreifen Embryo von Reis, Notohikari, mit einer Partikelpistole (Reebock Company) gemäß einem Verfahren eingebracht, das beschrieben ist in Shimada, T., et al., BulI.RIAR, Ishikawa Agr. Coll. 4: 1-8(1995) oder Ko Shimamoto und Kiyotaka Okada, Experimental Protocol of model plant, Rice and Arabidopsis Syujyun-sya, 1996 (ISBN4-B7962-157-9 C3345). Nachdem sterilisierte Samen für 7 bis 10 Tage in LS-D2-Medium gezüchtet worden waren, wurde der Embryo entnommen und in LS-D2-Agarmedium mit seinem Scutellum-Organ nach oben platziert. Mit je 10 μg von Gbox10/–90/GUS, –90/GUS oder pBI121(35S/GUS) als eine Kontrolle und pDM302, enthaltend eine äquimolare Menge des Bialaphos-Resistenzgens (J. Cao et al., Plant Cell Rep. 11: 586–591, 1992) wurden 3 mg eines Goldpartikels beschichtet (durchschnittlicher Durchmesser 1 μm). Zwei Schüsse wurden in Reisembryonen injiziert, wobei jeder Schuss 0,2 mg Goldpartikel (1 μg DNA, Injektionsdruck 150–200 kg/cm² bei 70 mmHg) enthielt. Zwei Tage nach dem Einbringen wurden die resultierenden Embryonen auf LS-D2-Agarmedium, enthaltend 4 mg/ml Bialaphos, überführt, um Herbizid-resistente Zellen zu selektieren. Der so erhaltene Herbizid-resistente Kallus wurde in Kulturmedium zu Redifferenzierung übertragen, und regenerierte, zufällige Embryonen oder kleine Pflanzen wurden auf LS-Agarmedium, enthaltend 4 mg/ml Bialaphos, überführt, um die Herbizid-resistenten Pflanzen zu züchten.
Beispiel 7 – Bestätigung der Insertion des eingebrachten Gens in transformierten Pflanzen
1. Herstellung von genomischer DNA aus transformierten Pflanzen
Genomische DNA wurde aus transformierten Pflanzen gemäß dem CTAB-Verfahren, beschrieben in Hirofumi Utiyama, Plant Gene Engineering Manual for Producing Transgenic Plants, Kodansha Scientific; Seiten 71–74, ISBN4-06-153513-7 c3045, isoliert.
Eine Tabakblattscheibe (ungefähr 0,5 g) von jeder transformierten Pflanze, erhalten in den Beispielen 4, 5 und 6, wurde unter Verwendung eines Homogenisators in einem Eppendorf-Röhrchen pulverisiert, in das in der Folge 0,5 ml auf 65°C vorgewärmtes 2 × CTAB (2% Acetyltrimethylammoniumbromid, 1% Polyvinylpyrrolidon (PVP)) zugefügt wurde, und dieses Gemisch wurde bei 65°C für 5 min inkubiert. 0,5 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) wurden dann zugefügt, und die Probe wurde sanft für 5 min gemischt. Die Probe wurde durch Zentrifugation bei 12 000 VpM (10 000 × g) für 10 min aufgetrennt, 0,5 ml Isopropylalkohol wurden zu der oberen Phase zugefügt, und die Probe wurde gemischt. Nach Zentrifugation bei 12 000 VpM (10 000 × g) für 15 min wurde das erhaltene Präzipitat in 200 μl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst. RNase wurde zugefügt, um eine Endkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten, und die Probe wurde für 30 min bei 37°C inkubiert, um RNAs zu degradieren. Nach der RNase-Behandlung wurde eine Gemisch von äquilibriertem Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) zugefügt, die Probe gründlich gemischt, und die obere Phase wurde gewonnen. 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumina Ethanol wurden zugefügt, die Probe wurde gründlich gemischt, und ungefähr 5 μg genomische DNA wurden durch Zentrifugation bei 12 000 VpM (10 000 × g) für 5 min erhalten.
2. Bestätigung der Geneinbringung durch das PCR-Verfahren
Unter Verwendung von 50 μg der oben erhaltenen genomischen DNA als eine Matritze und synthetischer DNA mit den Nucleotidsequenzen, wie in Sequenz ID NR: 10 und 11 gezeigt, als Primer wurde die Promotorregion unter Verwendung des PCR-Verfahrens amplifiziert (30 Reaktionszyklen von 94°C für 1 min, 55°C für 2 min und 72°C für 3 min). Das erhaltene PCR-Produkt wurde durch Elektrophorese in 12% Polyacrylamidgel (PAGE) (80 V, 1 h) analysiert. Durch dieses Verfahren wurde ein DNA-Fragment entsprechend der Promotorregion (ungefähr 250 bp für Gbox10/–90/GUS und Gbox11/–90/GUS oder 290 bp für –90/GUS) mit der erwarteten Größe erhalten.
Beispiel 8 – Selbstbefruchtung und Entwicklung einer genetisch homologen Linie einer transformierten Pflanze
Die in Beispiel 4 erzeugte transformierte junge Pflanze wurde in Erde überführt und gezüchtet, um eine transformierte Pflanze hervorzubringen. Zur Zeit der Anthese (Blütezeit) wurden die Pflanzen selbst-bestäubt, und Samen wurden von den reifen Blüten erhalten. Die Samen wurden für 5 min in 1% Natriumhypochlorit sterilisiert, wonach sie auf MS-Agramedium, enthaltend 100 μg/ml Kanamycin, ausgesät wurden. Clone, von denen alle Samen keimten und sich nach der Aussaat entwickelten, wurden selektiert.
Beispiel 9 – GUS-Genexpression in transformierten Tabakpflanzengeweben
GUS-Färbung der Samen, Blätter und Wurzeln der in Beispiel 8 erhaltenen transformierten Tabakpflanze (enthaltend das Plasmid Gbox10/–90/GUS oder Gbox11/–90/GUS oder das Plasmid –90/GUS oder pBI121 als eine Kontrolle) wurde gemäß den Verfahren durchgeführt, die beschrieben sind in Hirofumi Uchiyama, Plant Gene Engineering Manual for Producing Transgenic Plant, Kodansha Scientific; Seiten 68–70, 1990, ISBN4-06-153513-7 c3045 und Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387–405 (1987). Samen der entsprechenden transformierten Tabakpflanzen wurden in 1% Natriumhypochlorit sterilisiert und auf MS-Agarmedium, enthaltend 100 μg/ml Kanamycin, überfährt, und es wurde zugelassen, dass sie für ungefähr zwei Wochen Keimlinge entwickelten.
Aktivitätsfärbung wurde unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indol-β-D-glucoronsäure (X-Gluc) als ein Substrat und Messen der Menge des präzipitierten blauen Pigments (Indigotin) durchgeführt.
Färbung: Samen von 40 Individuen jeder Pflanzenprobe (transformierte Tabakpflanzen, enthaltend das Plasmid Gbox10/–90/GUS, Gbox11/–90/GUS, –90/GUS oder pBI121 zum Vergleich, oder eine unbehandelte Tabaksorte, SR-1, als eine Kontrolle) wurden mit einem Skalpell geschnitten und über Nacht bei 37°C in GUS-Färbelösung (1 mM X-Gluc, 0,5 mM K₃[Fe(CN)₆], 0,5 mM K₃[Fe(CN)₆], 0,3% Triton X-100) eingetaucht. Pflanzengewebe wurden dann in Ethanol überführt, durch einige Waschgänge in Ethanol entfärbt, und die Menge des restlichen blauen Pigmentpräzipitats wurde gemessen. Die Ergebnisse des GUS-Färbetests von Samen, jungen Blättern und Wurzeln von transformierten Pflanzen, enthaltend das Plasmid der vorliegenden Erfindung, Gbox10/–90/GUS, Gbox11/–90/GUS, –90/GUS oder pBI121 zum Vergleich, oder von der unbehandelten Tabaksorte SR-1 als eine Kontrolle sind in Tabellen 1–3 gezeigt. Tabelle 1 GUS-Färbung in Samen

A:: der gesamte Samen ist dunkel gefärbt
B:: ein Areal dunkler Färbung erscheint rund um die Basis (Primordium) der Wurzel im Samen
C:: Die Basis der Wurzel im Samen ist gefärbt
Ohne:: keine Färbung

In der nicht-transformierten (unbehandelten) Tabaksorte SR-1 wies keines der Gewebe Färbung auf. In mit –90/GUS-Plasmid transformierten Pflanzen, enthaltend die zum Transkriptionsstart notwendigen Minimalelemente des 35S-Promotors, wurde helle Färbung in der Basis (Primordium) der Wurzel gesehen. In mit dem Plasmid der vorliegenden Erfindung Gbox10/–90/GUS und Gbox11/–90/GUS transformierten Pflanzen zeigten nahezu alle Proben dunkle Färbung in den Samen, Blättern und Wurzeln. Besonders starke und einheitliche Färbung wurde in der Pflanze beobachtet, die Gbox10/–90/GUS ausgesetzt wurde.
Beispiel 10 – GUS-Genexpression in transformierter Karotte
GUS-Färbung wurde mit Blättern der transformierten Karottenpflanze (enthaltend das Plasmid der vorliegenden Erfindung, Gbox10/–90/GUS, und pBI121 als eine Kontrolle) durchgeführt, in denen das Vorhandensein des eingebrachten Gens in Beispiel 7 gemäß dem Verfahren, wie in Beispiel 9 beschrieben, bestätigt wurde. Es wurde keine Färbung für die Blätter von unbehandelter, untransformierter Karotte beobachtet. Starke Färbung wurde für die Blätter der meisten der Test-Proben der Pflanze, die mit dem Plasmid der vorliegenden Erfindung, Gbox10/–90/GUS, transformiert wurde, beobachtet.
Beispiel 11 – GUS-Genexpression in transformiertem Reis
Expression von GUS-Gen in den Blättern der kleinen transformierten Reispflanze (Höhe: 10 cm), hergestellt in Beispiel 6, oder des Gens, das in Beispiel 7 bestätigt wurde, wurde gemäß dem GUS-Färbeverfahren, wie in Beispiel 9 beschrieben, untersucht. Während in den Blättern von unbehandeltem, untransformiertem Reis wenig Färbung beobachtet wurde, wurde starke GUS-Aktivität in den Blättern der Pflanze, die mit Gbox10/–90/GUS transformiert wurde, beobachtet.
Die DNA-Länge der Genkassette, umfassend einen Promotor, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, ein Strukturgen von Interesse und einen Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, enthalten in den vorliegenden Plasmiden Gbox10/–90/GUS und Gbox11/–90/GUS, ist 2 300 bp (140 bp für den Promotor), während jene von pBI121(35S/GUS) 2 960 bp ist (800 bp für den Promotor), und die Genkassette, die eingebracht werden soll, wurde etwa 22% kürzer (83% für den Promotor).
Die Zusammensetzung der Medien, die in den Beispielen verwendet wurden, ist unten beschrieben.
1. MS-Agarmedium
34,7 g MURASHIGE AND SKOOG (Flow Laboratories) werden in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 M KOH auf pH 5,8 eingestellt. 8 g Agar werden zugefügt, und das Gemisch wird durch Autoklavieren sterilisiert.
2. MS-NB-Agarmedium
0,1 mg/ml 1-Naphtalin-Essigsäure (NAA) und 0,1 mg/ml 6-Benzylaminopterin (BA) werden zu MS-Agarmedium hinzugefügt.
3. LS-Medium
34,7 g MARUSHIGE AND SKOOG (Flow Laboratories) und 30 g Saccharose wurden in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst, und der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde durch 1 M KOH auf pH 5,8 eingestellt, und das Gemisch wurde durch Autoklavieren sterilisiert.
4. L-Agarmedium
Medium, erhalten durch Zugabe von 8 g/l Agar zu LS-Medium.
5. LS-D-Agarmedium
Medium, erhalten durch Zugabe von 1,0 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure zu LS-Agarmedium.
6. LS-D2-Agarmedium
Medium, erhalten durch Zugabe von 2,0 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure zu LS-Agarmedium.
7. L-Brühe-Medium
10 g Bacto-Trypton (Difco), 5 g Bacto-Hefeextrakt (Difco) und 10 g NaCl werden in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert wird mit 5 M NaOH auf 7,0 eingestellt, und das Medium wird durch Autoklavieren sterilisiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann effiziente Expression eines Gens von Interesse erreicht werden.
SEQUENZPROTOKOLL
Sequenzprotokoll

Claims

Rekombinanter Promotor, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, wobei der Promotor umfasst: ein Enhancer-Element umfassend die Nucleotidsequenz wie dargestellt in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2.
Promotor nach Anspruch 1, der eine Vielzahl der in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 dargestellten Nucleotidsequenzen enthält.
Promotor nach Anspruch 2, der ein Multimer enthält, das mindestens vier Tandemwiederholungen der in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 dargestellten Nucleotidsequenz umfasst.
Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor eine Region umfasst, die ein zum Transkriptionsstart notwendiges Minimalelement stromabwärts einer Region enthält, die die Nucleotidsequenz wie dargestellt in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 enthält.
Promotor nach Anspruch 4, wobei das zum Transkriptionsstart notwendige Minimalelement einen Transkriptionsstartort und eine TATA-Sequenz enthält.
Promotor nach Anspruch 4 oder 5, wobei das zum Transkriptionsstart notwendige Minimalelement die in SEQ ID NR: 3 dargestellte Nucleotidsequenz ist.
Rekombinantes DNA-Molekül umfassend den Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 7, welches darüber hinaus ein Transkriptionsterminationssignal stromabwärts von diesem Promotor umfasst, welches in Pflanzenzellen funktionsfähig ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 7 oder 8, welches darüber hinaus ein Strukturgen umfasst, welches funktionell mit dem Promotor verknüpft ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 7 bis 9, welches ein Vektor ist.
Vektor nach Anspruch 10, der ein Plasmid ist.
Plasmid nach Anspruch 11, welches das Plasmid pGbox10 wie dargestellt in 4 oder Plasmid pGbox11 wie dargestellt in 5 ist.
Wirtszelle, umfassend oder transformiert mit einem Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 7 oder 9 oder einem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 12.
Wirtszelle nach Anspruch 13, welche eine Pflanzenzelle ist.
Pflanzen, umfassend Pflanzenzellen nach Anspruch 14.
Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach Anspruch 15, umfassend Pflanzenzellen nach Anspruch 14.
Verfahren zur Expression eines Strukturgens von Interesse in Pflanzenzellen, welches umfasst: Expression des Strukturgens unter der Kontrolle eines Promotors nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Pflanzenzellen Teil einer ganzen Pflanze sind.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, darüber hinaus umfassend den Schritt des Erntens der gesamten Pflanze.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei Teile der Pflanzenzellen oder Pflanzen von diesen Pflanzenzellen oder Pflanzen abgetrennt werden.
Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids, umfassend: Verknüpfen eines Promotors nach einem der Ansprüche 1 bis 6, eines Strukturgens von Interesse und eines Terminators, der in Pflanzenzellen in dieser räumlichen Anordnung funktionsfähig ist.
Verwendung eines Promotors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Expression eines Strukturgens in Pflanzenzellen.