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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen Pflanzenpromotor und seine
Verwendung.
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Für die Expression
eines exogenen Strukturgens von Interesse in einer Pflanze oder
Pflanzenzellen ist Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotor (nachstehend
als „35S-Promotor" bezeichnet), der
aus etwa 0,8 kb besteht, verwendet worden, aber die Minimalregion
des 35S-Promotors (z.B. –90-Region
des 35S-Promotors, die aus 98 Nucleotidbasen (–90 bis +8) besteht, ist auf
Grund der niedrigen Transkriptionsaktivität der Region nicht zufriedenstellend
für praktische
Expression eines Gens von Interesse gewesen (Odell et al., Nature
313: 810–812
(1985), Jensen et al., Nature 321: 669–674 (1986), Jefferson et al.,
EMBO J. 6: 3901–3907
(1987), Kay et al., Science 236: 1299–1302 (1987), Sanderset et
al., Nucl. Acid. Res. 4: 1543–1558
(1987), usw.), Benfey et al., EMBO J. 8: 2195–2202 (1988).
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Im
Stand der Technik werden Promotorelemente beschrieben, die, wenn
sie mit einem Minimalpromotor kombiniert sind, die Transkription
verstärken.
Ein Typ solcher Promotorelemente sind G-Box-Motive, die im Allgemeinen
das Hexanucleotid CACGTG und einige flankierende Nucleotide enthalten.
Zum Beispiel beschriebt WO 94/12015 einige spezifische G-Box-Motive,
von denen gezeigt wurde, dass sie hohe Expressionsmengen in Wurzeln,
niedrige Expressionsmengen in Blättern
und wenig oder keine Expression in Samen vermitteln.
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Daher
betrifft die vorliegende Erfindung die Aufgabe, die effiziente Expression
eines exogenen Strukturgens von Interesse in einer Pflanze oder
Pflanzenzellen zu ermöglichen.
Dieses Problem wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen,
die in den Ansprüchen
charakterisiert werden, gelöst.
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Es
ist nämlich
gefunden worden, dass eine kompakte spezifische Nucleotidsequenz
die Expression eines Gens von Interesse verstärken kann, wenn sie stromaufwärts mit
einem Promotor, einschließlich
der Minimalregion, wie oben beschrieben, verbunden ist.
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Daher
betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Promotor, der
in Pflanzenzellen funktionsfähig
ist und der die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR:
2 gezeigt, enthält.
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Zusätzlich zu
den spezifischen Nucleotiden, wie in Sequenz ID NR: 1 oder 2 gezeigt,
kann der Promotor zusätzliche
Nucleotide am 5'-
und/oder 3'-Ende
der Sequenz einschließen.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante
DNA-Moleküle, die
einen Promotor umfassen, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist
und der die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2
gezeigt, und gegebenenfalls ein Transkriptionsterminationssignal,
das in Pflanzenzellen funktionsfähig
ist, enthält.
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Darüber hinaus
betrifft vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen
Promotor, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist und der die Nucleotidsequenz,
wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthält, ein Strukturgen von Interesse
und einen Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, umfasst.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Plasmid pGbox10,
wie in 4 gezeigt, und auf pGbox11, wie in 5 gezeigt.
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Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung eine Pflanzenzelle, die einen
Promotor, wie oben beschrieben, umfasst, und ein Strukturgen von
Interesse unter der Kontrolle dieses Promotors exprimiert, so wie eine
Pflanze, die solche Pflanzenzellen umfasst, und Vermehrungsmaterial
von solchen Pflanzen.
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Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression
eines Strukturgens von Interesse in Pflanzenzellen, wobei die Expression
durch den oben beschriebenen Promotor gesteuert wird, und ein Verfahren
zur Konstruktion eines Plasmids, wobei das Verfahren das Verbinden
des Promotors der vorliegenden Erfindung, eines Strukturgens von
Interesse und eines Terminators, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist,
in dieser Reihenfolge umfasst.
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1 zeigt
die Konstruktion von Plasmid –90/GUS
aus pBI101.
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2 zeigt
die Konstruktion des Plasmids Gbox10/–90/GUS aus Plasmid –90/GUS.
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3 zeigt
die Konstruktion des Plasmids Gbox11/–90/GUS aus Plasmid –90/GUS.
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4 zeigt
die Konstruktion von pGbox10 aus dem Plasmid Gbox10/–90/GUS.
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5 zeigt
die Konstruktion von pGbox11 aus dem Plasmid Gbox11/–90/GUS.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann effiziente Expression eines Gens von Interesse durch
den kompakten Promotor erreicht werden.
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Die
Gentechnik-Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden sollen, folgen Standard-Verfahren, wie in J. Sambrook, E.
F., Frisch, T. Maniatis „Molecular
Cloning, 2. Aufl.",
Verl. Cold Spring Harbor Laboratory (1989), D. M. Glover, „DNA Cloning", Verl. IRL (1985)
und anderswo beschrieben.
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Zuerst
wird eine Beschreibung des Promotors, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist
und der die Nucleotidsequenz, wie gezeigt in Sequenz ID NR: 1 oder
NR: 2, enthält,
gemacht. Der Promotor enthält üblicherweise
die Sequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, und er
enthält
vorzugsweise multiple Kopien, besonders in der Form von Tandemwiederholungen.
Der Promotor enthält
vorzugsweise vier oder mehr solche Kopien.
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Die
Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, kann
entweder natürlichen
oder synthetischen Ursprungs sein.
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Synthese
der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt,
kann durch chemische Standard-DNA-Syntheseverfahren erreicht werden.
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Der
Promotor der vorliegenden Erfindung enthält üblicherweise ein zum Transkriptiosstart
notwendiges Minimalelement, das anders ist als die Nucleotidsequenz,
wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt.
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Das
Transkriptionselement betrifft eine Sequenzregion, die für den Transkriptionsstart
notwendig ist, wie eine Transkriptionsstartstelle allein, eine Transkriptionsstartstelle
und eine TATA-Sequenz, eine Transkriptionsstartstelle und CAAT-Sequenz,
alternativ eine Transkriptionsstartstelle und TATA-Sequenz und CAAT-Sequenz,
usw.
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Ein
typisches Beispiel einer solchen Sequenzregion schließt eine
Sequenz ein, in der das 5'-Ende
einer Nucleotidsequenz entspricht, die mindestens etwa 30 Nucleotide
stromaufwärts
der Transkriptonsstartstelle lokalisiert ist und in der die 3'-End-Sequenz der Region von der Transkriptionsstartstelle
bis zur Translationsstartstelle entspricht. Die Transkriptionsaktivität einer
solchen Basenregion ist im Allgemeinen niedrig.
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Spezifische
Beispiele solcher Regionen schließen die 98-Nucleotidbasenregion des 35S-Promotors ein,
die die Transkriptionsstartstelle (+8 bis –90) (nachstehend als die „–90-Region" bezeichnet), die –204 bis +8-Region
des Tomatengens, das die kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase-Oxidase (rbcS-3A)
codiert (Plant Cell, 1: 217–227
(1989)), die –287
bis +29-Region des PR1a-Genpromotors (Plant Cell 2: 357–366 (1990))
und die –195
bis +32-Region des Kartoffel-Proteaseinhibitorgens (PI-II) (Plant
Cell 2: 61–70 (1990))
einschließt.
Die oben beschriebenen Regionen, die ein zum Transkriptionsstart
notwendiges Minimalelement enthalten, werden gewöhnlich durch deren Insertion
stromabwärts
der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt,
genutzt.
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Die
Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, und
die Sequenz, die ein Minimalelement zum Transkriptionsstart enthält, kann
durch Restriktionsenzymverdau von genomischer DNA, deren Sequenz
bekannt ist, oder durch Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifikation
einer Region einer DNA-Nucleotidsequenz,
die Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 oder die Sequenz, die ein Minimalelement
zum Transkriptionsstart enthält,
unter Verwendung genomischer DNA als eine Matrize und geeigneter
Oligonucleotide als Primer oder durch chemische DNA-Synthese hergestellt
werden.
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Wenn
die –90-Region
des 35S-Promotors genutzt wird, kann der Promotor der vorliegenden
Erfindung durch Synthese und Aneinanderlagerung von Oligonucleotiden,
die den +Strang (siehe Sequenz ID NR: 4) und den –Strang
(siehe Sequenz ID NR: 5) der –90-Region
darstellen, konstruiert werden.
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In
Bezug auf den 35S-Promotor, kann ein Deletionspromotor, der kürzer ist
als die –90-Region,
erhalten werden, und er wird gewöhnlich
durch Verdau mit Restriktionsenzymen, durch PCR-Amplifikation unter Verwendung
genomischer DNA als eine Matrize und Oligonucleotidprimern, die
Sequenzen aufweisen, die geeignet sind, um die Deletionspromotor-Region
zu amplifizieren, oder durch chemische DNA-Syntheseverfahren konstruiert.
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Der
Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist und der in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden soll, schließt zum Beispiel von Pflanzen
stammende Terminatoren wie den Terminator des von T-DNA stammenden
Nopalin-Synthasegens
(NOS) oder von Viren abstammende Terminatoren, die gewöhnlich in
Pflanzen-Gentechnikverfahren verwendet werden, wie die Terminatoren
der Knoblauchvirus-GV1- und -GV2-Gene ein.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus rekombinante DNA-Moleküle, die
einen Promotor gemäß der Erfindung
umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst solch ein
rekombinantes DNA-Molekül
darüber
hinaus einen Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist.
Stärker
bevorzugt umfasst das rekombinante DNA-Molekül ein Strukturgen, das funktionell
mit dem Promotor gemäß der Erfindung verbunden
ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das rekombinante DNA-Molekül
ein Vektor, nämlich
ein Plasmid.
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Das
rekombinante DNA-Molekül
der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise so konstruiert, dass
es mindestens eine Clonierungsstelle stromaufwärts des Terminators und stromabwärts des
Promotors enthält, um
das erwünschte
Strukturgen zu beherbergen. Stärker
bevorzugt ist das rekombinante DNA-Molekül so konstruiert, dass es multiple
Clonierungsstellen enthält.
Der Ausdruck „Clonierungsstelle" betrifft hier eine DNA-Region,
die durch Restriktionsenzyme, die gewöhnlich in Gentechnikverfahren
genutzt werden, erkannt und verdaut werden kann.
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Ein
Beispiel eines solchen rekombinanten DNA-Moleküls, das Clonierungsstellen
enthält,
ist das Plasmid pGbox10, wie in 4 gezeigt,
oder das Plasmid pGbox11, wie in 5 gezeigt.
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Beispiele
von nützlichen
Strukturgenen, die unter der Kontrolle des Promotors gemäß der vorliegenden
Erfindung exprimiert werden können,
sind Pflanzenabwehrgene wie das Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen (PAL),
das Chalcon-Synthetasegen (CHS), das Chitinasegen (CHT), das Lysozymgen,
das PR-Proteingen,
usw., Krankheitsresistenzgene wie Pto und Gene, die die Widerstandskraft
gegen Bakterien, Pilze, Viren und Insekten in allen Pflanzengeweben
erhöhen,
wie das Viruskapselproteingen, BT (Bacillus thuringiensis)-Toxinproteingen,
usw.
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Andere
nützliche
Gene schließen
jene ein, die den Proteingehalt von Futtergetreide erhöhen, wie
Gene, die Speicherproteine codieren, das Sojabohnen-Glyciningen und das β-Conglyciningen,
usw., Gene, die den Methionin- und Lysingehalt von Futtergetreide
erhöhen,
wie das Paranuss-2S-Albumingen, die 10 kDa- oder 15 kDa-Proteingene
von Mais und Reis, usw. und Gene, die den Biotingehalt von Futtergetreide
erhöhen- wie
die Bakteriengene von Escherichia coli, usw., die die bioA-, bioB-,
bioC-, bioD-, bioF- und bioH-Enzyme, die in die Synthese von Biotin
involviert sind, codieren.
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Andere
nützliche
Gene schließen
jene ein, die die Qualität
von Lipiden durch Liefern von Stabilität gegen Oxidierung, Senken
des Phospholipidgehalts und Steigern des Ölsäure- und Linolsäuregehalts
erhöhen, wie
die Stearosly-ACP-Desaturase-,
Acyl-ACP-Thioesterase- und 3-Phosphat-Acyltransferasegene, Gene,
die die Widerstandskraft gegen niedrige Temperaturen durch Erhöhen des
Gehalts an ungesättigten
Fettsäuren erhöhen, wie
das Acetyltransferasegen und Gene, die die Herstellung von Herbizid-resistenten
Feldfrüchten ermöglichen,
wie durch die Expression des Gens, das L-Phosphinothricin-Acetyltransferase,
5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimatsynthase
codiert, oder andere Gene, die sich auf Herbizidresistenz beziehen.
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Das
Strukturgen im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann auch ein DNA-Abschnitt. sein,
der eine Anti-sense-RNA zu einem Gen codiert, das in einer Pflanzenzelle
exprimiert wird. Darüber
hinaus kann das Strukturgen ein DNA-Abschnitt sein, der ein Ribozym codiert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus Wirtszellen, die
einen Promotor gemäß der Erfindung oder
ein rekombinantes DNA-Molekül
gemäß der Erfindung
umfassen, so wie Wirtszellen, die mit solchen Promotoren oder Molekülen transformiert
worden sind. Diese Wirtszellen können
prokaryontischen, nämlich
bakteriellen, oder eukaryontischen Ursprungs sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle. Daher betrifft die vorliegende
Erfindung auch Pflanzenzellen, die einen Promotor gemäß der Erfindung
umfassen oder ein Strukturgen unter der Kontrolle eines solchen
Promotors exprimieren. Der Promotor oder das rekombinante DNA-Molekül gemäß der Erfindung
ist vorzugsweise stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen, die Pflanzenzellen
gemäß der Erfindung
umfassen. Solche Pflanzen können
zum Beispiel durch Regeneration der Pflanzenzellen gemäß der Erfindung
produziert werden.
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Nachdem
die Pflanzen der vorliegenden Erfindung gezüchtet wurden, können die
ganzen Pflanzen oder Teile der Pflanzen geerntet und verkauft werden.
Teile der Pflanzen, besonders Teile, die Expressionsprodukte des
Strukturgens von Interesse enthalten, können von den Pflanzen durch
konventionelle Verfahren getrennt, extrahiert und/oder konzentriert
werden. Gleichermaßen
können
Pflanzenzellen geerntet oder als ein kommerzielles Produkt an sich
(wie eine Nahrungsmittelquelle oder Nahrungszusätze) verkauft werden, und/oder
Teile der Pflanzenzellen, im besonderen Teile, die Expressionsprodukte
der Strukturgene von Interesse enthalten, können von den Pflanzenzellen
durch konventionelle Verfahren getrennt, extrahiert und/oder konzentriert
werden.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Vermehrungsmaterial
von Pflanzen gemäß der Erfindung,
die Pflanzenzellen gemäß der Erfindung
umfasst. Beispiele für
Vermehrungsmaterial sind Samen, Keimlinge, Früchte, Knollen, Stecklinge,
usw.
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Der
Vektor der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel durch das folgende
Verfahren konstruiert werden. Der Promotor, der in Pflanzenzellen
funktionsfähig
ist und der die Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR:
2 gezeigt, enthält,
wird in die Multiclonierungsstelle des Vektors inseriert, der den
Terminator, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, wie pBI101 (Clontech
Inc.; Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901–3907 (1987)) enthält.
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Darüber hinaus
kann ein exogenes Markergen wie β-Glucuronidase
ggl. ausgeschnitten und durch ein erwünschtes Strukturgen ersetzt
werden. Ein anderes mögliches
Verfahren ist, einen binären
Vektor wie pBIN19 (Nuc. Acid. Res. 12: 8711–8721 (1984)) zu verwenden,
und den Promotor, nach Bedarf das erwünschte Strukturgen und den
Terminator, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll,
in dieser räumlichen
Anordnung in die Multiclonierungsstelle zu inserieren.
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Für die Verfahren
zum Einbringen des Plasmids in Pflanzenzellen gibt es konventionelle
Verfahren wie das Agrobacterium-Infektionsverfahren (d.h. Infektion
von Pflanzengewebe mit dem Erdbakterium Agrobacterium), elektrisch-basierende
Einbringungsverfahren (elektrisch-basierendes Verfahren zum Einbringen
in Protoplasten: Elektroporation) oder direktes Einbringen durch
eine Partikelpistole (direktes Einbringen in Pflanzengewebe oder
gezüchtete
Zellen: Partikelpistolen-Verfahren).
Pflanzenzellen, die das Plasmid der vorliegenden Erfindung beherbergen,
können
durch konventionelle Pflanzengewebe-Zuchtverfahren, wie zum Beispiel
in S. B. Gelvin, R. A. Schilperoot und D. P. S. Verma, Plant Molecular
Biology/Manual, Kluwer Academic Publishers Press, 1988 beschrieben,
erhalten werden, und in der Folge können Pflanzen oder deren Teile,
die von diesen Pflanzenzellen abstammen, durch Regenerierung gemäß den darin
beschriebenen Protokollen erhalten werden.
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Darüber hinaus
kann das hierin beschriebene Verfahren für die Pflanzenarten angewendet
werden, die Monokotyledone wie Reis, Mais, Gerste, Weizen und Zwiebel,
Dikotyledone wie die Mitglieder der Leguminosae, d.h. Sojabohnen,
Erbsen, Bohnen, Alfalfa, Mitglieder der Solanaceae wie Tabak, Tomate
und Kartoffel, Mitglieder der Cruciferae wie Kraut, Raps, Senfpflanze,
Mitglieder der Cucurbitaceae (Kürbisfamilie)
wie Melone, Kürbis,
Gurken, Mitglieder der Ammiaceae wie Karotte und Sellerie und Mitglieder
der Compositae wie Salat enthalten.
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Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines Promotors
gemäß der Erfindung
für die
Expression eines Strukturgens in Pflanzenzellen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können
Pflanzenzellen (transformierte Pflanzenzellen) und Pflanzen (transformierte
Pflanzen), die ein Strukturgen von Interesse exprimieren, effizient
durch die Verwendung des kompakten Promotors oder Plasmids der vorliegenden
Erfindung erhalten werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele
ausführlicher
veranschaulicht.
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Beispiel 1 – Konstruktion
der GUS-Expressionsplasmide Gbox10/–90/GUS, Gbox11/–90/GUS
und –90/GUS
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Das
Plasmid –90/GUS
wurde durch Insertion der –90-Region,
hergestellt durch chemische DNA-Synthese, in die Multiclonierungsstelle
stromaufwärts
des GUS-Gens, enthalten
im kommerziell erhältlichen
Plasmid pBI101 (Clontech Inc.; Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901–3907 (1987)),
das auch einen Terminator enthält, der
in Pflanzenzellen funktionsfähig
ist, konstruiert. Das Plasmid Gbox10/–90/GUS und Plasmid Gbox11/–90/GUS
wurden weiter durch Insertion eines Multimers, enthaltend 4 Tandemwiederholungen
der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 beziehungsweise NR:
2 gezeigt, stromaufwärts
der –90-Region von –90/GUS
konstruiert. Das Verfahren der Konstruktion ist unten im Detail
erklärt
(vgl. 1, 2 und 3).
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Schritt 1: Synthese und
Aufreinigung von komplementären
Oligonucleotiden, enthaltend 4 Tandemwiederholungen von G-box10
oder G-box11, und komplementären
Oligonucleotiden, enthaltend die –90-Region
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Zwei
komplementäre
Oligonucleotide (+Strang und –Strang,
jedes 46 Basen, vgl. Sequenz ID NR: 6, 7, 8 und 9), die ein Multimer,
bestehend aus Tandemwiederholungen der Oligonucleotidsequenz, wie
in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthalten und eine HindIII-Restriktionsstelle
am 5'-Ende und eine XbaI-Stelle
am 3'-Ende haben,
wenn sie aneinandergelagert sind, wurden chemisch synthetisiert.
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Darüber hinaus
wurden zwei komplementäre
Oligonucleotide (+Strang und –Strang,
jedes 102 Basen, vgl. Sequenz ID NR: 4 und 5), enthaltend die –90-Region,
die die zum Transkriptionsstart notwendigen Minimalelemente und
BamHI-Restriktionsstellen
an beiden Enden einschließt,
wenn sie aneinandergelagert sind, chemisch synthetisiert.
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Von
diesen chemisch synthetisierten Oligonucleotiden wurden mit Ammoniak-Behandlung (55°C, 5 h) die
Schutzgruppen entfernt, und in der Folge wurden sie durch Umkehrphasen-HPLC
(YMC GEL ODS S-5) aufgereinigt. Das zur Aufreinigung verwendete
Lösungsmittel
war 0,1 M Triethylamin (TEAA), und die Oligonucleotide wurden unter
Verwendung eines Konzentrationsgradienten von 5–100% Methylcyanid (CH3CN) extrahiert. Die extrahierten Oligonucleotide
wurden gewonnen, der Rest getrocknet, in 80% Essigsäure (3 ml)
für 20
min wieder gelöst
und in der Folge wieder getrocknet. Der getrocknete Rest wurde in
destilliertem Wasser (3 ml) wieder gelöst und wieder getrocknet, und
diese Vorgehensweise wurde insgesamt dreimal wiederholt, bevor die
Probe schließlich
in 100 μl
TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst wurde. Die so erhaltene Oligonucleotidprobe
wurde durch Elektrophorese mit einem 5% Polyacrylamidgel (80 V,
1 h) weiter aufgereinigt.
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Das
Paar der komplementären
Oligonucleotide, enthaltend das Multimer, das aus 4 Tandemwiederholungen
der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt
(jede 42 Basenpaare), besteht, so wie das Paar der komplementären Oligonucleotide,
enthaltend die –90-Region
(jedes 102 Basenpaare), wurden aus dem Polyacrylamidgel extrahiert
und durch elektrophoretischen Transfer (180 V, 40 min) aus dem Gel in
Dialyseschläuche
(SPECTRA/POR, molecularporöser
Membranschlauch MG 3500) gewonnen.
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Schritt 2: Aneinanderlagerung
der komplementären
Stränge
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0,5 μg eines Paars
von komplementären
Oligonucleotiden, die das Multimer, bestehend aus 4 Tandemwiederholungen
der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt,
enthalten, und ein Paar von komplementären Oligonucleotiden, die die –90-Region
(102 Basen) enthalten, wurden für
3 min in 10 μl
wässriger
Lösung
auf 100°C
erhitzt, in ein 65°C
Wasserbad überführt, langsam
auf Raumtemperatur abkühlen
lassen und schließlich
schnell in Eiswasser gekühlt.
Durch dieses Verfahren wurden ein DNA-Fragment, das ein Multimer,
bestehend aus 4 Tandemwiederholungen der Nucleotidsequenz, wie in
Sequenz ID NR: 1 oder NR: 2 gezeigt, enthält, und ein DNA-Fragment, das
die –90-Region
(102 Basen) enthält,
hergestellt.
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Schritt 3: Konstruktion
des –90/GUS-Plasmids
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2 μg pBI101
wurden mit 10 Einheiten BamHI verdaut, und 0,1 μg der –90-Region (102 Basen), hergestellt in Schritt
2, und 0,5 μg
des BamHI-verdauten pBI101 wurden gemischt und unter Verwendung
der T4-DNA-Ligase (DNA-Ligierungskit,
Takara Shuzo Ltd.) ligiert. Dieses Gemisch wurde verwendet, um den
E. coli-Stamm HB101 (Takara Shuzo Ltd) gemäß dem Protokoll von Cohen et
al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110–2114 (1972)) zu transformieren.
Von den resistenten Kolonien, die auf LB-Agar Platten, enthaltend
50 μg/ml
Kanamycin, gezüchtet
wurden, wurden Plasmid-DNAs durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und
deren Strukturen wurden durch Restriktionsenzymverdau analysiert.
Isolierte Plasmide, die nach dem Verdau mit SmaI und XbaI ein etwa
100 bp-DNA-Fragment
erbrachten, wurden selektiert. Die Sequenzen der in diese selektierten
Plasmide inserierten DNA wurden durch das Didesoxy-Verfahren (Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977)) bestimmt, und
Clone, in die die –90-Region in der richtigen
Orientierung inseriert worden ist, wurden ausgewählt, wobei die richtige Orientierung
die gleiche Orientierung der –90-Region, wie
sie im 35S-Promotor
gefunden wird, bedeutet. Auf diese Weise wurde das –90/GUS-Plasmid
konstruiert (siehe 1).
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Schritt 4: Konstruktion
des Gbox10/–90/GUS-Plasmids
und des Gbox11/–90/GUS-Plasmids
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2 μg des –90/GUS-Plasmids,
das in Schritt 3 hergestellt wurde, wurden mit 10 Einheiten XbaI
und HindIII (37°C,
2 h) verdaut, und die Verdauungsprodukte wurden durch Elektrophorese
in 0,8% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (80 V, 1,5 h) fraktioniert.
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Das
HindIII-XbaI-Fragment wurde unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchens
mit einem DNA-Auffangfilter (Takara Shuzo Ltd.) gewonnen und aufgereinigt.
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0,1 μg des DNA-Fragments,
das in Schritt 2 hergestellt wurde, enthaltend ein Multimer, bestehend
aus 4 Tandemwiederholungen der Nucleotidsequenz, wie in Sequenz
ID NR: 1 beziehungsweise NR: 2 gezeigt, und 0,5 μg des HindIII-XbaI-verdauten –90/GUS-Plasmids
wurden gemischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (DNA-Ligierungskit, Takara, Shuzo
Ltd.) ligiert. Dieses Gemisch wurde verwendet, um den E. coli-Stamm
HB101 (Takara Shuzo Ltd.) gemäß dem Protokoll
von Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110–2114 (1972))
zu transformieren.
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Von
den resistenten Kolonien, die auf LB-Agar-Platten, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin,
gezüchtet wurden,
wurden Plasmid-DNAs durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und deren Strukturen
wurden durch Restriktionsenzymverdau analysiert. Isolierte Plasmide,
die nach dem Verdau mit HindIII und XbaI etwa 50 bp-DNA-Fragmente erbrachten,
wurden selektiert. Die Strukturen der Plasmide wurden durch das
Didesoxy-Verfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:
5463 (1977)) bestätigt,
und die Sequenzen der DNA-Insertionen wurden bestimmt. Auf diese
Weise wurden das Gbox10/–90/GUS-Plasmid
beziehungsweise das Gbox11/–90/GUS-Plasmid
konstruiert (siehe 2 und 3).
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Beispiel 2 – Konstruktion
von pGbox10 und pGbox11
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2 μg von Plasmid
Gbox10/–90/GUS
beziehungsweise Plasmid Gbox11/–90/GUS
wurden mit je 10 Einheiten SmaI verdaut (37°C, 2 h). 0,1 μg des Verdauungsprodukts
wurden mit 0,05 μg
des kommerziell erhältlichen
SacI-Linkers (5'-CGAGCTCG-3') (Takara Shuzo Ltd.)
gemischt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (DNA-Ligierungskit, Takara
Shuzo Ltd.) ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden in der Folge
mit 10 Einheiten SacI verdaut, mit T4-DNA-Ligase (DNA-Ligierungskit (Takara
Shuzo)) wieder ligiert und verwendet, um den E. coli-Stamm HB101
(Takara Shuzo) gemäß dem Verfahren
von Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110–2114 (1972))
zu transformieren. Von den resistenten Kolonien, die auf LB-Agar
Platten, enthaltend 50 μg/ml
Kanamycin, gezüchtet
wurden, wurden Plasmid-DNAs durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und
deren Strukturen wurden durch Restriktionsenzymverdau analysiert.
Isolierte Plasmide wurden SmaI- und SacI-Verdau
unterzogen und einzelne lineare DNA-Fragmente wurden selektiert.
Auf diese Weise wurden das Plasmid pGbox10 beziehungsweise Plasmid
pGbox11 konstruiert (siehe auch 4 und 5).
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Beispiel 3 – Herstellung
von Plasmid-DNA zur Gen-Einbringung
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Die
Plasmide Gbox10/–90/GUS,
Gbox11/–90/GUS
bzw. –90/GUS,
hergestellt in Beispiel 1, wurden weiter durch das Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren
aufgereinigt. Diese DNA-Plasmide wurden durch Zufügen von
1 g Cäsiumchlorid
und 80 μl
von 10 mg/ml Ethidiumbromid pro 1 ml DNA-Lösung aufgereinigt. Versiegeln
der resultierenden Lösung
in Zentrifugationsröhrchen
(Quick-Seal, Beckman Co.) und Aussetzen der Lösung einer Zentrifugation in
einem NVT65-Rotor bei 60 000 VpM für 24 h erbrachte das aufgereinigte
Plasmid.
-
Beispiel 4 – Erzeugung
einer transformierten Tabakpflanze durch ein indirektes Einbringungsverfahren
-
Jedes
in Beispiel 3 beschriebene aufgereinigte Plasmid wurde durch Hitzebehandlung
(37°C, 5
min) in Agrobakterium (Agrobacterium tumefaciens LBA4404; Streptomycin-resistent,
Rifampicin-resistent; Hoekma et al., Nature 303: 179–180 (1983)),
mit 20 mM CaCl2 behandelt, um es kompetent
zu machen, eingebracht. Transformanten wurden durch Ausnutzen der
Kanamycin-Resistenz, die durch das Plasmid NPTII-Gen verliehen wurde
(Trien-Cout et al., Gene 23: 331–341 (1983)), erhalten und
auf L-Agar-Platten, enthaltend 300 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Rifampicin
und 100 μg/ml
Kanamycin, selektiert.
-
Die
auf diese Weise erhaltenen Agrobakterium-Transformanten wurden bei
20°C für einen
Tag in L-Brühenmedium,
enthaltend 300 μg/ml
Streptomycin, 100 μg/ml
Rifampicin und 100 μg/ml
Kanamycin, gezüchtet,
und diese Bakteriensuspension wurde dann verwendet, um eine Scheibe
einer Tabakpflanze gemäß dem Standardprotokoll,
beschrieben in S. B. Gelvin, R. A. Schilperoort und D. P. S. Verma,
Plant Molecular Biology Manual, Verl. Kluwer Academic Publishers,
1988, zu infizieren.
-
Die
infizierten Tabakblattscheiben (SR-1) wurden für 4 Tage in MS-NB-Agarmedium gezüchtet und dann
in MS-NB-Agarmedium, enthaltend 500 μg/ml Cefotaxim, überführt, um
die Agrobakterien zu töten.
11 Tage später
wurden die Blattscheiben in MS-NB-Agarmedium, enthaltend 500 μg/ml Cefotaxim
und 100 μg/ml Kanamycin, überführt, auf
diese Weise wurde die Selektion von transformierten Pflanzen begonnen.
Ungefähr 4
Wochen später
wurden junge Pflanzen, bei denen sich grüne Stämme und Blätter entwickelt hatten, von
der Blattscheibe abgetrennt und weiter in MS-Agarmedium, enthaltend
500 μg/ml
Cefotaxim und 50 μg/ml
Kanamycin, gezüchtet,
wonach junge Pflanzen, die Wurzeln erbrachten, selektiert wurden.
Die selektierten jungen Pflanzen wurden in Erde überführt und in einem Glashaus gezüchtet, um
transformierte Pflanzen zu produzieren.
-
Beispiel 5 – Erzeugung
von transformierter Karotte durch indirektes Einbringen
-
G-box10/–90/GUS,
aufgereinigt in Beispiel 3, wurde in Agrobacterium tumefaciens LBA4404
gemäß dem Verfahren,
wie in Beispiel 4 beschrieben, eingebracht, und das erhaltene Agrobakterium
wurde verwendet, um Hypocotyl einer Karottenart, Nantes Scarlet,
zu infizieren.
-
Das
infizierte Karotten-Hypocotyl wurde auf LS-D-Agarmedium, enthaltend
500 μg/ml
Cefotaxim, platziert. Selektion der transformierten Pflanze wurde
nach 10 Tagen durch Platzieren der Pflanze auf LS-D-Agarmedium,
enthaltend 100 μg/ml
Cefotaxim und 50 μg/ml
Kanamycin, begonnen. Der nach einem Monat erzeugte Kallus wurde
wiederholt alle vier Wochen in ein LS-D-Agarmedium, enthaltend 100 μg/ml Cefotaxim
und 50 μg/ml
Kanamycin, überfährt. Der
nach 2 Monaten selektierte Kallus wurde in LS-Agarmedium überführt, und eine
ganze Pflanze wurde aus einem zufälligen Embryo regeneriert.
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Beispiel 6 – Produktion
einer transformierten Pflanze durch direktes Einbringen
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G-box10/–90/GUS,
aufgereinigt, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde in unreifen Embryo
von Reis, Notohikari, mit einer Partikelpistole (Reebock Company)
gemäß einem
Verfahren eingebracht, das beschrieben ist in Shimada, T., et al.,
BulI.RIAR, Ishikawa Agr. Coll. 4: 1-8(1995) oder Ko Shimamoto und
Kiyotaka Okada, Experimental Protocol of model plant, Rice and Arabidopsis
Syujyun-sya, 1996 (ISBN4-B7962-157-9 C3345). Nachdem sterilisierte
Samen für
7 bis 10 Tage in LS-D2-Medium
gezüchtet
worden waren, wurde der Embryo entnommen und in LS-D2-Agarmedium mit seinem
Scutellum-Organ nach oben platziert. Mit je 10 μg von Gbox10/–90/GUS, –90/GUS
oder pBI121(35S/GUS) als eine Kontrolle und pDM302, enthaltend eine äquimolare
Menge des Bialaphos-Resistenzgens (J. Cao et al., Plant Cell Rep.
11: 586–591,
1992) wurden 3 mg eines Goldpartikels beschichtet (durchschnittlicher
Durchmesser 1 μm).
Zwei Schüsse
wurden in Reisembryonen injiziert, wobei jeder Schuss 0,2 mg Goldpartikel
(1 μg DNA,
Injektionsdruck 150–200
kg/cm2 bei 70 mmHg) enthielt. Zwei Tage
nach dem Einbringen wurden die resultierenden Embryonen auf LS-D2-Agarmedium,
enthaltend 4 mg/ml Bialaphos, überführt, um
Herbizid-resistente Zellen zu selektieren. Der so erhaltene Herbizid-resistente Kallus
wurde in Kulturmedium zu Redifferenzierung übertragen, und regenerierte,
zufällige Embryonen
oder kleine Pflanzen wurden auf LS-Agarmedium, enthaltend 4 mg/ml
Bialaphos, überführt, um die
Herbizid-resistenten Pflanzen zu züchten.
-
Beispiel 7 – Bestätigung der
Insertion des eingebrachten Gens in transformierten Pflanzen
-
1. Herstellung von genomischer
DNA aus transformierten Pflanzen
-
Genomische
DNA wurde aus transformierten Pflanzen gemäß dem CTAB-Verfahren, beschrieben in Hirofumi Utiyama,
Plant Gene Engineering Manual for Producing Transgenic Plants, Kodansha
Scientific; Seiten 71–74,
ISBN4-06-153513-7
c3045, isoliert.
-
Eine
Tabakblattscheibe (ungefähr
0,5 g) von jeder transformierten Pflanze, erhalten in den Beispielen 4,
5 und 6, wurde unter Verwendung eines Homogenisators in einem Eppendorf-Röhrchen pulverisiert,
in das in der Folge 0,5 ml auf 65°C
vorgewärmtes
2 × CTAB
(2% Acetyltrimethylammoniumbromid, 1% Polyvinylpyrrolidon (PVP))
zugefügt
wurde, und dieses Gemisch wurde bei 65°C für 5 min inkubiert. 0,5 ml Chloroform/Isoamylalkohol
(24:1) wurden dann zugefügt,
und die Probe wurde sanft für
5 min gemischt. Die Probe wurde durch Zentrifugation bei 12 000
VpM (10 000 × g)
für 10
min aufgetrennt, 0,5 ml Isopropylalkohol wurden zu der oberen Phase
zugefügt,
und die Probe wurde gemischt. Nach Zentrifugation bei 12 000 VpM
(10 000 × g) für 15 min
wurde das erhaltene Präzipitat
in 200 μl
TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst. RNase wurde zugefügt, um eine
Endkonzentration von 10 μg/ml
zu erhalten, und die Probe wurde für 30 min bei 37°C inkubiert,
um RNAs zu degradieren. Nach der RNase-Behandlung wurde eine Gemisch
von äquilibriertem Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
(25:24:1) zugefügt,
die Probe gründlich
gemischt, und die obere Phase wurde gewonnen. 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat
(pH 5,2) und 2,5 Volumina Ethanol wurden zugefügt, die Probe wurde gründlich gemischt,
und ungefähr
5 μg genomische
DNA wurden durch Zentrifugation bei 12 000 VpM (10 000 × g) für 5 min
erhalten.
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2. Bestätigung der
Geneinbringung durch das PCR-Verfahren
-
Unter
Verwendung von 50 μg
der oben erhaltenen genomischen DNA als eine Matritze und synthetischer
DNA mit den Nucleotidsequenzen, wie in Sequenz ID NR: 10 und 11
gezeigt, als Primer wurde die Promotorregion unter Verwendung des
PCR-Verfahrens amplifiziert (30 Reaktionszyklen von 94°C für 1 min,
55°C für 2 min
und 72°C
für 3 min).
Das erhaltene PCR-Produkt wurde durch Elektrophorese in 12% Polyacrylamidgel
(PAGE) (80 V, 1 h) analysiert. Durch dieses Verfahren wurde ein DNA-Fragment
entsprechend der Promotorregion (ungefähr 250 bp für Gbox10/–90/GUS und Gbox11/–90/GUS
oder 290 bp für –90/GUS)
mit der erwarteten Größe erhalten.
-
Beispiel 8 – Selbstbefruchtung
und Entwicklung einer genetisch homologen Linie einer transformierten
Pflanze
-
Die
in Beispiel 4 erzeugte transformierte junge Pflanze wurde in Erde überführt und
gezüchtet,
um eine transformierte Pflanze hervorzubringen. Zur Zeit der Anthese
(Blütezeit)
wurden die Pflanzen selbst-bestäubt, und
Samen wurden von den reifen Blüten
erhalten. Die Samen wurden für
5 min in 1% Natriumhypochlorit sterilisiert, wonach sie auf MS-Agramedium,
enthaltend 100 μg/ml
Kanamycin, ausgesät
wurden. Clone, von denen alle Samen keimten und sich nach der Aussaat
entwickelten, wurden selektiert.
-
Beispiel 9 – GUS-Genexpression
in transformierten Tabakpflanzengeweben
-
GUS-Färbung der
Samen, Blätter
und Wurzeln der in Beispiel 8 erhaltenen transformierten Tabakpflanze
(enthaltend das Plasmid Gbox10/–90/GUS
oder Gbox11/–90/GUS
oder das Plasmid –90/GUS
oder pBI121 als eine Kontrolle) wurde gemäß den Verfahren durchgeführt, die
beschrieben sind in Hirofumi Uchiyama, Plant Gene Engineering Manual
for Producing Transgenic Plant, Kodansha Scientific; Seiten 68–70, 1990, ISBN4-06-153513-7
c3045 und Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387–405 (1987).
Samen der entsprechenden transformierten Tabakpflanzen wurden in
1% Natriumhypochlorit sterilisiert und auf MS-Agarmedium, enthaltend
100 μg/ml
Kanamycin, überfährt, und
es wurde zugelassen, dass sie für
ungefähr
zwei Wochen Keimlinge entwickelten.
-
Aktivitätsfärbung wurde
unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indol-β-D-glucoronsäure (X-Gluc) als ein Substrat
und Messen der Menge des präzipitierten
blauen Pigments (Indigotin) durchgeführt.
-
Färbung: Samen
von 40 Individuen jeder Pflanzenprobe (transformierte Tabakpflanzen,
enthaltend das Plasmid Gbox10/–90/GUS,
Gbox11/–90/GUS, –90/GUS
oder pBI121 zum Vergleich, oder eine unbehandelte Tabaksorte, SR-1,
als eine Kontrolle) wurden mit einem Skalpell geschnitten und über Nacht
bei 37°C
in GUS-Färbelösung (1
mM X-Gluc, 0,5 mM K
3[Fe(CN)
6],
0,5 mM K
3[Fe(CN)
6],
0,3% Triton X-100) eingetaucht. Pflanzengewebe wurden dann in Ethanol überführt, durch
einige Waschgänge
in Ethanol entfärbt,
und die Menge des restlichen blauen Pigmentpräzipitats wurde gemessen. Die
Ergebnisse des GUS-Färbetests
von Samen, jungen Blättern
und Wurzeln von transformierten Pflanzen, enthaltend das Plasmid
der vorliegenden Erfindung, Gbox10/–90/GUS, Gbox11/–90/GUS, –90/GUS
oder pBI121 zum Vergleich, oder von der unbehandelten Tabaksorte
SR-1 als eine Kontrolle sind in Tabellen 1–3 gezeigt. Tabelle
1 GUS-Färbung in
Samen
- A:
- der gesamte Samen
ist dunkel gefärbt
- B:
- ein Areal dunkler
Färbung
erscheint rund um die Basis (Primordium) der Wurzel im Samen
- C:
- Die Basis der Wurzel
im Samen ist gefärbt
- Ohne:
- keine Färbung
Tabelle
2 GUS-Färbung in
Blättern „dunkel", „mittel", „hell" und „ohne" beziehen sich auf
den Grad der Färbung Tabelle
3 GUS-Färbung in
Wurzeln „dunkel", „mittel", „hell" und „ohne" beziehen sich auf
den Grad der Färbung
-
In
der nicht-transformierten (unbehandelten) Tabaksorte SR-1 wies keines
der Gewebe Färbung
auf. In mit –90/GUS-Plasmid
transformierten Pflanzen, enthaltend die zum Transkriptionsstart
notwendigen Minimalelemente des 35S-Promotors, wurde helle Färbung in
der Basis (Primordium) der Wurzel gesehen. In mit dem Plasmid der
vorliegenden Erfindung Gbox10/–90/GUS
und Gbox11/–90/GUS
transformierten Pflanzen zeigten nahezu alle Proben dunkle Färbung in
den Samen, Blättern
und Wurzeln. Besonders starke und einheitliche Färbung wurde in der Pflanze
beobachtet, die Gbox10/–90/GUS
ausgesetzt wurde.
-
Beispiel 10 – GUS-Genexpression
in transformierter Karotte
-
GUS-Färbung wurde
mit Blättern
der transformierten Karottenpflanze (enthaltend das Plasmid der
vorliegenden Erfindung, Gbox10/–90/GUS,
und pBI121 als eine Kontrolle) durchgeführt, in denen das Vorhandensein
des eingebrachten Gens in Beispiel 7 gemäß dem Verfahren, wie in Beispiel
9 beschrieben, bestätigt wurde.
Es wurde keine Färbung
für die
Blätter
von unbehandelter, untransformierter Karotte beobachtet. Starke
Färbung
wurde für
die Blätter
der meisten der Test-Proben
der Pflanze, die mit dem Plasmid der vorliegenden Erfindung, Gbox10/–90/GUS,
transformiert wurde, beobachtet.
-
Beispiel 11 – GUS-Genexpression
in transformiertem Reis
-
Expression
von GUS-Gen in den Blättern
der kleinen transformierten Reispflanze (Höhe: 10 cm), hergestellt in
Beispiel 6, oder des Gens, das in Beispiel 7 bestätigt wurde,
wurde gemäß dem GUS-Färbeverfahren,
wie in Beispiel 9 beschrieben, untersucht. Während in den Blättern von
unbehandeltem, untransformiertem Reis wenig Färbung beobachtet wurde, wurde
starke GUS-Aktivität in den
Blättern
der Pflanze, die mit Gbox10/–90/GUS
transformiert wurde, beobachtet.
-
Die
DNA-Länge
der Genkassette, umfassend einen Promotor, der in Pflanzenzellen
funktionsfähig
ist, ein Strukturgen von Interesse und einen Terminator, der in
Pflanzenzellen funktionsfähig
ist, enthalten in den vorliegenden Plasmiden Gbox10/–90/GUS
und Gbox11/–90/GUS,
ist 2 300 bp (140 bp für
den Promotor), während
jene von pBI121(35S/GUS) 2 960 bp ist (800 bp für den Promotor), und die Genkassette,
die eingebracht werden soll, wurde etwa 22% kürzer (83% für den Promotor).
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Die
Zusammensetzung der Medien, die in den Beispielen verwendet wurden,
ist unten beschrieben.
-
1. MS-Agarmedium
-
34,7
g MURASHIGE AND SKOOG (Flow Laboratories) werden in 1 Liter destilliertem
Wasser gelöst, und
der pH-Wert der Lösung
wurde mit 1 M KOH auf pH 5,8 eingestellt. 8 g Agar werden zugefügt, und
das Gemisch wird durch Autoklavieren sterilisiert.
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2. MS-NB-Agarmedium
-
0,1
mg/ml 1-Naphtalin-Essigsäure
(NAA) und 0,1 mg/ml 6-Benzylaminopterin (BA) werden zu MS-Agarmedium
hinzugefügt.
-
3. LS-Medium
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34,7
g MARUSHIGE AND SKOOG (Flow Laboratories) und 30 g Saccharose wurden
in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst, und der pH-Wert der resultierenden
Lösung
wurde durch 1 M KOH auf pH 5,8 eingestellt, und das Gemisch wurde
durch Autoklavieren sterilisiert.
-
4. L-Agarmedium
-
Medium,
erhalten durch Zugabe von 8 g/l Agar zu LS-Medium.
-
5. LS-D-Agarmedium
-
Medium,
erhalten durch Zugabe von 1,0 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure zu LS-Agarmedium.
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6. LS-D2-Agarmedium
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Medium,
erhalten durch Zugabe von 2,0 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure zu LS-Agarmedium.
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7. L-Brühe-Medium
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10
g Bacto-Trypton (Difco), 5 g Bacto-Hefeextrakt (Difco) und 10 g
NaCl werden in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert wird mit 5
M NaOH auf 7,0 eingestellt, und das Medium wird durch Autoklavieren sterilisiert.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann effiziente Expression eines Gens von Interesse erreicht
werden.
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