DE60035357T2

DE60035357T2 - System und verfahren zum sequenzieren genetischer substanzen

Info

Publication number: DE60035357T2
Application number: DE60035357T
Authority: DE
Inventors: Mitsuo Tokushima-shi ITAKURA; Hideji Matsudo-shi TAJIMA
Original assignee: Precision System Science Co Ltd
Current assignee: Itakura Mitsuo Tokushima Jp; Precision System Science Co Ltd
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2020-10-12
Also published as: EP1221491A1; EP1221491B1; EP1221491B8; DE60035357D1; JP3668075B2; US7029882B1; JP2001103970A; WO2001027320A1; EP1221491A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Suspension zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien, ein Verfahren zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer solchen Suspension und ein Verfahren zum Hochgeschwindigkeitsdurchmustern von SNPs unter Verwendung einer solchen Suspension. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Suspension zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien, ein Verfahren zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer solchen Suspension und ein Verfahren zum Hochgeschwindigkeitsdurchmustern von SNPs unter Verwendung einer solchen Suspension, um Basensequenzen von genetischen Materialien wie etwa DNA-Fragmenten und dergleichen zu bezeichnen und um SNPs zu bezeichnen.
Die vorliegende Erfindung kann zu Folgendem dienen: Bestimmen oder Steuern von Basensequenzen von Genen auf dem Gebiet der Landwirtschaft, des Ingenieurwesens, der Pharmakologie, der Medizin, der Psychologie oder der Naturwissenschaften wie etwa der Chemie, Biologie oder dergleichen, Bestimmen von Basensequenzen von genetischen Materialien in verschiedenen medizinischen Behandlungsbereichen, bei Pharmazeutika, in der Körperhygiene, der Gesundheit, in der Biowissenschaft oder bei Nahrungsmitteln und zum Klären von Beziehungen zwischen Basensequenzen von genetischen Materialien und der Form, der Struktur, des Charakters, des Körpertyps, von Krankheit, Empfindlichkeit in Bezug auf Medikamente, Temperament, Charakter und dergleichen verschiedener Lebensformen einschließlich menschlicher Lebensformen.
STAND DER TECHNIK
Um SNPs (Einzelnucleotidpolymorphismen) zu bezeichnen, welche die Identifizierung und die Arzneimittelempfindlichkeit krankheitsanfälliger Gene für "häufige Krankheiten" bestimmen, besteht bis heute ein dringender Bedarf für die Entwicklung eines Durchmusterungssystem für den hochwirksamen Nachweis von SNPs über das gesamte Genom. Zur Zeit ist ein System zum hocheffizienten Nachweisen und Durchmustern von SNPs in der Entwicklungsphase, und ein sogenannter DNA-Chip, der auf dem Prinzip der Hybridisierung beruht, befindet sich erst in der vorläufigen Prüfung.
Übrigens wird bei einem DNA-Chip ein System wie dasjenige von Affymetrix, Inc., bereits in der Praxis angewandt zum Nachweis von SNPs durch Herstellen für einen der bereits bekannten SNPs, der auf eine Platte wie etwa eine Halbleiterschicht oder ein Objektträgerglas usw. getüpfelt worden ist, eines Oligonucleotidarrays von mehr als 10 Typen einschließlich dieses SNP und durch Nachweisen der SNPs dahingehend, ob das PCR-amplifizierte DNA-Fragment dadurch hybridisiert worden ist.
Bei dem Verfahren, das diesen DNA-Chip verwendet, besteht jedoch das Problem, dass die Geräte- und Betriebskosten hoch sind. Da ferner für den DNA-Chip die Hybridisierungsreaktion eine nichtspezifische physikochemische Reaktion ist, ist ein System mit Redundanz unter Verwendung dieser Vielzahl von Oligonucleotiden erforderlich. Deshalb besteht selbst bei Anwendung dieses Systems auch das Problem, dass ungefähr 10 % fehlerhafte Beurteilungen erfolgen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben genannten Probleme zu lösen, wobei eine erste Aufgabe ist: Bereitstellen einer Suspension zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien, eines Verfahrens zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer solchen Suspension und eines Verfahren zum Hochgeschwindigkeitsdurchmustern von SNPs unter Verwendung einer solchen Suspension, wobei der Reaktionsbereich vergrößert und die Reaktion in einer Flüssigkeit gefördert und der Reaktionswirkungsgrad erheblich gesteigert werden kann, um dadurch die Zeit bis zum Erreichen eines Gleichgewichts zu verkürzen, und zwar durch Verwendung winziger Teilchen (Kügelchen), anstelle des Ausführens der herkömmlichen Methode eines sogenannten DNA-Chips oder dergleichen, die eine Hybridisierungsreaktion auf einer begrenzten schmalen Oberfläche innerhalb eines Flecks eines Objektträgerglases umfasst.
Eine zweite Aufgabe ist: Bereitstellen einer Suspension zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien, eines Verfahrens zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer solchen Suspension und eines Verfahren zum Hochgeschwindigkeitsdurchmustern von SNPs unter Verwendung einer solchen Suspension, wobei die Basensequenzen ohne das Erfordernis einer Duplikation zuverlässig durchgemustert werden können, indem die hohe Spezifität von Enzymreaktionen genutzt wird, um Basensequenzen differentiell zu unterscheiden.
Eine dritte Aufgabe ist: Bereitstellen einer hoch zuverlässigen Hochgeschwindigkeitssuspension zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien, eines Verfahren zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer solchen Suspension und eines Verfahrens zum Hochgeschwindigkeitsdurchmustern von SNPs unter Verwendung einer solchen Suspension, wobei die Sequenz bestimmt wird, indem die Reaktion insgesamt unter den gleichen Bedingungen durch Verwendung verschiedener Kügelchen gefördert wird, die codiert worden sind, anstatt die Sequenz auf der Basis der Positionen der Oligonucleotide zu bestimmen, die auf einem Objektträgerglas immobilisiert worden sind.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt bereit: eine Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach dem unabhängigen Anspruch 1, ein Verfahren zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach dem unabhängigen Anspruch 10 sowie ein Verfahren zum Hochgeschwindigkeitsdurchmustern von SNPs nach dem unabhängigen Anspruch 13. Bevorzugte Ausführungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die beanspruchte Erfindung ergibt sich im Einzelnen aus den nachstehend beschriebenen Ausführungsformen. Im Allgemeinen erläutern die beschriebenen Ausführungsformen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Der aufmerksame Leser erkennt jedoch, dass einige Aspekte der beschriebenen Ausführungsformen über den Umfang der Ansprüche hinausgehen. Insofern, als die beschriebenen Ausführungsformen in der Tat über den Umfang der Ansprüche hinausgehen, sind sie als zusätzliche Hintergrundinformation anzusehen und stellen keine Definitionen der Erfindung per se dar. Dies gilt auch für den nachstehende "Kurze Beschreibung der Zeichnungen" sowie für die "Beste Art, die Erfindung auszuführen".
Um die obigen Aufgaben zu lösen, sieht ein erster Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen vor, dass in einer Flüssigkeit in einem Behälter suspendiert sind: eine erste codierte Oligonucleotidgruppe, die erste codierte Oligonucleotide aufweist, die einen Basensequenztyp einer vorbestimmten Basenzahl haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren, um die Basensequenzen sämtlicher Typen oder spezieller Typen für die Basenzahl davon abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu dieser Gruppe gehört, eine zweite codierte Oligonucleotidgruppe, die zweite codierte Oligonucleotide aufweist, die einen Basensequenztyp einer vorbestimmten Basenzahl haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren, um die Basensequenzen sämtlicher Typen oder spezieller Typen für die Basenzahl davon abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu dieser Gruppe gehört, und ein Enzym, das die zwei Oligonucleotide über ein Desoxyribosepaar, das ein Zucker des Endnucleotids davon ist, nur im Fall einer Situation differentiell bindet, in der die zwei codierten Oligonucleotide an einem genetischen Einzelstrangmaterial hybridisiert sind und die Endnucleotide der Basensequenz davon unmittelbar benachbart sind, und die Basensequenz der vorbestimmten Basenzahl eine konstante Beziehung mit der Basensequenz dieses genetischen Materials ist.
Dabei ist das "genetische Material" hauptsächlich DNA (Fragmente), wobei jedoch auch RNA (Fragmente) umfasst sein kann. "Base" bedeutet im Fall von DNA Thymin (T), Cytosin (C), Adenin (A), Guanin (G), während im Fall von RNA Uracil (U) anstelle von Thymin eingebracht ist. Für die "speziellen Typen" können dann, wenn die Basensequenz des genetischen Zielmaterials in gewissem Umfang ungefähr bekannt ist, anstelle der Basensequenzen sämtlicher Typen die Typen etwas reduziert werden.
Was "so vorgesehen sind, dass sie ... sortierbar sind" angeht, gibt es den Fall der Sortierbarkeit dadurch, dass mit einem markierten Material codiert wird, damit die zwei Gruppen selbst identifiziert werden können, oder dass die Arten von markiertem Material, die für die zwei Gruppen verwendet werden, verschieden gemacht werden oder dass ein Carrier vorgesehen wird, der an dem codierten Oligonucleotid einer Gruppe fernsteuern und somit diese Gruppe durch Fernsteuerung in eine fakultative Position bewegen kann. Was "fernsteuern kann" angeht, gibt es beispielsweise den Fall, dass dadurch ferngesteuert werden kann, dass ein magnetisches Teilchen an dem Oligonucleotid vorgesehen wird und eine Fernsteuerung durch magnetische Operation möglich ist, dass ein geladenes Teilchen an dem Oligonucleotid vorgesehen wird oder dass das Oligonucleotid selbst geladen und ein elektrisches Feld angewandt wird.
Das "Codieren" wird dadurch ausgeführt, dass die Art(en) und/oder das Molverhältnis (die Molverhältnisse) des markierten Materials unter Verwendung von beispielsweise einem lumineszenten Material wie etwa einem Fluoreszenzmaterial oder einem markierten Materials wie etwa einem radioaktiven Materials geändert wird (werden). Ferner umfasst "codiertes Oligonucleotid" das Binden verschiedener markierter Materialen an ein Oligonucleotid über einen Adaptor oder umfasst wie bei dem siebten oder achten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen das Festhalten eines Typs von mehreren Oligonucleoti den und des markierten Materials an einem Carrier. Wie bei dem siebten oder achten Aspekt der Erfindung wird das markierte Material bevorzugt verteilt und nur an einen Teil der mehreren Oligonucleotide gebunden.
Für eine Analyse ist es zweckmäßig, die Art des markierten Materials, das bei dem Codieren des ersten Oligonucleotids verwendet wird, und die Art des markierten Materials, das beim Codieren des zweiten Oligonucleotids verwendet wird, verschieden zu machen. In diesem Fall werden die erste Oligonucleotidgruppe und die zweite Oligonucleotidgruppe nur durch Codieren sortiert.
Als "Enzym" ist beispielsweise ein Enzym vorgesehen, das die Oligonucleotide dann bindet, wenn diese unmittelbar benachbart sind, wie im Fall der DNA-Ligase (DNA-Linkerenzym). "Konstante Beziehung" bedeutet beispielsweise eine komplementäre Beziehung oder eine identische Beziehung.
Nach dem ersten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen hat die Suspension ein Enzym, das ein Desoxyribosepaar, das die Zucker des Endnucleotids der Oligonucleotide ist, nur im Fall einer Situation differentiell bindet, in der die Basensequenz der vorbestimmten Basenzahl der zwei codierten Oligonucleotide eine konstante Beziehung mit der Basensequenz des genetischen Materials ist. Infolgedessen kann durch Einbringen und Suspendieren eines genetischen Materials eines Einzelstrangs eines Ziels, für das die Basensequenz bekannt sein soll, in dieses Enzymsystem nur das Oligonucleotid mit einer konstanten Beziehung mit dieser Basensequenz gebunden werden. Deshalb kann man durch Dissoziation eines genetischen Einzelstrangmaterials und Lesen des Codes des Paars dieser Oligonucleotide das genetische Zielmaterial mit hoher Zuverlässigkeit aus der Basensequenz der vorbestimmten Basenzahl kennen.
Ferner werden nach dem ersten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen die zwei Gruppen, nämlich die erste codierte Oligonucleotidgruppe und die zweite codierte Oligonucleotidgruppe verwendet, wobei jedes codierte Oligonucleotid derselben eine Basensequenz einer vorbestimmten Basenzahl hat, und es wird das Enzym verwendet, welches das Desoxyribosepaar, welches der Zucker des Endnucleotids des Oligonucleotids ist, nur dann differentiell bindet, wenn eine konstante Beziehung mit dem genetischen Material vorliegt. Infolgedessen kann im Vergleich mit dem Fall, in dem die Basensequenz des komplementären Oligonucleotids dadurch erhalten wird, dass einfach die Hybridisierung wie bei dem DNA-Chip angewandt wird, die Sequenz des genetischen Materials auf einfache Weise mit noch größerer Zuverlässigkeit bestimmt werden.
Außerdem kann die Basensequenz auf leichte und einfache Weise durch eine Operation bestimmt werden, die das Suspendieren des Oligonucleotids umfasst, das die verschiedenen Basensequenzen hat, und zwar ohne, dass die Herstellung ausgeführt wird, die das Fixieren von Oligonucleotiden verschiedener Moden der Basensequenz an einem DNA-Chip umfasst, um SNPs zu bezeichnen.
Ferner kann bei den bevorzugten Ausführungsformen die Reaktion innerhalb eines weiten Bereichs im Inneren der Suspension anstelle der Hybridisierungsreaktion an der begrenzten schmalen flachen Oberfläche innerhalb eines Flecks auf einer Platte wie etwa einem Objektträgerglas usw. ausgeführt werden. Dadurch kann der Reaktionswirkungsgrad erheblich verbessert werden, und die Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichts kann verkürzt werden.
Im Unterschied zu der Methode des Unterscheidens der Sequenz von auf einem Objektträgerglas immobilisierten Oligonucleotiden mit Hilfe der Position der Oligonucleotide koexistieren die verschiedenen codierten Typen von Oligonucleotiden in der gleichen Reaktionsflüssigkeit, und somit können die Reaktionen insgesamt unter den gleichen Bedingungen ablaufen.
Anstatt die lange Basensequenz auf einmal zu bestimmen, werden bei den bevorzugten Ausführungsformen kurze Basensequenzen, die unterschieden werden können, wiederholt und angewandt, damit das Enzym eine differentielle Bindung ausführt und dadurch die lange Basensequenz bestimmt. Infolgedessen ist die Zahl der Basensequenztypen, die für die erste codierte Oligonucleotidgruppe und die zweite codierte Oligonucleotidgruppe, die bei der Bestimmung verwendet werden, erforderlich sind, äußerst gering im Vergleich mit der Anzahl von Oligonucleotidtypen, die für die Bestimmung der Basensequenzen erforderlich sind, die der Summe der Basenzahl derselben entsprechen. Der Vorgang des Codierens derselben ist also einfach. Beispielsweise genügt es bei der oben genannten Ausführungsform, wenn die Basensequenztyp-Gesamtzahl 64+64 ist, was 128 ergibt. Wenn dagegen die Oligonucleotide für 6 Basensequenzen bereitzustellen sind, ist es erforderlich, 4⁶ = 4096 Typen bereitzustellen, wogegen die Typenzahl der Basensequenz bei der Erfindung nur sehr gering ist.
Ein zweiter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei dem oben genannten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen die jeweiligen ersten codierten Oligonucleotide so codiert werden, dass sie als diejenigen sortierbar sind, die zu ihrer Gruppe gehören, und die jeweiligen zweiten codierten Oligonucleotide so vorgesehen werden, dass sie an magnetischen Teilchen festgehalten werden, die von einem Magnetfeld ferngesteuert werden, so dass sie als diejenigen sortierbar sind, die zu ihrer Gruppe gehören.
Nach dem zweiten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen können diese dann durch Anlegen eines Magnetfelds an die Innenseite eines Flüssigkeitskanals beispielsweise einer Düse eines Spenders getrennt werden. Dadurch können codierte Oligonucleotide, die kein magnetisches Teilchen haben, entfernt werden, und somit können codierte Oligonucleotide, die magnetische Teilchen haben, auf einfache und zuverlässige Weise sortiert werden.
Ein dritter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen die vorbestimmte Basenzahl der jeweiligen ersten codierten Oligonucleotide und der zweiten codierten Oligonucleotide mindestens drei Basen ist und die erste codierte Oligonucleotidgruppe mindestens 4³ Typen von ersten codierten Oligonucleotiden aufweist, die durch Ersetzen der jeweiligen Basen der drei Basen erhalten sind, und die zweite codierte Oligonucleotidgruppe mindestens 4³ Typen von zweiten codierten Oligonucleotiden aufweist, die durch Ersetzen der jeweiligen Basen der drei Basen erhalten sind.
Für eine Analyse sind die jeweiligen Mengen (Dichte und Absolutmenge) der ersten codierten Oligonucleotidgruppe und der zweiten codierten Oligonucleotidgruppe ungefähr identisch, und die Mengen für jeden der jeweiligen Typen in jeder dieser Gruppen sind ebenfalls ungefähr identisch.
Ein vierter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den oben genannten jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen das Enzym DNA-Ligase ist und die Desoxyribosen, die der Zucker des Endnucleotids sind, nur im Fall einer Situation differentiell bindet, in der die Endnucleotide einer Basensequenz, die drei oder mehr Basen von zwei codierten Oligonucleotiden aufweist, die an einem genetisches Einzelstrangmaterial hybridisert worden sind, unmittelbar benachbart sind, und die Basensequenzen der Oligonucleotide mit der Basensequenz dieses genetischen Materials komplementär sind.
Dabei bedeutet "komplementär" eine Beziehung, bei der sie unter Bildung eines Doppelstrangs in der DNA ein Basenpaar miteinander bilden können. Das Basenpaar in der DNA ist Adenin und Thymin sowie Cytosin und Guanin, wogegen das Basenpaar in der RNA Adenin und Uracil sowie Cytosin und Guanin ist.
Bei dem dritten und vierten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen ist die vorbestimmte Basenzahl des jeweiligen ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids mindestens drei Basen. Infolgedessen genügt es, wenn die Typen der ersten codierten Oligonucleotidgruppe und der zweiten codierten Oligonucleotidgruppe jeweils 4³ Typen sind, und somit ist es nicht erforderlich, 4096 Typen bereitzustellen wie bei den Oligonucleotiden, die sechs Basen haben. Es genügt daher, eine Substanz mit einer sehr geringen Zahl von Typen bereitzustellen, und somit ist der Vorgang einfach.
Ein fünfter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen die jeweiligen ersten codierten Oligonucleotide, die zu der ersten codierten Oligonucleotidgruppe gehören, ein Oligonucleotid eines Typs aufweisen, der eine vorbestimmte Basensequenz und markiertes Material hat, das an das Oligonucleotid gebunden ist, und das markierte Material vorbestimmte Arten mit jeweiligen vorbestimmten Molverhältnissen aufweist und die Codierung durch Ändern der Art(en) und/oder des Molverhältnisses (der Molverhältnisse) ausgeführt wird.
Nach dem fünften Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen wird die Codierung durch Binden des markierten Material, für das die Art und/oder das Molverhältnis geändert wird, an das Oligonucleotid ausgeführt. Nach diesem Aspekt der bevorzugten Ausführungs formen können Oligonucleotide, die in einer dem genetischen Material entsprechenden Kette verbunden sind, erhalten werden.
Ein sechster Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen bei sämtlichen oder einem Teil des ersten codierten Oligonucleotids, das zu der ersten codierten Oligonucleotidgruppe gehört, ein freies Ende davon markierte Didesoxyribose hat.
Dabei ist das "freie Ende" dasjenige Ende der Enden des Oligonucleotids, das an kein anderes Oligonucleotid gebunden ist, d. h. dasjenige End, welches das markierte Material bindet. Die markierte Didesoxyribose ist an das 3'-Ende des ersten codierten Oligonucleotids gebunden. Durch Einbeziehen von Didesoxyribose kann dann die Bindung unabhängig von dem Oligonucleotid induziert werden, das danach benachbart ist.
Infolgedessen wird dann, wenn Didesoxyribose in sämtlichen ersten codierten Oligonucleotiden vorliegt und Didesoxyribose gleichermaßen in sämtlichen zweiten codierten Oligonucleotiden vorliegt und das zweite codierte Oligonucleotid einen Carrier hat, nur ein Dimeres, für welches das erste codierte Oligonucleotid und das zweite Oligonucleotid jeweils einzeln (für jede der oben genannten vorbestimmten Basenzahlen) verbunden sind, erhalten. Dadurch kann die Basensequenz arrangiert werden, und somit kann beispielsweise dann, wenn die Codierung durch ein lumineszentes Material erfolgt, das Lesen des Codes auf zuverlässige und einfache Weise ausgeführt werden.
Wenn die Didesoxyribose in einem Teil der ersten codierten Oligonucleotide vorliegt, können das Konjugat mit dem ersten codierten Oligonucleotid, das vielfach einmal, zweimal, dreimal oder häufiger gebunden ist, und schließlich das erste codierte Oligonucleotid, das die gebundene Didesoxyribose enthält, identifiziert werden. Dadurch kann die DNA-Sequenz auf einfache Weise gelesen werden.
Nach einem sechsten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen wird dann, wenn die Didesoxyribose für sämtliche Teile vorgesehen ist, nur ein Dimeres mit dem ersten codierten Oligonucleotid und dem zweiten codierten Oligonucleotid, die jeweils einzeln (für jede der vorbestimmten Basen) verbunden sind, erhalten. Dadurch können die Basensequenzen arrangiert werden, und somit kann beispielsweise dann, wenn die Codierung durch ein lumineszentes Material erfolgt, das Lesen des Codes auf zuverlässige und einfache Weise ausgeführt werden. Ferner können dann, wenn die Didesoxyribose in einem Teil vorgesehen ist, das Konjugat mit dem ersten codierten Oligonucleotid, das vielfach einmal, zweimal, dreimal oder häufiger gebunden ist, und schließlich das erste codierte Oligonucleotid, das die gebundene Didesoxyribose enthält, identifiziert werden. Dadurch kann die DNA-Sequenz auf verhältnismäßig einfache Weise gelesen werden.
Ein siebter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen jedes von den ersten codierten Oligonucleotiden, die zu der ersten codierten Oligonucleotidgruppe gehören, aufweist: einen nichtmagnetischen Carrier, mehrere Oligonucleotide eines Typs, die eine vorbestimmte Basensequenz haben und an den Carrier gebunden sind, und markierte Materialien, die an einen Teil der Oligonucleotide an einer Position gebunden sind, die von der Position verschieden ist, an die der Carrier gebunden ist, oder an den Carrier an einer Position gebunden sind, die von der Position verschieden ist, an die das Oligonucleotid gebunden ist, und sämtliche der markierten Materialien vorbestimmte Arten mit jeweiligen vorbestimmten Molverhältnissen aufweisen, und die Codierung durch Ändern der Art(en) und/oder des Molverhältnisses (der Molverhältnisse) des markierten Materials ausgeführt wird.
Dabei wird das Binden der jeweiligen Oligonucleotide an die Carrier beispielsweise durch Auftragen eines Bindematerials, das an das Oligonucleotid differentiell bindet, auf den Carrier ausgeführt. Als diese Bindematerialien gibt es beispielsweise eine Kombination aus Biotin und Avidin.
Ein achter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen jedes von den zweiten codierten Oligonucleotiden, die zu der zweiten codierten Oligonucleotidgruppe gehören, aufweist: einen magnetischen Carrier, mehrere Oligonucleotide eines Typs, die eine vorbestimmte Basensequenz haben und an den Carrier gebunden sind, und markierte Materialien, die an einen Teil des Oligonucleotids an einer Position gebunden sind, die von der Position verschieden ist, an die der Carrier gebunden ist, oder an den Carrier an einer Position gebunden sind, die von der Position verschieden ist, an die das Oligonucleotid gebunden ist, und sämtliche der markierten Materialien vorbestimmte Arten mit jeweiligen vorbestimmten Molverhältnissen aufweisen, und die Codierung durch Ändern der Art(en) und oder des Molverhältnisses (der Molverhältnisse) des markierten Materials ausgeführt wird.
Der siebte und achte Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass das Oligonucleotid an einem nichtmagnetischen oder magnetischen Carrier gestützt ist und die Codierung durch Ändern der Art und/oder des Molverhältnisses des markierten Materials ausgeführt wird, das an einen Teil des Oligonucleotids oder den Carrier gebunden ist. Infolgedessen können Basensequenzen vieler Typen von mehreren zehn bis zu mehreren hundert zuverlässig und deutlich codiert und identifiziert werden. Ferner ist die Reaktionsfläche dadurch größer, dass die Reaktion an der Oberfläche des Carriers abläuft, die aus winzigen Teilchen oder dergleichen besteht, und somit kann der Reaktionswirkungsgrad erheblich gesteigert werden.
Ein neunter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen das Oligonucleotid an den Carrier oder das markierte Material über einen Arm gebunden ist.
Der neunte Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass das Oligonucleotid an den Carrier oder das markierte Material über einen Arm gebunden ist. Nach diesem Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen erfolgt sogar eine weitere Trennung zwi schen den markierten Materialien. Deshalb kann ein Quenchen (eine Extinktion) wirksam verhindert werden, und somit kann die Basensequenz mit hoher Zuverlässigkeit bestimmt werden.
Ein zehnter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen weist auf: einen Konjugationsschritt zum Einbringen und Suspendieren in der Suspension nach einem von dem ersten bis neunten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen eines genetischens Zielmaterials eines Einzelstrangs einer vorbestimmten Base, die ausreichend größer als die vorbestimmte Basenzahl ist, zum Hybridisieren des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids an dem genetischen Zielmaterial; einen Dissoziationsschritt, um das genetische Zielmaterial, welches das erste codierte Oligonucleotid oder das zweite codierte Oligonucleotid eingefangen hat, wieder in einen Einzelstrang zu dissoziieren; einen Sortierschritt zum Sortieren von Paaren des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten Oligonucleotids aus der Suspensionsflüssigkeit; und einen Bestimmungsschritt zum Bestimmen der Basensequenz des genetischen Zielmaterials auf der Grundlage einer Kombination des Codes zum Identifizieren der Basensequenz, die das sortierte erste codierte Oligonucleotid zeigt, und eines Codes zum Identifizieren der Basensequenz, die das zweite codierte Oligonucleotid zeigt.
Dabei verwendet der Sortierschritt dann, wenn die Codierung mit einem lumineszenten Material wie etwa einen Fluoreszenzmaterial ausgeführt wird, beispielsweise ein Durchflusscytometer, und nur dann, wenn ein Paar von Emissionswellenlängen des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids existiert, wird das Paar von Oligonucleotiden sortiert. Ferner wird dann, wenn ein codiertes Oligonucleotid der ersten und der zweiten Gruppe ein magnetisches Teilchen hat, durch Anlegen eines Magnetfelds an die Innenseite eines Flüssigkeitskanals von außen das Oligonucleotid an der Innenwand des Flüssigkeitskanals zum Anhaften gebracht und somit getrennt und sortiert, und nur dann, wenn eine geeignete Emissionswellenlänge existiert, erfolgt die Sortierung durch das Durchflusscytometer. Ferner kann durch Berücksichtigung der Emissionsintensität der jeweiligen Wellenlängen unter Verwendung des Durchflusscytometers die Anzahl von Überlappungserscheinungen bestimmt werden.
Nach dem zehnten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen wird eine Wirkung, die bereits für den ersten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen erläutert wurde, gezeigt.
Ein elfter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen in dem Konjugationsschritt die ersten codierten Oligonucleotide so codiert werden, dass sie als diejenigen sortierbar sind, die zu ihrer Gruppe gehören, und die zweiten codierten Oligonucleotide so vorgesehen werden, dass sie an magnetischen Teilchen festgehalten werden, die von einem Magnetfeld gesteuert werden, so dass sie als diejenigen sortierbar sind, die zu ihrer Gruppe gehören, und der Sortierschritt einen Trennungsschritt aufweist, um die zweiten codierten Oligonucleotide durch Magnetfeldoperation zu trennen.
Nach dem elften Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen wird eine Wirkung, die bereits für den zweiten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen erläutert wurde, gezeigt.
Ein zwölfter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen sieht vor, dass bei den jeweiligen Aspekten der bevorzugten Ausführungsformen dann, wenn die zweiten codierten Oligonucleotide magnetische Teilchen als den Träger haben, der Sortierschritt verwendet: einen Spender, der einen Flüssigkeitskanal hat, einen magnetischen Abschnitt zum Anlegen und Entfernen eines Magnetfelds von außen an den bzw. von dem Flüssigkeitskanal und einen Drucksteuerabschnitt zum Steuern eines Drucks im Inneren des Flüssigkeitskanals, um eine Flüssigkeit anzusaugen und abzugeben, und durch Anlegen oder Entfernen eines Magnetfelds von außen an den bzw. von dem Flüssigkeitskanal, die magnetischen Teilchen, welche die zweiten codierten Oligonucleotide haben, an die Innenwand des Flüssigkeitskanals angezogen oder davon getrennt werden.
Nach dem zwölften Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen wird ein Spender verwendet, der einen Flüssigkeitskanal und einen Magnetkraftabschnitt hat, und durch Anlegen oder Entfernen eines Magnetfelds von außen an den bzw. von dem Flüssigkeitskanals kann die Bestimmung der Basensequenz konsistent automatisch, effizient und rasch ausgeführt werden.
Ein dreizehnter Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen weist auf: einen Konjugationsschritt zum Herstellen von zwei ungefähr identischen Suspensionen nach einem von dem ersten bis neunten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen und zum Einbringen und Suspendieren eines durch Extraktion aus einer ersten Probe erhaltenen ersten genetischen Zielmaterials eines Einzelstrangs einer vorbestimmten Base in die eine/der einen davon und zum Einbringen und Suspendieren eines durch Extraktion aus einer zweiten Probe erhaltenen zweiten genetischen Zielmaterials eines Einzelstrangs einer vorbe stimmten Base in die andere/der anderen davon, und zum Hybridisieren des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids an jeweiligen Zielmaterialien; einen Dissoziationsschritt, um das genetische Zielmaterial, das jedes von dem ersten codierten Oligonucleotid oder dem zweiten codierten Oligonucleotid eingefangen hat, wieder in einen Einzelstrang zu dissoziieren; einen Sortierschritt zum Sortieren des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids aus der Suspensionsflüssigkeit; und einen Bestimmungsschritt zum Bestimmen der Basensequenz des genetischen Zielmaterials auf der Grundlage von jedem von einer Kombination des Codes zum Identifizieren der Basensequenz, die das sortierte erste codierte Oligonucleotid zeigt, und eines Codes zum Identifizieren der Basensequenz, die das zweite codierte Oligonucleotid zeigt; und einen Identifizierungsschritt zum Ausführen einer Identifizierung von SNPs durch Vergleichen von für das erste genetische Zielmaterial bestimmten Basensequenzen und von für das zweite genetische Zielmaterial bestimmten Basensequenzen. Dabei bedeutet "ungefähr identisch", dass mindestens die Bestandteile und die Menge davon (Dichte und Absolutmenge) ungefähr identisch sind. Das erste codierte Oligonucleotid, das bei dem siebten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen verwendet wird, und das zweite codierte Oligonucleotid, das bei dem achten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen verwendet wird, sind diejenigen, die für die Erfindung der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 00/05357 im Namen von Machida Masayuki and Precision System Science (PSS) Co., Ltd., verwendet werden.
Bei dem dreizehnten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen wird eine Wirkung, die bereits für den ersten Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen erläutert wurde, gezeigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Flussdiagramm, das eine Methode zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einer bevorzugten Ausführungsform zeigt.
2 ist ein konzeptuelles Schema, das ein Oligonucleotid zeigt, das an einem Ziel-DNA-Fragment nach einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert worden ist.
3 ist ein Flussdiagramm, das eine Methode zum Durchmustern von SNPs nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
BESTE ART, DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
Nachstehend wird eine Methode zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf 1 und 2 beschrieben. Wenn nichts anderes angegeben ist, schränkt diese Ausführungsform die bevorzugten Ausführungsformen nicht ein, Die Methode nach dieser Ausführungsform verwendet den folgenden Spender (anhängige Patentanmeldung von PSS Co., Ltd., offengelegte JP-Patentveröffentlichung Nr. 8-62224 , Anmeldungs-Nr. Her 6-157,959). Dieser Spender (in der Figur nicht gezeigt) weist Folgendes auf: einen Satz von acht Düsen jeweils mit einer daran abnehmbar angebrachten Pipettenspitze, eine Ansaug-/Abgabeeinrichtung zum Ansaugen und Abgeben einer Flüssigkeit und einen Magnetkraftabschnitt, der imstande ist, ein Magnetfeld von der Außenseite eines Flüssigkeitskanals der an die Düse angebrachten Pipettenspitze anzulegen und davon zu entfernen. Ferner ist ein Bewegungsabschnitt vorgesehen, der imstande ist, den Spender und die Düsen des Spenders entlang Richtungen parallel und vertikal zu der Ebene eines Objekttischs zu bewegen.
Außerdem hat der Spender einen Steuerabschnitt zum Steuern des Ansaugens/Abgebens der Ansaug-/Abgabeeinrichtung, zum Steuern des Magnetfelds des Magnetfeldabschnitts und zum Steuern der Bewegung. Der Steuerabschnitt hat eine Verarbeitungseinrichtung, die in einem Computer enthalten ist, eine Ausgabeeinrichtung wie etwa einen Kathodenstrahlröhren- oder Flüssigkristall- usw. -Displayabschnitt oder einen Drucker oder dergleichen, einen Eingabeabschnitt wie etwa eine Tastatur oder eine Maus zum Einstellen und Steuern von verschiedenen Verarbeitungsvorgängen und Ausführen einer Dateneingabe und dergleichen und eine Leseeinrichtung oder dergleichen zum Lesen eines Aufzeichnungsträgers wie etwa einer Diskette, eines CD- oder MO-Aufzeichnungsträgers, auf dem ein Programm oder Daten aufgezeichnet sind, und einen Kommunikationsabschnitt zur Verbindung mit einem Kommunikationsnetz. Ferner wird ein Durchflusscytometer (in der Figur nicht gezeigt) zur Bestimmung der DNA-Sequenz verwendet.
Um die Sequenz von genetischem Material gemäß der vorliegenden Ausführungsform zu bestimmen, wird außerdem eine Suspension, wie sie nachstehend gezeigt ist, in einem Behälter gehalten.
Bei dieser Suspension werden eine Nachweis-Oligonucleotidgruppe als eine erste codierte Oligonucleotidgruppe, eine durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotidgruppe als eine zweite codierte Oligonucleotidgruppe und eine DNA-Ligase in einer Flüssigkeit suspendiert und vermischt und in einem Behälter gehalten. Dabei sind die Mengen (Dichte und Absolutmenge) des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids ungefähr identisch gemacht, um die Analyse zu erleichtern.
Die Nachweis-Oligonucleotidgruppe weist Nachweis-Oligonucleotide auf, die mindestens einen Basensequenztyp mit der Basenzahl 3 haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren, um die Basensequenzen sämtlicher Typen 4³ (=64) Typen für diese Basenzahl 3 abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie durch Codierung sortierbar sind, um dieses Oligonucleotid als eines zu identifizieren, das zu der Gruppe gehört. Ferner weist die durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotidgruppe durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotide auf, die mindestens einen Basensequenztyp mit der Basenzahl 3 haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren, um die Basensequenzen sämtlicher Typen 4³ (=64) Typen für diese Basenzahl 3 abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie aufgrund ihrer Bewegbarkeit durch eine Magnetkraftoperation als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu der Gruppe gehört. Ferner sind die Mengen jedes Typs von Nachweis-Oligonucleotid und von durch Magnetkraft steuerbarem Oligonucleotid ungefähr identisch gemacht, um die Analyse zu erleichtern.
Außerdem ist die DNA-Ligase ein Enzym, welches das Desoxyribosepaar, welches die Zucker des Endnucleotids der Basensequenz von zwei Oligonucleotiden ist, nur im Fall einer Situation differentiell bindet, in der die zwei Oligonucleotide an einem genetischen Einzelstrangmaterial hybridisiert sind und die Desoxyribosen unmittelbar benachbart sind, und die Basensequenzen für jede der drei Basen sind mit der Basensequenz dieses genetischen Materials komplementär.
Die Nachweis-Oligonucleotide weisen auf: einen nichtmagnetischen Carrier, mehrere eines Typs von diesem Oligonucleotid mit einer Basensequenz von drei an diesen Carrier gebundenen Basen und ein Fluoreszenzmaterial, das ein markiertes Material ist, das an einen Teil des Oligonucleotids an einer Position gebunden ist, die von der Position verschieden ist, an die der Carrier gebunden ist, und sämtliche an diesem Carrier festgehaltenen Fluoreszenzmaterialien weisen jeweils vorbestimmte Arten mit vorbestimmten Molverhältnissen auf, und die Codierung zur Identifizierung von 4³ (=64) Arten wird durch Ändern der Art und/oder des Molverhältnisses des Fluoreszenzmaterials ausgeführt. Was das Fluoreszenzmaterial angeht, werden dabei beispielsweise drei Arten für das Nachweis-Oligonucleotid verwendet, und drei Arten werden für das durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotid verwendet. Als Arten des Fluoreszenzmaterials gibt es beispielsweise FITC (Fluorescein-Isothiocyanat), Rhodamin, Isothiocyanat, IRD 40, CY 3, CY 5, Europiumkomplex und dergleichen.
Ferner weist das durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotid auf: einen magnetischen Carrier, mehrere eines Typs von diesem Oligonucleotid mit einer Basensequenz der drei an diesen Carrier gebundenen Basen und ein Fluoreszenzmaterial, das ein markiertes Material ist, das an einen Teil des Oligonucleotids an einer Position gebunden ist, die von der Position verschieden ist, an die der Carrier gebunden ist, und sämtliche an diesem Carrier festgehaltenen Fluoreszenzmaterialien weisen jeweils vorbestimmte Arten mit vorbestimmten Molverhältnissen auf, und die Codierung zum Identifizieren von 4³ (=64) Arten wird durch Ändern der Art und/oder des Molverhältnisses des Fluoreszenzmaterials ausgeführt. Dabei wird an dem zum Codieren verwendeten Oligonucleotid bevorzugt IMP (Inosinsäure: nicht an dem Purinring usw. angelagerte Aminogruppe oder Hydroxylgruppe) als ein Arm oder ein Spacer zwischen dem Carrier oder dem markierten Material vorgesehen, um dadurch ein Quenchen des Fluoreszenzmaterials zu verhindern.
Nachstehend wird eine Methode zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer Suspension zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach der vorliegenden Ausführungsform unter Bezugnahme auf 1 beschrieben.
Wie 1 zeigt, umfasst die Methode zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien in Schritt S1 das Extrahieren eines Ziel-DNA-Fragments aus einer Probe, beispielsweise einer Zelle oder von Bakterien usw. einer Person, für die eine Basensequenz der DNA zu bestimmen ist. Beim Extrahieren des Ziel-DNA-Fragments beispielsweise unter Verwendung des Spenders werden eine Bakterienkolonie, in die ein Vektor eingebracht worden ist, und eine DNA-Extraktionsflüssigkeit vermischt und solubilisiert. Dann werden durch Einmischen der magnetischen Teilchen unter Verwendung des Spenders Ziel-DNA-Fragmente einer vorbestimmten Base (Basen von einem bis mehreren Kilo) an den magnetischen Teilchen eingefangen. Wenn eine Suspensionsflüssigkeit, welche die magnetischen Teilchen enthält, welche die Ziel-DNA-Fragmente eingefangen haben, durch einen Flüssigkeitskanal des Spenders geleitet wird, werden diese durch Anlegen eines Magnetfelds an der Innenwand des Flüssigkeitskanals zum Anhaften gebracht und getrennt. Durch Saugen einer Reinigungslösung durch den Flüssigkeitskanal, wobei die magnetischen Teilchen an der Innenwand des Flüssigkeitskanals haften, werden dann die magnetischen Teilchen und die Ziel-DNA-Fragmente, die an den magnetischen Teilchen eingefangen sind, und der Flüssigkeitskanal gewaschen. Danach wird der Vektor eluiert, wobei die magnetischen Teilchen noch an der Innenwand des Flüssigkeitskanals haften.
Danach wird in Schritt S2 in dem Vektor, in den das extrahierte ringförmige (cyclische) Ziel-DNA-Fragment eingebaut ist, das ringförmige Ziel-DNA-Fragment zerschnitten. Dabei enthält der Vektor ein Plasmid, einen Bakteriophage oder dergleichen.
Der Schneideschritt umfasst: Einsaugen einer Flüssigkeit durch einen Flüssigkeitskanal des Spenders aus verschiedenen Halteabschnitten, in denen jeweils der Vektor gehalten wird, in den das Ziel-DNA-Fragment eingebaut ist, und eines vorbestimmten Reagenzes, Bewegen dieser zu einem Halteabschnitt, der eine Thermostatfunktion hat, und anschließendes Zerschneiden des abgegebenen ringförmigen Ziel-DNA-Fragments. Ferner gibt es als das vorbestimmte Reagenz beispielsweise Wasser, einen Schneidepuffer und ein Nick-Enzym.
In Schritt Sequenz wird der Flüssigkeit zum Suspendieren des so erhaltenen Ziel-DNA-Fragments Wärme zugeführt, und die Flüssigkeit wird dann rasch abgekühlt, um dadurch das Ziel-DNA-Fragment in einen Einzelstrang zu dissoziieren.
In Schritt S4 wird die Flüssigkeit, in der das so erhaltene Ziel-DNA-Fragment enthalten ist, in die Suspension eingebracht, und die Beiden werden suspendiert und vermischt. Dadurch wird für jede der drei Basen der Basensequenz des Einzelstrang-Ziel-DNA-Fragments das Nachweis-Oligonucleotid, das damit ungefähr komplementär ist, oder das durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotid hybridisiert. Über die Basensequenz dieses Ziel-DNA-Fragments werden also nur ein Typ oder zwei Typen von Nachweis-Oligonucleotiden, nur ein Typ oder zwei Typen von durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotiden oder eine Kombination des Nachweis-Oligonucleotids und des durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotids erhalten. Ferner sind in dieser Suspensionsflüssigkeit Ziel-DNA-Fragmente, die überhaupt nicht hybridisiert sind, oder durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotide, die nicht mit diesen Ziel-DNA-Fragmenten hybridisiert worden sind, oder Nachweis-Oligonucleotide in einem suspendierten Zustand.
Wenn ein Basensequenzpaar, das drei Basen der Nachweis-Oligonucleotide aufweist, oder die durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide, die mit dem Ziel-DNA-Fragment hybridisiert sind, benachbart sind, wird aufgrund des Verhaltens der DNA-Ligase dann, wenn jede der drei Basen mit der Basensequenz des Ziel-DNA-Fragments vollständig komplementär ist, das Desoxyribosepaar, das der Zucker des Endnucleotids dieses Oligo nucleotids ist, gebunden, und die Oligonucleotide jeder der sechs Basensequenzen werden erhalten.
Die zwei Oligonucleotide, die an den Ziel-DNA-Fragmenten hybridisiert sind, sind nicht notwendigerweise auf eine Kombination des Nachweis-Oligonucleotids und des durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotids beschränkt. Ferner ist das Basensequenzpaar nicht darauf beschränkt, dass es benachbart ist. Es ist jedoch ersichtlich, dass eine gewisse Wahrscheinlichkeit besteht, dass eine Kombination davon immer existiert.
2 zeigt ein Beispiel einer Kombination eines Nachweis-Oligonucleotids 12 und eines durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotids 11, die an einem Ziel-DNA-Fragment 10 hybridisiert sind, das in einer Suspensionsflüssigkeit existiert. 2(a) zeigt einen Fall, in dem die Basensequenz für jede der drei Basen des Nachweis-Oligonucleotids 12 und des durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotids 11 mit der Basensequenz des Ziel-DNA-Fragments 10 komplementär werden, und die Endbasen davon sind benachbart und hybridisiert. In diesem Fall bindet aufgrund des Verhaltens der Ziel-DNA-Ligase das Desoxyribosepaar, das der Zucker der zwei Endnucleotid ist, und ein Oligonucleotid mit sechs Basensequenzen wird erhalten.
Dagegen zeigt 2(b) den Fall, in dem die Basensequenz für jede der drei Basen des Nachweis-Oligonucleotids 12 und des durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotids 11 mit der Basensequenz des Ziel-DNA-Fragments nicht komplementär sind, und somit bindet das Desoxyribosepaar, das der Zucker der zwei Endnucleotide ist, nicht, obwohl die Endbasen benachbart und hybridisiert sind.
Die kleinen weißen Kreise in 2 zeigen die jeweiligen Basen. Ferner zeigen übereinanderliegende Kreise beispielsweise Materialien wie etwa IMP (Inosinsäure). Die schwarzen Kreise zeigen eine Base (SNP), die hinsichtlich des Ziel-DNA-Fragments 10S von 2(b) von dem Ziel-DNA-Fragment 10 von 2(a) verschieden ist.
Wie die Figur zeigt, sind, was das durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotid 11 angeht, die Mehrfach-Oligonucleotide eines Typs, welche die drei Basen 15 haben, über Arme 16 und Biotin 17 an ein magnetisches Teilchen 18, das der magnetische Carrier ist, gebunden. Die Oberfläche des magnetischen Teilchens ist mit einem Avidin zur differentiellen Bindung an das Biotin beschichtet. Ferner sind Fluoreszenzmaterialien 13 und 14, welche die markierten Materialien sind, an die Endnucleotide der Oligonucleotide eines Teils gebunden, um dadurch diese Oligonucleotide zu identifizieren. Das Nachweis-Oligonucleo tid 12 hat eine Struktur mit drei Basen 19 und bindet über einen Arm 20 an einen nichtmagnetischen Carrier, in der Figur nicht gezeigt.
Dabei sind die "Oligonucleotide eines Teils" 1 % oder weniger als 10 % sämtlicher Oligonucleotide, die von den magnetischen Teilchen 18 oder nichtmagnetischen Teilchen (in der Figur nicht gezeigt) gehalten werden. Ferner ist das Molverhältnis beispielsweise zu 0,25 %, 0,5 %, 0,75 % und 1,0 % (oder 2,5 %, 5,0 %, 7,5 % und 10,0 %) geändert, so dass für die jeweiligen Arten von Fluoreszenzmaterial dieses so codiert ist, dass vier Phasen identifiziert werden. Ferner sind dadurch, dass die Arten von Fluoreszenzmaterial, die für das Nachweis-Oligonucleotid und das durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotid verwendet werden, verschieden gemacht werden, diese dann jeweils sortierbar.
In Schritt S5 wird die gesamte Suspensionsflüssigkeit von dem Spender angesaugt und zu einem Inkubator überführt und abgegeben, der in einem konstanten Temperaturzustand gehalten wird, um so die Suspension zu erwärmen. Dadurch werden die Ziel-DNA-Fragmente zu einem Einzelstrang gemacht, so dass die Oligonucleotide, die an diesen Ziel-DNA-Fragmenten hybridisiert sind, dissoziiert werden. Dabei können dann, wenn, wie in 2(a) gezeigt ist, zwei Oligonucleotide durch die DNA-Ligase gebunden sind, Oligonucleotide mit sechs Basensequenzen erhalten werden. Wie jedoch in 2(b) gezeigt ist, werden beispielsweise sogar dann, wenn es zwei Oligonucleotide gibt, die hybridisiert sind, da diese nicht vollständig komplementär sind, in dem Fall, in dem diese nicht durch die DNA-Ligase gebunden sind, diese in der Suspension als ein unverändertes Oligonucleotid mit den drei Basensequenzen suspendiert. Infolgedessen existieren in dieser Phase für die Oligonucleotide, die Basensequenzen mit sechs Basen haben, nur Basensequenzen, die mit der Basensequenz des Ziel-DNA-Fragments vollständig komplementär geworden sind.
In Schritt S6 werden dann, wenn der Spender die Suspensionsflüssigkeit dadurch ansaugt, dass ein Magnetfeld an die Innenseite des Flüssigkeitskanals des Spenders angelegt wird, von den Oligonucleotiden nur diejenigen, welche die magnetischen Teilchen haben, an der Innenwand des Flüssigkeitskanals zum Anhaften gebracht und getrennt. Dann werden bei an der Innenwand des Flüssigkeitskanals haftenden Oligonucleotiden durch wiederholtes Ansaugen und Abgeben einer Reinigungslösung oder dergleichen die haftenden Oligonucleotide gewaschen. Dadurch können die einzelnen Nachweis-Oligonucleotide, die kein magnetisches Teilchen haben, oder diejenigen, deren Nachweis-Oligonucleotidpaar gebunden ist, oder die einzelnen Ziel-DNA-Fragmente oder Verunreinigungen usw. entfernt werden. Die gewaschenen Oligonucleotide, die noch an der Innenwand des Flüs sigkeitskanals des Spenders haften, werden dann zu einem anderen Behälter überführt, und durch wiederholtes Ansaugen und Abgeben in einem Zustand, in dem das Magnetfeld entfernt ist, werden die magnetischen Teilchen von der Innenwand des Flüssigkeitskanals entfernt und wieder in der Flüssigkeit suspendiert.
In der so erhaltenen Suspensionsflüssigkeit existieren einzelne durch Magnetkraft steuerbare Oligonucleotide, die gebundenen einzelnen durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide und die gebundenen durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide und die Nachweis-Oligonucleotide.
In Schritt S7 wird der Code der Oligonucleotide gelesen, indem diese Suspensionsflüssigkeit durch ein Rohr eines Durchflusscytometers geleitet wird. Das Rohr dieses Durchflusscytometers ist versehen mit: einer Lichtemissionseinrichtung zum Ausstrahlen von Licht einer konstanten Anregungswellenlänge, einer Lichtempfangseinrichtung zum Empfangen von Licht von dem angeregten Fluoreszenzmaterial, welches das Zielmaterial ist, und einem Analyseabschnitt zum Analysieren des empfangenen Lichts.
Um die einzelnen durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide und die gebundenen einzelnen durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide zu entfernen, sortiert der Analyseabschnitt nur die Substanzen mit den Arten von Fluoreszenzmaterialien, welche die Codes zum Identifizieren der Gruppe von Nachweis-Oligonucleotiden sind, und bezeichnet die Arten von Fluoreszenzmaterial, welche die Kombinationen der Codes sind. Dadurch werden die Kombinationen der Codes der durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide und die Nachweis-Oligonucleotide gelesen.
In Schritt S8 können die Basensequenzen der sechs Basenteile, die in dem Ziel-DNA-Fragment existieren, aus der Kombination der gelesenen Codes bestimmt werden. Diese Codekombination ist so bestimmt, dass die Basensequenzen der Ziel-DNA-Fragmente aufeinanderfolgend verbunden sind, und durch Bestimmen des Arrays können sämtliche Basensequenzen, die in der Ziel-DNA existieren, bestimmt werden. Wenn die Base des Ziel-DNA-Fragments länger als 4096 Basensequenzen ist oder wenn es ein Array gibt, das eine Wiederholung enthält, wird die Anzahl von Überlappungserscheinungen auf der Grundlage der Emssionsintensität bestimmt. Da das Licht durch eine Kombination von Codes von jeweils sechs Basen gemessen werden kann, kann dann gemäß dieser Ausführungsform die Messung mit hoher Zuverlässigkeit ausgeführt werden.
Nachstehend folgt eine Beschreibung einer Methode zum Durchmustern von SNPs nach der vorliegenden Ausführungsform unter Bezugnahme auf 3.
Bei dieser Methode zum Durchmustern von SNPs nach der vorliegenden Ausführungsform werden ebenfalls, wie vorstehend erwähnt, ein Spender, ein Bewegungsabschnitt, ein Steuerabschnitt, eine Objekttisch und ein Durchflusscytometer verwendet.
Um die Methode zum Durchmustern von SNPs nach dieser Ausführungsform auszuführen, werden zur Vereinfachung der Analyse die vorstehend erwähnten Suspensionen in der gleichen Menge (Dichte und Absolutmenge) und mit den gleichen Komponenten vorher in zwei separaten Behältern als eine erste Suspension und eine zweite Suspension hergestellt.
Wie 3 zeigt, ist diese Methode zum Durchmustern von SNPs eine Methode zum Bestimmen von SNPs (polymorphe Basensequenzen) durch Vergleichen von Basensequenzen eines ersten DNA-Fragments und eines zweiten DNA-Fragments, die jeweils aus zwei verschiedenen Proben, nämlich einer ersten Probe und einer zweiten Probe, extrahiert worden sind.
In Schritt S11 von 3 wird ein Vektor, in den ein erstes DNA-Fragment einer vorbestimmten Base eingebaut ist, aus der ersten Probe extrahiert, und in Schritt S21 wird ein Vektor, in den ein zweites DNA-Fragment einer vorbestimmten Base eingebaut ist, aus der zweiten Probe extrahiert. Das Extraktionsverfahren wurde bereits im Zusammenhang mit Schritt S1 erläutert. Da der Nachweise dann möglich ist, wenn mehrere SNPs in dem Fragment enthalten sind, und ein einzelner SNP in 300 bis 500 Basenpaaren existiert und eine einzelne bezeichnete Sechs-Basensequenz in durchschnittlich 4096 (=4⁶) Basenpaaren existiert, ist dabei "vorbestimmte Base" eine bis mehrere Kilobasen.
In Schritt S12 und Schritt S22 wird jedes von dem ringförmigen ersten DNA-Fragment und den ringförmigen zweiten DNA-Fragmenten zerschnitten. Die Methode dafür ist in dem vorstehend genannten Schritt S2 beschrieben.
In Schritt S13 und Schritt S23 wird der Flüssigkeit zum jeweiligen Suspendieren des ersten DNA-Fragments und des zweiten DNA-Fragments Wärme zugeführt, und die Flüssigkeit wird dann rasch abgekühlt, um den Doppelstrang zu einem Einzelstrang zu machen.
In Schritt S14 und Schritt S24 wird das so erhaltene erste DNA-Fragment in die erste Suspension eingebracht und suspendiert und vermischt, und das zweite DNA-Fragment wird in die zweite Suspension eingebracht und suspendiert und vermischt.
In Schritt S15 und Schritt S25 werden sämtliche jeweiligen Suspensionsflüssigkeiten von dem Spender angesaugt und zu einem Inkubator überführt und abgegeben, der in einem konstanten Temperaturzustand gehalten wird, um so die Suspension zu erwärmen. Dadurch werden das erste DNA-Fragment und das zweite DNA-Fragment zu Einzelsträngen gemacht.
In Schritt S16 und Schritt S26 werden dann, wenn der Spender jede der Suspensionsflüssigkeiten dadurch ansaugt, dass ein Magnetfeld an die Innenseite des Flüssigkeitskanals des Spenders angelegt wird, von den Oligonucleotiden nur diejenigen, welche die magnetischen Teilchen haben, an der Innenwand des Flüssigkeitskanals zum Anhaften gebracht und getrennt. Dann werden bei an der Innenwand des Flüssigkeitskanals haftenden Oligonucleotiden durch wiederholtes Ansaugen und Abgeben einer Reinigungslösung oder dergleichen die haftenden Oligonucleotide gewaschen. Dadurch können die einzelnen Nachweis-Oligonucleotide, die kein magnetisches Teilchen haben, oder diejenigen mit dem gebundenen Nachweis-Oligonucleotidpaar oder die ersten DNA-Fragmente oder Vereinreinigungen usw. entfernt werden. Die gewaschenen Oligonucleotide, die noch an der Innenwand des Spenders haften, werden dann zu einem anderen Behälter überführt und durch wiederholtes Ansaugen und Abgeben wieder in der Flüssigkeit suspendiert.
In Schritt S17 und Schritt S27 sortiert bei dem vorstehend genannten Verfahren unter Verwendung des Durchflusscytometers der Analyseabschnitt nur die Substanzen mit Fluoreszenzmaterialien, welche die Codes zum Identifizieren der Gruppe von Nachweis-Oligonucleotiden sind, um die einzelnen durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide und die gebundenen einzelnen durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide zu entfernen, und bezeichnet die Arten der Fluoreszenzmaterialien, welche die Kombinationen der Codes sind. Dadurch können die Kombinationen der Codes der durch Magnetkraft steuerbaren Oligonucleotide und der Nachweis-Oligonucleotide gelesen werden.
In Schritt S18 werden die Basensequenz des ersten DNA-Fragments und die Basensequenz des zweiten DNA-Fragments, die aus der Kombination der gelesenen Codes erhalten wurden, verglichen, und wenn es eine oder zwei oder mehr verschiedene Basen gibt, ist jede ein SNP. Beispielsweise gibt es für das aus der ersten Probe erhaltene erste Ziel-DNA-Fragment 10 die Basensequenz von 2(a). Wenn aus der Analyse des Codes je doch ersichtlich ist, dass für das aus der zweiten Probe erhaltene zweite Ziel-DNA-Fragment 10S das erste Ziel-DNA-Fragment 10 und die Base 21 verschieden sind, wird bestimmt, dass es an der Position der Basensequenz der Base 21 einen Polymorphismus gibt. Nach dieser Ausführungsform können die SNPs durch einfache Beobachtung von Unterschieden in dem Ligasereaktionsprodukt nachgewiesen werden, und somit kann das Resultat auf einfache und hoch zuverlässige Weise erhalten werden.
Diese Ausführungsformen sind speziell beschrieben, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, sie stellen jedoch keine Beschränkung hinsichtlich anderer Formen der Erfindung dar. Infolgedessen ist eine Modifikation innerhalb eines Rahmens möglich, in dem der Kern der Erfindung nicht geändert wird. Beispielsweise wurde gemäß der obigen Beschreibung für das DNA-Fragment die Fortpflanzung und Extraktion unter Verwendung eines Vektors ausgeführt, um das DNA-Fragment zu erhalten. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diesen Fall beschränkt, und die DNA kann beispielsweise durch Amplifikation mit einer PCR-Methode erhalten werden, die das Binden eines PCR-Primers an das extrahierte DNA-Fragment umfasst, oder es kann eine thermisch metamorphisierte Einzelstrang-DNA verwendet werden. Ferner kann durch Clonen ein Ziel-DNA-Fragment, das die gleiche Basensequenz hat, erhalten werden. Außerdem kann bei der Einzelstrangbildung anstelle des Verfahrens, welches das Erwärmen und anschließende rasche Abkühlen umfasst, eine alkalische Lösung zugegeben werden. In diesem Fall wird ein Puffer erforderlich.
In dem obigen Beispiel wird ein Oligonucleotid von 128 Typen, d. h. jeweils von 4³ Typen, die sämtlich drei Typen von vorbestimmten Basenzahlen sind, suspendiert. Wenn der Bereich dieser Typen jedoch eingeengt werden kann, können Oligonucleotide eines speziellen Typs (von speziellen Typen) suspendiert werden. Ferner ist für die vorbestimmte Basenzahl die Beschreibung nur für den Fall von drei erfolgt, es sind jedoch auch Fälle von drei oder mehr möglich.
Außerdem wird für das Enzym dann, wenn zwei Oligonucleotide dem Einzelstrang-Ziel-DNA-Fragment benachbart hybridisert werden, jede der drei Basen unterschieden, und zwei Oligonucleotide werden differentiell gebunden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diesen Fall beschränkt.
Ferner betrifft die Beschreibung den Fall, in dem bei der Bestimmung der Basensequenzen sechs Basensequenzen aus der Kombination der Codes dadurch bestimmt werden, dass die Codes der Oligonucleotide einzeln nacheinander gelesen werden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diesen Fall beschränkt, und durch Messen der Intensität der Fluoreszenz oder dergleichen für einige oder eine große Zahl von Oligonucleotidpaaren kann die Basensequenz bestimmt werden. Außerdem wird in den obigen Beispielen für das erste codierte Oligonucleotid eines verwendet, das einen nichtmagnetischen Carrier hat, es kann jedoch eines verwendet werden, das keinen Carrier hat. Ferner kann für das gesamte oder einen Teil davon eines verwendet werden, das Didesoxyribose aufweist. Außerdem kann anstelle der Verwendung des magnetischen Carriers in dem zweiten Oligonucleotid eines verwendet werden, das mittels Code sortiert werden kann.

Claims

Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien, wobei in der Flüssigkeit in einem Behälter enthalten sind: eine erste codierte Oligonucleotidgruppe, die erste codierte Oligonucleotide aufweist, die einen Basensequenztyp einer vorbestimmten Basenzahl haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren, um die Basensequenzen sämtlicher Typen oder spezieller Typen für die Basenzahl davon abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu dieser Gruppe gehört, eine zweite Oligonucleotidgruppe, die zweite codierte Oligonucleotide aufweist, die einen Basensequenztyp einer vorbestimmten Basenzahl haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren und von den ersten codierten Oligonucleotiden verschieden sind, um die Basensequenzen sämtlicher Typen oder spezieller Typen für die Basenzahl davon abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu dieser Gruppe gehört, und ein Enzym, das die zwei Oligonucleotide über eine Desoxyribose, die ein Zucker des Endnucleotids davon ist, nur im Fall einer Situation differentiell bindet, in der die zwei codierten Oligonucleotide an einem genetischen Einzelstrangmaterial hybridisiert sind und die Endnucleotide der Basensequenz davon unmittelbar benachbart sind, und die Basensequenz der vorbestimmten Basenzahl eine konstante Beziehung mit der Basensequenz dieses genetischen Materials ist.
Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach Anspruch 1, wobei die jeweiligen ersten codierten Oligonucleotide so codiert sind, dass sie als diejenigen sortierbar sind, die zu ihrer Gruppe gehören, und die jeweiligen zweiten codierten Oligonucleotide so vorgesehen sind, dass sie an magnetischen Teilchen festgehalten werden, die von einem Magnetfeld ferngesteuert werden, so dass sie als diejenigen sortierbar sind, die zu ihrer Gruppe gehören.
Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die vorbestimmte Basenzahl der jeweiligen ersten codierten Oligonucleotide und der zweiten codierten Oligonucleotide mindestens drei Basen ist, und die erste codierte Oligonucleotidgruppe mindestens 4³ Typen von ersten codierten Oligonucleotiden aufweist, die durch Ersetzen der jeweiligen Basen der drei Basen erhalten sind, und die zweite codierte Oligonucleotidgruppe mindestens 4³ Typen von zweiten codierten Oligonucleotiden aufweist, die durch Ersetzen der jeweiligen Basen der drei Basen erhalten sind.
Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Enzym DNA-Ligase ist und das Desoxyribosepaar, das der Zucker des Endnucleotids ist, nur im Fall einer Situation differentiell bindet, in der das Endnucleotidpaar einer Basensequenz, die drei oder mehr Basen von zwei codierten Oligonucleotiden aufweist, die an ein genetisches Einzelstrangmaterial hybridisiert worden sind, unmittelbar benachbart ist, und die Basensequenzen der Oligonucleotide mit der Basensequenz dieses genetischen Materials komplementär sind.
Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die jeweiligen ersten codierten Oligonucleotide, die zu der ersten codierten Oligonucleotidgruppe gehören, ein Oligonucleotid eines Typs aufweisen, der eine vorbestimmte Basensequenz und markiertes Material hat, das an das Oligonucleotid gebunden ist, und wobei das markierte Material vorbestimmte Arten mit jeweiligen vorbestimmten Molverhältnissen aufweist, und die Codierung durch Ändern der Art und/oder des Molverhältnisses des markierten Materials ausgeführt wird.
Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach Anspruch 5, wobei bei sämtlichen oder einem Teil der ersten codierten Oligonucleotide, die zu der ersten codierten Oligonucleotidgruppe gehören, ein freies Ende davon markierte Didesoxyribose hat.
Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei jedes von den ersten codierten Oligonucleotiden, die zu der ersten codierten Oligonucleotidgruppe gehören, aufweist: einen nichtmagnetischen Carrier, mehrere Oligonucleotide eines Typs, die eine vorbestimmte Basensequenz haben und an den Carrier gebunden sind, und markierte Materialen, die an einen Teil der Oligonucleotide an einer Position gebunden sind, die von der Position verschieden ist, an die der Carrier gebunden ist, oder an den Carrier an einer Position gebunden sind, die von der Position verschieden ist, an die das Oligonucleotid gebunden ist, und sämtliche der genannten markierten Materialien vorbestimmten Arten mit jeweiligen vorbestimmten Molverhältnissen aufweisen, und wobei die Codierung durch Ändern der Art und/oder des Molverhältnisses des markierten Materials ausgeführt wird.
Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei jedes von den zweiten codierten Oligonucleotiden, die zu der zweiten codierten Oligonucleotidgruppe gehören, aufweist: einen magnetischen Carrier, mehrere Oligonucleotide eines Typs, die eine vorbestimmte Basensequenz haben und an den Carrier gebunden sind, und markierte Materialen, die an einen Teil der Oligonucleotide an einer Position gebunden sind, die von der Position verschieden ist, an die der Carrier gebunden ist, oder an den Carrier an einer Position gebunden sind, die von der Position verschieden ist, an die das Oligonucleotid gebunden ist, und sämtliche der genannten markierten Materialien vorbestimmten Arten mit jeweiligen vorbestimmten Molverhältnissen aufweisen, und wobei die Codierung durch Ändern der Art und/oder des Molverhältnisses des markierten Materials ausgeführt wird.
Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das Oligonucleotid an den Carrier oder das markierte Material über einen Arm gebunden ist.
Verfahren zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien, das aufweist: einen Konjugationsschritt zum Einbringen und Aufnehmen in die bzw. der Flüssigkeit, wobei in der Flüssigkeit in einem Behälter enthalten sind: eine erste codierte Oligonucleotidgruppe, die erste codierte Oligonucleotide aufweist, die einen Basensequenztyp einer vorbestimmten Basenzahl haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren, um die Basensequenzen sämtlicher Typen oder spezieller Typen für die Basenzahl davon abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu dieser Gruppe gehört, eine zweite codierte Oligonucleotidgruppe, die zweite codierte Oligonucleotide aufweist, die einen Basensequenztyp einer vorbestimmten Basenzahl haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren und von den ersten codierten Oligonucleotiden verschieden sind, um die Basensequenzen sämtlicher Typen oder spezieller Typen für die Basenzahl davon abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu dieser Gruppe gehört, und ein Enzym, das die zwei Oligonucleotide über eine Desoxyribose, die ein Zucker des Endnucleotids davon ist, nur im Fall einer Situation differentiell bindet, in der die zwei codierten Oligonucleotide an einem genetischen Einzelstrangmaterial hybridisert sind und die Endnucleotide der Basensequenz davon unmittelbar benachbart sind, und die Basensequenz der vorbestimmten Basenzahl eine konstante Beziehung mit der Basensequenz dieses genetischen Materials ist, ein genetisches Zielmaterial eines Einzelstrangs einer vorbestimmten Base, die ausreichend größer als die vorbestimmte Basenzahl ist, zum Hybridisieren des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids an dem genetischen Zielmaterial; einen Dissoziationsschritt, um das genetische Zielmaterial, welches das erste codierte Oligonucleotid oder das zweite codierte Oligonucleotid eingefangen hat, wieder in einen Einzelstrang zu dissoziieren; einen Sortierschritt zum Sortieren von Paaren des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids aus der Flüssigkeit; und einen Bestimmungsschritt zum Bestimmen der Basensequenz des genetischen Ziel materials auf der Grundlage einer Kombination des Codes zum Identifizieren der Basensequenz, die das sortierte erste codierte Oligonucleotid zeigt, und eines Codes zum Identifizieren der Basensequenz, die das zweite codierte Oligonucleotid zeigt.
Verfahren zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach Anspruch 10, wobei in dem Konjugationsschritt die ersten codierten Oligonucleotide so codiert werden, dass sie als diejenigen sortierbar sind, die zu ihrer Gruppe gehören, und die zweiten codierten Oligonucleotide so vorgesehen werden, dass sie an magnetischen Teilchen festgehalten werden, die von einem Magnetfeld ferngesteuert werden, so dass sie als diejenigen sortierbar sind, die zu ihrer Gruppe gehören, und wobei der Sortierschritt einen Trennungsschritt aufweist, um die zweiten codierten Oligonucleotide durch Magnetfeldoperation zu trennen.
Verfahren zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien unter Verwendung einer Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien nach einem der Ansprüche 10 und 11, wobei dann, wenn die zweiten codierten Oligonucleotide magnetische Teilchen als den Carrier haben, der Sortierschritt verwendet: einen Spender, der einen Flüssigkeitskanal hat, einen magnetischen Abschnitt zum Anlegen und Entfernen eines Magnetfelds von außen an den bzw. von dem Flüssigkeitskanal und einen Drucksteuerabschnitt zum Steuern eines Drucks im Inneren des Flüssigkeitskanals, um eine Flüssigkeit anzusaugen und abzugeben, und zum Anlegen oder Entfernen eines Magnetfelds von außen an den bzw. von dem Flüssigkeitskanal; wobei die magnetischen Teilchen, welche die zweiten codierten Oligonucleotide haben, an die Innenwand des Flüssigkeitskanals angezogen oder davon getrennt werden.
Verfahren zum Hochgeschwindigkeitsdurchmustern von SNPs unter Verwendung einer Flüssigkeit zum Bestimmen der Sequenz von genetischen Materialien, das aufweist: einen Konjugationsschritt zum Herstellen von zwei ungefähr identischen Flüssigkeiten, wobei in der Flüssigkeit in einem Behälter enthalten sind: eine erste codierte Oligonucleotidgruppe, die erste codierte Oligonucleotide aufweist, die einen Basensequenztyp einer vorbestimmten Basenzahl haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren, um die Basensequenzen sämtlicher Typen oder spezieller Typen für die Basenzahl davon abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu dieser Gruppe gehört, – eine zweite codierte Oligonucleotidgruppe, die zweite codierte Oligonucleotide aufweist, die einen Basensequenztyp einer vorbestimmten Basenzahl haben und so codiert worden sind, dass sie die Basensequenz davon identifizieren und von den ersten codierten Oligonucleotiden verschieden sind, um die Basensequenzen sämtlicher Typen oder spezieller Typen für die Basenzahl davon abzudecken, und die jeweils so vorgesehen sind, dass sie als ein Oligonucleotid sortierbar sind, das zu dieser Gruppe gehört, und ein Enzym, das die zwei Oligonucleotide über eine Desoxyribose, die ein Zucker des Endnucleotids davon ist, nur im Fall einer Situation differentiell bindet, in der die zwei codierten Oligonucleotide an einem genetischen Einzelstrangmaterial hybridisiert sind und die Endnucleotide der Basensequenz davon unmittelbar benachbart sind, und die Basensequenz der vorbestimmten Basenzahl eine konstante Beziehung mit der Basensequenz dieses genetischen Materials ist, und zum Einbringen und Aufnehmen eines durch Extraktion aus einer ersten Probe erhaltenen ersten genetischen Zielmaterials eines Einzelstrangs einer vorbestimmten Base in das eine bzw. dem einen davon, und zum Einbringen und Aufnehmen eines durch Extraktion aus einer zweiten Probe erhaltenen zweiten genetischen Zielmaterials eines Einzelstrangs einer vorbestimmten Base in das bzw. dem anderen davon, und zum Hybridisieren des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids an jeweiligen Zielmaterialien, einen Dissoziationsschritt, um das genetische Zielmaterial, das jedes von dem ersten codierten Oligonucleotid oder dem zweiten codierten Oligonucleotid eingefangen hat, wieder in einen Einzelstrang zu dissoziieren; einen Sortierschritt zum Sortieren des ersten codierten Oligonucleotids und des zweiten codierten Oligonucleotids aus der Flüssigkeit; und einen Bestimmungsschritt zum Bestimmen der Basensequenz des genetischen Zielmaterials auf der Grundlage von jedem von einer Kombination des Code zum Identifizieren der Basensequenz, die das sortierte erste codierten Oligonucleotid zeigt, und eines Codes zum Identifizieren der Basensequenz, die das zweite codierte Oligonucleotid zeigt; und einen Identifizierungsschritt zum Ausführen einer Identifizierung von Einzelnucleotidpolymorphismen durch Vergleichen von für das erste genetische Zielmaterial bestimmten Basensequenzen und von für das zweite genetische Zielmaterial bestimmten Basensequenzen.