WO2001027320A1

WO2001027320A1 - Systeme de suspension pour le sequençage d'une substance genetique, procede de sequençage d'une substance genetique mettant en oeuvre ledit systeme de suspension et procede d'identification des polymorphismes nucleotidiques uniques (snp) au moyen dudit systeme de suspension

Info

Publication number: WO2001027320A1
Application number: PCT/JP2000/007050
Authority: WO
Inventors: Mitsuo Itakura; Hideji Tajima
Original assignee: Precision System Science Co., Ltd.
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2001-04-19
Also published as: US7029882B1; DE60035357D1; JP2001103970A; EP1221491A4; JP3668075B2; EP1221491B1; EP1221491A1; DE60035357T2; EP1221491B8

Description

明細書遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いた S NPs 高速スコアリング方法

技術分野

本発明は、遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いた S N P s 高速スコアリング方法に関し、詳しくは、 DN A断片等の遺伝物質の塩基配列や、 S NPs の特定を行うための遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いた S NPs 高速スコアリング方法に関する。

本発明は、農学、工学、薬学、医学、心理学または化学若しくは生物学等の理学等の分野で、遺伝子の塩基配列の決定や操作や、医療、薬品、生理衛生、保健、生物または食品等の種々の領域において、遺伝物質の塩基配列の決定や、遺伝物質の塩基配列とヒトを含む種々の生物の形態、構造、性質、体質、病気、薬剤に対する感受性、気質、性格等との関係の解明に利用することができるものである。背景技術

従来、「ありふれた病気」の疾患感受性遺伝子の同定と薬剤に対する感受性を決定する S NPs (single nucleotid polymorphisms, 単一のヌクレオチド多型）を特定するために、全ゲノムにわたる高効率 S N Ps 検出のスコァリングシステムの開発が急務であった。現時点では、高効率で S NP sを検出スコアリングするシステムは開発段階にあり、ハイブリダィゼーシヨンの原理に基づくいわゆる D N Aチップが予備的に検討されているにすぎないところで、 D N Aチ''ノプは、半導体膜やスライドグラス等の平板にスボッ卜された既知のひとつの S NPに対し、この S NPを含む 1 0種類以上のォリゴヌクレオチドアレイを準備し、これらに P C R増幅した D N A断片がハイブリダイズするか否かにより S N P sを検出する Af f i me t r i x社等によるシステムが既に実用化されている。

しかし、この D N Aチップを用いた方法は、機器とランニングコストが高価であるという問題点を有していた。また、 D N Aチップは、ハイブリダィゼーション反応が非特異的物理化学反応であるために、このような複数ォリゴヌクレオチドを利用した重複性（ redundancy) のあるシステムが必要であり、このシステ厶を用いたとしても約 1 0 %の誤り判定が生ずるという問題点をも有していた。

本発明は以上の課題を解決することを目的としてなされたものであり、その第一の目的は、従来のいわゆる D N Aチップ等の方法で行われている、スライドグラスのスボッ卜内の限られた狭い平面上のハイブリダイゼ一シヨン反応ではなく、微小粒子（ビーズ）を用いることによって、反応面積を増加させ液体内での反応を促進させ、反応効率を飛躍的に上昇させて平衡に達するまでの時間を短縮させることができる遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いた S N P s 高速スコアリング方法を提供することである。

第 2の目的は、塩基配列を特異的に認識する酵素反応の高い特異性を用いることによって、重複性を必要とせず確実に塩基配列をスコアリングすることができる遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シ一ケンス決定方法およびその懸濁系を用いた S N P s 高速スコアリング方法を提供することである。

第 3の目的は、スライドグラス上に固定化したォリゴヌクレオチドの位置に基づいて配列を決定するのではなく、コード化した多種類のビーズを用いることによって同一条件で一括して反応を進めることによって決定するものであり、高速かつ信頼性高い遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いた S N P s 高速スコアリング方法を提供することである。発明の開示

以上の目的を達成するために、第一の発明は、所定塩基数の 1種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第 1のコード化ォリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群と、所定塩基数の 1種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第 2のコ一ド化ォリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第 2のコード化オリゴヌクレオチド群と、 2つのコード化オリゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイプリダイズされてその塩基配列の末端ヌクレオチドが直接に隣接する場合であって、かつ、前記所定塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と一定の関係にある場合にのみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボースを介して 2つのォリゴヌクレオチド同士を特異的に結合させる酵素とを容器内の液に懸濁させたものである。

ここで、「遺伝物質」は、主として D N A (断片）であるが、 R N A (断片）を含めることもできる。「塩基」とは、 D N Aではチミン（T ) 、シ卜シン（C ) 、アデニン（A ) 、グァニン（G ) であり、 R N Aの場合は、チミンの代わりにゥラシル（U ) を入れたものである。「特定種類」としたのは、その標的遺伝物質の塩基配列が大雑把にある程度知られている場合には、全種類の塩基配列でなくても、その種類をある程度絞り込むことができるかりである。

「選別可能となるように設ける」やり方としては、 2つのグループ自体を識別できるように標識物質でコード化を行うことによって、 2つのグループで用いる標識物質の種類を異ならせることによって、または、一方のグルーフのコ一ド化才リゴヌクレオチドに、遠隔操作可能な担体を有するように設け、そのグループを遠隔操作によって任意の位置に移動可能とすることによつて選別可能とするような場合がある。「遠隔操作可能化」としては、例えば、磁性粒子をオリゴヌクレオチドに具備させることにより、磁場操作によつて遠隔操作可能にしたり、荷電粒子をォリゴヌクレオチドに具備させることにより、またはォリゴヌクレオチド自体に電荷を帯びさせて電場によって遠隔操作可能にする場合がある。

「コード化」は、例えば、蛍光等の発光物質や、放射性物質等の標識物質を用いて、標識物質の種類および/またはその量比を変えることによって行う。また、「コード化オリゴヌクレオチド」は、例えば、 1本のオリゴヌクレオチドに種々の標識物質をアダプタを介して結合することによって、または、第七の発明または第八の発明のように 1種類の多数のォリゴヌクレオチドと標識物質を担体に保持させることによって行う。第七の発明や第八の発明のように標識物質は多数のォリゴヌクレオチドの一部にのみ分配して結合するのが好ましい。

第 1のオリゴヌクオしォチドのコ一ド化に用いる標識物質の種類と、第 2 のォリゴヌクオチドのコ一ド化に用いる標識物質の種類は、異ならせるのが解析上妥当である。この場合には、コード化のみによって第 1のオリゴヌクレオチド群と第 2のォリゴヌクレオチド群とは選別されることになる。

「酵素」には、例えば、 D N Aリガ一ゼ（D N A連結酵素）のようにオリゴヌクレオチド同士が直接隣接する場合にそれらを結合する酵素がある。「一定の関係」とは、例えば、相補的な関係または同一の関係等である。

第一の発明では、一本鎖化した遺伝物質とハイプリダイスした各オリゴヌクレオチドの前記所定塩基数について、その遺伝物質と一定の関係がある場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボース同士を特異的に結合させる酵素を有するようにしている。したがって、この懸濁系の中に、塩基配列を知ろうとする標的の一本鎖の遺伝物質を投入して懸濁させることによって、この塩基配列と一定の関係のあるオリゴヌクレオチドのみが結合することができる。そのため、一本鎖の遺伝物質を解離させるとともに、このオリゴヌクレオチドの対のコードを読むことによって、前記所定塩基数の塩基配列から、標的遺伝物質を高い信頼性をもって知ることができる。

さらに、第一の発明によれば、所定塩基数の塩基配列をもつコード化された第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群および第 2のコード化ォリゴヌクレォチド群の 2つのグループを用いるとともに、遺伝物質と一定の関係がある場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボース同士を特異的に結合させる酵素を用いている。したがって、 D N Aチップのように単にハィブリダイゼーシヨンを利用して、相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を得る場合に比較して、より高い信頼性で、かつ容易に遺伝物質のシーケンスを決定することができる。

また、 S N P s を特定するために塩基配列の種々の態様のオリゴヌクレオチドを D N Aチップに固定するという加工作業を行うことなく、種々の塩基配列をもつォリゴヌクレオチドを懸濁させるという作業によって、簡単かつ容易に塩基配列を決定することができる。

さらに、本発明では、スライドグラス等の平板上のスポット内の限られた狭い平面上のハイプリダイゼーション反応ではなく、懸濁系内の広い範囲内で、反応を行うことができるので、反応効率を飛躍的に上昇させ、平衡に達するまでの時間を短縮することができる。

また、スライドグラス上に固定化したオリゴヌクレオチドの位置によりその配列を区別する方法と異なり、コード化した多種類のォリゴヌクレオチドは同一の反応液の中に共存するので、同一条件下で一括して反応を進めることができる。

なお、本発明では、長い塩基配列を一挙に決定するのではなく、酵素が特異的結合を行うために認識できる短い塩基配列を繰り返して適用することによって、長い塩基配列を決定するようにしている。したがって、決定に使用する第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群と第 2のォリゴヌクレオチド群で必要とする塩基配列の種類は、これらの塩基数の和に相当する塩基配列の決定に必要とするオリゴヌクレオチドの種類数に比べて非常に小さくて済むので、これらのコード化の作業が容易である。例えば、前述した実施の形態では、全塩基配列種類数は 6 4 + 6 4の 1 2 8あれば足りる。一方、 6塩基配列についてのォリゴヌクレオチドを用意しょうとすると、 4 ⁶ = 4 0 9 6種類のものを用意する必要があり、塩基配列の種類は圧倒的に少なくて済む。第二の発明は、前記発明において、前記各第 1のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに、前記各第 2のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能としたものである。

第二の発明によれば、磁場を分注機のノズル等の液通路内に及ぼすことによって、分離することができるので、磁性粒子を有していないコード化オリゴヌクレオチドを排除することができるので、磁性粒子を有しているコード化ォリゴヌクレオチドを容易かつ確実に選別することができる。

第三の発明は、前記各発明において、前記各第 1のコード化ォリゴヌクレ才チドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドの前記所定塩基数は、少なくとも 3塩基であり、第 iのコード化オリゴヌクレオチド群は、その 3塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも 4 ³ 種類の第 1のコード化ォリゴヌクレオチドを包含し、第 2のコード化ォリゴヌクレオチド群は、その 3塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも 4 ³ 種類の第 2のコード化才リゴヌクレオチドを包含するものである。

解析上、好ましくは、第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群と、第 2のコ ―ド化ォリゴヌクレオチド群の各量（濃度および絶対量）は略同一であり、また、これらの各群における各種類ごとの量も略同一である。

第四の発明は、前記各発明において、前記酵素は、 D N Aリガーゼであつて、一本鎖の遺伝物質にハイプリダイズされた 2つのコード化ォリゴヌクレォチドの 3塩基以上からなる塩基配列の末端ヌクレオチド同士が直接に隣接する場合であって、かつ、前記ォリゴヌクレオチドの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補的である場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボース同士を特異的に結合させるものである。

ここで、「相補的」とは、 2本鎖を構成する D N Aにおいて、互いに塩基対を形成し得るような関係である。 D N Aにおける塩基対は、アデニンとチミン、シトシンとグァニンであり、 R N Aにおける塩基対は、ァデニンとゥラシル、シトシンとグァニンである。

第三の発明および第四の発明では、前記各第 1のコード化ォリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化オリゴヌクレオチドの所定塩基数は、少なくとも 3塩基である。したがって、第 1のコード化オリゴヌクレオチド群および第 2のコ一ド化ォリゴヌクレオチド群の種類は各々 4 ³ 種類で足りるので、 6 塩基をもつオリゴヌクレオチドのように 4 0 9 6種類を用意する必要がないので、圧倒的に小さい種類のものを用意すれば足りるので、作業が容易である。

第五の発明は、前記各発明において、前記第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群に属する各第 1のコード化ォリゴヌクレオチドは、所定の塩基配列をもつ 1種類のォリゴヌクレオチドと、そのォリゴヌクレオチドと結合した標識物質とからなり、その標識物質は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は標識物質の種類および/またはその量比を変えることによつ第五の発明によれば、種類および/または量比を変えた標識物質をォリゴヌクレオチドに結合させることによってコード化したものである。本発明によれば、遺伝物質に応じて、数珠繫ぎに連結したオリゴヌクレオチドを得ることができる。

第六の発明は、前記各発明において、前記第 iのコード化オリゴヌクレオチド群に属する第 1のコード化ォリゴヌクレオチドの全部または一部について、その遊離末端に標識化されたジデォキシリボースを有しているものである。

ここで、「遊離末端」とは、オリゴヌクレオチドの末端のうち、他のオリゴヌクレオチドと結合しない末端、すなわち、標識物質が結合する末端をいう。第 1のコード化オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端に標識化したジデォキシリボースを結合させる。ジデォキシリボースを含ませることによって、その後にどのようなオリゴヌクレオチドが隣接しても結合を引き起こすことがない。

したがって、第 1のコード化ォリゴヌクレオチドの全部にジデォキシリボースを含ませるとともに、第 2のコード化オリゴヌクレオチドについても全部にジデォキシリボースを同様に含ませたり、または第 2のコード化ォリゴヌクレオチドが担体を有するような場合には、第 1のコード化才リゴヌクレォチドと第 2のオリゴヌクレオチドが 1個ずつ（前記所定塩基数ずつ）連結した二量体のみが得られることになる。これによつて、塩基数列を揃えることができるので、例えば、発光物質によってコード化されている場合にはコ — ドの読取りを確実かつ容易に行うことができる。

また、第 1のコード化オリゴヌクレオチドの一部にジデォキシリボースを含ませた場合には、第 1のコード化オリゴヌクレオチドが 1個、 2個、 3個、それ以上と多数結合して最後にジデォキシリボースが含まれた第 1のコード化ォリゴヌクレオチドが結合した結合体を同定することができる。これによって、 D N Aシーケンスを簡単に読み取ることができる。

第六の発明によれば、全部にジデォキシリボースを設けた場合には第 1のコード化ォリゴヌクレオチドと第 2のォリゴヌクレオチドが I個ずつ（前記所定塩基数ずつ）連結した二量体のみが得られることになる。これによつて、塩基数列を揃えることができるので、例えば、発光物質によってコード化されている場合にはコードの読取りを確実かつ容易に行うことができる。また、一部にジデォキシリボースを設けた場合には第 1のコード化ォリゴヌクレオチドが 1個、 2個、 3個、それ以上と多数結合して最後にジデォキシリボースが含まれた第 1 のコード化ォリゴヌクレオチドが結合した結合体を同定することができる。これによつて、 D N Aシーケンスを比較的簡単に読み取ることができる。

第七の発明は、前記各発明において、前記第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群に属する各第 1のコ一ド化ォリゴヌクレオチドは、 1個の非磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ多数の 1種類のォリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部にまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および/または量比を変えることによつて行われたものである。

ここで、各ォリゴヌクレオチドの担体との結合は、例えば、ォリゴヌクレォチドと特異的に結合する結合物質を担体にコーティングすることによって行う。これらの結合物質には、例えば、ピオチンとアビジンの組み合わせがある。

第八の発明は、前記各発明において、前記第 2のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第 2のコード化オリゴヌクレオチドは、 1個の磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ 1種類の多数のォリゴヌクレォチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部とまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体と結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および/または量比を変えることによって行われたものである。

第七の発明および第八の発明は、非磁性または磁性の担体にォリゴヌクレォチドを担持させ、一部のォリゴヌクレオチドまたは担体に結合する標識物質の種類および/または量比を変えることによってコード化を行うものである。したがって、例えば、数十〜数百程度の多種類の塩基配列を、確実明瞭にコード化して識別することができる。さらに、微小粒子等の担体の表面上で反応させることにより反応面積が増加し、反応効率を飛躍的に上昇させることができる。

第九の発明は、前記各発明において、前記オリゴヌクレオチドは、ァ一厶を介して担体または標識物質と結合したものである。

第九の発明は、アームを介してォリゴヌクレオチドを担体または標識物質と結合したものである。本発明によれば、標識物質間がより一層離れることになるので、クェンチング（消光）を有効に防止することができるので、高 t、信頼性で塩基配列を決定することができる。

第十の発明は、第一の発明ないし第九の発明のいずれかの懸濁系に、前記所定塩基数よりも十分に大きい所定ベースの一本鎖の標的遺伝物質を投入懸濁させて、前記標的遺伝物質に前記第 1のコード化ォリゴヌクレオチドおよび第 2のコ一ド化ォリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程と、第 1のコード化オリゴヌクレオチドまたは第 2のコ一ド化ォリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液中から、第 1のコード化オリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化オリゴヌクレオチドの対を選別する選別工程と、選別された第 1のコード化ォリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第 2のコ一ド化ォリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程とを有しているものである。

ここで、選別工程は、コード化が、蛍光等の発光物質で行われている場合には、例えば、フローサイ卜メーターを用いて、第 1のコード化ォリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドの発光波長の対が存在する場合のみそのオリゴヌクレオチド対を選別する。また、第 1および第 2のグループの一方のコード化ォリゴヌクレオチドが磁性粒子を有する場合には、液通路内に外部から磁場を及ぼすことによってォリゴヌクレオチドを液通路内壁に吸着して分離して選別し、かつ、フローサイトメ一夕一によつて該当する発光波長が存在する場合のみを選別する。または、フローサイトメ一夕一によつて、各波長の発光強度を考慮することにより重複出現数を決定するようにしても良い。

第十の発明によると、既に第一の発明で説明した効果を奏する。

第 H ^—の発明は、前記発明において、前記対合工程において、前記第 1のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに、前記各第 2のコード化ォリゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能であり、前記選別工程は、磁場操作によって第 2のコード化ォリゴヌクレオチドを分離する分離工程を有しているものである。

第 "—の発明によれば、既に第二の発明について説明した効果を奏する。第十二の発明は、前記各発明において、第 2のコード化オリゴヌクレオチドが担体として磁性粒子を有している場合には、前記選別工程は、液通路、その液通路に外部から磁場を及ぼしかつ除去する磁力部、およびその液通路内の圧力を制御して流体の吸引および吐出を行う圧力制御部を有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによって

、前記第 2のコード化オリゴヌクレオチドが有する前記磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱するものである。

第十二の発明によれば、液通路および磁力部等を有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによって、塩基配列の決定を、自動的、効率的かつ迅速に一貫して行うことができる。

第十三の発明は、第一の発明ないし第九の発明のいずれかの 2つの略同一の懸濁系を用意し、その一方に、第一の試料から抽出して得られた所定べ一スの一本鎖の第一の標的遺伝物質を投入懸濁させ、他方に、第二の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第二の標的遺伝物質を投入懸濁させ、各標的物質に前記第 1のコード化オリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドをハイプリダイズさせる対合工程と、各々、第 1のコ一ド化ォリゴヌクレオチドまたは第 2のコード化ォリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液中から、第 1のコード化オリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレォチドを選別する選別工程と、各々、選別された第 1のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第 2のコ一ド化ォリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程と、前記第一の標的遺伝物質について決定された塩基配列と、前記第二の標的遺伝物質について決定された塩基配列とを比較することによって S N P s の同定を行う同定工程と、を有するものである。ここで、「略同一」とは、少なくとも構成要素とその量（濃度および絶対量）とが略同一であることを意味する。なお、第七の発明で用いた第 1のコ一ド化ォリゴヌクレオチドと第八の発明で用いた第 2のコード化オリゴヌクレオチドについては、町田雅之氏およびプレシジョン · システム . サイエンス（ P S S ) 株式会社等が出願中の特許出願（特願平 1 0— 2 0 6， 0 5 7号）および国際出願（P C T / J P 9 9 / 0 3 8 2 4 ) の発明を利用したものである。第十三の発明においては、既に第一の発明で説明した効果を奏するといえ

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の実施の形態に係る遺伝物質シーケンス決定方法を示す流れ図である。

図 2は、本発明の実施の形態に係る標的 D N A断片にハイブリダィズされたオリゴヌクレオチドを示す概念図である。

図 3は、本発明の実施の形態に係る S N P s のスコアリング方法を示す流れ図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の実施の形態に係る遺伝物質シーケンス方法について、図 1および図 2に基づいて説明する。その実施の形態は特に指定がない限り本発明を制限するものではない。

本実施の形態に係る方法は、次のような分注機（P S S株式会社が特許出願中、出願番号：特願平 6 _ 1 5 7， 9 5 9号および特顧平 7— 3 9 , 4 2 5 号）を利用したものである。その分注機（図示せず）は、着脱自在にピぺッ卜チップが各々揷着される 8連のノズルと、液体の吸引吐出を行う吸引吐 20 出機構と、そのノズルに挿着したピぺッ卜チップの液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することが可能な磁力部とを有するものである。また、その分注機および分注機のノズルをステージの平面に平行および上下方向に沿つて移動可能な移動部を有しているものである。

また、この分注機は前記吸引吐出機構の吸引吐出の制御や、磁力部の磁場の制御、および移動制御を行うための制御部を有する。制御部には、コンビユータを内蔵する処理手段と、 C R T、液晶等の表示部やプリン夕等の出力手段と、種々の処理手順の設定や指示、データの入力等を行うためのキーボード、マウス、フロッピ一、 C Dや M O等のプログラムやデータが記録された記録媒体を読み取る読取装置等の入力手段と、通信網に接続する通信部とを有している。さらに、 D N Aシーケンスを決定するためにはフローサイ卜メ一夕一（図示せず）を用いる。

また、本実施の形態に係る遺伝物質シーケンス決定を行うために次に示すような懸濁系を容器に収容しておく。

その懸濁系は、第 1のコード化才リゴヌクレオチド群としての検出用ォリゴヌクレオチド群と、第 2のコード化ォリゴヌクレオチド群としての磁力操作可能ォリゴヌクレオチド群と、 D N Aリガーゼとを液体中に懸濁混合させて容器に収容したものである。ここで、第 1のコード化オリゴヌクレオチド群と第 2のコード化オリゴヌクレオチド群の量（濃度および絶対量）は解析を容易にするために略同一とする。

前記検出用ォリゴヌクレオチド群は、少なくとも塩基数 3の 1種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された検出用ォリゴヌクレオチドを、その塩基数 3における全種類 4 ³ ( = 6 4 ) 種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして識別できるようにコード化することによって各々選別可能に設けられたものである。また、前記磁力操作可能ォリゴヌクレオチド群は、少なくとも塩基数 3の 1種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された磁力操作可能ォリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類 4 ³ ( = 6 4 ) 種類の塩基配列を網羅するように包含し、磁力操作によって移動可能とすることによって、その群に属するものとして各々選別可能に設けられたものである。さらに、これら検出用ォリゴヌクレオチドおよび磁力操作可能ォリゴヌクレオチドの各種類の塩基配列の量は解析を容易にするために略同一となるようにしておくまた、前記 D N Aリガーゼは、 1つのォリゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイプリダイズされてその塩基配列の末端オリゴヌクしォチドの糖であるデォキシリボース同士が直接に隣接する場合であって、各 3塩基ずつの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補的である場合にのみ、前記 2つのオリゴヌクレオチドの末端のデォキシリボース同士を特異的に結合させる酵素である。前記検出用ォリゴヌクレオチドは、 1個の非磁性の担体と、その担体に結合した 3個の塩基の塩基配列をもつ多数の 1種類のそのオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部と結合した標識物質である蛍光物質とからなり、その担体に保持された蛍光物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、 4 ³ ( = 6 4 ) 種類を識別するためのコード化は、蛍光物質の種類および/または量比を変えることによって行われるものである。ここで、蛍光物質は、例えば、検出用オリゴヌクレオチドに 3種類、磁力操作用オリゴヌクレオチドにさらに 3種類を用いる。蛍光物質の種類には、例えば、 F I T C (フルォレツセイン - イソチオシァネート）、ローダミン、イソチオシァネート、 I R D 4 0、 C Y 3、 C Y 5、ユウ口ピウ厶錯体等がある。

また、前記磁力操作可能オリゴヌクレオチドは、 1個の磁性の担体と、その担体に結合した 3個の塩基の塩基配列をもつ 1種類の多数のそのォリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部と結合した標識物質である蛍光物質とからなり、その担体に保持された蛍光物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、 4 ³ ( = 6 4 ) 種類を識別するためのコード化は、蛍光物質の種類および/または量比を変えることによって行われるものである。ここで、コード化のために使用される前記オリゴヌクレオチドには、 I M P (イノシン酸：ブリン環にァミノ基ゃ水酸基がついていない）等をアームまたはスぺーサ一として、担体又は標識物質との間に設けることによって、蛍光物質のクェンチングを防止するのが好ましい。

続いて、本実施の形態に係る懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法を図 1 に基づいて説明する。

図 1 に示すように、本遺伝物質シーケンス決定方法は、ステップ S 1で、 D N Aの塩基配列を決定しょうとする試料、例えば、ヒ卜等の細胞や細菌等から、標的 D N A断片を抽出する。標的 D N A断片を抽出するには、例えば、前記分注機を用いてベクターが導入された細菌コロニーと D A抽出液とを混合して可溶化させ、磁性粒子を分注機を用いて混合することによって所定ベース（ 1〜数キロベース）の標的 D N A断片を磁性粒子に捕獲させる。その標的 D N A断片を捕獲した磁性粒子を含む懸濁液を前記分注機の液通路を通過させる際に、磁場を及ぼすことによって、液通路の内壁に吸着させて分離する。さらに、磁性粒子を前記液通路の内壁に吸着させたままで洗浄液を前記液通路を通して吸引することによつて前記磁性粒子、その磁性粒子に捕獲された標的 D N A断片および液通路を洗浄する。その後、磁性粒子を液通路の内壁に吸着させたままでベクターを溶出する。

次に、ステップ S 2で、前記抽出した環状の前記標的 D N A断片が組み込まれたベクタ一について、その環状標的 D N A断片を切断する。ここで、ベクタ一には、プラスミドまたはバタテリオファージ等を含む。

ここで、前記切断工程は、前記標的 D N A断片が組み込まれたベクタ一と所定試薬を各々収容した各収容部から前記分注機の液通路を介して吸引し、恒温機能を有する収容部に移動し、かつ吐出して環状の標的 D N A断片を切断する。また前記所定試薬とは、水、切断用バッファおよび切断酵素である。

ステップ S 3で、このようにして得られた標的 D N A断片が懸濁する液に熱を加えた後、急冷することによって、その標的 D N A断片を一本鎖に解離する。

ステップ S 4で、このようにして得られた標的 D N A断片が懸濁する液を前記懸濁系に投入し、両者を懸濁混合させる。すると、一本鎖化された標的 D N A断片の塩基配列の 3塩基ごとに、それと略相補的な前記検出用ォリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能ォリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。このようにして、その標的 D N A断片の塩基配列を介して、 1種または 2 種の検出用ォリゴヌクレオチドのみ、 1種または 2種の磁力操作可能ォリゴヌクレオチドのみ、検出用ォリゴヌクレオチドと磁力操作可能ォリゴヌクレォチドの組み合わせたものが得られる。さらに、この懸濁液中には、全くハイブリダイズされない標的 D N A断片や、その標的 D N A断片とハイプリダィズされない磁力操作可能ォリゴヌクレオチドゃ検出用オリゴヌクレオチドが懸濁されている状態となっている。標的 D N A断片にハイプリダイズされている検出用ォリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能ォリゴヌクレオチドとの 3塩基を含む塩基配列端同士が隣接している場合、前記 D N Aリガーゼの働きにより、これらの 3塩基ずつが標的 D N A断片の塩基配列と完全に相補的である場合には、このオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボース同士が結合し、各々 6塩基配列のォリゴヌクレオチドが得られることになる。

なお、前記標的 D N A断片にハイプリダイズされた 1つのォリゴヌクレオチドは必ずしも検出用ォリゴヌクレオチドと磁力操作可能ォリゴヌクレオチドの組み合わせとは限らないし、また、塩基配列端同士が隣接するものとも限られないが、ある確率でこれらの組み合わせが必ず存在することは明らかである。

図 2は、この段階で、懸濁液中に存在する標的 D N A断片 1 0にハイプリダイズされた、検出用オリゴヌクレオチド 1 2 と、磁力操作可能ォリゴヌクしォチド 1 1の組み合わせの例を示すものである。図 2 ( a ) は、検出用ォリゴヌクレオチド 1 1 と磁力操作可能ォリゴヌクレオチド 1 1の 3塩基ずつの塩基配列が標的 D N A断片 1 0の塩基配列と相補的になるとともに、その端塩基が隣接してハイブリダィズされている場合を示す。この場合には、前言己 D N Aリガーゼの働きによって、両者の末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボース同士が結合して 6塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることになる。

一方、図 2 ( b ) は、検出用ォリゴヌクレオチド 1 2 と、磁力操作可能ォリゴヌクレオチド 1 iの 3塩基ずつの塩基配列が標的 D N A断片の塩基配列と相補的となっていないため、その端塩基が隣接してハイプリダイズされているが、両者の末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボ一ズ同士が結合しない場合を示している。

図 2中小さい白丸〇は各種塩基を表す。また、二重丸◎は例えば、 I M P (イノシン酸）等の物質を表す。黒丸秦は、図 1 ( a ) の標的 D N A断片 1 0と、図 1 ( b ) の標的 D N A断片 1 0 sのうち異なる塩基（ S N P ) を表同図に示すように、磁力操作可能ォリゴヌクレオチド 1 1は、 3塩基 1 5 をもつ 1種類の多数のォリゴヌクレオチドがアーム 1 6およびビォチン 1 7 を介して磁性の担体である磁性粒子 1 8に結合している。磁性粒子 1 8の表面は、前記ピオチンと特異的に結合するアビジンでコ一ティングされている。また、一部のオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドには、標識化物質である蛍光物質 1 3、 1 4が結合して、そのオリゴヌクレオチドを識別する。検出用ォリゴヌクレオチド 1 1は、 3塩基 1 9をもち、アーム 2 0を介して図示しない非磁性の担体と結合する構造である。

ここで、「一部のオリゴヌクレオチド」とは、磁性粒子 1 8または図示しない非磁性の粒子に保持された全ォリゴヌクレオチドの 1 %または 1 0 %以下である。また、量比は例えば、 0 . 2 5 %、 0 . 5 %、 0 . 7 5 %および 1 . 0 % (または、 2 . 5 %、 5 . 0 %、 7 . 5 %、および 1 0 . 0 % ) のように変えることによって、蛍光物質の各種類について、 4段階を識別するようにコード化する。また、検出用オリゴヌクレオチドと磁力操作可能ォリゴヌクレオチドに使用する蛍光物質の種類を異ならせることによって、各々が選別可能である。

ステップ S 5で、この懸濁液全体を、前記分注機で吸引し、一定の温度状態に保たれている恒温槽に移送し吐出することによって加熱する。これによつて、前記標的 D N A断片が一本鎖化されることによって、その標的 D N A 断片にハイブリダィズされているオリゴヌクレオチドが解離する。その際、図 2 ( a ) に示すように 2つのオリゴヌクレオチドが前記 D N Aリガーゼによって結合している場合には、 6塩基配列のォリゴヌクレオチドが得られることになる力、図 2 ( b ) に示すように、たとえ、ハイブリダィズした 2つのオリゴヌクレオチドであっても、完全に相補的でないために、 D N Aリガ —ゼによって結合していない場合には、 3塩基配列のままのオリゴヌクレオチドとして懸濁液中に懸濁することになる。したがって、この段階では、 6 塩基の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドは、標的 D N A断片の塩基配列に完全に相補的になっている塩基配列のみが存在することになる。

ステップ S 6で、前記分注機がこの懸濁液を吸引する際に、磁場を分注機の液通路内に及ぼすことによって、前記オリゴヌクレオチドのうち、磁性粒子を有する才リゴヌクレオチドのみを液通路の内壁に吸着させて分離する。液通路の内壁に才リゴヌクレオチドを吸着させたまま、洗浄液等の吸引および吐出を繰り返すことによって、吸着させたオリゴヌクレオチドを洗浄する。これによつて、磁性粒子をもっていない単独の検出用オリゴヌクレオチドや、検出用オリゴヌクレオチド同士が結合したものや、単独の標的 D N A断片や夾雑物等を除去することができる。洗浄されかつ分注機の液通路の内壁に吸着したォリゴヌクレオチドを別容器にまで移送し、磁場を除去した状態で吸引吐出を繰り返すことによって、液通路の内壁から磁性粒子を離脱させ、液中に再懸濁させる。

こうして得られた懸濁液中には、単独の磁力操作可能ォリゴヌクレオチド、磁力操作可能ォリゴヌクレオチド同士が結合したもの、磁力操作可能ォリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドとが結合したものが懸濁液中に存在することになる。

ステップ S 7で、この懸濁液をフローサイトメーターの管路を通過させることによって前記ォリゴヌクレオチドのコ一ドを読み取る。このフローサイトメ一ターの管路には、一定の励起波長の光を照射させる発光手段と、励起された標識物質である蛍光物質からの光を受光する受光手段と、受光した光を解析する解析部が設けられたものである。

前記解析部は、単独の磁力操作可能ォリゴヌクレオチドを排除するために検出用オリゴヌクレオチドのグルーフを識別するコードである蛍光物質の種類があるもののみを選別して、そのコードの組み合わせである蛍光物質の種類を特定する。これによつて、磁力操作可能オリゴヌクレオチドと検出用ォリゴヌクレオチドのコードの組み合わせを読み取ることになる。

ステツプ S 8で、読み取られたコードの組み合わせから、標的 D N A断片に存在するの 6塩基分の塩基配列を決定することができる。このようなコードの組み合わせを、その標的 D N A断片の塩基配列が順次つながるように、配列を決定することによって、標的 D N A断片に存在する全塩基配列を決定することができることになる。もし、前記標的 D N A断片のベース力 0 9 6塩基配列よりも長い場合、または繰返しを含む配列である場合には、重複出現数を発光強度に基づいて決定するようにする。本実施の形態によれば、 6塩基ずつのコ一ドの組み合わせによる発光を測定することができるので、高い信頼性で測定を行うことができる。

続いて、本実施の形態に係る S N P s のスコアリング方法について、図 3 に基づいて説明する。

本実施の形態に係る S N P s のスコアリング方法においても、前述したように、分注機、移動部、制御部、ステージおよびフローサイ卜メーターを用いる。

本実施の形態に係る S N P s のスコアリング方法を行うためには、解析の容易化のため前述した懸濁系を同量（濃度および絶対量）および同じ構成要素のものを第一の懸濁系および第二の懸濁系として、予め 2つの別の容器に用意しておく。

図 3に示すように、本 S N P s のスコアリング方法は、 2つの異なる第一の試料および第二の試料から各々抽出した第一の D N A断片および第二の D N A断片の塩基配列を比較することによって、 S N P s (多型の塩基配列）を決定しょうとするものである。

図 3のステップ S 1 1で、第一の試料から所定ベースの第一の D N A断片が組み込まれたベクタ一を抽出し、ステップ S 2 1で、第二の試料から所定ベースの第二の D N A断片が組み込まれたベクターを抽出する。抽出の方法については、既に、ステップ S 1で説明したとおりである。ここで、「所定ベース」は、その断片中に数個の S N P sが含まれる場合に検出可能であるので、 3 0 0〜 5 0 0塩基対にひとつ S N P sが存在し、特定の 6塩基配列が平均 4 0 9 6 ( = 4 ⁶ ) 塩基対にひとつ存在することから、 1〜数キロべースである。

ステツプ S 1 2およびステップ S 2 2で、各々、環状の第一の D N A断片および環状の第二の D N A断片を切断する。その方法については、前述したステップ S 2で説明した通りである。

ステップ S 1 3およびステップ S 2 3で、各々、第一の D N A断片および第二の D N A断片が懸濁する液に熱を加えた後、急冷することによって二本鎖を一本鎖化する。

ステップ S 1 4およびステップ S 2 4で、このようにして得られた第一の D N A断片を、第一の懸濁系に投入して懸濁混合させるとともに、第二の D N A断片を第二の懸濁系に投入して懸濁混合させる。

ステップ S 1 5およびステップ S 2 5において、各懸濁液全体を、前記分注機で吸引し、一定の温度状態に保たれている恒温槽に移送し吐出することによって加熱する。これによつて、前記第一の D N A断片および第二の D N A断片がー本鎖化されることになる。

ステップ S 1 6およびステップ S 2 6で、前記分注機が各懸濁液を吸引する際に、磁場を分注機の液通路内に及ぼすことによって、前記オリゴヌタレォチドのうち磁性粒子を有するォリゴヌクレオチドのみをその液通路の内壁に吸着させて分離する。液通路の内壁にォリゴヌクレオチドを吸着させたまま、洗浄液等の吸引および吐出を繰り返すことによって、吸着させたオリゴヌクレオチドを洗浄する。これによつて、磁性粒子をもっていない単独の検出用オリゴヌクレオチォドゃ、検出用ォリゴヌクレオチド同士を結合したものや、第 1の D N A断片や夾雑物等を除去することができる。洗浄されかつ分注機の液通路の内壁に吸着したォリゴヌクレオチドを別容器にまで移送し、吸引吐出を繰り返すことによて再懸濁させる。

ステツフ S 1 7およびステツフ S 2 7において、前記フローサイトメ一夕一を用いて、前述した方法で、解析部は、単独の磁力操作可能オリゴヌタレォチドを排除するために検出用ォリゴヌクレオチドのグループを識別するコ一ドである蛍光物質があるもののみを選択して、そのコードの組み合わせである蛍光物質の種類を特定する。これによつて、磁力操作可能オリゴヌタレォチドと検出用才リゴヌクレオチドのコ一ドの組み合わせを読み取ることができる。

ステツフ S 1 8で、読み取られたコードの組み合わせによって得られた第一の D N A断片の塩基配列と第二の D N A断片の塩基配列とを比較し、 1または 2以上の異なる塩基があれば、各々が S N P (s) である。例えば、第一の試料から得られた第一の標的 D N A断片 1 0については、図 2 ( a ) の塩基配列であるが、第 2の試料から得られた第二の標的 D N A断片 1 0 sについては、第一の標的 D N A断片 1 0 と塩基 2 1が異なることが、コードの解折によって判明したとすれば、塩基 2 1の塩基配列の位置において多型であることが決定される。本実施の形態によれば、リガーゼ反応産物の差を見るだけで S N P s を検出することができるので、高い信頼性で容易に結果を得ることができる。

これらの実施の形態は本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、 D N A断片については、ベクターを利用して増殖および抽出を行って得るようにしたが、この場合に限られることなく、例えば、抽出した D N A断片に P C Rブラィマを結合し P C R法によつて増幅することによって D N Aを得て、熱変成させた一本鎖化 D N Aを用いるようにしても良く、またはクローン化を行うことによって、同一の塩基配列をもつ標的 D N A断片を得ることができる。さらに、前記一本鎖化を行うには、熱した後急冷する方法の他に、アルカリ溶液を加えることによって行っても良い。この場合には緩衝剤が必要になる以上の例では、予め用意した懸濁系には、所定塩基数である 3個の全種類である 4 ³ 種類ずつの 1 1 8種類のォリゴヌクレオチドを懸濁させていたが、この種類を絞り込むことができる場合には、特定種類のオリゴヌクレオチドを懸濁させておくようにしても良い。また、所定塩基数として、 3個の場合についてのみ説明したが、 3個以上の場合であっても良い。

さらに、前記酵素として、 2つのオリゴヌクレオチドが標的の一本鎖の D N A断片に隣接してハイブリダィズした場合に、 3つの塩基ずつを認識して 2つのォリゴヌクレオチドを特異的に結合するようにしている力このような場合に限られない。

また、塩基配列を決定するには、 1個 1個のオリゴヌクレオチドのコードを読み取ることによって、コードの組み合わせから、 6つの塩基配列を決定

2 ] する場合について説明したが、このような場合に限られず、複数個または多数個のォリゴヌクレオチド対について蛍光等の強度を測定することによって、塩基配列を決定するようにしても良い。また、以上の例では、第 iのコード化オリゴヌクレオチドは非磁性の担体を有するものを用いたが、担体を有しないものを用いても良い。また、その全部または一部について、ジデォキシリボースを設けたものを用いても良い。さらに、第 2のコード化オリゴヌクレオチドに磁性担体を用いずに、コ一ドによって選別可能なものを用いても良い。

Claims

請求の範囲

1 . 所定塩基数の 1種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第 1のコード化ォリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群と、

所定塩基数の 1種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第 2のコード化ォリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第 2のコード化ォリゴヌクレオチド群と

2つのコード化オリゴヌクレオチドがー本鎖の遺伝物質にハイブリダィズされてその塩基配列の末端ヌクレオチドが直接に隣接する場合であって、かつ、前記所定塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と一定の関係にある場合にのみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボースを介して 2つのオリゴヌクレオチド同士を特異的に結合させる酵素と、を容器内の液に懸濁させた遺伝物質シ一ケンス決定用懸濁系。

2 . 前記各第 1のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに、前記各第 2のコード化ォリゴヌレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能であることを特徴とする請求項 1記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。

3 . 前記各第 1のコード化オリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドの前記所定塩基数は、少なくとも 3塩基であり、第 1 のコード化オリゴヌクレオチド群は、その 3塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも 4 ³ 種類の第 1のコード化ォリゴヌクレオチドを包含し、第 2のコ一ド化ォリゴヌクレオチド群は、その 3塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも 4 ³ 種類の第 2のコ一ド化才リゴヌクレオチドを包含することを特徴とする請求項 1または請求項 2のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。

4 . 前記酵素は、 D N Aリガーゼであって、一本鎖の遺伝物質にハイプリダイズされた 2つのコ一ド化ォリゴヌクレオチドの 3塩基以上からなる塩基配列の末端ヌクレオチド同士が直接に隣接する場合であって、かつ、前記ォリゴヌクレオチドの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補的である場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデォキシリボース同士を特異的に結合させるものであることを特徴とする請求項 1ないし請求項 3のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。

5 . 前記第 1のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第 1のコード化オリゴヌクしォチドは、所定の塩基配列をもつ 1種類のォリゴヌクレオチドと、そのオリゴヌクレオチドと結合した標識物質とからなり、その標識物質は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および/またはその量比を変えることによって行われたことを特徴とする請求項 1ないし請求項 4のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系

6 . 前記第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群に属する第 iのコード化ォリゴヌクレオチドの全部または一部について、その遊離末端に標識化されたジデォキシリボースを有していることを特徴とする請求項 5に記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。

7 . 前記第 i のコード化ォリゴヌクレオチド群に属する各第 1 のコード化オリゴヌクレオチドは、 1個の非磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ多数の 1種類のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部にまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および/または量比を変えることによって行われたことを特徴とする請求項 1ないし請求項 4のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。

8 . 前記第 1のコード化ォリゴヌクレオチド群に属する各第 2のコード化ォリゴヌクレオチドは、 1個の磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ 1種類の多数のォリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのォリゴヌクレオチドの一部にまたはォリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および/または量比を変えることによって行われたことを特徴とする請求項 1ないし請求項 7のいずれかに記載の記載の遺伝物質シ一ケンス決定用懸濁系。

9 . 前記オリゴヌクレオチドは、アームを介して担体または標識物質と結合したことを特徴とする請求項 5ないし請求項 8のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。

丄 0 . 請求項 1ないし請求項 9のいずれかに記載された懸濁系に、前記所定塩基数よりも十分に大きい所定ベースの一本鎖の標的遺伝物質を投入懸濁させて、前記標的遺伝物質に前記第 1のコード化オリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドをハイプリダイズさせる対合工程と、第 1のコード化ォリゴヌクレオチドまたは第 2のコード化ォリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液中から、第 1 のコード化オリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドの対を選別する選別工程と、

選別された第 1 のコード化ォリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程とを有している遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法。

1 1 . 前記対合工程において、前記第 iのコード化ォリゴヌクレオチドは

、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに

、前記各第 2のコード化ォリゴヌクレオチドは、磁場によつて遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能であり、前記選別工程は、磁場操作によって第 2のコード化ォリゴヌクレオチドを分離する分離工程を有していることを特徴とする請求項 1 0に記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法。

1 2 . 第 2のコード化ォリゴヌクレオチドが担体として磁性粒子を有している場合には、前記選別工程は、液通路、その液通路に外部から磁場を及ぼしかつ除去する磁力部、およびその液通路内の圧力を制御して流体の吸引および吐出を行う圧力制御部を有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによって、前記第 2のコード化ォリゴヌクレオチドが有する前記磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱するものであることを特徴とする請求項 9または請求項 1 0または請求項 1 1 のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法。

1 3 . 請求項 1ないし請求項 9のいずれかに記載の 2つの略同一の懸濁系を用意し、その一方に、第一の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第一の標的遺伝物質を投入懸濁させ、他方に、第二の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第二の標的遺伝物質を投入懸濁させ、各標的物質に前記第 1のコード化ォリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドをハイプリダイズさせる対合工程と、

各々、第 1のコード化オリゴヌクレオチドまたは第 2のコード化才リゴヌクレオチドの対を捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離ェ程と、

前記懸濁液中から、第 1のコード化ォリゴヌクレオチドおよび第 2のコード化ォリゴヌクレオチドを選別する選別工程と、

各々、選別された第 1のコード化ォリゴヌクしォチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第 2のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程と、

各々、前記第一の標的遺伝物質について決定された塩基配列と、前記第二の標的遺伝物質について決定された塩基配列とを比較することによつて単一ヌクレオチド多型の同定を行う同定工程を有することを特徴とする遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いた S N P s 高速スコアリング方法。