JP2001103970A - 遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法 - Google Patents
遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】反応効率を飛躍的に上昇させて平衡に達するま
での時間を短縮した遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。 【解決手段】所定塩基数の１種類の塩基配列をもちその
塩基配列がコード化された第１のコード化オリゴヌクレ
オチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類
の塩基配列を網羅するように多数包含し、その群に属す
るものとして各々選別可能に設けられた第１のコード化
オリゴヌクレオチド群と、第２のコード化オリゴヌクレ
オチド群と、２つのコード化オリゴヌクレオチドが一本
鎖の遺伝物質にハイブリダイズされてその塩基配列の末
端ヌクレオチド同士が直接に隣接する場合であって、所
定塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と一定の
関係にある場合に、その末端ヌクレオチドの糖であるデ
オキシリボース同士を特異的に結合させる酵素を容器内
の液に懸濁させた懸濁系を用いて、標的となる遺伝物質
の塩基配列を決定する。
での時間を短縮した遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。 【解決手段】所定塩基数の１種類の塩基配列をもちその
塩基配列がコード化された第１のコード化オリゴヌクレ
オチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類
の塩基配列を網羅するように多数包含し、その群に属す
るものとして各々選別可能に設けられた第１のコード化
オリゴヌクレオチド群と、第２のコード化オリゴヌクレ
オチド群と、２つのコード化オリゴヌクレオチドが一本
鎖の遺伝物質にハイブリダイズされてその塩基配列の末
端ヌクレオチド同士が直接に隣接する場合であって、所
定塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と一定の
関係にある場合に、その末端ヌクレオチドの糖であるデ
オキシリボース同士を特異的に結合させる酵素を容器内
の液に懸濁させた懸濁系を用いて、標的となる遺伝物質
の塩基配列を決定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝物質シーケン
ス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケン
ス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコ
アリング方法に関し、詳しくは、ＤＮＡ断片等の遺伝物
質の塩基配列や、ＳＮＰs の特定を行うための遺伝物質
シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質
シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs
高速スコアリング方法に関する。
ス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケン
ス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコ
アリング方法に関し、詳しくは、ＤＮＡ断片等の遺伝物
質の塩基配列や、ＳＮＰs の特定を行うための遺伝物質
シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質
シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs
高速スコアリング方法に関する。
【０００２】本発明は、農学、工学、薬学、医学、心理
学または化学若しくは生物学等の理学等の分野で、遺伝
子の塩基配列の決定や操作や、医療、薬品、生理衛生、
保健、生物または食品等の種々の領域において、遺伝物
質の塩基配列の決定や、遺伝物質の塩基配列とヒトを含
む種々の生物の形態、構造、性質、体質、病気、薬剤に
対する感受性、気質、性格等との関係の解明に利用する
ことができるものである。
学または化学若しくは生物学等の理学等の分野で、遺伝
子の塩基配列の決定や操作や、医療、薬品、生理衛生、
保健、生物または食品等の種々の領域において、遺伝物
質の塩基配列の決定や、遺伝物質の塩基配列とヒトを含
む種々の生物の形態、構造、性質、体質、病気、薬剤に
対する感受性、気質、性格等との関係の解明に利用する
ことができるものである。
【０００３】
【従来の技術】従来、「ありふれた病気」の疾患感受性
遺伝子の同定と薬剤に対する感受性を決定するＳＮＰs
（single nucleotid polymorphisms、単一のヌクレオチ
ド多型）を特定するために、全ゲノムにわたる高効率Ｓ
ＮＰs 検出のスコアリングシステムの開発が急務であっ
た。現時点では、高効率でＳＮＰｓを検出スコアリング
するシステムは開発段階にあり、ハイブリダイゼーショ
ンの原理に基づくいわゆるＤＮＡチップが予備的に検討
されているにすぎない。
遺伝子の同定と薬剤に対する感受性を決定するＳＮＰs
（single nucleotid polymorphisms、単一のヌクレオチ
ド多型）を特定するために、全ゲノムにわたる高効率Ｓ
ＮＰs 検出のスコアリングシステムの開発が急務であっ
た。現時点では、高効率でＳＮＰｓを検出スコアリング
するシステムは開発段階にあり、ハイブリダイゼーショ
ンの原理に基づくいわゆるＤＮＡチップが予備的に検討
されているにすぎない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところで、ＤＮＡチッ
プは、半導体膜やスライドグラス等の平板にスポットさ
れた既知のひとつのＳＮＰに対し、このＳＮＰを含む１
０種類以上のオリゴヌクレオチドアレイを準備し、これ
らにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片がハイブリダイズするか
否かによりＳＮＰｓを検出するAffimetrix社等によるシ
ステムが既に実用化されている。
プは、半導体膜やスライドグラス等の平板にスポットさ
れた既知のひとつのＳＮＰに対し、このＳＮＰを含む１
０種類以上のオリゴヌクレオチドアレイを準備し、これ
らにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片がハイブリダイズするか
否かによりＳＮＰｓを検出するAffimetrix社等によるシ
ステムが既に実用化されている。
【０００５】しかし、このＤＮＡチップを用いた方法
は、機器とランニングコストが高価であるという問題点
を有していた。また、ＤＮＡチップは、ハイブリダイゼ
ーション反応が非特異的物理化学反応であるために、こ
のような複数オリゴヌクレオチドを利用した重複性（re
dundancy) のあるシステムが必要であり、このシステム
を用いたとしても約１０％の誤り判定が生ずるという問
題点をも有していた。
は、機器とランニングコストが高価であるという問題点
を有していた。また、ＤＮＡチップは、ハイブリダイゼ
ーション反応が非特異的物理化学反応であるために、こ
のような複数オリゴヌクレオチドを利用した重複性（re
dundancy) のあるシステムが必要であり、このシステム
を用いたとしても約１０％の誤り判定が生ずるという問
題点をも有していた。
【０００６】本発明は以上の課題を解決することを目的
としてなされたものであり、その第一の目的は、従来の
いわゆるＤＮＡチップ等の方法で行われている、スライ
ドグラスのスポット内の限られた狭い平面上のハイブリ
ダイゼーション反応ではなく、微小粒子（ビーズ）を用
いることによって、反応面積を増加させ液体内での反応
を促進させ、反応効率を飛躍的に上昇させて平衡に達す
るまでの時間を短縮させることができる遺伝物質シーケ
ンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケ
ンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速ス
コアリング方法を提供することである。
としてなされたものであり、その第一の目的は、従来の
いわゆるＤＮＡチップ等の方法で行われている、スライ
ドグラスのスポット内の限られた狭い平面上のハイブリ
ダイゼーション反応ではなく、微小粒子（ビーズ）を用
いることによって、反応面積を増加させ液体内での反応
を促進させ、反応効率を飛躍的に上昇させて平衡に達す
るまでの時間を短縮させることができる遺伝物質シーケ
ンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケ
ンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速ス
コアリング方法を提供することである。
【０００７】第２の目的は、塩基配列を特異的に認識す
る酵素反応の高い特異性を用いることによって、重複性
を必要とせず確実に塩基配列をスコアリングすることが
できる遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を
用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を
用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法を提供することで
ある。
る酵素反応の高い特異性を用いることによって、重複性
を必要とせず確実に塩基配列をスコアリングすることが
できる遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を
用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を
用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法を提供することで
ある。
【０００８】第３の目的は、スライドグラス上に固定化
したオリゴヌクレオチドの位置に基づいて配列を決定す
るのではなく、コード化した多種類のビーズを用いるこ
とによって同一条件で一括して反応を進めることによっ
て決定するものであり、高速かつ信頼性高い遺伝物質シ
ーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シ
ーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高
速スコアリング方法を提供することである。
したオリゴヌクレオチドの位置に基づいて配列を決定す
るのではなく、コード化した多種類のビーズを用いるこ
とによって同一条件で一括して反応を進めることによっ
て決定するものであり、高速かつ信頼性高い遺伝物質シ
ーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シ
ーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高
速スコアリング方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】以上の目的を達成するた
めに、第一の発明は、所定塩基数の１種類の塩基配列を
もちその塩基配列を識別するようにコード化された第１
のコード化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における
全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包
含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けら
れた第１のコード化オリゴヌクレオチド群と、所定塩基
数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するよ
うにコード化された第２のコード化オリゴヌクレオチド
を、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基
配列を網羅するように包含し、その群に属するものとし
て各々選別可能に設けられた第２のコード化オリゴヌク
レオチド群と、２つのコード化オリゴヌクレオチドが一
本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされてその塩基配列の
末端ヌクレオチドが直接に隣接する場合であって、か
つ、前記所定塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配
列と一定の関係にある場合にのみ、その末端ヌクレオチ
ドの糖であるデオキシリボースを介して２つのオリゴヌ
クレオチド同士を特異的に結合させる酵素を容器内の液
に懸濁させたものである。
めに、第一の発明は、所定塩基数の１種類の塩基配列を
もちその塩基配列を識別するようにコード化された第１
のコード化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における
全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包
含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けら
れた第１のコード化オリゴヌクレオチド群と、所定塩基
数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するよ
うにコード化された第２のコード化オリゴヌクレオチド
を、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基
配列を網羅するように包含し、その群に属するものとし
て各々選別可能に設けられた第２のコード化オリゴヌク
レオチド群と、２つのコード化オリゴヌクレオチドが一
本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされてその塩基配列の
末端ヌクレオチドが直接に隣接する場合であって、か
つ、前記所定塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配
列と一定の関係にある場合にのみ、その末端ヌクレオチ
ドの糖であるデオキシリボースを介して２つのオリゴヌ
クレオチド同士を特異的に結合させる酵素を容器内の液
に懸濁させたものである。
【００１０】ここで、「遺伝物質」は、主としてＤＮＡ
（断片）であるが、ＲＮＡ（断片）を含めることもでき
る。「塩基」とは、ＤＮＡではチミン（Ｔ）、シトシン
（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）であり、ＲＮ
Ａの場合は、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）を入れた
ものである。「特定種類」としたのは、その標的遺伝物
質の塩基配列が大雑把にある程度知られている場合に
は、全種類の塩基配列でなくても、その種類をある程度
絞り込むことができるからである。
（断片）であるが、ＲＮＡ（断片）を含めることもでき
る。「塩基」とは、ＤＮＡではチミン（Ｔ）、シトシン
（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）であり、ＲＮ
Ａの場合は、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）を入れた
ものである。「特定種類」としたのは、その標的遺伝物
質の塩基配列が大雑把にある程度知られている場合に
は、全種類の塩基配列でなくても、その種類をある程度
絞り込むことができるからである。
【００１１】「選別可能となるように設ける」やり方と
しては、２つのグループ自体を識別できるように標識物
質でコード化を行うことによって、２つのグループで用
いる標識物質の種類を異ならせることによって、また
は、一方のグループのコード化オリゴヌクレオチドに、
遠隔操作可能な担体を有するように設け、そのグループ
を遠隔操作によって任意の位置に移動可能とすることに
よって選別可能とするような場合がある。「遠隔操作可
能化」としては、例えば、磁性粒子をオリゴヌクレオチ
ドに具備させることにより、磁場操作によって遠隔操作
可能にしたり、荷電粒子をオリゴヌクレオチドに具備さ
せることにより、またはオリゴヌクレオチド自体に電荷
を帯びさせて電場によって遠隔操作可能にする場合があ
る。
しては、２つのグループ自体を識別できるように標識物
質でコード化を行うことによって、２つのグループで用
いる標識物質の種類を異ならせることによって、また
は、一方のグループのコード化オリゴヌクレオチドに、
遠隔操作可能な担体を有するように設け、そのグループ
を遠隔操作によって任意の位置に移動可能とすることに
よって選別可能とするような場合がある。「遠隔操作可
能化」としては、例えば、磁性粒子をオリゴヌクレオチ
ドに具備させることにより、磁場操作によって遠隔操作
可能にしたり、荷電粒子をオリゴヌクレオチドに具備さ
せることにより、またはオリゴヌクレオチド自体に電荷
を帯びさせて電場によって遠隔操作可能にする場合があ
る。
【００１２】「コード化」は、例えば、蛍光等の発光物
質や、放射性物質等の標識物質を用いて、標識物質の種
類および／またはその量比を変えることによって行う。
また、「コード化オリゴヌクレオチド」は、例えば、１
本のオリゴヌクレオチドに種々の標識物質をアダプタを
介して結合することによって、または、第七の発明また
は第八の発明のように１種類の多数のオリゴヌクレオチ
ドと標識物質を担体に保持させることによって行う。第
七の発明や第八の発明のように標識物質は多数のオリゴ
ヌクレオチドの一部にのみ分配して結合するのが好まし
い。
質や、放射性物質等の標識物質を用いて、標識物質の種
類および／またはその量比を変えることによって行う。
また、「コード化オリゴヌクレオチド」は、例えば、１
本のオリゴヌクレオチドに種々の標識物質をアダプタを
介して結合することによって、または、第七の発明また
は第八の発明のように１種類の多数のオリゴヌクレオチ
ドと標識物質を担体に保持させることによって行う。第
七の発明や第八の発明のように標識物質は多数のオリゴ
ヌクレオチドの一部にのみ分配して結合するのが好まし
い。
【００１３】第１のオリゴヌクオレオチドのコード化に
用いる標識物質の種類と、第２のオリゴヌクオチドのコ
ード化に用いる標識物質の種類は、異ならせるのが解析
上妥当である。この場合には、コード化のみによって第
１のオリゴヌクレオチド群と第２のオリゴヌクレオチド
群とは選別されることになる。
用いる標識物質の種類と、第２のオリゴヌクオチドのコ
ード化に用いる標識物質の種類は、異ならせるのが解析
上妥当である。この場合には、コード化のみによって第
１のオリゴヌクレオチド群と第２のオリゴヌクレオチド
群とは選別されることになる。
【００１４】「酵素」には、例えば、ＤＮＡリガーゼ
（ＤＮＡ連結酵素）のようにオリゴヌクレオチド同士が
直接隣接する場合にそれらを結合する酵素がある。「一
定の関係」とは、例えば、相補的な関係または同一の関
係等である。
（ＤＮＡ連結酵素）のようにオリゴヌクレオチド同士が
直接隣接する場合にそれらを結合する酵素がある。「一
定の関係」とは、例えば、相補的な関係または同一の関
係等である。
【００１５】本発明によれば、一本鎖化した遺伝物質と
ハイブリダイスした各オリゴヌクレオチドの前記所定塩
基数について、その遺伝物質と一定の関係がある場合の
み、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース
同士を特異的に結合させる酵素を有している。したがっ
て、この懸濁系の中に、塩基配列を知ろうとする標的の
一本鎖の遺伝物質を投入して懸濁させることによって、
この塩基配列と一定の関係のあるオリゴヌクレオチドの
みが結合することができる。そのため、一本鎖の遺伝物
質を解離させるとともに、このオリゴヌクレオチドの対
のコードを読むことによって、前記所定塩基数の塩基配
列から、標的遺伝物質を高い信頼性をもって知ることが
できる。
ハイブリダイスした各オリゴヌクレオチドの前記所定塩
基数について、その遺伝物質と一定の関係がある場合の
み、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース
同士を特異的に結合させる酵素を有している。したがっ
て、この懸濁系の中に、塩基配列を知ろうとする標的の
一本鎖の遺伝物質を投入して懸濁させることによって、
この塩基配列と一定の関係のあるオリゴヌクレオチドの
みが結合することができる。そのため、一本鎖の遺伝物
質を解離させるとともに、このオリゴヌクレオチドの対
のコードを読むことによって、前記所定塩基数の塩基配
列から、標的遺伝物質を高い信頼性をもって知ることが
できる。
【００１６】第二の発明は、前記発明において、前記各
第１のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属する
ものとして選別可能であるようにコード化されるととも
に、前記各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場
によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設
けることによって、その群に属するものとして選別可能
としたものである。
第１のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属する
ものとして選別可能であるようにコード化されるととも
に、前記各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場
によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設
けることによって、その群に属するものとして選別可能
としたものである。
【００１７】第三の発明は、前記各発明において、前記
各第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコー
ド化オリゴヌクレオチドの前記所定塩基数は、少なくと
も３塩基であり、第１のコード化オリゴヌクレオチド群
は、その３塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくと
も４3 種類の第１のコード化オリゴヌクレオチドを包含
し、第２のコード化オリゴヌクレオチド群は、その３塩
基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも４3 種類の
第２のコード化オリゴヌクレオチドを包含するものであ
る。
各第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコー
ド化オリゴヌクレオチドの前記所定塩基数は、少なくと
も３塩基であり、第１のコード化オリゴヌクレオチド群
は、その３塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくと
も４3 種類の第１のコード化オリゴヌクレオチドを包含
し、第２のコード化オリゴヌクレオチド群は、その３塩
基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも４3 種類の
第２のコード化オリゴヌクレオチドを包含するものであ
る。
【００１８】解析上、好ましくは、第１のコード化オリ
ゴヌクレオチド群と、第２のコード化オリゴヌクレオチ
ド群の各量（濃度および絶対量）は略同一であり、ま
た、これらの各群における各種類ごとの量も略同一であ
る。
ゴヌクレオチド群と、第２のコード化オリゴヌクレオチ
ド群の各量（濃度および絶対量）は略同一であり、ま
た、これらの各群における各種類ごとの量も略同一であ
る。
【００１９】第四の発明は、前記各発明において、前記
酵素は、ＤＮＡリガーゼであって、一本鎖の遺伝物質に
ハイブリダイズされた２つのコード化オリゴヌクレオチ
ドの３塩基以上からなる塩基配列の末端ヌクレオチド同
士が直接に隣接する場合であって、かつ、前記オリゴヌ
クレオチドの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補
的である場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデ
オキシリボース同士を特異的に結合させるものである。
酵素は、ＤＮＡリガーゼであって、一本鎖の遺伝物質に
ハイブリダイズされた２つのコード化オリゴヌクレオチ
ドの３塩基以上からなる塩基配列の末端ヌクレオチド同
士が直接に隣接する場合であって、かつ、前記オリゴヌ
クレオチドの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補
的である場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデ
オキシリボース同士を特異的に結合させるものである。
【００２０】ここで、「相補的」とは、２本鎖を構成す
るＤＮＡにおいて、互いに塩基対を形成し得るような関
係である。ＤＮＡにおける塩基対は、アデニンとチミ
ン、シトシンとグアニンであり、ＲＮＡにおける塩基対
は、アデニンとウラシル、シトシンとグアニンである。
るＤＮＡにおいて、互いに塩基対を形成し得るような関
係である。ＤＮＡにおける塩基対は、アデニンとチミ
ン、シトシンとグアニンであり、ＲＮＡにおける塩基対
は、アデニンとウラシル、シトシンとグアニンである。
【００２１】第五の発明は、前記各発明において、前記
第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１の
コード化オリゴヌクレオチドは、所定の塩基配列をもつ
１種類のオリゴヌクレオチドと、そのオリゴヌクレオチ
ドと結合した標識物質とからなり、その標識物質は所定
の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は標識
物質の種類および／またはその量比を変えることによっ
て行われたものである。
第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１の
コード化オリゴヌクレオチドは、所定の塩基配列をもつ
１種類のオリゴヌクレオチドと、そのオリゴヌクレオチ
ドと結合した標識物質とからなり、その標識物質は所定
の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は標識
物質の種類および／またはその量比を変えることによっ
て行われたものである。
【００２２】第六の発明は、前記各発明において、前記
第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する第１のコ
ード化オリゴヌクレオチドの全部または一部について、
その遊離末端に標識化されたジデオキシリボースを有し
ているものである。
第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する第１のコ
ード化オリゴヌクレオチドの全部または一部について、
その遊離末端に標識化されたジデオキシリボースを有し
ているものである。
【００２３】ここで、「遊離末端」とは、オリゴヌクレ
オチドの末端のうち、他のオリゴヌクレオチドと結合し
ない末端、すなわち、標識物質が結合する末端をいう。
第１のコード化オリゴヌクレオチドの３’末端に標識化
したジデオキシリボースを結合させる。ジデオキシリボ
ースを含ませることによって、その後にどのようなオリ
ゴヌクレオチドが隣接しても結合を引き起こすことがな
い。
オチドの末端のうち、他のオリゴヌクレオチドと結合し
ない末端、すなわち、標識物質が結合する末端をいう。
第１のコード化オリゴヌクレオチドの３’末端に標識化
したジデオキシリボースを結合させる。ジデオキシリボ
ースを含ませることによって、その後にどのようなオリ
ゴヌクレオチドが隣接しても結合を引き起こすことがな
い。
【００２４】したがって、第１のコード化オリゴヌクレ
オチドの全部にジデオキシリボースを含ませるととも
に、第２のコード化オリゴヌクレオチドについても全部
にジデオキシリボースを同様に含ませたり、または第２
のコード化オリゴヌクレオチドが担体を有するような場
合には、第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のオ
リゴヌクレオチドが１個ずつ（前記所定塩基数ずつ）連
結した二量体のみが得られることになる。これによっ
て、塩基数列を揃えることができるので、例えば、発光
物質によってコード化されている場合にはコードの読取
りを確実かつ容易に行うことができる。
オチドの全部にジデオキシリボースを含ませるととも
に、第２のコード化オリゴヌクレオチドについても全部
にジデオキシリボースを同様に含ませたり、または第２
のコード化オリゴヌクレオチドが担体を有するような場
合には、第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のオ
リゴヌクレオチドが１個ずつ（前記所定塩基数ずつ）連
結した二量体のみが得られることになる。これによっ
て、塩基数列を揃えることができるので、例えば、発光
物質によってコード化されている場合にはコードの読取
りを確実かつ容易に行うことができる。
【００２５】また、第１のコード化オリゴヌクレオチド
の一部にジデオキシリボースを含ませた場合には、第１
のコード化オリゴヌクレオチドが１個、２個、３個、そ
れ以上と多数結合して最後にジデオキシリボースが含ま
れた第１のコード化オリゴヌクレオチドが結合した結合
体を同定することができる。これによって、ＤＮＡシー
ケンスを簡単に読み取ることができる。
の一部にジデオキシリボースを含ませた場合には、第１
のコード化オリゴヌクレオチドが１個、２個、３個、そ
れ以上と多数結合して最後にジデオキシリボースが含ま
れた第１のコード化オリゴヌクレオチドが結合した結合
体を同定することができる。これによって、ＤＮＡシー
ケンスを簡単に読み取ることができる。
【００２６】第七の発明は、前記各発明において、前記
第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１の
コード化オリゴヌクレオチドは、１個の非磁性の担体
と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ多数の１
種類のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位
と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部にまたは
オリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその
担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全
体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード
化は、標識物質の種類および／または量比を変えること
によって行われたものである。
第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１の
コード化オリゴヌクレオチドは、１個の非磁性の担体
と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ多数の１
種類のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位
と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部にまたは
オリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその
担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全
体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード
化は、標識物質の種類および／または量比を変えること
によって行われたものである。
【００２７】ここで、各オリゴヌクレオチドの担体との
結合は、例えば、オリゴヌクレオチドと特異的に結合す
る結合物質を担体にコーティングすることによって行
う。これらの結合物質には、例えば、ビオチンとアビジ
ンの組み合わせがある。
結合は、例えば、オリゴヌクレオチドと特異的に結合す
る結合物質を担体にコーティングすることによって行
う。これらの結合物質には、例えば、ビオチンとアビジ
ンの組み合わせがある。
【００２８】第八の発明は、前記各発明において、前記
第２のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第２の
コード化オリゴヌクレオチドは、１個の磁性の担体と、
その担体に結合した所定の塩基配列をもつ１種類の多数
のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異
なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部とまたはオリ
ゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体
と結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は
所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化
は、標識物質の種類および／または量比を変えることに
よって行われたものである。
第２のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第２の
コード化オリゴヌクレオチドは、１個の磁性の担体と、
その担体に結合した所定の塩基配列をもつ１種類の多数
のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異
なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部とまたはオリ
ゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体
と結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は
所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化
は、標識物質の種類および／または量比を変えることに
よって行われたものである。
【００２９】第九の発明は、前記各発明において、前記
オリゴヌクレオチドは、アームを介して担体または標識
物質と結合したものである。
オリゴヌクレオチドは、アームを介して担体または標識
物質と結合したものである。
【００３０】第十の発明は、第一の発明ないし第九の発
明のいずれかの懸濁系に、前記所定塩基数よりも十分に
大きい所定ベースの一本鎖の標的遺伝物質を投入懸濁さ
せて、前記標的遺伝物質に前記第１のコード化オリゴヌ
クレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドを
ハイブリダイズさせる対合工程と、第１のコード化オリ
ゴヌクレオチドまたは第２のコード化オリゴヌクレオチ
ドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する
解離工程と、前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴ
ヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチド
の対を選別する選別工程と、選別された第１のコード化
オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードお
よび第２のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列
を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的
遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程とを有している
ものである。
明のいずれかの懸濁系に、前記所定塩基数よりも十分に
大きい所定ベースの一本鎖の標的遺伝物質を投入懸濁さ
せて、前記標的遺伝物質に前記第１のコード化オリゴヌ
クレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドを
ハイブリダイズさせる対合工程と、第１のコード化オリ
ゴヌクレオチドまたは第２のコード化オリゴヌクレオチ
ドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する
解離工程と、前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴ
ヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチド
の対を選別する選別工程と、選別された第１のコード化
オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードお
よび第２のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列
を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的
遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程とを有している
ものである。
【００３１】ここで、選別工程は、コード化が、蛍光等
の発光物質で行われている場合には、例えば、フローサ
イトメーターを用いて、第１のコード化オリゴヌクレオ
チドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの発光波
長の対が存在する場合のみそのオリゴヌクレオチド対を
選別する。また、第１および第２のグループの一方のコ
ード化オリゴヌクレオチドが磁性粒子を有する場合に
は、液通路内に外部から磁場を及ぼすことによってオリ
ゴヌクレオチドを液通路内壁に吸着して分離して選別
し、かつ、フローサイトメーターによって該当する発光
波長が存在する場合のみを選別する。または、フローサ
イトメーターによって、各波長の発光強度を考慮するこ
とにより重複出現数を決定するようにしても良い。
の発光物質で行われている場合には、例えば、フローサ
イトメーターを用いて、第１のコード化オリゴヌクレオ
チドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの発光波
長の対が存在する場合のみそのオリゴヌクレオチド対を
選別する。また、第１および第２のグループの一方のコ
ード化オリゴヌクレオチドが磁性粒子を有する場合に
は、液通路内に外部から磁場を及ぼすことによってオリ
ゴヌクレオチドを液通路内壁に吸着して分離して選別
し、かつ、フローサイトメーターによって該当する発光
波長が存在する場合のみを選別する。または、フローサ
イトメーターによって、各波長の発光強度を考慮するこ
とにより重複出現数を決定するようにしても良い。
【００３２】第十一の発明は、前記発明において、前記
対合工程において、前記第１のコード化オリゴヌクレオ
チドは、その群に属するものとして選別可能であるよう
にコード化されるとともに、前記各第２のコード化オリ
ゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒
子に保持されるように設けることによって、その群に属
するものとして選別可能であり、前記選別工程は、磁場
操作によって第２のコード化オリゴヌクレオチドを分離
する分離工程を有しているものである。
対合工程において、前記第１のコード化オリゴヌクレオ
チドは、その群に属するものとして選別可能であるよう
にコード化されるとともに、前記各第２のコード化オリ
ゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒
子に保持されるように設けることによって、その群に属
するものとして選別可能であり、前記選別工程は、磁場
操作によって第２のコード化オリゴヌクレオチドを分離
する分離工程を有しているものである。
【００３３】第十二の発明は、前記各発明において、第
２のコード化オリゴヌクレオチドが担体として磁性粒子
を有している場合には、前記選別工程は、液通路、その
液通路に外部から磁場を及ぼしかつ除去する磁力部、お
よびその液通路内の圧力を制御して流体の吸引および吐
出を行う圧力制御部を有する分注機を用いて、その液通
路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによっ
て、前記第２のコード化オリゴヌクレオチドが有する前
記磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱す
るものである。
２のコード化オリゴヌクレオチドが担体として磁性粒子
を有している場合には、前記選別工程は、液通路、その
液通路に外部から磁場を及ぼしかつ除去する磁力部、お
よびその液通路内の圧力を制御して流体の吸引および吐
出を行う圧力制御部を有する分注機を用いて、その液通
路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによっ
て、前記第２のコード化オリゴヌクレオチドが有する前
記磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱す
るものである。
【００３４】第十三の発明は、第一の発明ないし第九の
発明のいずれかの２つの略同一の懸濁系を用意し、その
一方に、第一の試料から抽出して得られた所定ベースの
一本鎖の第一の標的遺伝物質を投入懸濁させ、他方に、
第二の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の
第二の標的遺伝物質を投入懸濁させ、各標的物質に前記
第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード
化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程
と、各々、第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第
２のコード化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺
伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液
中から、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２
のコード化オリゴヌクレオチドを選別する選別工程と、
各々、選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの
示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オ
リゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの
組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を
決定する決定工程と、前記第一の標的遺伝物質について
決定された塩基配列と、前記第二の標的遺伝物質につい
て決定された塩基配列とを比較することによってＳＮＰ
s の同定を行う同定工程と、を有するものである。ここ
で、「略同一」とは、少なくとも構成要素とその量（濃
度および絶対量）とが略同一であることを意味する。な
お、第七の発明で用いた第１のコード化オリゴヌクレオ
チドと第八の発明で用いた第２のコード化オリゴヌクレ
オチドについては、町田雅之氏およびＰＳＳ株式会社等
が出願中の特許出願（特願平１０−２０６,０５７号）
および国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０３８２４）の発
明を利用したものである。
発明のいずれかの２つの略同一の懸濁系を用意し、その
一方に、第一の試料から抽出して得られた所定ベースの
一本鎖の第一の標的遺伝物質を投入懸濁させ、他方に、
第二の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の
第二の標的遺伝物質を投入懸濁させ、各標的物質に前記
第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード
化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程
と、各々、第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第
２のコード化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺
伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液
中から、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２
のコード化オリゴヌクレオチドを選別する選別工程と、
各々、選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの
示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オ
リゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの
組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を
決定する決定工程と、前記第一の標的遺伝物質について
決定された塩基配列と、前記第二の標的遺伝物質につい
て決定された塩基配列とを比較することによってＳＮＰ
s の同定を行う同定工程と、を有するものである。ここ
で、「略同一」とは、少なくとも構成要素とその量（濃
度および絶対量）とが略同一であることを意味する。な
お、第七の発明で用いた第１のコード化オリゴヌクレオ
チドと第八の発明で用いた第２のコード化オリゴヌクレ
オチドについては、町田雅之氏およびＰＳＳ株式会社等
が出願中の特許出願（特願平１０−２０６,０５７号）
および国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０３８２４）の発
明を利用したものである。
【００３５】
【発明の実施の形態】本発明の実施の形態に係る遺伝物
質シーケンス方法について、図１および図２に基づいて
説明する。その実施の形態は特に指定がない限り本発明
を制限するものではない。
質シーケンス方法について、図１および図２に基づいて
説明する。その実施の形態は特に指定がない限り本発明
を制限するものではない。
【００３６】本実施の形態に係る方法は、次のような分
注機（ＰＳＳ株式会社が特許出願中、出願番号：特願平
６−１５７,９５９号および特願平７ー３９,４２５号）
を利用したものである。その分注機（図示せず）は、着
脱自在にピペットチップが各々挿着される８連のノズル
と、液体の吸引吐出を行う吸引吐出機構と、そのノズル
に挿着したピペットチップの液通路の外部から磁場を及
ぼしまたは除去することが可能な磁力部とを有するもの
である。また、その分注機および分注機のノズルをステ
ージの平面に平行および上下方向に沿って移動可能な移
動部を有しているものである。
注機（ＰＳＳ株式会社が特許出願中、出願番号：特願平
６−１５７,９５９号および特願平７ー３９,４２５号）
を利用したものである。その分注機（図示せず）は、着
脱自在にピペットチップが各々挿着される８連のノズル
と、液体の吸引吐出を行う吸引吐出機構と、そのノズル
に挿着したピペットチップの液通路の外部から磁場を及
ぼしまたは除去することが可能な磁力部とを有するもの
である。また、その分注機および分注機のノズルをステ
ージの平面に平行および上下方向に沿って移動可能な移
動部を有しているものである。
【００３７】また、この分注機は前記吸引吐出機構の吸
引吐出の制御や、磁力部の磁場の制御、および移動制御
を行うための制御部を有する。制御部には、コンピュー
タを内蔵する処理手段と、ＣＲＴ、液晶等の表示部やプ
リンタ等の出力手段と、種々の処理手順の設定や指示、
データの入力等を行うためのキーボード、マウス、フロ
ッピー、ＣＤやＭＯ等のプログラムやデータが記録され
た記録媒体を読み取る読取装置等の入力手段と、通信網
に接続する通信部とを有している。さらに、ＤＮＡシー
ケンスを決定するためにはフローサイトメーター（図示
せず）を用いる。
引吐出の制御や、磁力部の磁場の制御、および移動制御
を行うための制御部を有する。制御部には、コンピュー
タを内蔵する処理手段と、ＣＲＴ、液晶等の表示部やプ
リンタ等の出力手段と、種々の処理手順の設定や指示、
データの入力等を行うためのキーボード、マウス、フロ
ッピー、ＣＤやＭＯ等のプログラムやデータが記録され
た記録媒体を読み取る読取装置等の入力手段と、通信網
に接続する通信部とを有している。さらに、ＤＮＡシー
ケンスを決定するためにはフローサイトメーター（図示
せず）を用いる。
【００３８】また、本実施の形態に係る遺伝物質シーケ
ンス決定を行うために次に示すような懸濁系を容器に収
容しておく。
ンス決定を行うために次に示すような懸濁系を容器に収
容しておく。
【００３９】その懸濁系は、第１のコード化オリゴヌク
レオチド群としての検出用オリゴヌクレオチド群と、第
２のコード化オリゴヌクレオチド群としての磁力操作可
能オリゴヌクレオチド群と、ＤＮＡリガーゼとを液体中
に懸濁混合させて容器に収容したものである。ここで、
第１のコード化オリゴヌクレオチド群と第２のコード化
オリゴヌクレオチド群の量（濃度および絶対量) は解析
を容易にするために略同一とする。
レオチド群としての検出用オリゴヌクレオチド群と、第
２のコード化オリゴヌクレオチド群としての磁力操作可
能オリゴヌクレオチド群と、ＤＮＡリガーゼとを液体中
に懸濁混合させて容器に収容したものである。ここで、
第１のコード化オリゴヌクレオチド群と第２のコード化
オリゴヌクレオチド群の量（濃度および絶対量) は解析
を容易にするために略同一とする。
【００４０】前記検出用オリゴヌクレオチド群は、少な
くとも塩基数３の１種類の塩基配列をもちその塩基配列
を識別するようにコード化された検出用オリゴヌクレオ
チドを、その塩基数３における全種類４3 （＝６４）種
類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属する
ものとして識別できるようにコード化することによって
各々選別可能に設けられたものである。また、前記磁力
操作可能オリゴヌクレオチド群は、少なくとも塩基数３
の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するよう
にコード化された磁力操作可能オリゴヌクレオチドを、
その塩基数における全種類４3 （＝６４）種類の塩基配
列を網羅するように包含し、磁力操作によって移動可能
とすることによって、その群に属するものとして各々選
別可能に設けられたものである。さらに、これら検出用
オリゴヌクレオチドおよび磁力操作可能オリゴヌクレオ
チドの各種類の塩基配列の量は解析を容易にするために
略同一となるようにしておく。
くとも塩基数３の１種類の塩基配列をもちその塩基配列
を識別するようにコード化された検出用オリゴヌクレオ
チドを、その塩基数３における全種類４3 （＝６４）種
類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属する
ものとして識別できるようにコード化することによって
各々選別可能に設けられたものである。また、前記磁力
操作可能オリゴヌクレオチド群は、少なくとも塩基数３
の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するよう
にコード化された磁力操作可能オリゴヌクレオチドを、
その塩基数における全種類４3 （＝６４）種類の塩基配
列を網羅するように包含し、磁力操作によって移動可能
とすることによって、その群に属するものとして各々選
別可能に設けられたものである。さらに、これら検出用
オリゴヌクレオチドおよび磁力操作可能オリゴヌクレオ
チドの各種類の塩基配列の量は解析を容易にするために
略同一となるようにしておく。
【００４１】また、前記ＤＮＡリガーゼは、２つのオリ
ゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズさ
れてその塩基配列の末端オリゴヌクレオチドの糖である
デオキシリボース同士が直接に隣接する場合であって、
各３塩基ずつの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相
補的である場合にのみ、前記２つのオリゴヌクレオチド
の末端のデオキシリボース同士を特異的に結合させる酵
素である。
ゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズさ
れてその塩基配列の末端オリゴヌクレオチドの糖である
デオキシリボース同士が直接に隣接する場合であって、
各３塩基ずつの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相
補的である場合にのみ、前記２つのオリゴヌクレオチド
の末端のデオキシリボース同士を特異的に結合させる酵
素である。
【００４２】前記検出用オリゴヌクレオチドは、１個の
非磁性の担体と、その担体に結合した３個の塩基の塩基
配列をもつ多数の１種類のそのオリゴヌクレオチドと、
その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌク
レオチドの一部と結合した標識物質である蛍光物質とか
らなり、その担体に保持された蛍光物質の全体は所定の
種類が所定の量比含まれるとともに、４3 （＝６４）種
類を識別するためのコード化は、蛍光物質の種類および
／または量比を変えることによって行われるものであ
る。ここで、蛍光物質は、例えば、検出用オリゴヌクレ
オチドに３種類、磁力操作用オリゴヌクレオチドにさら
に３種類を用いる。蛍光物質の種類には、例えば、ＦＩ
ＴＣ（フルオレッセイン・イソチオシアネート）、ロー
ダミン、イソチオシアネート、ＩＲＤ４０、ＣＹ３、Ｃ
Ｙ５、ユウロピウム錯体等がある。
非磁性の担体と、その担体に結合した３個の塩基の塩基
配列をもつ多数の１種類のそのオリゴヌクレオチドと、
その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌク
レオチドの一部と結合した標識物質である蛍光物質とか
らなり、その担体に保持された蛍光物質の全体は所定の
種類が所定の量比含まれるとともに、４3 （＝６４）種
類を識別するためのコード化は、蛍光物質の種類および
／または量比を変えることによって行われるものであ
る。ここで、蛍光物質は、例えば、検出用オリゴヌクレ
オチドに３種類、磁力操作用オリゴヌクレオチドにさら
に３種類を用いる。蛍光物質の種類には、例えば、ＦＩ
ＴＣ（フルオレッセイン・イソチオシアネート）、ロー
ダミン、イソチオシアネート、ＩＲＤ４０、ＣＹ３、Ｃ
Ｙ５、ユウロピウム錯体等がある。
【００４３】また、前記磁力操作可能オリゴヌクレオチ
ドは、１個の磁性の担体と、その担体に結合した３個の
塩基の塩基配列をもつ１種類の多数のそのオリゴヌクレ
オチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でその
オリゴヌクレオチドの一部と結合した標識物質である蛍
光物質とからなり、その担体に保持された蛍光物質の全
体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、４
3 （＝６４）種類を識別するためのコード化は、蛍光物
質の種類および／または量比を変えることによって行わ
れるものである。ここで、コード化のために使用される
前記オリゴヌクレオチドには、ＩＭＰ（イノシン酸：プ
リン環にアミノ基や水酸基がついていない）等をアーム
またはスペーサーとして、担体又は標識物質との間に設
けることによって、蛍光物質のクエンチングを防止する
のが好ましい。
ドは、１個の磁性の担体と、その担体に結合した３個の
塩基の塩基配列をもつ１種類の多数のそのオリゴヌクレ
オチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でその
オリゴヌクレオチドの一部と結合した標識物質である蛍
光物質とからなり、その担体に保持された蛍光物質の全
体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、４
3 （＝６４）種類を識別するためのコード化は、蛍光物
質の種類および／または量比を変えることによって行わ
れるものである。ここで、コード化のために使用される
前記オリゴヌクレオチドには、ＩＭＰ（イノシン酸：プ
リン環にアミノ基や水酸基がついていない）等をアーム
またはスペーサーとして、担体又は標識物質との間に設
けることによって、蛍光物質のクエンチングを防止する
のが好ましい。
【００４４】続いて、本実施の形態に係る懸濁系を用い
た遺伝物質シーケンス決定方法を図１に基づいて説明す
る。
た遺伝物質シーケンス決定方法を図１に基づいて説明す
る。
【００４５】図１に示すように、本遺伝物質シーケンス
決定方法は、ステップＳ１で、ＤＮＡの塩基配列を決定
しようとする試料、例えば、ヒト等の細胞や細菌等か
ら、標的ＤＮＡ断片を抽出する。標的ＤＮＡ断片を抽出
するには、例えば、前記分注機を用いてベクターが導入
された細菌コロニーとＤＮＡ抽出液とを混合して可溶化
させ、磁性粒子を分注機を用いて混合することによって
所定ベース（１〜数キロベース）の標的ＤＮＡ断片を磁
性粒子に捕獲させる。その標的ＤＮＡ断片を捕獲した磁
性粒子を含む懸濁液を前記分注機の液通路を通過させる
際に、磁場を及ぼすことによって、液通路の内壁に吸着
させて分離する。さらに、磁性粒子を前記液通路の内壁
に吸着させたままで洗浄液を前記液通路を通して吸引す
ることによって前記磁性粒子、その磁性粒子に捕獲され
た標的ＤＮＡ断片および液通路を洗浄する。その後、磁
性粒子を液通路の内壁に吸着させたままでベクターを溶
出する。
決定方法は、ステップＳ１で、ＤＮＡの塩基配列を決定
しようとする試料、例えば、ヒト等の細胞や細菌等か
ら、標的ＤＮＡ断片を抽出する。標的ＤＮＡ断片を抽出
するには、例えば、前記分注機を用いてベクターが導入
された細菌コロニーとＤＮＡ抽出液とを混合して可溶化
させ、磁性粒子を分注機を用いて混合することによって
所定ベース（１〜数キロベース）の標的ＤＮＡ断片を磁
性粒子に捕獲させる。その標的ＤＮＡ断片を捕獲した磁
性粒子を含む懸濁液を前記分注機の液通路を通過させる
際に、磁場を及ぼすことによって、液通路の内壁に吸着
させて分離する。さらに、磁性粒子を前記液通路の内壁
に吸着させたままで洗浄液を前記液通路を通して吸引す
ることによって前記磁性粒子、その磁性粒子に捕獲され
た標的ＤＮＡ断片および液通路を洗浄する。その後、磁
性粒子を液通路の内壁に吸着させたままでベクターを溶
出する。
【００４６】次に、ステップＳ２で、前記抽出した環状
の前記標的ＤＮＡ断片が組み込まれたベクターについ
て、その環状標的ＤＮＡ断片を切断する。ここで、ベク
ターには、プラスミドまたはバクテリオファージ等を含
む。
の前記標的ＤＮＡ断片が組み込まれたベクターについ
て、その環状標的ＤＮＡ断片を切断する。ここで、ベク
ターには、プラスミドまたはバクテリオファージ等を含
む。
【００４７】ここで、前記切断工程は、前記標的ＤＮＡ
断片が組み込まれたベクターと所定試薬を各々収容した
各収容部から前記分注機の液通路を介して吸引し、恒温
機能を有する収容部に移動し、かつ吐出して環状の標的
ＤＮＡ断片を切断する。また前記所定試薬とは、水、切
断用バッファおよび切断酵素である。
断片が組み込まれたベクターと所定試薬を各々収容した
各収容部から前記分注機の液通路を介して吸引し、恒温
機能を有する収容部に移動し、かつ吐出して環状の標的
ＤＮＡ断片を切断する。また前記所定試薬とは、水、切
断用バッファおよび切断酵素である。
【００４８】ステップＳ３で、このようにして得られた
標的ＤＮＡ断片が懸濁する液に熱を加えた後、急冷する
ことによって、その標的ＤＮＡ断片を一本鎖に解離す
る。
標的ＤＮＡ断片が懸濁する液に熱を加えた後、急冷する
ことによって、その標的ＤＮＡ断片を一本鎖に解離す
る。
【００４９】ステップＳ４で、このようにして得られた
標的ＤＮＡ断片が懸濁する液を前記懸濁系に投入し、両
者を懸濁混合させる。すると、一本鎖化された標的ＤＮ
Ａ断片の塩基配列の３塩基ごとに、それと略相補的な前
記検出用オリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能オリゴ
ヌクレオチドがハイブリダイズする。このようにして、
その標的ＤＮＡ断片の塩基配列を介して、１種または２
種の検出用オリゴヌクレオチドのみ、１種または２種の
磁力操作可能オリゴヌクレオチドのみ、検出用オリゴヌ
クレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドの組み合
わせたものが得られる。さらに、この懸濁液中には、全
くハイブリダイズされない標的ＤＮＡ断片や、その標的
ＤＮＡ断片とハイブリダイズされない磁力操作可能オリ
ゴヌクレオチドや検出用オリゴヌクレオチドが懸濁され
ている状態となっている。
標的ＤＮＡ断片が懸濁する液を前記懸濁系に投入し、両
者を懸濁混合させる。すると、一本鎖化された標的ＤＮ
Ａ断片の塩基配列の３塩基ごとに、それと略相補的な前
記検出用オリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能オリゴ
ヌクレオチドがハイブリダイズする。このようにして、
その標的ＤＮＡ断片の塩基配列を介して、１種または２
種の検出用オリゴヌクレオチドのみ、１種または２種の
磁力操作可能オリゴヌクレオチドのみ、検出用オリゴヌ
クレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドの組み合
わせたものが得られる。さらに、この懸濁液中には、全
くハイブリダイズされない標的ＤＮＡ断片や、その標的
ＤＮＡ断片とハイブリダイズされない磁力操作可能オリ
ゴヌクレオチドや検出用オリゴヌクレオチドが懸濁され
ている状態となっている。
【００５０】標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされてい
る検出用オリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能オリゴ
ヌクレオチドとの３塩基を含む塩基配列端同士が隣接し
ている場合、前記ＤＮＡリガーゼの働きにより、これら
の３塩基ずつが標的ＤＮＡ断片の塩基配列と完全に相補
的である場合には、このオリゴヌクレオチドの末端ヌク
レオチドの糖であるデオキシリボース同士が結合し、各
々６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることにな
る。
る検出用オリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能オリゴ
ヌクレオチドとの３塩基を含む塩基配列端同士が隣接し
ている場合、前記ＤＮＡリガーゼの働きにより、これら
の３塩基ずつが標的ＤＮＡ断片の塩基配列と完全に相補
的である場合には、このオリゴヌクレオチドの末端ヌク
レオチドの糖であるデオキシリボース同士が結合し、各
々６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることにな
る。
【００５１】なお、前記標的ＤＮＡ断片にハイブリダイ
ズされた２つのオリゴヌクレオチドは必ずしも検出用オ
リゴヌクレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドの
組み合わせとは限らないし、また、塩基配列端同士が隣
接するものとも限られないが、ある確率でこれらの組み
合わせが必ず存在することは明らかである。
ズされた２つのオリゴヌクレオチドは必ずしも検出用オ
リゴヌクレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドの
組み合わせとは限らないし、また、塩基配列端同士が隣
接するものとも限られないが、ある確率でこれらの組み
合わせが必ず存在することは明らかである。
【００５２】図２は、この段階で、懸濁液中に存在する
標的ＤＮＡ断片１０にハイブリダイズされた、検出用オ
リゴヌクレオチド１２と、磁力操作可能オリゴヌクレオ
チド１１の組み合わせの例を示すものである。図２
（ａ）は、検出用オリゴヌクレオチド１１と磁力操作可
能オリゴヌクレオチド１１の３塩基ずつの塩基配列が標
的ＤＮＡ断片１０の塩基配列と相補的になるとともに、
その端塩基が隣接してハイブリダイズされている場合を
示す。この場合には、前記ＤＮＡリガーゼの働きによっ
て、両者の末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボー
ス同士が結合して６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得
られることになる。
標的ＤＮＡ断片１０にハイブリダイズされた、検出用オ
リゴヌクレオチド１２と、磁力操作可能オリゴヌクレオ
チド１１の組み合わせの例を示すものである。図２
（ａ）は、検出用オリゴヌクレオチド１１と磁力操作可
能オリゴヌクレオチド１１の３塩基ずつの塩基配列が標
的ＤＮＡ断片１０の塩基配列と相補的になるとともに、
その端塩基が隣接してハイブリダイズされている場合を
示す。この場合には、前記ＤＮＡリガーゼの働きによっ
て、両者の末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボー
ス同士が結合して６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得
られることになる。
【００５３】一方、図２（ｂ）は、検出用オリゴヌクレ
オチド１２と、磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１の
３塩基ずつの塩基配列が標的ＤＮＡ断片の塩基配列と相
補的となっていないため、その端塩基が隣接してハイブ
リダイズされているが、両者の末端ヌクレオチドの糖で
あるデオキシリボーズ同士が結合しない場合を示してい
る。
オチド１２と、磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１の
３塩基ずつの塩基配列が標的ＤＮＡ断片の塩基配列と相
補的となっていないため、その端塩基が隣接してハイブ
リダイズされているが、両者の末端ヌクレオチドの糖で
あるデオキシリボーズ同士が結合しない場合を示してい
る。
【００５４】図２中小さい白丸○は各種塩基を表す。ま
た、二重丸◎は例えば、ＩＭＰ（イノシン酸）等の物質
を表す。黒丸●は、図１（ａ）の標的ＤＮＡ断片１０
と、図１（ｂ）の標的ＤＮＡ断片１０ｓのうち異なる塩
基（ＳＮＰ）を表すものである。
た、二重丸◎は例えば、ＩＭＰ（イノシン酸）等の物質
を表す。黒丸●は、図１（ａ）の標的ＤＮＡ断片１０
と、図１（ｂ）の標的ＤＮＡ断片１０ｓのうち異なる塩
基（ＳＮＰ）を表すものである。
【００５５】同図に示すように、磁力操作可能オリゴヌ
クレオチド１１は、３塩基１５をもつ１種類の多数のオ
リゴヌクレオチドがアーム１６およびビオチン１７を介
して磁性の担体である磁性粒子１８に結合している。磁
性粒子１８の表面は、前記ビオチンと特異的に結合する
アビジンでコーティングされている。また、一部のオリ
ゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドには、標識化物質で
ある蛍光物質１３、１４が結合して、そのオリゴヌクレ
オチドを識別する。検出用オリゴヌクレオチド１２は、
３塩基１９をもち、アーム２０を介して図示しない非磁
性の担体と結合する構造である。
クレオチド１１は、３塩基１５をもつ１種類の多数のオ
リゴヌクレオチドがアーム１６およびビオチン１７を介
して磁性の担体である磁性粒子１８に結合している。磁
性粒子１８の表面は、前記ビオチンと特異的に結合する
アビジンでコーティングされている。また、一部のオリ
ゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドには、標識化物質で
ある蛍光物質１３、１４が結合して、そのオリゴヌクレ
オチドを識別する。検出用オリゴヌクレオチド１２は、
３塩基１９をもち、アーム２０を介して図示しない非磁
性の担体と結合する構造である。
【００５６】ここで、「一部のオリゴヌクレオチド」と
は、磁性粒子１８または図示しない非磁性の粒子に保持
された全オリゴヌクレオチドの１％または１０％以下で
ある。また、量比は例えば、０．２５％、０．５％、
０．７５％および１．０％（または、２．５％、５．０
％、７．５％、および１０．０％）のように変えること
によって、蛍光物質の各種類について、４段階を識別す
るようにコード化する。また、検出用オリゴヌクレオチ
ドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドに使用する蛍光物
質の種類を異ならせることによって、各々が選別可能で
ある。
は、磁性粒子１８または図示しない非磁性の粒子に保持
された全オリゴヌクレオチドの１％または１０％以下で
ある。また、量比は例えば、０．２５％、０．５％、
０．７５％および１．０％（または、２．５％、５．０
％、７．５％、および１０．０％）のように変えること
によって、蛍光物質の各種類について、４段階を識別す
るようにコード化する。また、検出用オリゴヌクレオチ
ドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドに使用する蛍光物
質の種類を異ならせることによって、各々が選別可能で
ある。
【００５７】ステップＳ５で、この懸濁液全体を、前記
分注機で吸引し、一定の温度状態に保たれている恒温槽
に移送し吐出することによって加熱する。これによっ
て、前記標的ＤＮＡ断片が一本鎖化されることによっ
て、その標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされているオ
リゴヌクレオチドが解離する。その際、図２（ａ）に示
すように２つのオリゴヌクレオチドが前記ＤＮＡリガー
ゼによって結合している場合には、６塩基配列のオリゴ
ヌクレオチドが得られることになるが、図２（ｂ）に示
すように、たとえ、ハイブリダイズした２つのオリゴヌ
クレオチドであっても、完全に相補的でないために、Ｄ
ＮＡリガーゼによって結合していない場合には、３塩基
配列のままのオリゴヌクレオチドとして懸濁液中に懸濁
することになる。したがって、この段階では、６塩基の
塩基配列をもつオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ断片
の塩基配列に完全に相補的になっている塩基配列のみが
存在することになる。
分注機で吸引し、一定の温度状態に保たれている恒温槽
に移送し吐出することによって加熱する。これによっ
て、前記標的ＤＮＡ断片が一本鎖化されることによっ
て、その標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされているオ
リゴヌクレオチドが解離する。その際、図２（ａ）に示
すように２つのオリゴヌクレオチドが前記ＤＮＡリガー
ゼによって結合している場合には、６塩基配列のオリゴ
ヌクレオチドが得られることになるが、図２（ｂ）に示
すように、たとえ、ハイブリダイズした２つのオリゴヌ
クレオチドであっても、完全に相補的でないために、Ｄ
ＮＡリガーゼによって結合していない場合には、３塩基
配列のままのオリゴヌクレオチドとして懸濁液中に懸濁
することになる。したがって、この段階では、６塩基の
塩基配列をもつオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ断片
の塩基配列に完全に相補的になっている塩基配列のみが
存在することになる。
【００５８】ステップＳ６で、前記分注機がこの懸濁液
を吸引する際に、磁場を分注機の液通路内に及ぼすこと
によって、前記オリゴヌクレオチドのうち、磁性粒子を
有するオリゴヌクレオチドのみを液通路の内壁に吸着さ
せて分離する。液通路の内壁にオリゴヌクレオチドを吸
着させたまま、洗浄液等の吸引および吐出を繰り返すこ
とによって、吸着させたオリゴヌクレオチドを洗浄す
る。これによって、磁性粒子をもっていない単独の検出
用オリゴヌクレオチドや、検出用オリゴヌクレオチド同
士が結合したものや、単独の標的ＤＮＡ断片や夾雑物等
を除去することができる。洗浄されかつ分注機の液通路
の内壁に吸着したオリゴヌクレオチドを別容器にまで移
送し、磁場を除去した状態で吸引吐出を繰り返すことに
よって、液通路の内壁から磁性粒子を離脱させ、液中に
再懸濁させる。
を吸引する際に、磁場を分注機の液通路内に及ぼすこと
によって、前記オリゴヌクレオチドのうち、磁性粒子を
有するオリゴヌクレオチドのみを液通路の内壁に吸着さ
せて分離する。液通路の内壁にオリゴヌクレオチドを吸
着させたまま、洗浄液等の吸引および吐出を繰り返すこ
とによって、吸着させたオリゴヌクレオチドを洗浄す
る。これによって、磁性粒子をもっていない単独の検出
用オリゴヌクレオチドや、検出用オリゴヌクレオチド同
士が結合したものや、単独の標的ＤＮＡ断片や夾雑物等
を除去することができる。洗浄されかつ分注機の液通路
の内壁に吸着したオリゴヌクレオチドを別容器にまで移
送し、磁場を除去した状態で吸引吐出を繰り返すことに
よって、液通路の内壁から磁性粒子を離脱させ、液中に
再懸濁させる。
【００５９】こうして得られた懸濁液中には、単独の磁
力操作可能オリゴヌクレオチド、磁力操作可能オリゴヌ
クレオチド同士が結合したもの、磁力操作可能オリゴヌ
クレオチドと検出用オリゴヌクレオチドとが結合したも
のが懸濁液中に存在することになる。
力操作可能オリゴヌクレオチド、磁力操作可能オリゴヌ
クレオチド同士が結合したもの、磁力操作可能オリゴヌ
クレオチドと検出用オリゴヌクレオチドとが結合したも
のが懸濁液中に存在することになる。
【００６０】ステップＳ７で、この懸濁液をフローサイ
トメーターの管路を通過させることによって前記オリゴ
ヌクレオチドのコードを読み取る。このフローサイトメ
ーターの管路には、一定の励起波長の光を照射させる発
光手段と、励起された標識物質である蛍光物質からの光
を受光する受光手段と、受光した光を解析する解析部が
設けられたものである。
トメーターの管路を通過させることによって前記オリゴ
ヌクレオチドのコードを読み取る。このフローサイトメ
ーターの管路には、一定の励起波長の光を照射させる発
光手段と、励起された標識物質である蛍光物質からの光
を受光する受光手段と、受光した光を解析する解析部が
設けられたものである。
【００６１】前記解析部は、単独の磁力操作可能オリゴ
ヌクレオチドを排除するために検出用オリゴヌクレオチ
ドのグループを識別するコードである蛍光物質の種類が
あるもののみを選別して、そのコードの組み合わせであ
る蛍光物質の種類を特定する。これによって、磁力操作
可能オリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドの
コードの組み合わせを読み取ることになる。
ヌクレオチドを排除するために検出用オリゴヌクレオチ
ドのグループを識別するコードである蛍光物質の種類が
あるもののみを選別して、そのコードの組み合わせであ
る蛍光物質の種類を特定する。これによって、磁力操作
可能オリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドの
コードの組み合わせを読み取ることになる。
【００６２】ステップＳ８で、読み取られたコードの組
み合わせから、標的ＤＮＡ断片に存在するの６塩基分の
塩基配列を決定することができる。このようなコードの
組み合わせを、その標的ＤＮＡ断片の塩基配列が順次つ
ながるように、配列を決定することによって、標的ＤＮ
Ａ断片に存在する全塩基配列を決定することができるこ
とになる。もし、前記標的ＤＮＡ断片のベースが、４０
９６塩基配列よりも長い場合、または繰返しを含む配列
である場合には、重複出現数を発光強度に基づいて決定
するようにする。本実施の形態によれば、６塩基ずつの
コードの組み合わせによる発光を測定することができる
ので、高い信頼性で測定を行うことができる。
み合わせから、標的ＤＮＡ断片に存在するの６塩基分の
塩基配列を決定することができる。このようなコードの
組み合わせを、その標的ＤＮＡ断片の塩基配列が順次つ
ながるように、配列を決定することによって、標的ＤＮ
Ａ断片に存在する全塩基配列を決定することができるこ
とになる。もし、前記標的ＤＮＡ断片のベースが、４０
９６塩基配列よりも長い場合、または繰返しを含む配列
である場合には、重複出現数を発光強度に基づいて決定
するようにする。本実施の形態によれば、６塩基ずつの
コードの組み合わせによる発光を測定することができる
ので、高い信頼性で測定を行うことができる。
【００６３】続いて、本実施の形態に係るＳＮＰs のス
コアリング方法について、図３に基づいて説明する。本
実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法において
も、前述したように、分注機、移動部、制御部、ステー
ジおよびフローサイトメーターを用いる。
コアリング方法について、図３に基づいて説明する。本
実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法において
も、前述したように、分注機、移動部、制御部、ステー
ジおよびフローサイトメーターを用いる。
【００６４】本実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリン
グ方法を行うためには、解析の容易化のため前述した懸
濁系を同量（濃度および絶対量）および同じ構成要素の
ものを第一の懸濁系および第二の懸濁系として、予め２
つの別の容器に用意しておく。
グ方法を行うためには、解析の容易化のため前述した懸
濁系を同量（濃度および絶対量）および同じ構成要素の
ものを第一の懸濁系および第二の懸濁系として、予め２
つの別の容器に用意しておく。
【００６５】図３に示すように、本ＳＮＰs のスコアリ
ング方法は、２つの異なる第一の試料および第二の試料
から各々抽出した第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ
断片の塩基配列を比較することによって、ＳＮＰs （多
型の塩基配列）を決定しようとするものである。
ング方法は、２つの異なる第一の試料および第二の試料
から各々抽出した第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ
断片の塩基配列を比較することによって、ＳＮＰs （多
型の塩基配列）を決定しようとするものである。
【００６６】図３のステップＳ１１で、第一の試料から
所定ベースの第一のＤＮＡ断片が組み込まれたベクター
を抽出し、ステップＳ２１で、第二の試料から所定ベー
スの第二のＤＮＡ断片が組み込まれたベクターを抽出す
る。抽出の方法については、既に、ステップＳ１で説明
したとおりである。ここで、「所定ベース」は、その断
片中に数個のＳＮＰｓが含まれる場合に検出可能である
ので、３００〜５００塩基対にひとつＳＮＰｓが存在
し、特定の６塩基配列が平均４０９６（＝４6 ）塩基対
にひとつ存在することから、１〜数キロベースである。
所定ベースの第一のＤＮＡ断片が組み込まれたベクター
を抽出し、ステップＳ２１で、第二の試料から所定ベー
スの第二のＤＮＡ断片が組み込まれたベクターを抽出す
る。抽出の方法については、既に、ステップＳ１で説明
したとおりである。ここで、「所定ベース」は、その断
片中に数個のＳＮＰｓが含まれる場合に検出可能である
ので、３００〜５００塩基対にひとつＳＮＰｓが存在
し、特定の６塩基配列が平均４０９６（＝４6 ）塩基対
にひとつ存在することから、１〜数キロベースである。
【００６７】ステップＳ１２およびステップＳ２２で、
各々、環状の第一のＤＮＡ断片および環状の第二のＤＮ
Ａ断片を切断する。その方法については、前述したステ
ップＳ２で説明した通りである。
各々、環状の第一のＤＮＡ断片および環状の第二のＤＮ
Ａ断片を切断する。その方法については、前述したステ
ップＳ２で説明した通りである。
【００６８】ステップＳ１３およびステップＳ２３で、
各々、第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ断片が懸濁
する液に熱を加えた後、急冷することによって二本鎖を
一本鎖化する。
各々、第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ断片が懸濁
する液に熱を加えた後、急冷することによって二本鎖を
一本鎖化する。
【００６９】ステップＳ１４およびステップＳ２４で、
このようにして得られた第一のＤＮＡ断片を、第一の懸
濁系に投入して懸濁混合させるとともに、第二のＤＮＡ
断片を第二の懸濁系に投入して懸濁混合させる。
このようにして得られた第一のＤＮＡ断片を、第一の懸
濁系に投入して懸濁混合させるとともに、第二のＤＮＡ
断片を第二の懸濁系に投入して懸濁混合させる。
【００７０】ステップＳ１５およびステップＳ２５にお
いて、各懸濁液全体を、前記分注機で吸引し、一定の温
度状態に保たれている恒温槽に移送し吐出することによ
って加熱する。これによって、前記第一のＤＮＡ断片お
よび第二のＤＮＡ断片が一本鎖化されることになる。
いて、各懸濁液全体を、前記分注機で吸引し、一定の温
度状態に保たれている恒温槽に移送し吐出することによ
って加熱する。これによって、前記第一のＤＮＡ断片お
よび第二のＤＮＡ断片が一本鎖化されることになる。
【００７１】ステップＳ１６およびステップＳ２６で、
前記分注機が各懸濁液を吸引する際に、磁場を分注機の
液通路内に及ぼすことによって、前記オリゴヌクレオチ
ドのうち磁性粒子を有するオリゴヌクレオチドのみをそ
の液通路の内壁に吸着させて分離する。液通路の内壁に
オリゴヌクレオチドを吸着させたまま、洗浄液等の吸引
および吐出を繰り返すことによって、吸着させたオリゴ
ヌクレオチドを洗浄する。これによって、磁性粒子をも
っていない単独の検出用オリゴヌクレオチオドや、検出
用オリゴヌクレオチド同士を結合したものや、第１のＤ
ＮＡ断片や夾雑物等を除去することができる。洗浄され
かつ分注機の液通路の内壁に吸着したオリゴヌクレオチ
ドを別容器にまで移送し、吸引吐出を繰り返すことによ
て再懸濁させる。
前記分注機が各懸濁液を吸引する際に、磁場を分注機の
液通路内に及ぼすことによって、前記オリゴヌクレオチ
ドのうち磁性粒子を有するオリゴヌクレオチドのみをそ
の液通路の内壁に吸着させて分離する。液通路の内壁に
オリゴヌクレオチドを吸着させたまま、洗浄液等の吸引
および吐出を繰り返すことによって、吸着させたオリゴ
ヌクレオチドを洗浄する。これによって、磁性粒子をも
っていない単独の検出用オリゴヌクレオチオドや、検出
用オリゴヌクレオチド同士を結合したものや、第１のＤ
ＮＡ断片や夾雑物等を除去することができる。洗浄され
かつ分注機の液通路の内壁に吸着したオリゴヌクレオチ
ドを別容器にまで移送し、吸引吐出を繰り返すことによ
て再懸濁させる。
【００７２】ステップＳ１７およびステップＳ２７にお
いて、前記フローサイトメーターを用いて、前述した方
法で、解析部は、単独の磁力操作可能オリゴヌクレオチ
ドを排除するために検出用オリゴヌクレオチドのグルー
プを識別するコードである蛍光物質があるもののみを選
択して、そのコードの組み合わせである蛍光物質の種類
を特定する。これによって、磁力操作可能オリゴヌクレ
オチドと検出用オリゴヌクレオチドのコードの組み合わ
せを読み取ることができる。
いて、前記フローサイトメーターを用いて、前述した方
法で、解析部は、単独の磁力操作可能オリゴヌクレオチ
ドを排除するために検出用オリゴヌクレオチドのグルー
プを識別するコードである蛍光物質があるもののみを選
択して、そのコードの組み合わせである蛍光物質の種類
を特定する。これによって、磁力操作可能オリゴヌクレ
オチドと検出用オリゴヌクレオチドのコードの組み合わ
せを読み取ることができる。
【００７３】ステップＳ１８で、読み取られたコードの
組み合わせによって得られた第一のＤＮＡ断片の塩基配
列と第二のＤＮＡ断片の塩基配列とを比較し、１または
２以上の異なる塩基があれば、各々がＳＮＰ(s) であ
る。例えば、第一の試料から得られた第一の標的ＤＮＡ
断片１０については、図２（ａ）の塩基配列であるが、
第２の試料から得られた第二の標的ＤＮＡ断片１０ｓに
ついては、第一の標的ＤＮＡ断片１０と塩基２１が異な
ることが、コードの解析によって判明したとすれば、塩
基２１の塩基配列の位置において多型であることが決定
される。本実施の形態によれば、リガーゼ反応産物の差
を見るだけでＳＮＰs を検出することができるので、高
い信頼性で容易に結果を得ることができる。
組み合わせによって得られた第一のＤＮＡ断片の塩基配
列と第二のＤＮＡ断片の塩基配列とを比較し、１または
２以上の異なる塩基があれば、各々がＳＮＰ(s) であ
る。例えば、第一の試料から得られた第一の標的ＤＮＡ
断片１０については、図２（ａ）の塩基配列であるが、
第２の試料から得られた第二の標的ＤＮＡ断片１０ｓに
ついては、第一の標的ＤＮＡ断片１０と塩基２１が異な
ることが、コードの解析によって判明したとすれば、塩
基２１の塩基配列の位置において多型であることが決定
される。本実施の形態によれば、リガーゼ反応産物の差
を見るだけでＳＮＰs を検出することができるので、高
い信頼性で容易に結果を得ることができる。
【００７４】これらの実施の形態は本発明をより良く理
解させるために具体的に説明したものであって、別形態
を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変
更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明で
は、ＤＮＡ断片については、ベクターを利用して増殖お
よび抽出を行って得るようにしたが、この場合に限られ
ることなく、例えば、抽出したＤＮＡ断片にＰＣＲプラ
イマを結合しＰＣＲ法によって増幅することによってＤ
ＮＡを得て、熱変成させた一本鎖化ＤＮＡを用いるよう
にしても良く、またはクローン化を行うことによって、
同一の塩基配列をもつ標的ＤＮＡ断片を得ることができ
る。さらに、前記一本鎖化を行うには、熱した後急冷す
る方法の他に、アルカリ溶液を加えることによって行っ
ても良い。この場合には緩衝剤が必要になる。
解させるために具体的に説明したものであって、別形態
を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変
更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明で
は、ＤＮＡ断片については、ベクターを利用して増殖お
よび抽出を行って得るようにしたが、この場合に限られ
ることなく、例えば、抽出したＤＮＡ断片にＰＣＲプラ
イマを結合しＰＣＲ法によって増幅することによってＤ
ＮＡを得て、熱変成させた一本鎖化ＤＮＡを用いるよう
にしても良く、またはクローン化を行うことによって、
同一の塩基配列をもつ標的ＤＮＡ断片を得ることができ
る。さらに、前記一本鎖化を行うには、熱した後急冷す
る方法の他に、アルカリ溶液を加えることによって行っ
ても良い。この場合には緩衝剤が必要になる。
【００７５】以上の例では、予め用意した懸濁系には、
所定塩基数である３個の全種類である４3 種類ずつの１
２８種類のオリゴヌクレオチドを懸濁させていたが、こ
の種類を絞り込むことができる場合には、特定種類のオ
リゴヌクレオチドを懸濁させておくようにしても良い。
また、所定塩基数として、３個の場合についてのみ説明
したが、３個以上の場合であっても良い。
所定塩基数である３個の全種類である４3 種類ずつの１
２８種類のオリゴヌクレオチドを懸濁させていたが、こ
の種類を絞り込むことができる場合には、特定種類のオ
リゴヌクレオチドを懸濁させておくようにしても良い。
また、所定塩基数として、３個の場合についてのみ説明
したが、３個以上の場合であっても良い。
【００７６】さらに、前記酵素として、２つのオリゴヌ
クレオチドが標的の一本鎖のＤＮＡ断片に隣接してハイ
ブリダイズした場合に、３つの塩基ずつを認識して２つ
のオリゴヌクレオチドを特異的に結合するようにしてい
るが、このような場合に限られない。
クレオチドが標的の一本鎖のＤＮＡ断片に隣接してハイ
ブリダイズした場合に、３つの塩基ずつを認識して２つ
のオリゴヌクレオチドを特異的に結合するようにしてい
るが、このような場合に限られない。
【００７７】また、塩基配列を決定するには、１個１個
のオリゴヌクレオチドのコードを読み取ることによっ
て、コードの組み合わせから、６つの塩基配列を決定す
る場合について説明したが、このような場合に限られ
ず、複数個または多数個のオリゴヌクレオチド対につい
て蛍光等の強度を測定することによって、塩基配列を決
定するようにしても良い。また、以上の例では、第１の
コード化オリゴヌクレオチドは非磁性の担体を有するも
のを用いたが、担体を有しないものを用いても良い。ま
た、その全部または一部について、ジデオキシリボース
を設けたものを用いても良い。さらに、第２のコード化
オリゴヌクレオチドに磁性担体を用いずに、コードによ
って選別可能なものを用いても良い。
のオリゴヌクレオチドのコードを読み取ることによっ
て、コードの組み合わせから、６つの塩基配列を決定す
る場合について説明したが、このような場合に限られ
ず、複数個または多数個のオリゴヌクレオチド対につい
て蛍光等の強度を測定することによって、塩基配列を決
定するようにしても良い。また、以上の例では、第１の
コード化オリゴヌクレオチドは非磁性の担体を有するも
のを用いたが、担体を有しないものを用いても良い。ま
た、その全部または一部について、ジデオキシリボース
を設けたものを用いても良い。さらに、第２のコード化
オリゴヌクレオチドに磁性担体を用いずに、コードによ
って選別可能なものを用いても良い。
【００７８】
【発明の効果】第一の発明に係る懸濁系、第十の発明に
係る方法または第十三の発明に係るＳＮＰs の決定方法
は、所定塩基数の塩基配列をもつコード化された第１の
コード化オリゴヌクレオチド群および第２のコード化オ
リゴヌクレオチド群の２つのグループを用いるととも
に、遺伝物質と一定の関係がある場合のみ、その末端ヌ
クレオチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に
結合させる酵素を有している。したがって、ＤＮＡチッ
プのように単にハイブリダイゼーションを利用して、相
補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を得る場合に比較
して、より高い信頼性で、かつ容易に遺伝物質のシーケ
ンスを決定することができる。
係る方法または第十三の発明に係るＳＮＰs の決定方法
は、所定塩基数の塩基配列をもつコード化された第１の
コード化オリゴヌクレオチド群および第２のコード化オ
リゴヌクレオチド群の２つのグループを用いるととも
に、遺伝物質と一定の関係がある場合のみ、その末端ヌ
クレオチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に
結合させる酵素を有している。したがって、ＤＮＡチッ
プのように単にハイブリダイゼーションを利用して、相
補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を得る場合に比較
して、より高い信頼性で、かつ容易に遺伝物質のシーケ
ンスを決定することができる。
【００７９】さらに、ＳＮＰs を特定するために塩基配
列の種々の態様のオリゴヌクレオチドをＤＮＡチップに
固定するという加工作業を行うことなく、種々の塩基配
列をもつオリゴヌクレオチドを懸濁させるという作業に
よって、簡単かつ容易に塩基配列を決定することができ
る。
列の種々の態様のオリゴヌクレオチドをＤＮＡチップに
固定するという加工作業を行うことなく、種々の塩基配
列をもつオリゴヌクレオチドを懸濁させるという作業に
よって、簡単かつ容易に塩基配列を決定することができ
る。
【００８０】また、本発明では、スライドグラス等の平
板上のスポット内の限られた狭い平面上のハイブリダイ
ゼーション反応ではなく、懸濁系内の広い範囲内で、反
応を行うことができるので、反応効率を飛躍的に上昇さ
せ、平行に達するまでの時間を短縮することができる。
板上のスポット内の限られた狭い平面上のハイブリダイ
ゼーション反応ではなく、懸濁系内の広い範囲内で、反
応を行うことができるので、反応効率を飛躍的に上昇さ
せ、平行に達するまでの時間を短縮することができる。
【００８１】さらに、スライドグラス上に固定化したオ
リゴヌクレオチドの位置によりその配列を区別する方法
と異なり、コード化した多種類のオリゴヌクレオチドは
同一の反応液の中に共存するので、同一条件下で一括し
て反応を進めることができる。
リゴヌクレオチドの位置によりその配列を区別する方法
と異なり、コード化した多種類のオリゴヌクレオチドは
同一の反応液の中に共存するので、同一条件下で一括し
て反応を進めることができる。
【００８２】また、本発明では、長い塩基配列を一挙に
決定するのではなく、酵素が特異的結合を行うために認
識できる短い塩基配列を繰り返して適用することによっ
て、長い塩基配列を決定するようにしている。したがっ
て、決定に使用する第１のコード化オリゴヌクレオチド
群と第２のオリゴヌクレオチド群で必要とする塩基配列
の種類は、これらの塩基数の和に相当する塩基配列の決
定に必要とするオリゴヌクレオチドの種類数に比べて非
常に小さくて済むので、これらのコード化の作業が容易
である。例えば、前述した実施の形態では、全塩基配列
種類数は６４＋６４の１２８あれば足りる。一方、６塩
基配列についてのオリゴヌクレオチドを用意しようとす
ると、４6 ＝４０９６種類のものを用意する必要があ
り、塩基配列の種類は圧倒的に少なくて済む。
決定するのではなく、酵素が特異的結合を行うために認
識できる短い塩基配列を繰り返して適用することによっ
て、長い塩基配列を決定するようにしている。したがっ
て、決定に使用する第１のコード化オリゴヌクレオチド
群と第２のオリゴヌクレオチド群で必要とする塩基配列
の種類は、これらの塩基数の和に相当する塩基配列の決
定に必要とするオリゴヌクレオチドの種類数に比べて非
常に小さくて済むので、これらのコード化の作業が容易
である。例えば、前述した実施の形態では、全塩基配列
種類数は６４＋６４の１２８あれば足りる。一方、６塩
基配列についてのオリゴヌクレオチドを用意しようとす
ると、４6 ＝４０９６種類のものを用意する必要があ
り、塩基配列の種類は圧倒的に少なくて済む。
【００８３】第二の発明または第十一の発明は、前記各
第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のコード化オ
リゴヌクレオチドの一方を遠隔操作される磁性粒子に保
持されるように設けたものである。本発明によれば、磁
場を分注機のノズル等の液通路内に及ぼすことによっ
て、分離することができるので、磁性粒子を有していな
いコード化オリゴヌクレオチドを排除することができる
ので、磁性粒子を有しているコード化オリゴヌクレオチ
ドを容易かつ確実に選別することができる。
第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のコード化オ
リゴヌクレオチドの一方を遠隔操作される磁性粒子に保
持されるように設けたものである。本発明によれば、磁
場を分注機のノズル等の液通路内に及ぼすことによっ
て、分離することができるので、磁性粒子を有していな
いコード化オリゴヌクレオチドを排除することができる
ので、磁性粒子を有しているコード化オリゴヌクレオチ
ドを容易かつ確実に選別することができる。
【００８４】第三の発明および第四の発明では、前記各
第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード
化オリゴヌクレオチドの所定塩基数は、少なくとも３塩
基である。したがって、第１のコード化オリゴヌクレオ
チド群および第２のコード化オリゴヌクレオチド群の種
類は各々４3 種類で足りるので、６塩基をもつオリゴヌ
クレオチドのように４０９６種類を用意する必要がない
ので、圧倒的に小さい種類のものを用意すれば足りるの
で、作業が容易である。
第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード
化オリゴヌクレオチドの所定塩基数は、少なくとも３塩
基である。したがって、第１のコード化オリゴヌクレオ
チド群および第２のコード化オリゴヌクレオチド群の種
類は各々４3 種類で足りるので、６塩基をもつオリゴヌ
クレオチドのように４０９６種類を用意する必要がない
ので、圧倒的に小さい種類のものを用意すれば足りるの
で、作業が容易である。
【００８５】第五の発明によれば、種類および／または
量比を変えた標識物質をオリゴヌクレオチドに結合させ
ることによってコード化したものである。本発明によれ
ば、遺伝物質に応じて、数珠繋ぎに連結したオリゴヌク
レオチドを得ることができる。
量比を変えた標識物質をオリゴヌクレオチドに結合させ
ることによってコード化したものである。本発明によれ
ば、遺伝物質に応じて、数珠繋ぎに連結したオリゴヌク
レオチドを得ることができる。
【００８６】第六の発明によれば、全部にジデオキシリ
ボースを設けた場合には第１のコード化オリゴヌクレオ
チドと第２のオリゴヌクレオチドが１個ずつ（前記所定
塩基数ずつ）連結した二量体のみが得られることにな
る。これによって、塩基数列を揃えることができるの
で、例えば、発光物質によってコード化されている場合
にはコードの読取りを確実かつ容易に行うことができ
る。また、一部にジデオキシリボースを設けた場合には
第１のコード化オリゴヌクレオチドが１個、２個、３
個、それ以上と多数結合して最後にジデオキシリボース
が含まれた第１のコード化オリゴヌクレオチドが結合し
た結合体を同定することができる。これによって、ＤＮ
Ａシーケンスを比較的簡単に読み取ることができる。
ボースを設けた場合には第１のコード化オリゴヌクレオ
チドと第２のオリゴヌクレオチドが１個ずつ（前記所定
塩基数ずつ）連結した二量体のみが得られることにな
る。これによって、塩基数列を揃えることができるの
で、例えば、発光物質によってコード化されている場合
にはコードの読取りを確実かつ容易に行うことができ
る。また、一部にジデオキシリボースを設けた場合には
第１のコード化オリゴヌクレオチドが１個、２個、３
個、それ以上と多数結合して最後にジデオキシリボース
が含まれた第１のコード化オリゴヌクレオチドが結合し
た結合体を同定することができる。これによって、ＤＮ
Ａシーケンスを比較的簡単に読み取ることができる。
【００８７】第七の発明および第八の発明は、非磁性ま
たは磁性の担体にオリゴヌクレオチドを担持させ、一部
のオリゴヌクレオチドまたは担体に結合する標識物質の
種類および／または量比を変えることによってコード化
を行うものである。したがって、例えば、数十〜数百程
度の多種類の塩基配列を、確実明瞭にコード化して識別
することができる。さらに、微小粒子等の担体の表面上
で反応させることにより反応面積が増加し、反応効率を
飛躍的に上昇させることができる。
たは磁性の担体にオリゴヌクレオチドを担持させ、一部
のオリゴヌクレオチドまたは担体に結合する標識物質の
種類および／または量比を変えることによってコード化
を行うものである。したがって、例えば、数十〜数百程
度の多種類の塩基配列を、確実明瞭にコード化して識別
することができる。さらに、微小粒子等の担体の表面上
で反応させることにより反応面積が増加し、反応効率を
飛躍的に上昇させることができる。
【００８８】第九の発明は、アームを介してオリゴヌク
レオチドを担体または標識物質と結合したものである。
本発明によれば、標識物質間がより一層離れることにな
るので、クエンチング（消光）を有効に防止することが
できるので、高い信頼性で塩基配列を決定することがで
きる。
レオチドを担体または標識物質と結合したものである。
本発明によれば、標識物質間がより一層離れることにな
るので、クエンチング（消光）を有効に防止することが
できるので、高い信頼性で塩基配列を決定することがで
きる。
【００８９】第十二の発明は、液通路および磁力部等を
有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及
ぼしまたは除去することによって、第２のコード化オリ
ゴヌクレオチドが有する磁気粒子を前記液通路の内壁に
吸着させまたは離脱するものである。これによって、塩
基配列の決定を、自動的、効率的かつ迅速に一貫して行
うことができる。
有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及
ぼしまたは除去することによって、第２のコード化オリ
ゴヌクレオチドが有する磁気粒子を前記液通路の内壁に
吸着させまたは離脱するものである。これによって、塩
基配列の決定を、自動的、効率的かつ迅速に一貫して行
うことができる。
【図１】本発明の実施の形態に係る遺伝物質シーケンス
決定方法を示す流れ図
決定方法を示す流れ図
【図２】本発明の実施の形態に係る標的ＤＮＡ断片にハ
イブリダイズされたオリゴヌクレオチドを示す概念図
イブリダイズされたオリゴヌクレオチドを示す概念図
【図３】本発明の実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリ
ング方法を示す流れ図
ング方法を示す流れ図
１０，１０ｓ…標的ＤＮＡ断片 １１…磁力操作可能オリゴヌクレオチド（第２のコード
化オリゴヌクレオチド） １２…検出用オリゴヌクレオチド（第１のコード化オリ
ゴヌクレオチド） １３、１４…蛍光物質（標識物質） １５…３塩基 １６…アーム １８…磁性粒子
化オリゴヌクレオチド） １２…検出用オリゴヌクレオチド（第１のコード化オリ
ゴヌクレオチド） １３、１４…蛍光物質（標識物質） １５…３塩基 １６…アーム １８…磁性粒子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 田島 秀二 東京都稲城市矢野口1843番地１ プレシジ ョン・システム・サイエンス株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 FB01 FB02 FB07 FB12 GC15 4B024 AA19 AA20 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 HA19 4B063 QA12 QA13 QQ42 QQ52 QR20 QR56 QR82 QS16 QS34 QS39 QX02
Claims (13)
- 【請求項１】 所定塩基数の１種類の塩基配列をもちそ
の塩基配列を識別するようにコード化された第１のコー
ド化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類
若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、
その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第
１のコード化オリゴヌクレオチド群と、 所定塩基数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識
別するようにコード化された第２のコード化オリゴヌク
レオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種
類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属する
ものとして各々選別可能に設けられた第２のコード化オ
リゴヌクレオチド群と、 ２つのコード化オリゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質
にハイブリダイズされてその塩基配列の末端ヌクレオチ
ドが直接に隣接する場合であって、かつ、前記所定塩基
数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と一定の関係に
ある場合にのみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオ
キシリボースを介して２つのオリゴヌクレオチド同士を
特異的に結合させる酵素を容器内の液に懸濁させた遺伝
物質シーケンス決定用懸濁系。 - 【請求項２】 前記各第１のコード化オリゴヌクレオチ
ドは、その群に属するものとして選別可能であるように
コード化されるとともに、前記各第２のコード化オリゴ
ヌレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に
保持されるように設けることによって、その群に属する
ものとして選別可能であることを特徴とする請求項１記
載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。 - 【請求項３】 前記各第１のコード化オリゴヌクレオチ
ドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの前記所定
塩基数は、少なくとも３塩基であり、第１のコード化オ
リゴヌクレオチド群は、その３塩基の各塩基を入れ換え
て得られる少なくとも４3 種類の第１のコード化オリゴ
ヌクレオチドを包含し、第２のコード化オリゴヌクレオ
チド群は、その３塩基の各塩基を入れ換えて得られる少
なくとも４3 種類の第２のコード化オリゴヌクレオチド
を包含することを特徴とする請求項１または請求項２の
いずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。 - 【請求項４】 前記酵素は、ＤＮＡリガーゼであって、
一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされた２つのコード
化オリゴヌクレオチドの３塩基以上からなる塩基配列の
末端ヌクレオチド同士が直接に隣接する場合であって、
かつ、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列がその遺伝物
質の塩基配列と相補的である場合のみ、その末端ヌクレ
オチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に結合
させるものであることを特徴とする請求項１ないし請求
項３のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁
系。 - 【請求項５】 前記第１のコード化オリゴヌクレオチド
群に属する各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、所
定の塩基配列をもつ１種類のオリゴヌクレオチドと、そ
のオリゴヌクレオチドと結合した標識物質とからなり、
その標識物質は所定の種類が所定の量比含まれるととも
に、コード化は、標識物質の種類および／またはその量
比を変えることによって行われたことを特徴とする請求
項１ないし請求項４のいずれかに記載の遺伝物質シーケ
ンス決定用懸濁系。 - 【請求項６】 前記第１のコード化オリゴヌクレオチド
群に属する第１のコード化オリゴヌクレオチドの全部ま
たは一部について、その遊離末端に標識化されたジデオ
キシリボースを有していることを特徴とする請求項５に
記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。 - 【請求項７】 前記第１のコード化オリゴヌクレオチド
群に属する各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、１
個の非磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配
列をもつ多数の１種類のオリゴヌクレオチドと、その担
体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチ
ドの一部にまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と
異なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、
その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれる
とともに、コード化は、標識物質の種類および／または
量比を変えることによって行われたことを特徴とする請
求項１ないし請求項４のいずれかに記載の遺伝物質シー
ケンス決定用懸濁系。 - 【請求項８】 前記第２のコード化オリゴヌクレオチド
群に属する各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、１
個の磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列
をもつ１種類の多数のオリゴヌクレオチドと、その担体
が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチド
の一部にまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異
なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、そ
の標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれると
ともに、コード化は、標識物質の種類および／または量
比を変えることによって行われたことを特徴とする請求
項１ないし請求項７のいずれかに記載の記載の遺伝物質
シーケンス決定用懸濁系。 - 【請求項９】 前記オリゴヌクレオチドは、アームを介
して担体または標識物質と結合したことを特徴とする請
求項５ないし請求項８のいずれかに記載の遺伝物質シー
ケンス決定用懸濁系。 - 【請求項１０】 請求項１ないし請求項９のいずれかに
記載された懸濁系に、前記所定塩基数よりも十分に大き
い所定ベースの一本鎖の標的遺伝物質を投入懸濁させ
て、前記標的遺伝物質に前記第１のコード化オリゴヌク
レオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドをハ
イブリダイズさせる対合工程と、 第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第２のコード
化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再
び一本鎖に解離する解離工程と、 前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴヌクレオチド
および第２のコード化オリゴヌクレオチドの対を選別す
る選別工程と、 選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩
基配列を識別するコードおよび第２のコード化オリゴヌ
クレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合
わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定す
る決定工程とを有している遺伝物質シーケンス決定用懸
濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法。 - 【請求項１１】 前記対合工程において、前記第１のコ
ード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとし
て選別可能であるようにコード化されるとともに、前記
各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場によって
遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けること
によって、その群に属するものとして選別可能であり、
前記選別工程は、磁場操作によって第２のコード化オリ
ゴヌクレオチドを分離する分離工程を有していることを
特徴とする請求項１０に記載の遺伝物質シーケンス決定
用懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法。 - 【請求項１２】 第２のコード化オリゴヌクレオチドが
担体として磁性粒子を有している場合には、前記選別工
程は、液通路、その液通路に外部から磁場を及ぼしかつ
除去する磁力部、およびその液通路内の圧力を制御して
流体の吸引および吐出を行う圧力制御部を有する分注機
を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除
去することによって、前記第２のコード化オリゴヌクレ
オチドが有する前記磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着
させまたは離脱するものであることを特徴とする請求項
９または請求項１０または請求項１１のいずれかに記載
の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いた遺伝物質シ
ーケンス決定方法。 - 【請求項１３】 請求項１ないし請求項９のいずれかに
記載の２つの略同一の懸濁系を用意し、その一方に、第
一の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第
一の標的遺伝物質を投入懸濁させ、他方に、第二の試料
から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第二の標的
遺伝物質を投入懸濁させ、各標的物質に前記第１のコー
ド化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌ
クレオチドをハイブリダイズさせる対合工程と、 各々、第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第２の
コード化オリゴヌクレオチドの対を捕獲した前記標的遺
伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、 前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴヌクレオチド
および第２のコード化オリゴヌクレオチドを選別する選
別工程と、 各々、選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの
示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オ
リゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの
組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を
決定する決定工程と、 各々、前記第一の標的遺伝物質について決定された塩基
配列と、前記第二の標的遺伝物質について決定された塩
基配列とを比較することによって単一ヌクレオチド多型
の同定を行う同定工程を有することを特徴とする遺伝物
質シーケンス決定用懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコア
リング方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29024699A JP3668075B2 (ja) | 1999-10-12 | 1999-10-12 | 遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法 |
| DE60035357T DE60035357T2 (de) | 1999-10-12 | 2000-10-11 | System und verfahren zum sequenzieren genetischer substanzen |
| US10/110,626 US7029882B1 (en) | 1999-10-12 | 2000-10-11 | Suspension for determining sequence of genetic materials, method of determining the sequence of genetic materials by using same, and method for high-speed scoring SNPs |
| EP00966410A EP1221491B8 (en) | 1999-10-12 | 2000-10-11 | SUSPENSION SYSTEM FOR SEQUENCING GENETIC SUBSTANCE, METHOD OF SEQUENCING GENETIC SUBSTANCE BY USING THE SUSPENSION SYSTEM, AND METHOD OF HIGH-SPEED SNPs SCORING BY USING THE SUSPENSION SYSTEM |
| PCT/JP2000/007050 WO2001027320A1 (fr) | 1999-10-12 | 2000-10-11 | Systeme de suspension pour le sequençage d'une substance genetique, procede de sequençage d'une substance genetique mettant en oeuvre ledit systeme de suspension et procede d'identification des polymorphismes nucleotidiques uniques (snp) au moyen dudit systeme de suspension |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29024699A JP3668075B2 (ja) | 1999-10-12 | 1999-10-12 | 遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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