JP2003284597A - 標的核酸の測定方法及びそのためのキット - Google Patents

標的核酸の測定方法及びそのためのキット

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JP2003284597A
JP2003284597A JP2002097407A JP2002097407A JP2003284597A JP 2003284597 A JP2003284597 A JP 2003284597A JP 2002097407 A JP2002097407 A JP 2002097407A JP 2002097407 A JP2002097407 A JP 2002097407A JP 2003284597 A JP2003284597 A JP 2003284597A
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Yoshiyuki Hotta
佳之 堀田
Ayako Hasegawa
亜矢子 長谷川
Satoru Ito
哲 伊藤
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Fujirebio Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 熟練した技術を要することなく、簡便に短時
間でSNPの検出や標的核酸の定量を行うことができる標
的核酸の測定方法を提供すること。 【解決手段】 標的核酸と、標的核酸とハイブリダイズ
する、標識された核酸から成る標識プローブと、標的核
酸内の領域であって前記標識プローブがハイブリダイズ
する領域とは異なる領域と相補的な塩基配列を有する核
酸から成る非標識プローブと、標的核酸内の領域であっ
て前記標識プローブがハイブリダイズする領域とは異な
る領域と相補的な塩基配列を有する核酸が支持体に結合
されて成る固相化プローブとを反応させ、前記支持体に
結合された前記標識プローブの標識を測定することから
成る標的核酸の測定方法であって、前記非標識プローブ
がハイブリダイズする領域の端部領域と、前記固相化プ
ローブがハイブリダイズする領域の端部領域とが重複し
ている、標的核酸の測定方法を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸の測定方
法及びそのためのキットに関する。本発明の方法は、一
塩基変異多型(SNP)の検出や遺伝子の接合型の判定に有
用である。
【０００２】
【従来の技術】核酸の変異の判定は、単離した核酸を制
限酵素によって切断し、ゲル（アガロース、アクリルア
ミドなど）上で核酸断片を電気泳動によって検出する方
法で行われている。しかし、この手法は、制限酵素によ
る核酸の切断に時間がかかり電気泳動による手間が要す
る。さらに、発癌性のエチレンブロマイドを使用するた
め、その廃棄には特別の配慮を必要とする。
【０００３】他にDNAシークエンス、DNAチップなどの技
術によるSNP解析も行われているが、熟練した技術の必
要性やコストなどの欠点がある。
【０００４】また、Cytometry 39: 131-140 (2000)に記
載された方法は、標的核酸と、標的核酸に相補的な蛍光
色素標識プローブと、標識プローブに隣接した標的核酸
と相補的な塩基配列部分および粒子固相化プローブと相
補的な塩基配列を持つプローブをハイブリダイズし、ラ
イゲースによるライゲーションを行い、次に粒子固相化
プローブとハイブリダイズさせ、粒子に結合した標識プ
ローブの蛍光強度をフローサイトメータで測定する方法
である。二つのプローブの隣接配列に変異配列が存在す
るとライゲーションは成立せず、粒子には標識プローブ
が結合せず、蛍光は観察されない。その差を用い標的核
酸の有無を判定する。この測定法はライゲーション操作
後、再度ハイブリダイゼーション操作を行うため時間が
かかる欠点を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、熟練した技術を要することなく、簡便に短時間でSN
Pの検出や標的核酸の定量を行うことができる標的核酸
の測定方法を提供することである。
【０００６】本願発明者らは、鋭意研究の結果、標的核
酸と、該標的核酸とハイブリダイズする固相化プロー
ブ、および標識プローブとを反応させ、支持体に結合さ
れた標識を測定することにより標的核酸を測定する方法
を採用するとともに、固相化プローブがハイブリダイズ
する領域の端部領域に、端部が重複する領域とハイブリ
ダイズする非標識プローブをさらに反応させることによ
り、驚くべきことに、固相化プローブと標的核酸との反
応の特異性が高まり、一塩基の相違も識別可能になるこ
とを見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、標的核酸と、標的核
酸とハイブリダイズする、標識された核酸から成る標識
プローブと、標的核酸内の領域であって前記標識プロー
ブがハイブリダイズする領域とは異なる領域と相補的な
塩基配列を有する核酸から成る非標識プローブと、標的
核酸内の領域であって前記標識プローブがハイブリダイ
ズする領域とは異なる領域と相補的な塩基配列を有する
核酸が支持体に結合されて成る固相化プローブとを反応
させ、前記支持体に結合された前記標識プローブの標識
を測定することから成る標的核酸の測定方法であって、
前記非標識プローブがハイブリダイズする領域の端部領
域と、前記固相化プローブがハイブリダイズする領域の
端部領域とが重複している、標的核酸の測定方法を提供
する。また、本発明は、標的核酸又は標的核酸の一塩基
変異多型を有する変異型核酸を含む被検試料に対して上
記本発明の方法を適用し、測定結果から被検試料中の核
酸が標的核酸か変異型核酸かを判定することを含む、一
塩基変異多型の検出方法を提供する。さらに、本発明
は、正常型遺伝子と、一塩基変異多型を含む異常型遺伝
子とが対立遺伝子になっている、該遺伝子を含む被検試
料に対して上記本発明の方法を適用し、測定結果から被
検試料中の前記遺伝子の接合型を判定することを含む、
遺伝子の接合型の判定方法を提供する。さらに、本発明
は、前記標識プローブと、前記非標識プローブと、前記
固相化プローブとを少なくとも含み、上記本発明の方法
に用いられる核酸測定用キットを提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の方法の一例を図１のＡに
示す模式図に基づき説明する。上述の通り、本発明の方
法は、標的核酸１０と、標識プローブ１２と、固相化プ
ローブ１４と、非標識体プローブ１６とをアニールする
ことにより、標的核酸１０と、標識プローブ１２、固相
化プローブ１４及び非標識体プローブ１６とをそれぞれ
ハイブリダイズさせ、固相化プローブ１４を固相化して
いる支持体１８に、標的核酸１０を介して結合された標
識プローブ１２の標識１９を測定することにより、被検
試料中の標的核酸１０を測定するものである。
【０００９】以下、各構成要素について詳細に説明す
る。標的核酸１０は、測定しようとする核酸であり、何
ら限定されるものではない。例として、ヒトやその他の
生物のゲノミック遺伝子、ｃＤＮＡ、病原性の微生物や
ウイルスの遺伝子等を挙げることができるがこれらに限
定されるものではない。本発明の方法は、一塩基の相違
さえ識別することができる特異性の高い方法であるの
で、SNPの検出に適用可能であるから、標的核酸が、こ
のようなSNPを検出しようとする核酸である場合には特
に威力を発揮する。標的核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでも
よく、また、これらとハイブリダイズすることが可能な
人工核酸であってもよい。標的核酸は、ＰＣＲのような
核酸増幅法で増幅されたものであってもよいし、増幅さ
れていない核酸であってもよい。なお、本明細書におい
て、「測定」には、検出と定量の両者が包含される。標
的核酸のサイズは、特に限定されないが、３種類のプロ
ーブとハイブリダイズする必要があるので、通常、４０
塩基以上、好ましくは６０塩基以上のサイズを有する。
標的核酸のサイズの上限は特にないが、通常、１００〜
５００塩基程度が好ましい。
【００１０】標識プローブ１２は、標的核酸内の一領域
とハイブリダイズする核酸を標識したものである。標識
プローブは、これがハイブリダイズする標的核酸内の領
域（以下、「標識プローブハイブリダイズ領域」という
ことがある）と相補的な塩基配列を有していることが好
ましいが、非標識プローブ及び固相化プローブと標的核
酸とのハイブリダイゼーション条件下において標的核酸
とハイブリダイズできるものであれば、通常１０％以
下、特に５％以下程度の数の非相補的なヌクレオチドを
含んでいてもよい。標識プローブのサイズは、特に限定
されるものではなく、標的核酸の検出に有効なサイズを
有していればよく、１５塩基以上が好ましく、特に２０
〜５０塩基程度が好ましい。標識プローブに結合される
標識は、プローブを測定できるものであればいずれのも
のであってもよく、従来の標識プローブに用いられてい
るいずれの標識をも採用することができる。すなわち、
蛍光標識、放射標識、酵素標識、ビオチン標識等を挙げ
ることができる。これらのうち、高価な装置を用いるこ
となく安全に測定可能で、標的核酸とのハイブリダイゼ
ーションに干渉しない点から、蛍光標識が好ましい。標
識は、プローブのどの部分に結合してもよく、このよう
な結合は周知の方法により行うことができる。また、プ
ローブは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また、これらと
ハイブリダイズすることが可能な人工核酸であってもよ
い。
【００１１】固相化プローブ１４は、前記標的核酸１０
内の領域であって前記標識プローブハイブリダイズ領域
とは異なる領域（以下、「固相化プローブハイブリダイ
ズ領域」と言うことがある）と相補的な塩基配列を有す
る核酸を、支持体上に固相化したものである。固相化プ
ローブのサイズは、特に限定されるものではなく、標的
核酸の検出に有効なサイズを有していればよく、１５塩
基以上が好ましく、特に２０〜５０塩基程度が好まし
い。支持体としては、核酸を固相化できるものであれば
いずれのものであってもよく、ポリスチレン粒子、ガラ
ス粒子、ラテックス粒子等の粒子、これらにフェライト
等を配合して磁力を与えた磁性粒子、マイクロプレート
のウェルの内壁等を挙げることができる。固相化プロー
ブと標的核酸とのハイブリダイゼーションが妨げられな
いように、支持体は核酸の末端に結合することが好まし
い。核酸の支持体への固相化は、周知の方法により行う
ことができ、核酸を結合しやすいようにカルボキシル基
等の官能基を表面に結合したポリスチレン粒子等が市販
されているので、このような市販の核酸固相化用粒子を
好ましく用いることができる。なお、固相化プローブ１
４の核酸は、支持体１８に直接結合されていてもよい
し、標的核酸とのハイブリダイゼーションに関与しない
塩基配列を有するスペーサー領域を介して支持体に結合
されていてもよい。このように、固相化プローブハイブ
リダイズ領域と相補的な配列を有する核酸が、スペーサ
ー領域を介して間接的に支持体に結合されている場合
も、本発明で言う「相補的な塩基配列を有する核酸が支
持体に結合されて」いる場合に該当する。
【００１２】非標識プローブ１６は、標的核酸１０内
の、標識プローブハイブリダイズ領域とは異なる領域と
相補的な塩基配列を有する核酸である。非標識プローブ
のサイズは、特に限定されるものではなく、標的核酸の
検出に有効なサイズを有していればよく、１５塩基以上
が好ましく、特に２０〜５０塩基程度が好ましい。
【００１３】非標識プローブハイブリダイズ領域と、固
相化プローブハイブリダイズ領域とは、互いの端部領域
が重複している（以下、この重複している部分を「重複
領域」と言うことがある）。重複領域は、図１のＡ中、
参照番号２０で示されている。重複領域のサイズは、特
に限定されないが、１塩基〜５塩基が好ましく、さらに
１塩基〜３塩基が好ましい。このような重複領域２０を
設けることにより、固相化プローブ１４と標的核酸１０
との反応の特異性が高まり、一塩基の相違でも識別でき
るようになる。
【００１４】本発明の方法は、標的核酸の変異型、とり
わけSNPが存在する場合に、このような一塩基変異を区
別して標的核酸を特異的に測定できるという優れた効果
を発揮するものであるが、このような変異を区別して標
的核酸を特異的に測定する場合には、この変異が起きる
部位が、固相化プローブハイブリダイズ領域中に位置す
るように、固相化プローブを設定する。変異している部
位が、重複領域２０から１塩基（重複領域の端部に隣接
する）ないし５塩基離れた位置にあることが好ましい。
なお、図１のＡ中、標的核酸１０上の、変異する塩基の
部位をＹで示す。また、Ｙに対合する固相化プローブ１
４内の塩基をＸで示す。なお、本明細書の説明において
は、標的核酸と変異している核酸を変異型と呼んでお
り、変異型が必ずしも異常型を意味するわけではない。
異常型の遺伝子の検出を目的にして異常型を標的核酸と
する場合には、正常型が変異型になる。
【００１５】なお、図１のＡに示す例では、固相化プロ
ーブハイブリダイズ領域の５’末端領域と、非標識プロ
ーブハイブリダイズ領域の３’末端領域とが重複してい
るが、これとは逆に固相化プローブハイブリダイズ領域
の３’末端領域と、非標識プローブハイブリダイズ領域
の５’末端領域とが重複するようにこれらのプローブを
設定してもよい（ただし、この場合には、固相化プロー
ブの核酸の３’側が支持体に固相化される）。また、標
識プローブハイブリダイズ領域は、非標識プローブハイ
ブリダイズ領域及び固相化プローブハイブリダイズ領域
と重複しない任意の位置でよい。
【００１６】上記の通り、本発明の方法では、標的核酸
１０と、標識プローブ１２、固相化プローブ１４及び非
標識プローブ１６とをハイブリダイズさせるものである
が、ハイブリダイゼーション反応は、これら４種類の核
酸を同時に反応させてもよいし、標的核酸１０と、任意
のプローブとを逐次的に反応させてもよいし、標的核酸
１０と、任意の２種類のプローブを反応させた後、第３
のプローブを反応させてもよい。反応条件は、特に限定
されず、プローブのサイズ等に応じて適宜選択される
が、標的核酸１０と、固相化プローブ１４と、非標識プ
ローブ１６とが共存する条件下におけるハイブリダイゼ
ーション反応は、通常、３０℃〜６０℃で１０分間以上
であればよく、好ましくは、４０℃〜５０℃で１０分間
〜６０分間程度行う。固相化プローブ１４と非標識プロ
ーブ１２のいずれかが存在しない条件下におけるハイブ
リダイゼーション反応は、上記の条件と同様に行うこと
もできるし、高温から低温に冷却する条件下で行っても
よい。例えば、下記実施例では、先に標的核酸１０と、
標識プローブ１２と、非標識プローブ１６とを反応さ
せ、その後、固相化プローブ１４を反応させているが、
標的核酸１０と、標識プローブ１２と、非標識プローブ
１６との反応は、反応液を変性温度（９５℃）から氷冷
する条件下で行っている。高温から低温に冷却すると、
ハイブリダイゼーションが起きる温度を必ず通過するの
で、標的核酸とプローブとをハイブリダイズさせること
ができる。
【００１７】ハイブリダイゼーション反応後、支持体１
８に結合された標識１９を測定する。標識１９の測定
は、各標識に応じた周知の方法により行うことができ
る。支持体１８が粒子の場合には、支持体１８を遠心分
離や磁力（磁性粒子の場合）を用いて集めた後、標識を
測定する。被検試料中に標的核酸１０が存在する場合、
標識プローブ１２は標的核酸１０及び固相化プローブ１
４の核酸部分を介して支持体１８に結合され、標的核酸
１０が存在しない場合には、支持体１８に結合されない
ので、支持体１８に結合された標識１９を測定すること
により、被検試料中の標的核酸１０を検出することがで
きる。また、支持体１９に結合される標識１９の量は、
被検試料中の標的核酸１０の量が多くなるほど多くなる
ので、標識１９を定量することにより標的核酸１０を定
量することも可能である。
【００１８】標的核酸又は標的核酸の一塩基変異多型を
有する変異型核酸を含む被検試料に対して上記した本発
明の方法を適用することにより、測定結果から被検試料
中の核酸が標的核酸か変異型核酸かを判定することが可
能である。これを図１のＢを参照して説明する。図１の
Ｂ中、１０’は、図１のＡにおける標的核酸１０内の塩
基Ｙが一塩基変異を起こした変異型核酸を示し、塩基Ｙ
が変異した塩基を○で示す。このように、一塩基が変異
した変異型核酸１０’と固相化プローブ１４とは図１の
Ｂに示すようにハイブリダイズしないか、又は一部の固
相化プローブ１４がハイブリダイズするにしても、ハイ
ブリダイズする固相化プローブの数が、標的核酸にハイ
ブリダイズする固相化プローブの数よりも識別可能な程
度に少なくなる。このため、支持体１８に結合する標識
の量が識別可能な程度に少なくなり、従って、被検試料
中に含まれる核酸が、標的核酸か変異型かを判定するこ
とができる。
【００１９】さらに、正常型遺伝子と、一塩基変異多型
を含む異常型遺伝子とが対立遺伝子になっている、該遺
伝子を含む被検試料に対して上記本発明の方法を適用す
ることにより、測定結果から被検試料中の前記遺伝子の
接合型を判定することが可能になる。従って、本発明の
方法により、目的の遺伝子が、ホモ接合かヘテロ接合か
を判定することが可能になる。標的核酸がホモ接合にな
っている場合に測定される標識量が最も多く、標的核酸
と変異型とがヘテロ接合になっている場合が次に多く、
変異型がホモ接合になっている場合が最も少ない。従っ
て、本発明の方法に従って、支持体に結合された標識量
を測定することにより、対立遺伝子の接合型を判定する
ことが可能になる。
【００２０】本発明は、また、前記標識プローブと、前
記非標識プローブと、前記固相化プローブとを少なくと
も含み、上記本発明の方法に用いられる核酸測定用キッ
トをも提供する。これらの構成要素は先に説明した通り
である。キットは、さらに反応に用いる緩衝液等を含ん
でいてもよい。
【００２１】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２２】標的核酸であるフコース転位酵素３（FUTI
II）遺伝子 FUTIII遺伝子は糖鎖末端にフコースを転移して血液型抗
原や癌関連抗原（CA19-9）の合成に関係している遺伝子
で、野生型（WT）と変異型（Le1、Le2、Le3）の４種類
が知られている。変異の部位として59、508、1067番目
の塩基が知られている。（Cancer Res. 58, 512-518(19
98), 蛋白質 核酸 酵素Vol.43 No.16(1998)）
【００２３】1. 標的核酸の調製 各FUTIII遺伝子を鋳型として用い、ポリメラーゼ・チェ
ーン・リアクション（PCR）法（94℃,1分間、55℃,1分
間、72℃,1分間を30サイクル）にてそれぞれの核酸を増
幅し、精製<MO BIO：ULTRA CLEAN DNA Purification ki
t : Catalog #12100-300>後にA260にて吸光度より濃度
を測定して調製を行った。以下に各変異部分を含む核酸
の増幅に用いたプライマーの組み合せを示す。59番目の
塩基の変異部分を標的とした核酸（WT<59>またはLe<59
>）は、センス側を1から20番目<atggatcccctgggtgcag
c：20mer>、アンチセンス側を180から200番目<agcaggat
caggagggtggg：20mer>のプライマーを用いて1から200番
目<200bp>までを増幅し、508番目の塩基の変異部分を標
的とした核酸（WT<508>またはLe<508>）は、センス側を
407から431番目<acttggagccaccccctaactgcca：25mer>、
アンチセンス側588から612番目 <tgagtccggcttccagttgg
acacca：25mer>のプライマーを用いて407から612番目<2
06bp>までを増幅し、1067番目の塩基の変異部分を標的
とした核酸（WT<1067>またはLe<1067>）は、センス側88
7から906番目<tccagagccccaaggacctg 20mer>、アンチセ
ンス側1086から1068番目<tcaggtgaaccaagccgct 19mer>
のプライマーを用いて887から1086番目<200bp>までを増
幅した。
【００２４】2. 固相化プローブの調製 FUTIII遺伝子の塩基配列に相補的かつ変異の出現する位
置を3’末端側から４から６塩基目にくるようにプロー
ブを設計し、5’末端にアミノ基を結合させた固相化用
プローブ（図2のa, b, c, dの塩基配列4：20mer、配列
番号７,10,11,16）(アマシャム バイオサイエンス社)を
作製し、粒子へ固相化した（固相化粒子）。
【００２５】粒子は、径が5.5μｍの表面にカルボキシ
ルが修飾されたポリスチレン粒子（Bangs Laboratorie
s, Inc. Catalog Code : PC06N, Polymer Description
: P(S/5.5%DVB/5%MMA)） を使用した。
【００２６】固相化プローブの粒子への固相化は、約10
8個粒子を0.1M MES(2-[N-モルホリノ]エタンスルホン
酸) （pH4.5）25μlに懸濁し、固相化用プローブ（約10
0pmol/μl）5μlおよびEDC（1-エチル-3-(ジメチルアミ
ノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩）（10mg/ml）1.25
μlを添加して37℃、1時間反応（粒子のカルボキシル基
と固相化用プローブのアミノ基との縮合反応）させるこ
とで固相化粒子を作製し、0.02% Tween20（商品名）溶
液で洗浄し、0.1% SDS溶液洗浄後、0.1M MES （pH4.5）
溶液に置換し4℃で保存した。
【００２７】3. 非標識プローブの調製 試料核酸と固相化したプローブとのハイブリダイズにお
いて、非標識プローブを固相化プローブの３’側のどの
位置に配置するか記載する。固相化プローブの３’側の
塩基配列と非標識プローブの５’側の塩基配列が1塩基
離れたプローブから3塩基重複するプローブ（約20mer）
(アマシャム バイオサイエンス社)を調製した(図2のa,
b, c, dの塩基配列3、配列番号2〜6,9,12,15)。
【００２８】4. 標識プローブの調製 固相化プローブおよび非標識プローブと重複しない標的
核酸と相補的な配列を持つプローブでこのプローブの5'
側に蛍光（CY3）標識したプローブ(アマシャムバイオサ
イエンス社)を調製した(図2のa, b, c, dの塩基配列2、
配列番号1,8,13,14)。
【００２９】5. 測定方法 試料核酸(800fmol)、非標識プローブ(50pmol)と標識プ
ローブ（1pmol）の入った水溶液(全量10μｌ)を熱変性
（95℃；5分間）し、氷上（1分間）で冷却後、固相化粒
子（10μｌの10ｘSSCに懸濁させた約10万粒子、最終濃
度5xSSC）を添加し、標的核酸とハイブリダイズ（40
℃；2時間、但し、経時的な検討では0〜2時間）させ、
遠心（15000rpm, 2分間）し反応液を除去した。その
後、TBS-Triton（10mM Tris-Cl, 0.2% NaCl, 0.1% Na
N2, 0.01% TritonX-100, pH7.2）50μlで洗浄し、再び
遠心して測定用の緩衝液（Beckman Coulter社、フロー
サイトメトリー専用シース液、P/N8599600）200μlに懸
濁、フローサイトメーター（Beckman Coulter社、EPICS
-PROFILE II）を用いて粒子上の蛍光強度を測定し、そ
の蛍光強度より標的核酸の有無を同定した。
【００３０】6. 非標識プローブの位置 FUTIII遺伝子の野生型（図2-a中1:WT<59>；1〜200の200
bp）を標的とする核酸とし、固相化粒子にはFUTIII遺伝
子の56番目から75番目の配列に対応するアンチセンス側
の配列（図2-a中4）を有するプローブを用い、プローブ
の５‘と固相化粒子のプローブの３’側と異なる塩基の
重複数を持つ非標識プローブ(図2のa中3、配列番号2〜
6)と標識プローブ（図2-a中2）を用い検出を試みた。固
相化プローブの3’側の塩基と非標識プローブの5’側の
塩基が1から3塩基が重複した時、標的核酸ではない変異
型（図2-ｂ中1:Le<59>；1〜200の200bp）の蛍光強度に
はほとんど変化が観察されなかったにもかかわらず標的
核酸であるWT<59>には蛍光強度の上昇が観察された。こ
とから、固相化プローブの3’側の塩基と非標識プロー
ブの5’側の塩基が1から3塩基重複させることで特異的
なハイブリダイズの向上する効果があることが示された
（図3）。
【００３１】7. 非標識プローブの効果 FUTIII遺伝子の1067番目の変異遺伝子（Le<1067>；887
〜1086の200bp）を標的核酸とし、固相化粒子のプロー
ブの配列をFUTIII遺伝子の1062番目から1081番目のアン
チセンス側（tgaaccaagccgctttgctg、配列番号１６）、
非標識プローブを固相化プローブの3’側と3塩基重複す
るアンチセンス側のプローブ（ctgcgcaccgtctggtacct、
配列番号１５）と標識プローブ（gcaggccttgcagaaatcca
g、配列番号１４）（図２のd）を用いて検討した。試料
核酸に非標識プローブを添加することで経時的に標的と
する核酸の蛍光強度が、非標識プローブを添加しない試
料に比べ蛍光強度の急激な上昇が観察された（図4）。
一方、標的ではない野生型（WT<1067>；887〜1086の200
bp）の核酸では蛍光強度に変化は観察されなかった。非
標識プローブが標的とする核酸と固相化粒子との特異的
なハイブリダイズの効率を改善していることが示され
た。
【００３２】8. 標的核酸の検出 FUTIII遺伝子には、各遺伝子型のホモ型とヘテロ型が存
在する。そこで標的核酸のホモおよびヘテロの判定が可
能であるか記載した。
【００３３】FUTIII遺伝子の59番目の変異核酸を標的核
酸とした時(図2のｂ中1)蛍光強度は(Le<59>/Le<59>)＞
(WT<59>/Le<59>)＞(WT<59>/WT<59>)（図5のa）、508番
目の変異核酸を標的核酸とした時(図2-ｃ-1) (Le<508>/
Le<508>)＞(WT<508>/Le<508>)＞(WT<508>/WT<508>)（図
5のb）、1067番目の変異核酸を標的核酸とした時(図2-
ｄ-1)、 (Le<1067>/Le<1067>)＞(WT<1067>/Le<1067>)＞
(WT<1067>/WT<1067>)（図5のc）となった。（用いた標
識体（CY3）プローブ、非標識プローブおよび固相化用
プローブの塩基配列は図2のb,c,dを参照）
【００３４】蛍光強度の大きい方から、標的とする核酸
のホモ型、標的とする核酸と標的としない核酸のヘテロ
型、標的としない核酸のホモ型の順となり、標的核酸の
有無および遺伝子型（ホモ、ヘテロ）の判断が可能であ
った。
【００３５】なお、図２のa,b,c,d中の各参照番号の意
味するところを以下にまとめて示す。例えば、図２のa
中の１を「a-1」のように記載する。 a−1 ： 標的核酸、野生型（WT(59)） a−2 ： 標的核酸であるWT（５９）を検出するためのCY
3標識プローブ a−3 ： 非標識プローブの設計によって標的核酸（a−
1）と固相化プローブ（a−4）のハイブリダイズの特異
性の変化を検討するために用いた非標識プローブ a−4 ： WT（５９）の検出用固相化プローブ b−1 ： 標的核酸、変異型（Le(59)） b−2 ： 標的核酸であるLe（５９）を検出するためのCY
3標識プローブ b−3 ： 標的核酸（b−1）と固相化プローブ（b−4）の
ハイブリダイズの特異性を高めるために添加する非標識
プローブ b−4 ： Le（５９）の検出用固相化プローブ c−1 ： 標的核酸、変異型（Le(508)） c−2 ： 標的核酸であるLe（508）を検出するためのCY
3標識プローブ c−3 ： 標的核酸（c−1）と固相化プローブ（c−4）の
ハイブリダイズの特異性を高めるために添加する非標識
プローブ c−4 ： Le（５08）の検出用固相化プローブ d−1 ： 標的核酸、変異型（Le(1067)） d−2 ： 標的核酸であるLe（1067）を検出するためのCY
3標識プローブ d−3 ： 標的核酸（d−1）と固相化プローブ（d−4）の
ハイブリダイズの特異性を高めるために添加する非標識
プローブ d−4 ： Le（1067）の検出用固相化プローブ
【００３６】
【発明の効果】以上のように、本発明により、簡便に短
時間でSNPの検出や標的核酸の定量を行うことができる
標的核酸の測定方法が提供された。本発明の方法によれ
ば、わずか１塩基の相違を識別することが可能であり、
また、わずか１塩基の相違を有する対立遺伝子の接合型
の判別が可能である。
【００３７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> FUJIREBIO INC. <120> Method for measuring nucleic acids and kit therefor <130> 01724 <160>
【００３８】 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 1 ttgtggcttg gctgcaccca g 21
【００３９】 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 2 ggccagacag cggcgccatg 20
【００４０】 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 3 cggccagaca gcggcgccat 20
【００４１】 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 4 gcggccagac agcggcgcca 20
【００４２】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 5 tgcggccaga cagcggcgcc 20
【００４３】 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 6 gtgcggccag acagcggcgc 20
【００４４】 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 7 cagcagctga aatagcagtg 20
【００４５】 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 8 ttgtggcttg gctgcaccca g 21
【００４６】 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 9 gcggccagac agcggcgcca 20
【００４７】 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 10 agcagctgaa atagccgtgc 20
【００４８】 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 11 atcttcacgc cctacggctg 20
【００４９】 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 12 tggctggagc cgtggtccgg 20
【００５０】 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 13 ggtggcctgg gcggtgtcca actgg 25
【００５１】 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 14 gcaggccttg cagaaatcca g 21
【００５２】 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 15 ctgcgcaccg tctggtacct 20
【００５３】 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 16 tgaaccaagc cgctttgctg 20
【００５４】 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 17 atggatcccc tgggtgcagc 20
【００５５】 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 18 agcaggatca ggagggtggg 20
【００５６】 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 19 acttggagcc accccctaac tgcca 25
【００５７】 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 20 tgagtccggc ttccagttgg acacc 25
【００５８】 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 21 tccagagccc caaggacctg 20
【００５９】 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 22 tcaggtgaac caagccgct 19
【００６０】 <210> 23 <211> 200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 atggatcccc tgggtgcagc caagccacaa tggccatggc gccgctgtct ggccgcactg 60 ctatttcagc tgctggtggc tgtgtgtttc ttctcctacc tgcgtgtgtc ccgagacgat 120 gccactggat cccctagggc tcccagtggg tcctcccgac aggacaccac tcccacccgc 180 cccaccctcc tgatcctgct 200
【００６１】 <210> 24 <211> 200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atggatcccc tgggtgcagc caagccacaa tggccatggc gccgctgtct ggccgcacgg 60 ctatttcagc tgctggtggc tgtgtgtttc ttctcctacc tgcgtgtgtc ccgagacgat 120 gccactggat cccctagggc tcccagtggg tcctcccgac aggacaccac tcccacccgc 180 cccaccctcc tgatcctgct 200
【００６２】 <210> 25 <211> 206 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 acttggagcc accccctaac tgccagcacc tggaagccct ggacagatac ttcaatctca 60 ccatgtccta ccgcagcgac tccgacatct tcacgcccta cggctggctg gagccgtggt 120 ccggccagcc tgcccaccca ccgctcaacc tctcggccaa gaccgagctg gtggcctggg 180 cggtgtccaa ctggaagccg gactca 206
【００６３】 <210> 26 <211> 206 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 acttggagcc accccctaac tgccagcacc tggaagccct ggacagatac ttcaatctca 60 ccatgtccta ccgcagcgac tccgacatct tcacgcccta cagctggctg gagccgtggt 120 ccggccagcc tgcccaccca ccgctcaacc tctcggccaa gaccgagctg gtggcctggg 180 cggtgtccaa ctggaagccg gactca 206
【００６４】 <210> 27 <211> 200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 tccagagccc caaggacctg gcccggtacc tgcaggagct ggacaaggac cacgcccgct 60 acctgagcta ctttcgctgg cgggagacgc tgcggcctcg ctccttcagc tgggcactgg 120 atttctgcaa ggcctgctgg aaactgcagc aggaatccag gtaccagacg gtgcgcagca 180 tagcggcttg gttcacctga 20 0
【００６５】 <210> 28 <211> 200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 tccagagccc caaggacctg gcccggtacc tgcaggagct ggacaaggac cacgcccgct 60 acctgagcta ctttcgctgg cgggagacgc tgcggcctcg ctccttcagc tgggcactgg 120 atttctgcaa ggcctgctgg aaactgcagc aggaatccag gtaccagacg gtgcgcagca 180 aagcggcttg gttcacctga 200
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を説明するための模式図である。
【図２】本発明の実施例で用いた標的核酸及び各種プロ
ーブの塩基配列及びハイブリダイズする領域を示す図で
ある。
【図３】非標識プローブの位置による蛍光強度の変化を
示したグラフである（横軸の数字はFUT III DNAの塩基
配列に対応する非標識プローブの位置を示し、カッコ内
は非標識プローブの5'側と固相化プローブの3'側が重複
する塩基数を現している）。
【図４】非標識プローブの添加の有無による経時的な蛍
光強度の変化を示したグラフである。
【図５】標的核酸の遺伝子型（ホモ型、ヘテロ型）によ
る蛍光強度の違いを示したグラフである。
【符号の説明】
１０ 標的核酸 １０’ 変異型核酸 １２ 標識プローブ １４ 固相化プローブ １６ 非標識プローブ １８ 支持体 １９ 標識 ２０ 重複領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 哲 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 HA14 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR32 QR55 QS34

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的核酸と、該標的核酸とハイブリダイ
    ズする、標識された核酸から成る標識プローブと、前記
    標的核酸内の領域であって前記標識プローブがハイブリ
    ダイズする領域とは異なる領域と相補的な塩基配列を有
    する核酸から成る非標識プローブと、標的核酸内の領域
    であって前記標識プローブがハイブリダイズする領域と
    は異なる領域と相補的な塩基配列を有する核酸が支持体
    に結合されて成る固相化プローブとを反応させ、前記支
    持体に結合された前記標識プローブの標識を測定するこ
    とから成る標的核酸の測定方法であって、前記非標識プ
    ローブがハイブリダイズする領域の端部領域と、前記固
    相化プローブがハイブリダイズする領域の端部領域とが
    重複している、標的核酸の測定方法。
  2. 【請求項２】 重複している領域の塩基数が１塩基ない
    し５塩基である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 重複している領域の塩基数が１塩基ない
    し３塩基である請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記非標識プローブの５’末端領域がハ
    イブリダイズする領域と、前記固相化プローブの３’末
    端領域がハイブリダイズする領域とが重複している請求
    項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 標的核酸の変異型が存在し、変異してい
    る部位が、前記固相化プローブがハイブリダイズする領
    域内に位置する請求項１ないし４のいずれか１項に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 前記変異している部位が、前記重複して
    いる領域から１塩基ないし５塩基離れた位置にある請求
    項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 標的核酸又は標的核酸の一塩基変異多型
    を有する変異型核酸を含む被検試料に対して請求項１な
    いし６のいずれか１項に記載の方法を適用し、測定結果
    から被検試料中の核酸が標的核酸か変異型核酸かを判定
    することを含む、一塩基変異多型の検出方法。
  8. 【請求項８】 正常型遺伝子と、一塩基変異多型を含む
    異常型遺伝子とが対立遺伝子になっている、該遺伝子を
    含む被検試料に対して請求項１ないし６のいずれか１項
    に記載の方法を適用し、測定結果から被検試料中の前記
    遺伝子の接合型を判定することを含む、遺伝子の接合型
    の判定方法。
  9. 【請求項９】 前記標識プローブと、前記非標識プロー
    ブと、前記固相化プローブとを少なくとも含み、請求項
    １ないし６のいずれか１項に記載の方法に用いられる核
    酸測定用キット。
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