DE10038237A1

DE10038237A1 - Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidsequenzen

Info

Publication number: DE10038237A1
Application number: DE10038237A
Authority: DE
Inventors: Andreas Kappel; Marc Pignot; Thomas Polakowski; Norbert Windhab
Original assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Current assignee: Nanogen Recognomics GmbH
Priority date: 2000-08-04
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2002-02-14
Also published as: IL154270A0; JP2004520010A; US20040110161A1; AU2001270635A1; CA2417861A1; WO2002012553A3; EP1307589A2; WO2002012553A2

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidsequenzen beschrieben, bei dem man DOLLAR A a) eine definierte, einzelsträngige Nucleotidsequenz auf einen Nucleotid-Chip aufträgt, DOLLAR A b) die auf Mutationen zu untersuchende Nucleotidsequenz, die komplementär zur bekannten Nucleotidsequenz ist, ebenfalls auf den Chip aufträgt und durch Hybridisierung beider Sequenzen eine Heteroduplex herstellt, DOLLAR A c) die Heteroduplex mit einem Fehlpaarungen erkennenden markierten Substrat inkubiert und DOLLAR A d) die Fehlpaarungen durch Detektion des an ihnen angelagerten, markierten Substrates nachweist. DOLLAR A Außerdem wird ein Verfahren zum quantitaitven Nachweis der Expression von mRNA in verschiednen Zellen oder Geweben beschrieben, bei dem man DOLLAR A a) eine bekannte einzelsträngige Nucleotidsequenz auf einen Nucleotid-Chip aufträgt, DOLLAR A b) aus verschiedenen Zellen oder Geweben gewonnene, markierte cDNA ebenfalls auf den Chip aufträgt und durch Hybridisierung beider Sequenzen eine Heteroduplex herstellt und DOLLAR A c) durch quantitative Messung der Markierung die Menge der mRNA bestimmt. DOLLAR A Außerdem werden Fehlpaarungen erkennende, markierte Proteine und Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem Mutationen parallel in verschiedenen Nucleotidsequenzen nachgewiesen werden können.

Es ist bekannt, dass die DNA-Sequenzen der meisten Gene des menschlichen Organismus in Proteinsequenzen umgeschrieben werden. Die Aktivität eines Proteins, bspw. eines Enzyms, wird dabei in unterschiedlichen Individuen oder Zelltypen durch mehrere Faktoren festgelegt: zum einen bestimmt die Tran scriptionsaktivität des jeweiligen Gens, wieviele Kopien des Proteins in einer Zelle des Proteins vorhanden sind. Zum anderen können Mutationen die Aktivität eines Proteins beeinflussen. So führen eine verminderte Transcriptionsrate oder eine reprimierende Mutation zur Verringerung der Proteinaktivität ("loss-of-function"), während eine erhöhte Transcriptionsrate oder eine selten auftretende aktivierende Mutation zur Erhöhung der Proteinaktivität führen ("gain-of- function"). Weitere Faktoren wie die Translationsregulation und posttranslationale Modifikationen regulieren in den folgenden Schritten die Aktivität von Proteinen. Obwohl sich zwei Individuen oder Zelltypen auf der genomischen Ebene fast gleichen, bedingen diese Faktoren letztlich große Unterschiede im Hinblick auf Anatomie, Physiologie, Pathologie und die Reaktion der pharmakologischen Wirkstoffe. Da die meisten Krankheiten durch eine veränderte Proteinaktivität verursacht werden und pharmazeutische Wirkstoffe die Aktivität bestimmter Proteine regulieren, eignet sich eine Beschreibung der Faktoren "Transcription" und "Mutation" sowohl für die klinische Diagnostik als auch für die Identifizierung von pharmakologischen Targets. Die Beschreibung dieser Faktoren stellt weiterhin ein wichtiges Werkzeug bei der Entscheidung für oder gegen eine Therapie mit einem gegebenen Wirkstoff dar. Die Berücksichtigung oder Untersuchung genotypischer Besonderheiten von Individuen bei der Therapie oder Vorsorge wird als "Pharmacogenomics" bezeichnet und dürfte einen entscheidenden Teil zukünftiger medizinischer Aktivitäten ausmachen.

Eine Veränderung der Transcriptionsrate bestimmter Gene kann mit unterschiedlichen Methoden zum RNA-Nachweis wie Northern Blot, RNAse Protection, RT-PCR und high density filter arrays oder indirekt über Nachweismethoden für die gebildeten Proteine wie Western Blot, RIA oder ELISA erkannt werden. Eine relativ neue Methode stellt die DNA-Chiptechnologie dar, mit deren Hilfe die hochparallele Analyse der Expressionsprofile multipler Gene möglich ist. Hierbei werden DNA-Sequenzen auf die Chipoberfläche aufgebracht, mit denen die mRNA oder cDNA aus einer biologischen Probe sequenzspezifisch hybridisieren und einfach nachgewiesen werden können. Außerdem wurden bereits mehrere Verfahren von der Firma Nanogen (San Die go/USA) publiziert, welche es dem Anwender erlauben, durch elektronische Adressierung von DNA-Sequenzen benutzerde finierte DNA-Chips herzustellen; die anschließende Hybridisie rung wird ebenfalls durch elektronische Adressierung innerhalb kürzester Zeit ermöglicht (US 6,068,818; US 6,051,380; US 6,017,696; US 5,965,452; US 5,849,486; US 5,632,957; US 5,605,662).

Es wird angenommen, dass Unterschiede im Expressionsniveau bestimmter Gene unterschiedliche Reaktionen auf Medikamente bei verschiedenen Patienten bedingen. Allerdings sind bisher nur für wenige Gene wie dem MDR-Gen (= multi drug resistance gene) (1) Daten publiziert worden. Im Gegensatz dazu ist eine Reihe von Medikamenten bekannt, bei denen Mutationen von bestimmten Genen zu einer Medikamentenunverträglichkeit oder einem Therapieversagen führen. Vor der Therapie mit diesen Wirkstoffen sollten Patienten daher auf das Vorhandensein der jeweiligen Mutation hin untersucht werden, um eine falsche Medikation zu verhindern. Dies ist heute nur in Einzelfällen möglich, da es selten gelingt, eine Medikamentenunverträglich keit einem spezifischen Genotyp zuzuordnen. Dies liegt vor allem an den unzureichenden Testverfahren, mit denen Genoty penanalysen im Hochdurchsatzverfahren nur bedingt möglich sind. Die Entwicklung derartiger Testverfahren ist jedoch erforderlich, da allein in den USA jährlich 100.000 Menschen durch Medikamentenunverträglichkeit sterben. Außerdem besteht ein großes Interesse seitens der pharmazeutischen Industrie an derartigen Testverfahren, da ein neues Medikament, dessen Fehlversagen bei einer Patientengruppe einer bestimmten Mutation zugeordnet werden kann, trotzdem zugelassen werden könnte, falls ein Testverfahren diese Patientengruppe identifizieren und damit die Verabreichung dieses Medikamentes an sie ausschließen kann.

Die häufigste Ursache der genetischen Variation innerhalb der menschlichen Population sind Punktmutationen (= single nucleotide polymorphisms, SNPs), die mit einer Häufigkeit von 0,5 bis 10 pro 1.000 Basenpaare auftreten (2). Bislang konnten nur wenige SNPs bestimmten Medikamentenunverträglichkeits reaktionen zugeordnet werden; so führt bspw. eine Mutation in dem Faktor IX-Propeptid zu starken Blutungen bei der antikoa gulanten Therapie mit Cumarin (3). Die im Verlauf des Human genomprojekts gewonnenen Sequenzdaten ermöglichen heute jedoch grundsätzlich eine schnelle Zuordnung eines identifizierten SNPs zu einer Medikamentenunverträglichkeit. Daher wurden verschiedene Methoden zum Nachweis bislang unbekannter SNPs entwickelt, z. B. basierend auf Kettenabbruch- oder Massenspek troskopiesequenzierung (4 bis 7). Diese Verfahren eignen sich jedoch weder für einen hohen Probendurchsatz noch weisen sie die für die klinische Diagnostik erforderliche Genauigkeit auf (8). Neben diesen chemischen oder physikalischen Verfahren wurden auch schon biologische Verfahren entwickelt (9). Viele dieser biologischen Verfahren nutzen die Eigenschaft von Proteinen der muts-Familie, mit hoher Selektivität an mutationsbedingte Basenpaarfehlpaarungen zu binden (10 bis 12). Wegen der Kompliziertheit haben sich diese Methoden allerdings bislang nicht in der Praxis durchsetzen können (9).

Es sind bereits Verfahren zur Identifikation unbekannter SNPs bekannt, vor denen sich jedoch keines für einen hochpar allelisierten Probendurchsatz eignet. Es ist insbesondere kein Verfahren bekannt, mit welchem unter Verwendung der DNA- Chiptechnologie unbekannte SNPs schnell identifiziert werden können. Für eine routinemäßige Untersuchung von Probanden eines klinischen Versuchs und der damit verbundenen Zuordnung eines Genotyps zu einer Medikamentenunverträglichkeit ist ein solches Nachweissystem wegen eines hohen Probendurchsatzes aber notwendig. Ein noch höherer Probendurchsatz wäre bei der Medikation einer großen Gruppe von Patienten mit solchen Wirkstoffen erwünscht, bei denen es häufig zu Nebenwirkungen oder Therapieversagen kommt wie bei der Brustkrebstherapie mit Antiöstrogenen.

Schließlich ist auch noch keine Methode bekannt, mit der die gleichzeitige Identifikation bislang unbekannter SNPs in einer DNA-Probe in Verbindung mit der Analyse der Expressionsstärke von Genen möglich ist. Dies wäre jedoch für Anwendungen wie z. B. Targetvalidierung und Patientenscreening erwünscht.

Gelöst werden diese Aufgaben durch ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidsequenzen, bei dem man

a) eine definierte einzelsträngige Nucleotidsequenz auf einen Nucleotidchip aufträgt,
b) die auf Mutationen zu untersuchende Nucleotidse quenz, die komplementär zu bekannten Nucleotidse quenz ist, ebenfalls auf den Chip aufträgt und durch Hybridisierung beider Sequenzen eine Hetero duplex herstellt,
c) die Heteroduplex mit einem Fehlpaarungen erkennen den markierten Substrat inkubiert und
d) die Fehlpaarungen durch Detektion des an ihnen angelagerten, markierten Substrats nachweist.

Mit diesem Verfahren könnten bekannte und unbekannte Punkt mutationen sowie Insertions- und Deletionsmutationen schnell und unkompliziert identifiziert werden. Treten zwischen der immobilisierten DNA und der zu untersuchenden DNA-Fehlpaa rungen auf, so werden diese z. B. durch markierte mismatch binding-Proteine oder durch eine elektronische Detektion erkannt. Damit ist ein Auslesen der Fehlpaarungen auf dem Chip möglich. Die Fehlpaarungen stellen die SNPs dar.

Zur weiteren Beschreibung der Erfindung werden folgende Begriffsdefinitionen eingeführt:

Der Ausdruck "DNA" wird im Zusammenhang mit der Beschreibung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens nicht nur für Desoxyribonucleinsäure, sondern auch für RNA oder chemisch modifizierte Polynucleotide verwendet;
Der Ausdruck "Referenz-DNA" bezeichnet eine biotinylierte DNA- Sequenz, die als Referenzsequenz verwendet wird;
"Proben-DNA" ist eine markierte DNA, die auf Mutationen überprüft werden soll;
Ein "DNA-Chip" ist durch eine in Zonen aufgeteilte Chip- Oberfläche gekennzeichnet, auf die jeweils eine Referenz-DNA aufgebracht wird;
"Genexpression" ist die Überführung der Erbinformation in RNA oder Protein.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden zunächst mit Hilfe einer elektronischen Adressierung DNA-Heteroduplices bestehend aus einer vorgegebenen DNA- Sequenz, der Referenz-DNA, sowie der Komplementär-DNA aus einer physiologischen Probe, der Proben-DNA, auf einer Chipoberfläche erzeugt. Dabei entstehende Fehlpaarungen zeigen einen SNP der Proben-DNA an und können durch ein Substrat nachgewiesen werden, das an der Fehlstelle bindet. Hierfür eigenen sich mismatch binding-Proteine. Mismatch binding- Proteine können z. B. mutS oder mutY aus E.coli oder T.aquati cus, MSH 1 bis 6 aus S. cerevisiae, S1-Nuclease, T4-Endonuclea se, Thyminglykosylase oder Cleavase sein. Es sind jedoch auch andere Proteine oder Substrate hierfür einsetzbar, wenn sie in der Lage sind, eine Basenfehlpaarung in einem DNA-Doppel strang spezifisch zu erkennen und daran zu binden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Referenz-DNA als biotinyliertes Oligonucleotid eingesetzt, das entweder synthetisiert oder durch eine Amplifikation mit sequenzspezi fischen Oligonucleotiden, von denen eines am 5'-Ende biotiny liert ist, hergestellt wird. Dabei muss die genaue Sequenz der Referenz-DNA bekannt sein. Danach wird die Referenz-DNA durch Aufschmelzen, vorzugsweise in einer Pufferlösung mit niedrigem Salzgehalt, in den einzelsträngige Zustand überführt und durch elektronische Adressierung auf eine vorgegebene Position eines Chips aufgebracht. Geeignete Chips werden bspw. von der Firma Nanogen (San Diego/USA) in den Handel gebracht. Das Aufbringen der Referenz-DNA kann bspw. mittels einer Nanogen Molecular Biology Workstation vorzugsweise unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Parameter erfolgen. Die Benutzung der Chips bzw. der Molecular Biology Workstation von Nanogen sind ausführlich beschrieben in (13).

Auf den so vorbereiteten Chip wird nun die Proben-DNA, welche komplementär zu der auf den Chip bereits aufgebrachten Sequenz ist, aufgetragen. Dazu werden farbstoffmarkierte Oligonucleo tide synthetisiert oder durch eine Amplifikation mit sequenz spezifischen Oligonucleotiden, von denen eines am 5'-Ende farbstoffmarkiert ist, erzeugt. Dabei stellt das farbstoff markierte Nucleotid der Proben-DNA den Gegenstrang zu dem biotinylierten DNA-Strang der Referenz-DNA dar. Auch die Proben-DNA muss vorher durch Aufschmelzen z. B. in einer Pufferlösung mit niedrigem Salzgehalt, in den einzelsträngigen Zustand überführt und durch elektronische Adressierung auf die biotinylierte Referenz-DNA aufgebracht werden. Dadurch entsteht durch Hybridisierung eine DNA-Heteroduplex bestehend aus Referenz-DNA und Proben-DNA. Auch die Herstellung der Heteroduplex kann z. B. mit einer Nanogen Molecular Biology Workstation unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Parameter erfolgen. Die erfolgreiche Hybridisierung kann durch Nachweis des an die Heteroduplex gekoppelten Farbstoffes optisch unter Verwendung der Nanogen Molecular Biology Workstation erfolgen und in Verbindung mit einem Computer programm quantitativ nachgewiesen werden.

Weist nun die Sequenz der Proben-DNA eine Mutation gegenüber der Referenz-DNA auf, so kommt es in der Heteroduplex zu einer Fehlpaarung. Solche Fehlpaarungen werden von den Proteinen der mutS-Familie mit hoher Spezifität erkannt. Besonders geeignet sind hierfür die Fehlpaarungen erkennenden muts-Protein aus E.coli und aus T. aquaticus.

Das Fehlpaarungen erkennende Protein kann außer farbstoff tragenden und fluoreszierenden Gruppen auch enzymatische oder radioaktive Markierungen enthalten. Zur enzymatischen Markierung eignen sich vor allem die Chloramphenicol-Acetyl transferase, die alkalische Phosphatase, die Luciferase oder die Peroxydase.

Unter den zur Markierung geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen sind vor allem Cy3, Cy5, FITC oder Texas Red zu bevorzugen.

Wird nun ein bspw. mit Farbstoff markiertes muts-Protein mit der auf der Chipoberfläche gebundenen Heteroduplex-DNA inkubiert, so bindet das Protein vorzugsweise an den Positio nen des Chips, wo es zu Fehlpaarungen innerhalb der Heterodu plex gekommen ist. Die gebundenen farbstoffmarkierten mutS- Proteine werden dann durch optische Detektion z. B. unter Verwendung der Nanogen Molecular Biology Workstation in Verbindung mit einem geeigneten Computerprogramm quantitativ nachgewiesen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nicht nur zum Nachweis von Genmutationen, sondern kann auch Unterschiede im Expressionsniveau der aus der cDNA in verschiedenen Zellen oder Geweben exprimierten mRNA anzeigen. Dies geschieht dadurch, dass der an die Proben-DNA gekoppelte Farbstoff optisch nachgewiesen wird. Da die Menge des Farbstoffes an einer gegebenen Chipposition mit der Menge der cDNA korre liert, erlaubt die Auswertung der Farbstoffintensität von mehreren Chippositionen Unterschiede im Expressionsniveau verschiedener Zellen oder Gewebe festzustellen. Dabei wird der an die Proben-DNA gebundene Farbstoff optisch nachgewiesen. Da die Menge des Farbstoffs an einer gegebenen Chipposition mit der Menge an cDNA korreliert, erlaubt die Auswertung der Farbstoffintensität von mehreren Chippositionen Unterschiede im Expressionsniveau verschiedener Zellen oder Gewebe festzustellen. Der parallele Nachweis von Mutationen und Genexpressionsunterschieden in derselben Probe ist nicht nur zeitsparend, sondern wegen der gleichmäßigen Behandlung der Proben in beiden Nachweissystemen auch weniger fehleranfällig. Die hier beschriebene Methode zum parallelen Nachweis von Mutationen und Genexpressionsunterschieden stellt die erste ihrer Art dar.

Durchführungsbeispiel 1. Einleitung

Basenfehlpaarungs-bindende Proteine wie Proteine der mutS- Familie spielen eine wichtige Rolle bei der Erkennung und Reparatur von Schäden der DNA in Eukaryoten, Bakterien und Archeae (14). Diese Proteine binden mit hoher Spezifität an Abschnitte der DNA mit Basenfehlpaarungen und leiten durch Rekrutierung von Enzymen die Reparatur des Schadens ein.

Wegen ihrer besonderen Bindungseigenschaften können diese Proteine zum Nachweis von Mutationen verwendet werden (9). Dazu wird gewöhnlich die DNA, in der eine Mutation vermutet wird, mit einer Referenz-DNA hybridisiert. Weist die zu testende DNA gegenüber der Referenz-DNA eine Mutation auf, bildet sich eine Basenfehlpaarung, die mit Basenfehlpaarungs bindenden Proteinen nachgewiesen werden kann. Die bestehenden Nachweisverfahren sind jedoch zeitaufwendig, ungenau und eignen sich nicht für einen hohen Probendurchsatz. Daher wurde das erfindungsgemäße Verfahren entwickelt, dass den schnellen Nachweis von Mutationen durch elektronisch beschleunigte Hybridisierung der Referenz-DNA mit der zu testenden DNA in Verbindung mit neuartigen, farbstoffmarkierten mutS-Proteinen erlaubt. Das Verfahren eignet sich weiterhin zur parallelen Mutationsanalyse multipler Sequenzen.

Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung des parallelen Mutationsnachweises und lässt folgendes erkennen:

1. Fragmente der Gene A-E werden als einzelsträngige Referenz-DNA auf individuelle Positionen eines Nanogen™- Chips (Nanogen Inc., San Diego, USA) elektronisch adressiert und
2. mit der farbstoffmarkierten Test-DNA elektronisch beschleunigt hybridisiert.
3. Basenfehlpaarungen der resultierenden Heteroduplices reflektieren eine Mutation der Test-DNA gegenüber der Referenz-DNA und können durch ein farbstoffmarkiertes muts-Protein lokalisiert werden.
4. Die optische Analyse des Chips erlaubt anschließend die Zuordnung einer Mutation zu einem Genfragment.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde das muts-Gen aus E.coli kloniert und anschließend überexprimiert. Anschließend wurde erstmalig gereinigtes mutS-Protein mit Farbstoffen markiert und funktionell getestet. In einem weiteren Schritt wurde dann das farbstoffmarkierte muts-Protein zum Mutations nachweis in elektronisch adressierten DNA-Heteroduplices verwendet.

2. Klonierung, Expression und Reinigung von E.coli muts

Die DNA-Sequenz, die für mutS aus E.coli kodiert, wurde über PCR amplifiziert und nach Standardverfahren isoliert. Der 5'- Primer (SEQ. ID No. 1) führt eine BamHI Schnittstelle unmittelbar vor dem Start-Codon ein, während der 3'-Primer (SEQ. ID No, 2) eine HindIII Schnittstelle nach dem Stop-Codon generiert. Die PCR ist dem Fachmann bekannt und wurde nach folgendem Schema durchgeführt:
Eine Zahnstocherspitze E.coli XL1Blue (Stratagene, Amsterdam Zuidoost, Niederlande) werden in einen 100 µl PCR-Ansatz mit 71 µl H₂O und 10 µM 5'-Primer, 10 µl 10 pH 3'-Primer, 10 µl 10x PCR-Puffer mit MgSO₄ (Roche, Mannheim), 2 µl DMSO, 1 µl dNTP's (jeweils 25 µM) und 2 µl Pwo Polymerase (= 10 U) gegeben. Die PCR läuft mit folgendem Programm: 94°C für 5 Minuten mit anschließend 30 Zyklen mit 0,5 Minuten 94°C, 0,5 Minuten 55°C und 2,5 Minuten 72°C. Am Ende der PCR schließt sich eine Inkubation von 7 Minuten bei 72°C an.

Das mutS-PCR-Produkt (SEQ. ID. No. 3) wird über ein 1%-iges TAE Agarose Gel aufgereinigt und die gewünschte DNA wird aus einem ausgeschnittenen Agarose-Block mit Hilfe des Gel Extraktion Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.

Die isolierte DNA wird über ein Gen quantifiziert und mit BamHI und HindIII geschnitten. In einem 60 µl Ansatz werden 10 µl mutS-PCR-Produkt (etwa 2 µg) mit 30 U BamHI (3 µl, NEB, Heidelberg), 30 U HindIII (3 µl, NEB, Heidelberg), 6 µl 10x NEB2-Puffer (NEB, Heidelberg), 0,6 µl 100y BSA (NEB, Heidel berg) und 37,4 µl H₂O vereint und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Enzyme werden anschließend bei 70°C für 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wird nach Zugabe von 6 µl Na- Acetat pH 4,9 und 165 µl Ethanol über Nacht bei 4°C gefällt. Nachdem das Pellet in 70%-igen Alkohol gewaschen wurde, wird es an der Luft getrocknet. Die DNA wird in 30 µl TE (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH8) aufgenommen.

Das E.coli Expressionsplasmid pQE30 (SEQ. ID No. 4) (Qiagen, Hilden) wird ebenfalls mit BamHI und HindIII geschnitten.

In einem 60 µl Ansatz werden 10 µl pQE30 mit 30 U BamHI (3 µl, NEB, Heidelberg) 30 U HindIII (3 µl, NEB, Heidelberg) 6 µl 10x NEB2-Puffer (NEB, Heidelberg), 0,6 µl 100y BSA (NEB, Heidel berg) und 37,4 µl Wasser vereint und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Enzyme werden anschließend bei 70°C für 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wird nach Zugabe von 6 µl Na- Acetat pH 4,9 und 165 µl Ethanol über Nacht bei 4°C gefällt. Nachdem das Pellet mit 70%-igem Alkohol gewaschen wurde, wird es an der Luft getrocknet. Die DNA wird in 30 µl TE (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH8) aufgenommen.

Die Mengen von pQE30 und mutS werden auf einem Agarose-Gel verglichen und es werden 100 ng Plasmid (2 µl) und 150 ng (5 µl) mutS DNA in einem 20 µl Ligationsansatz mit 2 µl 101x Ligase-Puffer (Roche, Mannheim), 2 µl Ligase (2 U, Roche, Mannheim) und 9 µl H₂O vereint und 2 Stunden bei 37°C inku biert. Der Ligationsansatz wird anschließend mittels CaCl₂- Methode (Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, Vol. 1, ED Wiley and Sons, 2000) E.coli TOP10 (Firma Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) tranformiert. Die Zellen werden auf Ampicillin-Resistenz hin selektiert und positive Klone werden mittels Minipräp-Analyse auf den Plasmidgehalt hin untersucht. Mit Klonen, bei denen das gewünschte Plasmid pQE30-mutS (SEQ. ID. No. 5) gefunden wurde, wurde eine Proteininduktion vorgenommen.

Eine 5 ml LB (mit 100 µg/ml Ampicillin) über Nacht Kultur E.coli TOP10 mit dem Plasmid pQE30-mutS wird so verdünnt, dass in einer darauf folgenden, 100 ml LB (100 µg/ml Ampicillin) eine OD von 0,05 entsteht. Die Zellen werden bei 37°C unter Schütteln (240 rpm) so lange inkubiert, bis eine OD von 0,25 erreicht wurde. Anschließend wird eine hPTG Konzentration von 1 mM in der Kultur eingestellt und die Zellen werden weitere 4 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (5.000 xg für 10 Minuten) geerntet. Das Zellpellet wird in 10 ml PBS-Puffer mit 0,1 g Lysozym (Sigma, Deisendorf) und 250 U Benzonase (Merck, Darmstadt) aufgenommen und bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.

Abb. 2 zeigt eine SDS-PAGE mit mutS (Pfeil) exprimierenden E.coli Stämmen nach Induktion (Bahn 1 und 2) und vor der Induktion (Bahn 3).

Danach wurden 100 µl PMSF (100 mM in Isopropanol) (Sigma, Deisendorf) und 100 µl Triton X-100 (Sigma, Deisendorf) zugegeben. Nachdem die Zellen lysiert sind, wurden die Zellreste bei 10.000 xg für 10 Minuten abzentrifugiert. 2 ml Nickel-NTA-Agarose (Qiagen, Hilden) werden 3 × mit 10 ml Puffer (Qiagen, Hilden) äquilibriert. Anschließend wird dem Lysat die äqulibrierte Nickel-NTA-Agarose zugegeben. Es folgt eine Inkubation bei 4°C für eine Stunde. Das Material mit gebundenem mutS-Protein wird über eine Minisäule mit Glasfritte abgetrennt (Biorat, München) und 3 × mit Puffer A gewaschen (4 ml, 2 ml, 2 ml). Anschließend wird das Protein mit 2 × 2 ml Puffer 8 (Qiagen) eluiert.

3. Farbstoffmarkierung und funktioneller Test von M.Taq mutS und E.coli mutS 3.1 Unspezifische Markierung von M.Taq mutS mit Cy™3

Die Farbstoffe Cy™3 und Cy™5 (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) werden aufgrund ihrer Fluoreszenzeigen schaften häufig zur Fluoreszenzmarkierung von Biomolekülen verwendet (Mujumdar, R. B. et al., Bioconjugate Chemistry 4 (1993) 105-111; Yu, H. et al., Nucleic, Acids Research 22 (1994) 3226-3232). Für die Konjugation wird dabei üblicher weise der entsprechende Succinimidylester über eine nukleophi le Substitutionsreaktion an Proteinlysinreste unspezifisch kovalent geknüpft. Das von der Firma Pharmacia ausgearbeitete Protokoll (FluoroLink™ product specification protocol, Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) sieht dabei für eine optimale Fluoreszenzmarkierung des Proteins dessen Inkubation mit einem großen Überschuss an Fluorophor unter relativ stark basischen Bedingungen vor (0,1 M Na₂CQ, ph 9,3). So wurde zunächst in Anlehnung an dieses Protokoll eine Fluoreszenzmarkierung des thermostabilen muts aus Thermus aquaticus mit Cy3 vorgenommen. Nach gelpermeationschromatogra phischer Aufreinigung und anschließender SDS-PAGE Analyse konnte eine stark fluoreszierende Proteinbande nachgewiesen werden, die eindeutig aufgrund ihres Molekulargewichts einem mit Cy3 markierten muts-Protein entspricht (Abb. 3). Bahn 1 zeigt das mutS-Cy™3 (M.Taq), während die Bahnen 2 bis 4 das mutS-Cy™S (E.coli) darstellen.

Der nachfolgende Aktivitätstest (Band-Shift-Assay) zeigte allerdings, dass das markierte Protein keinerlei Aktivität mehr besaß und daher nicht in der Lage war, ein G/T Mismatch enthaltendes Oligomer zu binden (s. Abb. 7). Dieses Experiment zeigt, dass im Fall der Markierung des mutS-Proteins die von Pharmacia vorgeschlagenen Markierungsprozedur unpraktikabel ist und zum Erhalt von aktivem Protein ein verfeinertes und optimiertes Markierungsprotokoll etabliert werden muss.

3.2 Unspezifische Markierung von E.coli muts und M.Taq mutS mit Cy™5

Für die Fluoreszenzmarkierung des Proteins wurden vier Labelingansätze mit steigenden Konzentrationen an Labeling- Reagenz in Labeling-Puffer (20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin- N'-2-Ethansulfonsäure (HEPES), pH 7,9, 150 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM N,N,N',N'-Ethylendiamintetraacetat (EDTA), 10% Glycerin in destilliertem Wasser) durchgeführt, um unter schiedliche Populationen an fluoreszenzmarkiertem mutS zu erhalten. Diese sich im Labelinggrad unterscheidenden Proteine wurden dann im Band-Shift-Assay auf ihre Aktivität hin untersucht.

Die Labeling-Reaktion wurde in einer Mischung (500 µl) aus E.coli muts-Protein (50 µg, 1,05 µM) mit steigenden Konzen trationen an Cy™5-Succinimidylester (12 µM, 20 µM, 50 µM und 100 µM) in Labeling-Puffer bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln durchgeführt. Zur Reinigung des farbstoffmarkierten mutS-Proteins wurde eine NAP-5 Gelfiltrationssäule (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) mit 3 Säulenvolumina Elutions-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 10% Glycerin in destilliertem Wasser equilibriert. Die Labeling-Reaktions lösung wird mit Elutions-Puffer (500 µl) versetzt, komplett auf die Säule aufgetragen und die unterschiedlich fluoreszenz markierten Proteine durch Elution mit Elutions-Puffer isoliert. Die fluoreszierenden Proteinfraktionen wurden dann näher UV-spektroskopisch (Abb. 4) und SDS-PAGE gelchromatogra phisch (Abb. 5) untersucht.

Abb. 4 zeigt die UV-Spektren von mutS-Cy™S (E.coli) Konjuga ten mit unterschiedlichem Fluoreszenzmarkierungsgrad (D/P- Ratio). Die Spektren 1 bis 4 zeigen folgende Fluoreszenzmar kierungsgrade: 1. D/P = 0,5 (20 µM Cy™5), 2. D/P = 1,0 (50 µM Cy™5), 3: D/P = 2,0 (100 µM Cy™S) und 4. D/P = 3,0 (100 µM Cy™5).

Abb. 5 zeigt die SDS-PAGE von mutS-C™5 (E.coli) Fraktionen mit unterschiedlichem Fluoreszenzmarkierungsgrad (D/P Ratio). Die Spektren 1 bis 7 zeigen folgende Fluoreszenzmarkierungs grade: 1. D/P = 0,5 (20 µM Cy™5), 2. D/P = 0,5 (20 µM Cy™5), 3. D/P = 1,5 (50 µM Cy™5), 4. D/P = 1,0 (50 µM Cy™5), 5. D/P = 2,0 (100 µm Cy™5), 6. D/P = 3,0 (100 µM Cy™5), 7. D/P = 2,5 (100 µM Cy™5).

Anschließend wurde mit der Band-Shift-Methode überprüft, ob die mit Cy™5 konjugierten muts-Proteine funktionell aktiv waren, d. h. ob sie noch spezifisch an Basenfehlpaarungen binden konnten. Dazu wurden die doppelsträngigen Oligonucleo tide AT (SEQ. ID No. 6) und GT (SEQ. ID No. 7) durch 5- minütiges Erhitzen der jeweiligen komplementären Einzelstränge in 10 M Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂) auf 95°C gefolgt vom langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur durch Hybridisierung erzeugt. Die komplementären Einzelstränge SEQ. ID. No. 6 und SEQ. ID. No. 7 bildeten dabei das Oligonucleotid AT, die Einzelstränge SEQ. ID. No. 6 und SEQ. ID. No. 8 das Oligonucleo tid GT. Das Oligonukleotid GT weist gegenüber dem Oligonu cleotid AT eine Basenfehlpaarung auf. Mit Hilfe der T₄- Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Frankfurt) wurden nach Angaben des Herstellers je 10 µmol der beiden Oligonu kleotide AT und GT mit 150 µCi γ-³²P-ATP an den 5'-Enden radioaktiv markiert und über Sephadex G50-Gelfiltrationssäulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Für einen Band-Shift Ansatz wurden 17 fmol des jeweiligen Oligonukleotids in 10 µl Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiotreitol (DTT), 100 µg/ml BSA Fraktion VII, 15% Glycerin in destilliertem Wasser) aufgenommen und mit 10 µl der Cy™5 konjugierten mutS-Proteine bzw. 10 µl entsprechend 0,5 mg kommerziell erhältlicher mutS-Proteine für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden unkonjugiertes E.coli mut S (Gene Check, Fort Collins, USA) und T.aquaticus mutS (Epicentre, Madison, USA) verwendet, und Cy™5-konjugiertes T.quaticus mut S wurde nach der für E.coli mutS etablierten Vorschrift zum Vergleich präpariert. Nach der Inkubation wurden die Ansätze auf 6% Polyacrylamidgelen vom Typ PROTEAN3 (Biorad, München) aufgetragen und für 90 Minuten bei 25 mA getrennt. Gel- und Laufpuffersystem war dabei 45 mM Tris- Borat, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA. Nach dem Lauf wurden die Gele getrocknet und durch Autoradiographie analysiert (Abb. 6). Die Abb. 6 zeigt Cy™5-konjugiertes E. coli mutS (Bahnen 4,9) und weist gegenüber kommerziell erhältlichem Protein (Gene Check, Fort Collings, USA, Bahnen 2, 7) keinen Aktivitätsverlust auf. Gleiches gilt für Cy™S-konjugiertes T.aquaticus mutS (Epicen tre, Madison, USA, Bahnen 3, 8 unkonjugiert, Bahnen 5, 10 konjugiert). Alle Proteine banden Oligonukleotid G/T (Bahnen 6 bis 10) besser als Oligonukleotid A/T (Bahnen 1 bis 5). Bahnen 1 und 6 enthalten kein Protein. Konjugierte und unkonjugierte Proteine banden stärker an das Oligonukleotid mit dem Mismatch (G/T) als an das Oligonukleotid ohne Mismatch (A/T). Unter den hier verwendeten Konjugationsbedingungen zeigten weder E.coli muts noch T.aquaticus muts einen Aktivitätsverlust.

Im Gegensatz zu dem vorstehend genannten Konjugationsprotokoll führt die Konjugation von T.aquaticus mit Cy™3 unter Verwen dung der vom Hersteller des Farbstoffs empfohlenen und z. B. für Antikörper geeigneten Bedingungen zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des konjugierten Proteins (Abb. 7), so dass dieses Standardprotokoll hier nicht verwendet werden konnte.

Abb. 7 zeigt unkonjugiertes T.aquaticus mutS (Bahnen 2, 7 : 0,16 µg, Bahnen 5, 10 : 0,64 µg) und bindet im Gegensatz zu unter Standardbedingungen Cy™3-konjugierten Protein (Bahnen 4, 9 : 0,16 µg, Bahnen 5, 10 : 0,64 µg) an DNA, wobei der Mismatch (Bahnen 6 bis 10) besser gebunden wird als die genaue Basenpaarung (Bahnen 1 bis 5). Bahnen 1 und 6 enthalten kein Protein.

Nachweis von Punktmutationen auf elektronisch adressierbaren DNA-Chips

Die funktionellen farbstoffmarkierten E. coli und T. aquaticus mutS-Proteine wurden nun zum Nachweis von Punktmutationen auf elektronisch adressierbaren DNA-Chips verwendet. Dazu wurde zunächst eine 100 nN Lösung des am 5'-Ende biotinylierten Oligonukleotids "Sense" (Seq. Id Nr. 9) auf alle Positionen der Reihen 1-5 sowie 7-9 eines 100-Positionen DNA-Chips der Firma Nanogen wie in (13, 15, 16) beschrieben für 60 s mit 2 V elektronisch adressiert (Abb. 8). Die Stromstärke pro Position schwankte in den Reihen 1-8 zwischen 262 nA und 364 nA, in den Reihen 9 und 10 zwischen 21 nA und 27 nA, wodurch an diese Positionen weniger DNA adressiert wurde. Anschließend wurde das zu dem Oligonukleotid "Sense" (Seq. Id Nr. 9) vollständig komplementäre und am 5'-Ende mit Cy™3 markierte Oligonukleo tid Seq. ID Nr. 7 unter den oben beschriebenen Bedingungen auf die Reihen 1, 3, 7 und 9 des Chips aufgebracht, so dass an diesen Positionen vollständig gepaarte, mit "AT" bezeichnete Doppelstränge entstanden (Tabelle 1). In einem weiteren Schritt wurde das Cy™3 markierte Oligonukleotid Seq. ID Nr. 8 wie oben beschrieben auf die Positionen 2, 4, 8 und 10 des Chips aufgebracht. Dieses Oligonukleotid bildet mit dem vorher adressierten Oligonukleotid "sense" einen Doppelstrang mit einer einzelnen G/T Basenfehlpaarung, weswegen das resultie rende doppelsträngige Oligonukleotid mit "GT" bezeichnet wird (Tabelle 1).

Je 50 µl der oben beschriebenen Cy™S markierten muts-Proteine wurden über Sephadex G50 Spin-Columns (Pharmacia, Uppsala, Schweden) nach Angabe des Herstellers gereinigt und somit von unkonjugiertem Farbstoff vollständig befreit. Die Säulen wurden vorher mit 500 µl Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (DTT), gegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Fluoreszenzintensität der Cy™3 auf der Chipoberfläche nach Angaben des Herstellers Nanogen gemessen (Tabelle 1). Die geringen Schwankungen der Werte in den Reihen 1-4 sowie 7 und 8 deuten auf eine gleichmäßige Hybridisie rung der doppelsträngigen Oligonukleotide AT und GT hin. Die im Vergleich dazu niedrigeren Werte der Reihen 9 und 10 reflektieren die in diesen Reihen kleineren DNA-Mengen wegen niedrigerer Adressierungsstromstärke (s. o.). Die niedrigen Werte in den Reihen 5 und 6 stellen das Hintergrundsignal dar, da an diese Reihen keine fluoreszenzmarkierte DNA adressiert wurde.

Tabelle 1

Bestimmung der Fluoreszenzintensität von Cy™3- markierter DNA auf einem elektronisch adressierten 100- Positionen Chip bei 575 nm. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten sowie die an diese Positionen adressierte DNA (äußere rechte Spalte)

Die anschließende Fluoreszenzmessung des Cy™5-markierten E. coli muts-Proteins zeigt deutlich, dass das Protein bevorzugt an das Oligonukleotid GT bindet (Tabelle 2). Selbst bei sehr kleinen DNA-Mengen (Tabelle 2, Reihen 9 und 10) ist eine Diskriminierung zwischen dem perfekt paarenden Oligonukleotid (AT) und dem mismatch-enthaltenden Oligonukleotid (GT) mit dem farbstoffmarkierten Protein möglich, die bei größeren DNA- Mengen (Reihen 1-4 sowie 7 und 8, vergleiche Tabelle 1) noch deutlicher wird. Auffällig sind weiterhin die niedrigen Hintergrundwerte (Tabelle 2, Reihe 5 und 6).

Um zu ermitteln, ob andere Mismatch-bindende Proteine wie z. B. das muts-Protein aus T. aquaticus ebenfalls zum schnellen Nachweis von Mutationen auf elektronisch adressier baren Chips verwendet werden können, wurde zunächst ein 100- Positionen-Chip der Firma Nanogen genau wie oben beschrieben adressiert. Anschließend wurde Cy™5-markiertes T. aquaticus muts-Protein wie oben beschrieben über Sephadex G50 Spin- Columns weiter aufgereinigt und für 20 min mit der Chipober fläche inkubiert. Anschließend wurde die Fluoreszenzintensität der Cy™3 auf der Chipoberfläche nach Angaben des Hersteller Nanogen gemessen (Tabelle 3). Die geringen Schwankungen der Werte in den Reihen 1-4 sowie 7 und 8 deuten wiederum auf eine gleichmäßige Hybridisierung der doppelsträngigen Oligonukleotide AT und GT hin. Die im Vergleich dazu niedrige ren Werte der Reihen 9 und 10 reflektieren wieder die in diesen Reihen kleineren DNA-Mengen wegen niedrigerer Adressie rungsstromstärke (s. o.). Die niedrigen Werte in den Reihen 5 und 6 stellen das Hintergrundsignal dar, da an diese Reihen keine fluoreszenzmarkierte DNA adressiert wurde. Die an schließende Fluoreszenzmessung des Cy™S markierten T. aquaticus mutS-Proteins zeigt deutlich, dass auch dieses Protein bevorzugt an das Oligonukleotid GT bindet (Tabelle 2) und somit zum Nachweis von Mutationen auf elektronisch adressierbaren DNA-Chips geeignet ist.

Tabelle 2

Bestimmung der Fluoreszenzintensität von Cy™5- markiertem E. coli mutS-Protein auf einem elektronisch adressierten 100-Positionen Chip bei 670 nm. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten sowie die an diese Positionen adressierte DNA (äußere rechte Spalte)

Tabelle 3

Tabelle 4

Bestimmung der Fluoreszenzintensität von Cy™5- markiertem T. aquaticus muts-Protein auf einem elektronisch adressierten 100-Positionen Chip bei 670 nm. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten sowie die an diese Positionen adressierte DNA (äußere rechte Spalte)

Literaturverzeichnis

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14. R. Fishel, Genes Dev. 12 (1998), 2096-2101.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidse quenzen, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) eine definierte, einzelsträngige Nucleotidsequenz auf einen Nucleotid-Chip aufträgt,
b) die auf Mutationen zu untersuchende Nucleotidse quenz, die komplementär zur bekannten Nucleotid sequenz ist, ebenfalls auf den Chip aufträgt und durch Hybridisierung beider Sequenzen eine Hete roduplex herstellt,
c) die Heteroduplex mit einem Fehlpaarungen erken nenden markierten Substrat inkubiert und
d) die Fehlpaarungen durch Detektion des an ihnen angelagerten, markierten Substrates nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erfolgreiche Hybridisierung der zu untersuchenden Nucleotidsequenz

a) durch einen Fluoreszenzfarbstoff oder
b) durch elektronische Detektion nachgewiesen wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, dass man zum quantitativen Nachweis der Menge der zu untersuchenden Nucleotidsequenz die Stärke des bei einer erfolgreichen Hybridisierung auftretenden Fluoreszenzlich tes misst.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, dass der Nucleotid-Chip elektronisch adressierbar ist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, dass das Fehlpaarungen erkennende Substrat ein Protein aus der Gruppe der mutS-Proteine ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Fehlpaarungen erkennende Protein das muts-Protein aus E.coli oder das mutS-Protein aus T. aquaticus ist.

7. Verfahren zum quantitativen Nachweis der Expression von mRNA in verschiedenen Zellen oder Geweben, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) eine bekannte einzelsträngige Nucleotidsequenz auf einen Nucleotid-Chip aufträgt,
b) aus verschiedenen Zellen oder Geweben gewonnene, markierte cDNA ebenfalls auf den Chip aufträgt und durch Hybridisierung beider Sequenzen eine Heteroduplex herstellt und
c) durch quantitative Messung der Markierung die Menge der mRNA bestimmt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine mit Farbstoff markierte cDNA einsetzt und die bei der Hybridisierung auftretende Färbung optisch quanti tativ misst.

9. Fehlpaarungen erkennendes Protein, dadurch gekenn zeichnet, dass es durch Kopplung mit einer nachweisbaren enzymatischen, radioaktiven, farbstofftragenden oder fluo reszierenden Gruppe markiert ist.

10. Fehlpaarungen erkennendes Protein nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein aus der Gruppe muts, mutY, MSH1 bis MSH6, SI-Nuclease, T4-Endonuclease, Thyminglykosylase oder Cleavase ist.

11. Fehlpaarungen erkennendes Protein der Ansprüche 7 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einer enzymatischen Gruppe ausgewählt aus der Gruppe Chloramphenicol-Acetyl transferase, alkalische Phosphatase, Luciferase oder Per oxidase markiert ist.

12. Fehlpaarungen erkennendes Protein der Ansprüche 7 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem Fluoreszenz farbstoff ausgewählt aus der Gruppe Cy3, Cy5, FITC oder Texas Red markiert ist.

13. Verfahren zur Herstellung von mit Fluoreszenzfarb stoffen markierten, Fehlpaarungen erkennenden Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Protein von Anspruch 10 mit einem als Ester vorliegenden Fluoreszenzfarbstoff von Anspruch 12 in einer wässrigen Lösung unter Lichtaus schluss inkubiert und das markierte Protein anschließend chromatographisch reinigt.

14. Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie der SEQ. ID. No, 5 des Sequenzprotokolls entspricht oder eine homo loge Nukleinsäuresequenz aufweist, die für ein Expression plasmid kodiert, mit dem das muts-Protein in E. coli ex primiert wird.

15. Nukleinsäure nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid den T5-Promotor enthält.