DE4011991A1 - Verfahren zur dna-basensequenzbestimmung - Google Patents
Verfahren zur dna-basensequenzbestimmungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur wirkungsvollen Basensequenzbestimmung.
Eine herkömmliche Technik, die für die Bestimmung von DNA-Basensequenzen
verwendet wird, ist Autoradiographie. Andererseits ist kürzlich ein Echtzeitnach
weissystem unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern entwickelt worden. Bei
dieser Technik werden DNA-Fragmente mit vier unterschiedlichen Fluorophoren
entsprechend den vier jeweiligen Sorten oder Arten von Anschlußgattungen, bzw.
Endgruppen, bzw. endständigen Basen markiert und auf eine Wanderungsbahn bzw.
Migrationsbahn zur Wanderung über eine bestimmte Entfernung injiziert und dann
wird ein Laserstrahl darauf angelegt, um zu beobachtendes Fluoreszenzlicht zu
emittieren. Die Endgruppen der DNA-Fragmente können durch die Wellenlängen
des Fluoreszenzlichts erkannt werden und anhand der Nachweiszeit kann die DNA-
Basensequenz bestimmt werden.
Bei einer anderen Technik werden DNA-Fragmente, die vier Sorten von
Endgruppen haben und mit einem einzigen Fluorophor markiert werden, auf vier
unterschiedliche Wanderungsbahnen injiziert, um das emittierte Fluoreszenzlicht zu
messen und die DNA-Basensequenzen zu bestimmen.
Die obenerwähnten herkömmlichen Techniken haben den Mangel, daß für jede
zu bestimmende Probe komplizierte Vorbereitungen gemacht werden müssen.
Um diese komplizierten Vorbereitungen zu vermeiden, wird ein Verfahren zur
DNA-Basensequenzbestimmung angegeben, das einschließt
- (1) einen Schritt 1, in dem verschiedene DNA-Proben in jeweils verschiedene Vektoren eingefügt bzw. inkorporiert bzw. eingebaut werden;
- (2) einen Schritt 2, in dem in einem einzigen Reagenzröhrchen gleichzeitig komplementäre Ketten zu den DNA-Proben synthetisiert werden, um DNA-Fragmente zu bilden;
- (3) einen Schritt 3, in dem die DNA-Fragmente elektrophoretisch getrennt und auf Filter immobilisiert werden;
- (4) einen Schritt 4, in dem eine mit einem Radioisotop markierte DNA-Sonde an einer der DNA-Proben angebracht wird, mit der sie als einziger hybridisieren kann, um das DNA-Fragment für die Bestimmung der DNA-Basensequenz in der DNA-Probe nachzuweisen;
- (5) einen Schritt 5, in dem die mit den Radioisotop markierte DNA-Sonde ausgewaschen wird und eine andere mit einem Radioisotop markierte Sonde an einer anderen DNA-Probe angebracht wird, mit der sie hybridisieren kann, um das DNA-Fragment zur Bestimmung der DNA-Basensequenz der DNA-Probe nachzuweisen und,
- (6) einen Schritt 6, in dem das Verfahren nach Schritt 5 für die anderen restlichen DNA-Proben wiederholt wird, bis ihre Basensequenz bestimmt werden kann.
Das obenerwähnte Verfahren gestattet die gleichzeitige Reaktion bzw. Umsetzung
und Elektrophorese zur Bestimmung der DNA-Basensequenzen von vielen Proben.
Diese Technik wurde von G. M. Church et al. "Multiplex DNA-Sequencing",
Science, Bd. 240 (1988), Seiten 185 bis 188, beschrieben.
Das obenerwähnte Verfahren kann nicht für Proben verwendet werden, die anders
als die Radioisotopen markiert sind, weil das DNA-Bandmuster auf dem Filter
fixiert werden muß. Der Grund ist, daß die Verwendung von Floureszenzsonden
die Lichtstreuung durch Filter zur Folge hat, was eine zu niedrige Empfindlichkeit
ergibt.
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, welches die
Schwierigkeiten der obenerwähnten herkömmlichen Technik vermeidet und eine
DNA-Basensequenzbestimmung durch Fluoreszenzlichtnachweis mit einer Vielzahl
von gleichzeitig zu verarbeitenden Proben möglich macht.
Als Ergebnis der Untersuchungen der Erfinder ist nun gefunden worden, daß
das obenerwähnte Ziel der Erfindung mit einem Verfahren erreicht werden kann,
das beinhaltet: einen Schritt 1, in dem verschiedene DNA-Proben in jeweils
verschiedene Vektoren geklont werden, einen Schritt 2, in dem verschiedene Primer
hergestellt werden, die einzig mit den entsprechenden Vektoren hybridisiert werden
können und welche mit jeweils unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind; einen
Schritt 3, in dem zu den in Schritt 1 erhaltenen Proben, im Gemisch mit den
obenerwähnten verschiedenen Primern, komplementäre Ketten synthetisiert werden;
einen Schritt 4, in dem aus den bekannten Gemischen, die in Schritt 3 erhalten
wurden, vier DNA-Fragmentgruppen mit jeweils vier unterschiedlichen Endgruppen
hergestellt wrden; und einen Schritt 5, in dem die durch die Endgruppen
klassifizierten vier DNA-Fragmentgruppen auf individuell unterschiedlichen
Elektrophoresebahnen elektrophoretisch wandern gelassen werden und, daß von den
DNA-Fragmenten jeder DNA-Fragmentgruppe emittierte Fluoreszenzlicht nach
gewiesen wird.
Auf der Grundlage der neuen Erkenntnis haben die Erfinder die vorliegende
Erfindung weiter studiert und vervollständigt. Ein erfindungsgemäßen Verfahren zur
DNA-Basensequenzbestimmung ist wie folgt:
Es werden Einzelstrang-DNA-Proben hergestellt, bei denen eine Vielzahl von
Basensequenzen, jeweils eingefügt in verschiedene Vektoren, bestimmt werden
sollen. Primer, deren Anzahl mit der Anzahl der Arten von Vektoren korrespon
diert, deren Basensequenzen voneinander unterschiedlich sind und welche nur mit
einem bestimmten Vektor hybridisiert werden können, werden mit jeweiligen
Fluorophoren mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen markiert. Die mit den
jeweiligen Fluorophoren mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen markierten
Primer werden mit der Vielzahl der entsprechenden unterschiedlichen Vektoren für
die jeweiligen Einzelstrang-DNA-Proben derart hybridisiert, daß alle DNA-Proben
mit allen Primern gemischt und umgesetzt werden; das Gemisch der umgesetzten
Proben wird in vier Teile aufgeteilt; in den in vier Teilen geteilten Gemischen der
Proben werden einzeln komplementäre Ketten synthetisiert, so daß die Endgruppen
davon Adenin, Cytosin, Guanin bzw. Thymin sind, wodurch einzeln eine DNA-
Fragmentgruppe hergestellt wird, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Adenin
ist, eine DNA-Fragmentgruppe, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Cytosin
ist, eine DNA-Fragmentgruppe, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Guanin
ist, und eine DNA-Fragmentgruppe, in der die Endgruppe des DNA-Fragments
Thymin ist; und die jeweiligen DNA-Fragmentgruppen werden eletrophoretisch
wandern gelassen; individuelles Fluoreszenzlicht, das von den DNA-Fragmenten
jeder Gruppe emittiert wird, wird nachgewiesen, und die Proben werden getrennt
und entsprechend den unterschiedlichen Emissionswellenlängen der Vielzahl der
DNA-Proben nachgewiesen.
Als Vektoren können verwendet werden, z. B., ein bekannter M13-Vektor, YAC-
Vektor, pUC-Vektor etc. Die Einzelstrang-DNA-Proben können in einer Art und
Weise hergestellt werden, z. B., daß die gewünschte bzw. Ziel-DNA mit einem
bestimmten Teil des Vektors kloniert wird und dann alkali-denaturiert wird, wie
bekannt. Jeder Vektor hat eine Vielzahl von Klonierteilen. Jeder der Primer kann
auf dem Weg erhalten werden, daß das Oglionucletid mit 18 bis 20 Basen,
welches zu einem Teil des Vektors komplementär ist, künstlich synthetisiert und
fluoreszenzmarkiert wird. Da die erhaltenen Primer in ihrer Sequenzkonfiguration
unterschiedlich voneinander sind, können sie nur mit einem besonderen der
einzelnen Vektoren hybridisiert werden. Die Fluorophoren, die die Primer
markieren, können FITC (Fluorescein-isothiocyanat) mit 515 nm maximaler
Emissionswellenlänge, NBD-F (4-Fluor-7-nitrobenbenzofurazan) mit 540 nm maximaler
Emissionswellenlänge, TRITC (Tetramethylrhodamin-isothiocyanat) mit 575 nm
maximaler Emissionswellenlänge, Texas-Rot mit 605 nm maximaler Emissions
wellenlänge usw. sein.
Das Verfahren zur Hybridisierung der Primer mit den Vektoren und die Bildung
der DNA-Fragmente durch Synthese komplementärer Ketten kann mit üblichen
Methoden durchgeführt werden.
Die Basensequenzen einer Vielzahl von Einzelstrang-DNA-Proben mit jeweils
unterschiedlichen DNA-Basensequenzen können z. B. dadurch gleichzeitig bestimmt
werden, daß die DNA-Fragmentgruppen, die gemäß der Sorte der Endgruppen
klassifiziert sind, auf ihren jeweiligen Wanderungsbahnen wandern gelassen werden
und, daß danach das Fluoreszenzlicht, das emittiert wird, durch das Anlegen eines
Laserstrahls auf die Abschnitte mit einem bestimmten Abstand, zu denen die
DNA-Fragmente wandern, durch bekannte Wellenlängentrennungsvorrichtungen, so
wie Rotationsfilter oder ein Prisma aufgetrennt werden und jede der getrennten
Wellenlängen einzeln mit einem zweidimensionalen Fluoreszenzlichtdetektor
nachgewiesen wird, wodurch die Proben getrennt und nachgewiesen werden, und
auf der anderen Seite die Sorte der Endgruppen jedes DNA-Fragments bekannt
wird, weil bekannt ist, auf welcher Wanderungsbahn die Fluoreszenz emittiert wird.
Die Wanderungsbahnen können auf einem Polyacrylamidgel oder Agarosegel
zwischen Gelträgerplatten, wie z. B. Quarz- oder Glasplatten, ausgebildet werden.
In Kürze kann das erfindungsgemäße Verfahren zur DNA-Basensequenzbestimmung
wie folgt zusammengefaßt werden. Unterschiedliche Primer werden mit Fluoropho
ren mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen markiert. Zu Proben von
unterschiedlichen DNA-Fragmenten, die mit den Primern hybridisiert sind, werden
im gemischten Zustand für jede Endgruppe komplementäre Ketten synthetisiert. Die
komplementär-ketten-synthetisierten Gemische werden auf unterschiedlichen
Wanderungsbahnen entsprechend den jeweiligen Sorten der Endgruppen wandern
gelassen. Fluoreszenzlicht, welches von Abschnitten emittiert wird, zu denen sie
gewandert sind und auf die ein Laserstrahl angelegt ist, wird nachgewiesen und
die vorbeiwandernden DNA-Fragmente werden nachgewiesen. Die Arten der Probe
und der Endgruppen werden bestimmt durch die Emissionswellenlänge bzw. die
Lage der Wanderungsbahnen, wodurch die DNA-Basensequenz jeder Probe
bestimmt wird.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden
Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit der
Zeichnung.
Fig. 1 ist ein Probenherstellungsschnittdiagramm einer erfindungsgemäßen
Ausführungsform.
Fig. 2 ist eine Veranschaulichung und zeigt Gruppen der in den Schritten
von Fig. 1 hergestellten Proben.
Fig. 3 ist eine schematische Ansicht, die eine Elektrophorese-Vorrichtung
vom Mehrfarben-Fluoreszenz-Nachweistyp veranschaulicht, die in einer
erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendet wird, und
Fig. 4 ist eine vergrößerte Ansicht von Linienabbildungen, die auf einem
Bildschirm der Elektrophoresevorrichtung vom Mehrfarben-Fluoreszenz-
Nachweistyp abgebildet wrden, die in einer erfindungsgemäßen
Ausführungsform verwendet wird.
Bezugnehmend auf die Fig. 1 bis 4 wird unten eine erfindungsgemäße
Ausführungsform beschrieben. Zuerst werden in der Ausführungsform zwei
doppelsträngige DNAs (DNAa und DNAb) isoliert, deren Basensequenzen bestimmt
werden sollen. In der vorliegenden Ausführungsform wird eine vordere und eine
hintere Basensequenz der beiden doppelsträngigen DNAs in der rechten und
umgekehrten Richtung bestimmt, d. h. insgesamt werden vier Basensequenzen
bestimmt.
Zu diesem Zweck werden vier unterschiedliche Vektoren 1 bis 4 verwendet, um
die jeweiligen DNA-Basensequenzen zu bestimmen. Insbesondere werden die
vordere Einzelstrang-DNAa1 und die hintere Einzelstrang-DNAa2 der doppel
strängigen DNAa und die vordere Einzelstrang-DNAb1 und die hintere Einzel
strang-DNAb2 der doppelsträngigen DNAb in jeweils unterschiediche Vektoren 1
bis 4 kombiniert, um neu angeordnete Vektoren zu bilden. Diese sind vier
Einzelstrang-DNA-Proben 5 bis 8.
Andererseits werden die Primer 9 bis 12 hergestellt, die unterschiedliche DNA-
Basensequenzen haben, wobei jeder nur mit einer Sorte der Vektoren 1 bis 4
hybridisieren kann. Die Primer sind jeweils mit Fluorophoren mit unterschiedlichen
Emissionswellenlängen markiert, einschließlich eines Fluorescein-isothiocyanats mit
515 nm Emissionswellenlänge (FITC, 4-Fluor-7-nitrobenzofurazan mit 540 nm
Emissionswellenlänge (NBD-F), Tetramethylrhodamin-isothiocyanat mit 573 nm
Emissionswellenlänge (TRITC) und Texas-Rot mit 605 nm Emissionswellenlänge.
Sodann wird jede der DNA-Proben 5 bis 8 mit den jeweiligen Primern 9 bis 12
zum Hydrisieren zusammengemischt. Jeder Primer 9 bis 12 kann nur mit einem
entsprechenden der Vektoren 1 bis 4 hybridisiert werden. Die erhaltenen
hybridisierten DNA-Proben, wie in Fig. 1 gezeigt, sind die DNA-Proben 5-9, 6-
10, 7-11 und 8-12 als ein verarbeitetes Gemisch.
Dann wird das verarbeitete Gemisch in jeweils vier Teile geteilt. Jeder Teil wird
einzeln mit Deoxynucleotid und Dideoxynucleotid zusammengesetzt, so daß die
jeweilige Endgruppe der vier Teile Adenin, Cytosin, Guanin bzw. Thymin werden
kann. Die Ergebnisse werden jeweiligen enzymatischen Umsetzungen unterworfen
(in Fig. 1 gezeigt als A-, C-, G- bzw. T-Umsetzung) um die Komplementär-
Ketten-Synthese zu vollziehen.
Die Komplementär-Ketten-Synthesen können individuelle DNA-Fragmentgruppen
herstellen, deren Endgruppe des DNA-Fragments eine von den vier Sorten ist. Die
DNA-Fragmentgruppen beinhalten die Gruppen A, C, G und T. Die Gruppe A
(oder A-Familie) ist die, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Adenin ist.
Insbesondere ist die DNA-Fragmentgruppe A eine Gruppe, in der die Endgruppen
der DNA-Probe, die mit den Vektoren hybridisiert wurde, Adenin sind. Sie
beinhaltet 5-9-A, 6-10-A, 7-11-A und 8-12-A, gezeigt in Fig. 1. Die Gruppe C
(oder C-Familie) ist die, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Cytosin ist.
Insbesondere ist das DNA-Fragment der Gruppe C eine Gruppe, in der die
Endgruppen der DNA-Proben, die mit den Vektoren hybridisiert sind, Cytosin sind.
Sie beinhaltet 5-9-C, 6-10-C, 7-11-C und 8-12-C, gezeigt in Fig. 2. Die Gruppe G
(oder G-Familie) ist die, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Guanin ist.
Insbesondere ist die DNA-Fragmentgruppe G eine Gruppe, in der die Endgruppen,
der mit den Vektoren hybridisierten DNA-Proben, Guanin sind. Sie beinhaltet 5-
9-G, 6-10-G, 7-11-G und 8-12-G, gezeigt in Fig. 2. Die Gruppe T (oder T-
Familie) ist die, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Thymin ist. Ins
besondere ist die DNA-Fragmentgruppe T eine Gruppe, in der die Endgruppen
der mit den Vektoren hybridisierten DNA-Proben, Thymin ist. Sie beinhaltet 5-
9-T, 6-10-T, 7-11-T und 8-12-T, gezeigt in Fig. 2.
In Fig. 3, in der die Elektrophoresevorrichtung vom Mehrfarben-Fluoreszenznach
weistyp veranschaulicht ist, enthält eine Elektrophoresetrenngelplatte 110 Poly
acrylamid einer Konzentration von 6%, gebildet in einem 0,3 mm Raum zwischen
Quarzplatten von 200 mm × 300 mm (nicht gezeigt). Es sollte angemerkt werden,
daß die Konzentration des Polyacrylamids hierin angezeigt wird als dessen totale
Monomerkonzentration in %-Gewicht pro Volumen (g/ml). Die Elektrophorese
trennplatte 110 hat Probeninjektionstaschen 112, 113, 114 und 115. Die
Probeninjektionstaschen tragen die DNA-Fragmentgruppen A, C, G und T jeweils
dort hineingetropft durch eine Injektionsschablone bzw. Spritze, um diese wandern
zu lassen. Die Elektrophoresetrenngelplatte 110 hat einen durch eine Seitenfläche
derselben auf einen Abschnitt etwa 25 cm unterhalb des Bodens der Taschen
gerichteten Laserstrahl 123, zu dem die DNA-Fragmentgruppen wandern, und zwar
unter Verwendung einer Laserstrahlquelle 116. Dies bewirkt, daß die DNA-
Fragmentgruppen Fluoreszenzlicht emittieren. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird
durch ein Prisma (nicht gezeigt) geteilt und Spektren verschiedener Wellenlängen,
die unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen der Proben 5 bis 8 entsprechen,
werden durch optische Bandpaßfilter erhalten. Diese Fluoreszenzspektren werden
auf einen Fokussierungsteil eines zweidimensionalen Fluoreszenzlichtdetektors 117
fokussiert, um Fluoreszenzlichtabbildungen entsprechend den Proben 5 bis 8 zur
Verfügung zu stellen.
Die Fluoreszenzlichtabbildungen, die auf den Fokussierungsteil des zweidimensiona
len Fluoreszenzlichtdetektors 117 fokussiert sind, können durch einen Bildschirm
121 als vier Linienbilder 122 entsprechend den jeweiligen Proben 5 bis 8
wiedergegeben werden. Zur gleichen Zeit können die Fluoreszenzlichtbilder durch
eine Anzeige 120, durch eine Steuerung 118 und eine Datenverarbeitungseinheit
119 wiedergegeben werden.
Fig. 4 zeigt eine vergrößerte Abbildung der Linienbilder 122, die auf dem
Bildschirm 121 abgebildet werden. Die vier Linienbilder entsprechen den jeweiligen
Proben 5 bis 8 abwärts. Die Flächen A, C, G und T, angezeigt durch Punktlinien
sind Flächen, die den jeweiligen DNA-Fragmentgruppen A, C, G und T jeder der
Probe entsprechen. Die auf diese Weise erhaltenen Daten können arithmetisch
verarbeitet werden, um die DNA-Basensequenzen simultan zu bestimmen.
In dieser Ausbildungsform werden als Laserstrahlenquellen ein Argonlaser mit 488
nm Wellenlänge und ein He-Ne-Laser mit 543 nm Wellenlänge verwendet. Der
Argonlaser und der He-Ne-Laser können in einer Einheit integriert werde, um
den gleichen Abschnitt oder unterschiedliche Abschnitte zu bestrahlen, die 2 mm
oder mehr beabstandet sind. Für die Anregung von FITC und NBD-F der
markierenden Fluorophore wird der Argonlaser verwendet; für die Anregung von
TRITC und Texas-Rot wird der He-Ne-Laser verwendet. Für große Proben
anzahlen können zusätzliche Fluorophore mit längeren Wellenlängen verwendet
werden. Für die zusätzlichen Fluorophore kann ein weiterer He-Ne-Laser mit 633
nm Wellenlänge oder ein Halbleiterlaser verwendet werden.
Die oben beschriebene Ausführungsform läßt deutlich erkennen, daß das
erfindungsgemäße Verfahren insofern vorteilhaft ist, daß so viele Proben
bearbeitet werden können, wie Mischungsformen selbst, wobei gleichzeitig der
betriebsmäßige Aufwand reduziert werden kann. In dem Verfahren, in dem die
DNA-Fragmentgruppen A, C, G und T mit verschiedenen Farben markiert sind
und auf der gleichen Bahn wandern, müssen die Wanderungszeitdifferenzen, bedingt
durch die Farbdifferenzen korrigiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist
auch in dieser Hinsich vorteilhaft, weil es keine Korrektur der Wanderungs
geschwindigkeitsdifferenzen benötigt, die durch den Unterschied der Markierungs
farbstoffe bedingt sind, da die gleiche Probe mit der gleichen Farbe markiert
werden kann.
Claims (6)
1. Verfahren zur DNA-Basensequenzbestimmung, umfassend die Schritte:
- i) Klonieren einer Vielzahl von DNA-Proben mit jeweils unterschiedlichen Vektoren (1, 2, 3, 4);
- ii) Komplementär-Ketten-Synthetisieren der Proben (5, 6, 7, 8) erhalten in Schritt i) im Gemisch mit Primern (9, 10, 11, 12), entsprechend den jeweiligen Vektoren (1, 2, 3, 4), wobei die Anzahl der Primer (9, 10, 11, 12) der Anzahl der Sorten von Vektoren (1, 2, 3, 4) entspricht, jeder dieser Primer (9, 10, 11, 12) in der Lage ist, ausschließlich mit einem spezifischen dieser Vektoren (1, 2, 3, 4) zu hybridisieren, und die Primer (9, 10, 11, 12) mit Fluorophoren markiert sind, die jeweils unter schiedliche Wellenlängen haben;
- iii) Herstellen von vier DNA-Fragmentgruppen mit jeweils vier unter schiedlichen Endgruppen aus dem behandelten Gemisch (5-9, 6-10, 7-11, 8-12) erhalten in Schritt ii); und
- iv) elektrophoretisches Wandernlassen der vier DNA-Fragmentgruppen und Nachweis des Fluoreszenzlichts, emittiert von den jeweiligen DNA- Fragmenten in jeder DNA-Fragmentgruppe.
2. Verfahren zur DNA-Basensequenzbestimmung, umfassend die Schritte:
- i) Klonieren einer Vielzahl von unterschiedlichen Einzelstrang-DNA-Proben, deren Basensequenz bestimmt werden soll, mit jeweiligen Vektoren (1, 2, 3, 4), unterschiedlich für jede Probe;
- ii) Markieren der Primer, deren Anzahl der Anzahl der Sorten von Vektoren (1, 2, 3, 4) entspricht, deren Basensequenzen unterschiedlich voneinander sind und die nur mit einem spezifischen Vektor hybridisiert werden können, und zwar mit jeweiligen Fluorophoren mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen;
- iii) Hybridisieren der Primer (9, 10, 11, 12), markiert mit den jeweiligen Fluorophoren mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen, mit einer Vielzahl von entsprechenden Vektoren (1, 2, 3, 4) für die jeweiligen Einzelstrang-DNA-Proben (5, 6, 7, 8), kloniert mit den Vektoren (1, 2, 3, 4) derart, daß all die DNA-Proben (5, 6, 7, 8), kloniert mit den Vektoren (1, 2, 3, 4), gemischt und verarbeitet werden mit all den Primern (9, 10, 11, 12);
- iv) Teilen jeder der Mischungen (5-9, 6-10, 7-11, 8-12) der Proben, verarbeitet in Schritt 3, in vier Teile;
- v) Komplementär-Ketten-Synthetisieren der viergeteilten Gemische (5-9, 6- 10, 7-11, 8-12) der Proben individuell, so daß Endgruppen davon Adenin, Cytosin, Guanin bzw. Thymin werden können, wobei individuell eine DNA-Fragmentgruppe hergestellt wird, in der die Endgruppe des DNA- Fragments Adenin ist, eine DNA-Fragmentgruppe, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Cytosin ist, eine DNA-Fragmentgruppe, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Guanin ist, und eine DNA-Fragment gruppe, in der die Endgruppe des DNA-Fragments Thymin ist; und
- vi) elektrophoretisches Wandernlassen der DNA-Fragmentgruppen,Nachweisen des individuellen Fluoreszenzlichts, emittiert von den DNA-Fragment gruppen, und Trennen und Nachweisen der Proben nach ihren unter schiedlichen Emissionswellenlängen, und zwar von einer Vielzahl von DNA-Proben.
3. Verfahren zur DNA-Basensequenzbestimmung nach Anspruch 2, in dem die
Trennung und der Nachweise der DNA-Fragmentgruppen derart durchgeführt
wird, daß die Proben getrennt und nachgewiesen werden unter Verwendung
der emittierten Wellenlängenunterschiede in jeder DNA-Fragmentgruppe, die
elektrophoretisch auf den entsprechenden Wanderungsbahnen bewegt wird
und zur gleichen Zeit wird die Sorte der Endgruppen spezifiziert durch die
Lage der Wanderungsbahnen, an der das Fluoreszenzlicht emittiert wird, so
daß eine Vielzahl von unterschiedlichen Basensequenzen einer Einzelstrang-
DNA-Probe simultan bestimmt wird.
4. Verfahren zur DNA-Basensequenzbestimmung nach Anspruch 3, in dem die
Proben separiert und nachgewiesen werden durch Verwendung von Fluo
reszenzlichtwellenlängenunterschieden der jeweiligen DNA-Fragmentgruppen,
daß emittiert wird durch das Anlegen eines Laserstrahls (123) auf Abschnitte
mit bestimmten Abständen, zu denen die DNA-Fragmentgruppen auf den
Wanderungsbahnen wandern.
5. Verfahren zur DNA-Basensequenzbestimmung nach Anspruch 4, in dem die
Trennung und der Nachweis der Proben unter Verwendung der Fluoreszenz
lichtemissionswellenlängenunterschiede der DNA-Fragmentgruppen in der Art
durchgeführt wird, daß das Fluoreszenzlicht der DNA-Fragmentgruppen mit
einer Wellenlängentrennvorrichtung aufgetrennt wird und jede der getrennten
Wellenlängen individuell durch einen Detektor (117) nachgewiesen wird.
6. Verfahren zur DNA-Basensequenzbestimmung nach Anspruch 5, in dem der
Detektor (117) ein zweidimensionaler Fluoreszenzlichtdetektor ist.
Applications Claiming Priority (1)
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