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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung der Hochgradienten-Magnetseparation
("high gradient
magnetic separation",
(HGMS)) zur Trennung von biologischen Materialien einschließlich Zellen,
Organellen und anderen biologischen Materialien. Insbesondere betrifft
diese Erfindung Mikrosäulen
und Mikrosäulensysteme
für die
Trennung von Makromolekülen
und Zellen in einem Magnetfeld mit hohem Gradienten.
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STAND DER
TECHNIK
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Die
Hochgradienten-Magnetseparation (HGMS) bezieht sich auf ein Verfahren
zum selektiven Zurückhalten
magnetischer Materialien in einer Kammer oder Säule, die sich in einem Magnetfeld
befindet. Diese Technik kann auch auf nichtmagnetische Ziele angewendet
werden, sofern diese mit magnetischen Partikeln markiert sind. Die
Technik wird in den US-Patentschriften Nr. 5,411,863 und 5,385,707
ausführlich
diskutiert.
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Das
betreffende Material, welches selbst magnetisch ist oder an einen
magnetischen Partikel gekoppelt ist, wird in einem Fluid in Suspension
gebracht und der Kammer zugeführt.
Bei Vorhandensein eines Magnetfeldes, welches sich über die
Kammer erstreckt, wird das betreffende Material, da es magnetisch
ist, in der Kammer zurückgehalten.
Materialien, die nicht magnetisch sind und über keine magnetische Markierung
verfügen,
durchqueren die Kammer. Die zurückgehaltenen
Materialien können
anschließend
eluiert werden, indem die Stärke
des Magnetfeldes verändert
wird oder indem dieses aufgehoben wird.
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Die
US-Patentschrift Nr. 4,508,625, die an Graham erteilt wurde (Graham '625), offenbart ein
Verfahren zum Inkontaktbringen chelatkomplexierter paramagnetischer
Ionen mit Partikeln, die eine negative Oberflächenladung aufweisen und sich
in einer Trägerflüssigkeit
befinden, um die Magnetempfindlichkeit der Partikel zu erhöhen. Anschließend werden
die Trägerflüssigkeit
und die Partikel einem Magnetfeld ausgesetzt, um mindestens einen
Teil der Partikel von der Trägerflüssigkeit
abzutrennen.
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Die
US-Patentschrift Nr. 4,666,595, die Graham erteilt wurde (Graham '595) offenbart eine
Vorrichtung zum Entfernen intakter biologischer Zellen aus einem
Fluidmedium mittels HGMS. Das Fluid, welches die Zellen enthält, wird
durch eine Fließkammer
geleitet, die eine Trennmatrix mit Zwischenräumen enthält, wobei das Fluid durch letztere
hindurchströmt.
Die Matrix wird einem starken Magnetfeld ausgesetzt, während sie
von dem Fluid durchströmt
wird. Dadurch werden zumindest einige der Zellen magnetisch von
der Matrix zurückgehalten,
während
der Rest des Fluid durch sie hindurchströmt.
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In
Graham '595 ist
weiterhin ein piezoelektrischer Schallwandler offenbart, der über das
Trägerfluid
mit der Matrix strömungsverbunden
ist. Wenn die Aufnahmekapazität
der Matrix für
Zellen erschöpft
ist, wird das Trägerfluid
durch ein Spülfluid
ersetzt. Anschließend
wird der piezoelektrische Schallwandler angeregt, um hochfrequente
Schallwellen durch das Fluid in der Kammer zu senden. Die Schallwellen
entfernen die Zellen (Partikel) aus der Matrix, und es erfolgt eine
Auswaschung durch das Spülfluid.
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Die
US-Patentschrift 4,664,796, die Graham et al. erteilt wurde (Graham
et al. '796), offenbart
ein HGMS-System zur Trennung intakter biologischer Zellen von einem
Fluidmedium. Das System umfasst eine Fließkammer, die eine Trennmatrix
mit Zwischenräumen
enthält,
wobei das Fluid durch letztere hindurchströmt, sowie eine damit in Verbindung
stehende Magnetisiervorrichtung zur Kupplung des magnetischen Flusses
mit der Matrix. Die Magnetisiervorrichtung umfasst einen Permanentmagneten
mit sich gegenüberliegenden
Nord- beziehungsweise Südpolen
sowie Polschuhen zur Ausrichtung des Feldes. Die Flusskupplungsvorrichtung
ist derart angeordnet, dass sie ein starkes Magnetfeld durch die
Matrix sendet, während
diese von dem Trägerfluid
durchströmt
wird, wodurch die Zellen oder Partikel von der Matrix eingefangen
werden können.
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Die
Flusskupplungsvorrichtung ist derart angeordnet, dass der magnetische
Fluss während
der Spülphase,
in welcher das Trägerfluid
durch das Spülfluid
ersetzt wird, von der Matrix fortgelenkt wird, sodass die Schleppkräfte des
Spülfluids
stärker
als die geschwächten
magnetischen Anziehungskräfte
zwischen der Matrix und den Zellen oder Partikeln sind, wodurch
es dem Spülfluid
ermöglicht
wird, die Zellen oder Partikel fortzuschleppen. Darüber hinaus
kann ein piezoelektrischer Schallwandler vorgesehen sein, der dazu
bestimmt ist, in Verbindung mit dem Umlenken des magnetischen Flusses
durch die Flusskupplungsvorrichtung in der Spülphase, für ein langsameres Fließen des
Spülfluids
zu sorgen.
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Die
Matrix ist derart in der Fließkammer
angeordnet, dass sie dem vollen magnetischen Fluss des Magneten
ausgesetzt ist, wenn sich die Fließkammer in einer ersten Position
befindet, und zwar während
der Abtrennung der Zellen von dem Trägerfluid. Wenn die Fließkammer
eine Drehbewegung von näherungsweise 90° aus der
ersten Position heraus vollführt,
und zwar während
der Spülphase,
ist die Matrix derart angeordnet, dass der magnetische Fluss im
Wesentlichen ab der Matrix vorbeigeleitet wird.
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Graham
et al. '795 offenbaren
weiterhin die Möglichkeit,
einen piezoelektrischen Schallwandler, der mit der Matrix strömungsverbunden
ist, einzusetzen, um im Zusammenwirken mit der Positionsänderung
der Flusskupplungsvorrichtung, welche dazu dient, das Magnetfeld
an der Matrix vorbeizuleiten, dafür zu sorgen, dass die Flussrate
des Spülfluids
verringert wird.
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Nach
dem Stand der Technik gibt es verschiedenartige HGMS-Verfahren sowie
Verfahren zum Wiedergewinnen der Zellen/Partikel, nachdem diese
mittels HGMS abgetrennt worden sind. Für sehr kleine Proben wie etwa
solche, die im Rahmen von molekularbiologischen Anwendungen vorkommen,
ist der Stand der Technik indes weit von den idealen Bedingungen
zur Durchführung
von HGMS entfernt. Um sehr kleine Proben, wie sie beispielsweise
bei der Abtrennung von Boten-RNA von der Gesamt-RNA oder von Zell-Lysaten auftreten,
zweckmäßig zu eluieren,
bedarf es sehr kleiner Elutionsvolumina. Größere Elutionsvolumina benötigen bei
den nachfolgenden Anwendungen größere Volumina
an Enzymen, wodurch diese Anwendungen unannehmbar kostspielig würden und
dem Vorgang insgesamt seine Effizienz und seinen Nutzwert nehmen
würden.
Hinzu kommt, dass kleine Totvolumina immer dann von Bedeutung sind,
wenn in der Säule
selbst chemische Reaktionen ablaufen sollen. Die vorliegende Erfindung
zielt darauf ab, den Einsatz der HGMS-Technik zur Trennung sehr
kleiner Proben, insbesondere im klinischen und gewerblichen Bereich,
effizienter und wirkungsvoller zu machen.
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In
WO-A-92/16301 ist eine magnetische Trennvorrichtung mit hohem Gradienten
zur Abtrennung magnetisierbarer Partikel aus einem Fluid offenbart.
Die Trennvorrichtung umfasst eine Trennkammer mit einer Einlassöffnung und
einer Auslassöffnung
sowie ein Mittel zur Erzeugung eines axialen Magnetfeldes innerhalb der
Kammer. In einer Anordnung (3) befinden
sich drei Matrixelemente, welche jeweils magnetisierbares Material
umfassen, übereinander
in der Kammer. Die Querschnittsflächen der drei Matrixelemente
unterscheiden sich jeweils voneinander, wobei die Querschnittsfläche des
obersten Matrixelements am kleinsten ist, die Querschnittsfläche des
untersten Matrixelements am größten ist
und die Querschnittsfläche
des mittleren Matrixelements zwischen den Querschnittsflächen der
darüber
und darunter befindlichen Matrixelemente liegt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine HGMS-Mikrotrennsäule bereitgestellt, die folgendes
umfasst:
erste und zweite rohrförmige Abschnitte, wobei der
erste Abschnitt integral mit dem zweiten Abschnitt ist und über dem
zweiten Abschnitt angeordnet ist, wobei der erste Abschnitt eine
erste Querschnittfläche
und der zweite Abschnitt eine zweite Querschnittfläche aufweist,
wobei die erste Querschnittfläche
größer als
die zweite Querschnittfläche
ist; und
eine Matrix, die dafür ausgelegt ist, wahlweise
mindestens eine Komponente eines Gemisches zu entfernen, wenn das
Gemisch durch die rohrförmigen
Abschnitte strömt,
wobei die Matrix in mindestens einem Teil des ersten Abschnitts
und in mindestens einem Teil des zweiten Abschnitts enthalten ist
und wobei die Matrix ferromagnetisches Material umfasst.
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Die
nachstehend beschriebenen und erläuterten Ausführungsformen
der HGMS-Mikrotrennsäule gemäß der vorliegenden
Erfindung schaffen Verbesserungen bei der Hochgradienten-Magnetseparation
von Materialien, die in sehr kleinen Volumina enthalten sind. Sie
kombinieren die Vorteile einer Bindungsreaktion in Suspension (z.B.
schnelle Kinetik, hohe Effizienz) mit denen eines Trennvorganges
auf einer Säule
(z.B. Reinheit, Einfachheit), wobei gleichzeitig die erforderlichen
Elutionsvolumina gering bleiben. Weiterhin sorgt ein kleines Totvolumina
dafür,
dass chemische Reaktionen innerhalb der Säule durchgeführt werden
können.
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Die
Trennungstechniken können
in einem kontinuierlichen Verfahren oder in einem schrittweisen
Verfahren eingesetzt werden, wobei die verschiedenen Schritte des
Trennvorganges durch einfaches Zugeben verschiedener Puffer, Chemikalien,
usw. welche möglicherweise
auch unterschiedlich Temperaturen aufweisen, wie dies z.B. bei heißem Wasser
der Fall ist, in einer Säule
erfolgen. Der Vorgang insgesamt ist somit sehr schnell.
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Das
ferromagnetische Material kann ferromagnetische Kugeln oder andere
ferromagnetische Partikel umfassen. Das ferromagnetische Material
kann mit einer Schicht überzogen
sein, welche die relative Anordnung der Partikel zueinander aufrechterhält. Vorzugweise
umfasst die Schicht Lack und insbesondere einen Lack gemäß der Beschreibung
in mindestens einer der US-Patentschriften 5,691,208; 5,693,539;
5,705,059; und 5,711,871. Die ferromagnetischen Kugeln oder Partikel
weisen vorzugsweise einen Durchmesser von mindestens 100 μm, mit besonderem
Vorzug von mehr als ungefähr
200 μm und
weniger als ungefähr
2.000 μm, mit
noch größerem Vorzug
von mehr als ungefähr
200 μm und
weniger als ungefähr
1.000 μm
und mit dem größten Vorzug
von ungefähr
280 μm auf.
Die Matrix (d.h., die ferromagnetischen Partikel und die Schicht) nehmen
vorzugsweise mindestens ungefähr
50 Prozent des Innenvolumens des ersten und des zweiten Abschnitts
ein. Das Totvolumen der Säule,
wobei es sich um das Volumen in den Zwischenräumen handelt, welches nicht
von der Matrix eingenommen wird (d.h., das matrixfreie Volumen),
sowie das Volumen desjenigen Abschnitts der Säule, der sich unterhalb der
Matrix befindet, beträgt
vorzugsweise weniger als ungefähr
85 μl, mit
besonderem Vorzug weniger als ungefähr 70 μl, mit noch größerem Vorzug
weniger als ungefähr
50 μl und mit
dem größten Vorzug
ungefähr
30 μl. Die
sich selbst einstellende, schwerkraftbedingte Fließgeschwindigkeit ist
im Allgemeinen größer als
ungefähr
100 μl/min.,
mit besonderem Vorzug größer als
ungefähr
200 μl/min. und
mit dem größten Vorzug
größer als
ungefähr
300 μl/min.
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Die
Röhre kann
weiterhin einen dritten Abschnitt umfassen, der mit dem zweiten
Abschnitt integral ist. Der dritte Abschnitt weist eine dritte Querschnittsfläche auf,
die kleiner als die Querschnittsfläche des zweiten Abschnitts
ist. Weiterhin kann die Röhre
einen vierten Abschnitt umfassen, der mit dem dritten Abschnitt
integral ist. Der vierte Abschnitt weist ein Außenmaß (d.h. einen Außerdurchmesser,
wobei es sich indes um ein Außenmaß einer
Struktur handelt kann, die im Querschnitt eine andere als die Kreisform
aufweist) auf, welches kleiner als das entsprechende Außenmaß des dritten
Abschnitts ist. Es kann ein oberer Abschnitt vorgesehen sein, welcher
integral mit dem ersten Abschnitt ist. Der obere Abschnitt weist
eine Querschnittsfläche
auf, die größer als
die Querschnittsfläche
des ersten Abschnitts ist.
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Wahlweise
kann die Mikrotrennsäule
eine Halterung umfassen, die im zweiten Abschnitt neben der Matrix
angeordnet ist. Vorzugsweise ist die Halterung im Wesentlichen kugelförmig und
erheblich größer als die
Partikel, aus denen die Matrix besteht. Alternativ dazu kann es
sich bei der Halterung um ein poröses Geflecht oder Gitter oder
um eine poröse
Fritte handeln.
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Die
Röhre kann
aus einem Material wie etwa PCTG oder aus Polyethylenen, Polyamiden,
Polypropylenen, Acrylstoffen, PET, anderen Kunststoffen, die gegenwärtig für Einweg-Laborartikel
verwendet werden, sowie aus Glas gebildet sein, wobei sie vorzugsweise
aus einem Kunststoff gebildet ist, der mit Lack eine Bindung eingeht,
und mit besonderem Vorzug aus PCTG.
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Wenn
eine kugelförmige
Halterung zum Einsatz kommt, erstreckt sich mindestens eine Befestigung
in dem zweiten Abschnitt der Röhre
und dient als Unterlage für
die Halterung. Vorzugsweise sind drei Befestigungen als Unterlage
für die
bevorzugte kugelförmige
Halterung vorgesehen.
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Wahlweise
kann eine obere Matrixhalterung im ersten Abschnitt der Röhre angeordnet
sein, und zwar neben der Matrix. Vorzugsweise umfasst die obere
Matrixhalterung ein poröses
Gitter oder Geflecht oder eine poröse Fritte. Zusätzlich zu
den ferromagnetischen Materialien kann die Matrix wahlweise eine
oder mehrere nichtmagnetische Komponenten wie etwa Glaspartikel
einschließlich
Kugeln oder Kunststoffpartikel oder -kugeln umfassen.
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Vorzugsweise
ist die Mikrotrennsäule
der vorliegenden Erfindung für
einen schwerkraftgespeisten Betrieb ausgelegt, alternativ dazu kann
sie aber auch für
einen druckgespeisten Betrieb ausgelegt sein.
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Es
ist eine Mikrotrennsäule
offenbart, welche einen ersten und einen zweiten rohrförmigen Abschnitt umfasst,
wobei der erste Abschnitt mit dem zweiten Abschnitt integral ist,
sowie eine Matrix, die dafür
ausgelegt ist, mindestens einen Bestandteil selektiv aus einer Mischung
zu entfernen, während
die Mischung durch die rohrförmigen
Abschnitte fließt.
Die Matrix ist in mindestens einem Teil des ersten Abschnitts und
mindestens einem Teil des zweiten Abschnitts enthalten. Derjenige
Teil der Matrix, der in dem ersten Abschnitt enthalten ist, trägt in stärkerem Ausmaß zum Entfernen
bei als die Menge an Matrix, die im zweiten Abschnitt enthalten
ist. Die Menge an Matrix, die im zweiten Abschnitt enthalten ist,
trägt in
stärkerem
Ausmaß zum
Fließwiderstand
bei als die Menge an Matrix, die im ersten Abschnitt enthalten ist.
Vorzugsweise weist die Matrix eine Gesamthöhe von weniger als ungefähr 20 mm,
mit besonderem Vorzug von weniger als ungefähr 15 mm und mit dem größten Vorzug
von weniger als ungefähr
12 mm auf. Vorzugsweise weist die Matrix im ersten Abschnitt eine
Höhe von
weniger als ungefähr
10 mm und mit besonderem Vorzug von weniger als ungefähr 6 mm
auf.
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Weiterhin
ist eine Mikrotrenneinrichtung zur Verwendung bei der Durchführung von
Mikrotrennvorgängen
offenbart. Die Mikrotrenneinrichtung umfasst ein magnetisches Joch
mit mindestens einer Kerbe, die entlang einer Länge desselben ausgebildet ist.
In jeder der Kerben ist ein Paar von Magneten angeordnet. Jedes Magnetpaar
grenzt einen dazwischen befindlichen Spalt ab, welcher dafür ausgelegt
ist, eine Mikrotrennsäule zur
Durchführung
von Mikrotrennvorgängen
aufzunehmen. Vorzugsweise besteht das Joch aus Stahl. Vorzugsweise
umfasst das Joch mindestens zwei Kerben und mit besonderem Vorzug
vier.
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Jedes
Magnetpaar bildet in ein Magnetfeld in dem jeweiligen Spalt, welches
stärker
als ungefähr
0,2 Tesla, vorzugsweise stärker
als ungefähr
0,4 Tesla, mit besonderem Vorzug stärker als ungefähr 0,5 Tesla
und mit dem größten Vorzug
stärker
als ungefähr
0,6 Tesla ist.
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Die
Mikrotrenneinrichtung umfasst weiterhin eine unzerbrechliche Abdeckung,
die das Joch und die Magnete umschließt. Vorzugsweise besteht die
Abdeckung aus Polyurethangummi. Darüber hinaus kann mindestens
ein Haftmagnet in der Abdeckung vorgesehen sein, der dem magnetischen
Befestigen der Mikrotrenneinrichtung an einer magnetischen Oberfläche dient.
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Weiterhin
ist ein Mikrosäulensystem
offenbart, das eine Mikrotrenneinrichtung umfasst, welches ihrerseits
ein magnetisches Joch mit mindestens einer Kerbe, die entlang einer
Länge desselben
ausgebildet ist, umfasst, wobei in jeder der Kerben, von denen mindestens
eine vorhanden ist, ein Magnetpaar derart angeordnet ist, dass dazwischen
ein Spalt entsteht; sowie mindestens eine Mikrotrennsäule, die
jeweils folgendes umfasst: erste und zweite rohrförmigen Abschnitte,
wobei der erste Abschnitt mit dem zweiten Abschnitt integral ist,
sowie eine Matrix, die dafür
ausgelegt ist, mindestens einen Bestandteil selektiv aus einer Mischung zu
entfernen, während
die Mischung durch die rohrförmigen
Abschnitte fließt.
Die Matrix ist in mindestens einem Teil des ersten Abschnitts und
mindestens einem Teil des zweiten Abschnitts enthalten. Derjenige
Teil der Matrix, der in dem ersten Abschnitt enthalten ist, trägt in stärkerem Ausmaß zum Entfernen
bei als die Menge an Matrix, die im zweiten Abschnitt enthalten
ist. Die Anzahl der Mikrotrennsäulen
ist gleich der Anzahl der Spalte in dem Joch.
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Ein
Aspekt der HGMS-Mikrotrennsäule
betrifft ein Trennungs- und Freisetzungsverfahren zum Reinigen von
biologischem Material auf der Mikrosäule. Nach dem Zurückhalten
des betreffenden biologischen Materials, welches an magnetische
Partikel in der Matrix gekoppelt ist, kann das gebundene Material wahlweise von
den magnetischen Partikeln getrennt und aus der Säule eluiert
werden, während
die magnetischen Partikel weiterhin von der Matrix magnetisch zurückgehalten
werden. Die Trennung kann durch eine geeignete Änderung von Puffern oder der
Temperatur sowie durch chemische oder enzymatische Reaktionen erfolgen,
welche die Bindung zwischen den magnetischen Partikeln und dem betreffenden
biologischen Material lösen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Schnittansicht einer Säule
des Standes der Technik;
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2 ist
eine Schnittansicht einer bevorzugten Ausführungsform einer Mikrosäule gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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3 ist
eine Schnittansicht einer Mikrosäule
gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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4 ist
eine Schnittansicht einer Säule,
wobei der Schnitt senkrecht zu dem Schnitt, der in 3 dargestellt
ist, erfolgt ist, und zwar auf der Höhe, die durch die Linien IV-VI
angezeigt wird;
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5 ist
eine Schnittansicht einer Variante der Mikrosäule gemäß der vorliegenden Erfindung;
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6 ist
eine Schnittansicht, die eine weitere Variante der Mikrosäule gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt;
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7 ist
eine perspektivische Ansicht des Mikrosäulen-Trennsystems gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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8A ist
eine Aufsicht einer Trenneinheit gemäß der vorliegenden Erfindung;
-
8B ist
eine Frontansicht der Trenneinheit, die in 8A dargestellt
ist;
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8C ist
eine Aufsicht einer Trenneinheit, wobei die im Inneren befindlichen
Komponenten durch gestrichelte Linien dargestellt sind;
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9 zeigt
die Zusammensetzung der Tropfen 1 bis 5 (prozentualer Anteil der
eluierten mRNA-Probe), die von Olig(dT)-MicroBeads in einem Mikrosäulensystem
stammen, wobei die Darstellung ein Agarosegel zeigt.
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BESTE AUSFÜHRUNGSFORM
DER ERFINDUNG
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Die
HGMS-Auftrennung sehr kleiner Proben, wie sie etwa bei vielen molekularbiologischen
Anwendungen vorkommen, z.B. im Falle von mRNA, erfordert den Einsatz
sehr kleiner Elutionsvolumina, um die Proben effizient und wirkungsvoll
zu eluieren, sowie den Ablauf der Reaktion in einem kleinen Volumen,
wobei auch das Totvolumen gering sein muss. Zur Erläuterung
dieses Bedarfs sei gesagt, dass eine Säule des Standes der Technik,
wie sie in 1 dargestellt ist, eine Matrix 1010 aus
Metallkugeln umfasst, die ungefähr
280 μm groß sind und
eine Porosität
von ungefähr
28 μm verleihen.
Die Höhe
der Säule
mit der Matrix 1010 beträgt ungefähr 20 mm, das Totvolumen der
Matrix 1010 ungefähr
70 μl und
das Totvolumen der Säule
ungefähr
85 μl. Die
Flussrate durch die Kugelmatrix beträgt ungefähr 400 μl/min.
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Eine
einfache Verringerung der Säulenhöhe der Matrix 1010 würde zwar
der Verringerung des Volumens derselben dienen, wäre aber
bei der Verarbeitung der erwähnten
kleinen Proben nicht wirkungsvoll, da dies zu einer zu hohen Flussrate
beim Durchströmen
der Matrix führen
würde.
Eine Verringerung der Querschnittsfläche der Matrix erhöht die Wahrscheinlichkeit
des Verstopfens und verringert darüber hinaus die Trennungsgeschwindigkeit.
Eine Verringerung der Höhe
der Fluidsäule
verringert oder verhindert möglicherweise
sogar die Tropfenbildung am Ende der Säule, da das erzeugte Druckgefälle ausreichend
groß sein muss,
um die Oberflächenspannung
am Ende der Säule,
wo die Tropfen gebildet werden, zu überwinden.
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Die
vorliegende Erfindung trägt
sämtlichen
der oben erwähnten
möglichen
Probleme Rechnung. In 2 ist eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung 100 dargestellt. Die Mikrosäule 100 weist
im Vergleich mit Säulen,
die nach dem Stand der Technik eingesetzt werden, ein erheblich
verringertes Totvolumen auf, wobei jedoch optimale Fließgeschwindigkeiten
beibehalten werden, und sie ist dafür ausgelegt, Makromoleküle (oder
Zellen), die über
spezifische biologische/chemische Wechselwirkungen magnetisch gebunden
sind, von anderen Makromolekülen/Zellen
zu trennen, und zwar in einem Magnetfeld mit hohem Gradienten, sowie
für die
Elution dieser Moleküle/Zellen
in einem kleinen Volumen. Der Mikrosäule wird eine hydrophile Beschaffenheit
verliehen, indem sie aus einem hydrophilen Material wie etwa einem
hydrophilen Kunststoff hergestellt wird oder, insbesondere, indem
die Säule
innen mit einem hydrophilen Material z.B. mit Polyvinylpyrrolidon überzogen
wird. Alternativ oder zusätzlich
dazu können
die Puffer, die auf die Säule
gegeben werden, einen oder mehrere Tenside enthalten, z.B. SDS.
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Die
Matrix 110 umfasst einen ersten Abschnitt 110a mit
einer Querschnittsfläche,
die im Verhältnis
zu derjenigen des zweiten Abschnitts 110b größer ist.
Die Säule 100 umfasst
einen verhältnismäßig großvolumigen
Vorratsbehälter 112,
in welchen eine zu trennende Probe gegeben wird. Der Vorratsbehälter 112 verjüngt sich
trichterförmig 114 bis
zu einem ersten rohrförmigen
Säulenabschnitt 116 mit
kleinerer Querschnittsfläche, in
welchem sich ein erster Teil 110a der Matrix befindet.
Der erste Abschnitt verjüngt
sich zu einem zweiten rohrförmigen
Säulenabschnitt 118 mit
einer noch kleineren Querschnittsfläche, in welchem sich ein zweiter
Teil 110b der Matrix befindet. Obgleich sämtliche
der Säulen,
die in den Figuren dargestellt sind, die bevorzugte zylindrische
Konfiguration aufweisen, ist dies nicht als Einschränkung der
vorliegenden Erfindung aufzufassen. Die Säulen können beispielsweise derart
bildet sein, dass sie einen elliptischen Querschnitt, einen quadratischen
Querschnitt, andere geometrische Querschnitte oder sogar nicht-geometrische
Querschnitte aufweisen. Darüber
hinaus müssen
die Formen der Abschnitte nicht gleichartig sein. Zum Beispiel kann
ein erster Abschnitt einen sechseckigen Querschnitt haben, während der
zweite Abschnitt zylindrisch ist.
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Die
Matrix 110 enthält
ferromagnetisches Material, vorzugsweise Kugeln 120, wobei
es sich aber auch um andere Partikel, die nicht kugelförmig sind,
oder um ein integriertes dreidimensionales Geflecht mit der gewünschten
Porosität
handeln kann. Das ferromagnetische Material 120 kann mit
einer Schicht überzogen
sein, welche die relative Anordnung der Partikel zueinander aufrechterhält. Vorzugsweise
handelt es sich um eine Lackschicht. Die Kugeln/Partikel sind größer als
ungefähr
100 μm,
vorzugsweise größer als
ungefähr
200 μm und
kleiner als ungefähr
2.000 μm,
mit besonderem Vorzug größer als
ungefähr
200 μm und
kleiner als ungefähr
1.000 μm,
und mit dem größten Vorzug
beträgt
ihre Größe 280 μm. Ausführliche,
beispielhafte Beschreibungen von Trennmatrices, die für die HGMS
von Nutzen sind, finden sich in den ebenfalls anhängigen Anmeldungen
Nr. 08/377,744, eingereicht am 23. Januar 1995, sowie in der US-Patentschrift
Nr. 5,411,863. Die Matrix nimmt vorzugsweise mindestens 50 Prozent
des Innenvolumens des ersten Abschnitts und des zweiten Abschnitts
ein.
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Die
Säule 100 besteht
vorzugsweise aus Kunststoffen wie etwa aus Polypropylenen, Polyethylenen, Acrylstoffen,
PET usw., wobei sie, wenn die Matrix mit Lack überzogen ist, vorzugsweise
aus einem Kunststoff, der mit dem Lack eine Bindung eingehen wird,
besteht, insbesondere aus einem Harz wie etwa PCTG (Polycyclohexadimethylterephthalat,
das mit Ethylenglykol modifiziert ist). Dies vereinfacht die Herstellung
der Säule
erheblich, da es auf diese Weise nicht mehr erforderlich ist, überschüssigen Lack
zu entfernen, nachdem der Lack in die Säule gegeben wurde, um die ferromagnetischen
Partikel zu beschichten. Wenn die Säule aus einem Material wie
etwa Polypropylen besteht, muss der überschüssige Lack nach dem Beschichten
der ferromagnetischen Partikel von den Wänden der Säule entfernt werden. Dies ist
ein zeitaufwändiger,
mühsamer Schritt,
der die Herstellungskosten der Säule
deutlich erhöht.
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Wenn
die Matrix 110 einem externen Magnetfeld ausgesetzt wird,
wird in derselben ein Magnetfeld mit hohem Gradienten erzeugt. Wenn
die Matrix aus dem Feld entfernt wird, findet in derselben eine
unverzügliche Entmagnetisierung
statt. In dem ersten Abschnitt 110a der Matrix ist die
Flussrate geringer als im zweiten Abschnitt 110b. Der erste
Abschnitt 110a der Matrix trägt am meisten zum Trennvorgang
bei, da seine Querschnittsfläche
und sein Volumen größer als
beim zweiten Abschnitt 110b sind. Die magnetisierten Partikel
der Matrix 110 halten einzeln vorliegende superparamagnetische
MicroBeads (mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 50 nm/gemäß den Angaben
von Miltenyi Biotec) sowie Material, das diesen anhaftet, aus einer
Lösung
oder Reaktionsmischung von variabler Viskosität zurück, wobei letztere durch die
Säule 100 fließt und dabei
vorzugsweise von der Schwerkraft angetrieben wird. Das gebundene
Material kann in einem kleinen Volumen eluiert werden. Der zweite
Abschnitt 110b erfüllt
in erster Linie eine Fließwiderstandsfunktion,
da seine Querschnittsfläche
deutlich geringer ist als diejenige des ersten Abschnitts 110a,
wobei die Erstere auch aus Partikeln von geringerer Größe bildet
werden kann. Selbstverständlich
stellt auch der erste Abschnitt 110a in einem gewissen
Ausmaße
ein Widerstandselement dar. Vorzugsweise kommt dem zweiten Abschnitt 110b eine
gewisse Trennfunktion zu, wobei er aber alternativ dazu auch vollständig aus
nichtmagnetischen Partikeln wie etwa Kunststoff oder Glas gebildet
sein kann und in diesem Falle ausschließlich als Widerstandselement dienen
würde.
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Somit
können
die Glaskugeln/partikel 120' oder
die Kunststoffkugeln/partikel oder die anderen nicht-ferromagnetischen
Kugeln oder Partikel in dem ersten und/oder in dem zweiten Abschnitt
durch einige der Kugeln/Partikel 120 ersetzt werden, ohne
dass die Trennleistung der Säule
und Matrix unerwünschterweise
beeinträchtigt
würde und
ohne dass die Widerstandsfunktion des zweiten Abschnitts beeinträchtigt würde, siehe 5.
In einigen Fällen
können
sämtliche
der Kugeln/Partikel 120 im zweiten Abschnitt in dieser
Weise ersetzt werden. Vorzugsweise ist die Mikrotrennsäule der
vorliegenden Erfindung dafür
ausgelegt, mit Schwerkraftspeisung betrieben zu werden, alternativ
dazu kann sie aber auch dafür
ausgelegt sein, mit Druckspeisung betrieben zu werden. Um Letzteres
zu ermöglichen,
passt ein Druckkolben 160 in den Vorratsbehälter 112 und kann
dazu verwendet werden, das gebundene Material auszuspülen. Darüber hinaus
kann gebundenes Material (z.B. Zellen) mittels Zentrifugation in
einem kleinstmöglichen
Volumen eluiert werden.
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Eine
poröse
Fritte oder ein poröses
Gitter 140 kann neben dem oberen Ende der Matrix 110 angeordnet
sein, insbesondere bei Ausführungsformen
mit Partikeln oder Kugeln, die frei beweglich sind, d.h. die nicht durch
einen Lack oder ein anderes Bindemittel festgehalten werden. Die/das
poröse
Fritte/Gitter besteht vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff oder
Metallgeflecht und weist eine Porengröße auf, die mindestens ebenso
groß oder
größer als
die Porengröße der Matrix
und kleiner als die Größe der Partikel/Kugeln
der Matrix ist.
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Anstelle
einer kugelförmiger
Halterung 130, kann eine poröse Fritte oder ein poröses Gitter 150 neben dem
unteren Ende der Matrix 110 angeordnet sein, insbesondere
bei Ausführungsformen
mit Partikeln oder Kugeln, die frei beweglich sind und auch bei
solchen, bei denen Lack oder ein anderes Bindemittel eine Festigungswirkung
ausübt,
siehe 6. Die/das poröse
Fritte/Gitter besteht vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff oder
Metallgeflecht und weist eine Porengröße auf, die mindestens ebenso
groß oder
größer als
die Porengröße der Matrix
und kleiner als die Größe der Partikel/Kugeln
der Matrix ist.
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Wenn
Kugeln 120 eingesetzt werden, um die Matrix 110 zu
bilden, so sind diese Kugeln größer als
100 μm,
vorzugsweise größer als
ungefähr
200 μm und
kleiner als ungefähr
2.000 μm,
mit besonderem Vorzug größer als
ungefähr
200 μm und
kleiner als ungefähr
1.000 μm,
und mit dem größten Vorzug
beträgt
ihre Größe 280 μm. Selbstverständlich kann
die Größe der Kugeln
verändert
werden, um eine angestrebte Flussrate durch die Matrix zu kalibrieren
oder zu variieren. Eine zu starke Verringerung der Kugelgröße kann
indes aufgrund der Verringerung der Porengröße zwischen den Kugeln, die
damit einhergeht, zum Verstopfen führen. Andererseits kann eine
zu starke Erhöhung
der Größe der Kugeln
zu einer Flussrate führen,
die ungebührlich
hohen Geschwindigkeiten entspricht, was negative Auswirkungen auf
die prozentuale Rückhalterate
der magnetischen Partikel hätte.
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Es
ist eine Mindesthöhe
an Fluidsäule
(d.h. der Höhe
der Fluids oberhalb des spitz zulaufenden Endes der Säule) erforderlich,
um einen Druck zu erzeugen, der ausreichend groß ist, um die Oberflächenspannung dort,
wo die Tropfen gebildet werden, zu überwinden, wodurch ein problemloser
Fluss gewährleistet
wird. Der zweite Abschnitt 110b erhöht in wirkungsvoller Weise
den Widerstand und ermöglicht
den Einsatz einer Matrix 110 mit einer geringeren Gesamthöhe, wodurch
auch das tatsächliche
Volumen der Matrix 110 verringert wird. Die Gesamthöhe der Matrix 110 beträgt weniger
als ungefähr
20 mm, vorzugsweise weniger als ungefähr 15 mm und mit dem größten Vorzug
weniger als ungefähr
12 mm. Wenn kleine Elutionsvolumina von Bedeutung sind, beträgt das Totvolumen
der Säule,
d.h. der Zwischenraum innerhalb der Matrix, der nicht von Kugeln/Partikeln
eingenommen wird, sowie das Volumen der Säule, das sich jenseits der
Matrix befindet, im Allgemeinen weniger als ungefähr 85 μl, vorzugsweise
weniger als ungefähr
70 μl, mit
besonderem Vorzug weniger als ungefähr 50 μl und mit dem größten Vorzug
ungefähr
30 μl.
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Ein
weiterer Faktor, der beim Entwurf der Säule berücksichtigt werden muss, ist
die Oberflächenspannung,
die am Ende der Säule,
wo sich beim Austritt der Flüssigkeit
aus der Säule
Tropfen bilden, erzeugt wird. Je länger und je höher die
Säule ist,
umso stärker
ist das Druckgefälle,
das sich entwickelt, um die Oberflächenspannung zu überwinden.
Wenn die Oberflächenspannung
im Verhältnis
zum Druckgefälle
zu groß ist, wird
die Tropfenbildung am Ende der Säule
behindert und möglicherweise
sogar verhindert, wodurch der Fluss durch die Säule zum Erliegen kommt. Somit
ist es erforderlich, einen dritten Säulenabschnitt 122 auszubilden, um
das Endstück 126 zu
verlängern.
Der dritte Abschnitt 122 hat eine geringere innere Querschnittsfläche als der
zweite Abschnitt 118 sowie ein geringeres Außenmaß (z.B.
Durchmessung im Fall eines zylindrischen Abschnitts). Die Länge des
dritten Abschnitts kann gemäß den jeweiligen
Querschnittsflächen
und der angestrebten Flussrate variieren.
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Die
Tabelle 1 zeigt die Auswirkung der Querschnittsflächen des
ersten, zweiten und dritten Abschnitts und der Höhenwerte auf die Flussrate
sowie den Zusammenhang zwischen der Flussrate und der prozentualen
Wiederfindungsrate der MicroBeads.
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Tabelle
1. Wiederfindungsrate im Zusammenhang mit der Flussrate
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Wenn
eine kugelförmige
Halterung 130 eingesetzt wird, erstreckt sich mindestens
eine Befestigung 128 vom oberen Ende des dritten Abschnitts 122 bis
in den zweiten Abschnitt hinein. Die jeweiligen Befestigungen 128 sind
vorzugsweise zapfenförmig
(siehe auch 3). Vorzugsweise erstreckt sich
ein Satz von drei Befestigungselementen 128 (siehe 4)
vom dritten Abschnitt in den zweiten Abschnitt und dient dazu, die kugelförmige Halterung 130 zu
stützen.
Bei der Halterung 130 handelt es sich vorzugsweise um eine
Kugel, die erheblich größer als
die Kugeln 120 ist und deren Größe derart ausgelegt ist, dass
sie verhindert, dass die Kugeln 120 beim Befüllen der
Säule 100 mit
der Matrix 110 in den dritten Abschnitt gelangen, wobei
diese Funktion ständig
ausgeübt
wird, wenn die Kugeln nicht durch einen Lack festgehalten werden.
Die Halterungskugel 130 lässt indes Durchgangstellen
frei, die mindestens so breit sind wie die Räume zwischen den Kugeln 120 in
der Matrix 110, sodass der Fluss des Fluids durch den zweiten
Abschnitt 118 und in den dritten Abschnitt 122 nicht
gestört
wird.
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Das
distale Ende des dritten Abschnitts 122 verjüngt sich
zu einer Spitze 126. Das Außenmaß (z.B. der Außendurchmesser,
wenn es sich bei der Spitze um die Spitze eines zylindrischen Rohres
handelt) der Spitze 126 ist kleiner als dasjenige des dritten
Abschnitts und legt die bevorzugte Tropfengröße des Fluid, das die Säule verlässt, fest.
Eine bevorzugte Ausführungsform
weist einen Außendurchmesser
von ungefähr
1,5 mm auf, wobei diesen Maß selbstverständlich variiert
werden kann, indem das Ende oder der "Ablauf' der Säule gemäß der angestrebten Tropfengröße geformt
wird.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Trennungs- und Freisetzungsverfahren
zum Reinigen von biologischem Material auf der Säule 100. Nach dem
Zurückhalten
des betreffenden biologischen Materials, welches an magnetische
Partikel in der Matrix 110 gekoppelt ist, kann das gebundene
Material wahlweise von den magnetischen Partikeln getrennt und aus
der Säule 100 eluiert
werden, während
die magnetischen Partikel weiterhin von der Matrix 110 magnetisch
zurückgehalten
werden. Die Trennung kann durch eine geeignete Änderung von Puffern oder der
Temperatur sowie durch chemische oder enzymatische Reaktionen erfolgen, welche
die Bindung zwischen den magnetischen Partikeln und dem betreffenden
biologischen Material lösen. Zum
Beispiel kann mRNA von Poly- T-konjugierten
Perlen gelöst
werden, indem die Pufferzusammensetzung geändert wird, wobei die Temperatur
vorzugsweise mehr als 30 °C
beträgt.
Materialien, die an Antikörper
gebunden sind, sowie an Protein A oder G, können in der Säule freigesetzt
werden, indem der pH-Wert, die Salzbedingungen oder die Chemikalien
(DTT- statt SPDP-Bindungen) geändert
werden oder aber durch Einleiten von Detergentien, z.B. von SDS
oder chaotropen Mitteln.
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Die
Mikrosäule 100 ist
dafür ausgelegt,
in einem Mikrosäulen-HGMS-System
gemäß der vorliegenden Erfindung
eingesetzt zu werden. Das System 300 umfasst eine Trenneinheit 200,
in welcher sich eine oder mehrere Mikrosäulen 100 (in der bevorzugten
Ausführungsform
sind es vier) befinden, wie in 7 dargestellt ist.
Die Mikrotrenneinrichtung umfasst ein Joch 210, welches
die Rahmenstruktur der Einrichtung bildet und welches die Magnetfelder
konzentriert. Das Joch ist derart ausgebildet, dass es in jedem
der Bereiche, in welchen die Verarbeitung mit einer Mikrosäule ablaufen
soll, eine Kerbe 212 umfasst.
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Ein
Magnetpaar 214 ist in jeder der Kerben 212 derart
angeordnet, dass genau dort ein engerer Spalt 216 gebildet
wird, wo das magnetische Feld der Magnete gebündelt wird und wo eine Mikrosäule zur
Durchführung
einer HGMS-Trennung eingeführt
werden soll. Wie bereits erwähnt
wurde, verbindet das Joch 210 in der bevorzugten Ausführungsform,
die in den Figuren dargestellt ist, vier Paare starker Permanentmagneten (8C),
die gemeinsam das Magnetfeld erzeugen, das dafür erforderlich ist, vier Trennvorgänge parallel
in vier Säulen
durchzuführen.
Es sei erneut darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung
selbstverständlich
keineswegs auf die Konfiguration mit vier Mikrosäulenständen beschränkt ist und dass eine andere
Anzahl genauso problemlos vorgesehen werden kann.
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Zwei
Magnete 218 sind vorzugsweise mit der Rückseite des Jochs 210 verbunden,
um die Befestigung oder Montage der Einheit an einer ferromagnetischen
Vorrichtung wie etwa einem Eisengestell zu erleichtern. Wiederum
kann eine unterschiedliche Anzahl an Magneten 218 für die Montage
benutzt werden. Darüber
hinaus können
weitere Befestigungsmittel wie etwa Klemmen, Schrauben, Bolzen usw.
alternativ und zusätzlich dazu
eingesetzt werden.
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Die
bislang beschriebene Einheit wird vollständig von einer unzerbrechlichen
Abdeckung 220 umschlossen. Die unzerbrechliche Abdeckung
schützt
die innenliegenden Komponenten der Einheit und macht die Einheit
weiterhin "anwenderfreundlicher" in dem Sinne, dass
diese angenehmer zu berühren
ist (wärmer, geschmeidiger)
und wesentlich einfacher gereinigt/sterilisiert werden kann. Vorzugsweise
handelt es sich bei der Abdeckung 220 um eine Schaumstoffschicht
z.B. aus Polyurethangummi, welche die Einheit 200 gegen Korrosion
und chemische oder mechanische Beschädigungen schützt. Alternativ
dazu können
andere Abdeckungsmaterialien, die den gleichen Zweck erfüllen, eingesetzt
werden.
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Jeder
der Spalte 216 der Trenneinheit 200 weist ein
Magnetfeld auf, das stärker
als ungefähr
0,2 Tesla, vorzugsweise stärker
als ungefähr
0,4 Tesla, mit besonderem Vorzug stärker als ungefähr 0,5 Tesla
und mit dem größten Vorzug
stärker
als ungefähr
0,6 Tesla ist. Eine bevorzugte Ausführungsform erzeugt Magnetfelder
in der Größenordnung
von 0,6 bis 0,7 T. Tabelle 2 zeigt die Beziehung zwischen der Stärke des
angewendeten Magnetfeldes und der Menge an MicroBeads, die infolgedessen
wiedergewonnen werden. Unabhängig von
der Art der verwendeten Säule
zeigt sich der gleiche Trend.
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Tabelle
2. Wiederfindungsrate der MicroBeads im Zusammenhang mit der Stärke des
Magnetfeldes
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Wie
in den 8A und 8B dargestellt
ist, bildet die Abdeckung 220 oben und unten an den Spalten 216 Abschrägungen 222.
Diese Abschrägungen
sind dafür
ausgelegt, die trichterförmigen
Abschnitte 114 der Mikrosäule bündig aufzunehmen, wodurch die
Mikrosäule
noch besser in einer vertikalen Position innerhalb des Spalts 216 stabilisiert
wird. Die Abschrägungen 222 sind
am oberen und unteren Ende jedes Spalts 216 derart ausgebildet,
dass die Einheit 200 entlang ihrer horizontalen Achse symmetrisch
ist. Somit sind die oberen und unteren Enden der Einheit identisch,
und der Anwender läuft
nicht Gefahr, die Einheit "verkehrt herum" zu benutzen. Wie
in 8B dargestellt ist, beträgt der Winkel der Abschrägung 222 vorzugsweise
ungefähr
90°, aber
dieser Winkel kann selbstverständlich
entsprechend der Steilheit der Trichterform einer Mikrosäule, die
in dem Spalt mit der Abschrägung
gehalten werden soll, variieren.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Um
ein kleines Elutionsvolumen (< 50 μl) zu erzielen,
betrug das Gesamtvolumen desjenigen Teils der Mikrosäule, der
mit Matrix gefüllt
war, 52 mm3, was einen Freiraum für 22 μl eines Fluids
ließ (Matrixvolumen), wenn
ferromagnetisches Standardmaterial eingesetzt wurde (Eisenkugeln
mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 280 μm). Unter
Berücksichtigung
des Volumens im Abschnitt 122 der Säule betrug das Totvolumen der
Säule,
das für
die Elution von Bedeutung war, insgesamt 29 μl.
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Um
zu gewährleisten,
dass bei einer Matrixhöhe
von 11 mm mehr als 90 % der MicroBeads, die (in einem Puffer, der
ein Detergens enthielt) auf die Säule gegeben wurden, (in einem
Magnetfeld von 0,6 bis 0,7 T) zurückgehalten wurden, musste die
Flussrate der MicroBead-Suspension eingestellt werden. Aus diesem Grunde
kam eine zweiteilige Matrix zum Einsatz. Der untere Teil der Matrix,
der 6 mm ausmachte (d.h. 110b), hatte einen Innendurchmesser
von lediglich 1,9 mm, was einen starken Einfluss auf die Flussrate
hatte, während
die oberen 5 mm der Matrix (d.h. 110a) einen größeren Durchmesser
von 3 mm hatte, um die Wahrscheinlichkeit der Verstopfens der Säule zu verringern.
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Die
Matrix wurde am unteren Ende durch eine Stahlkugel (d.h. 130)
von 1,6 mm Durchmesser begrenzt. Weiter unterhalb verjüngte sich
die innere Querschnittsfläche
der Röhre
(d.h. 122) auf 0,8 mm. Die Stahlkugel ruhte auf drei Brücken (d.h.,
Befestigungen 128), welche sie daran hinderten die Röhre zu verschließen. Die
Stahlkugel sorgte dafür,
dass das ferromagnetische Material während des Füllvorganges nicht durchrutschte.
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Um
sicherzustellen, dass die Säule
bei Aufgabe des Puffers auf die Matrix für eine Tropfenbildung durch
Schwerkraft ausgelegt war, wurde empirisch eine Gesamtsäulenhöhe von 24
mm bestimmt, bis zu welcher der Puffer eingefüllt werden muss. Aus diesem
Grunde wurde die Säule über den
Matrixbereich hinaus mittels einer Röhre 122 mit einer
Länge von
12 mm und einem Durchmesser von 0,8 mm verlängert.
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Die
Matrix und die untere Verlängerung
wiesen gemeinsam ein berechnetes Totvolumen von 29 μl auf. Um
das Elutionsvolumen so gering wie möglich zu halten, kann die erste
Fraktion des Puffers, die bei einer solchen Elution aus der Säule fließt (eine
Puffermenge, die dem Totvolumen nahekommt) verworfen werden, da
sie kein eluiertes Material enthält.
Die Puffertropfengröße ist derart
ausgelegt, dass sie kleiner als ungefähr 80 % des Totvolumens der
Säule ist,
sodass der erste Tropfen verworfen werden kann. Aus diesem Grunde wurde
die Tropfengröße des (detergentienfreien)
Puffers derart festgelegt, dass sie näherungsweise 24 μl betrug.
Dies wurde erzielt, indem der Durchmesser der unteren Spitze der
Säule auf
1,5 mm eingestellt wurde.
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Darüber hinaus
diente die kontrollierte Tropfengröße der Festlegung des Elutionsvolumens.
Die Tropfen 2 und 3 enthielten > 80
% des eluierten Materials (siehe 9), und
die Tropfen 2 bis 4 enthielten > 90
% des eluierten Material.
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Die
Mikrosäulen 100,
die sich in der oben beschriebenen Trenneinheit 200 befanden,
können
mindestens 2 mg MicroBeads binden, wie über die optische Dichte der
MicroBeads bei einer Wellenlänge
von 450 nm (Tabelle 1) bestimmt wurde. Ungefähr 90 bis 98 % einer Menge
von 0,1 bis 2 mg einfacher MicroBeads ("Basic MicroBeads", Miltenyi Biotec GmbH) werden bei Aufgabe
auf eine Säule
in einem Magnetfeld zurückgehalten, wie über die
optische Dichte der MicroBeads bei einer Wellenlänge von 450 nm (Tabelle 1)
bestimmt wurde.
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Da
die Flussrate in erster Linie durch die Teil der Matrix mit einem
Durchmesser von 1,9 mm aufrechterhalten wird, ist es einfach, die
Flussrate durch Änderung
des Durchmessers der Kugeln zu verringern oder zu steigern. Die
Flussrate des Puffers (der ein Detergens enthält, 1 % SDS) beträgt in einer
Säule mit
Standardmatrix (280-μm-Kugeln)
300 μl/min.
In einer Säule
mit Kugeln, deren durchschnittlicher Durchmesser 230 μm beträgt, liegt
die Flussrate bei 200 μl/min.
Bei automatisch hergestellten Säulen
mit einer Matrix aus 280-μm-Kugeln
beträgt
die durchschnittliche Flussrate 320 +/- 100 μl. Die durchschnittliche Tropfengröße beträgt bei Wasser
23,9 μl.
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Für viele
Anwendungen ist es vorteilhaft, das gebundene Material von den MicroBeads
zu eluieren, solange die MicroBeads noch an die Matrix im Magnetfeld
gebunden sind. In diesem Fall wird das Material eluiert, indem ein
anderer Puffer zugesetzt wird, der die chemischen Wechselwirkungen
zwischen dem zurückgehaltenen
Molekül
und dem Andockmittel aufbricht. Ein Beispiel für die Auftrennung von Makromolekülen ist die
Isolierung von mRNA aus rohem Zellextrakt über die spezifische Wechselwirkung
zwischen Oligo(dT), welches an MicroBeads gekuppelt ist, und dem
Poly-A-Schwanz der mRNA. (Die mRNA macht näherungsweise 0,01 % der gesamten
Zellmasse aus).
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1 × 107 angezüchtete
Hybridomzellen wurde in PBS gewaschen, das Pellet wurde wieder in
Suspension gebracht und einer Lyse mit 1 ml eines Lyse/Bindungspuffers
(0,1 M Tris/HCL pH 8,1, 1 % SDS, 0,2 M LiCl, 10 mM EDTA, 5 mM DDT)
unterzogen. Das SDS bewirkt die vollständige Inaktivierung des zellulären RNAasen,
welche bei der Lyse freigesetzt werden.
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Es
wird durch eine poröse
Matrix zentrifugiert (2 min. bei 13.000 × g durch drei Schichten Blottingpapier,
welches sich auf einem porösen
Polypropylenfilter befindet), um die hohe Viskosität des Lysats,
die durch genomische DNA hervorgerufen wird, erheblich zu verringern.
Dieser Vorgang kann keinen Einfluss auf die Integrität der mRNA.
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50 μl an Oligo(dT)-MicroBeads
wurden dem Lysat zugesetzt, und das Lysat wurde durchmischt. (Zur Hybridisierung
der mRNA an die Oligo(dT)-MicroBeads ist keine zusätzlich Inkubation
erforderlich).
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Eine
Säule,
die sich in dem Magneten befand, wurde durch Aufgabe von 100 μl Lyse/Bindungspuffer konditioniert.
Das Lysat wurde hinzugefügt.
Nachdem es durch die Matrix geflossen war, wurden zwei Aliquote von
250 μl des
Lyse/Bindungspuffers hinzugefügt,
um das gesamte ungebundene Material (Proteine, DNA) auszuwaschen,
sowie vier Aliquote von 250 μl
an Waschpuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA),
um das gesamte unspezifisch gebundene Material (rRNA, DNA) auszuwaschen.
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Um
die mRNA von den MicroBeads zu eluieren, wurden 200 μl an Elutionspuffer
(1 mM EDTA), der 65 °C
warm war, hinzugefügt.
Die Tropfen 1 bis 5 wurden getrennt voneinander in Röhrchen aufgefangen
und auf 0,8 %igem Agarosegel mit Ethidiumbromidfärbung analysiert (siehe
9). Tabelle
3. Prozentuale Wiederfindungsrate von näherungsweise 100 μg MicroBeads
aus verschiedenen Chargen bei Anwendung verschiedener Säulen a)
Durchmesser der Matrixkugeln: 230 μm
b)
Durchmesser der Matrixkugeln: 280 μm
- Prozentuale Wiederfindung von näherungsweise
2 mg MicroBeads des Charge B bei Anwendung der Säule 1
- Charge B
- Säule
1 97,8
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Beispiel 2 – Immunomagnetische
Isolierung von Protein mit Protein-G-MicroBeads
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Ein
weiteres Beispiel für
die Auftrennung von Makromolekülen
ist die Isolierung von Protein aus rohem Zellextrakt über Antikörper, die
an das Protein binden und anschließend an Protein G andocken,
wobei letzteres an magnetische MicroBeads gekoppelt ist.
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1 × 107 Leberzellen der Maus werden einer Lyse
in 1 ml Lyse-Puffer unterzogen, wobei die Zellkerne intakt bleiben
(150 mM NaCl, 1 % Triton × 100,
50 mM Tris, pH 8,1). Die Zellkerne wurden durch Zentrifugation entfernt.
Der Überstand
wurde mit 100 ng Phycoerythrin als Standard versetzt. Anschließend wurde
er mit 1 μg
eines monoklonalen anti-Phycoerythrin-Antikörpers gemischt und 5 bis 30
min. lang bei 6 °C
inkubiert. 10 μl
an Protein-G-MicroBeads (welche mit 0,5 μg rekombinantem Protein G beladen
waren) wurden hinzugefügt, woraufhin
die Reaktionsmischung kurz durchmischt und dann für weitere
5 bis 30 min. bei 6 °C
inkubiert wurde.
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Ein
Mikrosäule
wurde in der beschriebenen magnetischen Trennvorrichtung angebracht
und durch Waschen mit 100 μl
Lyse-Puffer konditioniert. Die Reaktionsmischung wurde auf die Säule gegeben.
Nachdem die Reaktionsmischung vollständig durch die Säule geflossen
war, wurde die Säule
durch Zugabe von 3 × 125 μl Lyse-Puffer
sowie 4 × 125 μl PBS gewaschen.
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Für die Elution
verblieb die Säule
in der magnetischen Trennvorrichtung, und der Puffer wurde durch Zugabe
von 50 μl
eines SDS-Gel-Probenpuffers (welcher 1 SDS enthielt) ersetzt. Der
Puffer wurde in der Säule 3
min. inkubiert, um die immunomagnetischen Komplexe zu lösen. Anschließend wurde
die Elution durch Zugabe von 75 μl
an Probenpuffer fortgeführt,
wobei diejenigen Tropfen (2 bis 4) aufgefangen wurden, welche das
Antigen und den Antikörper,
die von der Säule
eluiert wurden, enthielten. Aufgrund des Tensids (SDS) hatten die
Tropfen ein durchschnittliches Volumen von 15 μl, sodass das gesamte Elutionsvolumen
45 μl betrug.
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Die
Auftrennung wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel analysiert, wobei
die Ergebnisse in 10 dargestellt sind. Die Proteine
wurden durch Silberfärbung
sichtbar gemacht. In 10 stehen "A" und "B" für die
Eluenten von zwei unabhängigen
Isoliervorgängen. "C" steht für den Größenmarker. "D" steht
für den
anti-Phycoerythrin-Antikörper
und "E" steht für das Phycoerythrin. "F" steht für die Flussrate eines der Trennvorgänge.
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Dieses
Verfahren der Immunoaffinitätsaufreinigung
kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Es kommt ohne Zentrifugationsschritte
und lange Inkubationszeiten aus, welche für Standard-Immunopräzipitationsvorgänge typisch
sind. Darüber
hinaus werden sehr hohe Reinheitsgrade erzielt. Mit dem hochempfindlichen
Silberfärbungsverfahren
konnte nahezu ausschließlich
der Antikörper
und das Antigen auf der dargestellten SDS-PAGE nachgewiesen werden.
