DE60212930T2

DE60212930T2 - Detektionsmethode für Zielmoleküle, Reagenz sowie Verfahren zur Detektion von SNPs in DNA Nukleotidsequenzen

Info

Publication number: DE60212930T2
Application number: DE60212930T
Authority: DE
Inventors: c/o Yamaguchi University School Kohsuke Ube-shi Sasaki; c/o Yamaguchi University School Tomoko Ube-shi Furuya
Original assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Priority date: 2001-12-25
Filing date: 2002-12-23
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2022-12-24
Also published as: EP1323834B1; JP2003189862A; US20030129640A1; EP1323834A2; EP1323834A3; DE60212930D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweisen einer Zielsequenz unter Verwendung von Kügelchen, wie zum Beispiel Polystyrolkügelchen, Polypropylenkügelchen, magnetische Kügelchen und Glaskügelchen. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Reagenz und ein Verfahren zur Detektion von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (Single Nucleotide Polymorphismen, SNPs) in DNA Nukleotidsequenzen.
2. Hintergrundwissen
Ein Biochip (DNA Microarray) wird für die Detektion vieler Arten von Biopolymeren verwendet, wie zum Beispiel DNA Nukleotidsequenzen, die in einer Probe auf einmal enthalten sind. Der Biochip macht sich die Tatsache zu nutze, daß mehrere Arten an markierten Targets (wie zum Beispiel DNAs) in einer Probe selektiv an mehrere Arten von Proben (wie zum Beispiel DNAs) durch Hybridisierung binden, wobei die Proben auf einen flachen Träger immobilisiert sind, wie zum Beispiel Objektträger. Im Speziellen wird eine Zielsequenz in einer Probe durch das Mittel eines Markers detektiert, der eingebracht wird, da das Target an einen Punkt hybridisiert, wo eine Probe immobilisiert ist. Durch die Immobilisierung einer großen Anzahl von Proben auf einem Träger können viele Arten von Targets zur gleichen Zeit detektiert werden.
Eine weitere Hybridisierungsmethode, die entwickelt worden ist, verwendet anstatt eines flachen Trägers sphärische Kügelchen. Jedes Kügelchen hat einen Durchmesser in der Höhe von 100 nm bis 100 μm. Die Proben sind auf der Oberfläche der Kügelchen immobilisiert, so daß die Proben mit Targets auf der Oberfläche der Kügelchen hybridisiert sind. Dieses Verfahren, welches die Oberflächen der Kügelchen als Ort der Reaktion verwenden, hat den Vorteil, daß die Reaktionseffizienz und die Reinigungseffizienz sehr hoch ist.
Obwohl das Verfahren der Hybridisierung einer Probe mit einem Target auf einer Oberfläche eines Kügelchens eine hohe Reaktionseffizienz hat, muß das Target, das mit der Probe hybridisiert hat, die auf der Kügelchenoberfläche immobilisiert ist, identifiziert werden, indem das Kügelchen seinerseits identifiziert wird. Aus diesem Grunde, wenn nur eine Art Kügelchen vorhanden ist, kann nur eine Art Target identifiziert werden. Ein weiteres Verfahren ist bekannt, welches mehrere Arten an Kügelchen verwendet, die durch ihre Färbung mit fluoreszierenden Pigmenten identifizierbar gemacht worden sind. Aber dieses Verfahren erfordert eine separate Laserlichtquelle für die Anregung der fluoreszierenden Pigmente, die die Kügelchen färben, zusätzlich zu der Laserlichtquelle für die Anregung der fluoreszierenden Pigmente, die die Targets markieren. Als Ergebnis ist das System komplex und teuer.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Anbetracht der oben erwähnten Probleme des Standes der Technik ist es ein Ziel der Erfindung, ein Zielnachweisverfahren zur Verfügung zu stellen, das mehrere Arten von Kügelchen verwendet, auf welche unterschiedliche Proben immobilisiert sind, und das ermöglicht, die Kügelchen ihrerseits in einer einfachen Art und Weise zu identifizieren. Die Erfindung stellt auch ein Reagenz und ein Verfahren zur Detektion von SNPs in einer DNA Nukleotidsequenz unter Verwendung einer einzigen Art Kügelchen derselben Korngröße zur Verfügung.
Das oben genannte Ziel der Erfindung wird durch die Erfindung erreicht, indem Kügelchen von unterschiedlichen Korngrößen verwendet werden, die man in einem Durchflußcytometer fließen lässt, um die Vorwärtsstreuung zu messen. Basierend auf der Intensität der Vorwärtsstreuung wird die Korngröße der Kügelchen identifiziert. Unterschiedliche Proben sind auf der Oberfläche der Kügelchen mit unterschiedlicher Korngröße immobilisiert. Nach Hybridisierung der Proben mit einem Fluoreszenz-markiertem Target wird die Fluroeszenzintensität der Kügelchen durch das Durchflußcytometer gemessen, um das Target nachzuweisen.
Das obige Ziel wird auch wie folgt erreicht. Kügelchen, auf welchen eine Probe immobilisiert ist, die mit einer DNA Nukleotidsequenz hybridisiert, die kein SNP hat, werden mit Kügelchen gemischt, auf welchen eine andere Probe immobilisiert ist, die mit einer DNA Nukleotidsequenz hybridisiert, die ein SNP aufweist, um ein Reagenz herzustellen. Das Reagenz wird einer Probenlösung hinzugefügt, welche eine zu untersuchende Fluroeszenz-markierte DNA Nukleotidsequenz enthält, und eine Hybridisierungsreaktion wird durchgeführt. Die Kügelchen werden nach der Reaktion durch ein Durchflußcytometer geschickt, um ein Fluoreszenz-Intensitäts-Histogramm-Bild zu erhalten, basierend darauf, welches SNP in einer zu untersuchenden DNA Nukleotidsequenz bestimmt wird.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Zielnachweisverfahren zur Verfügung, umfassend die Schritte:
Durchführen einer Hybridisierungsreaktion zwischen einem Target und einer Probe durch Mischen, in einer Probenlösung, die ein Fluoreszenz-markiertes Target enthält, von Kügelchen einer ersten Korngröße, die eine erste Probe auf ihrer Oberfläche immobilisiert haben, und von Kügelchen einer zweiten Korngröße, die eine zweite Probe auf ihrer Oberfläche immobilisiert haben, die von der ersten Probe unterschiedlich ist;
nach der Hybridisierungsreaktion zeitgleiches Nachweisen einer Vorwärtsstreuung und Fluoreszenz durch den Fluß der Kügelchen in einem Flußcytometer; und
Identifizierung der Korngröße der Kügelchen, basierend auf der Intensität der Vorwärtsstreuung.
Kügelchen der gleichen Korngröße können die gleiche Probe darauf immobilisiert haben und Kügelchen von unterschiedlichen Korngrößen können unterschiedliche Proben darauf immobilisiert haben.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Reagenz für den Nachweis eines SNP in einer DNA Nukleotidsequenz zur Verfügung, umfassend ein Gemisch von ersten und zweiten Kügelchen, wobei die ersten Kügelchen eine Probe auf ihrer Oberfläche immobilisiert haben, welche mit einer DNA Nukleotidsequenz hybridisiert, die kein SNP hat, wobei die zweiten Kügelchen sich von den ersten Kügelchen nur darin unterscheiden, daß die Sequenz der Probe, die auf der Oberfläche der zweiten Kügelchen immobilisiert ist, mit einer DNA Nukleotidsequenz hybridisiert, welche ein SNP hat.
Die ersten Kügelchen und die zweiten Kügelchen können entweder zu gleichen Teilen oder zu unterschiedlichen Teilen gemischt werden.
In einem noch anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Reagenz zum Nachweis von SNPs in einer DNA Nukleotidsequenz zur Verfügung, welches ein Gemisch umfaßt aus:
Ersten Kügelchen einer ersten Korngröße, die eine Probe auf ihre Oberfläche immobilisiert haben, wobei die Probe mit einer ersten DNA Nukleotidsequenz hybridisiert, die kein SNP hat;
zweiten Kügelchen, die sich von den ersten Kügelchen nur darin unterscheiden, daß die Sequenz einer Probe, die auf der Oberfläche der zweiten Kügelchen immobilisiert ist, mit der ersten DNA Nukleotidsequenz, die ein SNP hat, hybridisiert;
dritten Kügelchen einer zweiten Korngröße, die eine Probe auf ihre Oberfläche immobilisiert haben, die Probe mit einer zweiten DNA Nukleotidsequenz, die kein SNP hat, hybridisiert; und
vierten Kügelchen, welche sich von den dritten Kügelchen nur darin unterscheiden, daß die Sequenz der Probe, die auf der Oberfläche der vierten Kügelchen immobilisiert ist, mit der zweiten DNA Nukleotidsequenz, die ein SNP hat, hybridisiert.
Die ersten und zweiten Kügelchen werden bevorzugt in unterschiedlichen Teilen gemischt, und die dritten und vierten Kügelchen werden bevorzugt in unterschiedlichen Teilen gemischt.
Die Korngröße der Kügelchen kann in dem Bereich von 0,1 μm bis 1 mm sein.
Im einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen eines SNP in einer DNA Nukleotidsequenz zur Verfügung, welches folgende Schritte umfaßt:
Durchführen einer Hybridisierungsreaktion durch Mischen, in einer Probenlösung, die eine zu untersuchende Fluoreszenz-markierte DNA Nukleotidsequenz enthält, von ersten Kügelchen und zweiten Kügelchen, die ersten Kügelchen haben eine Probe auf ihrer Oberfläche immobilisiert, welche mit einer DNA Nukleotidsequenz hybridisiert, die kein SNP hat, die zweiten Kügelchen unterscheiden sich von den ersten Kügelchen nur darin, daß die Sequenz der Probe, die auf der Oberfläche der zweiten Kügelchen immobilisiert ist, mit einer DNA Nukleotidsequenz hybridisiert, die ein SNP hat;
Erstellung eines Fluoreszenzintensitätshistogamms durch den Fluß der Kügelchen, nach der Hybridisierungsreaktion, in einem Flußcytometer und Messung der Fluoreszenzintensität; und Bestimmung eines SNP in der zu untersuchenden DNA Nukleotidsequenz, basierend auf dem Peakmuster in dem Fluoreszenzintensitätshistogramm.
Die Bestimmung eines SNP in der zu untersuchenden DNA Nukleotidsequenz kann darauf basieren, ob die Anzahl der Peaks eins oder zwei ist.
Die ersten und zweiten Kügelchen werden bevorzugt in unterschiedlichen Teilen gemischt. In diesem Fall kann das SNP in der zu untersuchenden DNA Nukleotidsequenz auf dem Verhältnis der zwei Peaks mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten in dem Fluoreszenzintensitätshistogramm basierend bestimmt werden.
Das Material der Kügelchen ist nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel können Polystyrolkügelchen, Polypropylenkügelchen, magnetische Kügelchen und Glaskügelchen verwendet werden. Durch den Aufsatz von Filtern, die geeignet sind für unterschiedliche Korngrößen der Kügelchen in den Durchflußanteilen des Flußcytometers können die Kügelchen unterschiedlicher Korngröße zurückgewonnen werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse der Messung der Vorwärtsstreuung von Kügelchen mit einer Korngröße von 4,5 μm.
2 zeigt die Ergebnisse einer Messung der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung von Kügelchen mit unterschiedlichen Korngrößen (4,5 μm, 6,0 μm und 10,0 μm).
3A bis 3C zeigen Histogramme der Fluoreszenzintensität von Kügelchen mit unterschiedlichen Durchmessern nach der Hybridisierung.
4 zeigt die Ergebnisse einer Messung der Vorwärtsstreuung von Kügelchen mit einer Korngröße von 4,5 μm und Kügelchen mit einer Korngröße von 6,0 μm.
5A und 5B zeigen Histogramme der Fluoreszenzintensität nach Hybridisierung eines PCR Produkts mit zwei Arten von Kügelchen.
6A bis 6C zeigen Beispiele von Histogrammen einer Fluoreszenzintensität für die Bestimmung von SNPs.
7A bis 7F zeigen andere Beispiele von Histogrammen einer Fluoreszenzintensität für die Bestimmung von SNPs.
8 zeigt schematisch ein System für die Rückgewinnung von Kügelchen und Biopolymeren, die auf der Oberfläche der Kügelchen interagieren.
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsformen, mit Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen beschrieben.
1 ist ein Flußcytogramm, welches die Ergebnisse der Messung der Vorwärtsstreuung zeigt, wie Polystyrolkügelchen mit einer Korngröße von 4,5 μm in einem Flußcytometer durchgeflossen sind. Die horizontale Achse zeigt die Intensität der Vorwärtsstreuung (in arbiträren Einheiten) und die vertikale Achse zeigt die Zahl der gezählten Kügelchen. Ein steiler Peak 11 der Zählungen wird bei einer spezifischen Intensität der Vorwärtsstreuung gebildet. Dieses zeigt, daß eine Vorwärtsstreuung von einer im Wesentlichen gleichen Intensität beobachtet werden kann, wenn Kügelchen mit der gleichen Korngröße das Leselicht des Flußcytometers durchschneiden. Die Summe der Zählungen von dem Peak 11 entsprechen der Gesamtanzahl der detektierten Kügelchen. Somit reflektiert die Vorwärtsstreuung die Größe (Korngröße) der Kügelchen oder Zellen, so daß die Korngröße der Kügelchen auf der Intensität der Vorwärtsstreuung basierend identifiziert werden kann.
Verschiedene Kügelchen, die eine Carboxylgruppe auf der Oberfläche haben, mit einer Korngröße sich erstreckend von 0,05 bis 90 μm, sind zum Beispiel von Polysciences Inc. oder Bangs Laboratories, Inc. kommerziell erhältlich. Ein Protein, welches nicht Teil der Erfindung ist, oder eine DNA oder ein DNA Fragment, dessen Endpunkt durch Aminierung modifiziert ist, kann passiv absorbiert oder kovalent auf die Oberfläche dieser Kügelchen gebunden werden. Kügelchen mit einer Probe, wie zum Beispiel einer DNA oder einem Protein (solch ein Protein ist nicht Teil der Erfindung), auf ihrer Oberfläche gekoppelt, werden in einer Probenlösung gemischt, die ein Target, wie zum Beispiel eine Fluoreszenz-markierte DNA oder ein Protein (solch ein Protein ist nicht Teil der Erfindung) enthält, somit spezifisch das Target mit der Probe auf der Oberfläche der Kügelchen hybridisierend. Auf diese Weise können Mutationen in DNA unter Verwendung von Hybridisierung zwischen DNA und DNA (einschließlich RNA, nicht Teil der Erfindung (Ribonukleinsäure)), PNA, nicht Teil der Erfindung (Peptidnukleinsäure) und LNA (eingeschlossene (locked) Nukleinsäure), nicht Teil der Erfindung, detektiert werden oder es können Interaktionen zwischen verschiedenen Biopolymeren, wie zum Beispiel zwischen Protein und Protein, nicht Teil der Erfindung, Protein und DNA, nicht Teil der Erfindung, oder Zuckern, nicht Teil der Erfindung, analysiert werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird im Detail beschrieben werden. Drei Arten von Polystyrolkügelchen mit Korngrößen von 4,5 μm, 6,0 μm und 10,0 μm sind hergestellt worden. DNAs (Proben), wie sie in Tabelle 1 unten gezeigt sind, sind kovalent an die Oberfläche der einzelnen Kügelchen gebunden worden. Im Speziellen, amino-substituierte Oligonukleotide (DNAs) sind kovalent mit Hilfe von EDC (Ethylendiamincarbodiimid) an die carboxylierten Kügelchen gebunden worden. Tabelle 1
Für jede Korngröße sind Kügelchen, an welche eine normale Probe kovalent gebunden worden war, und Kügelchen, an welche eine unterschiedliche Probe kovalent gebunden worden war, hergestellt worden, und die zwei Arten von Kügelchen sind in gleichen Mengen gemischt worden. Die sich daraus ergebenden Kügelchen mit den jeweiligen Korngrößen sind in einem Durchflußcytometer geflossen. Die 2 zeigt das Flußcytogramm, das durch Messung der Vorwärtsstreuung erhalten worden ist. Die horizontale Achse zeigt die Intensität der Vorwärtsstreuung an (in arbiträren Einheiten) und die vertikale Achse zeigt die Zahl der detektierten Kügelchen an.
Wie oben erwähnt, variiert die Intensität der Vorwärtsstreuung in Abhängigkeit von der Korngröße der Kügelchen. Peak 21 ist auf Polystyrolkügelchen mit einer Korngröße von 4,5 μm zurückzuführen. Peak 22 ist auf Polystyrolkügelchen mit einer Korngröße von 6,0 μm zurückzuführen. Peak 23 ist auf Polystyrolkügelchen mit einer Korngröße von 10,0 μm zurückzuführen. Somit können die Korngrößen der Kügelchen basierend auf der Intensität der Vorwärtsstreuung identifiziert werden, die durch das Durchflußcytometer gemessen wird.
Als nächstes ist ein komplementärer Strang zu der normalen Probe synthetisiert worden, dessen Endpunkt durch Fluoreszein Isothiocyanat (FITC) Fluoreszenz-markiert war. Der komplementäre Strang ist dann an die Kügelchen der jeweiligen Korngrößen in einem gleichteiligen Gemisch der Kügelchen hybridisiert worden, an welche die normale Probe kovalent gebunden worden war und die Kügelchen, an welche die abweichenden Proben gebunden worden waren. Die Kügelchen der jeweiligen Korngrößen sind nach der Hybridisierung durch das Durchflußcytometer geflossen. Die 3A bis 3C zeigen Fluoreszenzintensitätshistogramme, die durch die Messung der Fluoreszenzintensitäten erhalten worden sind. Die 3A zeigt ein Fluoreszenzintensitätshistogramm für Polystyrolkügelchen mit einer Korngröße von 4,5 μm. Die 3B zeigt ein Fluoreszenzintensitätshistogramm für Polystyrolkügelchen mit einer Korngröße von 6,0 μm. Die 3C zeigt ein Fluoreszenzintensitätshistogramm für Polystyrolkügelchen mit einer Korngröße von 10,0 μm. In jedem Histogramm zeigt die horizontale Achse die Fluoreszenzintensität an und die vertikale Achse zeigt die Anzahl der gezählten Kügelchen an.
Bei jeder Korngröße hybridisierte der FITC-markierte komplementäre Strang an Kügelchen, an welche die normalen Proben kovalent gebunden worden waren, während, im Bezug auf die abweichenden Proben, das Hybridisierungssignal signifikant aufgrund des Unterschiedes in einer Base abgesenkt war. Dieses resultierte in zwei unterschiedliche Peaks, die in dem Histogramm sichtbar sind. Zum Beispiel ist Peak 32, eine starke Fluoreszenz anzeigend, auf Kügelchen mit der normalen Probe zurückzuführen, an welche der FITC-markierte komplementäre Strang hybridisiert war, zurückzuführen. Demgegenüber ist Peak 31 auf Kügelchen zurückzuführen, an welche die abweichende Probe kovalent gebunden worden war. Dort ist nur wenig Fluoreszenz beobachtet worden, da der komplementäre Strang nicht an die Fluoreszenz-markierte normale Probe hybridisiert war. Auch in den 3B und 3C ist ein Peak auf der rechten Seite, wo eine starke Fluoreszenzintensität beobachtet wird, auf Kügelchen mit der normalen Probe, an welche der FITC-markierte komplementäre Strang hybridisiert war, zurückzuführen und der Peak auf der linken Seite mit einer schwachen Fluoreszenzintensität ist auf Kügelchen zurückzuführen, an welche die abweichenden Proben kovalent gebunden waren.
Als nächstes, ist anstelle des synthetischen Oligo DNA Targets ein PCR Produkt an die Kügelchen mit einem Durchmesser von 4,5 μm und 6,0 μm hybridisiert worden, wobei die Kügelchen, an welche die normale Probe kovalent gebunden worden war, und die Kügelchen, an welche die unterschiedliche Probe kovalent gebunden worden war, in gleichen Mengen gemischt worden sind. Das PCR-Produkt war durch FITC markiert. Die für die PCR verwendeten Primer waren:
Die PCR Amplifikation ist an einer 100-mer Genom DNA durchgeführt worden, einschließlich zweier SNP Detektionsstellen. Die PCR Reaktionsbedingungen waren so, daß nach 10 Minuten thermaler Denaturierung bei 95°C ein Zyklus einer PCR Reaktion bei 94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 68°C für 30 Sekunden 35-mal wiederholt worden ist. Die DNA wurde unter Verwendung von FITC-markiertem dUTP als dNTP während der PCR Fluoreszenz-markiert und die Fluoreszenz-markierte DNA ist für die Hybridisierung verwendet worden.
Die 4 zeigt die Ergebnisse der Messung der Vorwärtsstreuung von Kügelchen mit einer Korngröße von 4,5 μm und Kügelchen mit einer Korngröße von 6,0 μm. Peak 41 mit einer schwacheren Intensität zeigt die Vorwärtsstreuung an, die auf Kügelchen mit einer Korngröße von 4,5 μm zurückzuführen ist. Peak 42 mit einer stärkeren Intensität zeigt die Vorwärtsstreuung an, die auf Kügelchen mit einer Korngröße von 6,0 μm zurückzuführen ist.
Nach der Hybridisierung des oben erwähnten PCR Produkts (Target) an die zwei Arten von Kügelchen mit den Korngrößen von 4,5 μm und 6,0 μm, sind die Kügelchen durch ein Durchflußcytometer durchgeströmt worden, um die Fluoreszenzintensitäten zu messen, darauf basierend sind die Fluoreszenzintensitätshistogamme erzeugt worden. Die 5A zeigt ein Fluoreszenzintensitätshistogamm für Kügelchen mit einer Korngröße von 4,5 μm, während 5B ein Fluoreszenzintensitätshistogramm für Kügelchen mit einer Korngröße von 6,0 μm zeigt.
Beide 5A und 5B, zeigen zwei Peaks in den jeweiligen Fluoreszenzintensitätshistogammen. Das deutet darauf hin, dass ein Gemisch von jenen Kügelchen vorliegt, die Fluoreszenz aufgrund der Bindung durch Hybridisierung des Fluoreszenz-markierten PCR-Produkts daran emittieren, und solchen Kügelchen, die keine Fluoreszenz aufgrund des Fehlens einer Bindung des PCR-Produktes emittieren. Und zwar stellt das Fluoreszenzintensitätshistogamm der 5A oder 5B die Information bereit, dass das Target an entweder der normalen oder der abweichenden Probe, und nicht an beiden, gebunden hat. Wenn das Target sowohl an der normalen als auch den abweichenden Proben gebunden hätte, würde der Fluoreszenzmarker in alle Kügelchen eingebracht worden sein, und nur ein einziger Peak würde in dem Fluoreszenzintensitätshistogramm des Durchflußcytometers an der Position, entsprechend des oben erwähnten Peaks mit einer größeren Intensität, erschienen sein. Somit kann in Übereinstimmung mit der Erfindung die Information über SNPs basierend auf der Anzahl der Peaks erhalten werden, die in dem Fluoreszenzintensitätshistogamm des Durchflußcytometers erscheinen.
Das Durchflußcytometer kann die Vorwärtsstreuung und die Fluoreszenz gleichzeitig für jedes der Kügelchen messen, die nacheinander durchgeflossen sind. Somit speichert das Durchflußcytometer ein Paar von Daten über die Vorwärtsstreuungsintensität und die Daten über Fluoreszenzintensität, die gemessen werden, da jedes Kügelchen den Detektor in dem Durchflußcytometer passiert. Danach werden die Daten gemäß der Stärke (entsprechend der Korngröße des Kügelchens) der Intensität der Vorwärtsstreuung klassifiziert, wie in den 2 und 4 gezeigt wurde. Für jede Gruppe von Daten mit der gleichen Intensität der Vorwärtsstreuung ist ein Histogramm erstellt worden, wie zum Beispiel eines, das in den 3A, 3B, 5A und 5B gezeigt wurde. Auf diese Art und Weise kann die Information darüber erhalten werden, wie das Target an die unterschiedlichen Proben hybridisiert worden ist, die an die Kügelchen der gleichen Korngröße gebunden waren, das ist die Information darüber, ob das Target vom Homotyp oder von Heterotyp ist. Durch die Verbindung von Kügelchen mit einer Korngröße mit einem Gen oder einer DNA-Nukleotidsequenz können SNPs von verschiedenen Genen oder DNA-Nukleotidsequenzen gleichzeitig unter Verwendung von Kügelchen mit unterschiedlichen Korngrößen detektiert werden.
Nachstehend wird ein Verfahren zum Erhalt noch detaillierterer Informationen beschrieben, wie zum Beispiel die Art der substituierten Base, zusätzlich zu der Information darüber, ob das SNP einer DNA Nukleotidsequenz vom Homo- oder Heterotyp ist. Das folgende Beispiel verwendet eine Art von Kügelchen der gleichen Korngröße, um ein SNP eines spezifischen Gens zu detektieren (an einer einzigen Stelle).
Zunächst sind, im Hinblick auf ein Gen von Interesse, die Kügelchen A und die Kügelchen B hergestellt worden. Kügelchen A hat an seiner Oberfläche eine Probe kovalent gebunden, an welche eine Nukleotidsequenz hybridisieren würde, welche keine SNPs hat. Kügelchen B hat an seiner Oberfläche eine Probe kovalent gebunden, an welche eine Nukleotidsequenz eines SNP hybridisieren würde. Die Kügelchen A und die Kügelchen B sind in unterschiedlichen Teilen gemischt worden, wie zum Beispiel A:B = 1:2. Eine Stelle von Interesse in einem Gen, welches von einer Testperson bestimmt worden ist, ist mit einem Fluoreszenzmarker markiert worden und PCR-amplifiziert worden, um eine Probe herzustellen. Diese Probe ist dem Gemisch der Kügelchen A und der Kügelchen B hinzugefügt worden und hybridisiert worden. Anschließend sind die Kügelchen, die die Probe auf ihrer Oberfläche haben, an welche ein Target an der Probe hybridisiert hat, in einem Durchflußcytometer gemessen worden.
Die 6A bis 6C zeigen drei mögliche Muster der resultierenden Fluoreszenzintensitätshistogramme. Die 6A zeigt das Muster in dem Fall, wo der Fluoreszenzmarker in die Kügelchen A eingebracht worden ist, die weniger sind als Kügelchen B, nämlich wenn dort keine SNPs in dem Gen der Testperson sind. Wenn das Gemischverhältnis von den Kügelchen A und den Kügelchen B so ist, daß A:B = 1:2 ist, würde das Verhältnis der Zählung für Peak 61A und der Zählung für Peak 61B idealerweise 2:1 sein. Die 6B zeigt das Muster für den Fall, wo der Fluoreszenzmarker in die Kügelchen B eingeführt worden ist, die mehr sind als die Kügelchen A, nämlich wenn dort ein SNP in dem Gen der Testperson ist. In diesem Fall würde das Verhältnis der Zählung für Peak 62a und der Zählung für Peak 62b idealerweise 1:2 sein. Die 6C zeigt das Muster (Heterotyp) in dem Fall, wo der Fluoreszenzmarker in sowohl die Kügelchen A und die Kügelchen B eingeführt worden wäre, nämlich, wenn das Gen in der Testperson sowohl Nukleotidsequenzen ohne SNPs als auch Nukleotidsequenzen mit SNPs hat. In diesem Fall ist nur ein Peak 63 in dem Fluoreszenzintensitätshistogramm.
Somit kann, durch Durchführung der obigen Untersuchung und Bestimmung, welcher der 6A bis 6C das Muster des erhaltenen Fluoreszenzintensitätshistogramm entspricht, das SNP in der Region von Interesse in dem Gen der Testperson detektiert werden.
Als nächstes, eine Meßmethode für den Fall, wo zwei Arten von Basen vorhanden sind, die durch SNPs substituiert sein können. In diesem Fall werden, mit Hinblick auf das Gen von Interesse, die Kügelchen A, die Kügelchen B und die Kügelchen C hergestellt. Die Kügelchen A haben an ihrer Oberfläche eine Probe kovalent gebunden, an welche die Nukleotidsequenz ohne SNP hybrisieren wird. Die Kügelchen B haben eine Probe kovalent an ihrer Oberfläche gebunden, an welche die Nukleotidsequenz eines SNP, in welchem eine Base an der Stelle des Polymorphismus durch eine erste Base substituiert ist, hybridisieren wird. Die Kügelchen C haben eine Probe an ihrer Oberfläche kovalent gebunden, an welche die Nukleotidsequenz eines SNPs hybridiseren wird, in welchem die Base an der Stelle des Polymorphismus durch eine zweite Base, die von der ersten Base unterschiedlich ist, substituiert ist. Diese drei Arten von Kügelchen sind in unterschiedlichen Anteilen gemischt worden, wie zum Beispiel A:B:C = 1:3:5. Dann ist ein Target, das durch eine PCR-Amplifikation einer Fluoreszenz-markierten Region von Interesse in dem Gen, bestimmt von einer Testperson, erhalten wurde, dem Gemisch der drei Arten von Kügelchen A, B und C hinzugefügt worden und hybridisiert worden. Danach sind die Kügelchen mit der Probe an ihrer Oberfläche, an welche das Target hybridisiert hat, durch das Durchflußcytometer gemessen worden.
Die 7A bis 7F zeigen mögliche Muster der resultierenden Fluoreszenzintensitätshistogramme. Die 7A zeigt den Fall, wo ein Fluoreszenzmarker in die Kügelchen A eingefügt worden ist, die am wenigsten in der Anzahl sind, nämlich wenn keine SNPs in dem Gen der Testperson vorhanden sind. Wie oben erwähnt, wenn A:B:C = 1:3:5 ist, würde das Verhältnis der Zählungen für Peak 71A und das für Peak 71B idealerweise (3 + 5):1 = 8:1 sein. Die 7B zeigt den Fall, wo der Fluoreszenzmarker in die Kügelchen B eingefügt worden ist, nämlich wenn SNPs in dem Gen der Testperson durch Substitution mit einer ersten Base vorhanden sind. In diesem Fall würde das Verhältnis der Zählungen für Peak 72a und das für Peak 72b idealerweise 6:3 = 2:1 sein. Die 7C zeigt das Muster in dem Fall, wo der Fluoreszenzmarker in die Kügelchen C eingefügt wurde, nämlich wenn SNPs in dem Gen der Testperson durch Substitution mit der zweiten Base vorhanden sind. In diesem Fall würde das Verhältnis der Zählungen für Peak 73a und das für Peak 73b idealerweise 4:5 sein.
Die 7D zeigt das Muster in dem Fall, wo der Fluoreszenzmarker in die Kügelchen A und die Kügelchen B eingefügt worden ist, nämlich wenn das Gen von der Testperson eine Nukleotidsequenz enthält, die kein SNP hat und eine Nukleotidsequenz, die ein SNP aufgrund einer Substitution mit der ersten Base gleichzeitig hat. In diesem Fall würde das Verhältnis der Zählungen für Peak 74a und das für Peak 74b idealerweise 5:4 sein. Die 7E zeigt das Muster in dem Fall, wo der Fluoreszenzmarker in die Kügelchen A und die Kügelchen C eingefügt worden ist, nämlich wenn das Gen der Testperson gleichzeitig eine Nukleotidsequenz ohne SNP und eine Nukleotidsequenz enthält, die ein SNP aufgrund einer Substitution mit der zweiten Base enthält. In diesem Fall würde das Verhältnis der Zählungen für Peak 75a und das für Peak 75b idealerweise 3:6 = 1:2 sein. Die 7F zeigt das Muster in dem Fall, wo der Fluoreszenzmarker in die Kügelchen B und die Kügelchen C eingefügt worden ist, nämlich wenn das Gen der Testperson gleichzeitig eine Nukleotidsequenz enthält, die ein SNP aufgrund der ersten Base hat und eine Nukleotidsequenz, die SNPs aufgrund der Substitution mit der zweiten Base hat. In diesem Fall würde das Verhältnis der Zählungen für Peak 76a und das für Peak 76b idealerweise 1:8 sein.
Somit kann, selbst wenn zwei Arten von Basen, die möglicherweise bei einem SNP substituiert sind, das SNP in der Region von Interesse im Gen der Testperson detektiert werden, indem bestimmt wird, zu welchem der 7A bis 7F das Fluoreszenzintensitätshistogramm-Muster gehört. Selbst wenn drei oder mehr Basen, die bei einem SNP substituiert sein können, vorhanden sind, kann bestimmt werden, ob das Gen der Testperson ein SNP oder, wenn ja, welche Art von Polymorphismus das ist, unter Verwendung der Fluoreszenzintensitätshistogramme durch die gleiche Methode bestimmt werden. Im Speziellen werden Kügelchen, die mehrere Targets auf ihrer Oberfläche gebunden haben, zu unterschiedlichen Teilen gemischt. Das Gemisch wird dann mit einem Target gemischt, welches durch eine PCR-Amplifikation einer Fluoreszenz-markierten Nukleotidsequenz einer Region des Gens erhalten wird, wo ein SNP vorhanden sein kann und hybridisiert. Dann werden die hybridisierten Kügelchen von einem Durchflußcytometer gemessen.
Die 8 zeigt schematisch ein System für die Wiedergewinnung der Kügelchen und Biopolymere, die auf der Oberfläche der Kügelchen interagieren, nach der Messung in dem Durchflußcytometer. Dieses System umfaßt die Filter 85, 86 und 87, die unterschiedliche Maschen haben, die in mehreren Stufen in einem Durchflußweg 80 des Durchflußcytometers angeordnet sind. Wie zum Beispiel, wenn die Kügelchen der drei Korngrößen von 4,5 μm, 6,0 μm und 10,0 μm verwendet werden, sind der Filter 85 mit einer Maschengröße von 8 μm, der Filter 86 mit einer Maschengröße von 5 μm und der Filter 87 mit einer Maschengröße von 3 μm in dieser Anordnung stromaufwärts angeordnet. Diese Anordnung der Filter 85 bis 87 an dem Durchflußauslaß, die entsprechend für die Korngrößen der Kügelchen gewählt worden sind, macht es möglich, die Kügelchen zurück zu gewinnen, welche, zusammen mit der Lösung, normalerweise als flüssiger Abfall nach Beendigung der Messung in dem Durchflußcytometer abgeführt werden. Wie gezeigt, passieren die Kügelchen der Korngröße von 4,5 μm die Filter 85 und 86, werden aber durch den Filter 87 der Maschenweite von 3 μm erfaßt, der am äußersten stromabwärts angeordnet ist. Die Kügelchen mit einer Korngröße von 6,0 μm passieren den Filter 85 mit einer Maschenweite von 8 μm, werden aber durch den Filter 86 mit einer 5 μm Maschenweite erfaßt. Die Kügelchen mit einer Korngröße von 10 μm werden durch den Filter 85 erfaßt, mit einer Maschenweite von 8 μm, der am äußersten stromaufwärts angeordnet.
Somit können in Übereinstimmung mit der Erfindung Kügelchen durch ein einfaches Verfahren identifiziert werden und mehrere Arten von Proben können gleichzeitig gemessen werden. Die Erfindung macht es auch möglich, SNPs einer DNA Nukleotidsequenz durch eine einfache Methode zu bestimmen. Sequenzprotokoll

Claims

Ziel-Nachweisverfahren zum Nachweisen eines SNP in einer DNA-Nukleotidsequenz, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Durchführen einer Hybridisierungsreaktion zwischen einer DNA-Nukleotidsequenz und einer Sonde durch Mischen, in einer Probenlösung, enthaltend eine Fluoreszenz-markierte DNA-Nukleotidsequenz, von Kügelchen einer ersten Korngröße, die eine erste Sonde auf ihrer Oberfläche immobilisiert haben, wobei die erste Sonde mit einer DNA-Nukleotidsequenz hybridisiert, die eine Stelle eines Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) hat, und von Kügelchen einer zweiten Korngröße, die eine zweite Sonde auf ihrer Oberfläche immobilisiert haben, wobei die zweite Sonde von der ersten Sonde unterschiedlich ist, und wobei die zweite Sonde mit besagter DNA hybridisiert, die eine Stelle eines Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) hat, wobei jedoch eine Base durch eine unterschiedliche Base an der Stelle des Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) substituiert ist, zeitgleiches Nachweisen, nach der Hybridisierungsreaktion zwischen den Sonden und den DNA-Nukleotidsequenzen, von einer Vorwärtsstreuung und Fluoreszenz, indem man die Kügelchen in einem Fluß-Cytometer fließen läßt, und Identifizieren der Korngröße der Kügelchen, basierend auf der Intensität der Vorwärtsstreuung.