DE60029138T2

DE60029138T2 - Verwendung von Indolinonverbindungen zur Herstellung von Pharmazeutika für die Modulation der Funktion c-kit Proteintyrosinkinase

Info

Publication number: DE60029138T2
Application number: DE60029138T
Authority: DE
Inventors: Ken San Mateo LIPSON; Gerald San Francisco MCMAHON
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: AU3436301A; US20040002534A1; US7211600B2; JP5004392B2; DE60029138D1; WO2001045689A3; CY1106165T1; PT1255536E; HK1050642A1; EP1255536B1; WO2001045689A2; EP1255536A2; NZ519697A; CA2395461A1; DK1255536T3; MXPA02006263A; CA2395461C; US20020010203A1; JP2004500363A; US20050288353A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die folgende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Verbindungen und Zusammensetzungen zur Hemmung von Zellproliferationsstörungen. Die Erfindung ist insbesondere zur Hemmung von Zellproliferationsstörungen, die sich durch die Überaktivität und/oder unangemessene Aktivität einer c-kit Kinase auszeichnen, nützlich.
Hintergrund der Erfindung
Die folgende Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung wird bereitgestellt, um beim Verständnis der Erfindung zu helfen, aber es wird nicht zugestanden, dass sie Stand der Technik für die Erfindung beschreibt oder darstellt.
Der Kit-Signalweg ist für die fötale Keimdrüsenentwicklung kritisch und spielt weiter eine Rolle bei der Fertilität von Erwachsenen (Mauduit et al. (1999) Human Reproduction Update 5: 535–545). Die Spermatogenese ist in Abwesenheit von SCF (Ohta et al. (2000) Development 127: 2125–2131) oder der Fähigkeit von Kit über den PI3 Kinase Signalweg (Blume-Jensen et al. (2000) Nature Genetics 24: 157–162; Kissel et al. (2000) EMBO Journal 19: 1312–1326) Signale weiterzuleiten gehemmt. Es wurde beobachtet, dass die Expression von Kit in subfertilen Hoden geringer ist als in normalem Hodengewebe (Feng et al. (1999) Fertility & Sterility 71: 85–89). Die Kit-Signalwirkung ist ebenfalls für die Oogenese und die Follikulogenese wichtig (Parrott & Skinner (1999) Endocrinology 140: 4262–4271 Driancourt et al. (2000) Reviews of Reproduction 5: 143–152). Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass Kit-Kinase Inhibitoren sowohl die männliche als auch die weibliche Fruchtbarkeit verringern würden.
Als ein Schlüsselmediator der Mastzellenfunktion, kann Kit eine Rolle bei Pathologien, die mit Mastzellen in Verbindung stehen, spielen. Zum Beispiel wurden Mastzellen mit interstitieller Fibrose bei der chronischen Abstoßung von menschlichen allogenen Nierentransplantaten in Verbindung gebracht (Pardo et al. (2000) Virchows Archiv 437: 167–172). Mastzellen wurden ebenfalls bei der Abstoßung von allogenen Lebertransplantaten (Yamaguchi et al. (1999) Hepatology 29: 133–139) und bei der Leberfibrose, wo hepatische Sternzellen SCF herstellen, das die Mastzellen rekrutiert (Gaca et al. (1999) J. Hepatology 30: 850–858), vermutet. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass Kit-Kinase Inhibitoren dabei helfen können, die Organabstoßung und Fibrose zu verhindern.
Mastzellen wurden ebenfalls bei der Pathologie von Multipler Sklerose (Secor et al. (2000) J. Experimental Medicine 191: 813–822) und ischämischer Reperfusionsverletzung (Andoh et al. (1999) Clinical & Experimental Immunology 116: 90–93) in experimentellen Modellen unter Verwendung von Mäusen mit mutierten Kit-Rezeptoren, denen Mastzellen fehlen, vermutet. In beiden Fällen war die Pathologie der Krankheit relativ zu Mäusen mit normalen Kit und Mastzellpopulationen deutlich abgeschwächt. Somit lässt die Rolle von Mastzellen in diesen Krankheiten vermuten, dass Kit-Kinase Inhibitoren nützliche Therapeutika sein könnten.
Die zelluläre Signaltransduktion ist ein grundlegender Mechanismus, durch den extrazelluläre Reize in das Innere von Zellen weitergeleitet werden und im Folgenden verschiedene zelluläre Prozesse regulieren. Einer der biochemischen Schlüsselmechanismen der Signaltransduktion schließt die reversible Phosphorylierung von Proteinen ein. Die Phosphorylierung von Polypeptiden reguliert die Aktivität von reifen Proteinen durch das Verändern ihrer Struktur und Funktion. In Proteinen befindet sich Phosphat am häufigsten an den Hydroxylresten (-OH) von Serin, Threonin oder Tyrosinaminosäuren.
Enzyme, die die Phosphorylierung von zellulären Effektoren vermitteln, fallen im Allgemeinen unter zwei Klasen. Die erste Klasse besteht aus Proteinkinasen, die einen Phosphatrest von Adenosintriphosphat auf Proteinsubstrate übertragen. Die zweite Klasse besteht aus Proteinphosphatasen, die Phosphatreste von Phosphorylproteinsubstraten hydrolysieren. Die entgegengesetzten Funktionen von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen gleichen den Fluss von Signalen in Signaltransduktionsprozessen aus und regulieren diesen.
Proteinkinasen und Proteinphosphatasen werden im Allgemeinen in zwei Gruppen aufgeteilt: Proteine von Rezeptor- und Nicht-Rezeptorart. Die meisten Proteintyrosinphosphatasen vom Rezeptortyp enthalten zwei konservierte katalytische Domänen, von denen jede ein Segment von 240 Aminosäureresten umfasst. Saito et al., 1991, Cell Growth and Diff. 2: 59–65. Rezeptorproteintyrosinphosphatasen können ferner basierend auf der Verschiedenheit der Aminosäuresequenz ihrer extrazellulären Domänen unterklassifiziert werden. Saito et al., supra; Krueger, et al., 1992, Proc. Natl. Acad Sci USA 89: 7417–7421.
Proteinkinasen und Proteinphosphatasen werden ebenfalls typischerweise basierend auf den Aminosäuren, auf die sie wirken, in drei Klassen eingeteilt. Einige katalysieren die Addition oder Hydrolyse von Phosphat nur bei Serin oder Threonin, einige katalysieren die Addition oder Hydrolyse von Phosphat nur bei Tyrosin und einige katalysieren die Addition oder Hydrolyse von Phosphat bei Serin, Threonin und Tyrosin.
Tyrosinkinasen können die katalytische Aktivität von anderen Proteinkinasen, die an der Zellproliferation beteiligt sind, regulieren. Proteinkinasen mit unangemessener Aktivität sind ebenfalls an einigen Arten von Krebs beteiligt. Ein abnormal erhöhter Grad an Zellproliferation wird mit Rezeptor- und Nicht-Rezeptor-Proteinkinasen mit unregulierter Aktivität in Verbindung gebracht.
Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der zellulären Proliferation, wird angenommen, dass Proteinkinasen an Zelldifferenzierungsprozessen beteiligt sind. Zelldifferenzierung tritt in einigen Zellen bei Stimulation mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) auf. Die zelluläre Differenzierung ist durch Membrankräuselung, Zellabflachung und Erhöhung der Zelladhäsion charakterisiert. (Chao, 1992, Cell 68: 995–997).
Bei Bemühungen neuartige Behandlungsverfahren für Krebs und andere Krankheiten zu entdecken, haben biomedizinische Forscher und Chemiker Moleküle, die die Funktion von Proteinkinasen inhibieren, entworfen, synthetisiert und getestet. Einige kleine organische Moleküle bilden eine Klasse von Verbindungen, die die Funktion von Proteinkinasen modulieren. Beispiele von Molekülen, für die berichtet worden ist, dass sie die Funktion von Proteinkinasen hemmen, sind bis-monozyklische, bizylische oder heterozyklische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinyl-Azaindolderivate (PCT WO 94/14808), 1-Cyclopropyl-4-Pyridyl-Chinolone (US Patent Nr. 5,330,992), Styrolverbindungen (von Levitzki et al., US Patent Nr. 5,217,999 und betitelt "Styrolverbindungen, die EGF Rezeptorproteintyrosinkinase hemmen", Lyon & Lyon Docket Nr. 208/050), Styrol-substituierte Pyridylverbindungen (US Patent Nr. 5,302,606), bestimmte Chinazolinderivate (EP Anmeldung Nr. 0 566 266 A1), Seleoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), trizyklische polyhydroxylierte Verbindungen (PCT WO 92/21660) und Benzylphosphorsäureverbindungen (PCT WO 91/15495).
Die Verbindungen, die Zellmembranen überqueren können und gegenüber der Hydrolyse durch Säuren resistent sind, sind eventuell vorteilhafte Therapeutika, da sie, nachdem sie oral an Patienten verabreicht worden sind, gut bioverfügbar werden können. Viele dieser Proteinkinaseinhibitoren hemmen die Funktion von Proteinkinasen jedoch nur schwach. Zusätzlich hemmen viele eine Reihe von Proteinkinasen und verursachen daher als Therapeutika für Krankheiten vielfältige Nebenwirkungen.
Trotz wesentlicher Fortschritte, die bei der Entwicklung von Verbindungen für die Behandlung von Krebs gemacht worden sind, besteht auf dem Gebiet ein Bedarf bestimmte Strukturen und Substitutionsmuster, die Verbindungen bilden, die in der Lage sind die Funktion von bestimmten Proteinkinasen zu modulieren, zu identifizieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die folgende Erfindung richtet sich auf die Verwendung von Indolinonverbindungen zur Modulation der Funktion von Proteinkinasen mit diesen Verbindungen.
Die folgende Erfindung zeichnet sich durch Indolinonverbindungen, die wirksam Rezeptor-Proteinkinasen der c-kit Familie inhibieren, und verwandte Produkte und Verfahren aus. Andere Inhibitoren und/oder Aktivatoren von c-kit Proteinkinase können durch das Zufügen von chemischen Substituenten zu einer unsubstituierten Indolinonverbindung (siehe Formeln 1 und 2, unten) erhalten werden. Die Verbindungen, wie sie in der Erfindung verwendet werden, liefern Therapeutika und/oder Prophylaktika für Krankheiten, die mit einer oder mehreren funktionellen c-kit Proteinkinasen in Verbindung stehen. In diese Klasse von Krankheiten fallen bestimmte Arten von Krebs zusammen mit bestimmten Immunstörungen, die mit der Überproduktion oder Überstimulation von Mastzellen in Verbindung stehen. Verbindungen können so modifiziert werden, dass sie für ihr Ziel oder ihre Ziele spezifisch sind und folglich wenige Nebenwirkungen verursachen werden. Diese Eigenschaften sind wesentliche Verbesserungen gegenüber gegenwärtig verwendeten Krebstherapeutika, die vielfältige Nebenwirkungen erzeugen und die Patienten auf schädliche Weise schwächen.
Die Verbindungen, die in der Erfindung verwendet werden, verkleinern oder beseitigen bestimmte Arten von soliden Tumoren und Leukämien durch das Inhibieren der Aktivität der c-kit Rezeptor-Proteinkinasen oder werden zumindest das Tumorwachstum und/oder Metastasen modulieren oder inhibieren. Bestimmte Arten von Krebs, wie zum Beispiel kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC), exprimieren sowohl die c-kit Rezeptor-Proteinkinase als auch den Stammzellfaktor (SCF), einen c-kit Liganden.
Obwohl ein genaues Verständnis der Mechanismen, durch den Verbindungen Phosphotyrosinkinasen (PTKs) (z. B. die c-kit Rezeptorkinase, eine Transmembranwachstumsfaktorrezeptor-Tyrosinkinase) hemmen, nicht erforderlich ist, um die vorliegende Erfindung durchzuführen, wird angenommen, dass die Verbindungen mit den Aminosäuren der katalytischen Region der PTKs wechselwirken. PTKs besitzen typischerweise eine zwei-lappige Struktur und ATP scheint in der Nische zwischen den zwei Lappen in einer Region zu binden, in der zwischen den PTKs die Aminosäuren konserviert sind; es wird angenommen, dass Inhibitoren von PTKs über nicht kovalente Wechselwirkungen, wie zum Beispiel Wasserstoffbrückenbindungen, Van der Waals Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und ionische Bindung, in der gleichen allgemeinen Region an die PTKs binden, in der ATP an die PTKs bindet. Insbesondere wird angenommen, dass der Oxindolbestandteil (siehe Formel III, unten) der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in demselben allgemeinen Bereich bindet, der durch den Adenin-Ring von ATP besetzt wird. Spezifität eines PTK Inhibitors für eine bestimmte PTK kann durch Wechselwirkungen zwischen den Bestandteilen um den Oxindolkern herum mit Aminosäuredomänen, die für die einzelnen PKs spezifisch sind, verliehen werden. Somit können andere Substituenten zu der vorzugsweisen Bindung an bestimmte PKs beitragen. Die Fähigkeit diese Verbindungen, die an verschiedenen ATP Bindungsstellen aktiv sind, auszuwählen, macht sie beim Targeting jedes Proteins mit so einer Stelle, einschließlich nicht nur Proteintyrosinkinasen, sondern ebenfalls Serin/Threoninkinasen, nützlich. Somit haben solche Verbindungen einen Nutzen für in vitro Assays mit solchen Proteinen und für therapeutische in vivo Wirkung über solche Proteine. Wie oben erwähnt, exprimieren zum Beispiel bestimmte Arten von Krebs sowohl die c-kit Rezeptor-Proteinkinase als auch den Stammzellfaktor (SCF) und diese Paarung könnte eine autokrine Schleife, die das Wachstum dieser Krebszellen stimuliert, darstellen. Daher könnte die Inhibition der c-kit Proteinkinase diese autokrine Schleife unterbrechen und dadurch das Tumorwachstum verzögern und/oder Tumore über normale Apoptosemechanismen beseitigen.
Somit stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt die Verwendung wie in Anspruch 1 definiert für die Behandlung oder das Verhindern eines abnormalen Zustandes wie unten definiert in einem Organismus bereit. Der abnormale Zustand ist mit einer Anomalie in einem Signaltransduktionsweg, der durch eine Wechselwirkung zwischen einer c-kit Kinase und einem natürlichen Bindungspartner vermittelt wird, verbunden. Die Zusammensetzung wird in einer therapeutisch wirksamen Menge einer Indolinonverbindung an den Organismus verabreicht. Die Indolinonverbindung moduliert die Wechselwirkung zwischen der c-kit Kinase und einem natürlichen Bindungspartner. Daher wird vorhergesagt, dass das Fördern oder Unterbrechen (vorzugsweise Unterbrechen) dieser Wechselwirkung therapeutische Vorteile für eine bestimmte Patientenpopulation, die einer solchen Behandlung bedarf, besitzt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ausmaß der Signalweiterleitung über die c-kit Kinase abnormal und die Verbindung befördert oder unterbricht die Signalweiterleitung.
Der Ausdruck "behandeln" bezieht sich darauf, eine therapeutische Wirkung zu besitzen und einen abnormalen Zustand in dem Organismus zumindest teilweise zu lindern oder zu beseitigen. Der Ausdruck "behandeln" bezieht sich vorzugsweise auf das Lindern eines Symptoms des abnormalen Zustands in einer Gruppe von Patienten, an die das Indolinon verabreicht wird, relativ zu einer Kontrollgruppe, die das Indolinon nicht erhält. Die Wirkung der Behandlung kann durch das Messen einer Veränderung oder dem Fehlen einer Veränderung im Zellphänotyp, einer Veränderung oder dem Fehlen einer Veränderung in der Zellproliferation, einer Veränderung oder dem Fehlen einer Veränderung in der katalytischen Aktivität dieser c-kit Proteinkinase und einer Veränderung oder dem Fehlen einer Veränderung in der Wechselwirkung zwischen der Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner überwacht werden. Der Ausdruck "behandeln" oder "Behandlung" bedeutet nicht notwendigerweise eine vollständige Heilung. Jede Linderung jedes ungewünschten Symptoms der Krankheit zu jedem Ausmaß oder ein Verlangsamen des Fortschreitens der Krankheit kann als Behandlung angesehen werden. Ferner kann die Behandlung Handlungen einschließen, die das Gesamtwohlbefinden des Patienten oder dessen Erscheinungsbild verschlechtern. Zum Beispiel wird die Verabreichung einer Chemotherapie in Krebspatienten, die die Patienten sich "kränker" fühlen lässt, noch als Behandlung angesehen.
Der Ausdruck "katalytischer Aktivität", der oben im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, definiert die Rate, mit der eine Proteinkinase ein Substrat phosphoryliert. Die katalytische Aktivität kann zum Beispiel durch das Bestimmen der Menge des Substrats, das in ein Produkt umgewandelt wird, als Funktion der Zeit gemessen werden. Die Phosphorylierung eines Substrats findet am aktiven Zentrum einer Proteinkinase statt. Das aktive Zentrum ist normalerweise eine Vertiefung, in der das Substrat an die Proteinkinase bindet und phosphoryliert wird.
Der Ausdruck "Substrat", wie oben und hierin verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das durch eine Proteinkinase phosphoryliert wird. Das Substrat ist vorzugsweise ein Peptid und bevorzugter ein Protein.
Der Ausdruck "verhindern" bezieht sich auf das Verringern der Wahrscheinlichkeit, dass ein Organismus an einem abnormalen Zustand erkrankt oder diesen entwickelt. Der Ausdruck "verhindern" bezieht sich vorzugsweise auf das Verringern des Prozentsatzes an Individuen, die einen abnormalen Zustand entwickeln, relativ zu einer Kontrollgruppe, die kein Indolinon verabreicht bekommt.
Der Ausdruck "abnormaler Zustand" bezieht sich auf eine Funktion in den Zellen oder Geweben eines Organismus, die von den normalen Funktionen in dem Organismus abweicht. Ein abnormaler Zustand kann sich auf Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder Zellüberleben beziehen. Abnormale Zustände schließen Mastozytose, die Gegenwart von einem oder mehreren Mastzelltumoren, Asthma, allergie-assoziierte chronische Rhinitis und gastrointestinale Stromatumoren ein. In einer bevorzugten Ausführungsform treten diese abnormalen Zustände, wie zum Beispiel Mastzelltumore und Mastozytose, in nicht menschlichen Organismen auf und können somit in veterinärmedizinischen Anwendungen verhindert oder behandelt werden.
Abnormale Zellüberlebensbedingungen beziehen sich auf Bedingungen, in denen Signalwege des programmierten Zelltods (Apoptose) aktiviert oder außer Kraft gesetzt werden. Eine Reihe von Proteinkinasen steht in Verbindung mit dem Apoptosesignalweg. Abweichungen in der Funktion jeder dieser Proteinkinasen können zu Zellimmortalität oder vorzeitigem Zelltod führen.
Der Ausdruck "Funktion", wie im Zusammenhang mit einer Proteinkinase oben verwendet, bezieht sich auf die zelluläre Rolle einer Proteinkinase, vorzugsweise einer c-kit Kinase. Die Familie der Proteinkinasen schließt Mitglieder ein, die viele Schritte in Signalkaskaden regulieren, einschließlich Kaskaden, die das Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Genexpression, Muskelkontraktion, Glukosemetabolismus, zelluläre Proteinsynthese und die Regulation des Zellzyklus kontrollieren. Die "Funktion" einer Membranrezeptorkinase ist gewöhnlich ein Signal von außerhalb einer Zellmembran in das Innere einer Zelle weiterzuleiten. Um dies zu erreichen, kann sie eine oder alle dieser anderen Funktionen durchführen: Binden eines Liganden, Dimerisieren an eine andere Membranrezeptorkinase, Phosphorylieren von anderen Proteinen innerhalb der Zelle, Binden von anderen Proteinen innerhalb der Zelle und Verursachen der Lokalisation von Proteinen innerhalb der Zelle.
Der Ausdruck "Organismus" bezieht sich auf jedes lebende Wesen, das zumindest aus einer Zelle besteht. Ein Organismus kann so einfach wie eine eukaryotische Zelle oder so komplex wie ein Säugetier sein. Der Organismus ist vorzugsweise ein Säugetier, noch bevorzugter ein Mensch.
Der Ausdruck "Säugetier" bezieht sich vorzugsweise auf solche Organismen wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe und Ziegen, bevorzugter auf Katzen, Hunde, Affen und Menschenaffen. In bevorzugten Ausführungsformen schließt der abnormale Zustand, der mit Säugetieren in Verbindung steht, Mastozytose und das Vorhandensein von einem oder mehreren Mastzelltumoren ein.
Der Ausdruck "Abweichung" bezieht sich auf eine Proteinkinase, zum Beispiel eine c-kit Kinase, die in einem Organismus über- oder unterexprimiert wird, mutiert ist, so dass ihre katalytische Aktivität geringer oder höher als Proteinkinaseaktivität des Wildtyps ist, mutiert, so dass sie nicht mehr mit einem natürlichen Bindungspartner wechselwirken kann, nicht länger in einer autokrinen Schleife innerhalb der Zelle funktionieren kann, nicht mehr durch eine andere Proteinkinase oder Proteinphosphatase modifiziert wird, oder nicht mehr mit einem natürlichen Bindungspartner interagiert. Vorzugsweise schließt die Abweichung übermäßige oder fehlende Signalweiterleitung bei der Wechselwirkung mit einem natürlichen Bindungspartner ein.
Der Ausdruck "Signaltransduktionsweg" bezieht sich auf Moleküle, die ein extrazelluläres Signal durch die Zellmembran weiterleiten, damit dieses ein intrazelluläres Signal wird. Dieses Signal kann dann eine zelluläre Antwort stimulieren. Die Polypeptidmoleküle, die an Signaltransduktionsprozessen beteiligt sind, schließen Rezeptor- und Nicht-Rezeptor-Proteintyrosinkinasen, Rezeptor und Nicht-Rezeptor-Proteinphosphatasen, Proteine, die SRC Homologie 2 und 3 Domänen enthalten, Phosphotyrosin-bindende Proteine (SCR Homologie 2 (SH2) und Phosphotyrosin-bindende (PTB und PH) Domänen enthaltende Proteine), prolinreiche Bindungsproteine (SH3 Domänen enthaltende Proteine), GTPasen, Phosphodiesterasen, Phospholipasen, Prolylisomerasen, Proteasen, Ca²⁺-bindende Proteine, cAMP bindende Proteine, Guanylcyclasen, Adenylylcyclasen, NO-erzeugende Proteine, Nukleotidaustauschfaktoren und Transkriptionsfaktoren ein.
Der Ausdruck "vermittelt" bezieht sich auf die Beteiligung bei der Kontrolle oder der Wirkung der Interaktion zwischen der c-kit Kinase und den natürlichen Bindungspartnern auf die Abweichung in dem Signaltransduktionsweg. Somit enthält der Signaltransduktionsweg, der eine Abweichung besitzt und mit einem abnormalen Zustand in Verbindung steht, eine c-kit Kinase in Wechselwirkung mit einem natürlichen Bindungspartner.
Die "Wechselwirkung" eines c-kit Kinasemoleküls ist die Bindung dieses c-kit Kinasemoleküls an einen natürlichen Bindungspartner oder ein Molekül innerhalb der Zelle oder die Phosphorylierung eines anderen Proteins oder Moleküls durch ein c-kit Kinasemolekül innerhalb der Zelle oder jede andere Assoziierung von c-kit Kinase innerhalb einer Zelle. Diese Wechselwirkungen schließen nicht kovalente Wechselwirkungen, wie zum Beispiel Wasserstoffbrückenbindungen, Van der Waals Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Ionenpaarbindungen ein.
Der Ausdruck "c-kit Kinase" bezieht sich auf eine Membranrezeptor-Proteintyrosinkinase, die vorzugsweise bei der Bindung des Stammzellfaktors (SCF) an ihre extrazelluläre Domäne aktiviert wird (Yarden et al., 1987; Qiu et al., 1988). Die Rezeptortyrosinkinase c-kit Kinase enthält 5 Immunglobulin ähnliche Motive in der extrazellulären Domäne und eine cytoplasmatische "Split" Kinasedomäne, 1. Die Volllängen-Aminosäuresequenz einer c-kit Kinase ist vorzugsweise wie in Yarden, et al., 1987, EMBO J. 11: 3341–3351; und Qiu, et al., 1988, EMBO J 7: 1003–1011 dargelegt. Mutierte Versionen von c-kit Kinase werden durch den Ausdruck "c-kit Kinase" umfasst und schließen solche ein, die in zwei Klassen fallen: (1) Aufweisen einer einzelnen Aminosäuresubstitution in Codon 816 der menschlichen c-kit Kinase oder der äquivalenten Position in anderen Arten (Ma et al., 1999, J. Invest Dermatol 112: 165–170) und (2) solche, die Mutationen besitzen, die die angenommene membrannahe z-Helix des Proteins einschließen (Ma, et al., 1999, J. Biol Chem 274: 13399–13402).
Der Ausdruck "natürliche Bindungspartner" bezieht sich auf ein Polypeptid oder eine Verbindung, wie zum Beispiel ATP, die in Zellen an eine Proteinkinase binden. Natürliche Bindungspartner können eine Rolle bei der Weiterleitung eines Signals in einem Proteinkinase Signalweiterleitungsprozess spielen. Eine Veränderung bei der Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner kann in einer erhöhten oder verringerten Wahrscheinlichkeit, dass die Wechselwirkung gebildet wird, oder einer erhöhten oder verringerten Konzentration des Proteinkinase/natürlichen Bindungspartner-Komplexes zum Ausdruck kommen.
Eine "therapeutisch wirksame" Menge bedeutet eine Menge einer Verbindung, die wirksam ist, Symptome einer Krankheit zu verhindern, zu lindern, oder zu verbessern oder das Überleben des behandelten Subjekts zu verlängern. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge liegt innerhalb der Möglichkeiten des Durchschnittsfachmanns, insbesondere im Licht der hierin gelieferten detaillierten Offenbarung. Eine "therapeutisch wirksame Menge" mit Bezug auf die Behandlung von Krebs bezieht sich auf eine Menge, die ausreichend ist eines oder mehrere der folgenden Ergebnisse zu erzielen: Verringern der Größe des Krebs, Hemmen der Metastasierung des Krebs, Hemmen des Wachstums des Krebs, Stoppen des Wachstum des Krebs, Lindern der Beschwerden aufgrund des Krebs oder Verlängern des Lebens eines Patienten der an diesem Krebs leidet. Eine "therapeutisch wirksame Menge" in Bezug auf die Behandlung einer Zellproliferationsstörung, die eine andere ist als Krebs, bezieht sich auf eine Menge, die ausreichend ist eines oder mehrere der folgenden Ergebnisse zu erzielen: Hemmen des Wachstums der Zellen, die die Störung verursachen, Lindern der Beschwerden aufgrund der Störung oder Verlängern des Lebens eines Patienten der an der Störung leidet.
Der Ausdruck "Indolinon" wird verwendet, wie dieser Ausdruck gewöhnlich auf dem Gebiet verstanden wird und schließt eine große Unterklasse von substituierten oder nicht substituierten Verbindungen ein, die in der Lage sind aus einem Aldehydrest und einem Oxindolrest synthetisiert zu werden. In bevorzugten Ausführungsformen haben die Indolinone, die in dem vorliegenden Verfahren eingeschlossen sind, die Strukturen von Formeln I und II (siehe unten) und bevorzugter werden sie ausgewählt aus Verbindungen eins bis dreizehn (siehe unten).
Beispiele von beispielhaften Indolinonverbindungen und deren Synthese werden in den folgenden Anmeldungen dargelegt: (1) PCT Anmeldung Nummer US99/06468, eingereicht am 26. März 1999 durch Fong, et al. und betitelt VERFAHREN ZUR MODULATION VON PROTEINTYROSINKINASEN (Lyon & Lyon Docket Nr. 231/250 PCT), (2) provisorische US Anmeldung Nr. 60/131,192, eingereicht am 26. April 1999 von Tang, et al. und betitelt DIARYL INDOLINONVERBINDUNGEN ALS KINASEINHIBITOREN (Lyon & Lyon Docket Nr. 239/205), (3) provisorische US Anmeldung Nr. 60/132,243, eingereicht am 3. Mai 1999 von Tang, et al. und betitelt SYNTHESE VON 4-SUBSTITUIERTEN OXINDOL UND INDOLINONVERBINDUNGEN UND IHRE VERWENDUNG BEI DER BEHANDLUNG VON KRANKHEITEN (Lyon & Lyon Docket Nr. 231/251), (4) US Anmeldung Nr. 09/283,657, eingereicht am 1. April 1999 von Tang, et al. und betitelt VERFAHREN ZUR MODULATION DER FUNKTION VON PROTEINTYROSINKINASEN MIT INDOLINONVERBINDUNGEN (Lyon & Lyon Docket Nr. 241/180) und (5) US Patent Nr. 5,792,783, erteilt am 11. August 1998 an Tang et al., betitelt 3-HETEROARYL-2-INDOLINONVERBINDUNGEN FÜR DIE BEHANDLUNG VON KRANKHEITEN.
Die Verbindung, die in der Erfindung verwendet wird, ist eine der folgenden:
Verbindung Eins, unten:
Verbindung Zwei, unten:
Verbindung Drei, unten:
Verbindung Vier, unten:
Verbindung Fünf, unten:
Verbindung Sechs, unten:
Verbindung Sieben, unten:
Verbindung Acht, unten:
Verbindung Neun, unten:
Verbindung Zehn, unten:
Verbindung Elf, unten:
Verbindung Zwölf, unten:
Verbindung Dreizehn, unten:
Verbindung Vierzehn, unten:
Verbindung Fünfzehn, unten:
Verbindung Sechzehn, unten:
Die Indolinonverbindungen, die in dieser Erfindung verwendet werden, modulieren vorzugsweise die Aktivität der Proteintyrosinkinase in vitro. Diese Verbindungen zeigen vorzugsweise in einem oder mehreren in vitro Assays positive Ergebnisse für eine Aktivität, die der Behandlung der fraglichen Krankheit oder Störung entspricht (wie zum Beispiel die Assays, die in den unten stehenden Beispielen beschrieben werden). Die Proteintyrosinkinase, die durch die Indolinonverbindungen, die in der Erfindung verwendet werden, moduliert wird, ist vorzugsweise die c-kit Kinase. Beispiele der Verfahren für und Ergebnisse einer solchen Modulation werden in den unten stehenden Beispielen beschrieben.
Der Ausdruck "Modulieren" bezieht auf das Verändern der Funktion einer Proteinkinase durch das Erhöhen oder Verringern der Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner bildet. Ein Modulator erhöht vorzugsweise die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein solcher Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Verbindungspartner bildet, bevorzugter erhöht oder verringert die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Verbindungspartner bildet in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung, der gegenüber die Proteinkinase ausgesetzt wird, und am bevorzugtesten verringert die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Verbindungspartner bildet. Ein Modulator aktiviert vorzugsweise die katalytische Aktivität einer Proteinkinase, bevorzugter aktiviert oder hemmt die katalytische Aktivität einer Proteinkinase abhängig von der Konzentration der Verbindung, der die Proteinkinase ausgesetzt wird, oder am bevorzugtesten hemmt die katalytische Aktivität einer Proteinkinase.
Der Ausdruck "Komplex" bezieht sich auf eine Zusammensetzung von mindestens zwei Molekülen, die aneinander gebunden sind. Signaltransduktionskomplexe enthalten oft mindestens zwei Proteinmoleküle, die aneinander gebunden sind.
Der Ausdruck "aktiviert" bezieht sich auf das Erhöhen der Funktion einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefunktion ist vorzugsweise die Wechselwirkung mit einem natürlichen Bindungspartner und am bevorzugtesten katalytische Aktivität.
Der Ausdruck "hemmt" bezieht auf das Verringern der Funktion einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefunktion ist vorzugsweise die Wechselwirkung mit einem natürlichen Bindungspartner und am bevorzugtesten katalytische Aktivität.
Der natürliche Bindungspartner einer Proteinkinase kann an eine extrazelluläre oder intrazelluläre Region einer Proteinkinase mit hoher Affinität binden. Hohe Affinität bedeutet eine Gleichgewichtsbindungskonstante im Bereich von 10^–6 M oder weniger. Zusätzlich kann ein natürlicher Bindungspartner ebenfalls vorübergehend mit einer extrazellulären oder intrazellulären Region einer Proteinkinase wechselwirken und diese chemisch modifizieren. Natürliche Bindungspartner einer Proteinkinase werden aus einer Gruppe ausgewählt, die einschließt, aber nicht begrenzt ist auf, SRC Homologie 2 (SH2) oder 3 (SH3) Domänen, andere Phosphoryltyrosin bindende (PTB) Domänen, Guaninnukleotidaustauschfaktoren, Proteinphosphatasen, andere Proteinkinasen und Verbindungen, wie zum Beispiel ATP. Verfahren zum Bestimmen der Veränderungen in der Wechselwirkung zwischen Proteinkinasen und ihren natürlichen Bindungspartnern sind auf dem Gebiet einfach verfügbar.
Der Ausdruck "in Beziehung stehen mit" bezieht sich auf eine Krankheit, für die verglichen mit dem gleichen nicht kranken aus einem Organismus isolierten Gewebe gezeigt worden ist, dass sie von einer unangemessenen c-kit Kinaseexpression begleitet wird. Die unangemessene Expression kann eine Erhöhung von normalen Aktivitäten, eine Verringerung von normalen Aktivitäten oder das Vorhandensein von c-kit Kinase Aktivität, wo normalerweise keine gefunden wird, sein.
Der Ausdruck "in vitro" bezieht sich darauf, dass ein c-kit Kinaseenzym außerhalb eines lebenden Organismus mit einer Verbindung, die für diese Erfindung nützlich ist, getestet wird, wobei solche Verbindungen auf ihre Wirksamkeit untersucht werden. Der Ausdruck "in vitro" schließt die Verwendung von Zellen aus Gewebekulturen ein.
Der Ausdruck "fördert oder unterbricht die abnormale Wechselwirkung" bezieht sich auf ein Verfahren, das durch das Verabreichen einer Verbindung gemäß der Erfindung an Zellen oder Gewebe in einem Organismus erreicht werden kann. Eine Verbindung kann eine Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner durch das Bilden von günstigen Wechselwirkungen mit vielen Atomen am Komplexinterface fördern. Alternativ kann eine Verbindung eine Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner durch das Beeinträchtigen von günstigen Wechselwirkungen, die zwischen Atomen am Komplexinterface gebildet werden, hemmen. In bevorzugten Ausführungsformen bezieht sich die Förderung oder Unterbrechung einer abnormalen Wechselwirkung auf eine Verbindung gemäß der Erfindung, die eine konformationelle Änderung in einem der Proteine fördert.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein schematisches Diagramm, das die 5 Immunglobulin-ähnlichen Motive in der extrazellulären Domäne und eine cytoplasmatische "Split" Kinasedomäne von c-kit Kinase zeigt. Die Halbschleifen stellen die Immunglobulin-ähnlichen Motive und die schattierten Rechtecke die konservierte Kinase-Region der Rezeptoren dar.
2 zeigt die Wirkungen von Indolinonderivaten auf die Aktivität von c-kit Kinase wie mittels ELISA, wie in Beispiel 1 im experimentellen Teil beschrieben, gemessen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Verbindungen und Zusammensetzungen, die in der Lage sind die zelluläre Signaltransduktion und, in bevorzugten Ausführungsformen, die c-kit Kinase Signaltransduktion zu regulieren und/oder zu modulieren.
Rezeptorkinase-vermittelte Signaltransduktion wird durch extrazelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, gefolgt von Rezeptordimerisierung, vorübergehender Stimulation der intrinsischen Proteinkinaseaktivität und Phosphorylierung. Dadurch werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle geschaffen und führen zu der Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmatischen Signalmolekülen, die die entsprechenden zellulären Antworten (z. B. Zellteilung, metabolische Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung) ermöglichen. Siehe Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 303–391.
Die Signaltransduktion über Kinasen führt neben anderen Antworten zu Zellproliferation, Differenzierung und Metabolismus. Abnormale Zellproliferation kann zu einem weiten Bereich von Störungen und Krankheiten, einschließlich der Entwicklung von Neoplasien, wie zum Beispiel Karzinomen, Sarkomen, Leukämien, Glioblastomen, Hämangiomen, Psoriasis, Arteriosklerose, Arthritis und diabetischer Retinopathie (oder anderen Störungen, die mit unkontrollierter Angiogenese und/oder Vaskulogenese verbunden sind) führen.
Diese Erfindung richtet sich daher auf die Verwendung von Verbindungen und Zusammensetzungen, die die Signaltransduktion über Kinasen durch das Beeinflussen der enzymatischen Aktivität von Rezeptorkinasen und dem Stören des Signals, das durch solche Proteine weitergeleitet wird, regulieren, modulieren und/oder inhibieren. Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Verbindungen und Zusammensetzungen, die die c-kit Rezeptortyrosinkinase regulieren, modulieren und/oder inhibieren, als therapeutischem Ansatz, um viele Arten verwandter Krankheiten zu heilen. Die vorliegende Erfindung richtet sich daher auf die Behandlung und/oder Prävention von GISTs und solchen Zuständen, die sich durch die Überexpression von Mastzellen oder die unangemessene Hochregulation von Mastzellen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Mastozytose und allergie-assoziierte chronische Rhinitis, Entzündung und Asthma, auszeichnen. Diese Zustände werden unten detaillierter beschrieben.
I. Zielkrankheiten, die durch die Verbindungen, die in der Erfindung verwendet werden, behandelt werden sollen
Die hierin beschriebenen Verbindungen sind für die Behandlung von Störungen, die mit unregulierter Signaltransduktion über Kinasen, einschließlich Zellproliferationsstörungen, fibrotische Störungen und metabolische Störungen, in Zusammenhang stehen, nützlich. Zellproliferationsstörungen, die durch die vorliegende Erfindung behandelt oder weiter studiert werden können, schließen Krebs und proliferative Störungen von Mastzellen ein.
PTKs wurden mit solchen Zellproliferationsstörungen in Verbindung gebracht. Zum Beispiel wurden einige Mitglieder der Rezeptortyrosinkinase (RTK) Familie mit der Entwicklung von Krebs in Verbindung gebracht. Einige dieser Rezeptoren, wie EGFR (Tuzi, et al., 1991, Br. J. Cancer, Science 63: 227–233; Torp, et al., 1992, APMIS 100: 713–719), HER2/neu (Slamon, et al., 1989, Science 244: 707–712) und PDGF-R (Kumabe, et al., 1992, Oncogene 7: 627–633) werden in vielen Tumoren überexprimiert und/oder durch autokrine Schleifen dauerhaft aktiviert. Tatsächlich wurden in den häufigsten und schwersten Krebsformen Überexpressionen dieser Rezeptoren (Akbasak and Suner-Akbasak, et al., 1992, J. Neurol. Sci. 111: 119–133; Dickson, et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249–273; Korc, et al., 1992. J. Clin. Invest. 90: 1352–1360) und autokrine Schleifen (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol. 118: 1057–1070; Korc, et al., supra; Akbasak and Suner-Akbasak, et al., supra) gezeigt. Der EGFR Rezeptor wurde zum Beispiel mit Plattenepithelzellkarzinom, Astrozytom, Glioblastom, Kopf- und Halskrebs, Lungenkrebs und Blasenkrebs in Verbindung gebracht. HER2 wurde mit Brust-, Eierstock-, Magen-, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen- und Blasenkrebs in Verbindung gebracht. PDGF-R wurde mit Glioblastom, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Melanom und Prostatakrebs in Verbindung gebracht.
Die c-kit Rezeptorkinase wurde mit solchen Zellproliferationsstörungen in Verbindung gebracht. Zum Beispiel wurde gefunden, dass der c-kit Kinaserezeptor in über der Hälfte der SCLC Zellen, die zusammen mit ihren Liganden SCF untersucht wurden (Hibi, et al., 1991, Oncogene 6: 2291–2296), abweichend exprimiert wird. Möglicherweise wird die Inhibition der c-kit Kinase die Langzeitüberlebensrate von Patienten mit SCLC verbessern.
Die Gegenwart von c-kit RTK und/oder SCF wurde, wie unten beschrieben, ebenfalls mit anderen Arten von Krebs in Verbindung gebracht. Die Verbindung zwischen Abnormalitäten in RTKs und Krankheiten sind jedoch nicht auf Krebs beschränkt. Zum Beispiel wurde die c-kit Rezeptorkinase mit Immunkrankheiten, wie zum Beispiel Mastozytose, Asthma und chronischer Rhinitis in Verbindung gebracht. Die übermäßige Aktivierung von c-kit kann mit Krankheiten, die durch das übermäßige Vorkommen von Mastzellen entstehen, in Verbindung gebracht werden. Mastozytose ist der Ausdruck, der verwendet wird, um eine heterogene Reihe von Störungen zu beschreiben, die sich durch übermäßige Mastzellproliferation auszeichnen sind (Metclafe, 1991, J. Invest. Derm 93: 2S–4S; Valent, 1996, Wein/Klin Wochenschr 108: 385–397; and Golkar, et al., 1997, Lancet 349: 1379–1385). Erhöhte c-kit Expression wurde für Mastzellen von Patienten mit aggressiver Mastozytose, aber nicht für Mastzellen von Patienten mit indolenter Mastozytose berichtet (Nagata, et al., 1998, Leukemia 12: 175–181).
Zusätzlich stellen Mastzellen und Eosinophile Schlüsselzellen dar, die an Allergien, Entzündungen und Asthma beteiligt sind (Thomas, et al., 1996, Gen. Pharmacol 27: 593–597; Metcalfe, et al., 1997, Physiol Rev 77: 1033–1079; Holgate, 1997, CIBA Found. Symp.; Naclerio, et al., 1997, JAMA 278: 1842–1848 and Costa, et al., 1997, JAMA 278: 1815–1822). SCF und somit c-kit regulieren direkt und indirekt die Aktivierung von sowohl Mastzellen als auch Eosinophilen, und beeinflussen dadurch die primären Zellen, die an Allergien und Asthma beteiligt sind, durch vielfältige Mechanismen. Aufgrund dieser gegenseitigen Regulierung der Funktion von Mastzellen und Eosinophilen und der Rolle, die SCF in dieser Regulation spielen kann, kann die Inhibition der c-kit Kinase ein Mittel darstellen, um allergie-assoziierte chronische Rhinitis, Entzündung und Asthma zu behandeln.
II. c-kit Kinase
Die c-kit Kinase spielt bei der Entwicklung von Melanozyten, Mast-, Keim- und hämatopoetischen Zellen eine entscheidende Rolle. Das Protein, das durch den S1 Lokus kodiert wird, wurde, basierend auf seinen biologischen Eigenschaften, die verwendet wurden um es zu identifizieren, Kit Ligand (KL), Stammzellfaktor (SCF) oder Mastzellenwachstumsfaktor (MGF) genannt (ein Überblick wird in Tsujimura, 1996, Pathol Int 46: 933–938; Loveland, et al., 1997, J. Endocrinol 153: 337–344; Vliagoftis, et al., 1997, Clin Immunol 100: 435–440; Broudy, 1997, Blood 90: 1345–1364; Pignon, 1997, Hematol Cell Ther 39: 114–116; and Lyman, et al., 1998, Blood 91: 1101–1134 gegeben). Aus Gründen der Einfachheit werden wir SFC verwenden, um den Liganden für die c-kit RTK zu bezeichnen. SCF wird als ein Transmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 220 oder 248 Dalton, abhängig vom alternativen Spleißen der mRNA, um Exon 6 zu kodieren, synthetisiert. Das größere Protein kann proteolytisch gespalten werden, um ein lösliches, glykosyliertes Protein zu bilden, das nicht kovalent dimerisiert. Sowohl die lösliche als auch die membrangebundene Form von SCF kann an c-kit binden und dieses aktivieren. Zum Beispiel wird SCF in der Haut hauptsächlich durch Fibroblasten, Keratinozyten und Endothelzellen, die die Aktivität von Melanozyten und Mastzellen, die c-kit exprimieren, modulieren, exprimiert. In Knochen exprimieren Knochenmarksstromazellen SCF und regulieren die Hämatopoese von c-kit exprimierenden Stammzellen. Im gastrointestinalen Trakt, exprimieren intestinale Epithelzellen SCF und beeinflussen die interstitiellen Kajalzellen und die intraepithelialen Lymphozyten. In den Hoden exprimieren Sertolizellen und Granulosazellen SCF, das die Spermatogenese durch Interaktion mit c-kit auf Keimzellen reguliert.
a. Bösartige Zieltumore, die mit c-kit Kinase und/oder SCF in Verbindung stehen
Die abweichende Expression und/oder Aktivierung von c-kit wurde in eine Reihe von Tumoren vermutet. Beweise für ein Beitrag von c-kit zu der neoplastischen Pathologie schließt seine Assoziierung mit Leukämien und Mastzelltumoren, kleinzelligem Lungenkrebs, Hodenkrebs und einigen Krebsformen des gastrointestinalen Trakts und des zentralen Nervensystems ein (siehe unten). Zusätzlich wurde vermutet, dass c-kit eine Rolle bei der Karzinogenese des weiblichen Genitalbereichs (Inoue, et al., 1994, Cancer Res. 54(11): 3049–3053), Sarkomen neuroektodermalen Ursprungs (Ricotti, et al. 1998, Blood 91: 2397–2405) und Neoplasien der Schwannschen Zellen, die mit Neurofibromatose verbunden sind (Ryan, et al., 1994, J. Neuro. Res. 37: 415–432), eine Rolle spielt.
Leukämien: Die SCF Bindung an c-kit RTK schützt hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen vor Apoptose (Lee, et al., 1997, J. Immunol. 159: 3211–3219), und trägt dadurch zu der Koloniebildung und Hämatopoese bei. Die Expression von c-kit wird häufig in akuter myelozytischer Leukämie (AML) beobachtet, aber ist weniger häufig in akuter lymphozytischer Leukämie (ALL) (für Übersichtsartikel siehe Sperling, et al. 1997, Haemat 82: 617–621; Escribano, et al., 1998, Leuk. Lymph. 30: 459–466). Obwohl c-kit in der Mehrzahl von AML Zellen exprimiert wird, scheint seine Expression für das Fortschreiten der Krankheit nicht prognostisch zu sein (Sperling, et al. 1997, Haemat 82: 617–621). SCF schützt AML Zellen jedoch vor durch Chemotherapeutika induzierter Apoptose (Hassan, et al. 1996, Acta. Hem. 95: 257–262). Inhibition von c-kit durch die vorliegende Erfindung wird die Wirksamkeit dieser Mittel verstärken und kann die Apoptose von AML Zellen induzieren.
Es wurde gefunden, dass das klonale Wachstum von Zellen von Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom (Sawada, et al., 1996, Blood 88: 319–327) oder chronischer myelogener Leukämie (CML) (Sawai, et al., 1996, Exp. Hem. 2: 116–122) durch SCF in Kombination mit anderen Cytokinen deutlich erhöht wurde. CML zeichnet sich durch eine Expansion von Philadelphia Chromosom-positiven Zellen des Knochenmarks aus (Verfaillie, et al. 1998, Leuk. 12: 136–138), was hauptsächlich auf die Inhibition des apoptotischen Zelltods zurückzuführen zu sein scheint (Jones, 1997, Curr. Opin. Onc. 9: 3–7). Es wurde berichtet, dass das Produkt des Philadelphia Chromosoms, p210^BCR-ABL, die Inhibition der Apoptose vermittelt (Bedi, et al., 1995, Blood 86: 1148–1158). Da p210^BCR-ABL und die c-kit RTK beide die Apoptose hemmen und p62^dok als Substrat vorgeschlagen worden ist (Carpino, et al., 1997, Cell 88: 197–204), ist es möglich, dass die klonale Expansion, die durch diese Kinasen vermittelt wird, durch einen gemeinsamen Signalweg erfolgt. Es wurde jedoch ebenfalls berichtet, dass c-kit direkt mit p210^BCR-ABL interagiert (Hallek, et al., 1996, Brit. J. Haem. 94: 5–16), was vermuten lässt, dass c-kit eine stärker ursächliche Rolle bei der CML Pathologie besitzt. Daher wird sich die Inhibition der c-kit Kinase bei der Behandlung der oben stehenden Störungen als nützlich erweisen.
Gastrointestinale Krebsformen: Normale kolorektale Schleimhaut exprimiert kein c-kit (Bellone, et al., 1997, J. Cell Physiol. 172: 1–11). c-kit wird jedoch häufig in kolorektalen Karzinomen exprimiert (Bellone, et al., 1997, J. Cell Physiol. 172: 1–11) und autokrine Schleifen von SCF und c-kit wurden in mehreren Darmkarzinomzelllinien beobachtet (Toyota, et al., 1993, Turn Biol 14: 295–302; Lahm, et al., 1995, Cell Growth & Differ 6: 1111–1118; Bellone, et al., 1997, J. Cell Physiol. 172: 1–11). Ferner hemmt die Unterbrechung der autokrinen Schleife durch die Verwendung von neutralisierenden Antikörpern (Lahm, et al., 1995, Cell Growth & Differ 6: 1111–1118) und die Abregulation von c-kit und/oder SCF die Zellproliferation deutlich (Lahm, et al., 1995, Cell Growth & Differ 6: 1111–1118; Bellone, et al., 1997, J. Cell Physiol. 172: 1–11).
SCF/c-kit autokrine Schleifen wurden in Magenkarzinomzelllinien beobachtet (Turner, et al., 1992, Blood 80: 374–381; Hassan, et al., 1998, Digest. Dis. Science 43: 8–14) und die konstitutive c-kit Aktivierung scheint ebenfalls für gastrointestinale Stromatumoren (GISTs) wichtig zu sein. GISTs sind die häufigsten mesenchymalen Tumore des Verdauungstraktes. Mehr als 90% der GISTs exprimieren c-kit, was in Einklang mit dem angenommenen Ursprung dieser Tumorzellen aus interstitiellen Kajalzellen (ICCs) steht (Hirota, et al. 1998, Science 279: 577–580). Es wird angenommen, dass ICCs die Kontraktion des gastrointestinalen Traktes regulieren und Patienten, denen c-kit in ihren ICCs fehlt, zeigen eine myopathische Form von chronischer idiopathischer intestinaler Pseudoobstruktion (Isozaki, et al., 1997, Amer. J. of Gast. 9: 332–334). Es wurde beobachtet, dass c-kit, das in GISTs von mehreren verschiedenen Patienten exprimiert wurde, Mutationen in der intrazellulären membrannahen Domäne besitzt, was zu der konstitutiven Aktivierung dieser RTK führt (Hirota, et al. 1998, Science 279: 577–580). Daher wäre die Inhibition der c-kit Kinase ein wirksames Mittel für die Behandlung dieser Krebsformen.
Hodenkrebsformen: Männliche Keimzelltumore werden histologisch in Seminome, die Keimzelleigenschaften beibehalten, und Nicht-Seminome, die Eigenschaften embryonaler Differenzierung zeigen können, eingeteilt. Es wird angenommen, dass sowohl Seminome als auch Nicht-Seminome aus einem präinvasiven Stadium hervorgehen, das als Carcinoma in situ (CIS) bezeichnet wird (Murty, et al., 1998, Sem. Oncol. 25: 133–144). Es wurde berichtet, dass sowohl c-kit als auch SCF für die normale Keimdrüsenentwicklung während der Embryogenese essentiell sind (Loveland, et al., 1997, J. Endocrinol 153: 337–344). Verlust von entweder dem Rezeptor oder dem Liganden führt zu Tieren, denen Keimzellen fehlen. In postnatalen Tests wurde gefunden, dass c-kit in Leydig Zellen und Stammsamenzellen exprimiert wird, während SCF in Sertoli Zellen exprimiert wurde (Loveland, et al., 1997, J. Endocrinol 153: 337–344). In transgenen Mäusen, die die menschlichen Papillomavirus 16 (HPV16) E6 und E7 Onkogene exprimieren, entwickeln sich mit hoher Häufigkeit Hodentumore aus Leydig Zellen (Kondoh, et al., 1991, J. Virol. 65: 3335–3339; Kondoh, et al., 1994, J. Urol. 152: 2151–2154). Diese Tumore exprimieren sowohl c-kit als auch SCF und eine autokrine Schleife kann zu der Tumorgenese (Kondoh, et al., 1995, Oncogene 10: 341–347), die mit dem zellulären Verlust von funktionellen p53 und dem Produkt des Retinoblastomgens durch Assoziation mit E6 und E7 verbunden ist, beitragen (Dyson, et al., 1989, Science 243: 934–937; Werness, et al., 1990, Science 248: 76–79; Scheffner, et al., 1990, Cell 63: 1129–1136). Defekte Signalmutanten von SCF (Kondoh, et al., 1995, Oncogene 10: 341–347) oder c-kit (Li, et al., 1996, Canc. Res. 56: 4343–4346) hemmten die Bildung von Hodentumoren in Mäusen, die HPV16 E6 und E7 exprimieren. Die c-kit Kinaseaktivierung ist in diesen Tieren für die Tumorgenese entscheidend und somit wird die Modulation des c-kit Kinasesignalweges durch die vorliegende Erfindung solche Störungen verhindern oder behandeln.
Die Expression von c-kit auf Keimzellentumoren zeigt, dass der Rezeptor von der Mehrzahl von in situ Karzinomen und Seminomen exprimiert wird, aber c-kit nur in einer kleinen Zahl von Nicht-Seminomen exprimiert wird (Strohmeyer, et al., 1991, Canc. Res. 51: 1811–1816; Rajpert-de Meyts, et al., 1994, Int. J. Androl. 17: 85–92; Izquierdo, et al., 1995, J. Pathol. 177: 253–258; Strohmeyer, et al., 1995, J. Urol. 153: 511–515; Bokenmeyer, et al., 1996, J. Canc. Res. Clin. Oncol. 122: 301–306; Sandlow, et al. 1996, J. Androl. 17: 403–408). Daher liefert die Inhibition der c-kit Kinase ein wertvolles neues Mittel zur Behandlung dieser Störungen.
Krebsformen des ZNS: SCF and c-kit werden überall im ZNS von sich entwickelnden Nagetieren exprimiert und das Expressionsmuster lässt eine Rolle bei dem Wachstum, der Migration und Differenzierung von neuroektodermalen Zellen vermuten. Die Expression von sowohl Rezeptor als auch Ligand wurde auch für das Gehirn von Erwachsenen berichtet (Hamel, et al., 1997, J. Neuro-Onc. 35: 327–333). Die Expression von c-kit wurde ebenfalls im normalem menschlichen Gehirngewebe beobachtet (Tada, et al. 1994, J. Neuro 80: 1063–1073). Glioblastome und Astrozytome, die den größten Teil intrakranialer Tumore darstellen, entstehen aus neoplastischer Transformation von Astrozyten (Levin, et al., 1997, Principles & Practice of Oncology: 2022–2082). Die Expression von c-kit wurde in Glioblastomzelllinien und -geweben beobachtet (Berdel, et al., 1992, Canc. Res. 52: 3498–3502; Tada, et al., 1994, J. Neuro 80: 1063–1073; Stanulla, et al., 1995, Act Neuropath 89: 158–165).
Die Assoziation von c-kit mit der Pathologie des Astrozytoms ist weniger klar. Es gibt Berichte über die Expression von c-kit in normalen Astrozyten (Natali, et al., 1992. Int. J. Canc. 52: 197–201), (Tada, et al., 1994, J. Neuro 80: 1063–1073), während andere berichten, dass es nicht exprimiert wird (Kristt, et al., 1993, Neuro. 33: 106–115). Im letzteren Fall wurde ein hoher Grad an c-kit Expression in Tumoren hoher Tumorklasse beobachtet (Kristt, et al., 1993, Neuro. 33: 106–115), während die vorangehenden Gruppen nicht in der Lage waren irgendeine Expression in Astrozytomen nachzuweisen. Zusätzlich gibt es widersprüchliche Berichte von c-kit und SCF Expression in Neuroblastomen. Eine Studie fand, dass Neuroblastomzelllinien oft SCF, aber selten c-kit exprimieren. In Primärtumoren wurde c-kit in ungefähr 8% der Neuroblastome nachgewiesen, während SCF in 18% der Tumore gefunden wurde (Beck, et al., 1995, Blood 86: 3132–3138). Im Gegensatz dazu haben andere Studien (Cohen, et al., 1994, Blood 84: 3465–3472) berichtet, dass alle 14 Neuroblastomzelllinien, die untersucht wurden, c-kit/SCF autokrine Schleifen enthielten und die Expression von sowohl dem Rezeptor als auch dem Liganden in 45% der untersuchten Tumorproben beobachtet wurden. In zwei Zelllinien hemmten Anti-c-kit Antikörper die Zellproliferation, was vermuten lässt, dass die SCF/c-kit autokrine Schleife zu dem Wachstum beiträgt (Cohen, et al., 1994, Blood 84: 3465–3472). Somit werden sich c-kit Kinaseinhibitoren als Mittel um diese Krebsarten zu behandeln als therapeutisch nützlich erweisen.
b. Zielmastzellkrankheiten, die c-kit Kinase und/oder SCF einschließen und die durch die vorliegende Erfindung behandelt/verhindert werden sollen.
Mastozytose: Wie oben erwähnt, wurde berichtet, dass SCF (ebenfalls bekannt als Mastzellwachstumsfaktor) Stimulation von c-kit für das Wachstum und Entwicklung von Mastzellen essentiell ist (Hamel, et al., 1997, J. Neuro Onc. 35: 327–333; Kitamura, et al., 1995, Int. Arch. Aller. Immunol. 107: 54–56). Mäuse mit Mutation von c-kit, die dessen Signalgebungsaktivität abschwächen, zeigen deutlich weniger Mastzellen in ihrer Haut (Tsujimura, 1996, Pathol Int 46: 933–938). Die übermäßige Aktivierung von c-kit könnte mit Krankheiten, die aus einem übermäßigen Vorkommen von Mastzellen entstehen, in Verbindung stehen.
Mastozytose ist der Ausdruck, der verwendet wird, um eine heterogene Reihe von Störungen zu beschreiben, die sich durch übermäßige Mastzellproliferation auszeichnen (Metcalfe, 1991, J. Invest. Derm 93: 2S–4S; Valent; 1996; Golkar, et al., 1997, Lancet 349: 1379–1385). Mastozytose ist in der Mehrzahl der Patienten auf die Haut beschränkt aber kann in 15 bis 20% der Patienten andere Organe einschließen (Valent, 1996, Wein/Klin Wochenschr 108: 385–397; Golkar, et al., 1997, Lancet 349: 1379–1385). Selbst unter Patienten mit systemischer Mastozytose, kann die Krankheit von einer relativ gutartigen Prognose bis hin zu aggressiver Mastozytose und Mastzellleukämie reichen (Valent, 1996, Wein/Klin Wochenschr 108: 385–397; Golkar, et al., 1997, Lancet 349: 1379–1385). c-kit wurde auf bösartigen Mastzellen aus Mastzelltumoren von Hunden (London, et al., 1996, J. Compar. Pathol. 115: 399–414) sowie auf Mastzellen von Patienten mit aggressiver systemischer Mastozytose (Baghestanian, et al., 1996, Leuk.: 116–122; Castells, et al., 1996, J. Aller. Clin. Immunol. 98: 831–840) beobachtet.
Es wurde eine erhöhte c-kit Expression auf Mastzellen von Patienten mit aggressiver Mastozytose, aber nicht auf Mastzellen von Patienten mit indolenter Mastozytose berichtet (Nagata, et al., 1998, Mastocytosis Leuk 12: 175–181). Es wurde gezeigt, dass SCF auf Stromazellen als membrangebundenes Protein exprimiert wird und seine Expression durch fibrogene Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel PDGF, induziert werden kann (Hiragun, et al. 1998). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass es als membrangebundenes Protein auf Keratinozyten in normaler Haut exprimiert wird. In der Haut von Patienten mit Mastozytose wurde jedoch eine erhöhte Menge von löslichem SCF beobachtet (Longley, et al., 1993, New Engl. J. Med. 328: 1302–1307).
Es wurde berichtet, dass Mastzellchymase membran-assoziiertes SCF in eine lösliche und biologisch aktive Form spaltet. Dieser mastzellvermittelte Prozess könnte dazu dienen, eine Feedbackschleife zu erzeugen, um Mastzellproliferation und Funktion zu verstärken (Longley, et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9017–9021), und könnte für die Ätiologie der Mastozytose wichtig sein. Transgene Mäuse, die eine Form von SCF, die nicht proteolytisch von Keratinozyten freigesetzt werden kann, überexprimieren, entwickelten keine Mastozytose, während gleiche Tiere, die normales SCF in Keratinozyten exprimierten, einen Phänotyp aufwiesen, der menschlicher kutaner Mastozytose ähnelte (Kunisada, et al., 1998, J. Exp. Med. 187: 1565–1573). Die Bildung von großen Mengen von löslichem SCF kann in einigen Patienten zu der Pathologie, die mit Mastozytose in Verbindung steht, beitragen und die vorliegende Erfindung kann solche Störungen durch Modulation der Interaktion zwischen SCF und c-kit Kinase behandeln oder verhindern. Mehrere verschiedene Mutationen der c-kit RTK, die zu konstitutiver Kinaseaktivität führen, wurden in menschlichen und Nagetier Mastzelltumorzelllinien gefunden (Furitsu, et al., 1993, J. Clin. Invest. 92: 1736–1744; Tsujimura, et al., 1994, Blood 9: 2619–2626; Tsujimura, et al., 1995, Int. Arch. Aller. Immunol. 106: 377–385; Tsujimura, 1996, Pathol Int 46: 933–938). Zusätzlich wurden aktivierende Mutationen des c-kit Gens in peripheren mononukleären Zellen, die aus Patienten mit Mastozytose und damit verbundenen hämatologischen Störungen isoliert worden waren (Nagata, et al., 1998, Mastocytosis Leuk 12: 175–181), und in Mastzellen von einem Patienten mit Urticaria pigmentosa und aggressiver Mastozytose (Longley, et al., 1996, Nat. Gen. 12: 312–314) beobachtet. Es wird sich daher erweisen, dass die Inhibition der c-kit Kinase bei der Behandlung dieser Störungen eine exzellente therapeutische Rolle spielt.
In einigen Patienten können aktivierende Mutationen der c-kit RTK für die Pathogenese der Krankheit verantwortlich sein und diese Patienten können durch die Modulation der SCF Interaktion mit c-kit Kinase behandelt oder ihre Krankheiten verhindert werden. Es wurde gezeigt, dass die SCF Aktivierung von c-kit die Mastzell-Apoptose, die kritisch sein könnte, um die kutane Mastzellhomeostase beizubehalten, verhindert (Iemura, et al., 1994, Amer. J. Pathol 144: 321–328; Yee, et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1777–1787; Mekori, et al., 1994, J. Immunol. 153: 2194–2203; Mekori, et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 107: 137–138). Die Inhibition der Mastzell-Apoptose könnte zu der Akkumulation von Mastzellen führen, die mit Mastozytose in Verbindung gebracht wird. Somit liefert die Beobachtung der c-kit Aktivierung, die aus der Überexpression des Rezeptors resultiert, die übermäßige Bildung von löslichem SCF oder Mutationen des c-kit Gens, die dessen Kinase konstitutiv aktivieren, eine Erklärung dafür, dass die Inhibition der Kinaseaktivität von c-kit die Anzahl von Mastzellen verringern wird und für Patienten mit Mastozytose einen Nutzen liefert.
Asthma und Allergien: Mastzellen und Eosinophile stellen bei Infektion mit Parasiten, Allergien, Entzündung und Asthma Schlüsselzellen dar (Thomas, et al., 1996, Gen. Pharmacol 27: 593–597; Metcalfe, et al., 1997, Physiol Rev 77: 1033–1079; Holgate, 1997, CIBA Found. Symp.; Naclerio, et al., 1997, JAMA 278: 1842–1848; Costa, et al., 1997, JAMA 278: 1815–1822). Es wurde gezeigt, dass SCF für die Mastzellentwicklung, das Überleben und das Wachstum essentiell ist (Kitamura, et al., 1995, Int. Arch. Aller. Immunol. 107: 54–56; Metcalfe, et al., 1997, Physiol. Rev 77: 1033–1079). Zusätzlich wirkt SCF mit dem Eosinophilen-spezifischen Regulator IL-5 zusammen, um die Entwicklung von eosinophilen Vorläuferzellen zu erhöhen (Metcalfe, et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95: 6408–6412). Es wurde ebenfalls berichtet, dass SCF Mastzellen dazu veranlasst Faktoren zu sekretieren (Okayama, et al., 1997, Int. Arch. Aller. Immunol. 114: 75–77; Okayama, et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 708–715), die das Überleben von Eosinophilen fördern (Kay, et al., 1997, Int. Arch. Aller. Immunol. 113: 196–199), was zu chronischer, durch Eosinophile vermittelter Entzündung beitragen kann (Okayama, et al., 1997, Int. Arch. Aller. Immunol. 114 75–77; Okayama, et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 708–715). In diesem Zusammenhang reguliert SCF direkt und indirekt die Aktivierung von sowohl Mastzellen als auch Eosinophilen.
SCF induziert die Mediatorfreisetzung aus Mastzellen sowie das Priming dieser Zellen für IgE-induzierte Degranulation (Columbo, et al., 1992, J. Immunol. 149: 599–602) und Sensitivieren ihrer Ansprechempfindlichkeit gegenüber dem von Eosinophilen abgeleiteten basischen Hauptprotein aus Granula (Furuta, et al., 1998, Blood 92: 1055–1061). Unter den Faktoren, die durch die aktivierten Mastzellen freigesetzt werden, sind IL-5, GM-SCF und TNF-α, die die eosinophile Proteinsekretion beeinflussen (Okayama, et al., 1997, Int. Arch. Aller. Immunol. 114: 75–77; Okayama, et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 708–715). Zusätzlich zum Induzieren der Histaminfreisetzung aus Mastzellen (Luckacs, et al., 1996, J. Immunol. 156: 3945–3951; Hogaboam, et al., 1998, J. Immunol. 160: 6166–6171), fördert SCF die Mastzellproduktion des eosinophilen chemotaktischen Faktors Eotaxin (Hogaboam, et al., 1998, J. Immunol. 160: 6166–6171) und die eosinophile Infiltration (Luckacs, et al., 1996, J. Immunol. 156: 3945–3951).
SCF beeinflusst ebenfalls direkt die Adhäsion von sowohl Mastzellen (Dastych, et al., 1994, J. Immunol. 152: 213–219; Kinashi, et al., 1994, Blood 83: 1033–1038) als auch Eosinophilen (Yuan, et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 313–323), was wiederum die Gewebsinfiltration reguliert. Somit kann SCF die Primärzellen, die an Allergien und Asthma beteiligt sind, durch vielfältige Mechanismen beeinflussen. Gegenwärtig sind Kortikosteroide die wirksamste Behandlung für chronische Rhinitis und Entzündungen, die mit Allergien in Verbindung stehen (Naclerio, et al., 1997, JAMA 278: 1842–1848; Meltzer, 1997, Aller. 52: 33–40). Diese Mittel wirken über vielfältige Mechanismen einschließlich der Verringerung der zirkulierenden und infiltrierenden Mastzellen und Eosinophilen und der verringerten Überlebensrate von Eosinophilen, die mit der Inhibition der Cytokinproduktion in Verbindung stehen (Meltzer, 1997, Aller. 52: 33–40). Es wurde ebenfalls berichtet, dass Steroide die Expression von SCF durch Fibroblasten und residente Bindegewebszellen hemmen, was zu einer verringerten Überlebensrate der Mastzellen führt (Finotto, et al., 1997, J. Clin. Invest. 99: 1721–1728). Aufgrund der gegenseitigen Regulation von Mastzell- und Eosinophilen-Funktion und der Rolle, die SCF in dieser Regulation spielen kann, liefert die Inhibition der c-kit Kinase ein Mittel, um allergie-assoziierte chronische Rhinitis, Entzündung und Asthma zu behandeln.
c. Identifizierung von Agonisten und Antagonisten des c-kit Rezeptors
Angesichts der gefolgerten Wichtigkeit von RTKs in der Kontrolle, Regulation und Modulation der Proliferation von Endothelzellen und möglicherweise der Karzinogese, wurden unter Verwendung einer Reihe von Ansätzen viele Versuche gemacht, um RTK "Inhibitoren" zu identifizieren. Diese schließen die Verwendung von mutierten Liganden (US Patent Nr. 4,966,849) und lösliche Rezeptoren und Antikörper (Anmeldung Nr. WO 94/10202; Kendall and Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10705–10709; Kim, et al., 1993, Nature 362: 841–844); und RNA Liganden (Jellinek, et al., 1994, Biochemistry 33: 10450–10456) ein.
Ferner wurden Kinaseinhibitoren (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US Patent Nr. 5,330,992; Mariani, et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35: 2268) und Inhibitoren, die auf die Signaltransduktionswege von Rezeptorkinasen wirken, wie zum Beispiel Proteinkinase C Inhibitoren, identifiziert (Schuchter, et al., 1991, Cancer Res. 51: 682–687); Takano, et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella, et al., 1992, Exp. Cell Res. 199: 56–62; Wright, et al., 1992, J. Cellular Phys. 152 448–57).
Vor kurzem wurden Versuche gemacht, um kleine Moleküle, die als Kinaseinhibitoren wirken, für die Verwendung bei der Behandlung von Krebs zu identifizieren. Folglich besteht ein nicht erfüllter Bedarf für die Identifizierung und Erzeugung von wirksamen kleinen Verbindungen, die selektiv die Signaltransduktion der c-kit RTK inhibieren, um diese autokrine Schleife wirksam und spezifisch zu unterdrücken.
Einige der Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zeigen exzellente Aktivität in biologischen Assays und somit wird erwartet, dass diese Verbindungen und verwandte Verbindungen in der Behandlung von c-kit RTK-verwandten Störungen, wie denen, die oben beschrieben werden, wirksam sind. Zusätzlich können die hierin beschriebenen Assays und Bedingungen verwendet werden, um weitere Modulatoren der Funktion der c-kit Kinase zu identifizieren.
III. Biologische Aktivität der Verbindungen gemäß der Erfindung
Die Indolinonverbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, den größten Teil der Proteinkinaseaktivität zu inhibieren. Die biologischen Assays und Ergebnisse dieser Inhibitionsstudien werden hierin berichtet. Die Verfahren, die verwendet wurden, um die Modulation der Proteinkinasefunktion durch Indolinonverbindungen zu messen, gleichen denen, die in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 98/07695, veröffentlicht am 26. März 1998 von Tang et al., und betitelt "Kombinatorische Indolinon-Bibliotheken und verwandte Produkte und Verfahren für die Behandlung von Krankheiten" und US Patent Nr. 5,792,783, erteilt am 11. August 1998 an Tang et al. und betitelt "3-Heteroaryl-2-Indolinonverbindungen für die Behandlung von Krankheiten" mit Bezug auf die High Throughput Aspekte des Verfahrens beschrieben worden sind.
IV. Pharmazeutische Rezepturen und Verabreichungswege
Die hierin beschriebenen Verbindungen können per se oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen sie mit anderen aktiven Inhaltsstoffen gemischt sind, wie zum Beispiel in einer Kombinationstherapie oder in geeigneten Trägerstoffen oder Hilfsstoffen, an einen menschlichen Patienten verabreicht werden. Techniken für die Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Edition, gefunden werden.
a) Verabreichungswege
Geeignete Verabreichungswege können zum Beispiel orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung; parenterale Abgabe, einschließlich intramuskuläre, subkutane, intravenöse, intramedulläre Injektionen sowie intrathekale, direkte intraventrikuläre, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen einschließen.
Alternativ kann man die Verbindung in einer lokalen anstelle einer systemischen Weise verabreichen, zum Beispiel über Injektion der Verbindung direkt in einen soliden Tumor, oft in einem Depot oder in einer Formulierung zu verzögerten Freisetzung.
Ferner kann man das Medikament in einem zielgerichteten Medikamentenabgabesystem verabreichen, zum Beispiel in einem Liposom, das mit einem Tumor-spezifischen Antikörper beschichtet ist. Die Liposomen richten sich auf den Tumor und werden von diesem selektiv aufgenommen.
b) Zusammensetzung/Rezeptur
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Weise hergestellt werden, die bekannt ist, zum Beispiel mittels üblicher Mischungs-, Auflösungs-, Granulierungs-, Dragee-herstellender, verreibender, emulgierender, verkapselnder, einschließender oder lyophilisierender Verfahren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können somit in üblicher Art und Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Trägerstoffen, die Bindemittel und Hilfsstoffe umfassen, die die Verarbeitung der aktiven Verbindungen in Präparationen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Die angemessene Formulierung ist abhängig von dem gewählten Verabreichungsweg.
Für die Injektion können die Mittel gemäß der Erfindung in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie zum Beispiel Hanks Lösung, Ringers Lösung oder physiologischem Kochsalzpuffer formuliert werden. Für die transmukosale Verabreichung werden in der Formulierung Durchdringungsmittel, die für die zu durchdringende Barriere angemessen sind, verwendet. Solche Durchdringungsmittel sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen einfach durch Kombinieren der aktiven Inhaltsstoffe mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, die im Stand der Technik gut bekannt sind, formuliert werden. Solche Träger ermöglichen es den Verbindungen gemäß der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen und ähnlichen für die orale Aufnahme durch einen zu behandelnden Patient, formuliert zu werden. Pharmazeutische Präparationen für die orale Verwendung können durch das Mischen von einem oder mehreren festen Hilfsstoffen mit einem oder mehreren Verbindungen gemäß der Erfindung, gegebenenfalls Mahlen der resultierenden Mischung und Weiterverarbeitung der Mischung von Körnchen, wenn gewünscht, nach der Zugabe von geeigneten Hilfsstoffen, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten, erhalten werden. Geeignete Hilfsstoffe sind insbesondere Füllstoffe, wie zum Beispiel Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; Zellulosepräparate, wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragant-Gummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethyl-Zellulose, Natriumcarboxymethyl-Zellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Wenn gewünscht können Auflösungsmittel, wie zum Beispiel quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie zum Beispiel Natriumalginat, zugegeben werden.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglykol und/oder Titaniumdioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten. Zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen können für die Identifizierung oder um verschiedene Kombinationen von Dosen der aktiven Verbindung zu kennzeichnen Farbstoffe oder Pigmente zugegeben werden.
Pharmazeutische Präparationen, die oral verwendet werden können, schließen feste Kapseln, die aus Gelatine gemacht sind, sowie weiche, versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie zum Beispiel Glycerin oder Sorbitol gemacht sind, ein. Die festen Kapseln können den aktiven Inhaltsstoff in Mischung mit Füllstoffen, wie zum Beispiel Laktose, Bindemitteln, wie zum Beispiel Stärke und/oder Gleitmitteln, wie zum Beispiel Talkum oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Inhaltsstoffe in geeigneten Flüssigkeiten, wie zum Beispiel fettigen Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglykolen aufgelöst oder suspendiert werden. Zusätzlich können Stabilisatoren zugegeben werden. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in Dosen vorliegen, die für eine solche Verabreichung geeignet sind.
Für die bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Lutschtabletten, die auf übliche Art und Weise formuliert werden, annehmen.
Für die Verabreichung durch Inhalation, werden die Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise in Form eines Aerosolspray-Präparats aus unter Druck stehenden Verpackungen oder einem Nebulator, unter der Verwendung eines geeigneten Treibmittels, zum Beispiel Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem anderen geeigneten Gas, abgegeben. Im Fall von unter Druck stehenden Aerosolen kann die Dosierungseinheit durch das Bereitstellen eines Ventils, für die Abgabe einer abgemessenen Menge, bestimmt werden. Kapseln und Patronen aus zum Beispiel Gelatine für die Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können so formuliert werden, dass sie eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis, wie zum Beispiel Laktose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können für die parenterale Verabreichung durch Injektion, zum Beispiel durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen für die Injektion können in einer Einheitsdosisform, zum Beispiel in Ampullen oder Multidosisbehältern, mit einem zugegebenen Konservierungsmittel, bereitgestellt werden. Die Zusammensetzungen können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägerstoffen annehmen und können formulierende Mittel, wie zum Beispiel suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Mittel, enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen für die parenterale Verabreichung schließen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form ein. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als entsprechende ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Trägerstoffe schließen fettige Öle, wie zum Beispiel Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen ein. Wässrige Suspensionen für die Injektion können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylzellulose, Sorbitol oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, enthalten, um die Herstellung von hoch konzentrierten Lösungen zu erlauben.
Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff für die Herstellung mit einem geeigneten Trägerstoff, zum Beispiel sterilem pyrogen-freiem Wasser, vor der Verwendung in Pulverform sein.
Die Verbindungen können ebenfalls in rektalen Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Zäpfchen oder Bleibeklistiers, die zum Beispiel die übliche Zäpfchenbasen, wie zum Beispiel Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten, formuliert werden.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen, können die Verbindungen ebenfalls als Depotpräparat formuliert sein. Solche lang wirkenden Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Somit können die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten Polymeren, hydrophoben Materialien (zum Beispiel eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauscherharzen, oder als schwerlösliche Derivate, zum Beispiel als schwerlösliches Salz, formuliert werden.
Ein pharmazeutischer Träger für die hydrophoben Verbindungen gemäß der Erfindung ist ein Ko-Lösungsmittelsystem, das Benzylalkohol, ein nicht polares Tensid, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase umfasst. Das Ko-Lösungsmittelsystem kann das VPD Ko-Lösungsmittelsystem sein. VPD ist eine Lösung aus 3% w/v Benzylalkohol, 8% w/v des nicht polaren Tensids Polysorbat 80 und 65% w/v Polyethylenglykol 300 auf das Volumen aufgefüllt mit absolutem Ethanol. Das VPD Ko-Lösungsmittelsystem (VPD:D5W) besteht aus VPD verdünnt 1:1 mit einer 5%igen Dextroselösung in Wasser. Dieses Ko-Lösungsmittelsystem löst hydrophobe Verbindungen gut auf und besitzt selber bei systemischer Verabreichung eine niedrige Toxizität. Natürlicherweise können die Anteile eines Ko-Lösungsmittelsystems beträchtlich variiert werden ohne seine Löslichkeits- und Toxizitätseigenschaften zu zerstören. Ferner kann die Identität der Ko-Lösungsmittelbestandteile variiert werden: zum Beispiel können anstelle von Polysorbat 80 andere nicht polare Tenside mit niedriger Toxizität verwendet werden; die Fraktionsgröße von Polyethylenglykol kann variiert werden; andere biokompatible Polymere, zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon, können Polyethylenglykol ersetzen; und andere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
Alternativ können andere Abgabesysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposomen und Emulsionen sind gut bekannte Beispiel von Abgabeträgern für hydrophobe Medikamente. Bestimmte organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid, können ebenfalls verwendet werden, obwohl gewöhnlich auf Kosten einer größeren Toxizität. Zusätzlich können die Verbindungen unter Verwendung eines Systems zur verzögerten Freisetzung, wie zum Beispiel semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das therapeutische Mittel enthalten, abgegeben werden. Verschiedene Materialien zur verzögerten Freisetzung haben sich etabliert und sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Kapseln zur verzögerten Freisetzung können, abhängig von ihrer chemischen Zusammensetzung, die Verbindungen über einige Wochen bis zu über 100 Tage freisetzen. Abhängig von ihrer chemischen Zusammensetzung und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagenz können zusätzliche Strategien für die Proteinstabilisierung verwendet werden.
Viele der PTK modulierenden Verbindungen gemäß der Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, etc. gebildet werden. Salze neigen dazu in wässrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechenden Formen mit freier Base.
c) Wirksame Dosierung
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen ein, in denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer Menge enthalten sind, die wirksam ist, um den beabsichtigten Zweck zu erzielen. Insbesondere meint eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge einer Verbindung, die wirksam ist Symptome einer Krankheit zu verhindern, zu lindern oder zu verbessern oder das Überleben des behandelten Subjektes zu verlängern. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge liegt innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns, insbesondere im Licht der hierin gelieferten detaillierten Offenbarung.
Für jede Verbindung, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich aus Zellkulturassays abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann in Tiermodellen eine Dosis formuliert werden, um einen zirkulierenden Konzentrationsbereich zu erzielen, der den IC₅₀, wie in der Zellkultur bestimmt (d. h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibition der PTK Aktivität erreicht), einschließt. Solche Informationen können verwendet werden, um nützliche Dosen in Menschen genauer zu bestimmen.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der hierin beschriebenen Verbindungen können über pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren, zum Beispiel zur Bestimmung der LD₅₀ (der Dosis, der für 50% der Population letal ist) und der ED₅₀ (der Dosis, die in 50% der Population therapeutisch wirksam ist), bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis zwischen LD₅₀ und ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indices aufweisen, werden bevorzugt. Die Daten, die aus diesen Zellkulturassays und Tierstudien erhalten werden, können bei der Formulierung eines Bereichs von Dosierungen für die Verwendung in Menschen verwendet werden. Die Dosierung von solchen Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Konzentrationen im Blutkreislauf, die den ED₅₀ mit wenig oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches abhängig von der Dosierungsform, die verwendet wird, und dem verwendeten Verabreichungsweg variiert werden. Die exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung kann von dem einzelnen Arzt angesichts des Zustandes des Patienten gewählt werden (siehe z. B. Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1.1).
Die Dosismenge und das Intervall kann individuell angepasst werden, um Plasmalevel des aktiven Restes zu liefern, die ausreichend sind, um die Kinase modulierenden Wirkungen, oder die minimale wirksame Konzentration (MEC), beizubehalten. Die MEC wird für jede Verbindung variieren, aber kann aus in vitro Daten abgeschätzt werden; zum Beispiel als die Konzentration, die notwendig ist um 50–90% Inhibition der Kinase unter Verwendung der hierin beschriebenen Assays zu erzielen. Dosierungen, die notwendig sind, um die MEC zu erzielen, hängen von individuellen Eigenschaften und dem Verabreichungsweg ab. HPLC Assays oder Bioassays können jedoch verwendet werden, um Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
Die Dosierungsintervalle können ebenfalls unter Verwendung des MEC Wertes bestimmt werden. Verbindungen sollten in einer Kur verabreicht werden, die die Plasmalevel für 10–90%, vorzugsweise zwischen 30–90% und am bevorzugtesten zwischen 50–90% der Zeit über dem MEC hält.
In Fällen von lokaler Verabreichung oder der selektiven Aufnahme kann die wirksame lokale Konzentration des Medikamentes nicht in Beziehung zu der Plasmakonzentration gesetzt werden.
Die Menge der verabreichten Zusammensetzung wird natürlich von dem behandelten Subjekt, dem Gewicht des Subjektes, dem Schweregrad der Beschwerden, der Art der Verabreichung und der Einschätzung des verschreibenden Arztes abhängig sein.
d) Verpackung
Die Zusammensetzungen können, wenn gewünscht, in einer Verpackung oder einer Spendereinheit bereitgestellt werden, die ein oder mehrere Einheitsdosisformen, die den aktiven Inhaltsstoff enthalten, enthalten können. Die Verpackung kann zum Beispiel Metall oder Plastikfolie, wie zum Beispiel eine Blisterpackung, umfassen. Die Verpackung oder Spendereinheit kann von Anweisungen für die Verabreichung begleitet werden. Die Verpackung oder der Spender kann ebenfalls von einer Notiz, die mit dem Behälter verbunden ist, in einer Form, die durch eine Regierungsbehörde, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika reguliert, vorgeschrieben ist, begleitet werden, wobei die Notiz die Zulassung der Verbindungsform für die menschliche oder veterinäre Verabreichung durch die Behörde widerspiegelt. Eine solche Notiz kann zum Beispiel eine Kennzeichnung, die durch die US Food and Drug Administration für verschreibungspflichtige Medikamente anerkannt wird oder eine anerkannte Produktbeilage sein. Zusammensetzungen, die eine Verbindung gemäß der Erfindung in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formuliert umfassen, können ebenfalls hergestellt, in einen angemessenen Behälter platziert, und für die Behandlung einer angezeigten Krankheit markiert werden. Geeignete Krankheiten, die auf der Kennzeichnung angegeben sind, können die Behandlung eines Tumors, Inhibition der Angiogenese, die Behandlung von Fibrose und Diabetes einschließen.
Zusätzliche Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen der Verbindungen, Verfahren zur Bestimmung der Mengen von Verbindungen, die an einen Patienten verabreicht werden sollen, und Arten, um Verbindungen an einen Organismus zu verabreichen werden in der US Anmeldung mit der Seriennummer 08/702,232 von Tang, et al., und betitelt "Kombinatorische Indolinon-Bibliotheken und verwandte Produkte und Verfahren für die Behandlung von Krankheiten", eingereicht am 23. August 1996 und die internationale Patenveröffentlichung Nr. WO 96/22976 von Buzzetti et al., und betitelt "Wasserlösliche 3-Aryliden-2- Oxindolderivate als Tyrosinkinaseinhibitoren", veröffentlicht am 1. August 1996 offenbart. Der Durchschnittsfachmann wird anerkennen, dass solche Beschreibungen auf die vorliegende Erfindung anwendbar sind und einfach daran angepasst werden können.
Beispiele
Die unten stehenden Beispiele sind beispielhaft für verschiedene Aspekte und Merkmale der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele beschreiben Verfahren zur Synthese der Verbindungen gemäß der Erfindung und Verfahren zum Messen der Wirkung einer Verbindung auf die Funktion einer Proteinkinase.
Die Zellen, die in den Verfahren verwendet werden, sind kommerziell oder von akademischen Laboratorien erhältlich oder wurden aus kommerziell erhältlichen Zellen hergestellt. Die Nukleinsäurevektoren, die die Zellen enthalten, sind ebenfalls kommerziell erhältlich und die Sequenzen von Genen für die verschiedenen Proteinkinasen sind einfach in Sequenzdatenbanken zugänglich. Somit kann der Durchschnittsfachmann einfach die Zelllinien in einer zeitgerechten Art und Weise durch das Kombinieren der kommerziell erhältlichen Zellen, der kommerziell erhältlichen Nukleinsäurevektoren und den Proteinkinasegenen unter Verwendung von Techniken, die dem Durchschnittsfachmann einfach zugänglich sind, neu erzeugen.
Assayverfahren
Die folgenden in vitro Assays können verwendet werden, um den Grad der Aktivität und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehrere der PKs zu bestimmen. Ähnliche Assays können gemäß denselben Vorschriften für jede PK unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Techniken entworfen werden.
Die zellulären/katalytischen Assays, die hierin beschrieben werden, werden in einem ELISA Format durchgeführt. Das generelle Vorgehen ist wie folgt: Eine Verbindung wird in Zellen, die die Testkinase entweder natürlich oder rekombinant exprimieren, für einen gewissen Zeitraum eingeführt, nachdem, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand, für den bekannt ist, das er den Rezeptor aktiviert, zugegeben wird. Die Zellen werden lysiert und das Lysat wird in die Vertiefungen einer ELISA Platte, die zuvor mit einem spezifischen Antikörper, der das Substrat der enzymatischen Phosphorylierungsreaktion erkennt, beschichtet worden ist, überführt. Nicht-Substrat Bestandteile des Zelllysats werden weggewaschen und die Menge der Phosphorylierung des Substrates verglichen mit Kontrollzellen, die nicht mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wurden, wird mit einem Antikörper nachgewiesen, der spezifisch Phosphotyrosin erkennt. Der Assay kann ebenfalls an den Nachweis durch einen Western Blot angepasst werden.
Die zellulären/biologischen Assays, die hierin beschrieben werden, messen die Menge von DNA, die in Antwort auf die Aktivierung einer Testkinase hergestellt wurde, was ein allgemeines Maß einer proliferativen Antwort ist. Das allgemeine Vorgehen für diesen Assay ist wie folgt: Eine Verbindung wird in Zellen, die die Testkinase entweder natürlich oder rekombinant exprimieren, eingebracht, wonach, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, nach einem gewissen Zeitraum ein Ligand zugegeben wird, für den bekannt ist, das er den Rezeptor aktiviert. Nach der Inkubation für mindestens über Nacht wird ein DNA-markierendes Reagenz, wie zum Beispiel Bromdeoxy-Uridin (BrdU) oder 3H-Thymidin zugegeben. Die Menge an markierter DNA wird entweder mit einem Anti-BrdU Antikörper oder durch Messen der Radioaktivität bestimmt und mit Kontrollzellen, die nicht mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wurden, verglichen.
Zelluläre/Katalytische Assays
Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) können verwendet werden, um das Vorhandensein von PK Aktivität nachzuweisen und zu messen. Der ELISA kann gemäß bekannten Protokollen, die zum Beispiel in Voller, et al., 1980, "Enyzme-Linked Immunosorbent Assay", In: Manual of Clinical Immunology, 2te Auflage, editiert von Rose und Friedman, Seiten 359–371, Am. Soc. of Microbiology, Washington D.C., beschrieben werden, durchgeführt werden.
Das offenbarte Protokoll kann zum Bestimmen der Aktivität einer spezifischen PK, wie zum Beispiel c-kit Kinase, angepasst werden. Die bevorzugten Protokolle zur Durchführung der ELISA Experimente für die spezifische PK, c-kit Kinase, werden unten bereitgestellt. Die Anpassung von diesen Protokollen für die Bestimmung der Aktivität einer Verbindung für andere Mitglieder der RTK Familie sowie für CTKs und STKs liegt gut innerhalb des Umfanges des Wissens des Durchschnittsfachmanns.
Beispiel 1: Die Aktivität der Verbindungen gemäß der Erfindung
Die biochemische Aktivität von einigen der Verbindungen gemäß der Erfindung wurde unter Verwendung der beschriebenen Assays getestet. Die IC₅₀ Werte wurden für mehrere der Verbindungen gemäß der Erfindung gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
A. Materialien und Reagenzien

1) HNTG: 5× Stockkonzentration: 100 mM HEPES pH 7,2, 750 mM NaCl, 50% Glycerin, 2,5% Triton X-100
2) PBS (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salzlösung): Gibco Katalog #450-1300EB
3) 1× Blockierungspuffer: 10 mM TRIS-pH 7,5, 1% BSA, 100 mM NaCl, 0,1% Triton X-100
4) 1× Kinasepuffer: 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 6 mM MnCl₂
5) PMSF Stocklösung = 100 mM (Sigma Katalog #P-7626)
6) 10 mM ATP (Bakterielle Quelle) Sigma A-7699, 5 g
7) UB40 Anti-Phosphotyrosin mAb
8) HRP-konjugiertes Schaf Anti-Maus IgG (Amersham NA 931)
9) ABTS (5Prime-3Prime 7-579844)
10) TRIS HCL: Fisher BP 152-5
11) NaCl: Fisher S271-10
12) Triton X-100: Fisher BP151-100
13) Na₃VO₄: Fisher S454-50
14) MgCl₂: Fisher M33-500
15) MnCl₂: Fisher M87-500
16) HEPES: Fisher BP310-500
17) Albumin, Rinder-(BSA): Sigma A-8551
18) TBST Buffer: 50 mM Tris pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100
19) affinitätsgereinigter Ziegen Anti-Kaninchen IgG Antikörper (gesamtes Molekül): Cappel 55641
20) Anti Kit (C-20) polyklonaler Kanichen IgG Antikörper: Santa Cruz sc-168
21) Kit/CHO Zellen: CHO Zellen, die stabil GyrB/Kit exprimieren und die in Standard CHO Medium ergänzt mit 1 mg/ml G418 wachsen.
22) Indolinonverbindungen: Die Indolinonverbindungen wurden wie in der folgenden Anmeldung dargelegt synthetisiert: PCT Anmeldung Nr. US99/06468, eingereicht am 26. März 1999 durch Fong, et al. und betitelt "Verfahren zur Modulation von Tyrosinproteinkinasen" (Lyon & Lyon Docket Nr. 231/250 PCT).

B. Verfahren
Alle der folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern es nicht spezifisch angegeben ist. Alle ELISA Platten Waschschritte werden durch 4-maliges Spülen mit TBST durchgeführt.
Kit Zelllyse
Diese Prozedur wird eine Stunde vor dem Beginn des Einfangens des Rezeptors durchgeführt.

1) Waschen eines > 95% konfluenten 15 cm Schälchens mit PBS und Abziehen von so viel wie möglich.
2) Lyse der Zellen mit 3 ml 1× HNTG, das 1 mM PMSF enthält, pro 15 cm Platte. Abschaben der Zellen von der Platte und Überführen in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen.
3) Vereinigen der Überstände und Aufbewahren auf Eis für eine Stunde mit gelegentlichem Vortexen. Wird nicht so vorgegangen, führt das zu einem erhöhten Hintergrund (ungefähr 3-mal höher).
4) Ausbalancieren der Röhrchen und Zentrifugieren bei 10000 × g für 10 min bei 4°C. Entnehmen eines Aliquots für die Proteinbestimmung.
5) Durchführen der Proteinbestimmung nach dem SOP für die Proteinbestimmung unter Verwendung des Bicinchonsäure (BCA) Verfahrens.

ELISA Verfahren

1) Beschichten von Corning 96-Vertiefungs-ELISA-Platten mit 2 μg Ziegen Anti-Kaninchen Antikörper in PBS pro Vertiefung mit einem gesamten Vertiefungsvolumen von 100 μl. Aufbewahren über Nacht bei 4°C.
2) Entfernen von ungebundenem Ziegen Anti-Kaninchen Antikörper durch Invertieren der Platte, um Flüssigkeit entfernen.
3) Zufügen von 100 μl Blockierungspuffer zu jeder Vertiefung. Schütteln bei Raumtemperatur für 60 min.
4) 4-mal Waschen mit TBST. Abklopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überflüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
5) Zugeben von 0,2 μg Kaninchen Anti-Kit Antikörper verdünnt in TBST auf ein Gesamtvolumen von 100 μl pro Vertiefung. Schütteln bei Raumtemperatur für 60 min.
6) Verdünnen des Lysates in HNTG (180 μg Lysat/100 μl)
7) Zugeben von 100 μl von verdünntem Lysat zu jeder Vertiefung. Schütteln bei Raumtemperatur für 60 min.
8) 4-mal Waschen mit TBST. Abklopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überflüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
9) Verdünnen der Verbindungen/Extrakte (oder wie anders angegeben) in 1× Kinasepuffer, mit 5 μM ATP in Polypropylen 96-Vertiefungsplatten.
10) Überführen von 100 μl verdünntem Medikament in ELISA Plattenvertiefungen. Inkubieren bei Raumtemperatur unter Schütteln für 60 min.
11) Stoppen der Reaktion durch die Zugabe von 10 μl 0,5 M EDTA. Die Platte ist nun für einen angemessenen Zeitraum stabil.
12) 4-mal Waschen mit TBST. Abklopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überflüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
13) Zugeben von 100 μl UB40 (1:2000 Verdünnung in TBST) pro Vertiefung. Inkubieren für 60 min bei Raumtemperatur unter Schütteln.
14) 4-mal Waschen mit TBST. Abklopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überflüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
15) Zugeben von 100 μl Schaf Anti-Maus IgG-HRP (1:5000 Verdünnung in TBST) pro Vertiefung. Inkubieren für 60 min bei Raumtemperatur unter Schütteln.
16) 4-mal Waschen mit TBST. Abklopfen der Platte auf ein Papiertuch, um überflüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
17) Zugeben von 100 μl ABTS pro Vertiefung. Inkubieren unter Schütteln für 15–30 min.
18) Auslesen des Assays auf einem Dynatech MR7000 ELISA Reader Testfilter = 410 nm Referenzfilter = 630 nm

Beispiel II: Die Aktivität der Verbindungen gemäß der Erfindung
Die biochemische Aktivität von zweien der Verbindungen gemäß der Erfindung wurde unter Verwendung der unten beschriebenen Assays getestet.
Verfahren:
Zelllinien
MO7E Zellen, eine menschliche myeloische Leukämiezelllinie, wurden in RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und jeweils 10 ng/ml IL-3 und GM-CSF gehalten.
Nachweis der c-kit Tyrosinphosphorylierung
MO7E Zellen wurden über Nacht in 0,1% Serum Hungerbedingungen ausgesetzt. Die Zellen wurden mit Verbindung Acht für 2 Stunden oder mit Verbindung Sechs für 22 Stunden (gleichzeitig mit Serumhungerbedingungen) vor der Stimulation durch Liganden vorbehandelt. Die Zellen wurden mit 250 ng/ml rh-SCF für 15 min stimuliert. Nach der Stimulation, wurden die Zellen lysiert und mit einem Anti-c-kit Antikörper immunopräzipitiert. Phosphotyrosin- und Proteinlevel wurden über einen Western Blot bestimmt.
MTT Proliferationsassay
MO7E Zellen wurden unter Serumhungerbedingungen mit Verbindungen wie für die Phosphorylierungsexperimente beschrieben vorbehandelt. Die Zellen wurden mit 4 × 10⁵ Zellen/Vertiefungen einer 96 Wellplatte mit 100 μl RPMI + 10% Serum ausplattiert. rh-SCF (100 ng/ml) wurde zugegeben und die Platte wurde für 48 Stunden inkubiert. Nach 48 Stunden, wurden 10 μl 5 mg/ml MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid] zugegeben und für 4 Stunden inkubiert. Saures Isopropanol (100 μl 0,04 N HCL in Isopropanol) wurde zugegeben und die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen.
Apoptose Assays
MO7E Zellen wurden +/–SCF und +/–Verbindung (Verbindung Sechs oder Verbindung Acht mit 5 und 25 μM) in 10% FBS mit rh-GM-CSF (10 ng/ml) und rh-IL-3 (10 ng/ml) inkubiert. Die Proben wurden bei 24 und 48 Stunden untersucht. Um aktivierte Caspase-3 zu messen, wurden die Proben mit PBS gewaschen und mit eiskaltem 70% Ethanol permeabilisiert. Die Zellen wurden dann mit PE-konjugierten polyklonalen Kaninchen Anti-aktive Caspase-3 gefärbt und über FACS analysiert. Um gespaltenes PARP zu messen, wurden die Proben lysiert und mittels Western Blot mit einem Anti-PARP Antikörper analysiert.
Inhibition der biologischen Funktionen von c-kit durch Verbindung Acht und Verbindung Sechs
Ergebnisse:
Inhibition der Tyrosinphosphorylierung von c-kit:
Verbindung Acht und Verbindung Sechs hemmen die Tyrosinphosphorylierung von c-kit in MO7E Zellen, einer menschlichen myeloischen Leukämiezelllinie, in Antwort auf Ligandenstimulation mit Stammzellfaktor (SCF). In mit Verbindung Acht behandelten Zellen wurde bei 0,01 μM keine Inhibition der Phosphorylierung beobachtet, bei 0,1 μM wurde eine teilweise Inhibierung beobachtet und bei 1 und 10 μM wurde die vollständige Inhibition beobachtet. In mit Verbindung Sechs behandelten Zellen wurde bei 0,01 μM oder bei 0,1 μM keine Inhibition der c-kit Tyrosinphosphorylierung beobachtet, bei 1 μM wurde eine teilweise Inhibition beobachtet und bei 10 μM wurde vollständige Inhibition beobachtet.
Inhibition der c-kit vermittelten Proliferation
Verbindung Acht und Verbindung Sechs hemmen ebenfalls den c-kit vermittelten Signalweg in MO7E Zellen in einem MTT Proliferationsassay. Der IC₅₀ Wert für die Inhibition der Proliferation durch Verbindung Acht beträgt ungefähr 0,5 bis 1,0 μM und der IC₅₀ Wert für Verbindung Sechs beträgt ungefähr 5 bis 7 μM.
Induktion der Apoptose
Verbindung Acht und Verbindung Sechs induzieren in MO7E Zellen in einer Dosis- und zeitabhängigen Art ebenfalls Apoptose. Apoptose wurde mit zwei Assays beurteilt: einer FACS Analyse mit einem Antikörper, der aktivierte Caspase-3, die während der Apoptose induziert wird, in Zellen erkennt, und einem Western Blot Assay, der abgespaltene Fragmente von Poly (ADP-Ribose) Polymerase, die ebenfalls während der Apoptose induziert wird, erkennt.
Unter Verwendung des Caspase-3 Assays, wurde bei SCF-Stimulation und Behandlung mit 25 μM Verbindung Acht verglichen mit unbehandelten SCF stimulierten Zellen nach 48 Stunden ein ungefähr 50%-iger Anstieg in der Anzahl der apoptotischen Zellen beobachtet. Ein geringer Effekt wurde nach 48 Stunden mit 25 μM Verbindung Acht in Abwesenheit der SCF-Stimulation beobachtet. Die Behandlung für 24 Stunden mit 25 μM Verbindung Acht (+/–SCF-Stimulation) führte zu einer messbaren aber kleineren Anzahl von apoptotischen Zellen.
Die Behandlung von Zellen mit 5 μM Verbindung Acht für 24 oder 48 Stunden (+/–SCF-Stimulation) führte ebenfalls zu einer messbaren aber kleineren Anzahl von apoptotischen Zellen.
Ähnliche Ergebnisse wurden für Verbindung Sechs erhalten, mit der Ausnahme, dass mit 5 μM Verbindung Sechs nach 24 Stunden mit oder ohne SCF-Stimulation keine Wirkung beobachtet wurde.
Unter Verwendung des PARP Assays, führte die Behandlung mit 25 μM Verbindung Acht für 48 Stunden zum größten Anstieg in der Menge an gespaltenem PARP. Die Wirkung wurde durch SCF-Stimulation leicht verstärkt. Die 24 Stundenprobe, die mit 25 μM Verbindung Acht behandelt wurde, war ähnlich der 48 Stundenprobe.
Die Behandlung mit 5 μM Verbindung Acht, an beiden Zeitpunkten, führte zu einem sehr geringen Anstieg an gespaltener PARP.
Ähnliche Ergebnisse wurden für Verbindung Sechs erhalten.

Claims

Verwendung einer Indolinonverbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von oder Vorbeugung vor einem oder mehreren gastrointestinalen Stromatumoren in einem Organismus, wobei besagte Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge besagter Indolinonverbindung umfasst, und wobei besagte Verbindung in der Lage ist, die Funktion der c-Kit Rezeptortyrosinkinase zu inhibieren, und ausgewählt wird aus der Gruppe:
Verwendung einer Indolinonverbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung allergie-assoziierter chronischer Rhinitis, Mastozytose, der Anwesenheit von einem oder mehreren Mastzelltumoren oder Asthma in einem Organismus, wobei besagte Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge von besagter Indolinonverbindung, die wie in Anspruch 1 definiert ist, umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei besagter Organismus ein Säugetier ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei besagter Organismus ein Mensch ist.