DE69829657T2

DE69829657T2 - 2-indolinonderivate als modulatoren der proteinkinase-ativität

Info

Publication number: DE69829657T2
Application number: DE69829657T
Authority: DE
Inventors: Cho Peng Tang; Li Sun; Gerald Mcmahon; Kay Laura SHAWVER; Peter Klaus HIRTH
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-07
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2018-05-08
Also published as: AU7684298A; DE69829657D1

Description

Einführung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue 2-Indolinonderivate, insbesondere substituierte Diazaindolinone, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten und die Verwendung dieser Verbindungen bei der Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Störungen, die eine abnorme Proteinkinase-(„PK")-aktivität betreffen.
Hintergrund der Erfindung
Das Folgende wird nur als Hintergrundinformation bereitgestellt und wird nicht als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung anerkannt.
PKs sind Enzyme, die die Phosphorylierung von Hydroxygruppen bei Tyrosin-, Serin- und Threoninresten von Proteinen katalysieren. Die Folgen dieser scheinbar einfachen Aktivität sind Staffelung, Zellwachstum, Differentiation und Proliferation, d.h. nahezu alle Aspekte des Zelllebens hängen auf die eine oder andere Weise von der PK-Aktivität ab. Des Weiteren ist abnorme PK-Aktivität mit einer Schar von Krankheiten verbunden, die von relativ nicht lebensbedrohenden Erkrankungen, wie zum Beispiel Schuppenflechte, zu extrem bösartigen Erkrankungen, wie zum Beispiel Glioblastoma (Gehirnkrebs), reichen.
Die PKs können gewöhnlich in zwei Klassen aufgeteilt werden, die Proteintyrosinkinasen (PTKs) und die Serin-Threoninkinasen (STKs).
Einer der Hauptaspekte der PTK-Aktivität ist deren Beteiligung bei Wachstumsfaktorrezeptoren. Wachstumsfaktorrezeptoren sind Zelloberflächenproteine. Wenn sie durch einen Wachstumsfaktorliganden gebunden werden, werden die Wachstumsfaktorrezeptoren in eine aktive Form überführt, welche mit Proteinen an der inneren Oberfläche einer Zellmembran wechselwirken. Dies führt zur Phosphorylierung von Tyrosinresten des Rezeptors und anderen Proteinen und zu der Bildung von Komplexen mit einer Vielzahl von cytoplasmischen Signalmolekülen innerhalb der Zelle, die wiederum zahlreiche zelluläre Antworten, wie zum Beispiel Zellteilung (Proliferation), Zelldifferentiation, Zellwachstum, Exprimierung von metabolischen Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung, etc. beeinflussen. Für eine vollständigere Diskussion siehe Schlessinger und Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992).
Wachstumsfaktorrezeptoren mit PK-Aktivität sind als Rezeptortyrosinkinasen („RTKs") bekannt. Sie umfassen eine große Familie von Transmembranrezeptoren mit unterschiedlicher biologischer Aktivität. Gegenwärtig sind wenigstens neunzehn (19) unterschiedliche Unterfamilien von RTKs identifiziert worden. Ein Beispiel dieser ist die Unterfamilie, die als „HER" RTKs bezeichnet wird, welche EGFR (epithelialer Wachstumsfaktorrezeptor), HER2, HER3 und HER4 beinhaltet. Diese RTKs bestehen aus einer extrazellulären glycosylilierten Ligandenbindungsdomain, einer Transmembrandomain und einer intrazellulären cytoplasmischen katalytischen Domain, die Tyrosinreste auf Proteinen phosphorylieren können.
Eine andere RTK-Unterfamilie besteht aus einem Insulinrezeptor (IR), einem insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I-Rezeptor (IGF-1R) und dem Insulinrezeptor bezogenen Rezeptor (IRR). IR und IGF-1R wechselwirken mit Insulin, IGF-I und IGF-II, um ein Heterotetramer von zwei völlig extrazellulär glycosylilierten a-Untereinheiten und zwei ß-Untereinheiten zu bilden, die die Zellmembran kreuzen und die die Tyrosinkinasedomain enthalten.
Eine dritte RTK-Unterfamilie wird als von Blutplättchen stammende Wachstumsfaktorrezeptorgruppe („PDGFR") bezeichnet, die PDGFRa, PDGFRß, CSFIR, c-kit und c-fms beinhaltet. Diese Rezeptoren bestehen aus glycosylilierten extrazellulären Domains, die aus variablen Anzahlen von immunoglobinähnlichen Schleifen zusammengesetzt sind und einer intrazellulären Domain, wobei die Tyrosinkinasedomains durch unverbundene Aminosäuresequenzen unterbrochen werden.
Eine andere Gruppe, die manchmal aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu der PDGFR-Unterfamilie in die letztgenannte Gruppe subsumiert wird, ist die Fötusleberkinase-(„flk") Rezeptorunterfamilie. Von dieser Gruppe nimmt man an, dass sie aus Kinase-Insert-Domain-Rezeptor fötaler Leberkinase-1 (KDR/FLK-1), flk-1R, flk-4 und fms-ähnliche Tyrosinkinase 1 (flt-1) zusammengesetzt ist.
Ein weiteres Mitglied der Tyrosinkinase-Wachstumsfaktorezeptor-Familie ist die Fibroplastwachstumsfaktor („FGF") Rezeptorgruppe. Diese Gruppen bestehen aus vier Rezeptoren, FGFR1-4 und sieben Liganden, FGF1-7. Obwohl bis jetzt noch nicht genau definiert, scheint es, dass die Rezeptoren aus einer glycosylilierten extrazellulären Domain, die eine variable Anzahl von immunoglobinähnlichen Schleifen enthält, und einer intrazellulären Domain, in welcher die PTK-Sequenz durch Regionen ungebundenen Aminosäuresequenzen unterbrochen wird, bestehen.
Eine vollständigere Auflistung der bekannten RTK-Unterfamilien wird bei Plowman et al., DN&P, 7(6):334-339 (1994) beschrieben.
Zusätzlich zu den RTKs existiert ebenfalls eine Familie von vollständig intrazellulären PTKs, die „Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen" oder „zelluläre Tyrosinkinasen" genannt werden. Diese letztgenannte Bezeichnung, die „CTK" abgekürzt wird, wird hier verwendet werden. CTKs enthalten keine extrazellulären und transmembranen Domains. Gegenwärtig sind über 24 CTKs in 11 Unterfamilien (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak und Ack) identifiziert worden. Die Src-Unterfamilie scheint bis jetzt die größte Gruppe von CTKs zu sein und beinhaltet Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk. Für eine detaillierte Diskussion über CTKs, siehe Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993).
Die Serin-Threoninkinasen oder STKs, wie die CTKs, sind vorherrschend intrazellulär, obwohl es einige Rezeptorkinasen vom STK-Typ gibt. STKs sind die häufigsten der cytosolischen Kinasen, d.h. Kinasen, die ihre Funktion in dem Teil des Cytoplasmas ausführen, abweichend von cytoplasmischen Organellen und Cytoskelton. Das Cytosol ist die Region in der Zelle, wo vieles des dazwischenliegenden Metabolismus und der biosynthetischen Aktivität der Zelle auftritt, z.B. werden in den Cytosolen die Proteine an Ribosomen synthetisiert.
RTKs, CTKs und STKs sind alle in einer Schar von patogenen Bedingungen, einschließlich bezeichnenderweise einer großen Anzahl verschiedener Krebsarten einbezogen. Andere patogene Bedingungen, die mit PTKs verbunden sind, beinhalten ohne Beschränkung Schuppenflechte, hepatische Zirrhose, Diabetes, Atheriosklerose, Angiogenese, Restinose, okulare Erkrankungen, rheumatoide Arthritis und andere Entzündungskrankheiten, Autoimmunerkrankungen und eine Vielzahl renaler Erkrankungen.
Im Hinblick auf Krebs betreffen zwei der Haupthypothesen, die entwickelt wurden, um die exzessive zelluläre Proliferation, die die Tumorentwicklung vorantreibt, zu erklären, Funktionen, die bekannt sind, PK-reguliert sein. Das heißt, es ist vorgeschlagen worden, dass sich bösartiges Zellwachstum aus einem Zusammenbruch in dem Mechanismus ergibt, der die Zellteilung und/oder Differenziation kontrolliert. Man hat gezeigt, dass Proteinprodukte einer Anzahl von Protoonkogenen beim Signalweg, der das Zellwachstum und die Differentiation reguliert, involviert sind. Diese Proteinprodukte von Protoonkogenen beinhalten die extrazellulären Wachstumsfaktoren, Transmembranwachstumsfaktor PTK-Rezeptoren (RTKs), cytoplasmische PTKs (CTKs) und cytosolische STKs, wie oben diskutiert.
In Anbetracht der offensichtlichen Verbindung zwischen auf PK bezogenen zellulären Aktivitäten und einer Anzahl von menschlichen Erkrankungen ist es keine Überraschung, dass eine große Anstrengung aufgewendet wird in einem Versuch, Wege zu identifizieren, um die PK-Aktivität zu modulieren.
Einige davon haben biomimetische Versuche beinhaltet, wobei großer Moleküle, die auf die zugeschnitten sind, die in den tatsächlichen zellulären Verfahren involviert sind, verwenden (z.B., Mutantliganden (U.S. Anm. Nr. 4,966,849); lösliche Rezeptoren und Antikörper (Anm. Nr. WO 94/10202, Kendall und Thomas, Proc. Nat 1 Acad. Sci., 90:10705-09 (1994), Kim, et al., Nature, 362:841-844 (1993)); RNA ligands (Jelinek, et al., Biochemistry, 33:10450-56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4:358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199:56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152:448-57) und Tyrosinkinaseinhibitoren (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; U.S. Pat. Nr. 5,330,992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35:2268 (1994)).
Kürzlich sind Versuche unternommen worden, kleine Moleküle zu identifizieren, die als PK-Inhibitoren wirken. Zum Beispiel sind bis-monocyclische, bicyclische und heterocyclische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylen-Azaindolderviate (PCT WO 94/14808) und 1-Cyclopropyl-4-pyridylchinole (U.S. Pat. Nr. 5,330,992) als PTK-Inhibitoren beschrieben worden. Styrolverbindungen (U.S. Pat. Nr. 5,217,999), Styrolsubstituierte Pyridylverbindungen (U.S. Pat. Nr. 5,302,606), Chinazolinderivate (EP-Anmeldung Nr. 0 566 266 Al), Selenaindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyclische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495) sind alle als PTK-Inhibitoren beschrieben worden, die bei der Behandlung von Krebs verwendbar sind.
Unsere eigenen Anstrengungen, um kleine organische Moleküle zu identifizieren, die die PK-Aktivität modulieren und die deshalb bei der Behandlung und Prävention von Erkrankungen, die durch abnormale PK-Aktivität vorangetrieben werden, verwendbar sein sollten, haben uns zu der Entdeckung einer Familie neuer 2-Indolinolderivate geführt, die exzellente PK-Modulierungsfähigkeit zeigen und die Gegenstand dieser Erfindung sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen neue 2-Indolinolderivate und ihre Salze, die die Aktivität von Rezeptorproteintyrosinkinasen (RTK), Nicht-Rezeptorproteintyrosinkinasen (CTK) und Serin/Threoninproteinkinasen (STK) modulieren. Insbesondere betrifft die Erfindung 3-Methylidenyl-substituierte Diaza-2-indolinole.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung pharmakologische Zusammensetzungen der offenbarten Verbindungen und ihre physiologisch geeigneten Salze und ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel oder einen Träger.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung dieser Verbindungen bei der Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Erkrankungen, die mit abnormaler Proteinkinaseaktivität verbunden sind, wie zum Beispiel Krebs, andere Proliferationserkrankungen, Diabetes, Autoimmunerkrankungen, Entzündungserkrankungen und Angiogenesen.
1. Die Verbindungen
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen mit der allgemeinen chemischen Struktur:
Sulfinyl, Sulfonyl, S-Sulfonamido, N-Sulfonamido, N-Trihalogenmethansulfonamido, Carbonyl, Aldehyd, Trihalogenmethylcarbonyl, C-Carboxy, O-Carboxy, Cyano, Nitro,
wobei
A² und A⁴ Stickstoff und A¹ und A³ Kohlenstoff sind oder A¹ und A³ Stickstoff und A² und A⁴ Kohlenstoff sind, wobei zu verstehen ist, dass wenn A¹, A², A³ und A⁴ Stickstoff ist, R³, R⁴, R⁵ bzw. R⁶ nicht vorhanden sind;
R¹ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Cycloalkyl, C2-C10 Alkenyl, C2-C10 Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Trihalomethancarbonyl, Heteroalicyclen, Hydroxy, C1-C10 Alkoxy, C-Carboxy, O-Carboxy, C-Amido, C-Thioamido, Guanyl, Guanidinylyl, Ureidylyl, Sulfonyl und Trihalogenmethansulfonyl besteht, ausgewählt wird.
R² aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Halogen besteht, ausgewählt wird;
R³, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Trihalogenmethyl, Cycloalkyl, C2-C10 Alkenyl, C2-C10 Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Heteroalicyclen, Hydroxy, Thiohydroxy, C1-C10 Alkoxy, Aryloxy, Thiohydroxy, C1-C10 Thioalkoxy, Thioaryloxy, Sulfinyl, Sulfonyl, S-Sulfonamido, N-Sulfonamido, N-Trihalogenmethansulfonamido, Carbonyl, Aldehyd, Trihalogenmethylcarbonyl, C-Carboxy, O-Carboxy, Cyano, Nitro, Halogen, Cyanato, Isocyanato, Thiocyanato, Isothiocyanato, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, Phosphonyl, Guanyl, Guanidinylyl, Ureidyl, C-Amido, N-Amido, Amino, quartäres Ammonium und -NR¹⁸R¹⁹ besteht, ausgewählt werden.
R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Carbonyl, Acetyl, Trihalogenmethylcarbonyl, C-Carboxy, Trihalogenmethansulfonyl, Sulfonyl, C-Peptidyl und, kombiniert, einem fünf- oder sechsgliedrigen heteroalicylischen Ring besteht, ausgewählt werden;
Z Sauerstoff ist;
ist;
J¹ aus der Gruppe, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel besteht, ausgewählt wird;
J², J³ und J⁴ unabhängig aus der Gruppe, die aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht, ausgewählt werden, so dass der fünfgliedrige Heteroarylring eine in der Chemie bekannte Verbindung ist, und es des Weiteren zu verstehen ist, dass, wenn J², J³ oder J⁴ Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind, R⁸, R^8' bzw. R^8'' nicht existieren; gleichermaßen existiert R⁷ nicht, wenn J¹ Sauerstoff oder Schwefel ist;
R⁷ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Cycloalkyl, Trihalogenmethylcarbonyl, Aryl, Guanyl, Carboxyl, Sulfonyl und Trihalogenmethansulfonyl besteht, ausgewählt wird;
einer von R⁸, R^8' oder R^8'' -H oder eine -(alk₁)rM-Gruppe ist, wobei (alk₁) CH₂ ist; r 1 bis einschließlich 3 ist und M aus der Gruppe, die aus Hydroxy, Amino, Carboxy, Morpholinyl, Piperazinyl, Tetrazolyl, N-Carbamyl, O-Carbamyl, S-Sulfonamido, N-Sulfonamido, Sulfonyl, -S(O)₂OH und Phosphonyl besteht, ausgewählt wird;
die übrigen beiden von R⁸, R^8' und R^8'' unabhängig aus der Gruppe, die aus:
Wasserstoff;
unsubstituiertem C1-C4 Alkyl;
C1-C4 Alkyl substituiert mit einer oder mehreren Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Halogen, Hydroxyl, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, Amino, S-Sulfonamido, -NR¹⁸R¹⁹ oder Carboxy;
unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy;
C1-C4 Alkoxy substituiert mit einem oder mehreren Halogenen;
unsubstituiertem Aryl;
Aryl substituiert mit einer oder mehreren Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, Amino, -NR¹⁸R¹⁹, Hydroxy oder S-Sulfonamido;
unsubstituiertem Heteroaryl;
Heteroaryl substituiert mit einer oder mehreren Gruppen ausgewählt aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, Amino, -NR¹⁸R¹⁹, Hydroxy oder S-Sulfonamido;
unsubstituierten Heteroalicyclen;
Heteroalicyclen substituiert mit einer oder mehreren Gruppen ausgewählt aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, Halogen, Hydroxy, unsubstituiertem Alkoxy, Amino oder -NR¹⁸R¹⁹;
Halogen;
Cyano;
Carboxy; und
einem, durch die Kombination von R⁸ und R^8' oder R^8' und R^8'' gebildeten, sechsgliedrigen Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- oder heteroalicyclischen Ring;
und physiologisch annehmbare Salze davon besteht, ausgewählt werden.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck „Alkyl" einen gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff, der geradkettige und Gruppen mit verzweigten Ketten beinhaltet. Die Alkylgruppe hat 1 bis 10 Kohlenstoffatome. Am bevorzugtesten ist sie ein niederes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Die Alkylgruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn sie substituiert ist, ist/sind die Substituentengruppe(n) eine oder mehrere, die einzeln aus unsubstituiertem Cycloalkyl, das aus der Gruppe, die aus Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Adamantan, Cyclohexadien, Cycloheptan und Cycloheptatrien besteht, ausgewählt wird; unsubstituiertem Aryl, das aus der Gruppe, die aus Phenyl, Naphthalenyl, und Anthracenyl besteht, ausgewählt wird; unsubstituiertem Heteroaryl, das aus der Gruppe, die aus Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin, Isochinolin, Purin und Carbazol besteht, ausgewählt wird; unsubstituierte Heteroalicyclen, die aus der Gruppe, die aus Piperidin, Morpholin, Piperazin, Pyrrolin, Pyrrolidin, Dihydrothiophen und Tetrahydrofuran besteht, ausgewählt werden; Hydroxy; C1-C4 Alkoxy; Aryloxy; Thiohydroxy; C1-C4 Thioalkoxy; Thioaryloxy; Cyano; Halogen; Carbonyl; Thiocarbonyl; O-Carbamyl; N-Carbamyl; O-Thiocarbamyl; N-Thiocarbamyl; C-Amido; N-Amido; C-Carboxy, O-Carboxy, Cyanato; Isocyanato; Thiocyanato; Isothiocyanato; Nitro; Silyl; Amino und -NR¹⁸R¹⁹, wobei R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem Cycloalkyl wie oben definiert, unsubstituiertem Aryl wie oben definiert, Carbonyl, Trihalogenmethylcarbonyl, C-Carboxy, Trihalogenmethylsulfonyl, Sulfonyl und kombiniert einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen heteroalicyclischen Ring wie oben definiert, besteht, ausgewählt wird, ausgewählt wird.
Eine „Cycloalkyl"-Gruppe betrifft einen vollständig aus Kohlenstoff bestehenden monocyclischen oder kondensierten Ring (d.h. Ringe, die ein benachbartes Paar von Kohlenstoffatomen teilen), wobei einer oder mehrere der Ringe kein vollständig konjugiertes Pi-Elektronensystem hat. Die Cycloalkylgruppe wird aus Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Adamantan, Cyclohexadien, Cycloheptan und Cycloheptatrien ausgewählt. Eine Cycloalkylgruppe kann substituiert oder unsubtituiert sein. Wenn sein substituiert ist, ist/sind die Substituentgruppe(n) eine oder mehrere, die einzeln aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem Aryl, das aus der Gruppe, die aus Phenyl, Naphthenyl und Anthracenyl besteht, ausgewählt wird; unsubstituiertem Heteroaryl, das aus der Gruppe, die aus Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin, Isochinolin, Purin und Carbazolo besteht, ausgewählt wird; unsubstituierten Heteroalicyclen, die aus der Gruppe, die aus Piperidin, Morpholin, Piperazin, Pyrrolin, Pyrrolidin, Dihydrothiophen und Tetrahydrofuran besteht, ausgewählt wird; Hydroxy; C1-C4 Alkoxy; Aryloxy; Thiohydroxy; C1-C4 Thioalkoxy; Thioaryloxy; Cyano; Halo; Carbonyl; Thiocarbonyl; Carboxy; O-Carbamyl; N-Carbamyl; C-Amido; N-Amido; Nitro; Amino und -NR¹⁸R¹⁹, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie oben definiert, ausgewählt wird.
Eine „Alkenyl"-Gruppe betrifft eine Alkylgruppe, wie hier definiert, die wenigstens aus zwei Kohlenstoffatomen und wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung besteht.
Eine „Alkynyl"-Gruppe betrifft eine Alkylgruppe, wie hier definiert, die aus wenigstens zwei Kohlenstoffatomen und wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung besteht.
Eine „Aryl"-Gruppe betrifft vollständig aus Kohlenstoff bestehende monocyclische oder ringkondensierte polycyclische Gruppen (d.h. Ringe, die sich benachbarte Paare von Kohlenstoffatomen teilen) mit einem vollständig kondensierten Pi-Elektronensystem. Die Arylgruppe wird aus Phenyl, Naphtalenyl und Anthracenyl ausgewählt. Die Arylgruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn substituiert, ist/sind die Substituentengruppe(n) eine oder mehrere, die individuell aus Halogen, Trihalomethyl, unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem Aryl, das aus der Gruppe, die aus Phenyl, Napthalenyl und Anthracenyl besteht, ausgewählt wird, unsubstituiertes Heteroaryl, das aus der Gruppe, die aus Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin, Isochinolin, Purin und Carbazol besteht, ausgewählt wird, unsubstituiertem Heteroalicyclus, der aus der Gruppe, die aus Piperidin, Morpholin, Piperazin, Pyrrolin, Pyrrolidin, Dihydrothiophen und Tetrahydrofuran besteht, ausgewählt wird, Hydroxy, C1-C4 Alkoxy, Aryloxy, Thiohydroxy, C1-C4 Thioalkoxy, Thioaryloxy, Cyano, Nitro, Carbonyl, Thiocarbonyl, C-Carboxy, O-Carboxy, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amido, N-Amido, Sulfinyl, Sulfonyl, S-Sulfonamido, N-Sulfonamido, Trihalomethansulfonamido, Amino und -NR¹⁸R¹⁹, R¹⁸ und R¹⁹, wie oben definiert, ausgewählt wird.
Wie hier verwendet, betrifft eine „Heteroaryl"-Gruppe eine monocyclische oder kondensierte Ringgruppe (d.h. Ringe, die ein benachbartes Paar von Atomen teilen), die in dem/den Ring(en) eine oder mehrere Atome haben, die aus der Gruppe, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht, ausgewählt werden und zusätzlich ein vollständig konjugiertes Pi-Elektronensystem haben. Die Heteroarylgruppe wird aus Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin, Isochinolin, Purin und Carbazol ausgewählt. Die Heteroarylgruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn sie substituiert ist, ist/sind die substituierte(n) Gruppen(n) eine oder mehrere, die aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem Cycloalkyl, das aus der Gruppe, die aus Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Adamantan, Cyclohexadien, Cycloheptan und Cycloheptatrien besteht, ausgewählt wird, unsubstituiertes Aryl, das aus der Gruppe, die aus Phenyl, Napthalenyl und Anthracenyl besteht, ausgewählt wird, Halogen, Trihalomethyl, Hydroxy, C1-C4 Alkoxy, Aryloxy, Thiohydroxy, C1-C4 Thioalkoxy, Thioaryloxy, Cyano, Nitro, Carbonyl, Thiocarbonyl, Sulfonamido, Carboxy, Sulfinyl, Sulfonyl, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amido, N-Amido, Amino und -NR¹⁸R¹⁹, wobei R¹⁸ und R¹⁹ wie oben definiert sind, ausgewählt wird.
Eine „heteroalicyclische" Gruppe betrifft eine monocyclische oder eine kondensierte Ringgruppe, die in dem/den Ring(en) ein oder mehrere Atome haben, die aus der Gruppe, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht, ausgewählt werden. Die Ringe können ebenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen haben. Die Ringe haben jedoch kein vollständig konjugiertes Pi-Elektronensystem. Die heteroalicyclische Gruppe wird aus Piperidin, Morpholin, Piperazin, Pyrrolin, Pyrrolidin, Dihydrothiophen und Tetrahydrofuran ausgewählt. Der heteroalicyclische Ring kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn er substituiert ist, ist die substituierte Gruppe(n) eine oder mehrere, die aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem Cycloalkyl, das aus der Gruppe, die aus Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Adamantan, Cyclohexadien, Cycloheptan und Cycloheptatrien besteht, ausgewählt wird, Halogen, Trihalomethyl, Hydroxy, C1-C4 Alkoxy, Aryloxy, Thiohydroxy, C1-C4 Thioalkoxy, Thioaryloxy, Cyano, Nitro, Carbonyl, Thiocarbonyl, Carboxy, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, Sulfinyl, Sulfonyl, C-Amido, N-Amido, Amino und -NR¹⁸R¹⁹, wobei R¹⁸ und R¹⁹ wie oben definiert sind, ausgewählt wird.
Eine „Hydroxy"-Gruppe betrifft eine -OH-Gruppe.
Eine „Alkoxy"-Gruppe betrifft sowohl eine -O-Alkyl- und eine -O-Cycloalkylgruppe, wobei Alkyl und Cycloalkyl wie oben definiert sind.
Eine „Aryloxy"-Gruppe betrifft sowohl eine -O-Aryl- und eine -O-Heteroarylgruppe, wobei Aryl und Heteroaryl wie oben definiert sind.
Eine „Heteroalicycloxy"-Gruppe betrifft eine -O-heteroalicyclische Gruppe, wobei heteroalicyclisch wie oben definiert ist.
Eine „Thiohydroxy"-Gruppe betrifft eine -SH-Gruppe.
Eine „Thioalkoxy"-Gruppe betrifft sowohl eine S-Alkyl- als auch eine -S-Cycloalkylgruppe, wobei Alkyl und Cycloalkyl wie oben definiert sind.
Eine „Thioaryloxy"-Gruppe betrifft sowohl eine -S-Aryl- als auch eine -S-Heteroaryl-Gruppe, wobei Aryl und Heteroaryl wie oben definiert sind.
Eine „Carbonyl"-Gruppe betrifft eine -C(=O)-R''-Gruppe, wobei R'' aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl (gebunden durch einen Ringkohlenstoff) und Heteroalicyclus (gebunden durch einen Ringkohlenstoff), wie oben definiert, besteht, ausgewählt wird.
Eine „Trihalomethylcarbonyl"-Gruppe betrifft eine X₃CC(=O)-Gruppe, wobei X eine Halogengruppe, wie hier definiert, ist.
Eine „Aldehyd"-Gruppe betrifft eine Carbonylgruppe, wobei R'' Wasserstoff ist.
Eine „Thiocarbonyl"-Gruppe betrifft eine -C(=S)-R''-Gruppe, mit R'' wie hier definiert.
Eine „O-Carboxy"-Gruppe betrifft eine R''C(=O)O- Gruppe, mit R'' wie hier definiert.
Eine „C-Carboxy"-Gruppe betrifft eine -C(=O)OR''-Gruppe mit R'' wie hier definiert.
Eine „Acetyl"-Gruppe betrifft eine -C(=O)CH₃-Gruppe.
Eine „Carboxyalkyl"-Gruppe betrifft eine -(CH₂)_sC(O)OR'', wobei s 1-6 ist und R'' wie oben definiert ist.
Eine „Carbonsäure"-Gruppe betrifft eine C-Carboxy-Gruppe, bei der R'' Wasserstoff ist.
Eine „Halogen"-Gruppe betrifft Fluor, Chlor, Brom oder Jod.
Eine „Trihalomethyl"-Gruppe betrifft eine -CX₃-Gruppe, wobei X eine Halogengruppe, wie hier definiert, ist.
Eine „Trihalomethansulfonyl"-Gruppe betrifft eine X₃CS(=O)₂-Gruppe mit X wie oben definiert.
Eine „Cyano"-Gruppe betrifft eine -C=N-Gruppe.
Eine „Cyanato"-Gruppe betrifft eine -CNO-Gruppe.
Eine „Isocyanato"-Gruppe betrifft eine -NCO-Gruppe.
Eine „Thiocyanato"-Gruppe betrifft eine -CNS-Gruppe.
Eine „Isothiocyanato"-Gruppe betrifft eine -NCS-Gruppe.
Eine „Sulfinyl"-Gruppe betrifft eine -S(=O)-R''-Gruppe, mit R'' wie hier definiert.
Eine „Sulfonyl"-Gruppe betrifft eine -S(=O)₂R''-Gruppe, mit R'' wie hier definiert.
Eine „Sulfonamido"-Gruppe betrifft eine -S(=O)₂-NR¹⁸R¹⁹-Gruppe mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „Trihalomethansulfonamido"-Gruppe betrifft eine X₃CS(=O)₂N(R¹⁸)-Gruppe mit X und R¹⁸ wie hier definiert.
Eine „O-Carbamyl"-Gruppe betrifft eine -OC(=O)NR¹⁸R^l9-Gruppe mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „N-Carbamyl"-Gruppe betrifft eine R¹⁹OC(=O)NR¹⁸-Gruppe, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „O-Thiocarbamyl"-Gruppe betrifft eine -OC(=S)-NR¹⁸R¹⁹-Gruppe mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „N-Thiocarbamyl"-Gruppe betrifft eine R¹⁹OC(=S)NR¹⁸-Gruppe, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „Amino"-Gruppe betrifft eine -NR¹⁸R¹⁹-Gruppe, wobei R¹⁸ und R¹⁹ beide Wasserstoff sind.
Eine „quartäre Ammonium"-Gruppe betrifft eine -⁺N¹⁸R^18'R¹⁹-Gruppe mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert und R^18' gleich definiert wie R¹⁸ und R¹⁹.
Eine „C-Amido"-Gruppe betrifft eine -C(=O)-NR¹⁸R¹⁹-Gruppe mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „N-Amido"-Gruppe betrifft eine R¹⁸C(=O)NR¹⁹-Gruppe, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „C-Thioamido"-Gruppe betrifft eine -C(=S)NR¹⁸R¹⁹-Gruppe, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „Nitro"-Gruppe betrifft eine -NO₂-Gruppe.
Eine „Methylendioxy"-Gruppe betrifft eine -OCH₂O-Gruppe, wobei die Sauerstoffatome an benachbarte Ringkohlenstoffatome gebunden sind.
Eine „Ethylendioxy"-Gruppe betrifft eine -OCH₂CH₂O- Gruppe, wobei die Sauerstoffatome an benachbarte Ringkohlenstoffatome gebunden sind.
Eine „Guanyl"-Gruppe betrifft eine R¹⁸R¹⁹NC(=N)-Gruppe mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert.
Eine „Guanadinyl"-Gruppe betrifft eine -R¹⁸NC(=N)NR^18'R¹⁹-Gruppe mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert, wobei R^18' genauso wie R¹⁸ und R¹⁹ definiert ist.
Eine „Ureidyl"-Gruppe betrifft eine -NR¹⁸C(=O)NR^18'R¹⁹-Gruppe mit R¹⁸ und R¹⁹ wie hier definiert und R^18' gleich definiert wie R¹⁸ und R¹⁹.
Eine „Phosphonyl"-Gruppe betrifft eine -OP(=O)₂OR''-Gruppe mit R'' wie hier definiert.
Eine „C-Peptidyl"-Gruppe betrifft eine Gruppe, die durch die Umsetzung der 2-Amino-Gruppe einer Aminosäure mit der Carboxygruppe einer anderen Aminosäure gebildet wird, d.h. eine Peptidylgruppe hat die allgemeine Struktur -(NCHRC(=O)_n-, wobei die R-Gruppe gleich oder verschieden sein kann, abhängig davon, welche Aminosäure verwendet wird, um die Peptidylgruppe herzustellen, wobei sich die „C-Peptidyl"-Bezeichnung auf die Situation bezieht, bei der die Peptidyl-Gruppe an ein Nicht-Aminosäuremolekül durch das C(=O)-Kohlenstoff gebunden ist.
Eine „polare Gruppe" betrifft eine Gruppe, bei der der Kern der Atome, die kovalent aneinander gebunden sind, um die Gruppe zu bilden, nicht die Elektronen der kovalenten Bindung(en) teilt, die sie gleich haben, d.h. die Elektronenwolke ist bei einem Atom dichter als bei einem anderen. Dies führt dazu, dass ein Ende der kovalenten Bindung(en) relativ negativ ist und das andere Ende relativ positiv ist, d.h. es gibt einen negativen Pol und einen positiven Pol. Beispiele für polare Gruppen beinhalten ohne Beschränkung Hydroxy, Alkoxy, Carboxy, Nitro, Cyano, Amino, quartäres Ammonium, Amido, Ureidyl, Sulfonamido, Sulfinyl, Sulfonyl, Phosphono, Morpholino, Piperazinyl und Tetrazolyl.
Eine „Spirocycloalkyl"-Gruppe betrifft eine Cycloalkylgruppe, die ein Ringkohlenstoffatom mit einem anderen Ring teilt.
Eine „Spiroheteroalicyclische" Gruppe betrifft eine heteroalicyclische Gruppe, die ein Ringatom mit einem anderen Ring teilt.
Eine „N-Hydroxylamino"-Gruppe betrifft eine Gruppe R''ONR¹⁸-Gruppe mit R'' und R¹⁸ wie hier definiert.
Eine „Polyhydroxyalkyl"-Gruppe betrifft eine unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffen, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffen, die nur mit 2 oder mehr, bevorzugt 3 oder mehr Hydroxylgruppen substituiert ist.
Eine „Morpholin"-Gruppe betrifft eine Gruppe mit der chemischen Struktur:
Eine „Tetrazolyl"-Gruppe betrifft eine Gruppe mit der chemischen Struktur:
Eine „Aminotriazoly"-Gruppe betrifft eine Gruppe mit der chemischen Struktur:
Eine „1-Piperazinyl"-Gruppe betrifft eine Gruppe mit der chemischen Struktur:
Nicht begrenzende Beispiele von 5-gliedrigen Heteroarylringen Q, die im chemischen Stand der Technik bekannt sind, beinhalten die folgenden:
B. Bevorzugte strukturelle Merkmale
In einem bevorzugten Merkmal dieser Erfindung sind R¹, R² und R⁷ Wasserstoff.
In einem anderen bevorzugten Merkmal der Erfindung sind R³, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig aus der Gruppe, die aus: Wasserstoff, unsubstituiertem C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkyl, das mit einer Gruppe substituiert ist, die aus der Gruppe, die aus unsubstituiertem Cycloalkyl, Halogen, Hydroxy, unsubstituiertem C1-C4-Alkoxy, C-Carboxy, unsubstituiertem Aryl, unsubstituiertem Heteroaryl, unsubstituiertem Heteroalicyclus, Amino, quartärem Ammonium oder -NR¹⁸NR¹⁹ besteht, ausgewählt wird, unsubstituiertem Cycloalkyl, Hydroxy, unsubstituiertem C1-C4-Alkoxy, C1-C4-Alkoxy, das mit einer Gruppe substituiert ist, die aus der Gruppe, die aus einem oder oder mehrerer Halogengruppen, unsubstituiertem Aryl oder unsubstituiertem Heteroaryl besteht, ausgewählt wird, Trihalomethyl, Halogen, unsubstituiertem Aryl, Aryl, das mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe, die aus unsubstituiertem C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkyl, das mit einer oder mehreren Halogengruppen, Trihalomethyl, Halogen, Hydroxy oder unsubstituiertem C1-C4-Alkoxy substituiert ist, besteht, ausgewählt wird, unsubstituiertes Aryloxy, Aryloxy, das mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe, die aus Halogen, unsubstituiertem C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkyl, das mit einer oder mehreren Halogengruppen, unsubstituiertem Aryl, Hydroxy, unsubstituiertem C1-C4-Alkoxy, Amino oder -NR¹⁸NR¹⁹ substituiert ist, besteht, ausgewählt wird; S-Sulfonamido; unsubstituiertem Heteroaryl; Heteroaryl, das mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, unsubstituiertem C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkyl, das mit einer oder mehreren Halogengruppen, Trihalomethyl, Halogen, Hydroxy, unsubstituiertem C1-C4-Alkoxy, unsubstituiertem Aryloxy, Amino, S-Sulfonamido oder -NR¹⁸NR¹⁹ substituiert ist, besteht, ausgewählt wird, ; unsubstituiertes Heteroalicyclus; Heteroalicyclus, der mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe, die aus unsubstituiertem C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkyl, das mit einer oder mehreren Halogengruppen, unsubstituiertem C1-C4-Alkylalkoxy, Hydroxy, Amino, S-Sulfonamido oder NR¹⁸NR¹⁹ substituiert ist, besteht, ausgewählt wird; unsubstituiertes C1-C4-Alkyl C-Carboxy; Carbonsäure; unsubstituiertem C1-C4-Alkylcarbonyl; Aldehyd; unsubstituiertes Arylcarbonyl; Acetyl; S-Sulfonamido; N-Sulfonamido; Amino und -NR¹⁸NR¹⁹ besteht, ausgewählt wird.
Zusätzliche bevorzugte Merkmale dieser Erfindung sind die, bei denen:
Irgendwelche zwei von R⁸, R^8' oder R^8'' -(alk₁) rM-Gruppen sind; J¹ aus der Gruppe, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht, ausgewählt wird und J², J³ und J⁴ Kohlenstoff sind; J¹ und J³ Stickstoff sind und J² und J⁴ Kohlenstoff sind.
Beispiele von spezifischen Verbindungen dieser Erfindungen sind unten in Tabelle 1 gezeigt.
2. Die Biochemie
Die durch RTK vermittelte Weitergabe von Signalen wird durch extrazelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) eingeleitet, gefolgt von Rezeptordimerisierung, vorübergehender Stimulierung der intrinsischen Proteintyrosinkinaseaktivität und Phosphorylierung. Die Bindungssseiten werden dabei für intrazelluläre Signalweitergabemoleküle gebildet und führen zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmischen Signalmolekülen, die die geeignete zelluläre Antwort erleichtern (z.B. Zellteilung, metabolische Wirkung auf die extrazelluläre Mikroumgebung). Siehe Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391.
Man hat gezeigt, dass Tyrosinphosphorylierungsseiten bei Wachstumsfaktorrezeptoren als Hochaffinitätsbindungsseiten für SH2 (Src-Homologie)-Domains von Signalmolekülen wirken. Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423; Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785; Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778; und Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Verschiedene intrazelluläre Substratproteine, die mit RTKs verbunden sind, sind identifiziert worden. Sie können in zwei Hauptgruppen aufgeteilt werden: (1) Substrate, die eine katalytische Domain haben und (2) Substrate, denen eine solche Domain fehlt, die aber als Adapter dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen verbunden sind. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Die Spezifität der Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und SH2-Domains ihrer Substrate wird durch die Aminosäurereste bestimmt, die unmittelbar den phosphorylierten Tyrosinrest umgeben. Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domains und den Aminosäuresequenzen, die die Phosphortyrosinreste auf speziellen Rezeptoren umgeben, sind mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofilen konsistent. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Diese Beobachtungen deuten an, dass die Funktion jedes RTK nicht nur von seinem Exprimierungsmuster und der Ligandverfügbarkeit bestimmt werden, sondern ebenfalls durch die Anordnung der nachgelagerten Signalwege, die durch einen speziellen Rezeptor aktiviert werden. Somit stellt die Phosphorylierung einen wichtigen regulatorischen Schritt bereit, der die Selektivität der Signalwege, die durch spezifische Wachstumsfaktorrezeptoren ergänzt werden, als auch der Unterscheidungsfaktorrezeptoren bestimmt.
STKs, die hauptsächlich cytosolisch sind, beeinflussen die interne Biochemie der Zelle oft als eine Down-Line-Antwort auf ein PTK-Ereignis. STKs greifen in den Signalprozess ein, der die DNA-Synthese und die anschließende Mitosis, die zur Zellproliferation führt, startet.
Somit resultiert die PK-Signalweitergabe neben anderen Antworten in Zellproliferation, Differentation, Wachstum und Metabolismus. Abnormale Zellproliferation kann zu einem weiten Bereich von Krankheiten und Erkrankungen, einschließlich der Entwicklung von Neoplasie, wie zum Beispiel Carcinom, Sarcom, Leukämie, Glioblastom, Hemangiom, Psoriasis, Arteriosklerose, Arthritis und diabetische Retinopathie (oder anderen Krankheiten, die mit unkontrollierter Angiogenese und/oder Vasculogenese verbunden sind) führen.
Ein genaues Verstehen des Mechanismus, durch den die Verbindungen dieser Erfindungen PKs inhibieren, ist nicht erforderlich, um die vorliegende Erfindung auszuführen.
Während man hier nicht auf einen speziellen Mechanismus oder Theorie festgebunden sein will, wird jedoch angenommen, dass die Verbindungen mit den Aminosäuren der katalytischen Region des PKs wechselwirken. PKs besitzen typischerweise eine bilobate Struktur, wobei ATP auftritt, um in der Spalte zwischen zwei Lappen in einer Region, wo die Aminosäuren zwischen den PKs konserviert werden, zu binden. Man nimmt an, dass Inhibitoren der PKs durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie z.B. Wasserstoffbindung, van der Waals-Kräfte und ionische Wechselwirkungen in der gleichen allgemeinen Region, in der das zuvor genannte ATP an die PKs bindet, binden. Im Spezielleren nimmt man an, dass die 2-Indolinonkomponente der Verbindungen dieser Erfindung in dem allgemeinen Zwischenraum, der normalerweise durch den Adeninring des ATP besetzt ist, bindet. Die Spezifität eines besonderen Moleküls für eine besondere PK kann als Ergebnis zusätzlicher Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Substituenten des 2-Indolinonkerns mit Aminosäuredomains, die für spezielle PKs spezifisch sind, auftreten. Somit können unterschiedliche Indolinonsubstituenten zu bevorzugter Bindung an bestimmte PKs beitragen. Die Fähigkeit, diese Verbindungen, die bei verschiedenen ATP-Bindungsstellen (oder einem anderen Nukleotid) aktiv sind, auszuwählen, macht diese Verbindungen verwendbar, um irgendein Protein mit solch einer Seite zu erzielen, d.h. nicht nur PKs, sondern ebenso Proteinphosphatase. Die hier offenbarten Verbindungen haben somit Verwendung für in vitro Assays bei diesen Proteinen und für in vivo therapeutische Wirkungen durch diese Proteine.
In einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung die Verwendung einer Verbindung gemäß der Erfindung bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer Krankheit, die aus Krebs, der aus der Gruppe, die aus Plattenepitelkarzinom, Astrocytom, Glioblastom, Brustkrebs, Gliom, Melanom, Lungenkrebs, Kleinzellenlungenkrebs, Blasenkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs und Kopf- und Nackenkrebs besteht, ausgewählt wird, einer Proliferationserkrankung, die aus der Gruppe, die aus Restinose, Fibrose, Psoriase, Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis besteht, ausgewählt wird; Diabetes, Autoimmunerkrankungen, einer Entzündungserkrankung und Angiogenese ausgewählt wird.
3. Pharmakologische Zusammensetzungen und therapeutische Anwendungen
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung oder ein Salz, wie hier beschrieben, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
A. Verabreichungsarten
Wie hier verwendet, betrifft "verabreichen" oder "Verabreichung" die Abgabe einer Verbindung, eines Salzes oder eines Prodrugs der vorliegenden Erfindung oder einer pharmakologischen Zusammensetzung, die eine Verbindung, ein Salz oder ein Prodrug dieser Erfindung enthält, an einen Organismus zum Zwecke der Prävention oder Behandlung einer PK-bezogenen Erkrankung.
Geeignete Verabreichungsarten können ohne Beschränkung oral, rektal, transmukosal oder eine intestinale Verabreichung oder intramuskuläre, subkutane, intramedullare, intrathekale, direkt intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen enthalten.
Alternativ kann man die Verbindung eher auf eine örtliche als eine systematische Art und Weise, zum Beispiel über eine Injektion der Verbindung direkt in einen festen Tumor, oftmals in einer Depot- oder Retardformulierung, verabreichen.
Des Weiteren kann man das Arzneimittel in einem gezielten Pharmakotherapiesystem, z.B. in einem Liposom, das mit tumorspezifischen Antikörpern beschichtet ist, verabreichen. Die Liposome werden von dem Tumor erkannt und selektiv von ihm aufgenommen.
Zusammensetzung/Formulierung
Die pharmakologischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, hergestellt werden, z.B. mittels konventionellen Mischens, Auflösen, Granulieren, Drageeherstellung, Verreiben, Emulgieren, Einkapseln, Einfangen oder Lyophilisierverfahren.
Pharmakologische Zusammensetzungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können somit auf konventionelle Art und Weise formuliert werden unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch geeigneter Träger, die Arzneistoffträger und Hilfsmittel umfassen, was die Verarbeitung der aktiven Verbindungen in Zubereitungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtert. Eine geeignete Formulierung hängt von der gewählten Verabreichungsart ab.
Für die Injektion können die Verbindungen der Erfindung in wässrigen Lösungen, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffern, wie z.B. Hank's-Lösung, Ringers-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung, formuliert werden. Für die transmukosale Verabreichung werden Durchdringungsmittel, die für die zu durchdringende Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Diese Durchdringungsmittel sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen leicht durch Kombinieren der aktiven Verbindungen mit pharmazeutisch geeigneten, im Stand der Technik bekannten Trägern formuliert werden. Solche Träger ermöglichen, dass die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen und ähnliches für die orale Nahrungsaufnahme von einem zu behandelnden Patienten formuliert werden können. Pharmakologische Zubereitungen für die orale Verwendung können unter Verwendung eines festen Arzneistoffträgers, optional Vermahlen der resultierenden Mischung und Verarbeiten der Mischung von Granula nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, wenn notwendig, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten, hergestellt werden. Geeignete Arzneistoffträger sind insbesondere Füllstoffe, wie z.B. Zucker, einschließlich Lactose, Sucrose, Mannitol oder Sorbitol, Cellulosezubereitungen, wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Wenn notwendig, können sich auflösende Agenzien, wie zum Beispiel das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie zum Beispiel Natriumalginat, hinzugefügt werden.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummiarabikum, Talg, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Likörlösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zur Identifizierung oder um verschiedene Kombinationen von aktiven Verbindungsdosen charakterisieren zu können, zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen hinzugegeben werden.
Pharmakologische Zusammensetzungen, die oral verwendet werden können, beinhalten Push-fit-Kapseln, die aus Gelatine hergestellt sind, als auch weiche, versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie zum Beispiel Glycerol oder Sorbitol, hergestellt sind. Die Push-fit-Kapseln können die aktiven Inhaltsstoffe in einer Mischung mit einem Füllstoff, wie zum Beispiel Lactose, Bindemitteln, wie zum Beispiel Stärken, und/oder Gleitmitteln, wie zum Beispiel Talg oder Magnesiumstearat und optional Stabilisatoren enthalten. In Weichkapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Fettöle, flüssiges Paraffin oder flüssige Polyethylenglycole, aufgelöst oder suspendiert werden. Zusätzlich können Stabilisatoren hinzugefügt werden.
Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in für die Verabreichung geeigneten Dosierungen sein.
Für bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen, die auf herkömmliche Art und Weise formuliert sind, sein.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung gewöhnlicherweise in der Form einer Aerosolsprayaufmachung aus verdichteten Packungen oder eines Verneblers abgegeben, unter Verwendung eines geeigneten Treibgases, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas. Im Falle eines verdichteten Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils, um eine abgemessene Menge abzugeben, bestimmt werden. Kapseln und Patronen aus zum Beispiel Gelatine für die Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, wobei sie eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis, wie zum Beispiel Lactose oder Stärke, enthalten.
Die Verbindungen können für parenterale Verabreichung durch Injektion, z.B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen für Injektion können in einer Einheitsdosierungsform vorliegen, z.B. in Ampullen oder in Multidosisbehältern mit einem zugefügten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können in solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln annehmen und können Formulierungsagenzien, wie zum Beispiel suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Agenzien enthalten.
Pharmakologische Zusammensetzungen für parenterale Verabreichung beinhalten wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in einer wasserlöslichen Form. Zusätzlich können die Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel beinhalten Fettöle, wie zum Beispiel Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome.
Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Optional kann die Suspension ebenfalls geeignete Stabilisatoren oder Agenzien enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von höher konzentrierten Lösungen zu ermöglichen.
Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff vor der Verwendung in Pulverform für die Zusammensetzung mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, sein.
Die Verbindungen können ebenfalls als rektale Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Zäpfchen oder Retentionseinläufe, die gewöhnliche Zäpfchengrundlagen, wie zum Beispiel Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten, formuliert sein.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen ebenfalls als Depotzubereitung formuliert werden. Diese langanhaltenden Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Somit können zum Beispiel die Verbindungen mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel als eine Emulsion in einem geeigneten Öl) oder als Ionenaustauschharze oder als schwach lösliche Derivate, zum Beispiel als schwach lösliches Salz, formuliert werden.
Die pharmakologischen Zusammensetzungen hierin können ebenfalls geeignete feste oder Gelphasenträger oder Arzneistoffträger umfassen. Beispiele dieser Träger oder Arzneistoffträger beinhalten Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglycole), sind aber nicht darauf beschränkt.
Viele der PK-modulierenden Verbindungen der Erfindung können als physiologisch geeignete Salze bereitgestellt werden, wobei die beanspruchte Verbindung die negativ oder die positiv geladene Spezies bilden kann. Beispiele für Salze, bei denen die Verbindung die positiv geladene Einheit bildet, beinhalten ohne Begrenzung quartäres Ammonium (definiert hier an anderer Stelle), Salze, wie zum Beispiele das Hydrochlorid, Sulfat, Carbonat, Lactat, Tartrat, Maleat, Succinat etc., das durch die Umsetzung einer Aminogruppe mit der geeigneten Säure gebildet wird. Salze, bei denen die Verbindung die negativ geladene Spezies bildet, beinhalten ohne Beschränkung das Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalz, das durch die Umsetzung einer Carbonsäuregruppe in dem Molekül mit der geeigneten Base (z.B. Natriumhydroxid (NaOH), Kaliumhydroxid, (KOH), Calciumhydroxid (Ca(OH)₂), etc.) gebildet wird.
C. Dosierung
Pharmakologische Zusammensetzungen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten Zusammensetzungen, bei denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um ihren beabsichtigten Zweck zu erreichen.
Im Spezielleren bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge der Verbindung, die wirksam ist, um Symptome der Krankheit zu verhindern, zu lindern oder zu verbessern oder das Überleben des behandelten Subjekts zu verlängern.
Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge liegt in der Fähigkeit des Durchschnittsfachmanns, insbesondere im Licht der detaillierten Offenbarung, die hier bereitgestellt wird.
Für irgendeine Verbindung, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Menge oder Dosis zu Anfang aus Zellkulturassays bestimmt werden. Dann kann die Dosierung für die Verwendung in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Konzentrationsbereich, der die IC₅₀, wie in der Zellkultur bestimmt (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibierung der PK-Aktivität erreicht) zu erreichen. Diese Information kann dann verwendet werden, um die möglichen Dosen bei Menschen exakter zu bestimmen.
Die Toxizität und therapeutische Effizienz der hier beschriebenen Verbindungen kann durch standardpharmazeutische Verfahren bei Zellkulturen oder Experimentaltieren, z.B. zur Bestimmung der LD₅₀ (die Dosis, die für 50% der Population tödlich ist) und der ED₅₀ (die Dosis, die für 50% der Population therapeutisch wirksam ist) bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und er kann als das Verhältnis zwischen LD₅₀ und ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes zeigen, sind bevorzugt. Die aus diesen Zellkulturassays und Tierstudien erhaltenen Daten können bei der Formulierung eines Bereichs der Dosierung für die Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung dieser Verbindungen liegt bevorzugt innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, der die ED₅₀ mit wenig oder keiner Toxizität beinhaltet. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs variieren, abhängig von der verwendeten Dosierungsform und der verwendeten Verabreichungsart. Die exakte Formulierung, Verabreichungsart und Dosierung kann durch den einzelnen Arzt im Hinblick auf den Zustand des Patienten ausgewählt werden (siehe z.B. Fingl, et al., 1975, in „The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kapitel 1, Seite 1).
Die Dosierungsmenge und das Intervall können individuell angepasst werden, um die Plasmaniveaus der aktiven Mehrheit bereitzustellen, die ausreichend sind, die kinasemodulierenden Wirkungen oder die minimale effektive Konzentration (MEC) aufrechtzuerhalten. Die MEC wird für jede Verbindung variieren, kann aber aus in vitro Daten bestimmt werden, z.B. die Konzentration, die notwendig ist, um 50-90% Inhibierung der Kinase unter Verwendung der hier beschriebenen Assays zu erreichen. Die Dosierungen, die notwendig sind, um die MEC zu erreichen, werden von den individuellen Charakteristika und der Verabreichungsart abhängen. HPLC-Assays oder Bioassays können jedoch verwendet werden, um die Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
Dosierungsintervalle können ebenfalls unter Verwendung des MEC-Wertes bestimmt werden. Die Verbindungen sollten unter Verwendung einer Kur verabreicht werden, die die Plasmaniveaus oberhalb der MEC für 10–90% der Zeit, bevorzugt zwischen 30–90% und am bevorzugtesten zwischen 50–90% aufrechterhalten.
In den Fällen einer lokalen Verabreichung oder einer selektiven Aufnahme kann die wirksame lokale Konzentration des Arzneimittels nicht mit der Plasmakonzentration verbunden sein.
Die Menge der verabreichten Zusammensetzung wird natürlich von dem behandelten Subjekt ab, dem Gewicht des Subjekts, der Schwere der Erkrankung, der Art und Weise der Verabreichung und dem Urteil des verschreibenden Arztes abhängen.
D. Verpackung
Die Zusammensetzungen können, wenn gewünscht, in einem Paket oder Dispensergerät, wie zum Beispiel ein von der FDA genehmigtes Kit, welches eine oder mehrere Einheitsdosierungsformen enthalten kann, die den aktiven Inhaltsstoff enthalten, präsentiert werden. Das Paket kann zum Beispiel eine Metall- oder Plastikfolie, wie zum Beispiel ein Blisterpack, umfassen. Das Paket oder Dispensergerät kann von Instruktionen zur Verabreichung begleitet sein. Das Paket oder der Dispenser können ebenfalls durch eine Notiz begleitet sein, die mit dem Behälter in einer von der Regierungsbehörde, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln regelt, vorgeschriebenen Form verbunden sein, wobei die Notiz die Erlaubnis der Behörde der Form der Zusammensetzungen oder der menschlichen oder tierischen Verabreichung reflektiert. Diese Notiz kann zum Beispiel eine Beschriftung sein, die von der U.S. Food and Drug Administration für vorgeschriebene Arzneimittel oder von einem genehmigten Produktinsert sein. Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung, die in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formuliert ist, umfassen, können ebenfalls hergestellt, in einen geeigneten Behälter plaziert und für die Behandlung einer aufgezeigten Bedingung beschriftet werden. Geeignete Bedingungen, die auf dem Label aufgezeigt sind, können die Behandlung eines Tumors, die Inhibierung von Angiogenese, die Behandlung von Fibrose, Diabetes und ähnlichem sein.
4. Synthese
Die Verbindungen dieser Erfindungen als auch die 2-Oxindol- und Aldehydvorstufen können leicht unter Verwendung von im chemischen Stand der Technik gut bekannten Techniken synthetisiert werden. Es wird dem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein, dass andere synthetische Wege für die Bildung der Verbindungen der Erfindung möglich sind und dass das Folgende nur als Beispiel und nicht als Beschränkung gegeben wird.
Allgemeines synthetisches Verfahren
Das folgende allgemeine Verfahren kann verwendet werden, um die Verbindungen dieser Erfindung herzustellen:
Das in geeigneter Weise substituierte 2-Oxindol (1 Äquivalent), das in geeigneter Weise substituierte Aldehyd (1.2 Äquivalente) und Piperidin (0.1 Äquivalente) werden mit Ethanol (1–2 ml/mmol 2-Oxindol) gemischt und die Mischung wird dann auf 90°C für 3 bis 5 Stunden erwärmt. Nach dem Abkühlen wird die Reaktionsmischung auf konzentriert und auf pH 3 angesäuert. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser auf pH 7 und dann mit kaltem Ethanol, Ethylacetat und/oder Hexan gewaschen und vakuumgetrocknet, um die Zielverbindung zu erhalten. Das Produkt kann optional weiter durch Chromatographie gereinigt werden.
Aldehyde
Für die Synthese der Verbindungen dieser Erfindung verwendbare Aldehyde können durch verschiedene synthetische Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel können die Verfahren, die in den folgenden Publikationen beschrieben sind, verwendet werden, um einige der Aldehyde dieser Erfindung zu ergeben:
J. Med. Chem., 1993, 36(23), 3674–3685;
Chem. Commun., 1966, 393;
Chem. Heterocyl. Compd. (EN), 1974, 10, 50–52; und
J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1:EN, 1974, 1237–1243.
Tabelle 2 listet zusätzliche Aldehyde auf, die verwendet werden können, um die Verbindungen dieser Erfindung herzustellen.
5. Biologische Einschätzung
Es wird offensichtlich sein, dass bei irgendeiner gegebenen Serie von Verbindungen ein Spektrum biologischer Aktivitäten erhalten werden wird. In ihren bevorzugten Ausführungsformen betrifft diese Erfindung neue 2-Indolinone, die die Fähigkeit zeigen, RTK-, CTK- und STK-Aktivität zu modulieren. Die folgenden Assays werden durchgeführt, um die Verbindungen auszuwählen, die den optimalen Grad der gewünschten Aktivität zeigen.
Tabelle 2
Assayverfahren
Die folgenden in vitro-Assays können verwendet werden, um das Niveau der Aktivität und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehrerer der PKs zu bestimmen. Ähnliche Assays können entlang derselben Linien für irgendeinen PK unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannter Techniken entworfen werden.
Die zellulären/katalytischen Assays, die hier beschrieben werden, werden in einem ELISA-Format durchgeführt. Das allgemeine Verfahren ist wie folgt: eine Verbindung wird in Zellen, die die Testkinase exprimieren, entweder natürlich oder rekombinant, für einen gewissen Zeitraum nachdem, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand, der bekannt ist, den Rezeptor zu aktivieren, hinzugeführt wird, eingeführt. Die Zellen werden lysiert und das Lysat wird in die Vertiefungen einer ELISA-Platte transferiert, die zuvor mit einem spezifischen Antikörper, der das Substrat der enzymatischen Phosphorylierungsreaktion erkennt, beschichtet wurde. Nicht-Substratkomponenten des Zelllysats werden ausgewaschen und die Menge der Phosphorylierung auf dem Substrat wird mit einem Antikörper, der spezifisch Phosphotyrosin, verglichen mit Kontrollzellen, die nicht mit einer Testverbindung kontaktiert wurden, erkennt, bestimmt.
Die zellulären/biologischen Assays, die hier beschrieben werden, messen die Menge an DNA, die als Antwort auf die Aktivierung einer Testkinase hergestellt worden sind, was eine allgemeine Messung einer Proliferationsantwort ist. Das allgemeine Verfahren für dieses Assay ist wie folgt: eine Verbindung wird in Zellen, die die Testkinase exprimieren, entweder natürlich oder rekombinant, für einen bestimmten Zeitraum, nach dem, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand, der bekannt ist den Rezeptor zu aktivieren, hinzugefügt wird, eingeführt. Nach der Inkubation wenigstens über Nacht wird ein DNA-Markierungsreagenz, wie zum Beispiel Bromdeoxyuridin (BrdU) oder 3H-Thymidin hinzugefügt. Die Menge an markierter DNA wird entweder mit einem Anti-BrdU-Antikörper oder durch Messen der Radioaktivität detektiert und wird mit Kontrollzellen verglichen, die nicht mit einer Testverbindung kontaktiert wurden.
1. Zelluläre/katalytische Assays
Durch Enzym verbundene Immunosorbentassays (ELISA) können verwendet werden, um das Vorhandensein der PK-Aktivität zu detektieren und zu messen. Das ELISA kann gemäß bekannten Protokollen durchgeführt werden, welche zum Beispiel bei Voller et al., 1980, „Enzyme-linked Immunosorbent Assay" in: Manual of C1inical Immunology, 2d ed., editiert von Rose und Friedman, Seite 359–371, Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C.
Das offenbarte Protokoll kann zur Bestimmung der Aktivität in Bezug auf ein spezifisches PK angepasst werden. Zum Beispiel werden die bevorzugten Protokolle zum Ausführen der ELISA-Experimente für spezifische PKs unten bereitgestellt. Die Adaption dieser Protokolle zur Bestimmung der Aktivität einer Verbindung für andere Mitglieder der RTK-Familie, als auch für CTKs und STKs, liegt innerhalb des Wissensbereichs des Durchschnittsfachmanns.
a. FLK-1
Ein ELISA-Assay wurde ausgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-1-Rezeptors und im Spezielleren, die Inhibierung oder Aktivierung der TK-Aktivität auf dem FLK-1-Rezeptor, zu messen. Im Speziellen wurde das folgende Assay durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-1-Rezeptors bei Zellen, die genetisch erzeugt wurden, um FLK-1 zu exprimieren, zu messen.
Materialien und Verfahren
Materialien. Die folgenden Reagenzien und Hilfsstoffe wurden verwendet:

a. Corning ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Corning-Katalog Nr. 25805-96);
b. Cappel Ziege-anti-Kaninchen IgG (Katalog Nr. 55641);
c. PBS (Gibco Katalog Nr. 450-1300EB);
d. TBSW Buffer (50 mM Tris (pH 7.2), 150 mM NaCl and 0.1% Tween-20);
e. Ethanolamin Stammlösung (10% Ethanolamin (pH 7.0), gelagert bei 4°C);
f. HNTG Puffer (20 mM HEPES Puffer (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.2% Triton X-100, und 10% Glycerol);
g. EDTA (0.5 M (pH 7.0) als eine 100X Stammlösung);
h. Natriumorthovanadat (0.5 M als eine 100X Stammlösung);
i. Natriumpyrophosphat (0.2 M als eine 100X Stammlösung);
j. NUNC V-Boden Polypropylenplatten mit 96 Vertiefungen (Applied Scientific Katalog Nr. AS-72092);
k. NIH3T3 C7#3 Zellen (FLK-1 exprminierende Zellen);
l. DMEM mit 1X hoher Glucose-L-Glutamin (Katalog Nr. 11965-050);
m. FBS, Gibco (Katalog Nr. 16000-028);
n. L-Glutamin, Gibco (Katalog Nr. 25030-016);
o. VEGF, PeproTech, Inc. (Katalog Nr. 100-20) (gelagert als 1 μg/100 μl Stammlösung in Milli-Q dH₂O und gelagert bei –20°C;
p. Affinitätsgereinigtes Anti-FLK-1 Antiserum;
q. UB40 monoklonal Antikörper spezifisch für Phosphotyrosin (siehe, Fendley, et al., 1990, Cancer Research 50:1550–1558);
r. EIA Grad Ziege-anti-Maus IgG-POD (BioRad Katalog Nr. 172-1011);
s. 2,2-Azino-bis(3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonacidsäure-(ABTS)-Lösung (100 mM Zitronensäure (wasserfrei), 250 mM Na₂HPO₄ (pH 4.0), 0.5 mg/ml ABTS (Sigma Katalog Nr. A-1888)), Lösung sollte bis sie für die Verwendung bereit ist im Dunkeln bei 4°C gelagert werden;
t. H₂O₂ (30% Lösung) (Fisher Katalog Nr. H325);
u. ABTS/H₂O₂ (15 ml ABTS-Lösung, 2 μl H₂O₂) hergestellt 5 Minuten vor der Verwendung und bei Raumtemperatur gelassen;
v. 0.2 M HCl Stammlösung in H₂O;
w. Dimethylsulfoxid (100) (Sigma Katalog Nr. D-8418); und
y. Trypsin-EDTA (Gibco BRL Katalog Nr. 25200-049).

Protokoll. Das folgende Protokoll wurde zur Ausführung des Assays verwendet:

1. Beschichte Corning ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen mit 1.0 μg pro Vertiefung mit Cappel Anti-Kaninchen IgG Antikörper in 0.1M Na₂CO₃ pH 9.6. Bringe das Endvolumen auf 150 μl pro Vertiefung. Beschichte die Platten über Nacht bei 4°C. Die Platten können bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
2. Züchte die Zellen in Wachstumsmedium (DMEM, erweitert mit 2.0 mM L-Glutamin, 10% FBS) in geeigneten Kulturschalen, bis zum Zusammenfluss bei 37°C, 5% CO₂.
3. Ernte die Zellen durch Trypsinisation und sähe in Corning 25850 Polystyrol-Rundbodenzellenplatten mit 96 Vertiefungen, 25.000 Zellen/Vertiefung in 200 μl Wachstumsmedium.
4. Züchte die Zellen wenigstens einen Tag bei 37°C, 5% CO₂.
5. Wasche die Zellen mit D-PBS 1X.
6. Füge 200 μl/Vertiefung Hungermedium (DMEM, 2.0 mM 1-Glutamin, 0.1% FBS) hinzu. Inkubiere über nacht bei 37°C, 5% CO₂.
7. Verdünne die Verbindungen 1:20 in Polypropylen in Platten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung des Hungermediums. Verdünne Dimethylsulfoxid 1:20 für die Verwendung in Kontrollvertiefungen.
8. Entferne das Hungermedium aus den Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen und füge 162 μl frisches Hungermedium in jede Vertiefung hinzu.
9. Füge 18 μl 1:20 verdünnte Verbindungslösung (aus Schritt 7) in jede Vertiefung hinzu plus die 1:20 Dimethylsulfoxidverdünnung zu den Kontrollvertiefungen (+/–VEGF), für eine Endverdünnung von 1:200 nach der Zellstimulation. Das Enddimethylsulfoxid ist 0.5%. Inkubiere die Platte bei 37°C, 5% CO₂ für zwei Stunden.
10. Entferne ungebundenen Antikörper von den ELISA-Platten durch Invertieren der Platte, um die Flüssigkeit zu entfernen. Wasche 3mal mit TBSW + 0.5% Ethanolamin, pH 7.0. Klopfe die Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
11. Blockiere die Platten mit TBSW + 0.5% Ethanolamin, pH 7.0, 150 μl pro Vertiefung. Inkubiere die Platte 30 Minuten, während sie auf einem Mikrotiterplattenshaker geschüttelt wird.
12. wasche die Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
13. Füge 0.5 μl/Vertiefung Affinitäts-gereinigtes Anti-FLU-1-polyklonales Kaninchen-Antiserum hinzu. Bringe das Endvolumen auf 150 μl/Vertiefung mit TBSW + 0.5% Ethanolamin pH 7.0. Inkubiere die Platte für 30 Minuten, während sie geschüttelt wird.
14. Füge 180 μl Hungermedium zu den Zellen hinzu und stimuliere die Zellen mit 20 μl/Vertiefung 10.0 mM Natriumorthovanadat und 500 ng/ml VEGF (was zu einer endgültigen Konzentration von 1.0 mM Natriumorthovanadat und 50 ng/ml VEGF pro Vertiefung führt) für acht Minuten bei 37°C, 5% CO₂. Negative Kontrollvertiefungen erhalten nur Hungermedium.
15. Nach acht Minuten sollte das Medium von den Zellen entfernt werden und einmal mit 200 μl/Vertiefung PBS gewaschen werden.
16. Lysiere die Zellen in 150 μl/Vertiefung HNTG, während bei Raumtemperatur für fünf Minuten geschüttelt wird. Die HNTG-Formulierung beinhaltet Natriumorthovanadat, Natriumpyrophosphat und EDTA.
17. Wasche die ELISA-Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
18. Transferiere die Zelllysate aus der Zellplatte zur ELISA-Platte und inkubiere unter Schütteln für zwei Stunden. Um die Zelllysate zu transferieren, pipettiere sie auf und ab, während die Vertiefungen ausgesondert werden.
19. wasche die Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
20. Inkubiere die ELISA-Platte mit 0.02 μg/Vertiefung UB40 in TBSW + 0.5% Ethanolamin. Bringe das Endvolumen auf 150 μl/Vertiefung. Inkubiere unter Schütteln für 30 Minuten.
21. Wasche die Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
22. Inkubiere die ELISA-Platte mit 1:10.000 verdünntem EIA-Grad mit Ziege-anti-Maus IgG konjugierter Meerrettichperoxidase in TBSW + 0.5% Ethanolamin, pH 7.0. Bringe das Endvolumen auf 150 μl/Vertiefung. Inkubiere unter Schütteln für 30 Minuten.
23. Wasche die Platte wie in Schritt 10 beschrieben.
24. Füge 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu der Vertiefung hinzu. Inkubiere 10 Minuten unter Schütteln.
25. Füge 100 μl 0.2 M HCl für 0.1 M End-HCl hinzu, um die Farbentwicklungsreaktion zu stoppen. Schüttele eine Minute bei Raumtemperatur. Entferne die Blasen mit einem schwachen Luftstrom und lese die ELISA-Platte in einem ELISA-Plattenleser bei 410 nm aus.

b. HER-2 ELISA
Assay 1: EGF Rezeptor-HER2 chimäres Rezeptorassay in ganzen Zellen
HER2 Kinaseaktivität in ganzen EGFR-NIH3T3-Zellen wurde wie unten beschrieben gemessen:
Materialien und Reagenzien. Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet, um das Assay durchzuführen:

a. EGF: Stammlösung-Konzentration: 16.5 μM; EGF 201, TOYOBO, Co. Ltd. Japan.
b. 05-101 (UBI) (ein monoklonaler Antikörper, der eine EGFR extrazelluläre Domain erkennt). Anti-Phosphotyrosinantikörper (Anti-Ptyr) (polyklonal) (siehe, Fendley, et al., supra).
d. Detektionsantikörper: Ziege-anti-Kaninchen IgG Meerrettichperoxidasekonjugat, TAGO, Inc. Burlingame, CA.
e. TBST-Puffer:

Tris-HCl, pH 7.2 50 mM

NaCl 150 mM

Triton X-100 0.1
f. HNTG 5X Stammlösung:

HEPES 0.1 M

NaCl 0.75 M

Glycerol 50%

Triton X-100 1.0%
g. ABTS Stammlösung:

Zitronensäure 100 mM

Na₂HPO₄ 250 mM

HCl, konz. 0.5 pM

ABTS 0.5 mg/ml
h. Stammlösungs-Reagenzien:

EDTA 100 mM pH 7.0

Na₃VO₄ 0.5 M

Na₄ (P₂O₇) 0.2 M

Verfahren. Das folgende Protokoll wurde verwendet:
A. Vorbeschichtete ELISA-Platte

1. Beschichte ELISA-Platten (Corning, 96 Vertiefungen, Kat. #25805-96) mit 05-101 Antikörper bei 0.5 g pro Vertiefung in PBS, 100 μl Endvolumen/Vertiefung und lagere über Nacht bei 4°C. Beschichtete Platten sind bis zu 10 Tage gut, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
2. Ein Tag bei Verwendung entferne den Beschichtungspuffer und ersetze mit 100 μl Blockpuffer (5% Carnation Instant nicht fette Trockenmilch in PBS). Inkubiere die Platte unter Schütteln bei Raumtemperatur (ungefähr 23°C bis 25°C) für 30 Minuten. Entferne kurz vor der Verwendung den Blockpuffer und wasche die Platte 4 Mal mit TBST-Puffer.

B. Säen der Zellen

1. Eine NIH3T3-Zelllinie, die einen chimären Rezeptor, der die EGFR extrazelluläre Domain und die intrazelluläre HER2-Kinasedomain enthält, überexprimiert, kann für dieses Assay verwendet werden.
2. wähle die Schalen mit 80–90% Zusammenfluss für das Experiment aus. Trypsiniere die Zellen und stoppe die Reaktion durch Hinzufügen von 10% fötalem Rinderserum. Suspendiere die Zellen in DMEM-Medium (10% CS DMEM-Medium) und zentrifugiere einmal bei 1500 U/min bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
3. Suspendiere die Zellen wieder in Saatmedium (DMEM, 0.5% Rinderserum) und zähle die Zellen unter Verwendung von Trypan Blau. Lebensfähigkeit oberhalb 90% ist akzeptabel. Säe die Zellen in DMEM-Medium (0.5% Rinderserum) bei einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung, 100 μl pro Vertiefung, in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen. Inkubiere die gesäten Zellen in 5% CO₂ bei 37°C für ungefähr 40 Stunden.

C. Assayverfahren

1. Checke die gesäte Zellen nach Kontamination unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Verdünne die Arzneimittelstammlösung (10 mg/ml in DMSO) 1:10 in DMEM-Medium, dann transferiere 5 μl zu einer TBST-Vertiefung für eine Endarzneimittelverdünnung von 1:200 und einer End-DMSO-Konzentration von 1%. Die Kontrollvertiefungen erhalten alleine DMSO. Inkubiere in 5% CO₂ bei 37°C für zwei Stunden.
2. Präpariere den EGF-Ligand: Verdünne EGF-Stammlösung in DMEM, so dass nach dem Transfer von 10 μl verdünntem EGF (1:12 Verdünnung), eine 100 nM Endkonzentration erhalten wird.
3. Stelle frische HNTG* her, die für 100 μl pro Vertiefung ausreicht, und platziere auf Eis. HNTG* (10 ml):

HNTG-Stammlösung 2.0 ml

milli-Q H₂O 7.3 ml

EDTA, 100 mM, pH 7.0 0.5 ml

Na₃VO₄, 0.5 M 0.1 ml

Na₄(P₂O₇), 0.2 M 0.1 ml
4. Nach 120 Minuten Inkubation mit Arzneimittel füge den hergestellten EGF-Liganden zu den Zellen hinzu, 10 μl pro Vertiefung, für eine Endkonzentration von 100 nM. Die Kontrollvertiefungen erhalten alleine DMEM. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
5. Entferne das Arzneimittel, EGF und DMEM. Wasche die Zellen zweimal mit PBS. Transferiere HNTG* zu den Zellen, 100 μl pro Vertiefung. Platziere für 5 Minuten auf Eis. Entferne in der Zwischenzeit den Blockpuffer von der andere ELISA-Platte und wasche mit TBST wie oben beschrieben.
6. Kratze die Zellen mit einer Pipettenspitze, die sicher an einem Mikropipettor angebracht ist, von der Platte und homogenisiere das Zellmaterial durch wiederholtes Ansaugen und Dispensieren des HNTG*-Lysepuffers. Transferiere das Lysat zu einer beschichteten, blockierten und gewaschenen ELISA-Platte. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
7. Entferne das Lysat und wasche 4 Mal mit TBST. Transferiere den frisch verdünnten Anti-Ptyr-Antikörper zur ELISA-Platte bei 100 μl pro Vertiefung. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten in Gegenwart des Anti-Ptyr-Antiserums (1:3000 Verdünnung in TBST).
8. Entferne den Anti-Ptyr-Antikörper und wasche 4 Mal mit TBST. Transferiere den frisch verdünnten TAGO Anti-Kaninchen IgG-Antikörper zu der ELISA-Platte bei 100 ul pro Vertiefung. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten (Anti-Kaninchen IgG-Antikörper: 1:3000 Verdünnung in TBST).
9. Entferne den TAGO Detektionsantikörper und wasche 4 Mal mit TBST. Transferiere frisch hergestellte ABTS/H₂O₂-Lösung zu der ELISA-Platte, 100 μl pro Vertiefung. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. (ABTS/H₂O₂-Lösung: 1.0 μl 30% H₂O₂ in 10 ml ABTS-Stammlösung).
10. Stoppe die Reaktion durch Hinzufügen von 50 μl 5N H₂SO₄ (optional) und bestimme O.D, bei 410 nm.
11. Das maximale Phosphotyrosinsignal wird durch Subtrahieren des Wertes der negativen Kontrollen von den positiven Kontrollen bestimmt. Der Prozentsatz Inhibierung des Phosphotyrosingehaltes für die extrakthaltigen Vertiefungen wird dann berechnet, nach der Subtraktion der negativen Kontrollen.

c. PDGF-R ELISA
Alle Zellkulturmedien, Glutamin und das fötale Rinderserum wurden von Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) gekauft, wenn nicht anders spezifiziert. Alle Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre von 90–95% Luft und 5–10% CO₂ bei 37°C gezüchtet. Alle Zelllinien wurden routinemäßig zweimal in der Woche unterkultiviert und waren für Mycoplasma negativ, wie durch das Mycotect-Verfahren (Gibco) bestimmt.
Für ELISA-Assays wurden Zellen (U1242, erhalten von Joseph Schlessinger, NYU) auf 80–90% Zusammenfluss im Wachstumsmedium (MEM mit 10% FBS, NEAA, 1 mM NaPyr und 2 mM GLN) gezüchtet und in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen in 0.5% Serum bei 25.000 bis 30.000 Zellen pro Vertiefung gesät. Nach Inkubation über Nacht in 0.5% serumhaltigen Medium wurden die Zellen in serumfreies Medium gewechselt und mit der Testverbindung für 2 h in einem 5% CO₂, 37°C Inkubator behandelt. Die Zellen wurden dann mit dem Liganden für 5–10 Minuten stimuliert, gefolgt von Lysis mit HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10% Glycerol, 5 mM ETDA, 5 mM Na₃VO₄, 0.2% Triton X-100 und 2 mM NaPyr). Die Zelllysate (0.5 mg/Vertiefung in PBS) wurden zu ELISA-Platten transferiert, die zuvor mit rezeptorspezifischem Antikörper beschichtet wurden und die mit 5% Milch in TBST (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl und 0.1% Triton X-100) bei Raumtemperatur für 30 Minuten blockiert worden sind. Die Lysate wurden unter Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden vier Mal mit TBST gewaschen und dann mit polyklonalem Anti-Phosphotyrosinantikörper bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Überschüssiger Anti-Phosphotyrosinantikörper wurde durch 4-maliges Spülen der Platte mit TBST entfernt. Ziege-anti-Kaninchen IgG Antikörper wurde zu der ELISA-Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur hinzugegeben, gefolgt von 4-maligem Sülen mit TBST. ABTS (100 mM Zitronensäure, 250 mM Na₂HPO₄ und 0.5 mg/ml 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)) plus H₂O₂ (1.2 ml 30% H₂O₂ bei 10 ml ABTS) wurden zu den ELISA-Platten hinzugegeben, um die Farbentwicklung zu starten. Die Absorption bei 410 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm wurde ungefähr 15 bis 30 Minuten nach der ABTS-Zugabe aufgenommen.
d. IGF-I REZEPTOR ELISA
Das folgende Protokoll kann verwendet werden, um das Phosphotyrosinniveau am IGF-I Rezeptor zu messen, der die IGF-I Rezeptortyrosinkinaseaktivität aufzeigt.
Materialien und Reagenzien. Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:

a. Die in diesem Assay verwendete Zelllinie ist 3T3/IGF-1R, eine Zelllinie, die genetisch erzeugt wurde, um den IGF-1 Rezeptor überzuexprimieren.
b. NIH3T3/IGF-1R wird in einem Inkubator mit 5% CO₂ bei 37°C gezüchtet. Das Wachstumsmedium ist DMEM + 10% FBS (wärmeinaktiviert) + 2 mM L-Glutamin.
c. Affinitäts-gereinigter Anti-IGF-1R Antikörper 17–69.
d. D-PBS:

KH₂PO₄ 0. 2 0 g/l

K₂HPO₄ 2.16 g/l

KCl 0.20 g/l

NaCl 8.00 g/l (pH 7.2)
e. Block-Buffer: TBST plus 5% Milch (Carnation Instant nicht fette Trockenmilch).
f. TBST Puffer:

Tris-HCl 50 mM

NaCl 150 mM (pH 7.2/HCl 10N)

Triton X-100 0.1%

Stammlösung von TBS (10X) wird hergestellt und Triton x-100 wird zu dem Puffer während der Verdünnung hinzugegeben.
g. HNTG Puffer:

HEPES 20 mM

NaCl 150 mM (pH 7.2/HCl 1N)

Glycerol 10%

Triton X-100 0.2%

Stammlösung (5X) wird hergestellt und bei 4°C aufbewahrt.
h. EDTA/HCl: 0.5 M pH 7.0 (NaOH) als 100X Stammlösung.
i. Na₃VO₄: 0.5 M als 100X Stammlösung und Teilproben werden –80°C aufbewahrt.
j. Na₄P₂O₇: 0.2 M als 100X Stammlösung.
k. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-1 von Promega (Kat.# G5111).
l. Kaninchen-polyklonales Anti-Phosphotyrosinantiserum.
m. Ziege-anti-Kaninchen IgG, POD Konjugat (Detektionsantikörper), Tago (Kat. Nr. 420, Lot. Nr. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.
n. ABTS-(2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure)) Lösung:

Zitronensäure 100 mM

Na₂HPO₄ 250 mM (pH 4.0/l N HCl)

ABTS 0.5mg/ml

Die ABTS-Lösung sollte im Dunkeln bei 4°C aufbewahrt werden. Die Lösung sollte verworfen werden, wenn sie grün wird.
o. Wasserstoffperoxid: 30% Lösung wird im Dunkeln und bei 4°C aufbewahrt.

Verfahren. All die folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn es nicht speziell anders aufgezeigt ist. Alle ELISA-Platten-Waschungen werden durch Spülen der Platte mit Leitungswasser dreimal durchgeführt, gefolgt von einer TBST-Spülung. Die Platte wird mit Papiertüchern trockengeklopft.
A. Zellsäen

1. Die Zellen, die in einer Gewebekulturschale (Corning 25020-100) auf 80–90% Zusammenfluss gezüchtet wurden, werden mit Trypsin-EDTA (0.25%, 0.5 ml/D-100, GIBCO) geerntet.
2. Suspendiere die Zellen wieder in frischem DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin und transferiere sie in eine Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen (Corning, 25806-96) mit 20.000 Zellen/Vertiefung (100 μl/Vertiefung). Inkubiere für einen Tag, dann ersetze das Medium mit serumfreiem Medium (90/μl) und inkubiere in 5% CO₂ und 37°C über Nacht.

B. ELISA Plattenbeschichtung und Blockieren:

1. Beschichte die ELISA-Platte (Corning 25805-96) mit Anti-IGF-1R Antikörper mit 0.5 μg/Vertiefung in 100 μl PBS wenigstens 2 Stunden.
2. Entferne die Beschichtungslösung und ersetze mit 100 μl Blockpuffer und schüttelte für 30 Minuten. Entferne den Blockpuffer und wasche die Platte kurz vor der Zugabe des Lysats.

C. Assayverfahren

1. Die Arzneimittel werden in serumfreier Bedingung getestet.
2. Verdünne die Arzneimittel-Stammlösung (in 100 DMSO) 1:10 mit DMEM in einer Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen und transferiere 10 μl/Vertiefung dieser Lösung zu den Zellen, um die Endarzneimittelverdünnung 1:100 und die End-DMSO-Konzentration von 1.0% zu erreichen. Inkubiere die Zellen in 5% CO₂ bei 37°C für 2 Stunden.
3. Präpariere frischen Zelllysepuffer (HNTG*)

HNTG 2 ml

EDTA 0.1 ml

Na₃VO₄ 0.1 ml

Na₄ (P₂O₇) 0.1 ml

H₂O 7.3 ml
4. Nach der Arzneimittelinkubation für zwei Stunden transferiere 10 μl/Vertiefung 200 nM IGF-1 Ligand in PBS (Endkonzentration = 20 nM) zu den Zellen und inkubiere bei 5% CO₂ bei 37°C für 10 Minuten.
5. Entferne das Medium und füge 100 μl/Vertiefung HNTG* hinzu und schüttele für 10 Minuten. Beobachte die Zellen unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob sie adäquat lysiert sind.
6. Verwende eine 12-Kanalpipette, um die Zellen von der Platte zu kratzen und homogenisiere das Lysat durch wiederholtes Ansaugen und Dispersieren. Transferiere das gesamte Lysat zu der mit Antikörper beschichteten ELISA-Platte und schüttelte für 1 Stunde.
7. Entferne das Lysat, wasche die Platte, transferiere AntipTyr (1:3,000 mit TBST) 100 μl/Vertiefung und schüttele für 30 Minuten.
8. Entferne Anti-pTyr, wasche die Platte, transferiere TAGO (1:3.000) mit TBST) 100 μl/Vertiefung und schüttele für 30 Minuten.
9. Entferne den Detektionsantikörper, wasche die Platte und transferiere frisches ABTS/H₂O₂ (1.2 μl H₂O₂ auf 10 ml ABTS) 100 μl/Vertiefung zu der Platte, um die Farbentwicklung zu starten.
10. Messe OD bei 410 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm in einem Dynatec MR5000.

e. EGF Rezeptor ELISA
EGF Rezeptorkinaseaktivität in Zellen, die genetisch manipuliert sind, um menschlicher EGF-R zu exprimieren, wurden wie unten beschrieben gemessen:
Materialien und Reagenzien. Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:

a. EGF Ligand: Stammlösung-Konzentration = 16.5 μM; EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japan
b. 05-101 (UBI) (ein monoklonaler Antikörper, der eine EGFR extrazelluläre Domain erkennt).
c. Anti-Phosphotyrosinantikörper (Anti-Ptyr) (polyklonal).
d. Detektionsantikörper: Ziege-anti-Kaninchen IgG Meerrettichperoxidasekonjugat, TAGO, Inc. Burlingame, CA.
e. TBST-Puffer:

Tris-HCl, pH 7 50 mM

NaCl 150 mM

Triton X-100 0.1
f. HNTG 5X Stammlösung:

HEPES 0.1 M

NaCl 0.75 M

Glycerol 50

Triton X-100 1.0%
g. ABTS Stammlösung:

Zitronensäure 100 mM

Na₂HPO₄ 250 mM

HCl, konz. 4.0 pH

ABTS* 0.5 mg/ml

Bewahre die Lösung im Dunkeln bei 4°C bis zur Verwendung.
h. Stammlösung-Reagenzien von:

EDTA 100 mM pH 7.0

Na₃VO₄ 0.5 M

Na₄(P₂O₇) 0.2 M

1. Beschichte ELISA-Platten (Corning, 96 Vertiefungen, Katalog #25805-96) mit 05-101 Antikörper bei 0.5 μg pro Vertiefung in PBS, 150 μl Endvolumen/Vertiefung und lagere über Nacht bei 4°C. Die beschichteten Platten sind für bis zu 10 Tage gut, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
2. Entferne am Tag der Verwendung den Beschichtungspuffer und ersetze mit Blockpuffer (5% Carnation Instant nicht fette Trockenmilch in PBS). Inkubiere die Platte unter Sschütteln bei Raumtemperatur (ungefähr 23°C bis 25°C) für 30 Minuten. Entferne kurz vor der Verwendung den Blockpuffer und wasche die Platten 4 Mal mit TBST-Puffer.

B. Säen der Zellen

1. NIH 3T3/C7 Zelllinie (Honegger, et al., Cell 51:199–209, 1987) kann für dieses Assay verwendet werden.
2. Wähle Schalen mit 80–90% Zusammenfluss für das Experiment. Trypsiniere die Zellen und stoppe die Reaktion durch Hinzufügen von 10% CS DMEM-Medium. Suspendiere die Zellen im DMEM Medium (10% CS DMEM-Medium) und zentrifugiere einmal bei 1000 U/min bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
3. Resuspendiere die Zellen im Sämedium (DMEM, 0.5% Rinderserum) und zähle die Zellen unter Verwendung von Trypan Blau. Eine Lebensfähigkeit oberhalb 90% ist akzeptabel. Säe die Zellen in DMEM-Medium (0.5% Rinderserum) bei einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung, 100 μl pro Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen. Inkubiere die gesäten Zellen in 5% CO₂ bei 37°C für ungefähr 40 Stunden.

C. Assayverfahren

1. Checke die gesäten Zellen für Kontamination unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Verdünne die Arzneimittel-Stammlösung (10 mg/ml in DMSO) 1:10 im DMEM-Medium, dann transferiere 5 μl in eine Testvertiefung für eine Endarzneistoffverdünnung von 1:200 und einer End-DMSO-Konzentration von 1%. Die Kontrollvertiefungen erhalten alleine DMSO. Inkubiere in 5% CO₂ bei 37°C für eine Stunde.
2. Stelle den EGF-Ligand her: Verdünne Stammlösung EGF im DMEM, so dass nach dem Transfer von 10 μl verdünntem EGF (1:12 Verdünnung), 25 nm Endkonzentration erhalten wird.
3. Stelle frisches 10 ml HNTG* her, das für 100 μl pro Vertiefung ausreicht, wobei HNTG* umfasst: HNTG-Stammlösung (2.0 ml), Milli-Q H₂O (7.3 ml), EDTA 100 mM, pH 7.0 (0.5 ml), Na₃VO₄ 0.5 M (0.1 ml) und Na₄(P₂O₇), 0.2 M (0.1 ml).
4. Platziere auf Eis.
5. Füge nach zwei Stunden Inkubation mit dem Arzneimittel hergestellten EGF-Ligand zu den Zellen hinzu, 10 μl pro Vertiefung, um eine Endkonzentration von 25 nM zu erhalten. Die Kontrollvertiefungen erhalten alleine DMEM. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
6. Entferne das Arzneimittel, EGF und DMEM. Wasche die Zellen zweimal mit PBS. Transferiere HNTG* zu den Zellen, 100 μl pro Vertiefung. Platziere auf Eis für 5 Minuten. Entferne in der Zwischenzeit den Blockpuffer von der anderen ELISA-Platte und wasche mit TBST, wie oben beschrieben.
7. Kratze mit einer Pipettenspitze, die sicher an einen Mikropipettor angebracht ist, Zellen von der Platte und homogenisiere das Zellmaterial durch wiederholtes Ansaugen und Dispensieren des HNTG*-Lysepuffers. Transferiere das Lysat zu einer beschichteten, blockierten und gewaschenen ELISA-Platte. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
8. Entferne das Lysat und wasche 4 Mal mit TBST. Transferiere frisch verdünnten Anti-Ptyr-Antikörper zur ELISA-Platte mit 100 μl pro Vertiefung. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten in Gegenwart des Anti-Ptyr-Antiserums (1:3.000 Verdünnung in TBST).
9. Entferne den Anti-Ptyr-Antikörper und wasche 4 Mal mit TBST. Transferiere frisch verdünnten TAGO 30 Anti-Kaninchen IgG Antikörper zu der ELISA-Platte mit 100 μl pro Vertiefung. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten (Anti-Kaninchen IgG Antikörper: 1:3000 Verdünnung in TBST).
10. Entferne den Detektionsantikörper und wasche 4 Mal mit TBST. Transferiere frisch hergestellte ABTS/H₂O₂-Lösung zur ELISA-Platte, 100 μl pro Vertiefung. Inkubiere bei Raumtemperatur für 20 Minuten. ABTS/H₂O₂-Lösung: 1.2 μl 30% H₂O₂ in 10 ml ABTS-Stammlösung.
11. Stoppe die Reaktion durch Hinzufügen von 50 μl 5N H₂SO₄ (optional) und bestimme O.D. bei 410 nm.
12. Das maximale Phosphotyrosinsignal wird durch Subtrahieren des Wertes der negativen Kontrollen von den positiven Kontrollen bestimmt. Der Prozentsatz der Inhibierung des Phosphotyrosingehalts für extrakthaltige Vertiefungen wird dann berechnet, nach der Subtraktion der negativen Kontrollen.

f. Met Autophosphorylierungsassay – ELISA
Dieses Assay bestimmt die Mettyrosinkinaseaktivität durch Analysieren der Metproteintyrosinkinaseniveaus auf dem Met-Rezeptor.
1. Reagenzien:

a. HNTG (5X Stammlösung): Löse 23.83 g HEPES und 43.83 g NaCl in ungefähr 350 ml dH₂O. Passe den pH auf 7.2 an mit HCl oder NaOH, füge 500 ml Glycerol und 10 ml Triton X-100 hinzu, mische, füge dH₂O bis zu einem Endvolumen von 11 hinzu. Um 11 1X Arbeitslösung herzustellen, füge 200 ml 5X Stammlösung zu 800 ml dH₂O hinzu, checke und passe den pH wenn notwendig an, lagere bei 4°C.
b. PBS (Dulbecco's Phosphate-gepufferte Kochsalzlösung), Gibco Kat. # 450-1300EB (1X Lösung).
c. Block-Puffer: plaziere in 500 ml dH₂O 100 g BSA, 12.1 g Tris-pH 7.5, 58.44 g NaCl und 10 ml Tween-20, verdünne auf ein Endvolumen von 11.
d. Kinase-Puffer: Füge zu 500 ml dH₂O 12.1 g TRIS pH 7.2, 58.4 g NaCl, 40.7 g MgCl₂ und 1.9 g EGTA hinzu; bringe das Endvolumen auf 11 mit dH₂O.
e. PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), Sigma Kat. # P-7626, füge zu 435.5 mg 100% Ethanol bis zu einem Endvolumen von 25 ml hinzu, vortex.
f. ATP (bakterielle Quelle), Sigma Kat. # A-7699, lagere das Pulver bei –20°C; um die Lösung für die Verwednung herzustellen, löse 3.31 mg in 1 ml dH₂O.
g. RC-20H HRPO konjugiertes Anti-Phosphotyrosin, Transduction Laboratories Kat. # E120H.
h. Pierce 1-Step (TM) Turbo TMB-ELISA (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Pierce Kat. # 34022.
i. H₂SO₄, füge 1 ml konz. (18N) zu 35 ml dH₂O hinzu.
j. TRIS HCL, Fischer Kat. # BP152-5; füge zu 121.14 g Material 600 ml MilliQ H₂O hinzu, passe den pH auf 7.5 (or 7.2) mit HCl an, bring das Volume auf 11 mit MilliQ H₂O.
k. NaCl, Fischer Kat. # 5271-10, stelle 5M Lösung her.
l. Tween-20, Fischer Kat. # 5337-500.
m. Na₃VO₄, Fischer Kat. # 5454-50, füge zu 1.8 g Material 80 ml MilliQ H₂O dazu, passe den pH auf 10.0 mit HCl oder NaOH an, koche in Mikrowelle, kühle, checke den pH, wiederhole das Verfahren, bis der pH bei 10.0 stabil ist, füge MilliQ H₂O auf 100 ml Gesamtvolumen hinzu, mache 1 ml Teilproben und lagere bei –80°C.
n. MgCl₂, Fischer Katalog # M33-500, stelle 1M Lösung her.
o. HEPES, Fischer Katalog # BP310-500, zu 200 ml MilliQ H₂O füge 59.6 g Material hinzu, passe pH auf 7.5 an, bringe das Volumen auf insgesamt 250 ml, steriler Filter.
p. Albumin, Rind (BSA), Sigma Katalog # A-4503, füge zu 30 Gramm Material sterilisiertes, destilliertes Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 300 ml zu bringen, lagere bei 4°C.
q. TBST-Puffer: Füge zu ungefähr 900 ml dH₂O in 11 Messzylinder 6.057 g TRIS und 8.766 g NaCl hinzu, wenn aufgelöst, passe pH mit HCl auf 7.2 an, füge 1.0 ml Triton X-100 hinzu und bringe auf 1lk Gesamtvolumen mit dH₂O.
r. Ziege-Affinitäts gereinigter Antikörper Kaninchen IgG (gesamtes Molekül), Cappel Katalog # 55641.
s. Anti-h-Met (C-28) Kaninchen-polyklonaler IgG-Antikörper, Santa Cruz Chemical Katalog # SC-161.
t. Vorübergehend transfizierte EGFR/Met-chimäre Zellen (EMR) (Komada, et al., Oncogene, 8:2381-2390 (1993).
u. Natriumcarbonatpuffer, (Na₂CO₄, Fischer Katalog # 5495): Füge zu 10.6 g Material 800 ml MilliQ H₂O dazu, wenn aufgelöst, passe den pH mit NaOH auf 9.6 an, bringe auf 11 Gesamtvolumen mit MilliQ H₂O, filtriere, lagere bei 4°C.

2. Verfahren
All die folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn es nicht speziell anders aufgezeigt ist. Die gesamte ELISA-Plattenwaschung wird durch 4-maliges Abspülen mit TBST durchgeführt.
A. EMR-Lysis
Dieses Verfahren kann die Nacht vor oder unmittelbar vor dem Start des Rezeptoreinfangs durchgeführt werden.

1. Taue die Lysate schnell in einem 37°C Wasserbad mit einer wirbelnden Bewegung auf, bis die letzten Kristalle verschwinden.
2. Lysiere das Zellpellet mit 1X HNTG, das 1 mM PMSF enthält. Verwende 3 ml HNTG pro 15 cm Zellenschale. Füge 1/2 des kalkulierten HNTG-Volumens hinzu, vortexe das Röhrchen für 1 Min., füge die restliche Menge HNTG hinzu, vortexe für eine weitere Min.
3. Gleiche die Röhrchen aus, zentrifugiere mit 10.000 X g für 10 Minuten bei 4°C.
4. Sammle die Überstände, entferne eine Teilprobe zur Proteinbestimmung.
5. Friere die gesammelte Probe schnell in einem trockenen Eis/Ethanolbad ein. Dieser Schritt wird durchgeführt, unabhängig davon, ob das Lysat über Nacht gelagert werden wird oder unmittelbar im Anschluss an die Proteinbestimmung verwendet wird.
6. Führe die Proteinbestimmung unter Verwendung von Standard-Bicinchoninicsäure-(BCA)-Verfahrens durch (BCA Assay-Reagenz-Kit von Pierce Chemical Katalog # 23225).

B. ELISA-Verfahren

1. Beschichte Corning ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen mit 5 μg pro Vertiefung Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper in Carbonatpuffer für ein Gesamtvertiefungsvolumen von 50 μl. Lagere über Nacht bei 4°C.
2. Entferne ungebundenen Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper durch Invertieren der Platten, um Flüssigkeit zu entfernen.
3. Füge 150 μl Blockpuffer zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubiere für 30 min. bei Raumtemperatur unter Schütteln.
4. Wasche 4x mit TBST. Klopfe die Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
5. Füge 1 μg Kaninchen anti-Met Antikörper verdünnt in TBST für ein Gesamtvertiefungsvolumen von 100 μl pro Vertiefung hinzu.
6. Verdünne das Lysat in HNTG (90 μg lysate/100 μl).
7. Füge 100 μl verdünntes Lysat zu jeder Vertiefung hinzu. Schüttele bei Raumtemperatur für 60 min.
8. Wasche 4x mit TBST. Klopfe auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
9. Füge 50 μl 1X Lysatpuffer pro Vertiefung hinzu.
10. Verdünne Verbindungen/Extrakte 1:10 in 1X Kinasepuffer in einer Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen.
11. Transferiere 5.5 μl verdünntes Arzneimittel zu den Vertiefungen der ELISA-Platte. Inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 20 min.
12. Füge 5.5 μl 60 μM ATP-Lösung pro Vertiefung hinzu. Die negativen Kontrollen erhalten kein ATP. Inkubiere bei Raumtemperature unter Schütteln für 90 min.
13. Wasche 4x mit TBST. Klopfe die Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
14. Füge 100 μl RC20 (1:3000 Verdünnung in Blockpuffer) pro Vertiefung hinzu. Inkubiere 30 min. bei Raumtemperatur unter Schütteln.
15. Wasche 4x mit TBST. Klopfe die Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
16. Füge 100 μl Turbo-TMB pro Vertiefung hinzu. Inkubiere unter Schütteln für 30–60 min.
17. Füge 100 μl 1M H₂SO₄ pro Vertiefung hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
18. Lese das Assay an einem Dynatech MR7000 ELISA Leser aus. Testfilter = 450 nm, Refernzfilter = 410 nm.

g. Biochemisches src Assay – ELISA
Dieses Assay wird verwendet, um die src Proteinkinaseaktivität, die die Phosphorylierung eines biotinylierten Peptids als Anzeige misst, zu bestimmen.
1. Materialien und Reagenzien:

a. Hefe, die mit src transformiert ist, von Courtneidge Laboratory (Sugen, Inc., Redwood City, Kalifornien).
b. Zelllysate: Hefezellen, die src exprimieren, werden pelletiert, einmal mit Wasser gewaschen, wieder pelletiert und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
c. Auf N-endständiges biotinyliertes EEEYEEYEEEYEEEYEEEY wird durch Standardverfahren, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, hergestellt.
d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.
e. ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen: Corning Easy Wash mit 96 Vertiefungen, modifizierte Flachbodenplatte, Corning Katalog # 25805-96.
f. NUNC V-Bodenpolypropylenplatten mit 96 Vertiefungen für die Verdünnung der Verbindungen: Applied Scientific Katalog # A-72092.
g. Vecastain ELITE ABC-Reagenz: Vector, Burlingame, CA.
h. Anti-src (327) mab: Schizosaccharomyces Pombe wurde verwendet, um rekombinantes Src zu exprimieren (Superti-Furga, et al., EMBO J., 12:2625–2634; Superti-Furga, et al., Nature Biochem., 14:600–605). Der S. Pombe-Strang SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) wurde wie beschrieben gezüchtet und die Transformierungen mit pRSP-Express:onsplasmiden wurden über das Lithiumacetatverfahren durchgeführt (Superti-Furga, supra). Die Zellen wurden in Gegenwart von 1 μM Thiamin gezüchtet, um die Exprimierung des nmtl-Promoters zu unterdrücken oder in Abwesenheit von Thiamin die Expremierung einzuleiten.
i. Monoklonales Anti-Phosphotyrosin, UBI 05-321 (UB40 kann stattdessen verwendet werden).
j. Turbo TMB-ELISA-Peroxidasesubstrat: Pierce Chemical.

2. Pufferlösungen:

a. PBS (Dulbecco's Phosphate-gepufferte Kochsalzlösung): GIBCO PBS, GIBCO Cat. # 450-1300EB.
b. Blockpuffer: 5% Nicht-fette Milon (Carnation) in PBS.
c. Carbonatpuffer: Na₂CO₄ von Fischer, Katalog # 5495, der 100 mM Stammlösung ergibt.
d. Kinasepuffer: 1.0 ml (aus 1 M Stammlösung) MgCl₂; 0.2 ml (aus 1 M Stammlösung) MnCl₂; 0.2 ml (aus 1 M Stammlösung) DTT; 5.0 ml (aus 1 M Stammlösung) HEPES; 0.1 ml TX-100 werden mit MilliQ H₂O auf 10 ml Endvolumen gebracht.
e. Lysispuffer: 5.0 HEPES (aus 1M Stammlösung); 2.74 ml NaCl (aus 5M Stammlösung); 10 ml Glycerol; 1.0 ml TX-100; 0.4 ml EDTA (aus 100 mM Stammlösung); 1 ml PMSF (aus 100 mM Stammlösung); 0.1 ml Na₃VO₄ (aus). 1 M Stammlösung) werden mit MilliQ H₂O auf 100 ml Endvolumen gebracht.
f. ATP: Sigma Katalog # A-7699, ergeben 10 mM Stammlösung (5.51 mg/ml).
g. TRIS-HCl: Fischer Katalog # BP 152-5, füge zu 600 ml MilliQ H₂O 121.14 g Material hinzu, bringe den pH mit HCl auf 7.5, bringe mit MilliQ H₂O auf 11 Gesamtvolumen.
h. NaCl: Fischer Katalog # S271-10, ergibt 5 M Stammlösung mit MilliQ H₂O.
i. Na₃VO₄: Fischer Katalog # 5454-50; füge zu 80 ml MilliQ H₂O 1.8 g Material hinzu, bringe den pH mit HCl oder NaOH auf 10.0, koche in einer Mikrowelle, kühle, checke den pH, wiederhole die pH-Anpassung, bis der pH nach dem Wärme/Kühlungscyclus stabil bleibt, bringe mit MilliQ H₂O auf 100 ml Gesamtvolumen, mache 1 ml Teilproben und lagere bei –80°C.
j. MgCl₂: Fischer Katalog # M33-500, ergibt mit MilliQ H₂O 1 M Stammlösung.
k. HEPES: Fischer Katalog # BP 310-500; füge zu 200 ml MilliQ H₂O 59.6 g Material hinzu, bringe den pH auf 7.5, bringe mit MilliQ H₂O auf 250 ml Gesamtvolumen, filtriere steril (1M Stammlösung).
l. TBST-Puffer: Füge zu 900 ml dH₂O 6.057 g TRIS und 8.766 g NaCl hinzu, bringe den pH mit HCl auf 7.2, füge 1.0 ml Triton-X100 hinzu, bringe mit dH₂O auf 11 Gesamtvolumen.
m. MnCl₂: Fischer Katalog # M87-100, ergibt mit MilliQ H₂O 1 M Stammlösung.
n. DTT: Fischer Katalog # BP172-5.
o. TBS (TRIS-gepufferte Kochsalzlösung): füge zu 900 ml MilliQ H₂O 6.057 g TRIS und 8.777 g NaCl hinzu, bringe mit MilliQ H₂O auf 11 Gesamtvolumen.
p. Kinasereaktionsmischung: Menge pro Assayplatte (100 Vertiefungen): 1.0 ml Kinasepuffer, 200 μg GST-ζ, bringe mit MilliQ H₂O auf 8.0 ml Endvolumen.
q. Mit Biotin markiertes EEEYEEYEEEYEEEYEEEY: Stelle in frischem Wasser eine Peptidstammlösunglösung (1 mM, 2.98 mg/ml) kurz vor der Verwendung her.
r. Vectastain ELITE ABC-Reagenz: um 14 ml Arbeitsreagenz herzustellen, füge 1 Tropfen Reagenz A zu 15 ml TBST hinzu und drehe das Röhrchen mehrere Male um, um es zu mischen. Dann füge 1 Tropfen Reagenz B hinzu. Setze das Röhrchen auf einen Orbitalschüttler bei Raumtemperatur und mische für 30 Minuten.

3. Verfahren
a. Herstellung einer mit src beschichteten ELISA-Platte

1. Beschichte die ELISA-Platte mit 0.5 μg/Vertiefung anti-src mab in 100 μl pH 9.6 Natriumcarbonatpuffer über Nacht bei 4°C.
2. Wasche die Vertiefungen einmal mit PBS.
3. Blockiere die Platte mit 0. 15 ml 5% Milch in PBS für 30 Min. bei Raumtemperatur.
4. Wasche die Platte 5 Mal mit PBS.
5. Füge 10 μg/Vertiefung mit src transformierte Hefelysaten, die in Lysispuffer (0.1 ml Gesamtvolumen pro Vertiefung) verdünnt sind, hinzu. (Menge an Lysat kann zwischen den Chargen variieren). Schüttele die Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

b. Herstellung einer mit Phosphotyrosin Antikörper beschichteten ELISA-Platte

1. 4G10-Platte: Beschichte 0.5 μg/Vertiefung 4G10 in 100 μl PBS über Nacht bei 4°C und blockiere mit 150 μl 5% Milch in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

c. Kinase-Assay-Verfahren

1. Entferne ungebundene Proteine von Schritt 1–5 oben und wasche die Platten 5x mit PBS.
2. Füge 0.08 ml Kinasereaktionsmischung pro Vertiefung (die 10 μl 10X Kinasepuffer enthält) und 10 μM (Endkonzentration) Biotin-EEEYEEYEEEYEEEYEEEY pro Vertiefung, verdünnt in Wasser, hinzu.
3. Füge 10 μl der Verbindung, die in Wasser, das 10% DMSO enthält, verdünnt ist, hinzu und preinkubiere für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Beginne die Kinasereaktion durch Hinzufügen von 10 μm/Vertiefung 0.05 mM ATP in Wasser (5 μM End-ATP).
5. Schüttele die ELISA-Platte für 15 Min. bei Raumtemperatur.
6. Stoppe die Kinasereaktion durch Hinzufügen von 10 μl 0.5 M EDTA pro Vertiefung.
7. Transferiere 90 μl Überstand zu einer blockierten 4G10-beschichteten ELISA-Platte aus Abschnitt B oben.
8. Inkubiere für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln.
9. Wasche die Platte 5x mit TBST.
10. Inkubiere mit Vectastain ELITE ABC-Reagenz (100 μl/Vertiefung) für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Wasche die Vertiefungen 5x mit TBST.
12. Entwickele mit Turbo TMB.

h. Biochemisches lck-Assay – ELISA
Dieses Assay wird verwendet, um die lck-Proteinkinaseaktivitäten, die die Phosphorylierung von GST-ζ als das Ausleseergebnis messen, zu bestimmen.
1. Materialien und Reagenzien:

a. Mit lck transformierte Hefe. Schizosaccharomyces Pombe wurde verwendet, um rekombinantes lck zu exprimieren (Superti-Furga, et al., EMBO J, 12:2625-2634; Superti-Funga, et al., Nature Biotech., 14:600-605). Der S. Pombe Strang SP200 (h-s leu1.32 ura4 ade210) wurde wie beschrieben gezüchtet und Transformationen mit pRSP Expremierungsplasmiden wurden durch das Lithiumacetatverfahren hergestellt (Superti-Furga, supra). Die Zellen wurden in Gegenwart von 1 μM Thiamin gezüchtet, um die Exprimierung einzuleiten.
b. Zelllysate: Hefezellen, die lck exprimieren, werden pelletiert, einmal in Wasser gewaschen, wieder pelliert und bei –80°C bis zur Verwendung gefroren gelagert.
c. GST-ζ: DNA, die für GST-ζ-Funktionsprotein für die Exprimierung in Bakterien kodiert, erhalten von Arthur Weiss vom Howard Hughes Medical Institute der Universität von Kalifornien, San Francisco. Transformierte Bakterien wurden über Nacht unter Schütteln bei 25°C gezüchtet. GST-ζ wurde durch Glutathionaffinitätschromatographie gereinigt, Pharmacia, Alameda, CA.
d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.
e. ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen: Corning Easy Wash mit 96 Vertiefungen, modifizierte Flachbodenplatte, Corning Katalog #25805-96.
f. NUNC V-Boden Polypropylenplatten mit 96 Vertiefungen zur Verdünnung der Verbindungen: Applied Scientific Katalog # AS72092.
g. Gereinigtes Kaninchen-anti-GST-Antiserum: Amrad Corporation (Australien) Katalog #90001605.
h. Ziege-anti-Kaninchen-IgG-HRP: Amersham Katalog # V010301.
i. Schaf-anti-Maus-IgG (H+L): Jackson Labs Katalog #5215-005-003.
j. Anti-lck (3A5) mab: Santa Cruz Biotechnology Katalog # sc-433.
k. Antiklonales anti-Phosphotyrosin UBI 05-321 (UB40 kann stattdessen verwendet werden).

2. Pufferlösungen:

a. PBS (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 1X-Lösung: GIBCO BPS, GIBCO Katalog # 450-1300EB.
b. Blockpuffer: 100 g BSA, 12.1 g TRIS-pH 7.5, 58.44 g NaCl, 10 ml Tween-20 werden mit MilliQ H₂O auf 11 Gesamtvolumen gebracht.
c. Carbonatpuffer: Na₂CO₄ von Fischer, Katalog # S495, ergibt mit MilliQ H₂O 100 mM Lösung.
d. Kinasepuffer: 1.0 ml (aus 1 M Stammlösung) MgCl₂; 0.2 ml (aus 1 M Stammlösung) MnCl₂; 0.2 ml (aus 1 M Stammlösung) DTT; 5.0 ml (aus 1 M Stammlösung) HEPES; 0.1 ml TX-100 werden mit MilliQ H₂O auf 10 ml Gesamtvolumen gebracht.
e. Lysispuffer: 5.0 HEPES (aus 1 M Stammlösung); 2.74 ml NaCl (aus 5 M Stammlösung); 10 ml Glycerol; 1.0 ml TX-100; 0.4 ml EDTA (aus einer 100 mM Stammlösung); 1.0 ml PMSF (aus 100 mM Stammlösung); 0.1 ml Na₃VO₄ (aus einer 0.1 M Stammlösung) werden mit MilliQ H₂O auf 100 ml Gesamtvolumen gebracht.
f. ATP: Sigma Katalog # A-7699, ergibt 10 mM Stammlösung (5.51 mg/ml).
g. TRIS-HCl: Fischer Kat. # BP 152-5, füge zu 600 ml MilliQ H₂O 121.14 g Material hinzu, bringe den pH mit HCl auf 7.5, bringe mit MilliQ H₂O auf 11 Gesamtvolumen.
h. NaCl: Fischer Kat. # S271-10, ergibt mit MilliQ H₂O 5 M Stammlösung.
i. Na₃VO₄: Fischer Katalog # 5454-50; füge zu 80 ml MilliQ H₂O 1.8 g Material hinzu; bringe den pH mit HCl oder NaOH auf 10.0; koche in einer Mikrowelle, kühle, checke den pH, wiederhole die pH-Anpassung, bis der pH nach dem Wärme/Kühlcyclus konstant bleibt; bringe mit MilliQ H₂O auf 100 ml Gesamtvolumen, mache 1 ml Teilproben und lagere bei –80°C.
j. MgCl₂: Fischer Katalog # M33-500, ergibt mit MilliQ H₂O 1 ml Stammlösung).
k. HEPES: Fischer Katalog # PB 310-500; füge zu 200 ml MilliQ H₂O 59.6 g Material hinzu, bringe den pH auf 7.5, bringe mit MilliQ H₂O auf 250 ml Gesamtvolumen, filtriere steril (1 M Stammlösung).
l. Albumin, Rind (BSA), Sigma Katalog # A4503; füge zu 150 ml MilliQ H₂O 30 g Material hinzu, bringe mit MilliQ H₂O auf 300 ml Gesamtvolumen, filtriere durch 0.22 μm Filter, lagere bei 4°C.
m. TBST-Puffer: Füge zu 900 ml dH₂O 6.057 g TRIS und 8.766 g NaCl hinzu; bringe den pH mit HCl auf 7.2, füge 1.0 ml Triton X-100 hinzu, bringe mit dH₂O auf 11 Gesamtvolumen.
n. MnCl₂: Fischer Katalog # M87-100, ergibt 1 M Stammlösung mit MilliQ H₂O.
o. DTT; Fischer Katalog # BP172-5.
p. TBS (TRIS gepufferte Kochsalzlösung): Zu 900 ml MilliQ H₂O füge 6.057 g TRIS und 8.777 g NaCl hinzu, bringe mit MilliQ H₂O auf 11 Gesamtvolumen.
q. Kinasereaktionsmischung: Menge pro Assayplatte (100 Vertiefungen): 1.0 ml Kinasepuffer, 200 μg GST, bringe mit MilliQ H₂O auf ein Endvolumen 8.0 ml.

2. Verfahren:
a. Herstellung einer mit Lck beschichteten ELISA-Platte

1. Beschichte 2.0 μg/Vertiefung Schaf-anti-Maus IgG in 100 μl pH 9.6 Natriumcarbonatpuffer über Nacht bei 4°C.
2. Wasche die Vertiefung einmal mit PBS.
3. Blockiere die Platte mit 0.15 ml Blockpuffer für 30 Min. bei Raumtemperatur.
4. Wasche die Platte 5x mit PBS.
5. Füge 0.5 μg/Vertiefung Anti-lck (mab 3A5) in 0.1 ml PBS bei Raumtemperatur für 1–2 Stunden hinzu.
6. Wasche die Platte 5x mit PBS.
7. Füge 20 μg/Vertiefung von mit lck transformierten Hefelysaten, die in Lysispuffer verdünnt sind, hinzu (0.1 ml Gesamtvolumen pro Vertiefung). (Menge an Lysat kann zwischen den Chargen variieren). Schüttele die Platte bei 4°C über Nacht, um Aktivitätsverlust zu vermeiden.

b. Herstellung von mit Phosphotyrosinantikörper beschichteter ELISA-Platte

1. UB40-Platte: 1.0 μg/Vertiefung UB40 in 100 μl PBS über Nacht bei 4°C und blockiere mit 150 μl Blockpuffer für wenigstens 1 Stunde.

c. Kinaseassayverfahren

1. Entferne ungebundene Proteine aus Schritt 1–7 oben und wasche die Platten 5x mit PBS.
2. Füge 0.08 ml Kinasereaktionsmischung pro Vertiefung hinzu (enthält 10 μl 10X Kinasepuffer und 2 μg GST-ζ pro Vertiefung, verdünnt mit Wasser).
3. Füge 10 μl der Verbindung, die in Wasser, das 10% DMSO enthält, verdünnt ist, hinzu und vorinkubiere für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Starte die Kinasereaktion durch Hinzufügen von 10 μl/Vertiefung 0.1 mM ATP in Wasser (10 μM End-ATP).
5. Schüttele die ELISA-Platte für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Stoppe die Kinasereaktion durch Hinzufügen von 10 μl 0.5 M EDTA pro Vertiefung.
7. Transferiere 90 μl Überstand zu einer mit 4G10 beschichteten ELISA-Platte aus Abschnitt B oben.
8. Inkubiere unter Schütteln für 30 Min. bei Raumtemperatur.
9. Wasche die Platte 5x mit TBST.
10. Inkubiere mit Kaninchen-anti-GST-Antikörper bei 1:5.000 Verdünnung in 100 μl TBST für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Wasche die Vertiefungen 5x mit TBST.
12. Inkubiere mit Ziege-anti-Kaninchen-IgG-HRP bei 1:20.000 Verdünnung in 100 μl TBST für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Wasche die Vertiefungen 5x mit TBST.
14. Entwickele mit Turbo TMB.

i. Assaymessphosphorylierungsfunktion von RAF
Das folgende Assay zeigt die Menge an mit RAF katalysierter Phosphorylierung von dessen Targetprotein MEK, als auch des MEK Target MAPK an. Die RAF-Gensequenz wird bei Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5:1400-1407 beschrieben und ist in multiplen Gensequenzdatenbanken leicht erhältlich. Die Bildung des Nucleinsäurevektors und der für diesen Teil der Erfindung verwendeten Zelllinien wird vollständig bei Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8855–8859, beschrieben.
Materialien und Reagenzien

1. Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Zellen; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
2. RIPA-Puffer: 20 mM TRIS/HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 10% Glycerol, 1 mM PMSF, 5 mg/L Aprotein, 0.5% Triton X-100.
3. Thioredoxin-MEK Fusionsprotein (T-MEK): T-MEK-Exprimierung und Reinigung durch Affinitätschromatographie wurden gemäß den Verfahren des Herstellers durchgeführt. Katalog# K 350-01 und R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
4. His-MAPK (ERK 2); His-gebildetes MAPK wurde in XL1 Blauzellen, die mit pUC18-Vektor, der für His-MAPK kodiert, transformiert wurden, exprimiert. His-MAPK wurde durch Ni-Affinitätschromatographie gereinigt. Kat# 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, wie hier beschrieben.
5. Schaf-anti-Maus-IgG: Jackson laboratories, West Grove, PA. Katalog # 515-006-008, Lot# 28563.
6. RAF-1 Proteinkinasespezifitätsantikörper: URP2653 von UBI.
7. Beschichtungspuffer: PBS; mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
8. Waschpuffer: TBST – 50 mM TRIS/HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100.
9. Blockpuffer: TBST, 0.1% Ethanolamin pH 7.4.
10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.
11. Kinasepuffer (KB): 20 mM HEPES/HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/L Aprotenin, 75 mM Natriumorthovanadat, 0.5 MM DTT und 10 mM MgCl₂.
12. ATP-Mischung: 100 mM MgCl₂, 300 mM ATP, 10 mCi ³³P ATP (Dupont-NEN)/mL.
13. Stopplösung: 1% Phosphorsäure; Fisher, Pittsburgh, PA.
14. Wallac Cellulosephosphatfiltermatten; Wallac, Turku, Finnland.
15. Filterwaschlösung: 1% Phosphorsäure, Fisher, Pittsburgh, PA.
16. Tomtec Plattenernter, Wallac, Turku, Finnland.
17. Wallac Betaplattenleser # 1205, Wallac, Turku, Finnland.
18. NUNC V-Bodenpolypropylenplatten mit 96 Vertiefungen für Verbindungen, Applied Scientific Katalog # AS-72092.

Verfahren
All die folgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur, wenn nicht speziell angegeben, durchgeführt.

1. ELISA-Plattenbeschichtung: ELISA-Vertiefungen werden mit 100 ml Schaf-anti-Maus-affinitätsgereinigtes Antiserum (1 mg/100 ml Beschichtungspuffer) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die ELISA-Platten können für zwei Wochen verwendet werden, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
2. Invertiere die Platte und entferne die Flüssigkeit. Füge 100 ml Blocklösung hinzu und inkubiere für 30 Minuten.
3. Entferne die Blocklösung und wasche 4 Mal mit Waschpuffer. Klopfe die Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
4. Füge 1 mg Antikörper, der für RAF-1 spezifisch ist, zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere für 1 Stunde. Wasche wie in Schritt 3 beschrieben.
5. Taue die Lysate von mit RAS/RAF infizierten Sf9-Zellen auf und verdünne mit TBST auf 10 mg/100 mL. Füge 10 mg verdünntes Lysat zu den Vertiefungen hinzu und inkubiere für 1 Stunde. Schüttele die Platte während der Inkubation. Die negativen Kontrollen erhalten kein Lysat. Lysate von mit RAS/RAF infizierten Sf9 Insektenzellen werden hergestellt, nachdem die Zellen mit rekombinanten Baculoviren bei einem MOI von 5 für jeden Virus infiziert wurden und 48 Stunden später geerntet. Die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer lysiert. Unlösliches Material wird durch Zentrifugation entfernt (5 Min bei 10.000 × g). Die Proben der Lysate werden in trockenem Eis/Ethanol eingefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
6. Entferne nichtgebundenes Material und wasche wie oben (Schritt 3) dargestellt.
7. Füge 2 mg T-MEK und 2 mg His-MAEPK pro Vertiefung hinzu und passe das Volumen mit Kinasepuffer auf 40 ml an. Die Verfahren zur Reinigung von T-MEK und MAPK aus Zellextrakten werden hier als Beispiel bereitgestellt.
8. Vorverdünne die Verbindungen (Stammlösung 10 mg/mL DMSO) oder die Extrakte 20fach in TBST plus 1% DMSO. Füge 5 ml der vorverdünnten Verbindungen/Extrakte zu den Vertiefungen, wie in Schritt 6 beschrieben, hinzu. Inkubiere für 20 Min. Die Kontrollen erhalten keinen Arzneistoff.
9. Starte die Kinasereaktion durch Hinzufügen von 5 ml ATP-Mischung. Schüttele die Platte auf einem ELISA-Plattenschüttler während der Inkubation.
10. Stoppe die Kinasereaktion nach 60 Min. durch Hinzufügen von 30 ml Stoplösung zu jeder Vertiefung.
11. Platziere die Phosphocellulosematte und die ELISA-Platte in dem Tomtec Plattenernter. Ernte und wasche den Filter mit der Filterwaschlösung gemäß den Anforderungen des Herstellers. Trockne die Filtermatten. Versiegele die Filtermatten und platziere sie in dem Halter. Führe den Halter in den Radioaktivitäts-Detektionsapparat ein und quantifiziere den radioaktiven Phosphor auf den Filtermatten.

Alternativ können 40 ml Teilproben der einzelnen Vertiefungen der Assayplatte zu den entsprechenden Positionen auf der Phosphocellulosefiltermatte transferiert werden. Nach Luftrocknung der Filter setze die Filter in einen Trog. Rüttele vorsichtig den Trog, wechsele die Waschlösung in 15 Minuten Intervallen für 1 Stunde. Lufttrockne die Filtermatten. Versiegele die Filtermatten und platziere sie in einem Halter, der zur Messung des radioaktiven Phosphors in den Proben geeignet ist. Führe die Halter in ein Detektionsgerät ein und quantifiziere den radioaktiven Phosphor auf den Filtermatten.
j. CDK2/Cyclin A – Inhibitionsassay
Dieses Assay analysiert die Proteinkinaseaktivität von CDK2 im exogenen Substrat.
Reagenzien

A. Puffer A (80 mM Tris (pH 7.2), 40 mM MgCl₂): 4.84 G. Tris (F.W. = 121.1 g/mol), 4.07 g. MgCl₂ (F.W. = 203.31 g/mol) gelöst in 500 ml H₂O. Passe den pH mit HCL auf 7.2 an.
B. Histon-H1 Lösung (0.45 mg/ml Histon H1 und 20 mM HEPES pH 7.2 (pH 7.4 ist OK): 5 mg Histon H1 (Boehringer Mannheim) in 11.111 ml 20 mM HEPES pH 7.2 (477 mg HEPES (F.W. = 238.3 g/mol) gelöst in 100 ml dH₂O, gelagert in 1 ml Teilproben bei –80°C.
C. ATP-Lösung (60 μm ATP, 300 μg/ml BSA, 3 mM DTT): 120 μl 10 mM ATP, 600 μl 10 mg/ml BSA auf 20 ml, gelagert in 1 ml Teilproben bei –80°C.
D. CDK2-Lösung: cdk2/cyclin A in 10 mM HEPES pH 7.2, 25 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 10% Glycerol, gelagert in 9 μl Teilproben bei –80°C.

Beschreibung des Assays

1. Stelle Lösungen von Inhibitoren mit dreimal der gewünschten Endassaykonzentration in ddH₂O/15% DMSO pro Volumen her.
2. Dispensiere 20 μl der Inhibitoren in Vertiefungen der Polypropylenplatten mit 96 Vertiefungen (oder 20 μl 15% DMSO für positive und negative Kontrollen).
3. Taue Histon H1-Lösung (1 ml/Platte), ATP-Lösung (1 ml/Platte plus 1 Teilprobe für negative Kontrolle) und CDK2-Lösung (9 μl/Platte) auf. Halte CDK2 auf Eis bis zur Verwendung. Teile die CDK2-Lösung in geeigneter Weise, um wiederholte Friercyclen zu verhindern.
4. Verdünne 9 μl CDK2-Lösung in 2.1 ml Puffer A (pro Platte). Mische. Dispensiere 20 μl in jede Vertiefung.
5. Mische 1 ml Histon H1-Lösung mit 1 ml ATP-Lösung (pro Platte) in ein 10 ml Schraubkappenröhrchen. Füge ?³³P ATP zu einer Konzentration von 0.15 μCi/20 μl (0.15 μCi/Vertiefung im Assay) hinzu. Mische vorsichtig, um BSA-Ausfransen zu verhindern. Füge 20 μl zu den geeigneten Vertiefungen. Mische die Platten auf einem Plattenschüttler. Für die negativen Kontrollen mische ATP-Lösung mit einer gleichen Menge 20 mM HEPES pH 7.2 und füge ?³³P ATP mit einer Konzentration von 0.15 μCi/20 μl Lösung hinzu. Füge 20 μl zu den geeigneten Vertiefungen hinzu.
6. Lasse die Reaktionen für 60 Minuten fortschreiten.
7. Füge 35 μl 10% TCA zu jeder Vertiefung hinzu. Mische die Platten auf einem Plattenschüttler.
8. Tüpfle 40 μl jeder Probe auf P30 Filtermattenquadrate. Ermögliche es den Matten zu trocknen (ungefähr 10–20 Minuten).
9. Wasche die Filtermatten 4 × 10 Minuten mit 250 ml 1%iger Phosphorsäure (10 ml Phosphorsäure pro Liter ddH₂O).
10. Zähle die Filtermatten mit dem Betaplattenleser.

2. Zelluläre/Biologische Assays
Assay 1: PDGF-induzierter BrdU Inkorporationsassay
Materialien und Reagenzien:

(1) PDGF: Menschliches PDGF B/B; 1276-956, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7.4), Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(3) FixDenat: Fixlösung (gebrauchsfertig), Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4) Anti-BrdU-POD: Mausmonoklonaler Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert ist, Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(5) TMB Substratlösung: Tetramethylenbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7.4, selbst hergestellt (Sugen, Inc., Redwood City, Kalifornien).
(7) Albumin, Rind (BSA): Fraktion V-Pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
(8) 3T3 Zelllinie, die genetisch verändert ist, um menschliches PDGF-R zu exprimieren.

Protokoll

(1) Die Zellen werden mit 8000 Zellen/Vertiefung in DMEM, 10% CS, 2 mM Gln in einer Platte mit 96 Vertiefungen gesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
(2) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann in einem serumfreien Medium serumverhungert (0% CS DMEM mit 0.1% BSA) für 24 Stunden.
(3) Am dritten Tag werden der Ligand (PDGF, 3.8 nM, hergestellt in DMEM mit 0.1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die negativen Kontrollvertiefungen erhalten nur serumfreies DMEM mit 0.1% BSA; die positiven Kontrollvertiefungen erhalten den Liganden (PDGF), aber keine Testverbindungen. Die Testverbindungen werden im serumfreien DMEM mit Ligand in einer Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(4) Nach 20 Stunden der Ligandaktivierung wird verdünntes BrdU-Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0.1% BSA) hinzugefügt und die Zellen mit BrdU (Endkonzentration = 10 μm) für 1.5 Stunden inkubiert.
(5) Nach der Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Abtupfen der invertierten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Die FixDenat-Lösung wird hinzugefügt (50 μl/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(6) Die FixDenat-Lösung wird vorsichtig durch Dekantieren und Abtupfen der invertierten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Milch (5% dehydrierte Milch in PBS, 200 μl/Vertiefung) wird als eine Blocklösung hinzugefügt und dann wird die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die Blocklösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Anti-BrdU-POD-Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) wird hinzugefügt (100 μl/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Das Antikörperkonjugat wird vorsichtig durch Dekantieren und 5-maliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Invertieren und Klopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(9) Die TMB-Substratlösung wird hinzugefügt (100 μl/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung ausreichend für photometrische Detektion ist.
(10) Die Absorptionsfähigkeit der Proben wird bei 410 nm (in „dualer Wellenlänge"-Modus mit einem Filter, der 490 nm liest, als eine Referenzwellenlänge) auf einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.

Assay 2: EGF-induzierter BrdU Inkorporationsassay
Materialien und Reagenzien

(1) EGF: Maus-EGF, 201; Toyobo, Co., Ltd., Japan.
(2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7.4), Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(3) FixDenat: Fixlösung (gebrauchsfertig), Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4) Anti-BrdU-POD: Mausmonoklonaler Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert ist, Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(5) TMB Substratlösung: Tetramethylenbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7.4, selbst hergestellt (Sugen, Inc., Redwood City, Kalifornien).
(7) Albumin, Rind (BSA): Fraktion V-Pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
(8) 3T3 Zelllinie, die genetisch verändert ist, um menschliches PDGF-R zu exprimieren.

Protokoll

(1) Die Zellen werden mit 8000 Zellen/Vertiefung in 10% CS, 2 mM Gln in DMEM in einer Platte mit 96 Vertiefungen gesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
(2) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann in serumfreiem Medium serumverhungert (0% CS DMEM mit 0.1% BSA) für 24 Stunden.
(3) Am dritten Tag werden der Ligand (EGF, 2 nM, hergestellt in DMEM mit 0.1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die negativen Kontrollvertiefungen erhalten nur serumfreies DMEM mit 0.1% BSA; die positiven Kontrollvertiefungen erhalten den Liganden (EGF), aber keine Testverbindungen. Die Testverbindungen werden im serumfreien DMEM mit Ligand in einer Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(4) Nach 20 Stunden der Ligandaktivierung wird verdünntes BrdU-Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0.1% BSA) hinzugefügt und die Zellen mit BrdU (Endkonzentration = 10 μm) für 1.5 Stunden inkubiert.
(5) Nach der Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Abtupfen der invertierten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Die FixDenat-Lösung wird hinzugefügt (50 μl/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(6) Die FixDenat-Lösung wird vorsichtig durch Dekantieren und Abtupfen der invertierten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Milch (5% dehydrierte Milch in PBS, 200 μl/Vertiefung) wird als eine Blocklösung hinzugefügt und dann wird die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die Blocklösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Anti-BrdU-POD-Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) wird hinzugefügt (100 μl/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Das Antikörperkonjugat wird vorsichtig durch Dekantieren und 5-maliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Invertieren und Klopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(9) Die TMB-Substratlösung wird hinzugefügt (100 μl/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung ausreichend für photometrische Detektion ist.
(10) Die Absorptionsfähigkeit der Proben wird bei 410 nm (in „dualer Wellenlänge"-Modus mit einem Filter, der 490 nm liest, als eine Referenzwellenlänge) auf einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.

Assay 3: EGF-induzierte Her2-angetriebene BrdU-Inkorporation
Materialien und Reagenzien:

(1) EGF: Maus-EGF, 201; Toyobo, Co., Ldt. Japan
(2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7.4), Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(3) FixDenat: Fixlösung (gebrauchsfertig), Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4) Anti-BrdU-POD: Mausmonoklonaler Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert ist, Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(5) TMB Substratlösung: Tetramethylenbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7.4, selbst hergestellt (Sugen, Inc., Redwood City, Kalifornien).
(7) Albumin, Rind (BSA): Fraktion V-Pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
(8) 3T3 Zelllinie, die gebildet wurde, um einen chimären Rezeptor mit der extrazellulären Domain von EGF-R und der intrazellulären Domain von Her2 zu exprimieren.

Protokoll:

(1) Die Zellen werden mit 8000 Zellen/Vertiefung in DMEM, 10% CS, 2 mM Gln in einer Platte mit 96 Vertiefungen gesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
(2) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann in einem serumfreien Medium serumverhungert (0% CS DMEM mit 0.1% BSA) für 24 Stunden.
(3) Am dritten Tag werden der Ligand (EGF = 2 nM, hergestellt in DMEM mit 0.1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die negativen Kontrollvertiefungen erhalten nur serumfreies DMEM mit 0.1% BSA; die positiven Kontrollvertiefungen erhalten den Liganden (EGF), aber keine Testverbindungen. Die Testverbindungen werden im serumfreien DMEM mit Ligand in einer Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(4) Nach 20 Stunden der Ligandaktivierung wird verdünntes BrdU-Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0.1% BSA) hinzugefügt und die Zellen mit BrdU (Endkonzentration = 10 μm) für 1.5 Stunden inkubiert.
(5) Nach der Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Abtupfen der invertierten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Die FixDenat-Lösung wird hinzugefügt (50 μl/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(6) Die FixDenat-Lösung wird vorsichtig durch Dekantieren und Abtupfen der invertierten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Milch (5% dehydrierte Milch in PBS, 200 μl/Vertiefung) wird als eine Blocklösung hinzugefügt und dann wird die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die Blocklösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Anti-BrdU-POD-Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) wird hinzugefügt (100 μl/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Das Antikörperkonjugat wird vorsichtig durch Dekantieren und 5-maliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Invertieren und Klopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(9) Die TMB-Substratlösung wird hinzugefügt (100 μl/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung ausreichend für photometrische Detektion ist.
(10) Die Absorptionsfähigkeit der Proben wird bei 410 nm (in „dualer Wellenlänge"-Modus mit einem Filter, der 490 nm liest, als eine Referenzwellenlänge) auf einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.

Assay 4: IGF1-induziertes BrdU Inkorporationsassay
Materialien und Reagenzien

(1) IGF1-Ligand: Menschlich, rekombinant; G511, Promega Corp., USA
(2) BrdU Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7.4), Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(3) FixDenat: Fixlösung (gebrauchsfertig), Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(4) Anti-BrdU-POD: Mausmonoklonaler Antikörper, der mit Peroxidase konjugiert ist, Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(5) TMB Substratlösung: Tetramethylenbenzidin (TMB), gebrauchsfertig, Katalog Nr. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Deutschland.
(6) PBS Waschlösung: 1X PBS, pH 7.4, selbst hergestellt (Sugen, Inc., Redwood City, Kalifornien).
(7) Albumin, Rind (BSA): Fraktion V-Pulver; A-8551, Sigma Chemical Co., USA.
(8) 3T3 Zelllinie, die genetisch verändert ist, um menschliches PDGF-R zu exprimieren.

Protokoll:

(1) Die Zellen werden mit 8000 Zellen/Vertiefung in DMEM, 10% CS, 2 mM Gln in einer Platte mit 96 Vertiefungen gesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
(2) Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann in einem serumfreien Medium serumverhungert (0% CS DMEM mit 0.1% BSA) für 24 Stunden.
(3) Am dritten Tag werden der Ligand (IGF1 = 3.3 nM, hergestellt in DMEM mit 0.1% BSA) und die Testverbindungen gleichzeitig zu den Zellen hinzugegeben. Die negativen Kontrollvertiefungen erhalten nur serumfreies DMEM mit 0.1% BSA; die positiven Kontrollvertiefungen erhalten den Liganden (IGF1), aber keine Testverbindungen. Die Testverbindungen werden im serumfreien DMEM mit Ligand in einer Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt und seriell für 7 Testkonzentrationen verdünnt.
(4) Nach 16 Stunden der Ligandaktivierung wird verdünntes BrdU-Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0.1% BSA) hinzugefügt und die Zellen mit BrdU (Endkonzentration = 10 μm) für 1.5 Stunden inkubiert.
(5) Nach der Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Abtupfen der invertierten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Die FixDenat-Lösung wird hinzugefügt (50 μl/Vertiefung) und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(6) Die FixDenat-Lösung wird vorsichtig durch Dekantieren und Abtupfen der invertierten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Milch (5% dehydrierte Milch in PBS, 200 μl/Vertiefung) wird als eine Blocklösung hinzugefügt und dann wird die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(7) Die Blocklösung wird durch Dekantieren entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit PBS gewaschen. Anti-BrdU-POD-Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) wird hinzugefügt (100 μl/Vertiefung) und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
(8) Das Antikörperkonjugat wird vorsichtig durch Dekantieren und 5-maliges Abspülen der Vertiefungen mit PBS entfernt und die Platte wird durch Invertieren und Klopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
(9) Die TMB-Substratlösung wird hinzugefügt (100 μl/Vertiefung) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung ausreichend für photometrische Detektion ist.
(10) Die Absorptionsfähigkeit der Proben wird bei 410 nm (in „dualer Wellenlänge"-Modus mit einem Filter, der 490 nm liest, als eine Referenzwellenlänge) auf einem Dynatech ELISA Plattenleser gemessen.

g. HUV-EC-C Assay
Das folgende Protokoll kann ebenso verwendet werden, um eine Aktivität einer Verbindung gegenüber PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF oder Flk-1/KDR zu messen, wobei alle davon natürlich durch HUV-EC-Zellen exprimiert sind.
Tag 0

1. Wasche und trypsiniere HUV-EC-C Zellen (menschliche umbilicale venenendotheliale Zellen, (American Type Culture Collection; Katalog Nr. 1730 CRL). Wasche 2mal mit Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS; erhalten von Gibco BRL, Katalog Nr. 14190-029) mit ungefähr 1 ml/10 cm² Gewebekulturflasche. Trypsiniere mit 0.05 Trypsin-EDTA in nichtenzymatischer Zelldissoziationslösung (Sigma Chemical Company; Katalog Nr. C-1544). Das 0.05 Trypsin wurde durch Verdünnung von 0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Gibco; Katalog Nr. 25200-049) in der Zelldissoziationslösung hergestellt. Trypsiniere mit ungefähr 1 ml/25–30 cm² Gewebekulturflasche für ungefähr 5 Minuten bei 37°C. Nach dem die Zellen sich von der Flasche gelöst haben, füge ein gleiches Volumen des Assaymediums hinzu und transferiere in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen (Fisher Scientific; Katalog Nr. 05-539-6).
2. Wasche die Zellen mit ungefähr 35 ml Assaymedium in dem 50 ml sterilen Zentrifugenröhrchen durch Hinzufügen des Assaymediums, zentrifugiere für 10 Minuten mit ungefähr 200 g, sauge den Überstand ab und resuspendiere mit 35 ml D-PBS. Wiederhole die Waschung zweimal mit D-PBS, resuspendiere die Zellen in ungefähr 1 ml Assaymedium/15 cm² der Gewebekulturflasche. Das Assaymedium besteht aus F12K-Medium (Gibco BRL; Katalog Nr. 21127-014) + 0.5% wärmeinaktiviertes fötales Rinderserum. Zähle die Zellen mit einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics, Inc.) und füge Assaymedium zu den Zellen hinzu, um eine Konzentration von 0.8–1.0 × 10⁵ Zellen/ml zu erhalten.
3. Füge die Zellen zu den Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen bei 100 μl/Vertiefung oder 0.8–1.0 × 10⁴ Zellen/Vertiefung hinzu, inkubiere 24h bei 37°C, 5% CO₂.

Tag 1

1. Stelle zweifache Arzneimitteltitrationen in getrennten Platten mit 96 Vertiefungen her, im Allgemeinen 50 μM runter bis 0 μM. Verwende dasselbe Assaymedium wie bei Tag 0, Schritt 2 oben erwähnt. Die Titrationen werden durch Hinzufügen von 90 μl/Vertiefung des Arzneimittels mit 200 μM (4 Mal die Endvertiefungskonzentration) zu der obersten Vertiefung einer bestimmten Plattenkolonne hergestellt. Da die Stammlösungs-Arzneimittelkonzentration gewöhnlich 20 mM in DMSO ist, enthält die 200 μN Arzneimittelkonzentration 2% DMSO. Deshalb wird ein Verdünnungsmittel, das aus 2% DMSO in Assaymedium (F12K + 0.5% fötales Rinderserum) hergestellt ist, als Verdünnungsmittel für die Arzneimitteltritrationen verwendet, um das Arzneimittel zu verdünnen, aber die DMSO-Konzentration konstant zu halten. Füge dieses Verdünnungsmittel zu den restlichen Vertiefungen in der Kolonne mit 60 μl/Vertiefung hinzu. Nimm 60 μl der 120 μl der 200 μm Arzneimittelverdünnung in der obersten Vertiefung der Kolonne und mische mit 60 μl in der zweiten Vertiefung der Kolonne. Nimm 60 μl aus dieser Vertiefung und mische mit den 60 μl in der dritten Vertiefung der Kolonne und so weiter, bis zweifache Titrationen vervollständigt sind. Wenn die Vertiefung, die als nächstes zur letzten Vertiefung liegt, gemischt wurde, nimm 60 μl der 120 μl in dieser Vertiefung und verwerfe sie. Lasse die letzte Vertiefung mit 60 μl DMSO/Medium-Verdünnungsmittel als eine nicht arzneimittelhaltige Kontrolle. Stelle 9 Kolonnen von titriertem Arzneimittel her, die für dreifache Vertiefungen ausreichend sind, jede für 1) VEGF (erhalten von Pepro Tech Inc., Katalog Nr. 100–200), 2) endothelialer Zellwachstumsfaktor (ECGF) (ebenfalls als saurer Fibroplastwachstumsfaktor oder aFGF bekannt) (erhalten von Boehringer Mannheim, Biochemica, Katalog Nr. 1439 600) oder 3) menschliches PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Deutschland) und Assaymediakontrolle. ECGF kommt als Präparation mit Natriumheparin.
2. Transferiere 50 μl/Vertiefung der Arzneimittelverdünnungen zu den Assayplatten mit 96 Vertiefungen, die 0.8–1.0 × 10⁴ Zellen/100 μl/Vertiefung der HUV-EC-C-Zellen von Tag 0 enthalten und inkubiere bei 37°C, 5% CO₂ für ~2 h.
3. Füge 50 μl/Vertiefung 80 μg/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF oder Mediumkontrolle dreifach zu jeder Arzneimittelbedingung hinzu. Wie bei den Arzneimitteln sind die Wachstumsfaktorkonzentrationen 4x die gewünschte Endkonzentration. Verwende das Assaymedium von Tag 0, Schritt 2, um die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren herzustellen. Inkubiere ungefähr 24 Stunden bei 37°C, 5% CO₂. Jede Vertiefung wird 50 μl Arzneimittelverdünnung, 50 μl Wachstumsfaktor oder Medium und 100 μl Zellen = 200 μl/Vertiefung gesamt haben. Somit werden die 4x Konzentrationen der Arzneimittel und der Wachstumsfaktoren 1x, wenn einmal alles zu den Vertiefungen hinzugefügt wurde.

Tag 2

1. Füge ³H-Thymidin (Amersham; Katalog Nr. TRK-686) mit 1 μCi/Vertiefung (10 μl/Vertiefung von 100 μCi/ml Lösung, die in RPMI-Medium + 10% wärmeinaktiviertes fötales Rinderserum hergestellt wurde) und inkubiere für ~24 h bei 37°C, 5% CO₂. Bemerke: ³H-Thymidin wird im RPMI-Medium hergestellt, da alle anderen Anwendungen, für welche wir das ³H-Thymidin verwenden, Experimente beinhalten, die im RPMI durchgeführt werden. Der Mediumunterschied bei diesem Schritt ist wahrscheinlich nicht signifikant. RPMI wurde von Gibco BRL, Katalog Nr. 11875-051 erhalten.

Tag 3

1. Friere die Platten bei –20°C über Nacht.

Tag 4

1. Taue die Platten auf und ernte mit einem Plattenernter mit 96 Vertiefungen (Tomtec Ernter 96^(R)) auf Filtermatten (Wallac; Katalog Nr. 1205-401); lese die Zahlen auf einem Wallac Betaplateflüssigscintillationszähler^TM.

3. In Vivo Tiermodelle
A. Heterotransplantat Tiermodelle
Die Fähigkeit von menschlichen Tumoren, als Heterotransplantate in athymischen Mäusen (z.B. Balb/c, nu/nu) zu wachsen, stellt ein verwendbares in vivo Modell zum Studium der biologischen Antwort auf Therapien für menschliche Tumore bereit. Seit der ersten erfolgreichen Heterotransplantat-Transplantation von menschlichen Tumoren in athymische Mäuse (Rygaard und Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbiol. Scand. 77:758-760), sind viele verschiedene menschliche Tumorzelllinien (z.B. Brust, Lunge, genital, gastrointestinal, Kopf und Nacken, Glioblastoma, Knochen und maligne Melanome) transplantiert worden und erfolgreich in nackten Mäusen gezüchtet worden. Die folgenden Assays können verwendet werden, um das Niveau an Aktivität, Spezifität und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Drei allgemeine Arten von Assays sind zur Bestimmung der Verbindungen verwendbar: zellulär/katalytisch, zellulär/biologisch und in vivo. Der Gegenstand der zellulären/katalytischen Assay ist es, die Wirkung einer Verbindung bezüglich der Fähigkeit eines TK, Tyrosine auf einem bekannten Substrat in einer Zelle zu phosphorylieren, zu bestimmen. Der Gegenstand der zellulären/biologischen Assays ist es, die Wirkung einer Verbindung bezüglich der biologischen Antwort, die durch ein TK in einer Zelle stimuliert wird, zu bestimmen. Der Gegenstand der in vivo Assays ist es, die Wirkung einer Verbindung bei einem Tiermodell mit einer bestimmten Erkrankung, wie zum Beispiel Krebs, zu bestimmen.
Geeignete Zelllinien für subkutane Heterotransplantatexperimente beinhalten C6-Zellen (Gliom, ATCC # CCL 107), A375 Zellen (Melanoma, ATCC # CRL 1619), A431 Zellen (Epithelcarcinom, ATCC # CRL 1555), Calu 6 Zellen (Lunge, ATCC # HTB 56), PC3 Zellen (Prostata, ATCC # CRL 1435), SKOV3TP5 Zellen und NIH 3T3 Fibroblasten, die genetisch gezüchtet sind, um EGFR, PDGFR, IGF-1R oder irgendeine andere Testkinase zu überexprimieren. Das folgende Protokoll kann verwendet werden, um die Heterotransplantatexperimente durchzuführen:
Weibliche athymische Mäuse (BALB/c, nu/nu) werden von Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) erhalten. Alle Tiere werden unter sauberen Bedingungen in Mikroisolatorkäfigen mit Alphi-dri Streu gehalten. Sie erhalten steriles Nagetieressen und Wasser ad libitum.
Die Zelllinien werden in einem geeigneten Medium gezüchtet (zum Beispiel MEM, DMEM, Ham's F10 oder Ham's F12 plus 5%–10% fötales Rinderserum (FBS) und 2 mM Glutamin (GLN)). Das gesamte Zellkulturmedium, Glutamin und das fötale Rinderserum werden von Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) gekauft, wenn nicht anders spezifiziert. Alle Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre von 90–95% Luft und 5–10% CO₂ bei 37°C gezüchtet. Alle Zelllinien werden routinemäßig zweimal in der Woche unterkultiviert und sind bezüglich Mycoplasma negativ, wie durch das Mycotectverfahren (Gibco) bestimmt.
Die Zellen werden bei oder in der Nähe der Konfluenz mit 0.05% Trypsin-EDTA geerntet und mit 450 × g für 10 Minuten pelletiert. Die Pellets werden wieder in sterilem PBS oder Medium (ohne FBS) zu einer bestimmten Konzentration suspendiert und die Zellen werden in das Hinterbein der Mäuse (8–10 Mäuse pro Gruppe, 2–10 × 10⁶ Zellen/Tier) implantiert. Das Tumorwachstum wird über 3 bis 6 Wochen unter Verwendung von Venenkalibrierern gemessen. Die Tumorwerte werden als ein Produkt der Länge × Breite × Höhe berechnet, wenn nicht anders aufgezeigt. Die P-Werte werden unter Verwendung des Studenten-T-Tests berechnet. Die Testverbindungen in 50–100 μl Hilfsstoff (DMSO oder VPD:D5W) wurden durch IP-Injektion in unterschiedlichen Konzentrationen, die allgemein einen Tag nach der Implantation begannen, abgegeben.
B. Tumorinvasionsmodell
Das folgende Tumorinvasionsmodell ist entwickelt worden und kann für die Bestimmung von therapeutischen Werten und der Effizienz der Verbindungen, die identifiziert worden sind, um selektiv den KDR/FLK-1 Rezeptor zu inhibieren, verwendet werden.
Verfahren
8 Wochen alte nackte Mäuse (weiblich) (Simonsen Inc.) wurden als Experimentaltier verwendet. Die Implantation von Tumorzellen wurden in einem laminaren Flussverdeck durchgeführt. Zur Anästhesie werden ein Xylazin/Ketamin Cocktail (100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin) intraperitoneal verabreicht. Ein Mittellinienschnitt wird durchgeführt, um den abdominalen Hohlraum (ungefähr 1.5 cm in der Länge) freizusetzen, um 10⁷ Tumorzellen in einem Volumen von 100 μl Medium zu injizieren. Die Zellen werden entweder in das duodenale Gewebe der Pankreas oder unter der Serosa des Dickdarms injiziert. Das Peritoneum und die Muskeln werden mit einer 6-0 Silikonkontinuitätsnaht verschlossen und die Haut wurde unter Verwendung von Wundclips verschlossen. Die Tiere wurden täglich beobachtet.
Analyse
Nach 2–6 Wochen, abhängig von der Anzahl der Untersuchungen der Tiere, wurden die Mäuse geopfert und die lokalen Tumormetastasen von verschiedenen Organen (Lunge, Leber, Gehirn, Magen, Milz, Herz, Muskeln) werden herausgeschnitten und analysiert (Messung der Tumorgröße, des Grads der Invasion, Immunochemie und in situ Hybridisierung).
D. Messung der Zelltoxizität
Die therapeutischen Verbindungen sollten bei der Inhibierung der Proteinkinaseaktivität potenter sein als beim Ausüben einer cytotoxischen Wirkung. Eine Messung der Effektivität und der Zelltoxizität einer Verbindung kann durch Bestimmen des therapeutischen Index erhalten werden: IC₅₀/LD₅₀. IC₅₀, die Dosis, die benötigt wird, um 50% Inhibierung zu erreichen, kann gemessen werden unter Verwendung von Standardtechniken, wie zum Beispiel die hier beschriebenen. LD₅₀, die Dosierung, die in 50% Toxizität resultiert, kann ebenfalls durch Standardtechniken (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63) durch Messen der Menge des freigesetzten LDH (Korzeniewski und Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313; Decker und Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61) oder durch Messen der lethalen Dosis in den Tiermodellen gemessen werden. Die Verbindungen mit einem großen therapeutischen Index sind bevorzugt. Der therapeutische Index sollte größer als 2, bevorzugt wenigstens 10, bevorzugter wenigstens 50 sein.
Schlussfolgerung
Es wird somit anerkannt, dass die Verbindungen und pharmakologischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bei der Modulation der PK-Aktivität wirksam sind und es wird deshalb erwartet, dass sie als therapeutische Agenzien gegenüber RTK-, CTK- und STK-bezogenen Erkrankungen wirksam sind.

Claims

Ein 2-Indolinon mit der chemischen Struktur:
wobei A² und A⁴ Stickstoff und A¹ und A³ Kohlenstoff oder A¹ und A³ Stickstoff und A² und A⁴ Kohlenstoff sind, wobei zu verstehen ist, dass wenn A¹, A², A³ und A⁴ Stickstoff ist, R³, R⁴, R⁵ bzw. R⁶ nicht vorhanden sind; R¹ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Cycloalkyl, C2-C10 Alkenyl, C2-C10 Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Trihalomethancarbonyl, Heteroalicyclen, Hydroxy, C1-C10 Alkoxy, C-Carboxy, O-Carboxy, C-Amido, C-Thioamido, Guanyl, Guanidinylyl, Ureidylyl, Sulfonyl und Trihalogenmethansulfonyl besteht, ausgewählt wird. R² aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Halogen besteht, ausgewählt wird; R³, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Trihalogenmethyl, Cycloalkyl, C2-C10 Alkenyl, C2-C10 Alkinyl, Aryl, Heteroaryl, Heteroalicyclen, Hydroxy, Thiohydroxy, C1-C10 Alkoxy, Aryloxy, Thiohydroxy, C1-C10 Thioalkoxy, Thioaryloxy, Sulfinyl, Sulfonyl, S-Sulfonamido, N-Sulfonamido, N-Trihalogenmethansulfonamido, Carbonyl, Aldehyd, Trihalogenmethylcarbonyl, C-Carboxy, O-Carboxy, Cyano, Nitro, Halogen, Cyanato, Isocyanato, Thiocyanato, Isothiocyanato, O- Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, Phosphonyl, Guanyl, Guanidinylyl, Ureidylyl, C-Amido, N-Amido, Amino, quartäres Ammonium und -NR¹⁸R¹⁹ besteht, ausgewählt werden. R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Carbonyl, Acetyl, Trihalogenmethylcarbonyl, C-Carboxy, Trihalogenmethansulfonyl, Sulfonyl, C-Peptidyl und, kombiniert, einem fünf- oder sechsgliedrigen heteroalicylischen Ring besteht, ausgewählt werden; Z Sauerstoff ist;
ist; J¹ aus der Gruppe, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel besteht, ausgewählt wird; J², J³ und J⁴ unabhängig aus der Gruppe, die aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht, ausgewählt werden, so dass der fünfgliedrige Heteroarylring eine in der Chemie bekannte Verbindung ist, und es des Weiteren zu verstehen ist, dass, wenn J², J³ oder J⁴ Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind, R⁸, R^8' bzw. R^8'' nicht existieren; gleichermaßen existiert R⁷ nicht, wenn J¹ Sauerstoff oder Schwefel ist; R⁷ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl, Cycloalkyl, Trihalogenmethylcarbonyl, Aryl, Guanyl, Carboxyl, Sulfonyl und Trihalogenmethansulfonyl besteht, ausgewählt wird; einer von R⁸, R^8' oder R^8'' H oder eine -(alk₁)rM-Gruppe ist, wobei (alk₁) CH₂ ist; r 1 bis einschließlich 3 ist; und M aus der Gruppe, die aus Hydroxy, Amino, Carboxy, Morpholinyl, Piperazinyl, Tetrazolyl, N-Carbamyl, O-Carbamyl, S-Sulfonamido, N-Sulfonamido, Sulfonyl, -S(O)₂OH und Phosphonyl besteht, ausgewählt wird; die übrigen beiden von R⁸, R^8' und R^8'' unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus: Wasserstoff; unsubstituiertem C1-C4 Alkyl; C1-C4 Alkyl substituiert mit einer oder mehr Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Halogen, Hydroxyl, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, Amino, S-Sulfonamido, -NR¹⁸R¹⁹ oder Carboxy; unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy; C1-C4 Alkoxy substituiert mit einem oder mehreren Halogenen; unsubstituiertem Aryl; Aryl substituiert mit einer oder mehr Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, Amino, -NR¹⁸R¹⁹, Hydroxy oder S-Sulfonamido; unsubstituiertem Heteroaryl; Heteroaryl substituiert mit einer oder mehr Gruppen ausgewählt aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, Amino, -NR¹⁸R¹⁹, Hydroxy oder S-Sulfonamido; unsubstituierten Heteroalicyclen; Heteroalicyclen substituiert mit einer oder mehr Gruppen ausgewählt aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, Halogen, Hydroxy, unsubstituiertem Alkoxy, Amino oder -NR¹⁸R¹⁹; Halogen; Cyano; Carboxy; und einem, durch die Kombination von R⁸ und R^8' oder R^8' und R^8'' gebildeten, sechsgliedrigen Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- oder heteroalicyclischen Ring; und physiologisch annehmbare Salze davon; und wobei: C1-C10 Alkyl optional mit unsubstituiertem Cycloalkyl, das aus der Gruppe, die aus Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Adamantan, Cyclohexadien, Cycloheptan und Cycloheptatrien besteht, ausgewählt wird; unsubstituiertem Aryl, das aus der Gruppe, die aus Phenyl, Naphthalenyl, und Anthracenyl besteht, ausgewählt wird; unsubstituiertem Heteroaryl, das aus der Gruppe, die aus Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin, Isochinolin, Purin und Carbazol besteht, ausgewählt wird; unsubstituierte Heteroalicyclen, die aus der Gruppe, die aus Piperidin, Morpholin, Piperazin, Pyrrolin, Pyrrolidin, Dihydrothiophen und Tetrahydrofuran besteht, ausgewählt werden; Hydroxy; C1-C4 Alkoxy; Aryloxy; Thiohydroxy; C1-C4 Thioalkoxy; Thioaryloxy; Cyano; Halogen; Carbonyl; Thiocarbonyl; O-Carbamyl; N-Carbamyl; O-Thiocarbamyl; N-Thiocarbamyl; C-Amido; N-Amido; C-Carboxy, O-Carboxy, Cyanato; Isocyanato; Thiocyanato; Isothiocyanato; Nitro; Silyl; Amino und NR¹⁸R¹⁹, wobei R¹⁸ und R¹⁹ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem Cycloalkyl wie oben definiert, unsubstituiertem Aryl wie oben definiert, Carbonyl, Trihalogenmethylcarbonyl, C-Carboxy, Trihalogenmethylsulfonyl, Sulfonyl und kombiniert einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen heteroalicyclischen Ring wie oben definiert, besteht, ausgewählt wird, substituiert ist; Cycloalkyl aus der Gruppe, die aus Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Adamantan, Cyclohexadien, Cycloheptan und Cycloheptatrien besteht, ausgewählt wird und optional mit unsubstituiertem C1-C4 Alkyl; unsubstituiertem Aryl wie oben definiert; unsubstituiertem Heteroaryl wie oben definiert; unsubstituiertem Heteroalicyclen wie oben definiert; Hydroxy; C1-C4 Alkoxy; Aryloxy; Thiohydroxy; C1-C4 Thioalkoxy; Thioaryloxy; Cyano; Halo; Carbonyl; Thiocarbonyl; Carboxy; O-Carbamyl; N-Carbamyl; C-Amido; N-Amido; Nitro; Amino und -NR¹⁸R¹⁹, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie oben definiert, substituiert ist; C2-C10 Alkenyl optional wie oben für C1-C10 Alkyl definiert substituiert ist; C2-C10 Alkinyl optional wie oben für C1-C10 Alkyl definiert substituiert ist; Aryl aus der Gruppe, die aus Phenyl, Naphthalenyl und Anthracenyl besteht, ausgewählt wird und optional mit Halogen, Trihalogenmethyl, unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem Aryl wie oben definiert, unsubstituiertem Heteroaryl wie oben definiert, unsubstituiertem Heteroalicyclen wie oben definiert, Hydroxy, C1-C4 Alkoxy, Aryloxy, Thiohydroxy, C1-C4 Thioalkoxy, Thioaryloxy, Cyano, Nitro, Carbonyl, Thiocarbonyl, C-Carboxy, O-Carboxy, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amido, N-Amido, Sulfinyl, Sulfonyl, S-Sulfonamido, N-Sulfonamido, Trihalogenmethansulfonamido, Amino und -NR¹⁸R¹⁹, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie oben definiert, substituiert ist; Heteroaryl aus der Gruppe, die Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin, Isochinolin, Purin und Carbazol besteht, ausgewählt wird und optional mit unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, unsubstituiertem Cycloalkyl wie oben definiert, unsubstituiertem Aryl wie oben definiert, Halogen, Trihalogenmethyl, Hydroxy, C1-C4 Alkoxy, Aryloxy, Thiohydroxy, C1-C4 Thioalkoxy, Thioaryloxy, Cyano, Nitro, Carbonyl, Thiocarbonyl, Sulfonamido, Carboxy, Sulfinyl, Sulfonyl, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amido, Amino und -NR¹⁸R¹⁹, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie oben definiert, substituiert ist; Heteroalicyclen aus der Gruppe, die aus Piperidin, Morpholin, Piperazin, Pyrrolin, Pyrrolidin, Dihydrothiophen und Tetrahydrofuran besteht, ausgewählt werden, und optional mit unsubstituiertem C1-C4 Alkyl; unsubstituiertem Cycloalkyl wie oben beschrieben; Halogen; Trihalomethyl; Hydroxy; C1-C4 Alkoxy; Aryloxy; Thiohydroxy; C1-C4 Thioalkoxy; Thioaryloxy; Cyano; Nitro; Carbonyl; Thiocarbonyl; Carboxy; O-Carbamyl; N-Carbamyl; O-Thiocarbamyl; N-Thiocarbamyl; Sulfinyl; Sulfonyl; C-Amido; N-Amido; Amino und -NR¹⁸R¹⁹, mit R¹⁸ und R¹⁹ wie oben definiert, substituiert sind.
Die Verbindung oder das Salz nach Anspruch 1, wobei R¹ Wasserstoff ist.
Die Verbindung oder das Salz nach Anspruch 1, wobei R² Wasserstoff ist.
Die Verbindung oder das Salz nach Anspruch 1, wobei R⁷ Wasserstoff ist.
Die Verbindung oder das Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R³, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus: Wasserstoff; unsubstituiertem C1-C4 Alkyl; C1-C4 Alkyl substituiert mit einer Gruppe, die aus der Gruppe, die aus unsubstituiertem Cycloalkyl, Halogen, Hydroxy, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, C-Carboxy, unsubstituiertem Aryl, unsubstituiertem Heteroaryl, unsubstituiertem Heteroalicyclen, Amino, quaternärem Ammonium oder -NR¹⁸NR¹⁹ besteht, ausgewählt wird; unsubstituiertem Cykloalkyl; Hydroxy; unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy; C1-C4 Alkoxy substituiert mit einer Gruppe, die aus der Gruppe, die aus einer oder mehreren Halogengruppen, unsubstituiertem Aryl oder unsubstituiertem Heteroaryl besteht, ausgewählt wird; Trihalogenmethyl; Halogen; unsubstituiertem Aryl; Aryl substituiert mit einer oder mehreren Gruppen, die unabhängig aus der Gruppe, die aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, C1-C4 Alkyl substituiert mit einer oder mehr Halogengruppen, Trihalogenmethyl, Halogen, Hydroxy oder unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy besteht, ausgewählt wird; unsubstituiertem Aryloxy; Aryloxy substituiert mit einer oder mehreren Gruppen, die unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus Halogen, unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, C1-C4 Alkyl substituiert mit einer oder mehr Halogengruppen, unsubstituiertem Aryl, Hydroxy, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, Amino- oder -NR¹⁸NR¹⁹ besteht, ausgewählt werden; S-Sulfonamido; unsubstituiertem Heteroaryl; Heteroaryl substituiert mit einer oder mehreren Gruppen, die unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, C1-C4 Alkyl substituiert mit einer oder mehreren Halogengruppen, Trihalogenmethyl, Halogen, Hydroxy, unsubstituiertem C1-C4 Alkoxy, unsubstituiertem Aryloxy, Amino, S-Sulfonamido oder -NR¹⁸R¹⁹ besteht, ausgewählt werden; unsubstituierten Heteroalicyclen; Heteroalicyclen substituiert mit einer oder mehreren Gruppen, die unabhängig aus der Gruppe, die aus unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, C1-C4 Alkyl substituiert mit einer oder mehreren Halogengruppen, unsubstituiertem C1-C4 Alkyl, Alkoxy, Hydroxy, Amino, Amino, S-Sulfonamido, oder -NR¹⁸R¹⁹ besteht, ausgewählt werden; unsubstituiertem C1-C4 Alkyl C-Carboxy; Karbonsäure; unsubstituiertem C1-C4 Alkylcarbonyl; Aldehyd; unsubstituiertem Arylcarbonyl; Acetyl; S-Sulfonamido; N-Sulfonamido; Amino; und NR¹⁸NR¹⁹.
Die Verbindung oder das Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei zwei beliebige von R⁸, R^8' oder R^8'' -(alk₁)rM Gruppen sind.
Die Verbindung oder das Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei J¹ aus der Gruppe, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel besteht, ausgewählt wird und J², J³ und J⁴ Kohlenstoff sind.
Die Verbindung oder das Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei J¹ und J³ Stickstoff und J² und J⁴ Kohlenstoff sind.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung oder ein Salz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Die Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer Krankheit, die aus einer Krebserkrankung ausgewählt wird, die aus der Gruppe, die aus Plattenepithelkarzinom, Astrocytom, Glioblastom, Brustkrebs, Gliom, Melanom, Lungenkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Blasenkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs und Kopf- und Halskrebs besteht; einer Proliferationsstörung, die aus der Gruppe, die aus Restinose, Fibrose, Psoriasis, Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis, Diabetes, Autoimmunkrankheiten, einer entzündlichen Fehlfunktion und Angiogenese besteht, ausgewählt wird.