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Die
vorliegende Erfindung betrifft bestimmte therapeutische Anwendungen
von Helianthronverbindungen.
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Die
Entdeckung der Signaltransduktionswege, die die Zellproliferation
als Reaktion auf Wechselwirkungen zwischen Wachstumsfaktoren und
entsprechenden Zellrezeptoren aktiviert, löste eine extensive Suche nach
Inhibitoren aus, die diese Kaskade zur Malignität, wobei maligne Zellen sich
einer unkontrollierten Proliferation unterziehen, stören können. Die
chemischen Signale in dieser Kaskade sind als Phosphorylierung von
Proteinen identifiziert worden, entweder an Tyrosinresten, welche
durch eine Gruppe von Enzymen katalysiert werden, die insgesamt
als Proteintyrosinkinasen (PTK) bezeichnet werden, oder an Serin-/Threoninresten durch
die Proteinkinasen A, B und C. Die Proteinkinase C (PKC) ist auch
ein wichtiger Zellsignaltransducer, der eine katalytische Domäne, die
Substrate phosphoryliert, und eine regulatorische Domäne, welche
ihre Aktivität
steuert, enthält.
Polyhydroxylierte Flavone wie Genistein und Quercetin wurden als
Inhibitoren der Phosphorylierungskinasen identifiziert (Losiewicz
et al., 1994).
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Perylenchinone
sind eine einzigartige Gruppe von Kinaseinhibitoren (Diwu et al.,
1994). Die erste dieser Verbindungen, die sorgfältig bewertet wurde, war Hypericin,
ein potentes photodynamisches Mittel, von dem die gegenwärtigen Erfinder
zunächst
entdeckten, dass es für
Retroviren virizid ist (Lavie et al., 1989; Meruelo et al., 1988),
und anschließend,
dass es für
alle lipidummantelten Viren virizid ist (Tang et al., 1990). Weitere
Studien identifizierten Hypericin als potenten und irreversiblen,
licht-abhängigen
Inhibitor der Proteinkinase C (PKC), insbesondere wenn PKC nach
der Zellaktivierung an die Zellmembran transloziert ist, wobei diese PKC-Hemmwirkung
von Hypericin möglicherweise
mit seiner antiretroviralen Wirksamkeit in Zusammenhang steht (Takahashi
et al., 1989).
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Hypericin
ist imstande, innerhalb biologischer Systeme in Dunkelheit zu wirken,
möglicherweise
aufgrund eines geringen Redoxpotentials, und dies scheint das Abfangen
von Elektronen aus physiologischen Transferreaktionen zu ermöglichen
(Lavie et al., 1994). Die einzigartige Kombination von Eigenschaften
des Hypericins veranlasste seine derzeitige klinische Bewertung
in klinischen Phase-II-Versuchen als Antitumormittel bei der Behandlung
des malignen Glioms (Couldwell et al., 1994). Diese Neoplasie ist
zur Zellproliferation auf PKC-Signale angewiesen. Hypericin ist
auch ein potenter Photosensibilisator, der fähig ist, Singulett-Sauerstoff
und freie Radikale zu erzeugen (Hadjur et al., 1994). Diese Eigenschaften
machen es auch nützlich
in der photodynamischen Therapie (PDT) von oberflächlichen
Tumoren, die für
Lichtbestrahlung erreichbar sind.
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Unglücklicherweise
ist Hypericin nur in der Hälfte
der Fälle
wirksam und kann zudem schwere Nebenwirkungen verursachen wie eine
anhaltende Sensibilität
gegenüber
Licht nach der Behandlung, ein Zustand, der medizinisch als Hypericismus
bekannt ist. Es wäre
wünschenswert,
weitere photosensibilisierende Mittel und Zellproliferations-Signaltransduktions-Inhibitoren
bereitzustellen, welche ihre zytotoxische Wirkung verglichen mit
den bestehenden Mitteln mit größerer Wirksamkeit
und möglicherweise
mit geringeren oder weniger schweren Nebenwirkungen entfalten können.
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Die
gegenwärtigen
Erfinder haben zuvor offenbart, dass gewisse Helianthronderivate
in der photodynamischen Therapie (PDT) von Tumoren nützlich sein
können,
um die Zerstörung
von Tumoren in Verbindung mit Lichtbestrahlung herbeizuführen (PCT-Veröffentlichung
WO 99/06347).
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Während photodynamische
Eigenschaften mit dem Mechanismus der biologischen Aktivitäten von
Hypericin in Zusammenhang gebracht worden sind, vollziehen sich
viele dieser Aktivitäten
auch im Dunkeln. Wirkungen wie die Wachstumshemmung von malignen
Gliomzellen sind vom Licht unabhängig
(Couldwell et al., 1994), obwohl sie durch Licht stark verstärkt wird,
ist die virizide Wirksamkeit von Hypericin gegen das murine Zytomegalie-Virus auch im Dunkeln
dokumentiert worden (Hudson et al., 1991).
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Nirgendwo
wird im Stand der Technik gelehrt oder nahe gelegt, dass perihydroxylierte
polycyclische Dianthrachinone zur Hemmung von Tumormetastasen und
zur Vorbeugung von Angiogenese nützlich
sind. Es besteht ein breit anerkannter, nicht befriedigter Bedarf
an Angiogenese-Inhibitoren, welche die Proliferation von Gefäßstrukturen
spezifisch blockieren, im Wesentlichen ohne andere physiologische
Prozesse zu beeinträchtigen,
einschließlich
der Hemmung von Angiogenese, die mit Tumorwachstum oder -progression,
Restenose und ophthalmologischen Störungen in Zusammenhang steht.
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Feststellung,
dass einige Helianthronderivate fähig sind, in mikromolaren Konzentrationen
die Transduktion von Signalen für
die Zellproliferation und Zellprogression durch den Zellreplikationszyklus
hindurch zu hemmen, was darauf hinweist, dass sie als antineoplastische
Mittel zur Behandlung von Krebs in Abwesenheit von Lichtbestrahlung
verwendet werden können.
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Sie
basiert ferner auf der überraschenden
Feststellung, dass Helianthrone den Angiogeneseprozess (Bildung
neuer Blutgefäße) sowohl
im Auge als auch bei der Bildung von primären Tumoren und insbesondere von
Metastasen stören,
was darauf hinweist, dass sie für
die Behandlung von opthalmologischen Störungen, welche mit Angiogenese
im Zusammenhang stehen, und zur Behandlung von primären Tumoren
in Abwesenheit von Lichtbestrahlung verwendet werden können.
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Es
ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Arzneimittel
bereitzustellen, die Helianthronderivate umfassen, welche als Angiogenese-Inhibitoren
wirksam sind und zur Behandlung von mit Angiogenese assoziierten
ophthalmologischen Störungen
und zur Hemmung von Restenose geeignet sind. Es ist eine weitere
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, derartige Arzneimittel bereitzustellen,
welche derartige Helianthronderivate umfassen, die als Antikrebsmittel
in Abwesenheit von Lichtbestrahlung wirksam sind.
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Es
ist wird offenbart, dass Zusammensetzungen, die die Helianthronderivate
umfassen, die zuvor in WO 99/06347 als Antikrebsmittel, welche in
Verbindung mit Licht in der photodynamischen Therapie wirken beschrieben
wurden, unerwarteterweise in Abwesenheit von Lichtbestrahlung auch
wirksam sind. Es wird nun offenbart, dass die Zusammensetzungen
eine bisher unbekannte anti-angiogenetische Wirksamkeit aufweisen.
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Es
wird nun offenbart, dass Helianthron und Derivate davon den Prozess
der Tumorangiogenese stören.
Diese Entdeckung macht diese Verbindungen als Behandlungs-Heilmittel für Krebspatienten,
welche sich einer chirurgischen Entfernung von primären Tumoren
unterzogen haben, nützlich,
um dem Wachstum von unheilbaren Metastasen vorzubeugen. Es wurde
festgestellt, dass ein chirurgischer Eingriff das Wachstum von Mikrometastasen
stimuliert, die durch Wachstumsfaktor-Inhibitoren, welche vom primären Tumor
sezerniert werden, ruhend gehalten wurden. Diese Verbindungen können dem
Metastasenwachstum vorbeugen, indem sie die Produktion oder Aktivität des vaskulären endothelialen
Wachstumsfaktors (VEGF) oder anderer angiogenetischer Faktoren stören. Es
ist bekannt, dass VEGF, ein potenter Enhancer der Gefäßpermeabilität, in vivo eine
Schlüsselrolle
bei der pathologischer Gefäßneubildung
ausübt,
die mit vielen Erkrankungen einschließlich Tumor-Gefäßneubildung,
rheumatoider Arthritis und diabetischer Retinopathie in Zusammenhang
steht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform die Verwendung einer
Helianthronverbindung oder eines Derivats davon zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung von mit Angiogenese assoziierten
ophthalmologischen Störungen
und zur Vorbeugung oder Hemmung von Restenose bereit, wobei die
Verbindung von der allgemeinen Formel (I) ist:
wobei R aus Hydroxy, C
1-C
10-Alkoxy, NH-C
1-C
10-Alkyl und NH-Hydroxy(C
1-C
10)-alkyl ausgewählt ist;
R' aus Hydroxy und
C
1-C
10-Alkoxy ausgewählt ist;
und R
1, R
2, R
3, R
4, R
5 und
R
6 unabhängig
voneinander aus Wasserstoff, Hydroxy, Chlor, Brom, C
1-C
10-Alkyl, C
1-C
10-Alkoxy und C
1-C
10-Alkoxycarbonyl ausgewählt sind.
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In
einer zweiten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Helianthronverbindung
der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung
von Proliferation von Endothel- oder vaskulären glatten Muskelzellen, die
mit Restenose assoziiert ist.
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In
einer dritten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Helianthronverbindung
der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung von Tumoren in Abwesenheit von Lichtbestrahlung.
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Beispiele
für derartige
Verbindungen als die am meisten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung sind 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron und
10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron der Formeln A und
B wie folgt:
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In
einer Ausführungsform
sind die mit Angiogenese assoziierten ophthalmologischen Störungen Retinopathien,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, diabetische Retinopathie, Makuladegeneration und Augeninfektionen,
insbesondere bakterielle Augeninfektionen, sind jedoch nicht auf
diese beschränkt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Vorbeugung von Restenose insbesondere eine nach perkutaner
transluminaler Koronarangioplastie.
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1 zeigt
die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxy-helianthron
(Dimethyl-TMH) und Hypericin auf die Lebensfähigkeit humaner U251 Glioblastomzellen
in vollständiger
Dunkelheit.
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2 zeigt
die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Dimethyl-TMH auf
die Lebensfähigkeit von
LAN5 Neuroblastomzellen in vollständiger Dunkelheit.
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3 zeigt
die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Dimethyl-TMH und
Hypericin auf die Lebensfähigkeit
von U87MG Glioblastomzellen in vollständiger Dunkelheit.
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4 zeigt
die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Dimethyl-TMH und
TMH auf die Lebensfähigkeit
von U87MG Glioblastomzellen in vollständiger Dunkelheit für 48 Stunden.
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5 zeigt
die lichtabhängigen
photodynamischen Wirkungen von Dimethyl-TMH auf die Lebensfähigkeit
primärer
postmitotischer humaner Peripherblut-Lymphozyten (PBL) in der Dunkelheit
und in Verbindung mit Licht.
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6A–D zeigen
die Wirkungen von 10 μM
Dimethyl-TMH auf humane U251 Glioblastomzellen in Kultur ohne (12A)
und nach Behandlung für
24 Stunden (12B), 48 Stunden (12C) und 72 Stunden (12D).
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7A–C zeigen
die dosisabhängigen
Reaktionswirkungen von 10 μM
(13B) und 20 μM
(13C) Dimethyl-TMH auf humane U251 Glioblastomzellen in Kultur.
Kontrolle (unbehandelt, 13A).
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8 zeigt
das prozentuale Überleben
von BALB/c-Mäusen,
die mit Plattenepithelkarzinomzellen inokuliert wurden, nach der
Behandlung mit Dimethyl-TMH.
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9A–C zeigen
das prozentuale Überleben
von BALB/c-Mäusen,
die mit DA-3HI-induzierten Brust-Adenokarzinomzellen
inokuliert wurden, nach der Behandlung mit Hypericin an den Tagen
89 (9A) und 100 (9B) nach dem chirurgischen Eingriff.
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10A–B
sind Photographien der Augen von Ratten nach Heparanase-induzierter
Angiogenese ohne Behandlung (10A, Kontrolle) und nach der Behandlung
mit Hypericin (10B).
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Diese
bisher unbekannten Eigenschaften der Helianthronverbindungen wurden
während
des Studiums der Wirkungen von Hypericin und Helianthronderivaten
auf Brust-Adenokarzinomtumore,
die in Mäusen mit
der DA-3HI-Zelllinie induziert wurden, und
auf murine anaplastische Plattenepithelkarzinomtumore, die mit der
SQ-2-Zelllinie induziert wurden, entdeckt. Beides sind hoch metastatische
Tumore und wenn sie chirurgisch reseziert werden, nachdem sie einen
Durchmesser von größer als
5 mm erreicht haben, werden die Mäuse Metastasen in Lungen und
Leber entwickeln. Die Metastasen verursachen den Tod der Tiere innerhalb
von etwa zwei Monaten nach dem chirurgischen Eingriff. Obwohl die
Verwendung von Hypericin nicht erfindungsgemäß ist, wird sie im Folgenden
als Vergleich diskutiert werden.
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Obwohl
diese zwei Tumortypen durch Hypericin nicht gehemmt werden, wurde
unerwarteterweise entdeckt, dass, wenn die Tumore chirurgisch entfernt
werden, wenn sie einen Durchmesser von 8–10 mm erreicht haben, 2–4 Injektionen
von Hypericin in das Peritoneum die Mäuse vor dem Tod infolge von
Metastasen schützen.
Hypericin beugt demnach der Entwicklung von Metastasen vor.
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Darüber hinaus
wurde bei dem Versuch zu verstehen, warum primäre Tumore weniger durch Hypericin beeinträchtigt werden,
wohingegen Metastasen stark gehemmt werden, unerwarteterweise entdeckt,
dass Hypericin und auch 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron und sein Derivat
10,13-Dimethyl-1,3,4,6-Tetramethoxyhelianthron die Gefäßneubildung
(der Fähigkeit
des Tumors, die Bildung neuer Blutgefäße zu induzieren, um die Blut-
und Nährstoffversorgung
für die
wachsenden Tumore bereitzustellen) verhinderten. Indem die Entwicklung
neuer Blutgefäße, um eine
wachsende Metastase zu versorgen, verhindert wird, werden dem schnell
wachsenden Metastasenherd Nährstoffe
und Sauerstoff für
seine sich schnell vervielfachenden Zellen entzogen und die Läsion degeneriert.
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Der
Mechanismus, durch welchen Krebszellen die Bildung neuer Blutgefäße induzieren
und sie zum Tumor leiten, ist extensiv untersucht worden, und es
ist bekannt, dass komplexe Mechanismen daran beteiligt sind. Die
Krebszellen sezernieren den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor
(VEGF), der das Wachstum neu gebildeter Blutgefäße in die Richtung des VEGF-Konzentrationsgradienten
zur höheren
VEGF-Konzentration lenkt, damit sie schließlich den Tumor erreichen (Folkman,
J. 1985; Folkman J. et al.; 1989).
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In
den Verbindungen der Formel (I), die in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, ist R aus Hydroxy, C1-C10-Alkoxy, NH-C1-C10-Alkyl und NH-Hydroxy(C1-C10)-alkyl ausgewählt; R' ist aus Hydroxy und C1-C10-Alkoxy ausgewählt; und R1,
R2, R3, R4, R5 und R6 sind unabhängig voneinander aus Wasserstoff,
Hydroxy, Chlor, Brom, C1-C10-Alkyl,
C1-C10-Alkoxy und C1-C10-Alkoxycarbonyl
ausgewählt.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet "C1-C10-Alkyl", "C1-C10-Alkoxy" und "C1-C10-Alkoxycarbonyl" geradkettige oder verzweigte Reste
mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Beispiele für derartige Alkylreste sind,
ohne auf diese beschränkt
zu sein, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Hexyl und Octyl.
Beispiele für
derartige Alkoxyreste sind, ohne auf diese beschränkt zu sein,
Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, Isopropyloxy, Butoxy, Hexyloxy und Octyloxy.
Beispiele für
derartige Alkoxycarbonylreste sind, ohne auf diese beschränkt zu sein,
Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl und Propyloxycarbonyl. In einer
bevorzugten Ausführungsform
sind R, R', und
R1 bis R6 Methyl,
jedoch können
längere
aliphatische Ketten, die in diesen Positionen anstelle der Methylgruppe
vorstellbar sind, Vorteile wie die Verlängerung der biologischen Wirksamkeit
aufgrund der besseren Retention durch die Zellen aufweisen, was
einer weniger häufigen
Verabreichung bedarf.
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Die
in der Erfindung bevorzugt verwendeten Verbindungen sind Helianthron
und Derivate davon der Formel (I), wobei die zwei R5 an
den Positionen 1 und 6 Hydroxy, Methoxy, Butylamino oder Hydroxyethylamino sind,
die zwei R5 an den Positionen 3 und 4 Hydroxy
oder Methoxycarbonyl sind, R2 und R5 an den Positionen 14 und 9 Wasserstoff
sind und R3 und R6 an
den Positionen 2 und 5 Wasserstoff oder Brom sind. Beispiele für derartige
bevorzugte Verbindungen sind 1,3,4,6-Tetrahydroxyhelianthron, 1,3,4,6-Tetramethoxyhelianthron, 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron,
10,13-Di(methoxycarbonyl)-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron, 1,6-Di-N-Butylamino-3,4-dimethoxyhelianthron,
1,6-Di-N-Butylamino-3,4-dimethoxy-10,13-dimethylhelianthron, 1,6-Di-(N-hydroxyethylamino)-3,4-dimethoxy-helianthron,
2,5-Dibrom-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron, 2,5-Dibrom-10,13-dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron
und am meisten bevorzugt 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I), in denen R
2 und R
4 jeweils Niederalkyl sind, können durch
das in US-Patent 5,120,412 beschriebene Verfahren unter Verwendung
eines 1,3-Dihydroxy-6-(niederalkyl)-anthrachinons der Formel (II):
in der R' Niederalkyl ist, als ein Ausgangsmaterial
hergestellt werden. Die Verbindung II wird zu dem entsprechenden
Anthron der Formel (III) reduziert,
in der R' die vorstehende Bedeutung aufweist,
und die Verbindung III wird kondensiert, um die gewünschten Verbindungen
der Formel (I) zu erhalten, in denen R Niederalkyl ist.
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Andere
Verbindungen der Formel (I) können
auf analoge Weise unter Verwendung von entsprechend substituierten
1,3-Dihydroxy-anthrachinonen hergestellt werden.
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Die
Verbindungen der Formel (I), in denen R
2 und
R
4 jeweils Niederalkoxycarbonyle sind, können aus den
Diacetylderivaten der Verbindung der Formel (II) vorstehend, in
der R' Methyl ist,
durch Oxidation mit CrO
3 hergestellt werden,
um die Verbindung der Formel (IV) zu bilden:
die dann durch das Verfahren
von Spitzner (Angew. Chem. Int. Ed. 16, 46 (1977)) dimerisiert wird,
um eine Verbindung der Formel (I) zu bilden, in der R Carboxy ist,
welche dann mit einem Niederalkanol verestert wird, um das gewünschte Produkt
der Formel (I) zu erhalten, in dem R
2 und
R
4 Niederalkoxycarbonyl sind.
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Die
Verbindungen der Formel (I), in der jedes R an den Positionen 1
und 6 Alkylamino oder Hydroxy-alkylamino ist, können durch Aminierung der entsprechenden
Verbindung der Formel I, in der R Alkoxy ist, mit einem Alkylamin
wie Butylamin oder einem Hydroxyalkylamin wie Ethanolamin erhalten
werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Verbindungen bereitgestellt, welche die Zellproliferation durch
den mitotischen Zyklus hindurch hemmen. Es war überraschend zu entdecken, dass
diese Verbindungen und insbesondere 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron
(hierin als "Dimethyl-TMH" bezeichnet) hoch
potent in der Deregulation verschiedener, mit dem Zellzyklus in
Zusammenhang stehender Kontrollpunkte sind, welche den geordneten
Durchgang der Zellen durch die unterschiedlichen Phasen des mitotischen
Zyklus koordinieren. In diesem Zyklus gehen Zellen in der GO-Ruhephase
in die G1-Protein- und RNA-Akkumulationsphase über. Die
Zellen treten dann in die S-Phase ein, in der die genomische DNA
dupliziert wird. Wenn die DNA-Duplikation vollständig ist, sind die Zellen in
der G2-Phase mit der doppelten Menge DNA bereit zur Zellteilung
und Schreiten zur Zellteilungsphase M-Phase (Mitose), in der sich
die Zelle in zwei Tochterzellen teilt. So wurde gefunden, dass Dimethyl-TMH
eine grundlegende Hemmwirksamkeit bei der Transduktion von Zellproliferationssignalen
besitzt und dass es maligne Zellen, einschließlich Glioblastom- und Neuroblastomzellen
in der Mitte der S- und G2-Phasen des Zellreplikationszyklus anhält. In Plattenepithelzellkarzinomtumore
tragenden Mäusen
hemmte Dimethyl-TMH das Streuen des Tumors in multiple Herde und die
Tumore verhärteten,
wurden nekrotisch und fielen nach längerer Behandlung ab.
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In
humanen malignen Glioblastomzelllinien kulminiert die Blockade des
geordneten Fortschreitens der Zellen durch die unterschiedlichen
Zyklusphasen im Zelltod (1), wobei Dimethyl-TMH beim
Töten der
Tumorzellen in Kultur unter vollständiger Dunkelheit als stärker potent
im Vergleich zu Hypericin identifiziert wurde. Das Töten der
Zellen durch Dimethyl-TMH geschah bei Dosen, in denen Hypericin
keine Wirkung auf die Kulturen aufwies. Überraschenderweise war Dimethyl-TMH
gleichermaßen
in der photodynamischen Induktion des Zelltods stärker potent
als Hypericin, wenn die Behandlungen in Verbindung mit Licht durchgeführt wurden.
Die Mechanismen, die in Dunkelheit agieren, unterscheiden sich sehr
von denen, die lichtinduzierte Photosensibilisierung vermitteln.
In der Dunkelheit vollzieht sich der Zelltod etwa vier Tage nachdem
die Verbindung verabreicht wurde, wohingegen die Zellen mit Licht
innerhalb von 2–3
Stunden starben.
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An
normalen humanen mononukleären
Zellen des peripheren Blutes hatte Dimethyl-TMH keine Wirkung auf
die Zelllebensfähigkeit.
Darüber
hinaus hatte die intraperitoneale Verabreichung der Verbindung an BALB/c-Mäuse auf
täglicher
Basis für
eine Woche keine nachteilige Wirkung auf die Tiere. In BALB/c-Mäusen, welche
anaplastische Plattenepithelzellkarzinomtumore trugen, führten Behandlungen
mit 200 μg/Maus
jeden zweiten Tag zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums,
verglichen mit tumortragenden unbehandelten Kontrollmäusen.
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Die
gemäß der Erfindung
hergestellten Arzneimittel werden an den Patienten durch Standardverfahren
verabreicht werden. Die Menge der zu verabreichenden Verbindung
und der Verabreichungsweg werden gemäß der Art des Tumors, dem Stadium
der Erkrankung, dem Alter und den Gesundheitsbedingungen des Patienten
bestimmt werden. Die bevorzugten Verabreichungswege sind intravenös oder direkte
Injektion der wässrigen
Lösung
des Wirkstoffs, welche übliche
pharmazeutisch verträgliche
Träger
und Zusatzstoffe umfasst, in den festen Tumor und topische Behandlung
der Hauttumore mit geeigneten topischen Zusammensetzungen. In disseminierten
Tumoren mit Metastasen oder systemischen Krebsen wie Leukämien und
Lymphomen sind die bevorzugten Wege systemische Wege, wobei der
intravenöse
oder der orale Weg bevorzugt sind.
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Die
in der vorliegenden Erfindung nützlichen
Helianthronverbindungen können
verwendet werden, um verschiedene Typen von Krebsen und ihre Metastasen
zu behandeln, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt auf,
Plattenepithelzellkarzinom, Basalzellkarzinom, Melanom, Kaposi-Sarkom,
Brustkarzinom, Prostatakarzinom, Hämangiom, Meningiom, Astrozytom,
Neuroblastom, Karzinom des Pankreas, Magenkarzinom, kolorektales
Karzinom, Kolonkarzinom, Übergangsepithelkarzinom
der Blase und Karzinom des Larynx, chronische myeloische Leukämie, akute
lymphozytäre
Leukämie,
akute Promyelozytenleukämie,
multiples Myelom, T-Zell-Lymphom und B-Zell-Lymphome.
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Die
in der Erfindung nützlichen
Helianthronverbindung kann durch jedes erforderliche Verfahren formuliert
werden, um die für
die Verabreichung an einen Patienten geeigneten Arzneimittel bereitzustellen.
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Die
Arzneimittel enthalten zusätzlich
zum Wirkstoff übliche
pharmazeutisch verträgliche
Träger,
Verdünnungsmittel
und dergleichen. Feste Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung
wie Tabletten, Pillen, Kapseln oder dergleichen können durch
Mischen des Wirkstoffs mit üblichen,
pharmazeutisch verträglichen Bestandteilen
wie Maisstärke,
Lactose, Saccharose, Sorbit, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat
und Gummis und mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln
hergestellt werden. Die Tabletten oder Pillen können überzogen oder auf andere Weise
mit pharmazeutisch verträglichen,
auf dem Fachgebiet bekannten Materialien gemischt werden, um eine
Dosierungsform bereitzustellen, welche eine anhaltende Wirkung oder
verlängerte
Freisetzung bietet. Andere feste Zusammensetzungen können als
Mikrokapseln zur parenteralen Verabreichung hergestellt werden.
Flüssige
Formen können
zur oralen Verabreichung oder zur Injektion hergestellt werden,
wobei der Begriff die subkutane, intramuskuläre, intravenöse und andere parenterale
Verabreichungswege einschließt.
Die flüssigen
Zusammensetzungen schließen
wässrige
Lösungen
mit oder ohne organische Hilfslösungsmittel,
wässrige
oder ölige
Suspensionen, Emulsionen mit Speiseölen ebenso wie mit ähnlichen
pharmazeutischen Vehikeln ein. Zudem können die Arzneimittel als eingekapselte
Pellets oder andere Depots zur verlängerten Freisetzung gebildet
werden.
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Die
wirksame Dosis für
Menschen liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,1 Mikrogramm bis
etwa 1 mg pro kg Körpergewicht
bei einem Regime von einmal oder mehrmals am Tag. Jedoch kann die
Verabreichung in längeren
Intervallen auch möglich
sein, für
Verbindungen oder Formulierungen mit verlängerter Wirkung.
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Im
Allgemeinen beträgt
der bevorzugte Dosierungsbereich 1 bis 200 Mikrogramm pro kg Körpergewicht.
Es ist dem Fachmann offensichtlich, dass Dosierungsform und -regime
von dem behandelten Arzt gemäß der zu
behandelnden Erkrankung, dem Verabreichungsverfahren und dem allgemeinen
Zustand des Patienten bestimmt werden. Es wird selbstverständlich sein,
dass die am meisten geeignete Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel
zuallererst von der behandelnden klinischen Indikation abhängen wird.
Die prophylaktische Behandlung eines gesunden Individuums mit hohem
Risiko für
pathologische Angiogenese wird ein verlängertes Dosierungsregime mit
langer Aufrechterhaltung, das ausreichend ist, um Angiogenese zu
hemmen, erfordern. Dieser Typ der Behandlung kann an Individuen
mit einem Risiko für
diabetische Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie,
Makuladegeneration und andere Zustände, die bekannt dafür sind,
bestimmte Patientengruppen zu belasten, angewendet werden. Im Gegensatz
dazu könnte
die Behandlung einer bestehenden Erkrankung höhere Dosen in häufigeren
Intervallen erfordern. Es wird ferner erwartet, dass die Behandlung
von bestimmten Zuständen,
die dafür
bekannt sind, dass sie eine anomale Proliferation von vaskulären glatten
Muskelzellen, einschließlich
Restenose umfassen, mit Arzneimitteln in einer Menge, die ausreichend
ist, um die Proliferation vaskulärer
glatter Muskelzellen zu hemmen, vorteilhaft durchgeführt werden wird.
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Es
wird dem Fachmann selbstverständlich
sein, dass die Behandlungen in einigen Fällen vorteilhafterweise die
Verabreichung der Zusammensetzungen in Verbindung mit einer Depot- oder medizinischen
Vorrichtung einschließen
kann. So kann beispielsweise die Behandlung von Angiogenese im Auge
ein intraokulares Implantat erfordern. Ähnlich kann die Behandlung
von Restenose, die mit Endothelzellproliferation assoziiert ist,
die Anwendung einer Zusammensetzung in Verbindung mit einer Angioplastie,
z. B. einem Überzug
auf einem Stent oder einer ähnlichen
Vorrichtung, erfordern.
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Die
Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht einschränkenden
Beispiele veranschaulicht.
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BEISPIELE
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Alle
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen sind bekannte
Verbindungen und die Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der
Literatur und im Detail in der PCT-Veröffentlichung
99/06347 der gegenwärtigen
Anmelder offenbart.
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Experimentelle Verfahren
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A. Zelllinien:
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Man
ließ humane
HL-60-Leukämiezellen
in RPMI-1640, supplementiert mit 15% fötalem Kälberserum, 100 mM Glutamin
und 100 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin wachsen. Man ließ humane
Erythroleukämie K-562-Zellen
(von einem Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie abgeleitet)
in dem gleichen Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, wachsen. Diese Zellen
und die humanen U251 Glioblastom-, U87MG Glioblastom- und LAN5 Neuroblastomzellen,
die in den Experimenten verwendet wurden, sind von ATCC erhältlich.
Alle Zelllinien wurden in einer befeuchteten 5% CO2/95%
Luft-Atmosphäre bei 37°C kultiviert.
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B. Zell-Lebensfähigkeit:
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Die
Zell-Lebensfähigkeit
wurde durch den MTT-Test überwacht,
der die Reduktion von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromid
zu Formasan durch die Mitochondrien von lebensfähigen Zellen wie in Mossman,
T., J. Immunogen., 21, 235–248
(1983), beschrieben, misst. Die Zellen werden mit MTT für vier Stunden
bei 37°C
inkubiert und in einem ELISA-Lesegerät bei 560 nm analysiert. Die
optische Dichte des von den unbehandelten Zellkulturen erzeugten
Formasans (O. D. Kontrolle) wird als eine MTT-Einheit definiert.
Die Anzahl der MTT-Einheiten in Kulturproben, welche Behandlungen
durchlaufen, wird als das Verhältnis
(O. D.Probe – O. D.Blind)/O.
D.Kontrolle) berechnet.
-
C. Photodynamischer Stress:
-
Photodynamischer
(PD) Stress ist der Grad der Phototoxizität, der auf Zielzellen durch
photodynamische Verbindungen und das Aussetzen zu Licht ausgeübt wird.
Die Lichtbestrahlung wurde durch eine fluoreszierenden Quelle von
zwei parallelen 40-Watt-Röhren durchgeführt, die
in einem festen Abstand von 16 cm platziert waren. Es wurde gemessen,
dass sie einen Lichteinfall von 4 mWatt/cm2 emittieren.
Die Lichtintensitäten
wurden quantifiziert unter Verwendung eines IL 1350 Radiometers/Photometers
von International Light Inc., USA.
-
D. Bestimmung des prozentualen
Anteils apoptotischer Zellen:
-
Der
prozentuale Anteil apoptotischer Zellen wurde durch Lichtmikroskopie
an Cytospin-Präparaten, die
mit May-Grunwald-Giemsa angefärbt
worden waren, bestimmt. Insgesamt wurden 400 Zellen von zwei Individuen
unabhängig
voneinander gezählt
und die Daten werden als Mittel der Zählungen angegeben. Apoptotische
Zellen wurden aufgrund ihrer geringeren Größe und ihrer Kerne, die in
kondensierte Chromatinkörper fragmentiert
waren, erkannt.
-
E. Durchflusszytometrie-Analyse:
-
Zellen,
die 5 Stunden nach dem Anlegen von photodynamischem Stress geerntet
worden waren, wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)
gespült
und mit 70% wässrigem
Ethanol fixiert. Die Zellen wurden dann in Phosphat-Citrat-Puffer
(PC-Puffer) mit einem pH-Wert
von 7,8 (192 Teile 0,2 M Na2PHO4)
und 8 Teile 0,1 M Citronensäure)
bei Raumtemperatur für
30 Minuten resuspendiert und mit Propidiumiodid in PC-Puffer, der
10 μg/ml
RNAse A enthielt, angefärbt.
Die Zellen wurden dann in einem Coulter EPICS XL-MCL Durchflusszytometer analysiert,
wobei das gesamte Feld gegated wurde, um die verschiedenen Veränderungen,
welche die Zellen beeinträchtigten,
einzuschließen.
-
F. DNA-Fragmentations-Test
-
Die
DNA-Fragmentierung in Zellen, welche die Apoptose unterlaufen, wurde
wie früher
beschrieben (Lotem, J. und Sachs, J., Cell Growth and Differ., 6,
647–653
(1995) getestet. 2 × 106 Zellen, die in Eppendorfröhrchen pelletiert
waren, wurden in 0,5 ml Lysispuffer, der 10 mM Tris-HCl, pH-Wert
7,5, 0,6% SDS, 10 mM EDTA und 15 μg/ml
RNA-Gemisch (Ambion Corp., Austin TX) enthielt, lysiert. Nach der
Inkubation bei 37°C für 10 Minuten
wurde NaCl bis 1 M zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht
bei 4°C
gehalten. Die Zubereitung wurde bei 14.000 g für 30 Minuten bei 4°C geschleudert,
der Überstand
wurde gesammelt, das Phenol wurde extrahiert und die DNA wurde über Nacht
bei –20°C durch Zugabe
von 1 ml Ethanol präzipitiert.
Das DNA-Pellet wurde luftgetrocknet, in 20 μl TE-Puffer (10 mM Tris, 10
mM EDTA, pH-Wert 7,5) bei 4°C
für 24 Stunden
gelöst,
für 4 Stunden
der Elektrophorese bei 2 V/cm in 1,5% Agarosegel unterworfen, das
0,5 μg/ml Ethidiumbromid
enthielt, und unter UV-Licht photographiert.
-
Beispiel 1. Töten maligner
Tumorzellen in Kultur durch Dimethyl-TMH und TMH in Dunkelheit
-
Drei
humane maligne Zelllinien wurden auf Sensibilität gegenüber Dimethyl-TMH in vitro bewertet.
Humane U251-Glioblastom-, U87MG-Glioblastom- und LAN5-Neuroblastomzellen wurden
in 96er Flachboden Mikrokulturplatten ausplattiert (2 × 105 pro Vertiefung), mit Dimethyl-TMH (erfindungsgemäß) und Hypericin (nicht
erfindungsgemäß) mit Dosen
im Bereich von 0 (Kontrolle), 0,1–20 μM in vollständiger Dunkelheit für einen
Zeitraum von 72 Stunden behandelt. Das Medium wurde abgesaugt, die
anhaftende Monoschicht wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen
und die Zell-Lebensfähigkeit
wurde durch den MTT-Test überwacht.
-
Die 1, 2 und 3 zeigen
die Ergebnisse für
die U251-Glioblastom-, LAN5-Neuroblastom- beziehungsweise U87MG Glioblastomzellen;
ein Vergleich der zytotoxischen Wirksamkeit mit Hypericin wird in
den 1 und 3 gezeigt. Die Zell-Lebensfähigkeit
ging allen dreien nach dem Aussetzen zu Dimethyl-TMH für mindestens
72 Stunden verloren, wie in den MTT-Lebensfähigkeitstests gemessen. Der
Verlust der Zell-Lebensfähigkeit
nach Behandlung der zwei Glioblastomzellen mit Dimethyl-TMH in Dunkelheit
war stärker
wirksam als die Behandlung mit Hypericin.
-
Das
Experiment wurde dann mit U251-Glioblastomzellen, die mit Dimethyl-TMH
oder Tetramethoxy-helianthron (TMH) in Dosisbereichen von 0,1–12 μM in vollständiger Dunkelheit
behandelt worden waren, wiederholt. Die Zell-Lebensfähigkeit
wurde durch den MTT-Test überwacht.
Die Ergebnisse in 4 zeigen, dass sowohl Dimethyl-TMH
als auch TMH vergleichbare zytotoxische Wirksamkeit auf U251-Zellen
zeigten.
-
Beispiel 2. Lichtabhängige photodynamische
Wirkungen von Dimethyl-TMH an normalen primären humanen Peripherblut-Lymphozyten
-
Humane
Peripherblut-Lymphozyten (PBL) sind in Abwesenheit von mitogenen
Stimuli nicht proliferierende Zellen. Die Wirkungen unterschiedlicher
Dosen von Dimethyl-TMH auf PBL wurden in Gegenwart (nicht erfindungsgemäß) oder
in Abwesenheit (erfindungsgemäß) von Bestrahlung
mit polychromatischem weißen Licht
untersucht. PBL (postmitotisch) wurden in zwei getrennte Rundbodenplatten
mit 96 Vertiefungen ausplattiert (2 × 105 Zellen/Vertiefung)
(in dreifacher Ausführung).
Dimethyl-TMH wurde zu den Kulturen zugegeben. Eine Platte wurde
unter Dunkelheit gehalten, die andere wurde polychromatischem weißen Licht
mit einer Flussrate von 8 mW/cm2 für 30 min
(insgesamt 14,4 J/cm2) ausgesetzt. Beide
Platten wurden dann bei 37°C, 5%
CO2 für
72 Stunden kultiviert und die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch den MTT-Test
getestet. Die Ergebnisse in 5 zeigen,
dass Dimethyl-TMH keine Wirkung auf die PBL-Lebensfähigkeit
in Abwesenheit der Lichtbestrahlung aufwies, dass jedoch die Photosensibilisierung
mit Licht den Zelltod bei einer LD50 von
etwa 0,65 μM
Dimethyl-TMH verursachte, was anzeigt, dass Dimethyl-TMH ein potentes
photodynamisches Reagens ist, jedoch nicht auf nicht-proliferierende
Zellen in Abwesenheit von Lichtbestrahlung wirkt.
-
Beispiel 3: Bestimmung
der Zellzyklusphasen, in denen Dimethyl-TMH Wachstum und Proliferation
maligner Tumore in der Dunkelheit anhält
-
Zellzyklus-
und DNA-Gehaltsanalysen wurden in humanen U251-Glioblastomzellen
nach Behandlung mit 5 μg/ml
(10 μM)
Dimethyl-TMH für
24, 48 und 72 Stunden und an LAN5-Neuroblastomzellen nach 48 Stunden durchgeführt. Die
Zellen wurden dann mit Propidiumioidid angefärbt, mit PBS gewaschen und
in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortiergerät (FACS) analysiert. Ein Computerprogramm
ordnete die mit der DNA in Zusammenhang stehende Fluoreszenz wie
folgt an: Die minimale Menge an Fluoreszenz wird als ein vollständiger Satz
zellulärer
DNA angesehen, der mit der G1-Ruhephase
in Zusammenhang steht. Eine doppelte Menge an Fluoreszenz wird als
in der G2-Phase befindlich angesehen, in
der das gesamte Genom nach der vollständigen DNA-Synthese verdoppelt
wird, und dazwischen liegende Mengen werden als in der S-Phase der DNA-Synthese befindlich
angesehen, in der die gesamte DNA-Synthese noch nicht abgeschlossen
ist.
-
Die
in den 6–7 gezeigten
Ergebnisse geben zu erkennen, dass die Verabreichung von 10 μM Dimethyl-TMH
an humane U251-Glioblastomzellen ein Anhalten der Zellproliferation
in der mittleren S-Phase (12B) erzeugte. Der Anteil von Zellen,
die sich in der S-Phase befinden, erhöhte sich stetig mit der Dauer
des Aussetzens zu Dimethyl-TMH (6A, 6B, 6C).
Wenn die Dimethyl-TMH-Dosis von 10 μM auf 20 μM erhöht wurde (7B, 7C),
trat ein ausschließliches
Anhalten in der S-Phase auf. Studien mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
bestätigten
dieses Ungleichgewicht in der DNA-Replikation am Gen-Spiegel. Dieses Anhalten
des Zellzyklus verursachte toxische Wirkungen, welche den Zelltod
bewirken.
-
Beispiel 4: Vorbeugung
der Bildung von Metastasen in BALB/c-Mäusen, die ein hoch invasives
Plattenepithelzellkarzinom tragen, mit Dimethyl-tetramethoxyhelianthron
-
Die
effektive zytozide Wirksamkeit von Dimethyl-TMH in vitro regte zu
der Bewertung seines Sicherheits- und antitumoralen Wirksamkeitsprofils
in tumortragenden Mäusen
an. Die Experimente wurden an Mäusen
durchgeführt,
welche Tumore trugen, die von der hoch metastatischen, anaplastischen
Plattenepithelzellkarzinom-(SCC)Linie abgeleitet worden waren. Dieser
Tumor entwickelt sich in multifokalen Zentren, welche sich in der
Nähe des
primären
Tumors streuen, und Metastasen entwickeln sich etwa zwei Monate
nach der Zellinokulation. Es wurden Behandlungen mit 300–600 μM Dimethyl-TMH/Maus
begonnen, verabreicht zweimal oder dreimal pro Woche, sobald der
Tumor 5 bis 7 mm im Durchmesser erreichte.
-
Tabelle
1 zeigt die Ergebnisse von einem der Experimente, in dem BALB/c-Mäuse mit
5 × 105 Zellen der anaplastischen SQ2 Plattenepithelzellenkarzinomlinie
intradermal in die rasierten Rücken
inokuliert wurden, 8 Mäuse
pro Gruppe. Sobald die primären
Tumore einen Durchmesser von 5 mm erreichten, wurde die Therapie
mit 300 μM
Dimethyl-TMH/Maus, verabreicht intraperitoneal zweimal pro Woche,
begonnen. Drei Wochen nach Beginn der Therapie wurde die Anzahl
der Tumorherde, die sich am Ort des primären Tumors entwickelt hatten,
aufgezeichnet. Die Anzahl der Herde, die sich 21 Tage nach dem Start
der Therapie entwickelt hatten, wurde durch Dimethyl-TMH, das in
therapeutischen, für
die Tiere nicht toxischen Dosen verabreicht wurde, beträchtlich
verringert. Zusätzlich
zum Vorbeugen einer multifokalen Streuung dieses Tumors verhärtete sich
der primäre
Tumor und fiel bei 5 der behandelten Mäuse ab, was anzeigt, dass eine
vollständige
Heilung dieses Tumors erreicht werden kann, sobald die Behandlungsregime
optimiert sind.
-
Tabelle
1 Die
Anzahl der Tumorherde, beobachtet 21 Tage nach dem Start der Therapie
mit Dimethyl-TMH
-
Beispiel 5: Überleben
der Plattenepithelzellkarzinom-tragenden Mäuse, die mit Dimethyl-TMH behandelt
wurden
-
In
einem anderen Experiment wurden BALB/c-Mäuse mit 5 × 105 Zellen
der hoch metastatischen anaplastischen SQ2-Plattenepithelzelllinie
intradermal in die rasierten Rücken
inokuliert. Sobald die primären
Tumore einen Durchmesser von 3 bis 4 mm erreichten, wurde die i.p.
Verabreichung von Dimethyl-TMH 200 μg/Maus (400 μM/Maus) am Tag 7 nach der Tumorzellinokulation
begonnen und zweimal wöchentlich
an die tumortragenden Mäuse
für sechs
Wochen (insgesamt 12 Dosen) verabreicht. Dann wurde das Überleben
der Tiere verfolgt. Die Ergebnisse in 8 zeigen,
dass das Überleben
der Tiere um etwa 40,3% verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe
verlängert
wurde. Es ist beachtenswert, dass die primären Tumore während der
Behandlung fortführen
zu wachsen und das Überleben
der Tiere dennoch verlängert
wurde. Dies scheint ein Ergebnis des verringerten Metastasenwachstums
zu sein, wie aus Tabelle 1 in Beispiel 4 vorstehend ersichtlich.
-
Beispiel 6: Die Verwendung
von Dimethyl-TMH in der antineoplastischen Therapie von malignen
Tumoren in Mäusen
-
Die
antineoplastischen Wirkungen von Dimethyl-TMH in vivo können in
einer Anzahl von murinen experimentellen Tumoren untersucht werden.
Diese schließen
das murine Esb-Lymphom,
MCA-105-Sarkom und B16-Melanom ein, welche in C57BL/6J-Mäusen bewertet
werden. DA3HI murine Brustkarzinomzellen,
eine hoch metastatische Variante von DA3, welche ein metastatisches
Brust-Adenokarzinom in BALB/c-Mäusen
erzeugt, und A431-Zellen,
welche epidermoide Tumore in NIH Swiss-Mäusen erzeugen, werden auf ihre
Sensibilität
gegenüber
der Behandlung mit Dimethyl-TMH oder mit TMH getestet. Die Tumore
werden in Mäusen, 8–10 Tiere
pro Gruppe, durch intradermale Inokulationen der tumorerzeugenden
Zellen gezüchtet.
Es werden Dimethyl-TMH-Dosissteigerungen im Bereich zwischen 20–1000 μM (10–500 μg/Maus) untersucht.
Die Häufigkeiten
der Verabreichungen werden variiert von täglicher Verabreichung, 3 × wöchentlich
bis 1 × wöchentlich,
verabreicht in Zeiträumen
im Bereich von 2–12
Wochen. Die Tiere werden auf Unterschiede in der Größe des primären Tumors
verglichen mit den unbehandelten tumortragenden Kontrollmäusen überwacht.
Um das Streuen der Metastasen zu analysieren werden alle Mäuse beim
Tod der ersten Kontrollgruppen-Maus oder an zur Beendigung des Experiments
festgesetzten Zeitpunkten geopfert. Es werden Endpunkte, die in
früheren Beispielen
verwendet wurden, angewendet. Das Gewicht von Milz, Leber und Lungen
sind Parameter, welche wir zur Bestimmung der Metastasenlast verwenden.
Die Gesamtzahl metastatischer Herde in jedem dieser Organe ist ein
zweiter Parameter, der nach der Fixierung in Bouin-Lösung bestimmt
wird. Das Überleben
der Tiere ist ein weiterer Endpunkt, der untersucht wird. Die mittlere
und mediane Überlebenszeit
nach der Tumorzellinokulation wird bestimmt. Die Signifikanz der
Verlängerung
des Überlebens
wird durch den Vergleich mit den Kontrollen der unbehandelten tumortragenden
Tieren ohne Lichtexposition (Dunkelheits-Wirkungen der Verbindung) im T-Test
für verbundene
Stichproben berechnet.
-
In
einem Experiment wird die anti-tumorale Wirksamkeit von Dimethyl-TMH
auf humane Tumoren in einem in vivo-Modell am C.B-17 SCID-Maus-Stamm
(Fox Chase) bewertet. Humane epidermoide und Glioblastom-Tumore
sind in der Haut dieser Mäuse
durch Inokulation mit den entsprechenden humanen Zelllinien induziert
worden. Die Tiere werden dann verschiedenen Dimethyl-TMH-Behandlungsprotokollen
unterworfen, wobei die Verbindung intraperitoneal verabreicht wird.
Die Tiere werden auf Tumorgröße und Überleben überwacht.
-
Beispiel 7: Vorbeugung
der Bildung von Metastasen in DA-3HI induzierten
Brust-Adenokarzinomtumoren in BALB/c-Mäusen mit Hypericin (nicht erfindungsgemäß)
-
Die
Größe des primären Tumors,
bei der in DA-3HI-abgeleiteten Brust-Adenokarzinomtumoren
Metastasen auftreten, wurde zunächst
in BALB/c-Mäusen,
die mit 5 × 105 DA-3HI-Tumorzellen
intradermal inokuliert worden waren, kalibriert. Es wurde entdeckt,
dass, wenn die chirurgische Entfernung des primären Tumors durchgeführt wurde,
wenn der Tumor einen Durchmesser von 5 mm oder weniger erreicht
hatte, die Resektion des primären
Tumors die Mäuse
heilte. Wenn die Resektion an Tumoren mit größeren Durchmessern durchgeführt wurde,
starben die Mäuse
an den Metastasen. Ein Durchmesser von etwa 5 mm scheint der Grenzwert zu
sein, bei dem die Metastasen beginnen zu streuen.
-
DA-3HI-Tumore wurden in 12 Wochen alten weiblichen
BALB/c-Mäusen
wie vorstehend beschrieben induziert. Sobald die Tumore Durchmesser
von 8–10
mm erreichten, wurden die Mäuse
in vier Gruppen geteilt. Eine Gruppe von 19 Mäusen blieb unbehandelt und
in den drei anderen Gruppen wurden die Tumore chirurgisch entfernt.
Eine dieser resezierten Gruppen erhielt zwei intraperitoneale (i.p.)
Injektionen mit 200 μg
Hypericin (HY) im Abstand von 5 Tagen, wobei zwei Tage vor dem chirurgischen
Eingriff begonnen wurde (16 Mäuse).
Eine andere resezierte Gruppe erhielt fünf i.p. Injektionen mit jeweils
200 μg Hypericin
im Abstand von 5 Tagen, wobei zwei Tage vor dem chirurgischen Eingriff
(17 Mäuse)
begonnen wurde. Eine resezierte Gruppe wurde nicht mit Hypericin
behandelt (16 Mäuse).
Die Mäuse
wurden dann auf Überleben
beobachtet. 9A zeigt, dass keine der tumortragenden
unbehandelten Mäuse überlebte
und 20% der Mäuse,
die einem chirurgischen Eingriff unterzogen worden waren, überlebten
auch am Tag 89. Jedoch erhöhte
die Verabreichung von 2 i.p. Injektionen Hypericin die Überlebensrate
auf 35% und die Verabreichung von 5 Hypericindosen erhöhte die Überlebensrate
auf 60%.
-
9B zeigt
das kumulative Überleben
der Mäuse,
die 2 und 5 Dosen Hypericin (jeweils 200 μg/Maus) für 100 Tage nach dem chirurgischen
Eingriff erhielten (diese Werte bestanden für 164 Tage nach der Tumorinokulation).
Sie legen die vollständige
Vermeidung von Metastasen in der überlebenden Gruppe von Mäusen nahe,
insbesondere in der Gruppe, die fünf Dosen Hypericin erhielt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Hypericin die Mäuse davor schützt, Metastasen
zu entwickeln, und dass es so dem Tod der Tiere durch die Auswirkungen
der systemischen Dissemination von Zellen aus dem primären Tumor
vorbeugt.
-
BEISPIEL 8. Vorbeugung
der Bildung von Metastasen in BALB/c Mäusen, welche hoch invasives
Plattenenithelzellkarzinom tragen, mit Hypericin (nicht erfindungsgemäß)
-
In
einer anderen Versuchsreihe wurden die Plattenepithelzellkarzinomtumore
in BALB/c-Mäusen durch
Inokulieren von 5 × 105 SQ2-Zellen pro Maus erzeugt. Sobald die
Tumore einen Durchmesser von 1,0–1,2 cm im Durchmesser erreicht
hatten, wurden sie durch einen chirurgischen Eingriff entfernt (reseziert). Eine
Gruppe von 5 Mäusen
erhielt drei i.p. Injektionen Hypericin von 100 μg/Maus vor dem chirurgischen
Eingriff und zwei Regime von 50 μg/Maus
nach dem chirurgischen Eingriff in Intervallen von 5 Tagen zwischen jeder
Dosierung. Eine andere Gruppe von 8 Mäusen erhielt sechs i.p. Injektionen
Hypericin von 100 μg/Maus vor
dem chirurgischen Eingriff und fünf
Regime von 50 μg/Maus
nach dem chirurgischen Eingriff in Intervallen von 5 Tagen Abstand.
Eine Kontrollgruppe von 17 Mäusen
wurde nur dem chirurgischen Eingriff ohne Behandlungen mit Hypericin
unterzogen und eine weitere Kontrollgruppe blieb unbehandelt (22
Mäuse).
Das Überleben
der Tiere wurde dann verfolgt. Es wurde gefunden, dass 60% der Mäuse, die
drei Hypericininjektionen erhalten hatten, 240 Tage nach der Tumorzellinokulation
noch am Leben waren; von den Mäusen,
welche 6 Hypericininjektionen erhalten hatten, waren 40% am Leben,
wohingegen von den Mäusen,
welche nur einem chirurgischen Eingriff unterzogen worden waren,
20% am Leben waren. Diese Ergebnisse zeigen ebenfalls Schutzraten
von 20–40%
aufgrund der Hypericinverabreichung.
-
Im
Bemühen,
zu verstehen, wie Hypericin das Metastasenwachstum verhindert, wurde
das Experiment wiederholt und die Morphologie der metastatischen
Läsionen
wurde dann verfolgt. Primäre
DA-3HI-Tumore wurden in BALB/c-Mäusen induziert.
Der chirurgische Eingriff wurde an den Tumoren durchgeführt, sobald
die Durchmesser 8–10
mm erreicht hatten. Diese Mäuse
(17 Tiere) wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, eine wurde mit 5 Dosen
200 μg/Maus
Hypericin in 5-Tages-Intervallen wie vorstehend beschrieben (9 Tiere) behandelt
und eine andere Gruppe diente als unbehandelte Kontrolle (8 Mäuse). Man
ließ die
Tiere für
zwei weitere Monate wachsen. Die Mäuse wurden dann geopfert und
die inneren Organe auf metastatische Läsionen untersucht. Die physische
Untersuchung offenbarte zahlreiche gut entwickelte metastatische
Läsionen
in den unbehandelten Mäusen,
die mit großen,
sichtbaren Blutgefäßen versorgt
wurden. Die wenigen Läsionen, die
sich in einigen der mit Hypericin behandelten Mäusen entwickelt hatten, waren
viel kleiner, etwas stärker nekrotisch
und ohne eine derartige Gefäßversorgung
(versorgende Blutgefäße). Dies
war nur ersichtlich, wenn die Hypericininjektionen sehr früh vor der
Resektion des primären
Tumors begonnen wurden. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass
Hypericin die Angiogenese (Wachstum einer neuen Gefäßversorgung)
hemmt. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Mangel an Blutversorgung
und keine direkten Anti-Krebs-Wirkungen die Entwicklung von Metastasen
vorhindern. Da Angiogenese primär
durch den vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) vermittelt wird, kann Hypericin
entweder die Bildung oder Sezernierung von VEGF aus Tumorzellen
oder sein Zielen auf die Rezeptoren auf vaskulären Endothelzellen stören. Ohne
sich zu sehr an einen der vorgeschlagenen Mechanismen binden zu
wollen, ist von Hypericin gezeigt worden, dass es die Proteinkinase
C hemmt, und die Letztere ist für
die VEGF-Produktion wesentlich. Die Störung des Signaltransduktionsweges,
der in der Produktion von VEGF gipfelt, kann der Mechanismus für die durch
Hypericin oder Helianthronderivate vermittelte Hemmung der VEGF-Wirkung
sein, die zur Hemmung des Wachstums metastatischer Läsionen führt. Ungeachtet
des vorgeschlagenen Wirkungsmechanismus ist nun gezeigt worden,
dass diese Zusammensetzungen hoch potente Angiogeneseinhibitoren
sind.
-
Beispiel 9. Verhinderung
von Vaskularisation (Angiogenese) der Augenvorderkammer durch systemische
Verabreichung von Hypericin (nicht erfindungsgemäß)
-
Vier
Ratten (jeweils 250 g) wurden drei intraperitoneale Injektionen
Hypericin (750 μg
pro Dosis in 5 ml Wasser, das 3,5% Ethanol enthielt) in Vier-Tages-Intervallen
gegeben. Am folgenden Tag wurden die Tiere mit Xylazin-Ketamin anästhesiert
und Angiogenese (Bildung neuer Blutgefäße) wurde durch Inokulation
von 2 μl
Heparanase (30 μg/ml)
in das frontale Kompartiment des Auges in die Hornhaut eines der
beiden Augen jeder Ratte induziert. Eine vierte intraperitoneale
Injektion von 750 μg
Hypericin wurde am nächsten
Tag angewendet. Zwei Tiere der positiven Kontrolle erhielten nur
2 μl Heparanase
(30 μg/ml)
in das frontale Kompartiment des Auges. Man ließ die Angiogenese sich für 5 Tage
entwickeln, dann wurden die Tiere mit Xylazin-Ketamin anästhesiert
und unter einem Binokularmikroskop auf die Entwicklung von Blutgefäßen in der
Augenvorderkammer hin untersucht und fotografiert. Die Fotografie
in 10A zeigt die Blutgefäße im Kontrollauge einer Ratte
nach der Heparanase-induzierten
Angiogenese und ohne Behandlung mit Hypericin, während die Fotografie 10B das Fehlen von Blutgefäßen im Auge einer mit Hypericin
behandelten Ratte zeigt. Ein ähnlicher
Schutz wurde erhalten, wenn die Angiogenese in Rattenaugen mit bFGF
(basischer Fibroblastenwachstumsfaktor) (nicht gezeigt) induziert
wurde.
-
Beispiel 10. Hypericin
stört Angiogenese
-
Eine
Rattenaorta wurde in Ringe zerschnitten, welche in Fibringele eingebettet
und in MCDB 131 Medium kultiviert wurden. Die Endothelzellen, die
sich aus den Aortaringen lösen,
erzeugen verzweigte Mikrogefäße gemäß einem
früher
beschriebenen Verfahren (Nicosia R. F. und Ottinetti, A., Growth
of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. Laboratory
Investigation 63: 115, 1990). Die Zugabe von Hypericin (nicht erfindungsgemäß) in einem
Dosisbereich zwischen 0,1–10 μg/ml (0,2–20 μM) oder Dimethyl-tetrahydroxyhelianthron
(erfindungsgemäß) in einem
Dosisbereich zwischen 0,1–10 μg/ml (0,2–20 μM) führte zur
Hemmung der Bildung der organisierten Mikrogefäße.
-
Die
voranstehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen wird die allgemeine
Natur der Erfindung so vollständig
offenbaren, dass andere unter Anwendung des gegenwärtigen Wissens
derartige spezifische Ausführungsformen
leicht modifizieren und/oder den verschiedenen Anwendungen anpassen
können,
ohne Experimentieren über
Gebühr
und ohne vom allgemeinen Konzept abzuweichen, und deshalb sollten
derartige Adaptionen und Modifikationen innerhalb der Bedeutung
und dem Bereich von Äquivalenten
der offenbarten Ausführungsformen
verstanden werden. Es sollte selbstverständlich sein, dass die hierin
verwendete Phraseologie oder Terminologie dem Zweck der Beschreibung
dient und nicht der Einschränkung.
Die Mittel, Materialien und Schritte zur Durchführung der verschiedenen offenbarten
Funktionen können
eine Vielzahl von alternativen Formen annehmen, ohne von der Erfindung
abzuweichen.
-
LITERATURHINWEISE
-
- Couldwell W. T., Gopalakrishna, R., Hinton,
D. R., He, S., Weiss, M. H., Law, R. E., Apuzzo, M. L. und Law,
R. E., Hypericin: a potential antiglioma therapy. Neurosurgery 35:
705–710,
1994.
- Diwu, Z., Zimmermann, J., Meyer, Th. & Lawn, J. W., Design, synthesis,
and investigation of mechanisms of action of novel protein kinase
C inhibitors: perylene quinonoid pigments. Biochem. Pharmacol. 47;
373–385; 1994.
- Folkman, J. Angiogenesis and its inhibitors. In: Important Advances
in Oncology. De Vita V. T., Hellman, S., Rosenberg S. A. – Herausgeber,
S. 42, Philadelphia, Lippincott Co., 1985.
- Folkman J., Watson, K., Ingber D., Hanahan, D., Induction of
angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia.
Nature 339: 58, 1989.
- Hadjur, C. Jeunet, A. und Jardon, P., Photosensitization by
hypericin: ESR evidence for singlet oxygen and superoxide anion
radicals formation in an in vitro model. J. Photochem. & Photobiol. B.
Biol. 26: 67–74,
1994.
- Hudson, J. B., Lopez-Bazzocchi, I. und Towers, G. H., Antiviral
activities of hypericin. Antiviral Res. 15: 101, 1991.
- Lavie, G., Valentine, F., Levin, B., Mazur, Y., Gallo, G., Lavie,
D., Weiner, D. und Meruelo D., Studies of the mechanisms of action
of the antiretroviral agents hypericin and pseudohypericin. Proc.
Nat. Acad. Sci. (USA) 86: 5963, 1989.
- Lavie, G., Mazur, Y., Lavie, D., und Meruelo, D., The chemical
and biological properties of hypericin – A compound with a broad spectrum
of biological activities. Medicinal Res. Rev. 15: 111–119, 1994.
- Lavie, G., Mazur, Y., Lavie, D., Prince A. M., Pascual, D.,
Liebes, L., Levin, B. und Meruelo D., Hypericin as an inactivator
of infectuos viruses in blood products. Transfusion 35: 392–400, 1995.
- Losiewicz, M. D., Bradley, A. C., Kaur, G., Sauwille, E. A.
und Worland, P. J., Potent inhibition of CDC2 kinase activity by
the flavonoid L86-8275. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 589–595, 1994.
- Meruelo, D., Lavie, G., Lavie, D., Therapeutic agents with dramatic
antiretroviral activity and little toxicity at effective doses:
aromatic polycyclic diones hypericin and pseudohypericin. Proc.
Nat. Acad. Sci. (USA) 85: 5230–5324,
1988.
- Mossman, T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.
J. Immunogen. 21: 235, 1983.
- Takahashi, I., Nakanishi, S. Kobayashi, E., Nakano, H., Suzuki,
K., und Tamaoki, T., Hypericin and pseudohypericin specifically
inhibit protein kinase C: possible relation to their antiretroviral
activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1207, 1989.
- Tang, J., Colacino, J. M., Larsen, S. H. und Spitzer, W., Virucidal
activity of hypericin against enveloped and non-enveloped DNA and
RNA viruses. Antiviral Res. 13: 313–326, 1990.