DE60125048T2

DE60125048T2 - Polycyclische dianthrachinone als antikrebsmittel und antiangiogenesemittel

Info

Publication number: DE60125048T2
Application number: DE60125048T
Authority: DE
Inventors: Yehuda Mazur; Gad Lavie
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; New York University NYU
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; New York University NYU
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2021-02-01
Also published as: IL150457A0; US20030105357A1; ES2275647T3; CA2396704A1; US20050038115A1; DE60125048D1; WO2001056558A1; ATE347355T1; EP1313459B1; EP1313459A1; AU3047001A; US6867235B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte therapeutische Anwendungen von Helianthronverbindungen.
Die Entdeckung der Signaltransduktionswege, die die Zellproliferation als Reaktion auf Wechselwirkungen zwischen Wachstumsfaktoren und entsprechenden Zellrezeptoren aktiviert, löste eine extensive Suche nach Inhibitoren aus, die diese Kaskade zur Malignität, wobei maligne Zellen sich einer unkontrollierten Proliferation unterziehen, stören können. Die chemischen Signale in dieser Kaskade sind als Phosphorylierung von Proteinen identifiziert worden, entweder an Tyrosinresten, welche durch eine Gruppe von Enzymen katalysiert werden, die insgesamt als Proteintyrosinkinasen (PTK) bezeichnet werden, oder an Serin-/Threoninresten durch die Proteinkinasen A, B und C. Die Proteinkinase C (PKC) ist auch ein wichtiger Zellsignaltransducer, der eine katalytische Domäne, die Substrate phosphoryliert, und eine regulatorische Domäne, welche ihre Aktivität steuert, enthält. Polyhydroxylierte Flavone wie Genistein und Quercetin wurden als Inhibitoren der Phosphorylierungskinasen identifiziert (Losiewicz et al., 1994).
Perylenchinone sind eine einzigartige Gruppe von Kinaseinhibitoren (Diwu et al., 1994). Die erste dieser Verbindungen, die sorgfältig bewertet wurde, war Hypericin, ein potentes photodynamisches Mittel, von dem die gegenwärtigen Erfinder zunächst entdeckten, dass es für Retroviren virizid ist (Lavie et al., 1989; Meruelo et al., 1988), und anschließend, dass es für alle lipidummantelten Viren virizid ist (Tang et al., 1990). Weitere Studien identifizierten Hypericin als potenten und irreversiblen, licht-abhängigen Inhibitor der Proteinkinase C (PKC), insbesondere wenn PKC nach der Zellaktivierung an die Zellmembran transloziert ist, wobei diese PKC-Hemmwirkung von Hypericin möglicherweise mit seiner antiretroviralen Wirksamkeit in Zusammenhang steht (Takahashi et al., 1989).
Hypericin ist imstande, innerhalb biologischer Systeme in Dunkelheit zu wirken, möglicherweise aufgrund eines geringen Redoxpotentials, und dies scheint das Abfangen von Elektronen aus physiologischen Transferreaktionen zu ermöglichen (Lavie et al., 1994). Die einzigartige Kombination von Eigenschaften des Hypericins veranlasste seine derzeitige klinische Bewertung in klinischen Phase-II-Versuchen als Antitumormittel bei der Behandlung des malignen Glioms (Couldwell et al., 1994). Diese Neoplasie ist zur Zellproliferation auf PKC-Signale angewiesen. Hypericin ist auch ein potenter Photosensibilisator, der fähig ist, Singulett-Sauerstoff und freie Radikale zu erzeugen (Hadjur et al., 1994). Diese Eigenschaften machen es auch nützlich in der photodynamischen Therapie (PDT) von oberflächlichen Tumoren, die für Lichtbestrahlung erreichbar sind.
Unglücklicherweise ist Hypericin nur in der Hälfte der Fälle wirksam und kann zudem schwere Nebenwirkungen verursachen wie eine anhaltende Sensibilität gegenüber Licht nach der Behandlung, ein Zustand, der medizinisch als Hypericismus bekannt ist. Es wäre wünschenswert, weitere photosensibilisierende Mittel und Zellproliferations-Signaltransduktions-Inhibitoren bereitzustellen, welche ihre zytotoxische Wirkung verglichen mit den bestehenden Mitteln mit größerer Wirksamkeit und möglicherweise mit geringeren oder weniger schweren Nebenwirkungen entfalten können.
Die gegenwärtigen Erfinder haben zuvor offenbart, dass gewisse Helianthronderivate in der photodynamischen Therapie (PDT) von Tumoren nützlich sein können, um die Zerstörung von Tumoren in Verbindung mit Lichtbestrahlung herbeizuführen (PCT-Veröffentlichung WO 99/06347).
Während photodynamische Eigenschaften mit dem Mechanismus der biologischen Aktivitäten von Hypericin in Zusammenhang gebracht worden sind, vollziehen sich viele dieser Aktivitäten auch im Dunkeln. Wirkungen wie die Wachstumshemmung von malignen Gliomzellen sind vom Licht unabhängig (Couldwell et al., 1994), obwohl sie durch Licht stark verstärkt wird, ist die virizide Wirksamkeit von Hypericin gegen das murine Zytomegalie-Virus auch im Dunkeln dokumentiert worden (Hudson et al., 1991).
Nirgendwo wird im Stand der Technik gelehrt oder nahe gelegt, dass perihydroxylierte polycyclische Dianthrachinone zur Hemmung von Tumormetastasen und zur Vorbeugung von Angiogenese nützlich sind. Es besteht ein breit anerkannter, nicht befriedigter Bedarf an Angiogenese-Inhibitoren, welche die Proliferation von Gefäßstrukturen spezifisch blockieren, im Wesentlichen ohne andere physiologische Prozesse zu beeinträchtigen, einschließlich der Hemmung von Angiogenese, die mit Tumorwachstum oder -progression, Restenose und ophthalmologischen Störungen in Zusammenhang steht.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Feststellung, dass einige Helianthronderivate fähig sind, in mikromolaren Konzentrationen die Transduktion von Signalen für die Zellproliferation und Zellprogression durch den Zellreplikationszyklus hindurch zu hemmen, was darauf hinweist, dass sie als antineoplastische Mittel zur Behandlung von Krebs in Abwesenheit von Lichtbestrahlung verwendet werden können.
Sie basiert ferner auf der überraschenden Feststellung, dass Helianthrone den Angiogeneseprozess (Bildung neuer Blutgefäße) sowohl im Auge als auch bei der Bildung von primären Tumoren und insbesondere von Metastasen stören, was darauf hinweist, dass sie für die Behandlung von opthalmologischen Störungen, welche mit Angiogenese im Zusammenhang stehen, und zur Behandlung von primären Tumoren in Abwesenheit von Lichtbestrahlung verwendet werden können.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Arzneimittel bereitzustellen, die Helianthronderivate umfassen, welche als Angiogenese-Inhibitoren wirksam sind und zur Behandlung von mit Angiogenese assoziierten ophthalmologischen Störungen und zur Hemmung von Restenose geeignet sind. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, derartige Arzneimittel bereitzustellen, welche derartige Helianthronderivate umfassen, die als Antikrebsmittel in Abwesenheit von Lichtbestrahlung wirksam sind.
Es ist wird offenbart, dass Zusammensetzungen, die die Helianthronderivate umfassen, die zuvor in WO 99/06347 als Antikrebsmittel, welche in Verbindung mit Licht in der photodynamischen Therapie wirken beschrieben wurden, unerwarteterweise in Abwesenheit von Lichtbestrahlung auch wirksam sind. Es wird nun offenbart, dass die Zusammensetzungen eine bisher unbekannte anti-angiogenetische Wirksamkeit aufweisen.
Es wird nun offenbart, dass Helianthron und Derivate davon den Prozess der Tumorangiogenese stören. Diese Entdeckung macht diese Verbindungen als Behandlungs-Heilmittel für Krebspatienten, welche sich einer chirurgischen Entfernung von primären Tumoren unterzogen haben, nützlich, um dem Wachstum von unheilbaren Metastasen vorzubeugen. Es wurde festgestellt, dass ein chirurgischer Eingriff das Wachstum von Mikrometastasen stimuliert, die durch Wachstumsfaktor-Inhibitoren, welche vom primären Tumor sezerniert werden, ruhend gehalten wurden. Diese Verbindungen können dem Metastasenwachstum vorbeugen, indem sie die Produktion oder Aktivität des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) oder anderer angiogenetischer Faktoren stören. Es ist bekannt, dass VEGF, ein potenter Enhancer der Gefäßpermeabilität, in vivo eine Schlüsselrolle bei der pathologischer Gefäßneubildung ausübt, die mit vielen Erkrankungen einschließlich Tumor-Gefäßneubildung, rheumatoider Arthritis und diabetischer Retinopathie in Zusammenhang steht.
Die vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform die Verwendung einer Helianthronverbindung oder eines Derivats davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit Angiogenese assoziierten ophthalmologischen Störungen und zur Vorbeugung oder Hemmung von Restenose bereit, wobei die Verbindung von der allgemeinen Formel (I) ist:
wobei R aus Hydroxy, C₁-C₁₀-Alkoxy, NH-C₁-C₁₀-Alkyl und NH-Hydroxy(C₁-C₁₀)-alkyl ausgewählt ist; R' aus Hydroxy und C₁-C₁₀-Alkoxy ausgewählt ist; und R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Hydroxy, Chlor, Brom, C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀-Alkoxy und C₁-C₁₀-Alkoxycarbonyl ausgewählt sind.
In einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Helianthronverbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Proliferation von Endothel- oder vaskulären glatten Muskelzellen, die mit Restenose assoziiert ist.
In einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Helianthronverbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren in Abwesenheit von Lichtbestrahlung.
Beispiele für derartige Verbindungen als die am meisten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron und 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron der Formeln A und B wie folgt:
In einer Ausführungsform sind die mit Angiogenese assoziierten ophthalmologischen Störungen Retinopathien, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, diabetische Retinopathie, Makuladegeneration und Augeninfektionen, insbesondere bakterielle Augeninfektionen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorbeugung von Restenose insbesondere eine nach perkutaner transluminaler Koronarangioplastie.
1 zeigt die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxy-helianthron (Dimethyl-TMH) und Hypericin auf die Lebensfähigkeit humaner U251 Glioblastomzellen in vollständiger Dunkelheit.
2 zeigt die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Dimethyl-TMH auf die Lebensfähigkeit von LAN5 Neuroblastomzellen in vollständiger Dunkelheit.
3 zeigt die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Dimethyl-TMH und Hypericin auf die Lebensfähigkeit von U87MG Glioblastomzellen in vollständiger Dunkelheit.
4 zeigt die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von Dimethyl-TMH und TMH auf die Lebensfähigkeit von U87MG Glioblastomzellen in vollständiger Dunkelheit für 48 Stunden.
5 zeigt die lichtabhängigen photodynamischen Wirkungen von Dimethyl-TMH auf die Lebensfähigkeit primärer postmitotischer humaner Peripherblut-Lymphozyten (PBL) in der Dunkelheit und in Verbindung mit Licht.
6A–D zeigen die Wirkungen von 10 μM Dimethyl-TMH auf humane U251 Glioblastomzellen in Kultur ohne (12A) und nach Behandlung für 24 Stunden (12B), 48 Stunden (12C) und 72 Stunden (12D).
7A–C zeigen die dosisabhängigen Reaktionswirkungen von 10 μM (13B) und 20 μM (13C) Dimethyl-TMH auf humane U251 Glioblastomzellen in Kultur. Kontrolle (unbehandelt, 13A).
8 zeigt das prozentuale Überleben von BALB/c-Mäusen, die mit Plattenepithelkarzinomzellen inokuliert wurden, nach der Behandlung mit Dimethyl-TMH.
9A–C zeigen das prozentuale Überleben von BALB/c-Mäusen, die mit DA-3^HI-induzierten Brust-Adenokarzinomzellen inokuliert wurden, nach der Behandlung mit Hypericin an den Tagen 89 (9A) und 100 (9B) nach dem chirurgischen Eingriff.
10A–B sind Photographien der Augen von Ratten nach Heparanase-induzierter Angiogenese ohne Behandlung (10A, Kontrolle) und nach der Behandlung mit Hypericin (10B).
Diese bisher unbekannten Eigenschaften der Helianthronverbindungen wurden während des Studiums der Wirkungen von Hypericin und Helianthronderivaten auf Brust-Adenokarzinomtumore, die in Mäusen mit der DA-3^HI-Zelllinie induziert wurden, und auf murine anaplastische Plattenepithelkarzinomtumore, die mit der SQ-2-Zelllinie induziert wurden, entdeckt. Beides sind hoch metastatische Tumore und wenn sie chirurgisch reseziert werden, nachdem sie einen Durchmesser von größer als 5 mm erreicht haben, werden die Mäuse Metastasen in Lungen und Leber entwickeln. Die Metastasen verursachen den Tod der Tiere innerhalb von etwa zwei Monaten nach dem chirurgischen Eingriff. Obwohl die Verwendung von Hypericin nicht erfindungsgemäß ist, wird sie im Folgenden als Vergleich diskutiert werden.
Obwohl diese zwei Tumortypen durch Hypericin nicht gehemmt werden, wurde unerwarteterweise entdeckt, dass, wenn die Tumore chirurgisch entfernt werden, wenn sie einen Durchmesser von 8–10 mm erreicht haben, 2–4 Injektionen von Hypericin in das Peritoneum die Mäuse vor dem Tod infolge von Metastasen schützen. Hypericin beugt demnach der Entwicklung von Metastasen vor.
Darüber hinaus wurde bei dem Versuch zu verstehen, warum primäre Tumore weniger durch Hypericin beeinträchtigt werden, wohingegen Metastasen stark gehemmt werden, unerwarteterweise entdeckt, dass Hypericin und auch 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron und sein Derivat 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-Tetramethoxyhelianthron die Gefäßneubildung (der Fähigkeit des Tumors, die Bildung neuer Blutgefäße zu induzieren, um die Blut- und Nährstoffversorgung für die wachsenden Tumore bereitzustellen) verhinderten. Indem die Entwicklung neuer Blutgefäße, um eine wachsende Metastase zu versorgen, verhindert wird, werden dem schnell wachsenden Metastasenherd Nährstoffe und Sauerstoff für seine sich schnell vervielfachenden Zellen entzogen und die Läsion degeneriert.
Der Mechanismus, durch welchen Krebszellen die Bildung neuer Blutgefäße induzieren und sie zum Tumor leiten, ist extensiv untersucht worden, und es ist bekannt, dass komplexe Mechanismen daran beteiligt sind. Die Krebszellen sezernieren den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), der das Wachstum neu gebildeter Blutgefäße in die Richtung des VEGF-Konzentrationsgradienten zur höheren VEGF-Konzentration lenkt, damit sie schließlich den Tumor erreichen (Folkman, J. 1985; Folkman J. et al.; 1989).
In den Verbindungen der Formel (I), die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist R aus Hydroxy, C₁-C₁₀-Alkoxy, NH-C₁-C₁₀-Alkyl und NH-Hydroxy(C₁-C₁₀)-alkyl ausgewählt; R' ist aus Hydroxy und C₁-C₁₀-Alkoxy ausgewählt; und R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ sind unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Hydroxy, Chlor, Brom, C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀-Alkoxy und C₁-C₁₀-Alkoxycarbonyl ausgewählt.
Wie hierin verwendet bezeichnet "C₁-C₁₀-Alkyl", "C₁-C₁₀-Alkoxy" und "C₁-C₁₀-Alkoxycarbonyl" geradkettige oder verzweigte Reste mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Beispiele für derartige Alkylreste sind, ohne auf diese beschränkt zu sein, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Hexyl und Octyl. Beispiele für derartige Alkoxyreste sind, ohne auf diese beschränkt zu sein, Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, Isopropyloxy, Butoxy, Hexyloxy und Octyloxy. Beispiele für derartige Alkoxycarbonylreste sind, ohne auf diese beschränkt zu sein, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl und Propyloxycarbonyl. In einer bevorzugten Ausführungsform sind R, R', und R₁ bis R₆ Methyl, jedoch können längere aliphatische Ketten, die in diesen Positionen anstelle der Methylgruppe vorstellbar sind, Vorteile wie die Verlängerung der biologischen Wirksamkeit aufgrund der besseren Retention durch die Zellen aufweisen, was einer weniger häufigen Verabreichung bedarf.
Die in der Erfindung bevorzugt verwendeten Verbindungen sind Helianthron und Derivate davon der Formel (I), wobei die zwei R₅ an den Positionen 1 und 6 Hydroxy, Methoxy, Butylamino oder Hydroxyethylamino sind, die zwei R₅ an den Positionen 3 und 4 Hydroxy oder Methoxycarbonyl sind, R₂ und R₅ an den Positionen 14 und 9 Wasserstoff sind und R₃ und R₆ an den Positionen 2 und 5 Wasserstoff oder Brom sind. Beispiele für derartige bevorzugte Verbindungen sind 1,3,4,6-Tetrahydroxyhelianthron, 1,3,4,6-Tetramethoxyhelianthron, 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron, 10,13-Di(methoxycarbonyl)-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron, 1,6-Di-N-Butylamino-3,4-dimethoxyhelianthron, 1,6-Di-N-Butylamino-3,4-dimethoxy-10,13-dimethylhelianthron, 1,6-Di-(N-hydroxyethylamino)-3,4-dimethoxy-helianthron, 2,5-Dibrom-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron, 2,5-Dibrom-10,13-dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron und am meisten bevorzugt 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I), in denen R₂ und R₄ jeweils Niederalkyl sind, können durch das in US-Patent 5,120,412 beschriebene Verfahren unter Verwendung eines 1,3-Dihydroxy-6-(niederalkyl)-anthrachinons der Formel (II):
in der R' Niederalkyl ist, als ein Ausgangsmaterial hergestellt werden. Die Verbindung II wird zu dem entsprechenden Anthron der Formel (III) reduziert,
in der R' die vorstehende Bedeutung aufweist, und die Verbindung III wird kondensiert, um die gewünschten Verbindungen der Formel (I) zu erhalten, in denen R Niederalkyl ist.
Andere Verbindungen der Formel (I) können auf analoge Weise unter Verwendung von entsprechend substituierten 1,3-Dihydroxy-anthrachinonen hergestellt werden.
Die Verbindungen der Formel (I), in denen R₂ und R₄ jeweils Niederalkoxycarbonyle sind, können aus den Diacetylderivaten der Verbindung der Formel (II) vorstehend, in der R' Methyl ist, durch Oxidation mit CrO₃ hergestellt werden, um die Verbindung der Formel (IV) zu bilden:
die dann durch das Verfahren von Spitzner (Angew. Chem. Int. Ed. 16, 46 (1977)) dimerisiert wird, um eine Verbindung der Formel (I) zu bilden, in der R Carboxy ist, welche dann mit einem Niederalkanol verestert wird, um das gewünschte Produkt der Formel (I) zu erhalten, in dem R₂ und R₄ Niederalkoxycarbonyl sind.
Die Verbindungen der Formel (I), in der jedes R an den Positionen 1 und 6 Alkylamino oder Hydroxy-alkylamino ist, können durch Aminierung der entsprechenden Verbindung der Formel I, in der R Alkoxy ist, mit einem Alkylamin wie Butylamin oder einem Hydroxyalkylamin wie Ethanolamin erhalten werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen bereitgestellt, welche die Zellproliferation durch den mitotischen Zyklus hindurch hemmen. Es war überraschend zu entdecken, dass diese Verbindungen und insbesondere 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron (hierin als "Dimethyl-TMH" bezeichnet) hoch potent in der Deregulation verschiedener, mit dem Zellzyklus in Zusammenhang stehender Kontrollpunkte sind, welche den geordneten Durchgang der Zellen durch die unterschiedlichen Phasen des mitotischen Zyklus koordinieren. In diesem Zyklus gehen Zellen in der GO-Ruhephase in die G1-Protein- und RNA-Akkumulationsphase über. Die Zellen treten dann in die S-Phase ein, in der die genomische DNA dupliziert wird. Wenn die DNA-Duplikation vollständig ist, sind die Zellen in der G2-Phase mit der doppelten Menge DNA bereit zur Zellteilung und Schreiten zur Zellteilungsphase M-Phase (Mitose), in der sich die Zelle in zwei Tochterzellen teilt. So wurde gefunden, dass Dimethyl-TMH eine grundlegende Hemmwirksamkeit bei der Transduktion von Zellproliferationssignalen besitzt und dass es maligne Zellen, einschließlich Glioblastom- und Neuroblastomzellen in der Mitte der S- und G2-Phasen des Zellreplikationszyklus anhält. In Plattenepithelzellkarzinomtumore tragenden Mäusen hemmte Dimethyl-TMH das Streuen des Tumors in multiple Herde und die Tumore verhärteten, wurden nekrotisch und fielen nach längerer Behandlung ab.
In humanen malignen Glioblastomzelllinien kulminiert die Blockade des geordneten Fortschreitens der Zellen durch die unterschiedlichen Zyklusphasen im Zelltod (1), wobei Dimethyl-TMH beim Töten der Tumorzellen in Kultur unter vollständiger Dunkelheit als stärker potent im Vergleich zu Hypericin identifiziert wurde. Das Töten der Zellen durch Dimethyl-TMH geschah bei Dosen, in denen Hypericin keine Wirkung auf die Kulturen aufwies. Überraschenderweise war Dimethyl-TMH gleichermaßen in der photodynamischen Induktion des Zelltods stärker potent als Hypericin, wenn die Behandlungen in Verbindung mit Licht durchgeführt wurden. Die Mechanismen, die in Dunkelheit agieren, unterscheiden sich sehr von denen, die lichtinduzierte Photosensibilisierung vermitteln. In der Dunkelheit vollzieht sich der Zelltod etwa vier Tage nachdem die Verbindung verabreicht wurde, wohingegen die Zellen mit Licht innerhalb von 2–3 Stunden starben.
An normalen humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes hatte Dimethyl-TMH keine Wirkung auf die Zelllebensfähigkeit. Darüber hinaus hatte die intraperitoneale Verabreichung der Verbindung an BALB/c-Mäuse auf täglicher Basis für eine Woche keine nachteilige Wirkung auf die Tiere. In BALB/c-Mäusen, welche anaplastische Plattenepithelzellkarzinomtumore trugen, führten Behandlungen mit 200 μg/Maus jeden zweiten Tag zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums, verglichen mit tumortragenden unbehandelten Kontrollmäusen.
Die gemäß der Erfindung hergestellten Arzneimittel werden an den Patienten durch Standardverfahren verabreicht werden. Die Menge der zu verabreichenden Verbindung und der Verabreichungsweg werden gemäß der Art des Tumors, dem Stadium der Erkrankung, dem Alter und den Gesundheitsbedingungen des Patienten bestimmt werden. Die bevorzugten Verabreichungswege sind intravenös oder direkte Injektion der wässrigen Lösung des Wirkstoffs, welche übliche pharmazeutisch verträgliche Träger und Zusatzstoffe umfasst, in den festen Tumor und topische Behandlung der Hauttumore mit geeigneten topischen Zusammensetzungen. In disseminierten Tumoren mit Metastasen oder systemischen Krebsen wie Leukämien und Lymphomen sind die bevorzugten Wege systemische Wege, wobei der intravenöse oder der orale Weg bevorzugt sind.
Die in der vorliegenden Erfindung nützlichen Helianthronverbindungen können verwendet werden, um verschiedene Typen von Krebsen und ihre Metastasen zu behandeln, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Plattenepithelzellkarzinom, Basalzellkarzinom, Melanom, Kaposi-Sarkom, Brustkarzinom, Prostatakarzinom, Hämangiom, Meningiom, Astrozytom, Neuroblastom, Karzinom des Pankreas, Magenkarzinom, kolorektales Karzinom, Kolonkarzinom, Übergangsepithelkarzinom der Blase und Karzinom des Larynx, chronische myeloische Leukämie, akute lymphozytäre Leukämie, akute Promyelozytenleukämie, multiples Myelom, T-Zell-Lymphom und B-Zell-Lymphome.
Die in der Erfindung nützlichen Helianthronverbindung kann durch jedes erforderliche Verfahren formuliert werden, um die für die Verabreichung an einen Patienten geeigneten Arzneimittel bereitzustellen.
Die Arzneimittel enthalten zusätzlich zum Wirkstoff übliche pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel und dergleichen. Feste Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung wie Tabletten, Pillen, Kapseln oder dergleichen können durch Mischen des Wirkstoffs mit üblichen, pharmazeutisch verträglichen Bestandteilen wie Maisstärke, Lactose, Saccharose, Sorbit, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat und Gummis und mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln hergestellt werden. Die Tabletten oder Pillen können überzogen oder auf andere Weise mit pharmazeutisch verträglichen, auf dem Fachgebiet bekannten Materialien gemischt werden, um eine Dosierungsform bereitzustellen, welche eine anhaltende Wirkung oder verlängerte Freisetzung bietet. Andere feste Zusammensetzungen können als Mikrokapseln zur parenteralen Verabreichung hergestellt werden. Flüssige Formen können zur oralen Verabreichung oder zur Injektion hergestellt werden, wobei der Begriff die subkutane, intramuskuläre, intravenöse und andere parenterale Verabreichungswege einschließt. Die flüssigen Zusammensetzungen schließen wässrige Lösungen mit oder ohne organische Hilfslösungsmittel, wässrige oder ölige Suspensionen, Emulsionen mit Speiseölen ebenso wie mit ähnlichen pharmazeutischen Vehikeln ein. Zudem können die Arzneimittel als eingekapselte Pellets oder andere Depots zur verlängerten Freisetzung gebildet werden.
Die wirksame Dosis für Menschen liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,1 Mikrogramm bis etwa 1 mg pro kg Körpergewicht bei einem Regime von einmal oder mehrmals am Tag. Jedoch kann die Verabreichung in längeren Intervallen auch möglich sein, für Verbindungen oder Formulierungen mit verlängerter Wirkung.
Im Allgemeinen beträgt der bevorzugte Dosierungsbereich 1 bis 200 Mikrogramm pro kg Körpergewicht. Es ist dem Fachmann offensichtlich, dass Dosierungsform und -regime von dem behandelten Arzt gemäß der zu behandelnden Erkrankung, dem Verabreichungsverfahren und dem allgemeinen Zustand des Patienten bestimmt werden. Es wird selbstverständlich sein, dass die am meisten geeignete Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel zuallererst von der behandelnden klinischen Indikation abhängen wird. Die prophylaktische Behandlung eines gesunden Individuums mit hohem Risiko für pathologische Angiogenese wird ein verlängertes Dosierungsregime mit langer Aufrechterhaltung, das ausreichend ist, um Angiogenese zu hemmen, erfordern. Dieser Typ der Behandlung kann an Individuen mit einem Risiko für diabetische Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie, Makuladegeneration und andere Zustände, die bekannt dafür sind, bestimmte Patientengruppen zu belasten, angewendet werden. Im Gegensatz dazu könnte die Behandlung einer bestehenden Erkrankung höhere Dosen in häufigeren Intervallen erfordern. Es wird ferner erwartet, dass die Behandlung von bestimmten Zuständen, die dafür bekannt sind, dass sie eine anomale Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen, einschließlich Restenose umfassen, mit Arzneimitteln in einer Menge, die ausreichend ist, um die Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen zu hemmen, vorteilhaft durchgeführt werden wird.
Es wird dem Fachmann selbstverständlich sein, dass die Behandlungen in einigen Fällen vorteilhafterweise die Verabreichung der Zusammensetzungen in Verbindung mit einer Depot- oder medizinischen Vorrichtung einschließen kann. So kann beispielsweise die Behandlung von Angiogenese im Auge ein intraokulares Implantat erfordern. Ähnlich kann die Behandlung von Restenose, die mit Endothelzellproliferation assoziiert ist, die Anwendung einer Zusammensetzung in Verbindung mit einer Angioplastie, z. B. einem Überzug auf einem Stent oder einer ähnlichen Vorrichtung, erfordern.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIELE
Alle in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen sind bekannte Verbindungen und die Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der Literatur und im Detail in der PCT-Veröffentlichung 99/06347 der gegenwärtigen Anmelder offenbart.
Experimentelle Verfahren
A. Zelllinien:
Man ließ humane HL-60-Leukämiezellen in RPMI-1640, supplementiert mit 15% fötalem Kälberserum, 100 mM Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin wachsen. Man ließ humane Erythroleukämie K-562-Zellen (von einem Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie abgeleitet) in dem gleichen Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, wachsen. Diese Zellen und die humanen U251 Glioblastom-, U87MG Glioblastom- und LAN5 Neuroblastomzellen, die in den Experimenten verwendet wurden, sind von ATCC erhältlich. Alle Zelllinien wurden in einer befeuchteten 5% CO₂/95% Luft-Atmosphäre bei 37°C kultiviert.
B. Zell-Lebensfähigkeit:
Die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch den MTT-Test überwacht, der die Reduktion von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromid zu Formasan durch die Mitochondrien von lebensfähigen Zellen wie in Mossman, T., J. Immunogen., 21, 235–248 (1983), beschrieben, misst. Die Zellen werden mit MTT für vier Stunden bei 37°C inkubiert und in einem ELISA-Lesegerät bei 560 nm analysiert. Die optische Dichte des von den unbehandelten Zellkulturen erzeugten Formasans (O. D. Kontrolle) wird als eine MTT-Einheit definiert. Die Anzahl der MTT-Einheiten in Kulturproben, welche Behandlungen durchlaufen, wird als das Verhältnis (O. D._Probe – O. D._Blind)/O. D._Kontrolle) berechnet.
C. Photodynamischer Stress:
Photodynamischer (PD) Stress ist der Grad der Phototoxizität, der auf Zielzellen durch photodynamische Verbindungen und das Aussetzen zu Licht ausgeübt wird. Die Lichtbestrahlung wurde durch eine fluoreszierenden Quelle von zwei parallelen 40-Watt-Röhren durchgeführt, die in einem festen Abstand von 16 cm platziert waren. Es wurde gemessen, dass sie einen Lichteinfall von 4 mWatt/cm² emittieren. Die Lichtintensitäten wurden quantifiziert unter Verwendung eines IL 1350 Radiometers/Photometers von International Light Inc., USA.
D. Bestimmung des prozentualen Anteils apoptotischer Zellen:
Der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen wurde durch Lichtmikroskopie an Cytospin-Präparaten, die mit May-Grunwald-Giemsa angefärbt worden waren, bestimmt. Insgesamt wurden 400 Zellen von zwei Individuen unabhängig voneinander gezählt und die Daten werden als Mittel der Zählungen angegeben. Apoptotische Zellen wurden aufgrund ihrer geringeren Größe und ihrer Kerne, die in kondensierte Chromatinkörper fragmentiert waren, erkannt.
E. Durchflusszytometrie-Analyse:
Zellen, die 5 Stunden nach dem Anlegen von photodynamischem Stress geerntet worden waren, wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült und mit 70% wässrigem Ethanol fixiert. Die Zellen wurden dann in Phosphat-Citrat-Puffer (PC-Puffer) mit einem pH-Wert von 7,8 (192 Teile 0,2 M Na₂PHO₄) und 8 Teile 0,1 M Citronensäure) bei Raumtemperatur für 30 Minuten resuspendiert und mit Propidiumiodid in PC-Puffer, der 10 μg/ml RNAse A enthielt, angefärbt. Die Zellen wurden dann in einem Coulter EPICS XL-MCL Durchflusszytometer analysiert, wobei das gesamte Feld gegated wurde, um die verschiedenen Veränderungen, welche die Zellen beeinträchtigten, einzuschließen.
F. DNA-Fragmentations-Test
Die DNA-Fragmentierung in Zellen, welche die Apoptose unterlaufen, wurde wie früher beschrieben (Lotem, J. und Sachs, J., Cell Growth and Differ., 6, 647–653 (1995) getestet. 2 × 10⁶ Zellen, die in Eppendorfröhrchen pelletiert waren, wurden in 0,5 ml Lysispuffer, der 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,6% SDS, 10 mM EDTA und 15 μg/ml RNA-Gemisch (Ambion Corp., Austin TX) enthielt, lysiert. Nach der Inkubation bei 37°C für 10 Minuten wurde NaCl bis 1 M zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C gehalten. Die Zubereitung wurde bei 14.000 g für 30 Minuten bei 4°C geschleudert, der Überstand wurde gesammelt, das Phenol wurde extrahiert und die DNA wurde über Nacht bei –20°C durch Zugabe von 1 ml Ethanol präzipitiert. Das DNA-Pellet wurde luftgetrocknet, in 20 μl TE-Puffer (10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH-Wert 7,5) bei 4°C für 24 Stunden gelöst, für 4 Stunden der Elektrophorese bei 2 V/cm in 1,5% Agarosegel unterworfen, das 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthielt, und unter UV-Licht photographiert.
Beispiel 1. Töten maligner Tumorzellen in Kultur durch Dimethyl-TMH und TMH in Dunkelheit
Drei humane maligne Zelllinien wurden auf Sensibilität gegenüber Dimethyl-TMH in vitro bewertet. Humane U251-Glioblastom-, U87MG-Glioblastom- und LAN5-Neuroblastomzellen wurden in 96er Flachboden Mikrokulturplatten ausplattiert (2 × 10⁵ pro Vertiefung), mit Dimethyl-TMH (erfindungsgemäß) und Hypericin (nicht erfindungsgemäß) mit Dosen im Bereich von 0 (Kontrolle), 0,1–20 μM in vollständiger Dunkelheit für einen Zeitraum von 72 Stunden behandelt. Das Medium wurde abgesaugt, die anhaftende Monoschicht wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch den MTT-Test überwacht.
Die 1, 2 und 3 zeigen die Ergebnisse für die U251-Glioblastom-, LAN5-Neuroblastom- beziehungsweise U87MG Glioblastomzellen; ein Vergleich der zytotoxischen Wirksamkeit mit Hypericin wird in den 1 und 3 gezeigt. Die Zell-Lebensfähigkeit ging allen dreien nach dem Aussetzen zu Dimethyl-TMH für mindestens 72 Stunden verloren, wie in den MTT-Lebensfähigkeitstests gemessen. Der Verlust der Zell-Lebensfähigkeit nach Behandlung der zwei Glioblastomzellen mit Dimethyl-TMH in Dunkelheit war stärker wirksam als die Behandlung mit Hypericin.
Das Experiment wurde dann mit U251-Glioblastomzellen, die mit Dimethyl-TMH oder Tetramethoxy-helianthron (TMH) in Dosisbereichen von 0,1–12 μM in vollständiger Dunkelheit behandelt worden waren, wiederholt. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch den MTT-Test überwacht. Die Ergebnisse in 4 zeigen, dass sowohl Dimethyl-TMH als auch TMH vergleichbare zytotoxische Wirksamkeit auf U251-Zellen zeigten.
Beispiel 2. Lichtabhängige photodynamische Wirkungen von Dimethyl-TMH an normalen primären humanen Peripherblut-Lymphozyten
Humane Peripherblut-Lymphozyten (PBL) sind in Abwesenheit von mitogenen Stimuli nicht proliferierende Zellen. Die Wirkungen unterschiedlicher Dosen von Dimethyl-TMH auf PBL wurden in Gegenwart (nicht erfindungsgemäß) oder in Abwesenheit (erfindungsgemäß) von Bestrahlung mit polychromatischem weißen Licht untersucht. PBL (postmitotisch) wurden in zwei getrennte Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert (2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) (in dreifacher Ausführung). Dimethyl-TMH wurde zu den Kulturen zugegeben. Eine Platte wurde unter Dunkelheit gehalten, die andere wurde polychromatischem weißen Licht mit einer Flussrate von 8 mW/cm² für 30 min (insgesamt 14,4 J/cm²) ausgesetzt. Beide Platten wurden dann bei 37°C, 5% CO₂ für 72 Stunden kultiviert und die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch den MTT-Test getestet. Die Ergebnisse in 5 zeigen, dass Dimethyl-TMH keine Wirkung auf die PBL-Lebensfähigkeit in Abwesenheit der Lichtbestrahlung aufwies, dass jedoch die Photosensibilisierung mit Licht den Zelltod bei einer LD₅₀ von etwa 0,65 μM Dimethyl-TMH verursachte, was anzeigt, dass Dimethyl-TMH ein potentes photodynamisches Reagens ist, jedoch nicht auf nicht-proliferierende Zellen in Abwesenheit von Lichtbestrahlung wirkt.
Beispiel 3: Bestimmung der Zellzyklusphasen, in denen Dimethyl-TMH Wachstum und Proliferation maligner Tumore in der Dunkelheit anhält
Zellzyklus- und DNA-Gehaltsanalysen wurden in humanen U251-Glioblastomzellen nach Behandlung mit 5 μg/ml (10 μM) Dimethyl-TMH für 24, 48 und 72 Stunden und an LAN5-Neuroblastomzellen nach 48 Stunden durchgeführt. Die Zellen wurden dann mit Propidiumioidid angefärbt, mit PBS gewaschen und in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortiergerät (FACS) analysiert. Ein Computerprogramm ordnete die mit der DNA in Zusammenhang stehende Fluoreszenz wie folgt an: Die minimale Menge an Fluoreszenz wird als ein vollständiger Satz zellulärer DNA angesehen, der mit der G₁-Ruhephase in Zusammenhang steht. Eine doppelte Menge an Fluoreszenz wird als in der G₂-Phase befindlich angesehen, in der das gesamte Genom nach der vollständigen DNA-Synthese verdoppelt wird, und dazwischen liegende Mengen werden als in der S-Phase der DNA-Synthese befindlich angesehen, in der die gesamte DNA-Synthese noch nicht abgeschlossen ist.
Die in den 6–7 gezeigten Ergebnisse geben zu erkennen, dass die Verabreichung von 10 μM Dimethyl-TMH an humane U251-Glioblastomzellen ein Anhalten der Zellproliferation in der mittleren S-Phase (12B) erzeugte. Der Anteil von Zellen, die sich in der S-Phase befinden, erhöhte sich stetig mit der Dauer des Aussetzens zu Dimethyl-TMH (6A, 6B, 6C). Wenn die Dimethyl-TMH-Dosis von 10 μM auf 20 μM erhöht wurde (7B, 7C), trat ein ausschließliches Anhalten in der S-Phase auf. Studien mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) bestätigten dieses Ungleichgewicht in der DNA-Replikation am Gen-Spiegel. Dieses Anhalten des Zellzyklus verursachte toxische Wirkungen, welche den Zelltod bewirken.
Beispiel 4: Vorbeugung der Bildung von Metastasen in BALB/c-Mäusen, die ein hoch invasives Plattenepithelzellkarzinom tragen, mit Dimethyl-tetramethoxyhelianthron
Die effektive zytozide Wirksamkeit von Dimethyl-TMH in vitro regte zu der Bewertung seines Sicherheits- und antitumoralen Wirksamkeitsprofils in tumortragenden Mäusen an. Die Experimente wurden an Mäusen durchgeführt, welche Tumore trugen, die von der hoch metastatischen, anaplastischen Plattenepithelzellkarzinom-(SCC)Linie abgeleitet worden waren. Dieser Tumor entwickelt sich in multifokalen Zentren, welche sich in der Nähe des primären Tumors streuen, und Metastasen entwickeln sich etwa zwei Monate nach der Zellinokulation. Es wurden Behandlungen mit 300–600 μM Dimethyl-TMH/Maus begonnen, verabreicht zweimal oder dreimal pro Woche, sobald der Tumor 5 bis 7 mm im Durchmesser erreichte.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von einem der Experimente, in dem BALB/c-Mäuse mit 5 × 10⁵ Zellen der anaplastischen SQ2 Plattenepithelzellenkarzinomlinie intradermal in die rasierten Rücken inokuliert wurden, 8 Mäuse pro Gruppe. Sobald die primären Tumore einen Durchmesser von 5 mm erreichten, wurde die Therapie mit 300 μM Dimethyl-TMH/Maus, verabreicht intraperitoneal zweimal pro Woche, begonnen. Drei Wochen nach Beginn der Therapie wurde die Anzahl der Tumorherde, die sich am Ort des primären Tumors entwickelt hatten, aufgezeichnet. Die Anzahl der Herde, die sich 21 Tage nach dem Start der Therapie entwickelt hatten, wurde durch Dimethyl-TMH, das in therapeutischen, für die Tiere nicht toxischen Dosen verabreicht wurde, beträchtlich verringert. Zusätzlich zum Vorbeugen einer multifokalen Streuung dieses Tumors verhärtete sich der primäre Tumor und fiel bei 5 der behandelten Mäuse ab, was anzeigt, dass eine vollständige Heilung dieses Tumors erreicht werden kann, sobald die Behandlungsregime optimiert sind.
Tabelle 1 Die Anzahl der Tumorherde, beobachtet 21 Tage nach dem Start der Therapie mit Dimethyl-TMH
Beispiel 5: Überleben der Plattenepithelzellkarzinom-tragenden Mäuse, die mit Dimethyl-TMH behandelt wurden
In einem anderen Experiment wurden BALB/c-Mäuse mit 5 × 10⁵ Zellen der hoch metastatischen anaplastischen SQ2-Plattenepithelzelllinie intradermal in die rasierten Rücken inokuliert. Sobald die primären Tumore einen Durchmesser von 3 bis 4 mm erreichten, wurde die i.p. Verabreichung von Dimethyl-TMH 200 μg/Maus (400 μM/Maus) am Tag 7 nach der Tumorzellinokulation begonnen und zweimal wöchentlich an die tumortragenden Mäuse für sechs Wochen (insgesamt 12 Dosen) verabreicht. Dann wurde das Überleben der Tiere verfolgt. Die Ergebnisse in 8 zeigen, dass das Überleben der Tiere um etwa 40,3% verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe verlängert wurde. Es ist beachtenswert, dass die primären Tumore während der Behandlung fortführen zu wachsen und das Überleben der Tiere dennoch verlängert wurde. Dies scheint ein Ergebnis des verringerten Metastasenwachstums zu sein, wie aus Tabelle 1 in Beispiel 4 vorstehend ersichtlich.
Beispiel 6: Die Verwendung von Dimethyl-TMH in der antineoplastischen Therapie von malignen Tumoren in Mäusen
Die antineoplastischen Wirkungen von Dimethyl-TMH in vivo können in einer Anzahl von murinen experimentellen Tumoren untersucht werden. Diese schließen das murine Esb-Lymphom, MCA-105-Sarkom und B16-Melanom ein, welche in C57BL/6J-Mäusen bewertet werden. DA3^HI murine Brustkarzinomzellen, eine hoch metastatische Variante von DA3, welche ein metastatisches Brust-Adenokarzinom in BALB/c-Mäusen erzeugt, und A431-Zellen, welche epidermoide Tumore in NIH Swiss-Mäusen erzeugen, werden auf ihre Sensibilität gegenüber der Behandlung mit Dimethyl-TMH oder mit TMH getestet. Die Tumore werden in Mäusen, 8–10 Tiere pro Gruppe, durch intradermale Inokulationen der tumorerzeugenden Zellen gezüchtet. Es werden Dimethyl-TMH-Dosissteigerungen im Bereich zwischen 20–1000 μM (10–500 μg/Maus) untersucht. Die Häufigkeiten der Verabreichungen werden variiert von täglicher Verabreichung, 3 × wöchentlich bis 1 × wöchentlich, verabreicht in Zeiträumen im Bereich von 2–12 Wochen. Die Tiere werden auf Unterschiede in der Größe des primären Tumors verglichen mit den unbehandelten tumortragenden Kontrollmäusen überwacht. Um das Streuen der Metastasen zu analysieren werden alle Mäuse beim Tod der ersten Kontrollgruppen-Maus oder an zur Beendigung des Experiments festgesetzten Zeitpunkten geopfert. Es werden Endpunkte, die in früheren Beispielen verwendet wurden, angewendet. Das Gewicht von Milz, Leber und Lungen sind Parameter, welche wir zur Bestimmung der Metastasenlast verwenden. Die Gesamtzahl metastatischer Herde in jedem dieser Organe ist ein zweiter Parameter, der nach der Fixierung in Bouin-Lösung bestimmt wird. Das Überleben der Tiere ist ein weiterer Endpunkt, der untersucht wird. Die mittlere und mediane Überlebenszeit nach der Tumorzellinokulation wird bestimmt. Die Signifikanz der Verlängerung des Überlebens wird durch den Vergleich mit den Kontrollen der unbehandelten tumortragenden Tieren ohne Lichtexposition (Dunkelheits-Wirkungen der Verbindung) im T-Test für verbundene Stichproben berechnet.
In einem Experiment wird die anti-tumorale Wirksamkeit von Dimethyl-TMH auf humane Tumoren in einem in vivo-Modell am C.B-17 SCID-Maus-Stamm (Fox Chase) bewertet. Humane epidermoide und Glioblastom-Tumore sind in der Haut dieser Mäuse durch Inokulation mit den entsprechenden humanen Zelllinien induziert worden. Die Tiere werden dann verschiedenen Dimethyl-TMH-Behandlungsprotokollen unterworfen, wobei die Verbindung intraperitoneal verabreicht wird. Die Tiere werden auf Tumorgröße und Überleben überwacht.
Beispiel 7: Vorbeugung der Bildung von Metastasen in DA-3^HI induzierten Brust-Adenokarzinomtumoren in BALB/c-Mäusen mit Hypericin (nicht erfindungsgemäß)
Die Größe des primären Tumors, bei der in DA-3^HI-abgeleiteten Brust-Adenokarzinomtumoren Metastasen auftreten, wurde zunächst in BALB/c-Mäusen, die mit 5 × 10⁵ DA-3^HI-Tumorzellen intradermal inokuliert worden waren, kalibriert. Es wurde entdeckt, dass, wenn die chirurgische Entfernung des primären Tumors durchgeführt wurde, wenn der Tumor einen Durchmesser von 5 mm oder weniger erreicht hatte, die Resektion des primären Tumors die Mäuse heilte. Wenn die Resektion an Tumoren mit größeren Durchmessern durchgeführt wurde, starben die Mäuse an den Metastasen. Ein Durchmesser von etwa 5 mm scheint der Grenzwert zu sein, bei dem die Metastasen beginnen zu streuen.
DA-3^HI-Tumore wurden in 12 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen wie vorstehend beschrieben induziert. Sobald die Tumore Durchmesser von 8–10 mm erreichten, wurden die Mäuse in vier Gruppen geteilt. Eine Gruppe von 19 Mäusen blieb unbehandelt und in den drei anderen Gruppen wurden die Tumore chirurgisch entfernt. Eine dieser resezierten Gruppen erhielt zwei intraperitoneale (i.p.) Injektionen mit 200 μg Hypericin (HY) im Abstand von 5 Tagen, wobei zwei Tage vor dem chirurgischen Eingriff begonnen wurde (16 Mäuse). Eine andere resezierte Gruppe erhielt fünf i.p. Injektionen mit jeweils 200 μg Hypericin im Abstand von 5 Tagen, wobei zwei Tage vor dem chirurgischen Eingriff (17 Mäuse) begonnen wurde. Eine resezierte Gruppe wurde nicht mit Hypericin behandelt (16 Mäuse). Die Mäuse wurden dann auf Überleben beobachtet. 9A zeigt, dass keine der tumortragenden unbehandelten Mäuse überlebte und 20% der Mäuse, die einem chirurgischen Eingriff unterzogen worden waren, überlebten auch am Tag 89. Jedoch erhöhte die Verabreichung von 2 i.p. Injektionen Hypericin die Überlebensrate auf 35% und die Verabreichung von 5 Hypericindosen erhöhte die Überlebensrate auf 60%.
9B zeigt das kumulative Überleben der Mäuse, die 2 und 5 Dosen Hypericin (jeweils 200 μg/Maus) für 100 Tage nach dem chirurgischen Eingriff erhielten (diese Werte bestanden für 164 Tage nach der Tumorinokulation). Sie legen die vollständige Vermeidung von Metastasen in der überlebenden Gruppe von Mäusen nahe, insbesondere in der Gruppe, die fünf Dosen Hypericin erhielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hypericin die Mäuse davor schützt, Metastasen zu entwickeln, und dass es so dem Tod der Tiere durch die Auswirkungen der systemischen Dissemination von Zellen aus dem primären Tumor vorbeugt.
BEISPIEL 8. Vorbeugung der Bildung von Metastasen in BALB/c Mäusen, welche hoch invasives Plattenenithelzellkarzinom tragen, mit Hypericin (nicht erfindungsgemäß)
In einer anderen Versuchsreihe wurden die Plattenepithelzellkarzinomtumore in BALB/c-Mäusen durch Inokulieren von 5 × 10⁵ SQ2-Zellen pro Maus erzeugt. Sobald die Tumore einen Durchmesser von 1,0–1,2 cm im Durchmesser erreicht hatten, wurden sie durch einen chirurgischen Eingriff entfernt (reseziert). Eine Gruppe von 5 Mäusen erhielt drei i.p. Injektionen Hypericin von 100 μg/Maus vor dem chirurgischen Eingriff und zwei Regime von 50 μg/Maus nach dem chirurgischen Eingriff in Intervallen von 5 Tagen zwischen jeder Dosierung. Eine andere Gruppe von 8 Mäusen erhielt sechs i.p. Injektionen Hypericin von 100 μg/Maus vor dem chirurgischen Eingriff und fünf Regime von 50 μg/Maus nach dem chirurgischen Eingriff in Intervallen von 5 Tagen Abstand. Eine Kontrollgruppe von 17 Mäusen wurde nur dem chirurgischen Eingriff ohne Behandlungen mit Hypericin unterzogen und eine weitere Kontrollgruppe blieb unbehandelt (22 Mäuse). Das Überleben der Tiere wurde dann verfolgt. Es wurde gefunden, dass 60% der Mäuse, die drei Hypericininjektionen erhalten hatten, 240 Tage nach der Tumorzellinokulation noch am Leben waren; von den Mäusen, welche 6 Hypericininjektionen erhalten hatten, waren 40% am Leben, wohingegen von den Mäusen, welche nur einem chirurgischen Eingriff unterzogen worden waren, 20% am Leben waren. Diese Ergebnisse zeigen ebenfalls Schutzraten von 20–40% aufgrund der Hypericinverabreichung.
Im Bemühen, zu verstehen, wie Hypericin das Metastasenwachstum verhindert, wurde das Experiment wiederholt und die Morphologie der metastatischen Läsionen wurde dann verfolgt. Primäre DA-3^HI-Tumore wurden in BALB/c-Mäusen induziert. Der chirurgische Eingriff wurde an den Tumoren durchgeführt, sobald die Durchmesser 8–10 mm erreicht hatten. Diese Mäuse (17 Tiere) wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, eine wurde mit 5 Dosen 200 μg/Maus Hypericin in 5-Tages-Intervallen wie vorstehend beschrieben (9 Tiere) behandelt und eine andere Gruppe diente als unbehandelte Kontrolle (8 Mäuse). Man ließ die Tiere für zwei weitere Monate wachsen. Die Mäuse wurden dann geopfert und die inneren Organe auf metastatische Läsionen untersucht. Die physische Untersuchung offenbarte zahlreiche gut entwickelte metastatische Läsionen in den unbehandelten Mäusen, die mit großen, sichtbaren Blutgefäßen versorgt wurden. Die wenigen Läsionen, die sich in einigen der mit Hypericin behandelten Mäusen entwickelt hatten, waren viel kleiner, etwas stärker nekrotisch und ohne eine derartige Gefäßversorgung (versorgende Blutgefäße). Dies war nur ersichtlich, wenn die Hypericininjektionen sehr früh vor der Resektion des primären Tumors begonnen wurden. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass Hypericin die Angiogenese (Wachstum einer neuen Gefäßversorgung) hemmt. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Mangel an Blutversorgung und keine direkten Anti-Krebs-Wirkungen die Entwicklung von Metastasen vorhindern. Da Angiogenese primär durch den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) vermittelt wird, kann Hypericin entweder die Bildung oder Sezernierung von VEGF aus Tumorzellen oder sein Zielen auf die Rezeptoren auf vaskulären Endothelzellen stören. Ohne sich zu sehr an einen der vorgeschlagenen Mechanismen binden zu wollen, ist von Hypericin gezeigt worden, dass es die Proteinkinase C hemmt, und die Letztere ist für die VEGF-Produktion wesentlich. Die Störung des Signaltransduktionsweges, der in der Produktion von VEGF gipfelt, kann der Mechanismus für die durch Hypericin oder Helianthronderivate vermittelte Hemmung der VEGF-Wirkung sein, die zur Hemmung des Wachstums metastatischer Läsionen führt. Ungeachtet des vorgeschlagenen Wirkungsmechanismus ist nun gezeigt worden, dass diese Zusammensetzungen hoch potente Angiogeneseinhibitoren sind.
Beispiel 9. Verhinderung von Vaskularisation (Angiogenese) der Augenvorderkammer durch systemische Verabreichung von Hypericin (nicht erfindungsgemäß)
Vier Ratten (jeweils 250 g) wurden drei intraperitoneale Injektionen Hypericin (750 μg pro Dosis in 5 ml Wasser, das 3,5% Ethanol enthielt) in Vier-Tages-Intervallen gegeben. Am folgenden Tag wurden die Tiere mit Xylazin-Ketamin anästhesiert und Angiogenese (Bildung neuer Blutgefäße) wurde durch Inokulation von 2 μl Heparanase (30 μg/ml) in das frontale Kompartiment des Auges in die Hornhaut eines der beiden Augen jeder Ratte induziert. Eine vierte intraperitoneale Injektion von 750 μg Hypericin wurde am nächsten Tag angewendet. Zwei Tiere der positiven Kontrolle erhielten nur 2 μl Heparanase (30 μg/ml) in das frontale Kompartiment des Auges. Man ließ die Angiogenese sich für 5 Tage entwickeln, dann wurden die Tiere mit Xylazin-Ketamin anästhesiert und unter einem Binokularmikroskop auf die Entwicklung von Blutgefäßen in der Augenvorderkammer hin untersucht und fotografiert. Die Fotografie in 10A zeigt die Blutgefäße im Kontrollauge einer Ratte nach der Heparanase-induzierten Angiogenese und ohne Behandlung mit Hypericin, während die Fotografie 10B das Fehlen von Blutgefäßen im Auge einer mit Hypericin behandelten Ratte zeigt. Ein ähnlicher Schutz wurde erhalten, wenn die Angiogenese in Rattenaugen mit bFGF (basischer Fibroblastenwachstumsfaktor) (nicht gezeigt) induziert wurde.
Beispiel 10. Hypericin stört Angiogenese
Eine Rattenaorta wurde in Ringe zerschnitten, welche in Fibringele eingebettet und in MCDB 131 Medium kultiviert wurden. Die Endothelzellen, die sich aus den Aortaringen lösen, erzeugen verzweigte Mikrogefäße gemäß einem früher beschriebenen Verfahren (Nicosia R. F. und Ottinetti, A., Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. Laboratory Investigation 63: 115, 1990). Die Zugabe von Hypericin (nicht erfindungsgemäß) in einem Dosisbereich zwischen 0,1–10 μg/ml (0,2–20 μM) oder Dimethyl-tetrahydroxyhelianthron (erfindungsgemäß) in einem Dosisbereich zwischen 0,1–10 μg/ml (0,2–20 μM) führte zur Hemmung der Bildung der organisierten Mikrogefäße.
Die voranstehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen wird die allgemeine Natur der Erfindung so vollständig offenbaren, dass andere unter Anwendung des gegenwärtigen Wissens derartige spezifische Ausführungsformen leicht modifizieren und/oder den verschiedenen Anwendungen anpassen können, ohne Experimentieren über Gebühr und ohne vom allgemeinen Konzept abzuweichen, und deshalb sollten derartige Adaptionen und Modifikationen innerhalb der Bedeutung und dem Bereich von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen verstanden werden. Es sollte selbstverständlich sein, dass die hierin verwendete Phraseologie oder Terminologie dem Zweck der Beschreibung dient und nicht der Einschränkung. Die Mittel, Materialien und Schritte zur Durchführung der verschiedenen offenbarten Funktionen können eine Vielzahl von alternativen Formen annehmen, ohne von der Erfindung abzuweichen.
LITERATURHINWEISE

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Claims

Verwendung einer Helianthronverbindung oder eines Derivats davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit Angiogenese assoziierten ophthalmologischen Störungen und zur Vorbeugung oder Hemmung von Restenose, wobei die Verbindung die allgemeine Formel (I) aufweist:
wobei R aus Hydroxy, C₁-C₁₀-Alkoxy, NH-C₁-C₁₀-Alkyl und NH-Hydroxy(C₁-C₁₀)-alkyl ausgewählt ist; R' aus Hydroxy und C₁-C₁₀-Alkoxy ausgewählt ist; und R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Hydroxy, Chlor, Brom, C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀-Alkoxy und C₁-C₁₀-Alkoxycarbonyl ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die mit Angiogenese assoziierte ophthalmologische Störung diabetische Retinopathie, Makuladegeneration oder Augeninfektion ist.
Verwendung einer Helianthronverbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Proliferation von Endothel- oder vaskulären glatten Muskelzellen, die mit Restenose assoziiert ist, wobei die Helianthronverbindung die allgemeine Formel (I) aufweist:
wobei R aus Hydroxy, C₁-C₁₀-Alkoxy, NH-C₁-C₁₀-Alkyl und NH-Hydroxy(C₁-C₁₀)-alkyl ausgewählt ist; R' aus Hydroxy und C₁-C₁₀-Alkoxy ausgewählt ist; und R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Hydroxy, Chlor, Brom, C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀-Alkoxy und C₁-C₁₀-Alkoxycarbonyl ausgewählt sind.
Verwendung einer Helianthronverbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren in der Abwesenheit von Lichtbestrahlung, wobei die Helianthronverbindung die allgemeine Formel (I) aufweist:
wobei R aus Hydroxy, C₁-C₁₀-Alkoxy, NH-C₁-C₁₀-Alkyl und NH-Hydroxy(C₁-C₁₀)-alkyl ausgewählt ist; R' aus Hydroxy und C₁-C₁₀-Alkoxy ausgewählt ist; und R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Hydroxy, Chlor, Brom, C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀-Alkoxy und C₁-C₁₀-Alkoxycarbonyl ausgewählt sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Helianthronverbindung der Formel (I) 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron oder 10,13-Dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung der Formel (I) aus: 1,3,4,6-Tetrahydroxyhelianthron; 1,3,4,6-Tetramethoxyhelianthron; 10,13-Di(methoxycarbonyl)-1,3,4,6-tetramethoxyhelianthron; 1,6-Di-N-butylamino-3,4-dimethoxy-helianthron; 1,6-Di-N-butylamino-3,4-dimethoxy-10,13-dimethyl-helianthron; 1,6-Di-(N-hydroxyethylamino)-3,4-dimethoxy-helianthron; 2,5-Dibrom-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron; und 2,5-Dibrom-10,13-dimethyl-1,3,4,6-tetrahydroxyhelianthron ausgewählt ist.