MXPA01001893A - Derivados de quinazolina. - Google Patents

Abstract

La invencion provee inhibidores de JAK-3 novedosos, que son utiles para tratar leucemia y linfomas. Los compuestos tambien son utiles para tratar o prevenir cancer de la piel, asi como quemaduras solares e inflamacion cutanea inducida por UVB. Ademas, los compuestos de la presente invencion previenen los efectos inmunosupresores de la radiacion UVB, y son utiles para tratar o prevenir enfermedades autoinmunologicas, inflamacion y rechazo de transplantes. La invencion provee tambien composiciones farmaceuticas que comprenden compuestos de la invencion, asi como metodos terapeuticos para su uso. (ver formula).

Description

DERIVADOS DE QUINAZOLINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los transductores de señal y activadores de transcripción (STAT, acrónimo por su designación en inglés: SJgnal Transducers and Activators of Transcription) son una familia de proteínas de unión a ADN que residen en el citoplasma hasta que son activadas por la fosforilación de tirosina. Se cataliza este evento de fosforilación mediante miembros de la familia Janus de tirosina-cinasas, que incluyen JAK3 (Ihle, J. N., Adv. Immunol., 60: 1-35, 1995; Witthuhn, B. A. y coautores, Leukemia and Lymphoma, 32: 389-297, 1999). El doble papel de los STAT como moléculas de señalización y factores de transcripción se refleja en su estructura. Todas las proteínas STAT contienen un dominio de unión a ADN, un dominio SH2 y un dominio de transactivación, necesario para inducir la transcripción. En células no estimuladas, las formas latentes de STAT están localizadas predominantemente en el citoplasma. La unión de ligando induce que las proteínas STAT se unan con sus dominios SH2 a los motivos fosforilados de tirosina, en los dominios intracelulares de diversos receptores de transmembrana superficiales de célula (Horvath, C. M. y Darnell, J. E., Curr. Opin. Cell. Biol., 9(2): 233-239, 1997; Levy, D. E., Cytokine Growth Factor Rev., 8(1): 81-90, 1997).

Una vez q ue los STAT se unen a los receptores, las cinasas de Janus (JAK) asociadas con el receptor fosforilan los STAT en un solo resid uo tirosina localizado cerca del dominio S H2. Dos STAT se dimerizan entonces por medio de interacciones de SH2-fosfotirosina recíprocas, específicas. Las proteínas STAT dimerizadas también pueden formar complejos con otras proteínas q ue se unen a ADN . Los d ímeros/complejos de STAT se traslocan a continuación al núcleo y utilizan su dominio de unión a ADN para interactuar con elementos de respuesta a ADN en los promotores de genes de destino (Demoulin , J . B. y coautores, Mol. Cell. Biol. , 16: 471 0-6, 1996). Luego los STAT interactúan directa o indirectamente, por medio de su dominio de transactivación , con componentes del complejo ARN-polimerasa I I para activar la transcripción de los genes de destino. Diferentes ligandos emplean miembros específicos de JAK y de la familia STAT; así pues, la utilización de esa trayectoria exige especificidad en las cascadas de señalización y contribuye a una disposición diversa de respuestas celulares. Las cinasas de Janus, incluyendo JAK3, están expresadas abundantemente en las células leucémicas primarias de niños con leucemia linfoblástica aguda (ALL), la forma más común de cáncer infantil, y estudios recientes han correlacionado la activación de STAT en las células ALL con señales que regulan la apoptosis (Demoulin, J. B. , y coautores, Mol. Cell. Biol. , 16: 4710-6, 1996; Jurlander, J. y coautores, Blood, 89: 4146-52, 1997; Kaneko, S. , Suzuki y coautores, Clin. Exp. Immun. , 109: 185-193, 1997; y Nakamura , N . y coautores, J. Biol. Chem. , 271 : 1 9483-8, 1 996). Así pues, JAK-3 es una enzima importante q ue juega un papel esencial en la función de los linfocitos , los macrofagos y las células mastoidales. Sería de esperar que los compuestos q ue inhiben JAK-3 fueran útiles para tratar o prevenir enfermedades o condiciones en las que la función de los linfocitos, macrofagos o células mastoidales están implicadas, tales como leucemia , linfoma, rechazo de trasplantes (por ejemplo, rechazo de trasplante de la isleta de pancreasa), aplicaciones en trasplante de méd ula ósea (por ejemplo, enfermedad de injerto contra receptor) , enfermedades autoinmunológicas (por ejemplo, diabetes) e inflamación (por ejemplo, asma, inflamación asociada con quemad uras solares y cáncer de la piel). Existe una necesidad continua de compuestos y métodos que sean útiles en el tratamiento y/o la prevención de dichas condiciones y enfermedades.

BREVE DESC RIPCIÓN DE LA I NVENCIÓN La presente invención provee compuestos inhibidores de JAK-3 que son no tóxicos a la escala de dosis administrada. Los inhibidores de JAK-3 de la invención son útiles para tratar leucemia y linfoma. Los compuestos son útiles también para prevenir el cáncer de piel, así como para tratar o prevenir quemaduras solares e inflamación cutánea inducida por UVB. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención previenen los efectos inmunosupresores de la radiación UVB, y son útiles para tratar o prevenir enfermedades autoinmunológicas, inflamación y rechazo de trasplantes. La presente invención provee el uso de un inhibidor de JAK-3 para preparar un medicamento útil para tratar leucemia o linfoma. La presente invención provee el uso de un inhibidor de JAK-3 para preparar un medicamento útil para tratar o prevenir rechazo de trasplantes. La presente invención provee el uso de un inhibidor de JAK-3 para preparar un medicamento útil para prevenir o reducir la respuesta inflamatoria, inducida por radiación UVB, en un mamífero. La presente invención provee el uso de un inhibidor de JAK-3 para preparar un medicamento útil para inhibir la liberación de prostaglandina E2 en un mamífero. La presente invención provee el uso de un inhibidor de JAK-3 para preparar un medicamento útil para prevenir o reducir el edema cutáneo inducido por UVB o los cambios en la permeabilidad vascular, en un mamífero. La presente invención provee el uso de un inhibidor de JAK-3 para preparar un medicamento útil para prevenir o reducir el daño inducido por radiación UVB, a las células epiteliales, o la frecuencia de mutación en la piel de un mamífero. La presente invención provee el uso de un inhibidor de JAK-3 para preparar un medicamento útil para proteger un mamífero contra los efectos tumorígenos de la luz UVB . La presente inven ción provee el uso de un inh ibidor de JAK-3 para preparar un med icamento útil para med iar la actividad de célu la T en un mamífero. La presente invención provee el uso de un inhibidor de JAK-3 para preparar un medicamento úti l para tratar una enfermedad autoinmunológ ica. La presente invención provee también un compuesto inhibidor de JAK-3, para uso en terapia médica. La presente invención provee un método terapéutico para tratar leucemia o linfoma, q ue comprende administrar al mamífero q ue necesite de ello, una cantidad efectiva de un inhibidor de JAK-3. La presente invención provee también un método terapéutico para prevenir o reducir la respuesta inflamatoria inducida por radiación UVB, en un mamífero, que comprende administrar al mamífero que necesite de ello, una cantidad efectiva de un inhibidor de JAK-3. La presente invención provee también un método terapéutico para inhibir la liberación de prostaglandina E2 en un mamífero, que comprende administrar al mamífero que necesite de ello, una cantidad efectiva de un inhibidor de JAK-3. La presente invención también provee un método terapéutico para prevenir o reducir el edema cutáneo inducido por UVB o los cambios en la permeabilidad vascular, en un mamífero, que comprende administrar al mamífero que necesite de ello, una cantidad efectiva de un inhibidor de JAK-3. La presente invención provee también un método terapéutico para prevenir o red ucir los daños ind ucidos por la radiación UVB a células epiteliales o la frecuencia de mutación en la piel de u n mamífero, q ue comprende ad ministrar al mamífero que necesite de ello, una cantidad efectiva de un in hibidor de JAK-3. La presente invención provee también un método terapéutico para proteger un mamífero contra los efectos tumorígenos de la luz UVB, que comprende administrar al mamífero que necesite de el lo una cantidad efectiva de un inhibidor de JAK-3. Se ha encontrado que los inhibidores de JAK-3 representativos, de la presente invención , exhiben significativa actividad anti-proliferante, contra las células T, y se ha encontrado que inhiben I L-2, dependiente de la proliferación celular. Así, los compuestos pueden ser usados para tratar o prevenir complicaciones de trasplante (por ejemplo, rechazo de los órganos de donador por el sistema inmu nológico del receptor) y las complicaciones asociadas con el trasplante de médula ósea, como el desarrollo de enfermedad de injerto contra receptor (GVHD , acrónimo por su designación en inglés: G/aft Versus H st Djsease). Adicionalmente, los compuestos de la presente invención también proveen un método terapéutico para tratar (o prevenir) la leucemia, el rechazo de trasplante, GVHD, inflamación, asma, enfermedades autoinmunológicas, incluyendo diabetes, desarrollo de cáncer en la piel, relacionado con inflamación; que comprende administrar al mamífero que necesite de ello, una cantidad efectiva de un compuesto d e la fórmula I . La invención provee también compuestos novedosos de la fórmula I , descritos aquí, así como composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de la fórmula I . U n inhibidor de JAK-3 específico, útil en los medicamentos y los métodos de la invención es un compuesto de la fórmula I : donde: X es H N, R N, S, O, CH2 o R? ,CH; Rn es hidrógeno, alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono) o alcanoílo (de 1 a 4 átomos de carbono); cada uno de Rn-Rß es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro (alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), alcoxi (de 1 a 4 átomos de carbono), alq uiltio (de 1 a 4 átomos de carbono) o halo; donde dos grupos adyacentes de R?-R5, junto con el anillo de fenilo al que están fijados, pueden formar opcionalmente un anillo fundido, por ejemplo, formando un anillo de naftilo o de tetrahidronaftilo; y adicionalmente, donde el anillo formado por los dos grupos adyacentes de R1-R5 pueden estar sustituidos opcionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), alcoxi (de 1 a 4 átomos de carbono), alquiltio (de 1 a 4 átomos de carbono) o halo; y cada uno de R9 y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), alcoxi (de 1 a 4 átomos de carbono), halo o alcanoílo (de 1 a 4 átomos de carbono); o Rg y R10, juntos, son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. Se prefiere que por lo menos uno de R2 y R3 sea hidroxi. Más preferible, por lo menos uno de R2 y R3 es hidroxi y uno de R-i a R5 es halo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra la síntesis de los compuestos representativos de la fórmula I, a partir del compuesto 5. La figura 2 [A] es un modelo de JAK3 que muestra la superficie molecular de la proteína (azul) y el sitio catalítico (de unión de ATP) (amarillo); [B] es la representación de cinta (estructura Ca) del modelo de homología del dominio de JAK3-cinasa. La molécula SHI-P131 está mostrada como un modelo llenador de espacio en el sitio catalítico de JAK3. [C] es una vista en acercamiento del sitio catalítico del modelo JAK3 con el inhibidor de quinazolina suprimido WHI-P131 (verde). Están mostrados los residuos y el in hibidor como átomos llenadores de espacio. La abertura expuesta a solvente del sitio catal ítico, tiene d imensiones para permitir que un i nh ibidor relativamente plano entre y se u na a JAK3. La abertura del receptáculo está definida por los residuos Pro906, Ser907, Gly908, Asp912, Arg953, Gly829, Leu828 y Tyr904 (resid uos azules). La pared lejana, profundamente dentro del receptáculo, está revestida con Leu905 (esqueleto Ca), Glu903, Met902, Lys905 y Asp967 (residuos rosa), y el piso del receptáculo está revestido con Leu905 (cadena lateral), Val884, Leu956 y Ala966 (residuos amarillos). Los residuos que definen el techo del receptáculo incluyen : Leu828, Gly829, Lys830 y Gly831 (residuos azules de más arriba). Preparada usando el programa I nsightl l . La figura 3 [A] es un modelo de espacio no ocupado en el sitio catalítico (de unión a ATP) de un modelo de homología de JAK3. Se muestra en verde el sitio de unión para ATP y el sitio de unión más probable para los inhibidores de dimetoxiquinazolina. La región del sitio activo de cinasa verde representa un volumen total de aproximadamente 530Á. Los estudios de modelo mostraron q ue un inhibidor, o una porción de un inhibidor con unión significativa a esta región, ocuparía un volumen inferior a 530Á3 y tendría dimensiones moleculares compatibles con la forma de la región del sitio de unión. Otras regiones cercanas al sitio de unión, que muestran volumen mensurable no ocupado, están mostradas en azul rey, rosa, amarillo y azul claro. Estas regiones de unión no están disponibles para las moléculas de inhibidor (azul rey) o bien representan regiones apenas suficientemente grandes para ocupar las moléculas de solvente (rosa, amarillo, azul claro). Un modelo de WHI-P131 anclado en el sitio catalítico está mostrado en blanco, sobrepuesto sobre la región verde. [B] es el modelo del sitio catalítico de JAK3 con quinazolinas WHI-P131 (multicolor), WHI-P132 (rosa) y WHI-P154 (amarillo). Cada compuesto ajusta en el sitio de unión, excepto que WHI-P132 (que demostró en los análisis biológicos ser inactivo contra JAK3) carece de un grupo OH que esté en una ubicación para unirse con Asp967. WHI-P131 y WHI-P154 con grupos OH en la posición C4' del anillo de fenilo, son capaces de formar una interacción favorable con Asp967 de JAK3, que puede contribuir a su actividad de inhibición incrementada. [C] son aspectos de los derivados de dimetoxiquinazolina que se predice que ayudan a la unión del sitio catalítico de JAK3. La figura 4 [A] es una comparación estructural de residuos no conservados en los sitios catalíticos de cinco tirosina-cinasas de proteína diferentes; JAK3 (rosa), BTK (roja) SYK (azul claro), IRK (azul oscuro) y HCK (amarillo). Los residuos dentro de 5Ádel inhibidor JAK3 anclado, WHI-P131 (blanco), están mostrados como cadenas laterales en forma de barra. La estructura C-alfa de JAK3 está mostrada como una línea rosa delgada, para perspectiva. Las regiones A a F corresponden a áreas que contienen residuos no conservados en el sitio catalítico (véase B y los Resultados y la Discusión). Las coordenadas de estructura cristalina de HCK y de IRK y los modelos de homología de JAK3, BTK y SYK fueron usados para el análisis estructural. [B] ilustra residuos no conservados en los sitios catalíticos, de 8 diferentes tirosina-cinasas de proteína. Las regiones A-F se refieren a las ubicaciones en el sitio catalítico, que están ¡lustradas en A. La figura 5 ilustra los efectos de WHI-P131 sobre la actividad de tirosina-cinasa de JAK3. [A]-[D]. JAK3, JAK1 y JAK2, inmunoprecipitados a partir de células de ovario de insecto Sf21 transfectadas con vectores de expresión de baculovirus apropiados, fueron tratados con WHI-P131, luego fueron sometidas a análisis de cinasa in vitro, como se describe en los Métodos. Se determinó la actividad enzimática de los JAK, midiendo la autofosforilación en un análisis de cinasa de 10 minutos, como se describe en los Métodos. Se expresó los niveles de actividad de cinasa (KA) como el porcentaje de la actividad de línea básica (%CON). [E] Las EMSA de células 32Cd22-IL-2Rß. WHI-P131 (10 µg/ml = 33.65 µM) y WHI-P154 (10 µg/ml = 26.6 µM) (pero no WHI-P132; 10 µg/ml = 33.6 µM) inhibieron la activación de STAT dependiente de JAK-3, disparada por IL-2, pero no la activación de STAT dependiente de JA-1/JAK-2, disparada por lL-3, en células 32Dc11-IL-2Rß. La figura 6 representa la especificidad de WHI-P131.

JAK3, SYK y BTK inmunoprecipitados a partir de células de ovario de insectos Sf21, transfectadas con vectores de expresión de baculovirus apropiados, LYN inmunoprecipitado de células ALL de linaje B de NALM-6 humanas, e IRK inmunoprecipitadas de células de hepatoma HepG2, fueron tratadas con WHI-P131, luego fueron sometidas a análisis de cinasa in vitro, como se describe en los Métodos. La figura 7 ilustra que WHI-P131 despolariza las membranas mitocóndricas en una forma que depende de la concentración, sin afectar la masa mitocondriana. Se incubó células leucémicas humanas NALM-6 con las concentraciones indicadas de WHI-P131 durante 48 horas, se tiñó con DÍIC1 para determinar el potencial de membrana mitocóndrica (??m) o NAO para detectar la masa mitocóndrica, y luego se analizó con un clasificador de células, equipado con láser de HeNe. WHI-P131 provocó un aumento progresivo en los mitocondrios despolarizados (como lo indica M1 en A) al aumentar las concentraciones. A concentraciones similares no se detectó ningún cambio importante en la masa mitocondriana [B]. [C]: Se tiñó las células con JC-1 para análisis simultáneo de la masa mitocondriana (fluorescencia verde) y el potencias de transmembrana mitocóndrica (fluorescencia roja/naranja). Se incubó células NALM-6 sin tratar [D.1] así como células NALM-6 con 50 µM de WHI-P131 durante 24 horas [D.2], con JC-1 y se analizó mediante microscopía exploratoria con láser confocal. Los mitocondrios de las células de control mostraron un potencial mayor de membrana (??m), como se indica mediante la fluorescencia roja JC-1 más brillante. El tratamiento de las células con WHI-P131 redujo el ??m de la membrana mitocóndrica, como lo indica una disminución sustancial en la, fluorescencia roja de JC-1. En la figura 8 WHI-P131 induce apoptosis en células de leucemia NALM-6. [A]: Se incubó las células con 10 µM-500 µM de WHI-P131 durante 24 horas, y luego se las procesó para análisis de apoptosis in situ. Se determinó el porcentaje de células apoptóticas examinando un promedio de 1380 células/10 campos/muestra. Los puntos de datos representan la media de cuentas duplicadas obtenidas en dos experimentos independiente. [B.1][B.2]: Se incubó células NALM-6 con 100 µM de WHI-P131 durante 48 horas, se procesó para el análisis de apoptosis in situ y se analizó con un microscopio confocal de exploración por láser. Cuando se comparó con los controles tratados con DMSO (0.1% [B.1], varias de las células incubadas con WHI-P131 [B.2] mostraron núcleos apoptóticos (fluorescencia amarilla). La fluorescencia roja representa núcleos teñidos con yoduro de propidio. En la figura 9 WHI-P131 induce fragmentación apoptótica de ADN en células leucémicas humanas. El ADN de lisatos de Triton-X-100 de control y células tratadas con el fármaco, fue analizado para fragmentación, como se describe (21). [A] Se trató células ALL de linaje B humano, NALM-6, durante 24 horas, a 37CC con los compuestos de dimetoxiquinazolina mencionados en la lista, a concentraciones finales de 1, 3 o 10 µM. Se usó WHI-P131 como el compuesto inhibidor de JAK3 delantero y todos los demás compuestos fueron incluidos como controles, faltando en ellos la actividad inhibidora de JAK3. [B] Se trató células ALL de linaje B humanas LC1;19 y las líneas de célula de control SQ20B y M24-MET durante 24 horas a 37°C con WHI-P131 a concentraciones finales de 1 o 3 µ M . La fig ura 10 ilustra el efecto inhibidor del compuesto 6 sobre el espesor de piel ind ucido por UVB en ratones skh- 1 . Se trató tópicamente ratones hembras skh- 1 con 1 mg/cm2 de compuesto 6 , antes de cada exposición a luz UVB con 35 mj/cm2. Se registró el espesor del pliegue cutáneo de cada ratón dos veces por semana y se usó el promed io de dos mediciones en los cálculos. Los datos representan la media±SEM (n =5-14). *P < 0.05 y **P < 0.005, en comparación con el control tratado con vehículo. La figura 1 1 representa el efecto inhibidor del compuesto 6 sobre el número promed io de lesiones, por ratón . Se trató tópicamente ratones hembras skh-1 con 1 mg/cm2 del compuesto 6 , antes de cada exposición a luz UVB con 35 mj/cm2. Se registró el número de lesiones dos veces por semana y se usó el promedio de dos mediciones en los cálculos. Los datos representan la media±SEM (n = 5-14). *P <. 0.05 y **P < 0.005, en comparación con el control tratado con vehículo. La figura 12 representa el efecto inhibidor del compuesto 6 sobre el volumen promedio de lesión, por ratón. Se trató tópicamente ratones hembras skh-1 con 1 mg/cm2 del compuesto 6, antes de cada exposición a luz UVB con 35 mj/cm2. Se mid ió las lesiones mayores que o iguales a 1 mm de diámetro, y se registró dos veces por semana, y se usó en los cálculos un promedio de dos mediciones. Se calculó el volumen de lesión usando la fórmula descrita en Material y en Métodos. Los datos representan la media±SEM (n = 5-14). *P <. 0.05, en comparación con el control tratado con vehículo. La figura 13 es la apariencia morfológica de la superficie dorsal de ratones, después de 20 semanas de irradiación con UVB. Se trató tópicamente ratones hembras skh-1 con 1 mg/cm2 del compuesto 6, antes de cada exposición a luz UVB con 35 mj/cm2. Se irradió los ratones tres veces por semana durante un total de 20 semanas. A las 20 semanas se anestesió los ratones y se tomó una imagen de su superficie dorsal. Panel A: control sin irradiación y tratado con vehículo. Panel B: ratón irradiado con UVB y tratado con vehículo. Panel C: Ratón irradiado con UVB y tratado con el compuesto 6. Ampliación 2X. La figura 14 representa que el compuesto 6 inhibe la síntesis de PGE2 inducida por UVB. Se irradió cultivos de célula HaCaT con UVB (25 mj/cm2 o se irradió simuladamente. Se añadió el compuesto 6 (3-30 M) 60 minutos antes de la irradiación y se volvió a administrar después de exposición a UVB. Se determinó el PGE2 acumulativo liberado durante la incubación subsecuente de seis horas, por medio de EIA. Los datos representan la media (SEM (n = 3). En la figura 15, el compuesto 6 inhibe la liberación de PGE2 estimulada por EGF, en células epidérmicas. Se usó 50 ng/ml de EGF para estimular los cultivos confluentes de células HaCaT tanto en ausencia como en presencia del compuesto 6 y se incubó las células durante seis horas a 37°C. Después de la incubación, se recogió el sobrenadante y se determinó el PGE2 liberado durante la incubación, por medio de EIA. Los datos representan la media ( SEM (n = 5). La figura 16 ilustra el efecto del compuesto 6 sobre el espesor del pliegue cutáneo de ratones skh-1, después de daños por luz UVB. Se trató previamente ratones skh-1 con el compuesto 6 (16 mg/kg; i.p., inyección de bolo) durante dos días. El día de la irradiación UVB se anestesió los ratones y se los pintó con 1.5 mg/cm2 del compuesto 6 sobre la superficie dorsal, 15 minutos antes de la exposición a UVB, y se los irradió con luz UVB (250 mj/cm2). Se midió el espesor del pliegue cutáneo el día 1 hasta el día 5 después de la irradiación. Los datos están expresados como la media ( SEM (n = 5-34). La figura 17 representa la inhibición de exudación de plasma, inducido por UVB, en la piel de ratones skh-1. Se evaluó la exudación de plasma en los tiempos indicados después de la exposición a UVB (250 mj/cm2), midiendo la absorbencia de azul Evans en los extractos de piel, siguiendo ei método descrito en Materiales y Método. Los datos representan la media ( SEM (n = 5-17). La figura 18 ilustra el efecto del compuesto 6 sobre la morfología de la piel el día 4 después de la irradiación con UVB. Se trató previamente ratones skh-1 con el compuesto 6 (16 mg/kg, i.p., inyección de bolo) durante dos días, se pintó con 1.5 mg/cm2 de compuesto 6 sobre la superficie dorsal, 15 minutos antes de la exposición a UVB, y se irradió con luz UVB (250 mj/cm2). El día 4 se anestesió los ratones y se tomó una imagen de su superficie dorsal. Ampliación 2X. La figura 19 ilustra la inhibición de los cambios histológicos inducidos por UVB en la piel de ratones skh-1 mediante el compuesto 6. Se trató los ratones con el fármaco y se los expuso a UVB (250 mj/cm2) siguiendo el mismo procedimiento descrito en la leyenda 3 de la figura. A las 48 horas después de la irradiación se sacrificó los ratones, se hizo la biopsia de piel y se tiñó secciones parafínicas del tejido con hematoxilina y eosina; (a) control, (b) UVB (250 mj/cm2), y (c) Compuesto 6 + UVB (250 mj/cm2). Ampliación 40X. La figura 20 ilustra la apoptosis de células epidérmicas en piel irradiada con UVB de ratones skh-1 y su inhibición mediante el compuesto 6. Se tomó biopsias de piel de ratones irradiados e irradiados simuladamente, con o sin tratamiento por fármaco, a las 48 horas después de irradiación con UVB y se tiñó secciones parafínicas obtenidas, para células apoptóticas. La figura muestra imágenes capturadas mediante microscopio confocal, usando ampliación de 60X. La mancha verde en la imagen muestra células apoptóticas. La figura 21 ilustra la supresión de la proliferación de esplenocitos, dependiente de la dosis, de MLR(A), inducida por PHA (B) e inducida por ConA (C), mediante WHI-P131. Se añadió WHI-P131 en la concentración de 0.1, 1.0, 10 y 50 µg/ml durante el periodo de cultivo de cinco días (MLR), o el periodo de cultivo de 3 días (PHA y ConA). Se midió la proliferación mediante análisis colorimétrico WST-1. Los resultados están presentados como la media de O.D. ± SEM de 3-7 experimentos separados. Las diferencias estadísticas entre los grupos fueron analizadas por la prueba t de Student. La figura 22 ilustra el análisis de citometría de flujo del porcentaje de esplenocitos apoptóticos (TUNEL-positivos) obtenido después de un periodo de cultivo de 24 horas, con adición de 0.1, 1, 10 y 100 µg/ml de WHI-P131. Los resultados están presentados como la media ± SEM. Las diferencias estadísticas entre los grupos fueron analizadas mediante la prueba t de Student. La figura 23 consigna el efecto profiláctico in vivo de la administración de WGU.P131 sobre GVHD inducida a través de la principal barrera de histocompatibilidad en receptores C57BL6 (H-2b) con injertos BALB/c (H-2d) BM/esplenocito. Los receptores irradiados (7.5 Gy) recibieron BM y esplenocitos (25 x 106 de cada uno). Algunos receptores recibieron BM singénico, mientras que otros fueron tratados diariamente con2 5 mg/kg de WHI-P131, 50 mg/kg de WHI-P132, 3 mg/kg de ciclosporina A, 10 mg/m2 de Metotrexato o un control de vehículo, como se describe en la sección Material y Método. Se analizó las diferencias en la sobrevivencia entre los grupos mediante análisis de tabla de vida, de la prueba Mantel-Cox. La figura 24 ilustra el efecto profiláctico in vivo de la administración de combinaciones de fármacos, presentadas en la figura 23, sobre GVHD, inducido por medio de la barrera principal de histocompatibilidad en receptores C47BL6 (H-2b), con injertos BALB/c (H-2d) BM/esplenocito. Se administró intraperitonealmente WHI-P131 (25 mg/kg), ciclosporina A (3 mg/kg) o combinación de ciclosporina A y WHI-P131 (A). La diferencias en sobrevivencia entre los grupos fueron analizados mediante análisis de tabla de vida, en la prueba Mantel-Cox. La figura 25 ilustra el efecto profiláctico in vivo de la administración de combinaciones de fármaco presentadas en la figura 23 sobre GVHD inducida a través de la barrera principal de histocompatibilidad en receptores C57BL6 (H-2b) con injertos BALB/c (H-2d) BM/esplenocito. Se administró intraperitonealmente WHI-P131 (25 mg/kg) y WHI-P131 y Metotrexato (10 mg/m2) o combinación de Metotrexato y WHI-P131. Se analizó las diferencias en la sobrevivencia entre los grupos, por medio del análisis de la tabla de vida, de la prueba Mantel-Cox. La figura 26 muestra los efectos del compuesto 6 (60 mg/kg/día) sobre el desarrollo de GVHD. La figura 27 ilustra la incidencia acumulativa de diabetes (A) en machos deficientes en Jak3 y de tipo silvestre (WT), tratados con LDSTZ, estudiados durante el periodo experimental de 25 días después de la administración de la primera inyección de STZ; la diferencia estadística se obtuvo mediante el análisis de la tabla de vida.

La figura 28 representa el nivel de glucosa en sangre (mg/dl) (B) en machos deficientes en Jak3 y de tipo silvestre (WT), tratados con LDSTZ, estudiados durante el periodo experimental de 25 días después de la administración de la primera inyección de STZ; la diferencia estadística fue obtenida por ANOVA. La figura 29 ilustra la incidencia acumulativa de diabetes (A) en seis machos C57BL, tratados con LDSTZ, estudiados durante el periodo experimental de 25 días después de la administración de ia primera inyección de STZ; la diferencia estadística fue obtenida mediante análisis de la tabla de vida (prueba de Mantel-Cox). La figura 30 es el nivel de glucosa en sangre (mg/dl) en seis machos C57BL tratados con LDSTZ, estudiados durante el periodo experimental de 25 días después de la administración de la primera inyección de STZ; la diferencia estadística fue obtenida por ANOVA. La figura 31 es la incidencia de diabetes en hembras NOD, tratadas con 20 y con 50 mg/kg de WHI-P131 diariamente desde las 5 hasta las 25 semanas de edad (A); las diferencias estadísticamente importantes entre ratones tratados con WHI-P131 y ratones de control, fueron obtenidas mediante el análisis de tabla de vida (prueba de Mantel-Cox). La figura 32 ilustra la incidencia de diabetes en hembras NOD tratadas con 100 mg/kg de WHI-P131 desde las 5 o 10 semanas hasta las 25 semanas de edad; las diferencias estadísticamente importantes entre los ratones tratados con WHI-P131 y los ratones de control fueron obtenidas mediante análisis de la tabla de vida (prueba de Mantel-Cox). La figura 33 es la prueba IPGTT efectuada en seis hembras C57BL (20 semanas de edad), hembras NOD de control, no diabéticas (25 semanas de edad) y hembras NOD (25 semanas de edad) tratadas durante 15 o 20 semanas con 100 mg/kg de WHI-P131; las diferencias estadísticas fueron obtenidas por la prueba t de Student: *, **, ***, ***p < 0.05, 0.01, 0.005 y 0.0001, respectivamente; en comparación con el grupo de control con vehículo NOD. La figura 34 representa la transferencia adoptiva retardada de la diabetes a hembras NOD-scid, mediante tratamiento con WHI-P131. Se transfirió hembras NOD-scid con 10 x 106 espienocitos diabéticos, y se trató diariamente con 50 mg/kg de WHI-P131 i.p., hasta la aparición de diabetes. La diferencia estadísticamente importante fue obtenida mediante análisis de la tabla de vida (prueba de Mantel-Cox). En la figura 35 los ratones -\ak3~'~ no rechazan el aloínjerto de isleta (A); hematoxilina y eosina (B) y el inmunomanchado para insulina (C) del injerto de isleta alógeno trasplantado bajo la cápsula de riñon de ratones Ja/3" diabéticos, sacrificados el día 100 después del trasplante. Los datos representantes de más de 30 secciones/injerto y 6 ratones/grupo, x10. La figura 36 muestra que SHI-P131 suprime la reacción MLR. Se mezcló esplenocitos de respondedor (4 x 106/ml) con esplenocitos de estimulador (1.6 x 106/ml) y se añadió los fármacos a concentraciones de 0.1, 1, 10 y 50 g/ml durante el periodo de cultivo de cinco días. Se midió la proliferación mediante análisis colorimétrico de SWT-1. Los resultados están presentados como O.D. media ± SEM de seis experimentos separados; p = 0.0095, en comparación con las células de control no expuestas a WHI-P131. La figura 37 muestra el análisis citométrico de flujo de esplenocitos apoptóticos (TUNEL-positivos). Se efectuó el teñido TÚNEL después de un periodo de incubación de 20 horas de los esplenocitos (1.5 x 106) con 0.1, 1, 10 y 100 µg/ml de WHI-P131. Los resultados están presentados como la media ± SEM. Las diferencias estadísticas entre los grupos fueron analizadas mediante la prueba t de Student. La figura 38 es el efecto del tratamiento con WHI-P131 (50 y 75 mg/kg), WHI-P132 (50 mg/kg) y ciclosporina A (20 mg/kg) sobre la sobrevivencia del injerto de isleta; los valores p fueron obtenidos mediante análisis de la tabla de vida (prueba de Mantel-Cox). La figura 39 ilustra el análisis citométrico de flujo de esplenocitos C57BL/6 después del tratamiento con 130 mg/kg de WHI-P131 durante 10 días. Los resultados están presentados como la media ± SEM. Las diferencias estadísticas entre los grupos fueron analizadas mediante la prueba t de Student. La figura 40 representa la glucosa en sangre (mg/dl) no en ayunas, en receptores de trasplante de isleta singénicos, tratados con 50 mg/kg/día de WHI-P131 o control de vehículo durante el periodo de 180 días después del trasplante (A). Los resultados están presentados como la media ± SD. La figura 41 ilustra el IPGTT de los mismos receptores de ia figura 39, y ratones de control no trasplantados, efectuado el día 70 (B) después del trasplante, después del periodo de ayunas de ocho horas. Los resultados están presentados como la media ± SEM (B, C). La figura 42 ilustra el IPGTT de los mismos receptores de la figura 39 y de ratones de control no trasplantados, efectuado el día 180 (C) después del trasplante, después de un periodo de ayunas de ocho horas. Los resultados están presentados como la media ± SEM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se usa las siguientes definiciones, a menos que se describa de otra manera: halo es flúor, cloro, bromo o yodo. Alquilo, alcoxi, etc., denotan grupos rectos y también ramificados; pero la referencia a un radical individual, como "propilo", comprende únicamente el radical de cadena recta; y la referencia a un radical individual, tal como "isopropilo", comprende únicamente el radical de cadena ramificada. Arilo denota un radical fenilo o un radical carbocíclico bicíclico orto-fundido, que tiene aproximadamente nueve a diez átomos de anillo, donde por lo menos un anillo es aromático. Heteroarilo incluye un radical fijado mediante un carbono de anillo de un anillo aromático monocíclico que contiene cinco o seis átomos de anillo, que consisten de carbono y uno a cuatro heteroátomos, cada uno seleccionado del grupo que consiste de oxígeno no peroxídico, azufre y N(W), donde W está ausente o es H, O, alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), fenilo o bencilo, así como un radical de un heterociclo bicíclico orto-fundido, de alrededor de ocho a diez átomos de anillo, derivado de él, en particular un benzo-derivado o uno derivado fundiendo un dirradical propileno, trimetileno o tetrametíleno, con él. Los valores específicos de la siguiente lista, para los radicales, sustituyentes y las escalas, son únicamente para ilustración; no excluyen otros valores definidos ni otros valores dentro de las escalas definidas para los radicales y los sustituyentes. Específicamente, alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono) puede ser metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o butilo secundario; alcoxi (de 1 a 4 átomos de carbono) puede ser metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi o butoxi secundario; alquiltio (de 1 a 4 átomos de carbono) puede ser metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio o isobutiltio; alcanoílo (de 1 a 4 átomos de carbono) puede ser acetilo, propanoílo, butanoílo o isobutanoílo; arilo puede ser fenilo, indenilo o naftilo; y heteroarilo puede ser furilo, imidazolilo, triazolilo, triazinilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, ¡sotiazolilo, pirazolilo, pirrolilo, pirazinilo, tetrazolilo, piridilo (o su N-óxido), tienilo, pirimidinilo (o su N-óxido), indolilo isoquinolilo (o su N-óxido) o quinolilo (o su N-óxido). Quienes sean expertos en la materia apreciarán que los compuestos de la invención que tienen un centro quiral pueden existir en, y ser aislados en, formas ópticamente activas y racémicas. Algunos compuestos pueden exhibir polimorfismo. Debe entenderse que la presente invención comprende cualquier forma racémica, ópticamente activa, polimórfica o estereoisomérica, o mezclas de ellas, de un compuesto de la invención, que posee las propiedades útiles aquí descritas, de un compuesto de la invención, que posee las propiedades útiles aquí descritas, siendo bien conocido en la técnica cómo preparar formas ópticamente activas (por ejemplo, por resolución de la forma racémica mediante técnicas de recristalización, por síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos, por síntesis quiral, o mediante separación cromatógráfica, usando una fase estacionaria quiral), y cómo determinar la actividad de inhibición de prostaglandina E2, usando las pruebas normales aquí descritas, o usando otras pruebas similares que son bien conocidas en la técnica. Un grupo específico de compuestos está formado por los compuestos de la fórmula I, en los que X es R-MN. Otro grupo específico de compuestos está formado por los compuestos de la fórmula I en los que X es HN. Un grupo específico de compuestos está formado por los compuestos de la fórmula I en los que cada uno de R^ R2, R4, R5, Un grupo específico de compuestos son los compuestos de la fórmula I en los que R3 es alcoxi (de 1 a 4 átomos de carbono), hidroxi, nitro, halógeno, trifluorometilo o NR12R13, donde cada uno de Ri2 y R13 es independientemente hidrógeno, alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), alquenilo (de 1 a 4 átomos de carbono), alquinilo (de 1 a 4 átomos de carbono), cicloalquilo (de 3 a 8 átomos de carbono) o heterociclo. Otro grupo específico de compuestos está formado por los compuestos de la fórmula I en los que R3 es hidroxi. Un grupo específico de compuestos está formado por los compuestos de la fórmula I en los que R8 es alcoxi (de 1 a 4 átomos de carbono. Otro grupo específico de compuestos está constituido por los compuestos de la fórmula I en los que R8 es metoxi. Un grupo específico de compuestos es el de los compuestos de la fórmula I en los que R9 es alcoxi (de 1 a 4 átomos de carbono). Otro grupo específico de compuestos es el de los compuestos de la fórmula I en los que R9 es metoxi. Un compuesto preferido es la 4-(4'-hidroxi!-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina WHI-P131; o una sal farmacéuticamente aceptable de ella. Un compuesto preferido es la 4-(3'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina WHI-P180, o una sal farmacéuticamente aceptable de ella. Un compuesto preferido es la 4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxil- fenil)amino-6 , 7-d¡metoxiqu inazolina , WH I-P97, o una sal farmacéuticamente aceptable de ella. U n compuesto preferido es 4-(3'-bromo-4'-h idroxil-fenil) amino-6 ,7-d imetoxiquinazolina WH I-P 1 54, o una sal farmacéutica-mente aceptable de ella. Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados como composiciones farmacéuticas y admin istrados a un anfitrión mamífero, como un paciente humano, en una variedad de formas, adaptadas para la ruta de ad ministración seleccionada , es decir, oral o parenteralmente, mediante rutas intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea. Así, las sustancias pueden ser administradas sistémicamente, por ejemplo oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un d iluyente inerte o un portador comestible asimilable. Pueden ser encerrados en cápsulas de gelatina dura o de cubierta blanda; se los puede comprimir a tabletas o se los puede incorporar directamente en el alimento de la dieta del paciente. Para administración terapéutica oral se puede combinar la sustancia con uno o más excipientes y se lo puede usar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, sellos y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener por lo menos 0.1 % de la sustancia. Por supuesto el porcentaje de las composiciones y de las preparaciones puede variar y, convenientemente, puede estar entre alrededor de 2 y alrededor de 60% del peso de una forma de dosis unitaria dada. La cantidad de sustancia en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal, que se obtendrá un nivel de dosis efectivo. Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: aglutinantes, como goma de tragacanto, goma de acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes, como fosfato de dicalcio; un agente desintegrante como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante, como estearato de magnesio; y un agente edulcorante, como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo; o un agente saborizante, como yerbabuena, aceite de menta o sabor de cereza. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Pueden estar presentes diversos materiales adicionales, como revestimientos, o para modificar de otra manera la forma física de la forma de dosis unitaria sólida. Por ejemplo, las tabletas, pildoras o cápsulas pueden estar revestidas con gelatina, cera, Shellac o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservadores, un tinte y un saborizante, como sabor de cereza o de naranja. Por supuesto cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosis unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Adicionalmente se puede incorporar la sustancia en preparaciones y dispositivos de liberación sosten ida. Se puede administrar también las sustancias intravenosa o intraperitonealmente med iante infusión o inyección . Se puede preparar soluciones de sustancia en agua, opcionalmente en mezcla con un agente tensioactivo no tóxico. También se puede preparar dispersiones en glicerol , polietileng licoles líquidos, triacetin y sus mezclas y en aceites. Bajo cond iciones ordinarias de almacenamiento y de uso, estas preparaciones contienen un conservador para prevenir el desarrollo de microorganismos. Las formas de dosis farmacéutica adecuadas para inyección o infusión pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas, estériles, o polvos estériles que comprenden la sustancia, que están adaptados para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles, inyectables o para infundir, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la forma de dosis final debe ser estéril , fluida y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un solvente o un medio de dispersión líquido que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo: glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos y similares), aceites vegetales, esteres de glicerilo no tóxicos y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en caso de dispersiones, o mediante el uso de agentes tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede ser efectuada mediante diversos agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo: parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, reguladores o cloruro de sodio. Se puede efectuar la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso, en las composiciones, de agentes que retarden la absorción, por ejemplo: monoestearato de aluminio y gelatina. Se prepara las soluciones inyectables estériles incorporando la sustancia en la cantidad requerida, en el solvente apropiado, con varios de los demás ingredientes enumerados arriba, según se requiera, seguidos por la esterilización en filtro. En caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y secado por congelación, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, en las soluciones previamente filtradas para esterilizarlas. Para administración tópica se puede aplicar las sustancias en forma pura, es decir, cuando son líquidas. Sin embargo, en general será conveniente administrarlas a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido. Los portadores sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos, como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los portadores líquidos útiles incluyen: agua, alcoholes o glicoles, o mezclas de agua-alcohol/glicol, en las q ue se puede disolver o dispersar las sustancias a niveles efectivos, opcionalmente con ayuda de agentes tensioactivos no tóxicos. Se puede añadir adyuvantes, como fragancias y agentes antimicrobianos ad icionales, para elevar al óptimo las propiedades, para un uso dado. Se puede aplicar las composiciones líquidas resultantes desde torundas absorbentes, usadas para impregnar vendas y otros vendajes, o se puede rociar sobre el área afectada, utilizando rociadores del tipo de bomba o de aerosol. También se puede emplear espesadores, como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y esteres de ácido graso, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados, con portadores líquidos para formar pastas para untar, geles, ungüentos, jabones y similares, para aplicarlos d irectamente a la piel del usuario. Los ejemplos de composiciones dermatológicas útiles, que pueden ser usadas para suministrar a la piel las sustancias, son conocidos en la técnica; por ejemplo, véase Jacquet y coinventores (patente estadounidense No. 4,608,392), Geria (patente estadounidense No. 4,992,478), Smith y coinventores (patente estadounidense No. 4,559, 157) y Wortzman (patente estadounidense No. 4,820,508). Se puede determinar las dosis útiles de los compuestos de la fórmula I comparando su actividad in vitro y su actividad in vivo en modelos animales. Los métodos para la extrapolación de dosis efectivas en ratones y otros an imales, a los huma nos, son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, la patente estadou nidense No. 4,938,949. En general la concentración de la sustancia en una composición líq uida, como una loción, será aproximadamente de 0.1 a 25% en peso, de preferencia aproximadamente de 0.5 a 10% en peso. La concentración en una composición semisólida o sólida , como un gel o un polvo, será aproximadamente de 0.1 -5% en peso, de preferencia aproximadamente de 0.5 a 2.5% en peso. La cantidad de la sustancia requerida para uso en el tratamiento variará no solamente con la sal particular seleccionada, sino también con la ruta de administración , la naturaleza de la condición q ue está siendo tratada y la edad y ia condición del paciente, y finalmente estará a discreción dei método o personal clínico que esté a cargo. Sin embargo, en general , una dosis adecuada estará en la escala aproximada de 0.5 a 100 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente de 1 0 a 75 mg/kg de peso del cuerpo, por día, tal como de 3 a alrededor de 50 mg por kilogramo de peso del cuerpo del receptor, por d ía, de preferencia en la escala de 6 a 90 mg/kg/día; muy preferible, en la escala de 15 a 60 mg/kg/día. Se administra convenientemente la sustancia en forma de dosis unitaria, por ejemplo, que contiene de 5 a 1000 mg, convenientemente de 10 a 750 mg , muy conveniente, de 50 a 500 mg del ingrediente activo, por forma de dosis unitaria.

Idealmente, la sustancia debe ser administrada para obtener concentraciones pico en el plasma de alrededor de 0.5 a 75 EJEMPLOS Los puntos de fusión no están corregidos. Se registró los espectros de RMN con 1H usando un espectrómetro Varían Mercury 300 en DMSO-d6 o en CDCI3. Están informadas las desviaciones químicas en partes por millón (ppm) con tetrametilsilano (TMS) como norma interna a cero ppm. Están dadas las constantes de acoplamiento (J) en hertz y las abreviaturas s, d, t, c y m se refieren a singulete (una sola banda), doblete, triplete, cuarteto y multiplete (bandas múltiples), respectivamente. Se registró los espectros infrarrojos en un espectrómetro Nicolet PROTEGE 460-IR. Se registró los datos de espectroscopia de masa en un sistema G. C. FINNIGAN MAT 95, VG 7070E-HF, con un detector de selección de masa HP 5973. Se registró los espectros UV en BECKMAN DU 7400 y usando MeOH como solvente. Se llevó a cabo la cromatografía en capa delgada (TLC) en una placa de gel de sílice previamente revestida (Silica Gel KGF, Whitman Inc.). Se usó gel de sílice (200-400 mallas, Whitman Inc.) para todas las separaciones mediante cromatografía en columna. Todas las sustancias químicas fueron de calidad de reactivo y fueron adquiridas de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl, E. U. A.) o de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, E. U. A.). En el ejemplo 1 se describe la síntesis de un compuesto representativo de la fórmula I. Se puede preparar otros compuestos de la fórmula I usando procedimientos similares a los descritos en el ejemplo 1.

EJEMPLO 1 SÍNTESIS QUÍMICA Y CARACTERIZACIÓN DE 4-(4'- HIDROXIFENI 1AMINO-6.7-DIMETOXIQUINAZOLINA (6) CuSOi (1) m POClj <4 Se trató ácido 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzoico (1) con cloruro de tionilo y luego se hizo reaccionar con amoniaco para dar 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzamida (2) como lo describieron F. Nomoto y coautores, Chem. Pharm. Bull., 1990, 38, 1591-1595. Se redujo el grupo nitro del compuesto (2) con borohidruro de sodio en presencia de sulfato de cobre (véase C. L. Thomas, Catalytic Processes and Proven Catalysts, Academic Press, Nueva York, E. U. A. (1970)) para dar 4,5-dimetoxi-2-aminobenzamida (3), que fue ciclizada poniéndola al reflujo con ácido fórmico para dar 6,7-dimetoxiquinazolin-4(3H)ona (4). Se dejó al reflujo el compuesto (4) con oxitricloruro de fósforo para dar el compuesto (5), que es un intermediario útil en la preparación de compuestos de la fórmula l en los que X es NH. La reacción del compuesto (5) con la anilina requerida provee los siguientes compuestos de la fórmula I: rR3 y R4 juntos son benzo.

Usando un procedimiento simi lar al descrito arriba, o usando proced imientos que son conocidos en la técnica, para preparara otros compuestos de quinazol ina, se puede preparar los compuestos de la fórmula I . Por ejemplo, se puede preparar compuestos de la fórmula I en los que X es S , O o CH2, a partir de un compuesto de la fórmula (5) med iante una reacción como la q ue se ilustra en la Figura 1 .

EJ EMPLO 2 I DENTI FI CACIÓN DE I NHI BI DORES S ELECTIVOS DE JAK-3 CONSTRUCCIÓN D E UN MODELO D E HOMOLOGÍA PARA EL DOM I N IO JAK3-CINASA. Se construyó un modelo de homología para JAK-3, como lo describieron E. A. Sudbeck y coautores, Clinical Cáncer Research, 199, 5, 1569-1 582. Debido a que las coordenadas tridimensionales del dominio JAK3-cinasa son desconocidas actualmente, se necesitó de un modelo estructural de JAK3 para un análisis de anclaje de los inhibidores de JAK3. Se construyó un modelo de homolog ía de JAK3 (figura 2) usando coordenadas conocidas de dominios homólogos de cinasa como referencia. Se construyó el modelo de homología de JAK3 obteniendo primero la secuencia de proteínas de JAK3 (Swiss-Prot #P52333, U niversidad de Ginebra, Ginebra, Suiza) del GenBank (National Center for Biotechnology I nformation, Bethesda, MD) y determinando la alineación de secuencia más razonable para el dominio JAK3-cinasa , con relación a alg unas coordenadas de planti lla (conocidas como estructuras de cinasa , como H CK, FG FR e I RK (Sicheri, F. y coa utores , Nature, 385: 602-9, 1997; Mohammad i M. y coautores, Cell 86: 577-87, 1996; Mohammad i , M y coautores, Science, 276: 955-60, 1 997; y Hubbard , S. R. y coautores , Nature, 372: 746-54, 1 994) . Se logró esto sobreponiendo primero las coordenadas Ca de los domin ios de cinasa de HCK, FG FR e I RK, usando el programa I ns ig h 11 para dar la mejor comparación de estructura general ( i ns ig ht I I , Molecular Simulations Inc. , San Diego, CA, 1996). Luego se alineó las secuencias con base en la sobreposición de sus estructuras (las secuencias de aminoácido fueron alineadas juntas, si sus posiciones de Ca estuvieron relacionadas espacialmente entre sí). La alineación acomodó aspectos tales como los rizos en una proteína que diferían de las demás secuencias de proteína. Se llevó a cabo la sobreposición estructural usando el mód ulo de homología del programa Insightl l y una computadora Silicon Graphics I ND IGO2 (Silicon Graphics, Mountain View, CA, E. U . A.). Se efectuó manualmente la alineación de secuencias y se prod ujo un perfil de variación de secuencia para cada posición Ca sobrepuesta. El perfil de variación de secuencia sirvió como base para la alineación subsecuente de secuencias de la JAK3-cinasa, con las otras tres proteínas. En este procedimiento se incorporó la secuencia de JAK3 en el programa y se alineó con las tres proteínas de cinasa conocidas, con base en los perfiles de variación de secuencia descritos previamente. A continuación se asig nó una serie de coordenadas tridi mensionales a la secuencia de JAK3 usando las coordenadas trid imensionales de H CK como plantilla y el módulo de homolog ía dentro del programa I nsightl l . Se seleccionó las coordenadas para una región de rizo donde ocurre una inserción de secuencia (con relación a HCK sin el rizo), de entre un número limitado de posibilidades, generadas automáticamente por el programa de computadora, y se aj ustó manualmente a una geometría más ideal, usando el programa CHAI N (Sack, J . S. , J. Mol. Graphics, 6: 244-245, 1988). Finalmente se sometió el modelo construido del dominio de JAK3-cinasa a red ucción al mínimo de energía, usando el programa X-PLOR, de manera que se pud iera aliviar cualqu ier esfuerzo estérico introducido durante el proceso de formación de modelo (Brünger, A. T. X-PLOR, A System for X-ray Crystallography and NMR). Se seleccionó el modelo para contactos estéricos desfavorables y, de ser necesario, se remodeló d ichas cadenas laterales, usando una base de datos de banco de rotámeros, o haciendo girar manualmente las cadenas laterales respectivas. Se repitió el procedimiento para la construcción del modelo de homología para JAK1 (SWISS-PROT #P23458) y JAK2 (Genbank #AF005216) usando el modelo JAK3 como una plantilla estructural. Luego se usó los modelos de homología de energía reducida al mínimo, de JAK1 , JAK2 y JAK3, conjuntamente con los modelos estructurales, de energía reducida al mínimo, de los compuestos de dimetoxiquinazolina, para estudios de formación de modelo de los complejos JAK/dimetoxiquinazolina.

PROCEDIMIENTO DE ANCLAJE USANDO EL MODELO DE HOMOLOGÍA DEL DOMINIO JAK3-CINASA. Se logró la formación de modelo de los complejos JAK3/dimetoxiquinazolina usando el modelo de anclaje dentro del programa INSIGHTII, y usando la serie de programas Affinity para anclar automáticamente un inhibidor en un sitio de unión de proteína (un procedimiento similar para EGFR y BTK fue descrito previamente; véase Ghosh, S. y coautores, Clin. Can. Res., 4: 2657-2668, 1998; Mahajan, S. y coautores, J. Biol. Chem., 274: 9587-9599, 1999). Se evaluó las diversas posiciones ancladas de cada compuesto usando un procedimiento de marcación de Ludi (Bohm, H. J. y coautores, J. Comput. Aided Mol. Des. ,8: 243-56, 1994), en INSIGHTII, que estimó una constante de unión, K¡, teniendo en cuenta la unión de hidrógeno lipófila predicha, y las interacciones de van der Waals, entre el inhibidor y la proteína. Se efectuó una comparación de los residuos de sitio catalítico de varios PTK diferentes, manualmente, sobreponiendo las coordenadas de estructura cristalina de los dominios de cinasa de IRK y HCK, y los modelos de JAK1, JAK2, JAK3, BTK y SYK, y luego identificando aspectos en el sitio activo, que fuera únicos para JAK3 (figura 3 y figura 4).

SÍNTESIS QUÍMICA DE DERIVADOS DE QUINAZOLINA. Se sintetizó los compuestos que aparecen en la lista del Cuadro 1 , y se los caracterizó utilizando procedimientos de la literatura (Rewcastle, G. W. y coautores, J. Med. Chem., 38: 3482-7, 1995).

CUADRO 1 INTERACCIÓN DE QUINAZOLINAS PROTONADAS CON EL SITIO ACTIVO JAK3-CINASA Y VALORES DE INHIBICIÓN MEDIDOS (VALORES Cl n DE LOS ANÁLISIS DE JAK3-CINASA CUADRO 1 (continuación) ANÁLISIS DE CINASA EN COMPLEJO INMUNOLÓGICO. Se obtuvo células Sf21 (IPLB-SF21-AE) (Vassilev, A. y coautores, J. Biol. Chem. 2. A: 1646-1656, 1999), derivadas dei tejido de los ovarios del gusano medidor de otoño Spodoptera frugiperda, de Invitrogen (Carlsbad, CA, E. U. A.) y se mantuvo a 26-28°C en un medio de células de insecto de Grace, suplementado con 10% de FBS y 1.0% de antibiótico/antimicótico (GIBCO-BRL). Se mantuvo las células de almacén en suspensión a 0.2-1.6 x 106/ml en 600 ml de volumen total de cultivo en matraces de centrífuga Bélico de 1 litro, a 60-90 r.p.m. Se mantuvo la viabilidad a 95-100% según se determinó mediante exclusión de tinta azul tripano. Se infectó las células Sf21 con un vector de expresión de baculovirus para BTK, SYK, JAK1, JAK2 o JAK3. Se cosechó las células, se las sometió a lisis (10 mM de Tris, pH 7.6; 100 mM de NaCI, 1% de Nonidet P-40, 10% de glicerol, 50 mM de NaF, 100 µM de Na3VO4, 50 µg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 µg/ml de aprotonina, 10 µg/ml de leupeptin), se inmunoprecipitó las cinasas de los lisatos y se analizó su actividad enzimática, como se informó (Vassilev, A. y coautores, J. Biol. Chem., 2 : 1646-1656, 1999; Uckun, F. M. y coautores, Science, 22: 1096-1100, 1996; Goodman, P. A. y coautores, J. Biol. Chem., 273: 17742-48, 1998; Mahajan, S. y coautores, Mol. Cell. Biol., 15: 5304-11, 1995; y Uckun, F. M. y coautores, Science, 267: 886-91, 1995). Se sometió los inmunoprecipitados a análisis de mancha de Western, como se describió previamente (Vassilev, A. y coautores, J. Biol. Chem., 274: 1646-1656, 1999; y Uckun, F. M. y coautores, Science, 22: 1096-1100, 1996). Para los análisis de cinasa de receptor de insulina (IRK), se desarrolló células de hepatoma humano HepG2 aproximadamente a 80$ de confluencia; se las lavó una vez con DMEM libre de suero y se las agotó durante tres horas a 37°C en un incubador de CO2. Subsecuentemente se estimuló las células con insulina (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN, E. U. A., número de catálogo CP-410; 10 unidades/ml/10 x 106 células) durante 10 minutos a la temperatura ambiente. Después de este paso de activación de IRK, se lavó las células una vez con medio libre de suero, se las sometió a lisis en regulador NP-40 y se inmunoprecipitó la IRK a partir de los lisatos con un anticuerpo anti-IRß (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, E. U. A., número de catálogo sc-711, IgG policlonal). Antes de efectuar los análisis de cinasa de complejo inmunológico, se equilibró los glóbulos con el regulador de cinasa (30 mM de Hepes, pH 7.4, 30 mM de NaCI, 8 mM de MgCI2, 4 mM de MnCI2). Se inmunoprecipitó LYN desde los lisatos de células enteras de células de leucemia humana NALM-6, como se informó previamente (Uckun, F. M. y coautores, Science, 267: 886-91, 1995; y Uckun, F. M. y coautores, Journal of Biological Chemistry, 271: 6396-6397, 1996). En los análisis de cinasa en complejo inmunológico de JAK3 /17.22), se sometió a lisis células linfoblastoides B humanas, transformadas con KL-2 EBV (análisis de JAK3-cinasa natural) o células de ovario de insectos (análisis de JAK3-cinasa recombinante) con regulador de lisis NP-40 (50 mM de Tris, pH 8, 150 mM de NaCI, 5 mM de EDTA, 1% de NP-40, 100 µM de ortovanadiato de sodio, 100 µM de molibdato de sodio, 8 µg/ml de aprotinina, 5 µg/ml de leupeptin y 500 µM de PMSF) y se centrifugó durante 10 minutos a 13000 x g, para eliminar el material insoluble. Se inmunoprecipitó muestras con antisueros preparados contra JAK3. Se diluyó los antisueros y se recogió los complejos inmunológicos mediante incubación con 15 µl de proteína A- Sepharose. Después de lavar cuatro veces con regulador de lisis NP-40, se lavó los glóbulos de proteína A-Sepharose una vez en regulador de cinasa (20 mM de MOPS, pH 7, 10 mM de MgCI2) y se volvió a suspender en el mismo regulador. Se inició las reacciones mediante la adición de 25 µCi[?-32P]ATP (5000 Ci/mMol) y ATP sin marcar una concentración final de 5 µM. Se terminó las reacciones poniendo a ebullición durante 4 minutos en regulador de muestra SDS. Se operó las muestras en 9.5% de geles de poliacrilamida SDS y se detectó las proteínas marcadas por autorradiografía. Después de electroforesis, se secó los geles de cinasa sobre papel filtro Whatman 3M, y se los sometió a fosforimaginería en un formador de imagen molecular (Bio-Rad, Hercules, CA, E. U. A.), así como autorradiografía sobre película. Para cada concentración de fármaco se determinó un índice de actividad de cinasa (KA) comparando la actividad de cinasa en unidades de fosfoimaginería (PIU), con la muestra de línea básica. En algunos experimentos se efectuó análisis de cinasa en frío, como se describió por Uckun, F. M. y coautores, Clin. Can. Res., 4: 901-912, 1998). ANÁLISIS DE DESVIACIÓN DE MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA (EMSA). Se efectuó EMSA para examinar los efectos de compuestos de dimetoxiquinazolina sobre la activación de STAT inducida por citocina en células 32Dc11/IL2Rß (obsequio del doctor James Ihle, St. Jude Children's Research Hospital), como fue descrito previamente (Goodman, P. A. y coautores, J. Biol. Chem., 273: 17742-48, 1998). DETERMINACIÓN POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCÓNDRICA. Para medir los cambios en los mitocondrios, se incubó células con WHI-P131 a concentraciones que van desde 7.4 µg/ml (25 µM) a 30 µg/ml (200 µM) durante 24 horas o 48 horas, se tiñó con tintes fluorescentes específicos y se analizó con un citómetro de flujo. Se midió ei potencial de membrana mitocóndrica (??m) usando dos tintes, que incluyen un catión lipófilo, yoduro de 5, 5', 5,5'-tetracloro-1 ,1 \3,3'-tetraetilbencimidazolilcarbocianina (JC-1) y un tinte de cianina, yoduro de 1 , 1 ',3,3,3', 3'-hexametilindodicarbocianina (DÍIC1 (27-29)) obtenido de Molecular Probes (Eugene, OR, E. U. A.). JC-1 es un monómero a 527 nm después de haber sido excitado a 490 nm; con polarización de (??m), se forman agregados J que desplazan o desvían la emisión a 590 nm (30). Se puede detectar esto en un citómetro de flujo, determinando la señal verde (a 527 nm) y la señal verde-naranja (a 590 nm) simultáneamente, creando un índice del número de mitocondrios polarizados y despolarizados de las células. Di I C1 , un tinte de cianina que es anfioateico y catiónico, se concentra en los mitocondrios energizados y ha sido usado en una variedad de estudios para medir el potencial de membrana mitocóndrica (Fujii, H. y coautores, Histochem J., 29: 571-581, 1997; Mancini, M. y coautores, J. Cell Biol., 138: 449-469, 1997; y Petit, P. X. y coautores, J. Cell Biol., 130, 157-167, 1995). También se manchó células con DMC1 a 40 nM de concentración durante 30 minutos en la oscuridad, como se describió para JC1. Se analizó las células usando un clasificador de células Vantage Becton Dickinson (San José, CA, E. U. A.), equipado con láser de HeNe, con excitación a 635 nm y se recogió la fluorescencia a 666 nm. DETERMINACIÓN DE MASA MITOCONDRIANA. Se midió la masa mitocondriana relativa usando citometría de flujo Becton Dickinson Calibur, y teñido fluorescente con 10-n-nonilacridina naranja (NAO), que se une a cardiolipin, un fosfolípido mitocóndrico, que ha sido usado extensamente para dar un índice de masa mitocondriana (Maftah, A. y coautores, Biochem. Biophys. Res. Commun., 164: 185-190, 1989).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN PARA EL EJEMPLO 2 MODELO DE HOMOLOGÍA DEL DOMINIO JAK3-CINASA. Se construyó las coordenadas tridimensionales de TAK3 usadas en los estudios de formación de modelo de proteína/inhibidor, con base en una alineación estructural con las secuencias de estructuras cristalinas conocidas de los dominios de cinasa de tres proteínas tirosina-cinasas (PTK) (dominios de cinasa de HCK (9), FGFR (11) e IRK (37)), como se detalle en Materiales y Métodos. Las figuras 2A y 1B muestran el modelo de homología del dominio JAK3-cinasa, que está compuesto de un lóbulo N-terminal y un lóbulo C-terminal, que están enlazados mediante una región de gozne, cercano al sitio catalítico (que se une a ATP). El sitio catalítico es un receptáculo localizado en la región central del dominio de cinasa, que está definido por dos láminas beta en la interfaz entre los lóbulos N y C. La abertura al sitio catalítico es accesible al solvente y facilita la unión de ATP. Los inhibidores de molécula pequeña también pueden unirse al sitio catalítico que da por resultado una atenuación de la actividad de PTK inhibiendo la unión de ATP. Un análisis del modelo JAK3 reveló aspectos específicos del sitio catalítico que se pueden describir como un receptáculo en forma de cuadrilátero (figura 2C). La abertura del receptáculo está definida por los residuos Pro906, Ser907, Gly908, Asp912, Arg953, Gly829, Leu828 y Tyr904 (residuos azules, fig ura 2C). La pared lejana, profunda dentro del receptáculo, está revestida con Leu905 (estructura Ca), Glu903, Met902, Lys905 y Asp967 (residuos rosas, Figura 2C) y el piso del receptáculo está revestido con Leu905 (cadena lateral), Val884, Leu956 y Ala9656 (residuos amarillos, Figura 2C). Los residuos que definen el techo del receptáculo incluyen: Leu828, Gly829, Lys830 y Gly831 (residuos azules de más arriba , figura 2C). La figura 2C y la figura 3A ilustran el sitio catalítico del modelo JAK3, que tiene dimensiones aproximadas de 8 x 1 1 x 20 Á y un volumen disponible para unión de aproximadamente 530 Á3. Conforme al modelo, la abertura expuesta a solvente hacia la región de unión permitiría que entraran los inhibidores y se unieran si la molécula contiene alguna planalidad. Aunque la mayoría de los residuos de sitio catalítico del dominio JAK3-cinasa se conservaron con respecto a otras PTK, se observó unas cuantas variaciones específicas (figura 4). Estas diferencias incluyen un residuo alanina en BTK, I RK y HCK/LYN (región A, figura 4A), que cambia a Glu en SYK y Pro906 en JAK3. En la región B se conserva un residuo tirosina en JAK3 (Tyr904), BTK y LYN, pero cambia a Phe en HCK (que es la única diferencia de residuo aparente entre HCK y LYN, relevante para la unión de in h ibidor), Met en SYK y Leu en I RK. La región C muestra un resid uo metionina que se conserva en BTK, I RK y H CK/LYN , pero cambia a Leu905 en JAK3 y a Ala en SYK. La región D muestra Met902 en JAK3, que se conserva en SYK e IRK, pero q ue cambia a Thr en BTK y a un residuo mucho menor, Ala, en LYN y HCK. Este resid uo Met902 en JAK3, que está localizado en la pared posterior del receptáculo y sobresale hacia el centro del volumen del receptáculo puede afectar significativamente la forma del receptáculo de unión . En esta localización, la conformación extendida de la cadena lateral de Met902 puede imped ir el contacto íntimo de los inhibidores con los residuos que cubren la pared posterior del receptáculo y con la región de gozne, en relación con otras cinasas con menores residuos aquí, como BTK (Thr) y HCK/LYN (Ala). Se conserva Ala966 en la región E en HCK/LYN, pero cambia a Gly en I RK y al residuo Ser más hidrófilo en BTK y SYK. La región F, que está más lejana de la ubicación de inhibidor, es la región menos conservada del sitio catalítico y contiene Asp912 en JAK3, Asn en BTK, Lys en SYK, Ser en I RK y Asp en HCK/LYN (figura 4). Estas diferencias de identidad en los residuos, entre las tirosina-cinasas, proveen la base para el diseño de inhibidores selectivos del dominio JAK3-cinasa. D ISEÑO BASADO EN LA ESTRUCTU RA Y SÍNTESIS DE I NH I BI DORES DE JAK3. Se usó un procedimiento de anclaje por computadora para predecir cómo podrían ajustara bien los inhibidores potenciales y cómo se podrían unir al sitio catalítico de JAK3 y dar por resultado la inhibición de cinasa (figura 3B). El compuesto de dimetoxiquinazolina SHI-P258 (4-(fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina) contiene dos grupos metoxi en la porción quinazolina, pero sin otro sustituyente de anillo. Los estudios de formación de modelo molecular usando el modelo de homología del dominio JAK3-cinasa sugirieron que WHI-P258 ajustaría dentro del sitio catalítico de JAK3, pero probablemente no se uniría muy apretadamente debido a las interacciones limitadas de unión de hidrógeno. Asp967, un residuo clave en el sitio catalítico de JAK3 puede formar una ligadura hidrógeno con moléculas que se unen al sitio catalítico, si dichas moléculas contienen un grupo donador de unión de hidrógeno, tal como un grupo OH. Sin embargo, WHI-P258 no contiene un grupo OH y por lo tanto, no interactúa de manera tan favorable con Asp967. Se postuló que la presencia de un grupo OH en la posición 4' del anillo de fenilo de WHI-P258 daría por resultado una unión más fuerte a JAK3 debido a las interacciones adicionales con Asp967. Se diseñó una serie de compuestos de dimetoxiquinazolina y se los sintetizó para probar esta hipótesis. En el cuadro 1 está dada una estimación del volumen molecular para los compuestos. En la figura 3C está mostrado un sumario de los aspectos estructurales de los compuestos de dimetoxiquinazolina diseñados, que se observó que eran relevantes para unión al sitio catalítico de JAK3. Los volúmenes moleculares aproximados de los compuestos del cuadro 1 varían desde 252Á a 307Á, que son suficientemente pequeños para ajustar en el sitio de unión, de 530 Á3 de la JAK3-cinasa. El cuadro 1 también tiene la lista de los resultados de estudios de modelo molecular, que incluyen constantes de unión estimados (o sea, valores K^ para los compuestos que fueron anclados en el sitio catalítico de JAK3. Los compuestos que fueron evaluados en estudios de anclaje contienen sustituciones de grupos funcionales similares, en diferentes posiciones en el anillo de fenilo. Las conformaciones de los modelos anclados, con energía reducida al mínimo, de los compuestos que aparecen en la lista del cuadro 1, fueron relativamente planas, con ángulos diédricos de aproximadamente 4-18° entre el sistema de anillo de fenilo y anillo de quinazolina. Esta conformación permite que la molécula ajuste más fácilmente en el sitio catalítico de JAK3. Todos los compuestos de la lista contienen un nitrógeno de anillo (N1), que puede formar una ligadura de hidrógeno con NH de Leu905 en la región de gozne de JAK3. Cuando N1 está protonado, el NH más bien puede interactuar con el grupo carbonilo en Leu905 de JAK3. La presencia de un grupo OH en la posición 4' del anillo de fenilo fue anticipada como particularmente importante para el sitio catalítico de JAK3. Se predijo que WHI-P131 (K, estimado = 2.3 µM), WHI-P154 (Ki estimado = 1.4 µM) y WHI-P97 (Ki estimado = 0.6 µM) mostrado en el cuadro 1, tenían unión favorable a JAK3 y actividad potente inhibidora de JAK3 debido a que contenían un grupo 4'-OH en el anillo de fenilo, que puede formar una ligadura de hidrógeno con Asp967 de JAK3, lo que contribuye a acrecentar la unión. Sin embargo, el grupo 2'-OH de WHI-P132 no está en la orientación correcta para ¡nteractuar con Asp967 y probablemente formaría una ligadura intramolecular de hidrógeno con el nitrógeno del anillo de quinazolina, io que puede contribuir a disminuir significativamente la afinidad de WHI-P132 para el sitio catalítico de JAK3. Los sustituyentes de bromo relativamente grandes (WHI-97, WHI-P154) pueden aumentar el área de superficie molecular en contacto con los residuos del sitio de unión si la molécula puede ajustar dentro del sitio de unión. La formación de modelo de WHI-P154 y WHI-P97 mostró que hay suficiente espacio para acomodar los grupos bromo si se inclina ligeramente el anillo de fenilo con relación al grupo de anillo fundido de la molécula. Los- resultados de los estudios de formación de modelo permitieron la hipótesis de que WHI-P131, WHI-P154 y WHI-P97 podría exhibir potente actividad inhibidora de JAK3. A fin de probar esta hipótesis y validar el valor de predicción del modelo de homología JAK3 descrito, se sintetizó WHI-P131, WHI-P154, WHI-P97 y otros cinco compuestos de dimetoxiquinazolina, mencionados en la lista del cuadro 1. INHIBICIÓN DE JAK3 POR COMPUESTOS DE DIMETOXIQUINAZOLINA DISEÑADOS RACIONALMENTE. Se usó primeramente análisis de cinasa de complejo inmunológico para comparar los efectos de los compuestos de dimetoxiquinazolina sintetizados, sobre la actividad enzimática de JAK3 humana, inmunoprecipitada desde la línea de células de Iinfoblastoide B humano, transformada con KL2 EBV. WHI-P131, WHI-P154 Y WHI-P97, que tuvieron valores K¡ estimados, similares, que varían de 0.6 µM a 2.3 µM y que se predijo que mostrarían actividad inhibidora de JAK3 significativa a concentraciones micromolares (lo que no sucede con los demás compuestos que tuvieron valores K¡ estimados que van de 25 µM a 72 µM), inhibieron JAK3 de una manera que depende de la concentración. Los valores Clso medidos fueron 9.1 µM para WHI-P131, 11.0 µM para WHI-P97 y 27.9 µM para WHI-P154, pero >300 µM para todos los demás compuestos de dimetoxiquinazolina (cuadro 1). También se probó WHI-P131 y WHI-P154 contra JAK3 de múrido recombinante, expresada en un sistema de expresión en vector de baculovirus, e inhibió JAK3 en una forma que depende de la concentración, con un valor CI5o de 23.2 µg/ml (alrededor de78 µM, figura 5A) y 48.1 µg/ml (alrededor de 128 µM, figura 5B), respectivamente. Se confirmó la capacidad de WHI-P131 y de WHI-P154 para inhibir JAK3 recombinante, en cuatro experimentos independientes. Estos resultados de análisis de cinasa son consistentes con estos estudios de formación de modelo, descritos más arriba. Es importante que WHI-131 y WHI-P154 no exhibieron ninguna actividad inhibidora detectable contra JAK1 o JAK2 recombinantes, en análisis de cinasa en complejo inmunológico (figuras 5C y 5D). También se efectuó análisis de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) para confirmar la especificidad de JAK3 de estos compuestos de dimetoxiquinazolina, examinando sus efectos sobre la activación de STAT inducida por citocina, en células 32Dc11/IL2Rß. Como se muestra en la figura 5E, tanto WHI-P131 (10 µg/ml = 33.6 µM) y WHI-P154 (10µg/ml = 26.6 µM) (pero no el compuesto de control WHI-P132, 10 µg/ml = 33.6 µM), inhibieron la activación de STAT dependiente de JAK3, después de estímulo con IL-2, pero no afectaron la activación de STAT dependiente de JAK1/JAK2, después de estímulo con IL-3. Los estudios de formación de modelo sugieren que esta especificidad exquisita para JAK3 podría deberse, en parte, a un residuo alanina (Ala966) que está presente en el sitio catalítico de JAK3, pero que cambia a glicina en JAK1 y JAK2. Este grupo alanina, que está en una posición cercana al anillo de fenilo de los compuestos de dimetoxiquinazolina unidos, puede proveer mayor contacto hidrófobo con el grupo fenilo y, de tal manera, puede contribuir a una mayor afinidad con relación al residuo glicina, menor, en esta región del sitio de unión en JAK1 y JAK2. Sin embargo, una interpretación precisa de estas diferencias notables en la sensibilidad de JAK3 contra JAK1 y JAK2 a WHI-131 Y WHI-P154, necesitará esperar la determinación de las estructuras cristalinas de rayos X de estas cinasas, puesto que las simples discrepancias en aminoácidos en sus sitios catalíticos podría dar por resultado diferencias estructurales pronunciadas. ESPECIFICIDAD DE WHI-P131 COMO INHIBIDOR DE TIROSINA-CINASA. Se seleccionó el compuesto WHI-P131 para experimentos adicionales diseñados para examinar la sensibilidad de la proteína tirosina-cinasa que no es de la familia Janus, a esta clase novedosas de dimetoxiquinazolina, de inhibidores de JAK3. La actividad inhibidora de WHI-P131 contra JÁK3 fue específica, puesto que no afectó la actividad enzimática de otras proteínas tirosina-cinasas (Cuadro 1, figura 6), incluyendo la tirosina-cinasa SYK de la familia ZAP/SYK (figura 6C), la tirosina-cinasa BTK de la familia TEC (figura 6D), la tirosina-cinasa LYN de la familia SRC (figura 6E) y la tirosina-cinasa IRK de la familia receptora (figura 6F), aun a concentraciones de hasta 350 µM. Se llevó a cabo un análisis estructural de estas PTK usando las estructuras cristalinas de HCK (que sirvieron como modelo de homología para LYN) e IRK, y modelos de homología construidos de JAK3, BTK y SYK. Este análisis reveló algunos residuos no conservados localizados en el sitio de unión catalítico de las diferentes tirosina-cinasas, que pueden contribuir a la especificidad de WHI-P131 (figura 4). Uno de dichos residuos, que está localizado más cerca de los inhibidores anclados es Ala966 en JAK3 (mostrada en la región E de la figura 4), que puede proveer el contacto superficial molecular más favorable, con el anillo de fenilo hidrófobo de WHI-P131. El hecho de que WHI-P131 no inhiba LYN, ni siquiera cuando LYN contiene el residuo Ala conservado en JAK3 (Ala966), sugiere que otros factores (diferencias de residuo) contribuyen a esta selectividad. Otros residuos no conservados en el sitio catalítico de tirosina-cinasas están mostrados en las regiones A a F (figura 4). Todas estas diferencias en los residuos, especialmente los residuos que hacen contacto directamente con el inhibidor unido, pueden jugar un papel importante en la especificidad observada de WH I-P131 para JAK3. El ejemplo 2 demuestra que un modelo de homología novedoso del dominio JAK3-cinasa puede ser usado para un diseño basado en la estructura y la síntesis de in hibidores potentes y específicos de JAK3. Finalmente, el modelo de homología indica singularmente que el sitio activo de JAK3 mide aproximadamente 8Á x 1 1 Á x 20Á, con un volumen aproximado de 530 Á3 disponible para la unión de inhibidor. .Los estudios de modelo de la presente, usando el modelo de homología construido de JAK3-cinasa, también mostraron que hay oportunidad significativa para la mejora de los inhibidores de q uinazolina. El modelo JAK3 muestra que hay volumen adicional en el sitio de unión de ATP que puede ser utilizado mejor por los derivados de quinazolina. El volumen molecular promedio de los compuestos de dimetoxiquinazolina de la presente es 277Á3, que es bastante inferior al volumen total estimado del sitio de unión de 530 Á3. Esto deja oportunidad para el diseño de nuevos inhibidores que tienen grupos funcionales ligeramente mayores en las posiciones 2' y 3' del anillo de fenilo. Los aspectos estructurales y químicos de los compuestos de dimetoxiquinazolina que están propuestos para facilitar su unión al sitio catalítico Jak3, incluyen los siguientes aspectos, que están ilustrados en la figura 3C: 1 ) La presencia de un grupo 4'-OH en el anillo de fenilo; 2) la presencia de un receptor de unión de hidrógeno (N, carbonilo, OH) cerca del NH de Leu905, o un donador de unión de hidrógeno (NH, OH), cerca del carbonilo de Leu905; 3) una forma molecular relativamente plana para permitir acceso al sitio de unión; 4) la capacidad para ajustar en un espacio de 530Á3 definido por los residuos que revisten el sitio catalítico Jak3. Estas preferencias de unión predichas para los residuos JAK3 en el sitio catalítico, pueden ser usadas para el diseño de nuevos y más potentes inhibidores de JAK3. Se puede determinar la capacidad de un compuesto para actuar como un agente antileucémico usando análisis similares a los descritos en el ejemplo 3.

EJEMPLO 3 ANÁLISIS DE LEUCEMIA Se usó las siguientes líneas de células en diversos análisis biológicos: NALM-6 (pre-B-ALL), LC1; 19 (Pre-B-ALL), DAUDI (B-ALL), RAMOS (B-ALL), MOLT-3 (T-ALL), HL60 (AML), BT-20 (cáncer de mama), M24-MET (melanoma), SQ20B (carcinoma de célula escamosa) y PC3 (cáncer de próstata). Se mantuvo estas líneas de células en cultivo, como se informó previamente (16, 17, 20, 24, 32, 33). Se sembró las células en placas de cultivo de tejido de 6 concavidades, a una densidad de 50 x 104 células/concavidad, en un medio de tratamiento que contiene diversas concentraciones del compuesto 6, y se incu bó durante 24 a 48 horas a 37°C en una atmósfera de CO2 con 5% de humedad . Para probar la citotoxicidad del compuesto 6 contra células de leucemia humana que expresan JAK3 se expuso las células leucémicas a este inhibidor de JAK3 y se vigiló los cambios asociados con la apoptosis, en el potencial de membrana mitocóndrica (??m) y la masa mitocondriana, usando sondas de mitocondrio fluorescentes, específicas, y citometría de flujo de parámetros múltiples. Para med ir los cambios en ??m, se usó DÍ I C1 (que se acumula en mitocondrios energizados) mientras que se determinó la masa mitocondriana tiñendo las células con NAO, un tinte fluorescente que se une a la membrana interior mitocóndrica, independientemente del estado energético. El tratamiento de células de leucemia NALM-6 con el compuesto 6 a 7.4 µg/ml (25 µM) a 60 µg/ml (200 µM) durante 24 horas o 48 horas, aumentó el número de mitocondrios despolarizados de una manera que depende de la concentración y del tiempo, como se determina mediante citometría de flujo, usando DMC1 (27-29)(figura 7A). Como se muestra en la figura 7A, la fracción de células DM C1 -negat¡vas, con mitocondrios despolarizados aumento de 1 .3% en células de control tratadas con vehículo, a 81 .6% en células tratadas con 200 µM del compuesto 6 d urante 48 horas. Los valores CE50 promedio para el compuesto 6 indujeron despolarización de los mitocondrios, cuando se midió por tinción de DÍ IC1 disminuida, fueron 79.3 µM para un tratamiento de 24 horas y 58.4 µM para un tratamiento de 48 horas. Los cambios observados en ??m no se debieron a la pérdida de masa mitocondriana, como se confirmó por una intensidad de tinción virtualmente idéntica de NAO en las células de NALM-6 tratadas y sin tratar (figura 7B). Para confirmar adicionalmente este cambio relativo en ??m se usó JC-1, un tinte mitocondriano, que existe normalmente en solución como un monómero que emite fluorescencia verde, y asume una configuración dimérica que emite fluorescencia roja en una reacción impulsada por el potencial de transmembrana mitocóndrica (Smiley, S. T. y coautores, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 88: 3671-3675, 1991). Así, el uso de JC-1 permite el análisis simultáneo de masa mitocondriana (fluorescencia verde) y potencial de transmembrana mitocóndrica (fluorescencia roja/naranja). Después del tratamiento de las células NALM-6 con el compuesto 6, a concentraciones en aumento que van desde 25 µM a 200 µM y con un tiempo de exposición que aumenta de 24 horas o 48 horas, se observó una disociación progresiva entre ??m y la masa mitocondriana, con disminución en la fluorescencia roja/naranja de JC-1, sin una caída correspondiente, significativa, en la fluorescencia verde de JC-1 (figura 7, C y D). Como se muestra en la figura 7C, la fracción de células negativas a la fluorescencia roja/naranja de JC-1 disminuyó de 79.2% en las células de control tratadas con vehículo, a 16.9% en células tratadas con 200 µM de compuesto 6 durante 48 horas. Los valores correspondientes para la fluorescencia verde de JC-1 fueron 99.3% para células tratadas con vehículo y 99.8% para células tratadas con el compuesto 6 (200 µ M x 48 horas) . Los valores EC50 promedio para la despoiarización de los mitocondrios, inducida por el compuesto 6, cuando se mide por la disminución en la fluorescencia roja/naranja de J C-1 , fueron 94.2 µM para un tratamiento de 24 horas, y 50.4 µ M para un tratamiento de 48 horas. La figura 7D compara las imágenes confocales fluorescentes de un solo color (rojo/naranja) de las células NALM- tratadas con veh ículo y tratadas con el compuesto 6 (100 µM x 48 horas), manchadas con JC- 1 . Estos resultados demuestran colectivamente que el compuesto 6 provoca una disminución significativa en el potencial de transmembrana mitocóndrica de las células de leucemia humana NALM-6.

ANÁLISIS DE APOPTOSIS Se examinó las células para cambios apoptóticos después del tratamiento con el compuesto 6, mediante análisis de (TÚ NEL) de etiquetado extremo dUTP mediado por didesoxinucleotidil-transferasa terminal, in situ, usando el equipo de detección de apoptosis ApopTag (Oncor, Gaithersburg, M D, E. U . A. ), conforme a las recomendaciones del fabricante, como se detalló en los informes previos de la presente (Zhu, D.-M y coautores, Clin. Can. Res. , 4: 2967-2976, 1998; D'Cruyz, O. , P. , G y Uckun, F. M. , Biology of Reproduction, 58: 1515-1526 , 1998). Para detectar la fragmentación apoptótica del ADN se cosechó células después de 24 horas de exposición a 37°C, a concentraciones de 1 , 3 y/o 1 0 µ M . Se preparó el AD N a partir de lisatos de Triton-X- 100 para análisis de fragmentación 821 ). En breve se sometió a lisis las células en regulador hipotónico, 1 0 mmol/L de Tris-HCl (pH 7.4), 1 mmol/L de EDTA, 0.2% de detergente Triton-X- 1 00, y se centrifugó subsecuentemente a 1 1 ,000 g. Para detectar la fragmentación de ADN asociada con apoptosis, se sometió a electroforesis los sobrenadantes en u n gel de agarosa al 1.2% y se visualizó los fragmentos de ADN med iante luz ultravioleta, después de teñir con bromuro de etidio. Para confirmar que el compuesto 6 puede inducir apoptosis en células de leucemia, se empleó el etiq uetado mediado con TdT, de los extremos 3'-OH con UTP conjugada con digoxigenina, usando el método de análisis TÚNEL in situ , combinado con microscopía exploratoria con láser confocal . A las 48 horas después del tratamiento con el compuesto 6, a concentraciones que van desde 1 0 µM hasta 500 µM, se examinó las células NALM-6 para la incorporación de digoxigenina-dUTP usando anti-digoxigenina conjugada con FITC (fluorescencia verde) y contramanchando con yod uro de propidio (fluorescencia roja). El porcentaje de células apoptóticas aumentó en forma que dependía de la concentración , con un valor CE50 promedio de 84.6 µM (figura 8A). Las figuras 8B.| 1 y 8B.2 ilustran las imágenes de microscopía confocal bicolores de las células de control tratadas con vehículo y las células tratadas con 100 µM del compuesto 6. Las células tratadas con el compuesto 6 mostraron núcleos amarillos apoptóticos (= fluorescencia verde y roja sobrepuestas) (figura 8B.2). Se observó otra evidencia de apoptosis en los análisis de fragmentación de ADN. Debido a su sensibilidad exquisita para detectar fragmentos de ADN liberados de un pequeño porcentaje de células apoptóticas, los análisis en gel de ADN son singularmente adecuados para examinar la toxicidad no específica de nuevos agentes antileucémicos. La figura 9A demuestra que los sobrenadantes de células de leucemia NALM-6, tratadas con 1 µM o 3 µM del COMPUESTO 6, contenían fragmentos de ADN de longitud de oligonucleosoma, con un patrón de fragmentación "en escalera", consistente con la apoptosis; mientras que no se detectó fragmentos de ADN en los sobrenadantes de las células NALM-6, tragadas con compuestos de dimetoxiquinazolina estructuralmente similares, que carecían de actividad inhibidora de JAK3. Al contrario de las células de leucemia JAK3-positivas (células NALM-6 en la figura 9A y células LC1;19 en la figura 9B), las células de carcinoma escamoso SQ20B JAK3-negativas y las células de melanoma M24-MET no mostraron ninguna evidencia de fragmentación apoptótica de ADN después del tratamiento con el compuesto 6 (figura 9B). Tomados juntos, estos resultados produjeron evidencia experimental de que el compuesto 6, inhibidor de tirosina-cinasa, específico para JAK3, dio por resultado la despolarización de la membrana mitocóndrica y desata la muerte apoptótica en las células ALL de linaje B humanas, como se evidencia por el patrón de fragmentación en forma de escalera, del ADN nuclear y el etiquetado con digoxigenina-11-UTP del extremo 3'-hidroxilo expuesto del ADN nuclear fragmentado, en presencia de TdT.

ANÁLISIS CLONOGENICOS Se examinó la actividad antileucémica del compuesto 6 contra células de tumor clonogénicas, usando un sistema de análisis de colonia con metilcelulosa (Uckun, F. M. y coautores, J. Exp. Med., 163: 347-368, 1986; Messinger, Y y coautores, Clin. Cáncer Res., 4: 165-70, 1998). En breve, se trató células (105/ml en RPMI-10% de FBS) durante la noche a 37°C con el compuesto 6 a diversas concentraciones. Después del tratamiento se lavó dos veces las células, se las aplicó a 104 o 105 células/ml en RPMI-10% de FMS-0.9% de metilcelulosa, en platos Petri, y se cultivó durante siete días a 37°C en un incubador de CO2 al 5%, humidificado. Subsecuentemente se enumeró las colonias de células leucémicas (o células tumorales) usando un microscopio de contraste de fase invertida. Se calculó el porcentaje de inhibición de colonia usando la siguiente fórmula: número medio de colonias en cultivo de prueba % de inhibición = 1 x100 número medio de colonias en cultivo de control Se midió la actividad antileucémica del compuesto 6 determinando su capacidad para inhibir el desarrollo clonogénico in vitro de líneas de células ALL: NALM-6, DAUDI, LC1;19, RAMOS, MOLT-3 y la línea de células AML HL-60. Como se detalla en el cuadro 1, el compuesto 6 inhibió el desarrollo clonogénico en una forma que depende de la concentración, con valores CE50 de 24.4 µM para células NALM-6 y 18.8 µM para células DAUDI. A 100 µM el compuesto 6 inhibió la formación de colonia in vitro por estas líneas de células de leucemia en >99%. En contraste, el compuesto 6 no inhibió el desarrollo clonogénico del melanoma M24-MET JAK3- negativo ni de las líneas de célula de carcinoma escamoso SQ20B.

*Se trató las células con el compuesto 6 y luego se analizó para la formación de colonia, como se describió en Métodos. N.A. = no aplicable, N.D. = no determinado. En otros estudios, se mostró que el compuesto 6 inhibía JAK3 pero no otras tirosina-cinasas de proteína, incluyendo JAK2, SYK, BTK, LYN e IRK. Las células ALL expresan JAK2.

Similarmente, la familia Src PTK LYN, la familia Zap/Syk PTK SYK y la familia Tec PTK BTK son expresadas en células ALL y afectan su adhesión, proliferación y sobrevivencia (Vassilev, A. y coautores, J. Biol. Chem., 27 A: 1646-1656, 1999; Uckun, F. M. y coautores, Science, 267: 886-91, 1995; Kristupaitis, D. y coautores, J. Biol. Chem., 273(15): 9119-9123, 1998; y Xiao, J. y coautores, J. Biol. Chem., 271: 7659-64, 1996). IRK es el único miembro de la familia de receptores PTK que ha sido detectado en células leucémicas, especialmente células pre-B ALL, con una translocación t(1;19) (41-43). Puesto que el compuesto 6 no inhibe estas tirosina-cinasas, no se puede atribuir su capacidad de matar células ALL a una inhibición no específica de JAK2, LYN, SYK, BTK o IRK en estas células (Kaplan, G. C. y coautores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 159(3): 1275-82, 1989; Newman, J. D. y coautores, Int. J. Cáncer. 50(3): 500-4, 1992; Bushkin, I y Zick Y., Biochem. Biophys,. Res. Commun., 172(2): 676-82, 1990). Lo anterior muestra que un inhibidor representativo de JAK-3 de la fórmula I (compuesto 6) es un agente terapéutico útil para tratar leucemia linfoblástica aguda y demuestra que el compuesto 6 desata la apoptosis en células de leucemia. Así pues, los inhibidores potentes y específicos de JAK3, como las dimetoxiquinazolinas de la fórmula I , son útiles para tratar leucemia linfoblástica aguda, que es la forma más común del cáncer infantil. La capacidad de un compuesto para prevenir o tratar cáncer de la piel puede ser determinada usando análisis que son conocidos en la técnica, o se puede determinar usando análisis similares a los descritos en el ejemplo 4.

EJEMPLO 4 ANÁLISIS DE CÁNCER DE LA PI EL Se compró ratones albinos calvos (skh-1 ) hembras, de 6-7 semanas de edad, de Charles River Laboratories (Wilmington, MA, E. U. A.), y se alojó en un ambiente controlado (periodo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad, 22±1 °C, 60±10% de humedad relativa), que está acreditado plenamente por el USDA (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos). Se puso en jaula los animales, en grupos de cinco, en un ambiente libre de patógenos, de acuerdo con las reglas y los reglamentos de la U. S. Animal Welfare Act, y de los National Institutes of Health (N IH). Se alojó todos los ratones en jaulas microaislantes (Lab Products, Inc. , NJ, E. U. A.), que contenían lechos con autoclave. Se permitió libre acceso de los ratones al alimento en pellas tratado en autoclave al agua corriente, durante todo el experimento. Se llevó a cabo procedimientos de cuidado y experimentales con los animales, de acuerdo con los lineamientos institucionales. Se obtuvo fosfato de formalina regulado (10%) de Fisher Scientific (Springfield, NJ, E. U. A.). Se adquirió sulfóxido de dimetilo (DMSO) y salina regulada con fosfato (PBS), de Sigma, St. Louis, MO, E. U. A.). Se obtuvo lámparas ultravioleta (8-FSX24T12/HO/UVB) que emitían luz predominantemente en la escala UVB (280-320 nm) de National Biological Corporation, Twinsburg, OH, E. U. A.. Se determinó la capacidad de irradiación de las lámparas UVB antes de cada irradiación, usando un medidor de UVB (modelo 500C, obtenido de National Biological Corporation, Twinsburg, OH, E. U. A.). Para exposición a luz UV, se colocó tres ratones en una caja de plástico abierta, de 28 cm x 10 cm, que estaba dividida en tres compartimentos (un ratón por compartimento). Se colocó la caja de plástico en el centro, bajo el banco de luz UVB, y se irradió los ratones con una dosis de 35 mj/cm2 de UVB. El tiempo de exposición para una dosis de 35 mj/cm2 de UVB varió de 30 a 34 segundos. La distancia entre las lámparas de UVB y la superficie que recibe la irradiación fue de 20 cm. PROTOCOLO DE TUMORIGÉNESIS: Se dividió los ratones en tres grupos que contenían 5 a 14 ratones por grupo, como se muestra en el cuadro 1. Se trató los ratones tópicamente con una sola aplicación del compuesto 6 (1.0 mg/cm2, disuelto en DMSO) sobre un área de 2 cm2 de la superficie dorsal, antes de cada exposición a UVB. Después de 15 minutos a partir de la aplicación del compuesto 6, se irradió los ratones con 35 mj/cm2 de UVB. Se llevó a cabo la exposición a UVB de los ratones tres veces por semana, para un total de 20 semanas. Se trató los ratones de control con vehículo, antes de la exposición a luz UVB.

CUADRO 1 DISEÑO EXPERIMENTAL Y RÉGIMEN DE TRATAMIENTO Se midió el espesor de la' piel de los ratones y las lesiones cutáneas papilares de más de 1 mm de diámetro y se registró dos veces por semana, y se usó en los cálculos el promedio de las dos mediciones. El espesor de la piel, el número de lesiones y las mediciones de diámetro de lesión estuvieron limitados únicamente al área de 2 cm2 en la superficie dorsal de los ratones, que había sido tratada con el compuesto 6 o con vehículo. Se calculó el volumen de la lesión usando la fórmula: Volumen = 4/3pr3 Al finalizar el estudio se hizo la biopsia aleatoriamente de 5 a .19 lesiones de cada grupo, y se las fijó en formalina regulada al 10%. Se embebió las muestras fijadas con formalina en bloques de parafina , se las seccionó a espesores de µm y se tiñó con hematoxilin-eosina . Se l levó a cabo la evaluación patológica de secciones de piel por parte de un patólogo veterinario titulado, q uien no tenía noticia de la identidad de las muestras. CLASI FICACIÓN PATOLÓGICA DE LOS TUMORES: La clasificación patológica de los tumores fue como sigue: 1 ) papiloma cutáneo: un desarrollo papilomatoso de tumor, de epidermis acantótica, sin desarrollo invasor de células tumorales en la dermis. No parecieron atípicas las célu las tumorales. 2) Queratosis actínica: un epitelio hiperplástico, ortoqueratótico, de suave a moderadamente acantótico. 3) Queratosis actínica florida: queratosis actínica con rebordes suave a moderadamente acantóticos, que se extienden hacia la dermis superficial , que se parecen a carcinoma de célula escamosa superficialmente invasora. 4) Queratoacantoma: un desarrollo papilar con un cráter central relleno de q ueratina, rodeado por epitelio escamoso estratificado, acantótico, hiperplástico. El borde delantero del tumor empuja hacia la dermis subyacente. 5) Carcinoma de célula escamosa (SCC): un tumor con nidos de células atípícos, que invaden la dermis superficial y media.

RESULTADOS PARA EL EJ EMPLO 4 La quemadura solar es una reacción inflamatoria inducida por UV que está caracterizada por vasodilatación cutánea (eritema) y un aumento en la permeabilidad vascular, con exudación de fluido (edema) en la piel afectada. El incremento en la exudación de plasma, inducido por UVB, puede ser detectado como un aumento en el espesor del pliegue cutáneo a las 24 horas después de la irradiación (Berg, R. J. y coautores, 1998, J. Invest. Dermatol., 110: 405-9). La exposición de los ratones a UVB (grupo B) indujo un aumento en el espesor del pliegue cutáneo, en comparación con el espesor cutáneo de los ratones del grupo de control (figura 10). En el grupo tratado con el compuesto 6 (grupo C), hubo un aumento en el espesor de la piel, en comparación con el control (grupo A); sin embargo, el aumento en el espesor de la piel fue significativamente menor, en comparación con el grupo irradiado con UVB y el grupo tratado con vehículo, de los ratones, lo que indica un efecto antiinflamatorio del compuesto 6. Puesto que los ratones fueron irradiados crónicamente tres veces por semana, se observó un aumento sostenido en el edema cutáneo durante el curso del estudio, en los ratones irradiados con UVB (grupos B y C). Sin embargo, en algún punto en el tiempo se inhibió parcialmente el aumento en el edema cutáneo mediante el compuesto 6, en los ratones tratados con el fármaco. La exposición crónica de la piel a las radiaciones UVB conduce primariamente al desarrollo de lesiones finas en la piel que pueden crecer tanto en número como en tamaño, con exposiciones adicionales a dichas radiaciones. Como se muestra en la figura 11, la exposición crónica a UVB de los ratones indujo la aparición de lesiones finas en la piel afectada que aparecieron primeramente a alrededor de las 10 semanas de irradiación en el grupo de ratones tratado con vehículo e irradiado con UVB (grupo B). El número total de lesiones cutáneas aumentó exponencialmente al aumentar los números de exposición a UVB en el grupo de ratones irradiado con UVB (grupo B). Sin embargo, en el grupo tratado con el compuesto 6 (grupo C) se retardó ia aparición de las lesiones; se observó la primera lesión después de 14 semanas de irradiación con UVB. Si bien el número promedio de lesiones por ratón en este grupo también aumento al aumentar el número de exposiciones a UVB como en el grupo B, en cualquier punto dado del tiempo el número promedio de lesiones por ratón siempre fue menor en comparación con su control sin tratamiento (grupo B). Estos datos indican que la aplicación del compuesto 6 antes de la exposición a UV (a) retarda la aparición del tumor de 10 semanas de tratamiento con UVB (grupo B) a 14 semanas; y (b) inhibe el número total de lesiones que resultan de la exposición repetida a UVB. Después de la primera aparición a alrededor de las 10-14 semanas de irradiación con UVB, las lesiones cutáneas aumentaron tanto en número como en tamaño, al aumentar el número de exposiciones a UVB. A fin de comparar el tamaño de las lesiones cutáneas, se convirtió el diámetro de la lesión a volumen de lesión usando la fórmula descrita en Materiales y Métodos, y se comparó el volumen promedio de lesión por ratón. La figura 12 muestra el efecto del tratamiento con el compuesto 6 sobre el volumen promedio de lesión por ratón. Se observa de la figura que el volumen promedio de lesión aumentó con el tiempo en ambos grupos de ratones irradiados con UVB (grupos B y C), pero que el tratamiento de los ratones con el compuesto 6 inhibió el aumento en el volumen de lesión (grupo C, figura 12 y cuadro 2). Además, también se comparó el volumen promedio por lesión en los grupos de ratones tratado con el compuesto 6 y no tratados, después de 20 semanas de irradiación. Como se observó antes con el volumen de lesión cutánea promedio, por ratón, el volumen promedio por lesión también fue inhibido por el tratamiento con el compuesto 6 (cuadro 2).

CUADRO 2 EFECTO INHIBIDOR DE LA ADMINISTRACIÓN TÓPICA DEL COMPUESTO 6 SOBRE LA TUMORIG ÉNESIS INDUCIDA POR UVB EN RATONES skh-1 Se trató tópicamente ratones hembras skh-1 (7-8 semanas de edad) con el compuesto 6 (1 mg/cm2) o con vehículo, antes de cada irradiación con UVB (dosis de irradiación: 35 mj/cm2). Se expuso los ratones a UVB tres veces por semana durante veinte semanas. Los datos representan la media±SEM de 5-14 ratones, a las veinte semanas. *P < 0.05, en comparación con el control tratado con vehículo. DATOS MORFOLÓGICOS O HISTOPATOLÓG ICOS: Se ha comparado la apariencia morfológica de piel de ratón después de 20 semanas de irradiación de los tres grupos de ratones. La figura 13 muestra que la exposición repetida con luz UVB indujo el crecimiento de muchas lesiones en la piel afectada (figura 13, panel B), mientras que el tratamiento con el compuesto 6 inhibió el desarrollo de dichas lesiones. Los hallazgos histopatológicos de las biopsias de piel en los ratones, después de 20 semanas de irradiación con UVB, están presentados en el cuadro 3.

CUADRO 3 EFECTO INHIBIDOR DE LA ADMINISTRACIÓN TÓPICA DEL COMPUESTO 6 SOBRE QUERATOACANTOMAS Y CARCINOMAS DE CÉLULA ESCAMOSA. INDUCIDOS POR UVB. EN RATONES skh-1 Se trató tópicamente ratones hembras skh-1 (7-8 semanas de edad) con el compuesto 6 (1 mg/cm2) o bien con vehículo, antes de cada irradiación con UVB (dosis de irradiación. 35 mj/cm2). Se expuso los ratones a UVB tres veces por semana durante veinte semanas. Los datos representan el porcentaje del número total de ratones por grupo, a las veinte semanas. Se observó una dermatitis de suave a moderada en los tres grupos, incluyendo el grupo no irradiado de ratones (grupo A), que pudo ser inducida por la aplicación tópica del vehículo (DMSO) tres veces por semana durante el curso del estudio. Se presentó queratosis actínica, que representa una epidermis hiperplástica y de suave a moderadamente acantótica, en la mayoría de las biopsias de ambos grupos irradiados con UVB (grupos B y C). Se observó una sola lesión de queratoacantoma en el grupo de ratones irradiado con UVB y tratado con vehículo (grupo B). No se observó lesión en ninguno de los 14 ratones del grupo tratado con el compuesto 6 (grupo C). La ocurrencia de carcinoma de célula escamosa, superficialmente invasor (queratosis actínica florida, y un precursor de SCC) y de SCC se notó en ambos grupos irradiados con UVB (grupos B y C), pero en los ratones tratados con el compuesto 6 (grupo C) se inhibió en alrededor de 23% (cuadro 3). Similarmente, también se inhibió parcialmente la incidencia de papiloma cutáneo mediante el compuesto 6. Los resultados del ejemplo 4 indican que la aplicación tópica del compuesto 6 antes de la irradiación con UV protege la piel contra las consecuen cias dañinas del cáncer de piel en exposición crónica. Específicamente, una aplicación tópica del compuesto 6 sobre la piel, antes de la exposición a luz UVB, inhibió notablemente la formación de lesiones cutáneas, disminuyó el tamaño del tumor e i nhibió el desarrollo de tumores en ratones skh-1 . Una documentación amplia ha validado el papel de las radiaciones UVB en la formación de tumores de piel (Davary, Y. y coautores, 1 992, Cell 75: 1081 -91 ; Ley, R. D. y coautores, 1989 Photochem. Photobiol, 50: 1 -5; Hall, E. J. y coautores, 1988, Am. J. Clin. Oncol. , 1 1 : 220-52; y Marks, R. , 1 995, Cáncer 75: 607-12). La irradiación de las células cutáneas con irrad iación UVB desata la liberación de cantidades incrementadas de ácido araquidónico y sus metabolitos (Konger, R. L. y coautores, 1 998, Biochim. Biophys Acta, 1401 : 221 -34. ( 12-15). Se produce prostaglandinas, que son el producto de oxigenación del ácido araquidónico, abundantemente después de irradiar las células cutáneas con UVB (Hawk, J . L. M. y J. A. Parrish, 1993, Responses of Normal Skin to Ultraviolet Radiations, Plenum Medical Book Publishers, Nueva York, E. U. A.; Hruza, L. L. y A. P. Pentland, 1 993, J. Invest. Dermatol. , 100:35S-41 S; Kang-Rotondo y coautores, 1993, Am. J. Physiol. , 264:C396-401 ; y Grewe, M . U . y coautores, 1993, J. Invest. Dermatol., 101 : 528-31 ) y han estado implicadas en diversos modelos para tumorigénesis (Vanderveen , E. E. y coautores, 1986, Arch. Dermatol. , 122: 407-12; Cerutti, P. A. y B. F. Trump, 1991 , Cáncer Cells, 3: 1 -7). Las evidencias indican también que, además de estimular el desarrollo de tumores, las prostaglandinas tienen tendencia a suprimir la sobrevivencia inmunológica del receptor (Plescia , O. J . y coautores, 1 975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 1848-51 ; Goodwin, J. S. , 1 984, Am. J. Med. , 77:7-1 5) y, de tal manera, ayudan a ia promoción del tumor. Se ha observado niveles elevados de PGE2 en carcinomas de piel de célula escamosa y basal, y se los puede correlacionar con la actividad metastática incrementada y el comportamiento invasor (Vanderveen, E. E. y coautores, 1986, Arch. Dermatol. , 122: 407-12; Klapan, I . V. y coautores, 1992, J. Cáncer Res. Clin. Oncol. , 1 18: 308-13), de estos tumores. Se ha observado que varios compuestos químicos que inhiben la producción de prostaglandinas inhiben el crecimiento de tumores (Snyderman , C. H . y coautores, 1 995, Arch. Otolaryngol Head Neck Surg. , 121 : 101 7-20; Hial, V. y coautores, 1976, Eur. J. Pharmacol. , 37: 367-76; Lynch , N. R. y coautores, 1978, Br. J. Cáncer, 38: 503-12. La capacidad del compuesto 6 para inhibir la tumorigénesis de la piel, inducida por UVB, combinada con las observaciones previas de los inventores, de que inhibe la inflación aguda de la piel, indican que el compuesto 6 es un agente de quimioprevención útil contra algunas formas de cánceres humanos, inducidas por agentes ambientales, como la luz ultravioleta. La capacidad de un compuesto para prevenir o tratar el cáncer de la piel puede ser determinada usando análisis que son conocidos en la técnica, o se puede determinar utilizando análisis similares a los del ejemplo 5.

EJEMPLO 5 ANÁLISIS DE CARCINOGÉNESIS DE PIEL. INDUCIDA POR UVB El compuesto 6 es capaz de inhibir significativamente la liberación de mediador inflamatorio, inducida por la luz UVB, en células epidérmicas y, de tal manera, previene las respuestas inflamatorias de la piel expuesta a UVB. Se adquirió ratones albinos calvos, hembras, de 6-7 semanas de edad (skh-1) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Se obtuvo de Stratagene (La Jolla, CA, E. U. A.), ratones BigBlue transgénicos que llevan múltiples copias del vector de lanzadera BigBlue (LIZ) que contiene substrato para la detección de mutaciones in vivo. Se puso en jaulas los ratones, en grupos de cinco, en un ambiente libre de patógenos, de acuerdo con las reglas y los reglamentos de la U. S. Animal Welfare Act y del National Institute of Health (NIH). Se llevó a cabo los procedimiento de cuidado y experimentales con los animales, de acuerdo con los lineamientos institucionales. LÍNEA DE CÉLULAS EPIDÉRMICAS.- Se mantuvo HaCaT, que es una línea de células epidérmicas humanas, espontáneamente transformadas (16), en medio de Eagle, modificado de Dubeicco (DMEM), suplementado con 10% de suero bovino fetal (Summit Biotech, Ft. Collins, CO, E. U. A.). PROCEDIMIENTO DE IRRADIACIÓN: Se usó un banco de 8-FSX24T1 2/HO/UVB lámparas (National Biological Corporation , Twinsburg , OH , E. U. A. ), que emite luz predominantemente en la escala UVB de 280-320 nm, para irradiar los ratones y los cultivos de células. Se midió siempre la capacidad de irradiación de las lámparas UVB antes de la irradiación, usando un med idor de UVB (modelo -500C, obtenido de National Biological Corporation, Twinsburg , OH , E. U . A. ). La dosis de luz UVB usada para irradiar los cultivos fue de 25 mj/cm2. Los ratones anestesiados recibieron radiaciones UVB en un área de 2.0 cm2 en su superficie dorsal. Esta área estaba pintada con el compuesto de prueba (1 .5 mg/cm2) en los ratones que recibieron fármaco, o con vehículo, en los ratones de control, quince minutos antes de la irradiación. La distancia entre las lámparas UVB y la superficie que recibe la irradiación fue de 20 cm. La dosis final de radiación recibida por los ratones calvos skh-1 fue de 250 mj/cm2, que es aproximadamente siete veces mayor que la dosis mínima para eritema (MED) ( 17) en estos ratones. Se afeitó los ratones Big Blue en su lomo antes de la irradiación y luego se los expuso a 400 mj/cm2 de luz UVB, ya sea en presencia o en ausencia del compuesto 6. ANÁLISIS DE PROSTAGLANDI NA E2.- Se lavó células HaCaT confluentes, cultivadas en platos de cultivo de 24 concavidades, tres veces con DMEM libre de suero, que contenía 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) (Cayman Chemicals, Ann Arbor, Ml , E. U. A.) y se incubó con 3-30 µM del compuesto 6 d urante una hora, a 37°C. Después de la incubación se lavó las células dos veces con PBS y se las expuso a 25 mj/cm2 de luz UVB o bien se las estimuló con 50 ng/ml de rhEG F, y se las alimentó con DMEM libre de suero que conten ía 1 % de BSA. Se volvió a administrar el compuesto 6 y se incubó las células durante seis horas a 37°C. A las seis horas después del estímu lo, se recogió el sobrenadante de las células y se mid ió el PG E3 liberado en los sobrenadantes de células, mediante EIA competitivo, usando un trazador de acetilcolina-esterasa/PGE2, y anticuerpo anti-PGE2 suministrado con el equipo ELISA (Cayman Chemicals, Ann Arbor, M l , E. U . A. ). Se determinó la proteína celular usando el método de análisis de proteína BCA de Pierce (Smith , P. K. y coautores, 1985, Anal. Biochem. , 150(1 ): 76-85). Se disolvió inicialmente el compuesto 6 en sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, E. U . A. ) a una concentración de 10 mg/ml y se diluyó a una concentración de 1 mg/ml con salina y regulador fosfato (PBS) antes de la inyección . Se trató diariamente los ratones con 16 mg/kg i. p. como inyección de bolo, del compuesto 6 desde el d ía -2 (es decir, dos d ías antes de la exposición a UVB), hasta que terminó el experimento. Se aplicó también a los ratones receptores de fármaco 1 .5 mg/cm2 del compuesto 6, 15 minutos antes de la irradiación. Los ratones de control recibieron únicamente vehículo. Uno de los principales metabolitos de ácido araquidónico en los queratinocitos irradiados con luz ultravioleta B es la prostaglandina E2 que se puede detectar desde las 6 horas, con picos entre 24 y 48 horas después de ia exposición a UVB, e induce edema y eritema en la piel (Gilchrest, B. A. y coautores, 1981, J. Am. Acad. Dermatol., 5(4): 411-22; Konger, R. L. y coautores, 1998, Biochim. et Biophys. Acta (1401): 221-34; Woodward D. F. y coautores, 1981, Agents Actions, 11(6-7): 711-7; Snyder, D. S. y W. H. Eaglstein, 1974, Br. J. Dermatol., 90(1): 91-93; Snyder, D. S. y W. Eaglstein, 1974, J. Invest. Dermatol., 62: 47-50; y Gupta, N. y L. Levy, 1973, Br. J. Pharmacol., 74(2): 240-8). Se determinó el efecto del compuesto 6 sobre la liberación de PGE2 en células epidérmicas irradiadas con IVB. Se expuso células epidérmicas humanas, HaCaT, a luz UVB y se incubó tanto en presencia como en ausencia del compuesto 6, y se determinó la PGE2 acumulativa liberada en los sobrenadantes de células durante la incubación de seis horas. El análisis de la PGE2 liberada (figura 14) mostró que una exposición de HaCaTs a 25 mj/cm2 de UVB indujo aproximadamente once (11.11 (4.23) veces el aumento en el nivel de PGE2 a las seis horas después de la irradiación, en comparación con el control no irradiado con UVB. La liberación de prostaglandina inducida por luz UVB fue inhibida por el compuesto 6 de una manera que depende de la concentración, y se observó aproximadamente 90% de inhibición en la liberación de prostaglandina a dosis de 30 µM del compuesto 6. Estos datos indicaron que el compuesto 6 es capaz de inhibir la liberación de prostaglandina E2 en células epidérmicas estimuladas con luz UVB. Los queratinocitos humanos primarios, así como las HaCaT expresan un húmero significativamente alto de receptores de EGF funcionales en su superficie 0 de célula. Por estimulación, los receptores de EGF presentes sobre las células epidérmicas participan en la señalización de transmembrana e inducen la formación de prostaglandinas. Para determinar que la inhibición previamente observada en la liberación de prostaglandina, por el compuesto 6, se debió a la inhibición de la activación de EGF-R, se estudió el efecto del compuesto 6 sobre la formación de prostaglandina estimulada por EGF en células epidérmicas. La estimulación de las células HaCaT con 50 ng/ml de rhEGF durante seis horas, indujo un aumento de aproximadamente 4 veces la liberación de prostaglandina con respecto al control sin estimular (figura 15) y el aumento observado en la liberación de prostaglandina fue inhibido en presencia de 30 µM del compuesto 6, lo que indica que: (i) los receptores del factor de desarrollo epidérmicos median la formación de prostaglandina en células epidérmicas; y (ii) que el compuesto 6 inhibe la liberación de prostaglandina en células estimuladas con luz UVB mediante la inhibición de la activación de EGF-R. MORFOLOGÍA Y MEDICIÓN DEL EDEMA DE PIEL.- La apariencia morfológica de la piel irradiada con UVB se vigiló visualmente y se la comparó con la piel de ratones de control. Se registró antes el espesor del pliegue cutáneo de la superficie dorsal de los ratones, y cada día, después de la exposición a UVB durante cinco días, con un medidor de espesor digital (Mitutoyo, So.

Plainfield , NJ , E. U . A. ) , que mide el espesor en escala de 0- 1 0 mm, con una precisión de 0.01 5 mm. Como se mencionó anteriormente, la prostaglandina E2 es un mediador inflamatorio potente, y es bien sabido q ue induce vasodilatación y potencia el edema en la piel , después de los daños. Dado que este estudio ¡n vitro, usando células epidérmicas mostró q ue ei compuesto 6 in h ibe la liberación de PG E2 en células estimuladas con UVB, hubo interés en determinar si el compuesto 6 es capaz de inhibir las respuestas inflamatorias dañinas de la piel, después de exposición a luz UVB in vivo. Para estos estudios se usó ratones hembras calvos, albinos, skh-1 , y se expuso su superficie dorsal con 250 mj/cm2 de luz UVB. Se determinó el espesor del pliegue cutáneo de la superficie dorsal de los ratones, como una med ida del edema de piel , desde el d ía 1 hasta el día 5 después de la irradiación. La figura 16 muestra que una sola exposición de los ratones a 250 mj/cm2 de UVB, indujo un aumento en el espesor del pliegue cutáneo, que dependió del tiempo. El compuesto 6 no fue capaz de inhibir de manera efectiva el edema de piel a las 24 horas después de la irradiación . Sin embargo, bloqueó el aumento adicional en el espesor de piel a las 48 horas después de la exposición a UVB en el grupo irradiado de ratones. En contraste, el espesor de la piel aumentó a alrededor de 70% del espesor de la piel en los ratones de control, en el mismo punto del tiempo. A las 72 horas después de la irradiación, se observó una disminución importante en el edema cutáneo en los ratones tratados con el compuesto 6 y a l q uinto d ía después de la irradiación, el espesor del pliegue cutáneo en los ratones tratados con fármaco regresó casi al nivel de control. En contraste, en el grupo tratado con vehículo, el espesor de la piel aumentó a un total de 2.5 veces el espesor de piel de los ratones de control, durante el periodo de cinco días. Se obtuvo resultados similares con P 131 disuelto en polietilenglicol 200 (PEG-200) (datos no mostrados). Estas observaciones indicaron q ue el compuesto 6 es capaz de inhibir el edema de piel inducido por luz UVB en ratones . También se vigiló los cambios morfológicos en la apariencia de la piel después de la exposición a luz UVB en grupos de ratones tratados con el compuesto 6 y tratados con vehículo. Fue visible el daño por quemadura solar en la piel , en las primeras 24-48 horas después de la exposición a UVB con una apariencia de "piel de elefante". La piel de los ratones irradiada con luz UVB apareció de color rosa, esponjosa y gruesa. El día 1 y el día 2 después de la inducción de inflamación no se notó diferencia significativa en la apariencia de la piel de los grupos de ratones tratados con fármaco y tratados con vehículo. Sin embargo, en los ratones irradiados con UVB y tratados con vehículo, comenzando el día 3, se pudo ver muchas escamas de piel q ue se desescama, que se desprendían de la superficie de la piel; y para el día 5, la piel de este grupo de ratones se había vuelto tiesa, cueruda y había desarrollado cicatrices en la superficie. En contraste, en el grupo tratado con el compuesto 6, la apariencia de la piel en los ratones mejoró después del día 3, y para el día 5 después de UVB, los signos de inflamación cutánea habían disminuido y la apariencia de la piel se parecía a la de los ratones del grupo de control (figura 18). También se estudió los cambios histológicos de la piel, inducidos por luz UVB. La epidermis normal típicamente tiene una capa de 2-3 células y contiene células inflamatorias diseminadas, especialmente alrededor de los folículos pilosos (figura 19A). La piel irradiada con UVB mostró epidermis engrosada, con capas de 3-5 células. También se acumuló gran número de neutrófilos en la dermis (figura 19B). En contraste, la piel de los ratones tratados con el compuesto 6 pareció mucho más similar a la piel de los controles sin irradiar (figura 19C), con capas de epidermis de 1-2 células y de dermis normal. Así pues, el compuesto 6 previene el desarrollo de edema y el flujo de entrada de neutrófilos en la piel de ratones irradiada con UVB. PERMEABILIDAD VASCULAR.- Se determinó cuantitativamente la permeabilidad vascular mediante fuga desde vasos de un tinte aniónico unido a albúmina, azul de Evans (Sigma, St. Louis, MO, E. U. A.). Se inyectó azul de Evans (1%, 200 (l/ratón) a través de la vena caudal; cuatro horas después se sacrificó los ratones y se hizo la biopsia de la piel dorsal irradiada. De las biopsias se extrajo el tinte en formamida (Sigma, St. Louis, MO, E. U. A.), calentando las muestras a 80°C durante dos horas y se midió la absorbencia óptica de la formamida a 620 nm. Puesto que el edema está asociado con exudación de plasma incrementada , se determinó el efecto del compuesto 6 sobre la permeabilidad vascular de la piel, ind ucida por UVB. Los datos sobre los cam bios en la permeabilidad vascular, después de la irradiación con UVB, han sido presentados en la figura 1 7. Consistente con los hallazgos de edema cutáneo, hubo un aumento en la permeabilidad vascular de la piel en los ratones irradiados con UVB. El efecto del compuesto 6 fue mínimo a las 24 horas y a las 48 horas después de la irradiación . Sin embargo, al quinto d ía después de UVB, en el grupo tratado con el compuesto 6 la permeabilidad vascular regresó al nivel de control, mientras que se observó un aumento al quíntuplo en la permeabilidad vascular en el grupo de ratones expuestos a UVB y tratados con vehículo. ESTUDIOS DE TI NCIÓN E HISTOLÓGICOS DE CÉLULAS CON QUEMADURA SOLAR.- Después que se sacrificó los ratones por dislocación cervical , se separó la piel y se estiró sobre una lámina de cera dental. Se tomó un punzón (8 mm) y se fijó en formalina regulada. Se cortó secciones de 4-5 µm de espesor de los bloques de parafina. Se efectuó la tinción de células con quemad ura solar usando el equipo de detección in situ ApopTag Plus (Oncor, Gaithersburg , MD, E. U. A.), que detecta células con quemadura solar por fluorescencia directa de ADN genómico marcado con digoxigenina. Brevemente se añadió catalíticamente los residuos de digoxigenina-nucleótidos a los extremos 3'-OH de ADN de doble filamento o de un solo filamento, en presencia de la enzima desoxinucleotidil-transferasa, y se detectó los nucleótidos unidos usando el anticuerpo anti-digoxigenina, conjugado con fluoresceína. Para estudiar los cambios histológicos después de la irradiación se tiñó las secciones de tejido con hematoxilina y con eosina, y se examinó microscópicamente las rebanadas teñidas. Una exposición aguda a luz UVB induce quemadura solar en las células cutáneas. La presencia de células con quemadura solar en la piel de los ratones irradiados con UVB fue detectada usando el equipo de detección de apoptosis in situ, que se identificó anteriormente. Se observó un número importante de células con quemadura solar (figura 20) en la piel de ratones irradiados con UVB 48 horas después de la exposición a la luz. En contraste, en los ratones tratados con el compuesto 6, se observó significativamente menos células o ninguna célula con quemaduras solares, en ese mismo punto del tiempo. Así pues, los datos sugieren que el compuesto 6 inhibe la muerte celular inducida por UVB en la piel de ratones. Se puede determinar la capacidad de un compuesto para prevenir o tratar las complicaciones de trasplante usando análisis que son conocidos en la técnica, o se puede determinar usando análisis similares al descrito en el ejemplo 6.

EJEMPLO 6 COMPLICACIONES DE TRASPLANTE ANÁLISIS DE PROLIFERACIÓN: Se usó esplenocitos (4 x 105/100 µl) de machos C57BL6 de 9 semanas de edad, como respondedores en análisis de proliferación inducida por fitohemaglutinina (PHA) y por concanavalina A (Con A). Se aplicó las células por triplicado en cada grupo, a una microplaca de 96 concavidades, en un volumen final de 200 µl de medio RPMl 1640, suplementado por suero de ternera fetal al 10%. Se añadió PHA o Con A (Sigma, St. Louis, MO. E. U. A.), en una concentración de 5 o 2 µg/ml, respectivamente. Se añadió el compuesto 6 en la concentración de 0.1, 1, 10 y 50 µg/ml. Se cultivó las células en 5% de CO2 con aire humidificado en un incubador, a 37°C durante tres días. Luego se llevó a cabo un análisis colorimétrico para la cuantificación de la proliferación celular, con base en la división de la sal de tetrazolio WST-1 por las deshidrogenasas mitocóndricas en células viables (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E. U. A.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se midió la absorbencia a 450-690 nm en un explorador de microplaca Multiskan MS. Se obtuvo el valor de proliferación de células disminuyendo del valor O.D. de la proliferación de células estimulada por PHA o por CON A, el valor O.D. de las células no estimulada (control negativo). REACCIÓN DE LINFOCITO MIXTO (MLR).- Para el análisis de MLR, se aplicó células respondedoras (esplenocitos obtenidos de machos C57BL6 de 9 semanas de edad) por triplicado en placas de 96 concavidades, a concentración de 4 x 105/100 µl y se añadió estimuladores tratados con mitomicina (esplenocitos obtenidos de machos BALB/c de 10-12 semanas de edad) a concentración de 8 x 104 en 50 µl. Se añadió el compuesto 6 a las concentraciones descritas arriba, a un volumen final de 200 µl. Se cultivó células durante cinco días y se llevó a cabo un análisis WST-1 colorimétrico, como se describió anteriormente. DETECCIÓN DE APOPTOSIS: Se cultivó esplenocitos de C57BL6 (3 x 106/ml) en una placa de 24 concavidades, durante 24 horas, en 500 µl de RPMl 1640, bajo las condiciones descritas anteriormente. Se añadió el compuesto 6 a concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 µg/ml. Se detectó la muerte apoptótica de células por medio de TÚNEL, usando el equipo de detección de células in situ, fluresceína (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E. U. A.). Después del periodo de cultivo se lavó las células, se las fijó, permeabilizó y tiñó siguiendo las instrucciones del fabricante y se analizó la apoptosis mediante citometría de flujo, usando FACS Calibur (Becton Dickinson, San José, CA, E. U. A.). RATONES.- Los receptores de trasplante de médula ósea fueron ratones machos C57BL/6 (H-2b) de 8-10 semanas de edad, y los donadores fueron machos BALB/c (H-2d) de 6 a 8 semanas de edad (ambas razas adquiridas de Taconic, Germantown, NY, E. U. A.). Se mantuvo los ratones en una instalación de cuidado de animales, en The Hughes Institute, bajo la condición libre de patógeno específico (SPF). Se permitió libre acceso a la dieta normal de ratones (Harían Teklad LM-485) y al agua. El agua de los receptores fue suplementada con antibiótico (sulfametoxazol/ trimetoprim, Hi-Tech Pharmacal-Amityville, NY, E. U. A.) comenzando el d ía anterior al traspla nte. I RRAD IACIÓN: Se trató los ratones receptores, situados en un retenedor de Lucite en forma de tartaleta, un día antes del trasplante de médula ósea, con una dosis letal (7.5 Gy) de cesio (JL Sheppard Labs, 47.08 rad/min). TRAS PLANTE DE M É D U LA ÓSEA (MBT). Se recolectó méd ula ósea del donador BALB/c en RPMl 1640 con L-glutamina (Cellgro)(Mediatech, Hendon, VA, E. U. A.), inundando los caños de fémur y tibia. Al mismo tiempo, se preparó también la suspensión monocelular de donador, de esplenocitos, eliminada de glóbulos rojos mediante regulador de lisis (regulador de lisis ACK - 0.15M de NH4CI, 1 .09M de KHCO3, 0.01 M de Na2EDTA). Se suspendió las células BM mediante agitación con una pipeta de Pasteur y se separó de los desechos haciéndola pasar a través de un colador de células, de nylon, de poros finos. Se eliminó los glóbulos rojos mediante regulador de lisis y se dejó sedimentar los grumos de desechos. Se lavó las células y se las volvió a suspender para inyección intravenosa a través de la vena caudal. El inoculo de norma consistió de 25 x 10a células BM y 25 x 106 esplenocitos en 0.5 ml de RPMl 1640). VIGI LANCIA DE EN FERM EDAD DE INJERTO CONTRA RECEPTOR (GVHD). Se vigiló diariamente los receptores de BMT para determinar el inicio de la evidencia clínica de GVH D (determinada por pérdida de peso, manifestaciones de eritema cutáneo, alopecia, encorvamiento, diarrea) y la sobrevivencia durante el periodo de observación de 90 días. Se midió los tiempos de sobrevivencia desde el día de BMT (día 0). Las muertes que ocurren dentro de los 11 días después del trasplante fueron considerados inducidas por la radiación y fueron excluidas. TRATAMIENTOS CON FÁRMACO.- Para la profilaxis de GVHD se administró diariamente a los ratones inyecciones intraperitoneales (i.p.) del compuesto 6 (WHI-P131), de 4-(3'-hidroxilfenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina (WHI-P132, compuesto 7), de ciclosporina (Sandimmune®, Sandoz Pharmaceuticals Ltd., Basilea, Suiza), de metilprednisolona (Depo-Medrol®, Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, Ml, E. U. A.), Metotrexato (Immunex Corporation, Seattle, WA, E. U. A.) y de control con vehículo, comenzando el día anterior a BMT (-1) o el día de BMT (día 0). Se administró el compuesto 6 en una dosis de 25 mg/kg/día y 60 mg/kg/día (dividida en tres dosis); se administró el compuesto 7 a 50 mg/kg/día (dividido en tres dosis), desde el día 0 de BMT; se inyectó ciclosporina, metilprednisolona y metotrexato en dosis de acuerdo con el protocolo de grupo de cáncer de Children (CCG): 3 mg/kg/día (divididos en dos dosis), 10 mg/kg/día (divididos en dos dosis) y 10 mg/m2/día (una vez al día, respectivamente. Los tratamientos con ciclosporina y con metilprednisolona comenzaron el día anterior a BMT (-1) y duraron hasta el final del periodo experimental, mientras que se administró el metotrexato los días 1, 3, 6 y 11 después de BMT. ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Se efectuó ei análisis 96 STZ, únicamente 1/12 (8.3%) de los ratones deficientes en JAK3 inició la diabetes en el periodo experimental de 25 días (p <0.0001) (Figura 27). Los ratones WT exhibieron aumento en la glucosa en sangre desde el día 7, llegando al nivel hiperglicémico (>220 mg/dl) el día 9 después de la primera inyección de STZ (figura 28). Por el contrario, los ratones deficientes en JAK3 permanecieron normoglicémicos durante todo el periodo experimental (p<0.001, en comparación con el nivel glicémico en WT, mediante ANOVA) (figura 28). INHIBICIÓN DEL DESARROLLO DE DIABETES EN EL MODELO LDSTZ DE ENFERMEDAD MEDIANTE L INHIBIDOR DE JAK3-CINASA WHI-P131.- El tratamiento diario de machos C57BL/6 mediante 100 mg/kg de WHI-P131 (2 dosis), i.p., iniciado desde el primer día de las inyecciones de STZ, inhibió el desarrollo de diabetes LDSTZ (figura 29). Si bien 20(37 (52.6%) de los ratones de control desarrolló diabetes para el día 7, seguido por 32/38 (84.2%) de ratones diabéticos para el día 9 y 36/38 (97.4%) de ratones diabéticos el día 11 después de la primera inyección de STZ, únicamente 4/20 (20%) de los ratones tratados con WHI-P131 se volvieron diabéticos el día 7, seguidos por 10/20 (50%) el día 9 y 13/20 (65%) el día 11 (figura 29). La figura 30 muestra que los ratones tratados con WHI-P131 exhibieron un nivel de glucosa en sangre significativamente inferior (p = 0.027) durante todo el periodo experimental, en comparación con los ratones de control. PREVENCIÓN DEL DESARROLLO DE IDDM EN HEMBRAS 97 NOD, MEDIANTE TRATAMIENTO CON WHI-P131.- Se estudió la incidencia de diabetes en hembras NOD tratadas diariamente con: a) 20 y 50 mg/kg de WHI-P131, desde la 5 a la 25 semanas de edad (figura 27) y b) 100 mg/kg de WHI-P131 desde las semanas 5 a 8, 5 a 25 y 10 a 25 de edad (figura 28). Si bien apareció diabetes a las 13 semanas de edad en los ratones tratados con DMSO (control), los ratones tratados con WHI-P131 (50 mg/kg) comenzaron a desarrollar diabetes a las 22 semanas de edad (figura 27). A las 25 semanas, 22/37 (60%) de los ratones de control se volvieron diabéticos, mientras que únicamente 2/11 (18%) de las hembras NOD tratadas con 50 mg/kg de WHI-P131 desarrolló diabetes (p = 0.017). El tratamiento diario con 20 mg/kg de WHI-P131 no mostró efecto protector sobre el desarrollo de diabetes - 5/9 (56%) de los ratones tratados desarrollaron diabetes, hasta las 18 semanas de edad (figura 27). Se preguntaron los inventores si un curso corto de tratamiento con 100 mg/kg de WHI-P131, desde las semanas 5 a 9 de vida, pudo tener un efecto protector duradero. La figura 28 muestra que dicho tratamiento no dio resultado protección contra el desarrollo de la diabetes. La diabetes se inició a las 10 semanas y para la semana 25 de edad, 10/12 (83%) de las hembras NOD se volvieron diabéticas. Luego se estudio si el inicio posterior del tratamiento (a las 10 semanas de edad) con 100 mg/kg de WHI-P131 podría ser efectivo para prevenir la diabetes. La figura 28 muestra que el tratamiento con 100 mg/kg de WHI-P131, iniciado a las 10 semanas de edad, es tan efectivo como el tratamiento iniciado 98 anteriormente, a 5 semanas de edad; la incidencia de diabetes alcanzó 9% (1 /1 1 ) a las 25 semanas de edad , bajo el primer tratamiento (p = 0.007, en comparación con los controles) y 18% (4/22) bajo el último (p = 0.025, en comparación con los controles). El grupo de hembras NOD normoglicémicas, tratadas con DMSO (n = 3) o con 100 mg/kg de WH I-P 131 durante 20 (n = 6) semanas o 15 semanas (n = 7) fue dejado en ayunas al final del periodo experimental (a las 25 semanas de edad) y se llevó a cabo el I PGTT. Se usó también ratones C57BL/6 no diabéticos, sin tratar, como controles en la prueba I PGTT. Los resultados muestran que los niveles de glucosa en la sangre fueron similares entre los ratones C57BL/6 y ambos grupos de ratones NOD tratados con WHI-P 1 31 durante el periodo de 120 minutos después del desafío con glucosa. En contraste, los ratones normoglicémicos, tratados con DMSO, exhibieron un nivel de glucosa en la sangre significativamente superior, en cada punto del tiempo observado, en cualquiera de los grupos tratados con WHI-P131 . Adicionalmente, se llevó a cabo el examen histológico del nivel de insulitis de la pancreata obtenida de los ratones analizados en IPGTT. La marca de insulitis de los controles (n = 3) fue 1 .43 ± 0.15, mientras que la marcación de insulitis de las hembras NOD tratada mediante WHI-P131 desde las 5 a las 25 semanas de edad fue significativamente inferior (p = 0.026): 0.86 ± 0.12. Sin embargo, la marca de insulitis de las hembras NOD tratadas con WH I-P 131 desde las 10 a las 25 semanas de edad no fue diferente de los 99 controles (1.42 ± 0.24). PREVENCIÓN DEL DESARROLLO DE DIABETES EN HEMBRAS NOD-scid/scid TRANSFERIDAS ADOPTIVAMENTE, MEDIANTE TRATAMIENTO CON WHI-P131. Como WHI-P131 mostró capacidad para prevenir el desarrollo de diabetes en hembras NOD durante la fase prediabética de desarrollo espontáneo de diabetes de tipo I, a continuación se quiso determinar si WHI-P131 era capaz de suprimir los efectores de ratones ya diabéticos en la transferencia de enfermedad a ratones NOD-scid. Se transfirió adoptivamente dos grupos de hembras NOD-scid con 1 x 107 esplenocitos desde hembras NOD diabéticas y se trató un grupo diariamente desde el día de la transferencia, con 50 mg/kg de WHI-P131 (n = 12), mientras que otro fue tratado con 10% de DMSO (n = 11) (figura 34). Si bien 6/11 (55%) del control NOD-scid se volvieron diabéticos a las 4 semanas, seguidos por 8/11 (73%) de ratones diabéticos en la semana 5 después de la transferencia adoptiva, únicamente 1/12 (8%) de las hembras NOD-scid tratadas con WHI-P131 se volvieron diabéticas en el mismo periodo experimental (figura 4). Claramente, el desarrollo de diabetes después de la transferencia adoptiva fue prevenido significativamente (p <0.002) mediante el tratamiento con WHI-P131. Se puede determinar la capacidad de un compuesto para prolongar la sobrevivencia al aloinjerto usando análisis que son conocidos en la técnica, o se puede determinar usando análisis similares a los descritos en el ejemplo 8. 1 00 EJ EMPLO 8 PROLONGACIÓN DE SOBREVIVENCIA AL ALOINJ ERTO SIN DAÑOS A LA FUNCIÓN CELULAR DE ISLETA Se usó como receptores ratones machos C57BL/6 (H-2b), de 8 a 12 semanas de edad, y se usó como donadores ratones machos BALB/c (H-2d) de la misma edad. Ambas razas de ratones fueron adquiridas en Taconic, Germantown , NY, y alojadas bajo condiciones libres de patógenos, en la instalación para cuidado de animales de Hughes Institute. Los ratones Jak3_ " (C57BL/6 x 129/Sv, H-2b), homólogos para el gene interrumpido Jak3, fueron donación generosa del doctor J. N. I h le, St. J ude Children's Research Hospital, Memphis, TN, E. U. A. Se cruzó un ratón Jak3"/_ homozigótico con ratones C57BL/6 y las crías de la generación F1 fueron cruzadas de nuevo con ratones C57BL/6. Se entrecruzó después de tres generaciones de cruzas repetidas con C57BL/5, las crías para producir ratones Jak3_ " y ratones Jak3+ + de tipo silvestre (WT). Se usó como receptores de isletas BALB/c ratones machos Jak3"'" y WT de 10 a 12 semanas de edad. REACCIÓN DE LINFOCITO MIXTO (MLR).- Para análisis MLR, se aplicó células de respondedor (esplenocitos obtenidos de machos C57BL/6 de 10 semanas de edad) por triplicado, en placas de 96 concavidades, a concentración de 4 x 105 / 100 µl de RPMl (Life Technologies, Grand Island, NY, E. U. A.), con adición de 10% 101 de suero bovino fetal (Laboratories, Inc., Logan, UT, E. U. A.). Se añadió estimuladores tratados con mitomicina (esplenocitos obtenidos de machos BALB/c de 10-12 semanas de edad) en una concentración de 8 x 104 en 50 µl. Se añadió WHI-P131 a diferentes concentraciones hasta un volumen final de 200 µl, y se cultivó las células en CO2 al 5%, con aire humidificado, en un incubador a 37°C durante 5 días. Luego se efectuó un análisis colorimétrico para cuantificará la proliferación de células, con base en la división de la sal de tetrazolio WST-1 por las deshidrogenasas mitocóndricas, en células viables (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E. U. A.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se midió la absorbencia a 450-690 nm en un explorador de microplaca Multiskan MS. Se obtuvo el valor de la proliferación de células restando del valor O.D. de proliferación de las células estimuladas, el valor O.D. de las células no estimuladas (los valores O.D. para las células sin estimulación fueron de entre 0.370 y 0.450). DETECCIÓN DE APOPTOSIS.- Se cultivó esplenocitos C57BL6 (3 x 106/ml) en una placa de 24 concavidades durante 20 horas, en 500 µl de RPMI-1640, bajo las condiciones descritas más arriba. Se añadió WHI-P131 a las concentraciones de 0.1, 1, 10 y 100 µg/ml. Se detectó la muerte apoptótica de las células mediante TÚNEL, usando el equipo de detección de células InSitu, fluoresceína (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E. U. A.). Después del periodo de cultivo, se lavó las células, se las fijó, se las permeabilizó y tiñó siguiendo las instrucciones del fabricante, y se 102 analizó la apoptosis mediante citometría de flujo, usando FACS Calibur (Becton Dickinson, San José, CA, E. U. A.). ANÁLISIS CITOMÉTRICO DE FLUJO (FACS).- Se preparó una suspensión de una sola célula de esplenocitos, a partir de ratones C57BL/6 tratados con WHI-P131 (130 mg/kg/día) o tratados con vehículo; se sometió a lisis los glóbulos rojos por medio de regulador de lisis, y se tiñó los esplenocitos (1 x 106) con una dilución 1:100 de ios siguientes anticuerpos (Ab) monoclonales antiratón: anti-CD3-FITC Ab (clon 145-2C11), anti-CD4-FITC Ab (clon GK1.5), anti-CD8-PE Ab (clon 53-6.7) y anti-CD19-PE Ab (clon 1D3). Todos fueron adquiridos de Pharmingen, San Diego, CA, E. U. A. Se analizó los esplenocitos teñidos mediante FACS Calibur, como se describió más atrás. Aislamiento de isleta.- Se aisló isletas de Langerhans de machos BALB/c mediante perfusión de ducto biliar con 3-4 ml de colagenasa P (3 mg/ml) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, E. U. A.) y desoxirribonucleasa (0.1 mg/ml) (Sigma, St. Louis, MO), como se describió previamente en Cetkovic-Cvrlje M. y coautores, 1997, Diabetes, 45: 1975-1982). Se recogió a mano las isletas 3-4 veces bajo microscopio de disección, antes que las isletas estuvieran libres de tejido exocrino, vasos, nodos linfáticos y ductos, y listas para transplante. TRASPLANTE ALÓGENO DE ISLETA Y TRATAMIENTO CON FÁRMACO.- Se colocó cuatrocientas isletas en una jeringa de Hamilton y se las trasplantó debajo de la cápsula renal izquierda de 103 cada ratón receptor diabético. Se hizo diabéticos los receptores con una sola dosis i.p. de estreptozotocina (200 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO, E. U. A.), una semana antes del trasplante. Se midió el nivel de glucosa en la sangre mediante el sistema de vigilancia de glucosa One Touch Profile (Lifescan, Milpitas, CA, E. U. A.). Solamente se usó ratones diabéticos con glicemia superior a 350 mg/dl, como receptores de trasplante. Se vigiló la función de injerto primario como un valor de glucosa en sangre de menos de 200 mg/dl el día 3 después del trasplante, y se definió el rechazo al injerto como una elevación en la glucosa en sangre que fue mayor que 250 mg/dl, en dos mediciones consecutivas, después de un periodo de función de injerto primario. Se trató diariamente los receptores con una dosis elevada (20 mg/kg) de ciclosporina A (Sigma, St. Louis, MO, E. U. A.), WHI-P131 (50 y 75 mg/kg, divididos en tres dosis), WHI-P132 (50 mg/kg, dividida en tres dosis) o con control de vehículo, desde el día del trasplante hasta el día del rechazo. Todas las inyecciones fueron aplicadas i.p. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA INTRAPERITONEAL (IPGTT) EN RECEPTORES DE TRASPLANTE SINGÉNICO DE ISLETA.- Se llevó a cabo IPGTT en receptores C57BL/6 que fueron trasplantados con injertos de isleta singénica (400 isletas de C57BL/6) y tratados con WHI-P131 o control de vehículo durante dos meses. Se dejó en ayunas los ratones durante 10 horas, y se inyectó solución de glucosa (15 g/kg de peso del cuerpo) i.p. Antes y después de la inyección de glucosa se tomó 1 04 muestras de sangre y se midió los niveles de g lucosa en la sangre (como se describió más atrás) a los puntos de tiempo de 0, 30, 60 y 120 minutos. ESTUDIOS H ISTOPATOLÓG ICOS.- Se sacrificó los receptores de aloinjerto de isleta (n = 5) C57BL/6, de control con vehículo (n = 3) y tratados con WHI-P 131 , el día 14 posterior al trasplante; se sacrificó los receptores Jak3"/_ (n-) el día 100 después del trasplante; se sacrificó los receptores de isletas singénicas C57BL/6 -tratados con control de veh ículo (n = 4) y tratados con WHI-P131 (n = 5) el día 180 después del trasplante. Se retiró los ríñones que llevan injertos, se los fijó en formalina al 10% y se embebió en parafina. Se cortó secciones seriadas de área de injerto y se las tiñó con hematoxilina y con eosina. Para la tinción con insulina se tiñó las secciones mediante el método de inmunoperoxidasa usando una dilución 1 : 100 de anticuerpo antiinsulina de cuyo policlonal (Gpx I nsulin, Dako, Carpintería, CA, E. U. A.) y una dilución 1 : 100 de anticuerpo secundario, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Inmunoglobulinas de cuyo HRP, Dako, Carpintería, CA, E. U. A.). Se contratiñó brevemente las secciones con hematoxilina y se las montó para examen en microscopio de luz. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Se efectuó el análisis estadístico usando la prueba t de Student no apareada (datos MLR y FACS). Las diferencias experimentales en los rechazos de aloinjerto entre los grupos tratado con fármaco y de control fueron determinadas mediante el análisis con la tabla de vida de Kaplan- 1 05 Meier, usando la prueba Mantel-Cox. El va lor p <0.05 fue considerado estad ísticamente importante.

RESULTADOS PARA EL EJEMPLO 8 LOS RATON ES JAK3"'" NO RECHAZAN EL ALOI NJERTO D E I SLETA.- Se trasplantó machos deficientes en JAK3 (n = 6) y sus compañeros de nidada WT (n = 7), que se volvieron d iabéticos mediante STZ, con isletas BALB/c, debajo de la cápsula renal, y se siguió el nivel de glucosa en la sangre durante 100 días después del trasplante. Si bien los aloinjertos de isleta, de los controles WT fueron rechazados con un MST de 12.9 ± 1 .1 días, todos los aloinjertos de isleta de los receptores de JakS'Aobrevivieron 100 días después del trasplante (figura 35). El análisis histológico de los injertos mostró ninguna infiltración (datos no mostrados) a ligera infiltración mononuclear del área de injerto, con morfología de isleta completamente preservada. INHIBICIÓN DE LA RESPUESTA A MLR, INDUCIDA POR WHI-P131 .- WHI-P131 , añadido a una concentración de 0.1 , 1 , 10 y 50 µg/ml, inhibió la proliferación de esplenocitos alorreactivos en MLR, de una manera que dependió de la dosis (figura 36). Si bien la concentración de 0.1 g/ml de WH I-P 131 indujo reducción estadísticamente importante (p = 0.0095) de la respuesta a MLR, la abrogación completa de la respuesta (los valores O. D. obtenidos fueron inferiores al nivel O. D. de los controles sin estimulación), fue 1 06 obtenida al añad ir 1 µg/ml de WH I-P 131 (figura 36) . A continuación se probó si la muerte de iinfocitos inducida por WH I-P 131 era la razón para la respuesta de MLR inhibida. Por lo tanto, se determinó los esplenocitos apoptóticos (TUNEL-positivos) después del periodo de cultivo de 20 horas, con adición de diferentes concentraciones de WH I-P 131 . La figura 37 muestra q ue la muerte de célula apoptótica de los esplenocitos cultivados con ad ición de 0.1 y 1 µg/ml de WH I-P 1 31 no difiere de las células de control, mientras que la adición de 10 y 100 µg/ml de WH I-P 131 aumentó significativamente (p = 0.008 y p <0.0001 , respectivamente, la muerte apoptótica de células, en comparación con la muerte de las células de control, durante el periodo de cultivo observado. Por lo tanto, los efectos de WHI-P131 sobre la supresión de MLR, obtenida con menor concentración del fármaco (0.1 y 1 µg/ml), parece no ser provocada por la inducción de la muerte de las células. EL TRATAM I ENTO CON WH I-P 131 D E RECEPTORES PROLONGÓ LA SOBREVIVENCIA D E ALO INJ ERTO DE ISLETA. Los ratones C57BL/6 de control (n = 39) rechazaron el aloinjerto de isleta de BALB/c con un tiempo medio de sobrevivencia (MST) de 14.1 ± 0.9 días. El tratamiento diario de los receptores (n = 10) con una dosis elevada, 20 mg/kg, de CsA(18) aumentó significativamente (p = 0.0005) la sobrevivencia de aloinjerto (MST = 27.9 ± 4.6 días) (figura 38). Los tratamientos con 50 mg/kg (n = 14) o con 75 mg/kg (n = 14) de WH I-P 131 fueron tan efectivos como el tratamiento con CsA, en prolongar la sobrevivencia de aloinjerto (MST = 24.7 ± 3.4 y 25.3 ± 1 07 3.8, respectivamente) en comparación con los controles (p = 0.0002 y 0.001 , respectivamente) (figura 38). El examen histológico de los aloinjertos de isleta que fueron cosechados a los 14 días después del trasplante, de receptores normoglicémicos tratados con el control con veh ículo (n = 3) mostró invasión linfocítica y destrucción masiva de isleta, como se ve claramente con inmunotinción para la insulina. Este descubrimiento está en contraste total con los aloinjertos de receptores tratados con 50 mg/kg de WH I-P 131 (n =5), en los que estuvo presente una infiltración linfocítica, pero sin destrucción extensa de las isletas. Los aloinjertos tratados con vehículo hiperglicémicos (n = 4), cosechados en el mismo punto de tiempo, estaban invadidos completamente por linfocitos, sin células productores de insulina restantes. Se llevó a cabo el siguiente experimento con la finalidad de estudiar los efectos del tratamiento con WH I-P131 de las poblaciones de esplenocitos, in vivo. Se trató machos C57BL/6 con 130 mg/kg de WH I-P131 (n = 7) y con control de vehículo (n = 5) durante 10 días. Se encontró que el número total de esplenocitos ea de 154 ± 8.5 x 106 en los controles tratados con vehículo, mientras que se encontró un número reducido de esplenocitos, 1 19 ± 9.4 x 106, en ratones tratados con WHI-P 131 (p = 0.025). No hubo diferencias en los porcentajes de células T CD3 + , CD4+ y CD8+ ni en células CD19+ B, entre los ratones tratados con WHI-P131 y tratados con vehículo (datos no mostrados. Sin embargo, la figura 6 108 muestra que se encontró ligeras diferencias en el número de poblaciones de células estudiadas, entre los grupos tratado con WHI-P131 y de control. Así, el número de esplenocitos CD3+ se redujo a 37.7 ± 3.2 x 106 (sin embargo, no estadísticamente significativo, p = 0.0617) en ratones tratados con WHI-P131, en comparación con 46.9 ± 2.6 x 106 en los controles. El número de células T CD4+ - 16.8 ± 1.2 x 106 (p = 0.0416) así como células B - 57.1 ± 5.3 x 106 (p = 0.0267) se redujo en los ratones tratados con WHI-P131, en comparación con los controles, 20.5 ± 0.6 x 106 y 78.2 ± 6.1 x 106, respectivamente (figura 39). LA FUNCIÓN DE ISLETAS SINGÉNICAS TRASPLANTADAS ES PRESERVADA DESPUÉS DEL TRATAMIENTO A LARGO PLAZO CON WHI-P131. Se efectuó este estudio para probar el efecto del tratamiento a largo plazo (180 días) con 50 mg/kg de WHI-P131 sobre la función de injerto de isleta singénica. Como se pudo ver en la figura 40, el nivel de glucosa en la sangre, no en ayunas, no difirió durante todo el periodo experimental de 180 días después del trasplante entre el control con vehículo (n = 4) y los receptores singénicos tratados con WHI-P131 (n = 5). Se llevó a cabo IPGTT el día 70 del tratamiento. El nivel de glucosa en la sangre, no en ayunas, de los controles y de los receptores tratados con P131, en ese momento, fue 102.0 ± 6.7 y 124.6 ± 108 mg/dl, respectivamente. La prueba IPGTT mostró que no hubo diferencia importante en la función de isleta de machos C57BL/6 no tratados, no trasplantados, los receptores trasplantados y tratados con vehículo (controles) y los 1 09 receptores trasplantados y tratados con WH I-P 131 (figura 41 ). Se llevó a cabo otra prueba I PGTT ai final del periodo experimental (d ía 180 después del trasplante). El nivel de glucosa en sangre, no en ayunas, en ese momento, fue de 120.9 ± 12.5 en receptores con control de vehículo y 1 15.2 ± 9.2 mg/dl en receptores tratados con WH I-P 131 . La prueba I PGTT mostró nuevamente que la función isleta de los receptores tratados con WH I-P 131 no fue diferente de la función de isleta de ninguno de los ratones receptores de control o C57B L/6 no trasplantados. Los ejemplos representativos de la evaluación microscópica con luz de los injertos de isleta singénicos, con control de vehículo y tratados con WH I-P 1 31 , están ilustrados en la figura 8. La tinción con hematoxilina y con eosina de los injertos de control con vehículo y tratados con WHI-P131 mostró que no hubo cambios morfológicos importantes entre ellos. El análisis inmunohistoquímico confirmó que la expresión de insulina en los injertos tratados con WH I-P 131 fue comparable a la de los injertos de los receptores tratados con el control de vehículo. Todas las publicaciones, patentes y documentos de patente quedan incorporados aq uí mediante la referencia, como si fueran incorporados individualmente mediante la referencia. Se ha descrito la invención con referencia a diversas modalidades y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, se debe entender que se puede hacer muchas variaciones y modificaciones, permaneciendo siempre dentro del espíritu y alcance de la invención.

Claims (1)

110 REIVINDICACIONES 1.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir el rechazo de trasplante de órganos en un mamífero; donde: X es HN, R,,N, S, O, CH2 o R„CH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R?-R4 es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos d carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9 y Río juntos son metilendioxi, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2.- El uso de conformidad con la reivindicación 1, 111 caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fen¡l)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-hidroxil-fenil)-amino-6,7-dimetox¡quinazolina, 4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxil-fenil)am¡no-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, o su sal farmacéuticamente aceptable. 3.- El uso de un compuesto de la fórmula: en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir el rechazo de trasplante de órganos en un mamífero. 4.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la respuesta inflamatoria inducida por radiación UVB en un mamífero; donde: 112 X está seleccionado de HN, R„N, S, O, CH2 o RpCH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y Rs es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de Rg y R10 es ¡ndependientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9 y R10, juntos, son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 5.- El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazol¡na, 4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxi-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3-bromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, o su sal farmacéuticamente aceptable. 6.- El uso de un compuesto de la fórmula: 113 en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la respuesta inflamatoria inducida por radiación UVB en un mamífero. 7.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para inhibir la liberación de prostaglandina E2 en un mamífero; donde: X es HN, RnN, S, O, CH2 o R,,CH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R?-R es independientemente hidrógeno, hidroxi o "halógeno; cada uno de R6, R7 y Rß es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9 y R10 juntos son 114 metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 8.- El uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetox¡quinazolina, 4-(3'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3',5'-d?bromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, o su sal farmacéuticamente aceptable. 9.- El uso de un compuesto de la fórmula: en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la respuesta inflamatoria inducida por radiación UVB en un mamífero. 10.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir el daño 115 inducido por radiación UVB a células epiteliales, o la frecuencia de mutación en la piel de un mamífero, donde: X es HN, RnN, S, O, CH2 O R„CH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y R8 es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de Rg y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o Rg y R10 juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 11.- El uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3',5'-dibromo-4'-hídroxil- fe nil)amino-6,7-dimetoxiquina zolina, 4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, o su sal farmacéuticamente aceptable. 12.- El uso de un compuesto de la fórmula: 116 en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir el daño inducido por radiación UVB a las células epiteliales, o la frecuencia de mutación en la piel de un mamífero. 13.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir el edema cutáneo o los cambios en la permeabilidad vascular, inducidos por radiación UVB, en un mamífero, donde: X es HN, RnN, S, O, CH2 o R CH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y R8 es independientemente hidrógeno, hidroxi, 117 mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de Rg y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9 y R10 juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 14.- El uso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-d¡metoxiquinazl¡na, 4-(3'-bromo-4 '-hid roxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazo lina, o su sal farmacéuticamente aceptable. 15.- El uso de un compuesto de la fórmula: en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir el edema cutáneo o los cambios en la permeabilidad vascular, inducidos por radiación UVB, en un mamífero. 16.- El uso de un compuesto de la fórmula I: 118 en la fabricación de un medicamento para proteger un mamífero contra los efectos tumorígenos de la luz UVB; donde: X es HN, R,,N, S, O, CH2 o RnCH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es ¡ndependientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y Rß es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9 y R 0 juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 17.- El uso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 119 4-(3' -hid roxil-fenil)amino-6,7-dimetox i quinazolina, 4-(3'-hidroxil-fen¡l)am¡no-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-5'-dibromo-4 '-hidroxi I- fe nil)amino-6,7-dimetoxiquinazol¡na, 4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, o su sal farmacéuticamente aceptable. 18.- El uso de un compuesto de la fórmula: en la fabricación de un medicamento para proteger a un mamífero contra los efectos tumorígenos de la luz UVB. 19.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad de célula T en un mamífero, donde: X es HN, RnN, S, O, CH2 o R(1CH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 120 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y R8 es ¡ndependientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y R10 es ¡ndependientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi, halógeno o alcanoílo; o R9 y R10 juntos son metilendioxi, o su sal farmacéuticamente aceptable. 20.- El uso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiqu¡nazolina, 4-(3'-hidroxil-fenil)am¡no-6,7-dimetoxiquinazol¡na, 4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetox¡qu¡nazolina, 4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-d¡metoxiquinazol¡na, o su sal farmacéuticamente aceptable. 21.- El uso de un compuesto de la fórmula: en la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad de célula T en un mamífero. 121 22.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmunológica en un mamífero; donde: X es HN, R„N, S, O, CH2 o RnCH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y Rß es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9 y R10 juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 23.- El uso de conformidad con la reivindicación 22, 122 caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-hidrox¡l-fenil)am¡no-6,7-dimetoxiqu¡nazolina, 4-(3',5'-dib romo -4 '-hidroxil- fe nil)amino-6,7-dimetoxiqu i nazolina, 4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, o su sal farmacéuticamente aceptable. 24.- El uso de un compuesto de la fórmula: en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmunológica en un mamífero. 25.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad de injerto contra receptor, después de un trasplante de médula ósea un mamífero; 123 donde: X es HN, R11N, S, O, CH2 o R„CH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y Rs es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o Rg y R10 juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 26.- El uso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el compuesto es: 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina, 4-(3'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazol¡na, 4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxil-fenil)am¡no-6,7-dimetox¡quinazolina, 4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fen i l)amino-6,7-dimetoxiquina zolina, o su sal farmacéuticamente aceptable. 27.- El uso de un compuesto de la fórmula: 124 en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar la enfermedad de injerto contra receptor después de un trasplante de médula ósea en un mamífero. 28.- El uso de un compuesto de la fórmula I: en la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad de JAK- 3-tirosina-cinasa; donde: X es HN, RnN, S, O, CH2 o R CH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y Re es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 125 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y R10 es ¡ndependientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9 y R10 juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 29.- El uso de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 es un compuesto de la fórmula II: donde: R3' es H o halógeno; R4. es OH; R5- es H o halógeno; cada uno de R9> y R10- es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9> y Río- juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 30.- El uso de conformidad con la reivindicación 28, 126 caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 comprende 4-(4'-hidroxilfenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina o una sal farmacéuticamente aceptable de ella. 31.- El uso de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 comprende 4-(3'-bromo-4'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina o una sal farmacéuticamente aceptable de ella. 32.- El uso de un compuesto inhibidor de JAK-3-tirosina-cinasa en la fabricación de un medicamento para tratar la inflamación. 33.- El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3-tirosina cinasa es un compuesto de la fórmula I: donde: X es HN, RnN, S, O, CH2 o RnCH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o 127 halógeno; cada uno de R6, R7 y Rß es ¡ndependientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y R10 es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, aicoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o Rg y R1o juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 34.- El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 es un compuesto de la fórmula II: en la que: R3- es H o halógeno; R4- es OH; R5' es H o halógeno; R6- es H; cada uno de R9- y R10- es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 128 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o Rg- y R10- juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 35.- El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 comprende 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina o una sal farmacéuticamente aceptable de ella. 36.- El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 comprende 4-(3'-bromo-4'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina o una sal farmacéuticamente aceptable de ella. 37.- El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 comprende 4-(3',5'-dibromo-4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina o una sal farmacéuticamente aceptable de ella. 38.- El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la inflamación es inflamación de las vías respiratorias. 39.- El uso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la inflamación es asma. 40.- El uso de un compuesto inhibidor de JAK-3 tirosina-cinasa en ia fabricación de un medicamento para inhibir el asma mediada por célula mastoidal. 41.- El uso de un compuesto inhibidor de JAK-3 tirosina-cinasa en la fabricación de un medicamento para tratar una patología 129 en la que está implicada la función de célula mastoidal y se desea la inhibición de la función de célula mastoidal. 42.- El uso de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 es un compuesto de la fórmula i: donde: X es HN, RnN, S, O, CH2 o R„CH; Rn es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; cada uno de R1-R5 es independientemente hidrógeno, hidroxi o halógeno; cada uno de R6, R7 y Rß es independientemente hidrógeno, hidroxi, mercapto, amino, nitro, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono o halógeno; y cada uno de R9 y Río es independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o R9 y R10 juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 130 43.- El uso de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque el inhibidor e JAK-3 es un compuesto de la fórmula II: donde: R3- es H o halógeno; R4. es OH; R5' es H o halógeno; R6- es H; cada uno de Rg- y R10- es ¡ndependientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, halógeno o alcanoílo de 1 a 4 átomos de carbono; o Rg> y R10- juntos son metilendioxi; o su sal farmacéuticamente aceptable. 44.- El uso de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque el inhibidor de JAK-3 es 4-(4'-hidroxil-fenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina o 4-(3'-bromo-4'-hidroxil-fenil) amino-6,7-dimetoxiquinazolina, o su sal farmacéuticamente aceptable.