DE69734521T2

DE69734521T2 - Kombinatorische indolinonbibliotheken und verwandte produkte und verfahren zur behandlung von erkrankungen

Info

Publication number: DE69734521T2
Application number: DE69734521T
Authority: DE
Inventors: Cho Peng Tang; Li Sun; Gerald Mcmahon; Peter Klaus HIRTH; Kay Laura SHAWVER
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-20
Publication date: 2006-07-06
Also published as: DE69734521T9; ATE308520T1; EP1247803A2; ES2251741T3; CA2264220A1; AU4155697A; DE69734521D1; EP0929520B1; JP2001503736A; WO1998007695A1; EP0929520A1; EP1247803A3

Description

Einführung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die die Proteinkinasesignaltransduktion modulieren, regulieren und/oder inhibieren können.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Synthetisieren dieser Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen umfassen und die Verwendung solcher Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zum Vorbeugen und/oder Behandeln von Störungen, die mit einer unregulierten Proteinkinasesignaltransduktion, einschließlich zellproliferativen und metabolischen Störungen, im Zusammenhang stehen.
Hintergrund der Erfindung
Die folgende Beschreibung des Hintergrundes der Erfindung wird bereitgestellt, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, sie soll jedoch nicht zur Beschreibung des Standes der Technik der Erfindung dienen.
Proteinkinasen und Proteinphosphatasen regulieren eine breite Vielfalt von zellulären Prozessen, die den Metabolismus, die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung und das Zellüberleben durch Teilnehmen an den Signaltransduktionswegen einschließen. Veränderungen in der zellulären Funktion einer Proteinkinase oder einer Proteinphosphatase können verschiedene Erkrankungszustände in einem Organismus zur Folge haben. Zum Beispiel hängen viele Arten von Krebstumoren mit einer Zunahme der Aktivität spezifischer Proteinkinasen zusammen. Die Zell- und Gewebedegeneration kann auch mit der Abnahme der Aktivität von bestimmten Proteinkinasen zusammenhängen.
Die zelluläre Signaltransduktion ist ein fundamentaler Mechanismus, bei dem extrazelluläre Reize in das Innere der Zelle weitergeleitet werden. Einer der biochemischen Schlüsselmechanismen der Signaltransduktion schließt die reversible Phosphorylierung von Proteinen ein. Die Phosphorylierung von Aminosäuren reguliert die Aktivität von reifen Proteinen durch Verändern ihrer Struktur und Funktion.
Das Phosphat befindet sich am häufigsten am Hydroxylrest von Serin, Threonin oder Tyrosinaminosäuren in Proteinen. Enzyme, die die Phosphorylierung von zellulären Effektoren vermitteln, fallen in zwei Klassen. Während Proteinphosphatasen Phosphatreste an Phosphorylproteinsubstraten hydrolisieren, übertragen Proteinkinasen einen Phosphatrest von Adenosintriphosphat auf Proteinsubstrate. Die umgekehrten Funktionen von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen balancieren und regulieren den Signalfluss in Signaltransduktionsprozessen.
Proteinkinasen werden in zwei Gruppen aufgeteilt – Rezeptor- und Nichtrezeptor-Proteintypen. Rezeptorproteinkinasen umfassen einen extrazellulären Bereich, einen Transmembranbereich und einen intrazellulären Bereich. Ein Teil des intrazellulären Bereiches von Rezeptorproteinkinasen beherbergt eine katalytische Domäne. Während Nichtrezeptorproteinkinasen keine extrazellulären oder Transmembranbereiche beherbergen, umfassen sie doch einen Bereich, der den intrazellulären Bereichen ihrer Rezeptorgegenstücke ähnelt.
Proteinkinasen sind weiterhin auf Grundlage der Aminosäuren auf die sie wirken in drei Klassen unterteilt. Einige fügen Phosphat nur an Serin oder Threonin, einige fügen Phosphat nur an Tyrosin und einige fügen Phosphat nur an Serin, Threonin und Tyrosin.
Im Bemühen neue Behandlungen für Erkrankungen zu entdecken, haben biomedizinische Forscher und Chemiker Moleküle, die die Funktion der Proteinkinasen inhibieren, entworfen, synthetisiert und getestet. Einige kleine organische Moleküle bilden eine Klasse von Verbindungen, die die Funktion von Proteinkinasen modulieren.
Die Verbindungen, die Zellmembranen überqueren können und gegenüber einer Säurehydrolyse resistent sind, sind potentiell vorteilhafte Therapeutika, da sie, nachdem sie dem Patienten oral verabreicht worden sind, biologisch gut verfügbar werden können. Jedoch inhibieren viele dieser Proteinkinaseinhibitoren die Funktion von Proteinkinasen nur schwach. Zusätzlich inhibieren viele eine Vielzahl von Proteinkinasen und werden daher als Therapeutika für Erkrankungen multiple Nebenwirkungen verursachen.
Einige Indolinonverbindungen bilden jedoch Klassen von säureresistenten und membranpermeablen organischen Molekülen, die möglicherweise nur spezifische Proteinkinasen inhibieren. Die Indolinonsynthese, Verfahren zum Testen der biologischen Aktivität von Indolinonen und Inhibitionsmuster einiger Indolinonderivate sind in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist und mit „Benzylidene-Z-Indolinone Compounds for the Treatment of Disease" von Tang et al. (Lyon & Lyon Aktennummer 223/298) betitelt worden ist, und der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/22976, die am 1. August 1996 veröffentlicht worden ist, von Ballinari et al. beschrieben.
Trotz der signifikanten Fortschritte, die bei der Entwicklung von auf Indolinon basierenden Pharmazeutika gemacht worden sind, bleibt im Stand der Technik ein Bedarf zur Identifikation der besonderen Strukturen und Substitutionsmuster, die die Inhibition von bestimmten Proteinkinasen verursachen und andere näher beschriebene biologische Aktivitäten, bestehen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft organische Moleküle, die die Proteinkinasesignaltransduktion modulieren, regulieren und/oder inhibieren können. Solche Verbindungen sind zur Behandlung von Erkrankungen, die mit der unregulierten Proteinkinasesignaltransduktion, einschließlich von Zellproliferationserkrankungen, wie z.B. Krebs, Arteriosklerose, Arthritis und Restenose, und metabolischen Erkrankungen, wie z.B. Diabetes, zusammenhängen, verwendbar. Die betroffenen Proteinkinasen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf FLK, FGFR, PDGFR und raf.
Die vorliegende Erfindung betrifft Indolinonverbindungen, die möglicherweise Proteinkinasen inhibieren, und damit im Zusammenhang stehende Produkte und Verfahren.
Indolinonverbindungen, die die FLK- und die Plättchenwachstumsfaktor-Rezeptorproteinkinasen inhibieren, können einen Tetrahydroindol- oder Cyclopentan-b-Pyrrolrest beherbergen.
Diese Erfindung betrifft neue wasserlösliche Indolinonverbindungen, die Tyrosinkinaseinhibitoren sind und damit im Zusammenhang stehende Produkte und Verfahren.
Die Verbindungen der Erfindung repräsentieren eine neue Generation von potentiellen Therapeutika für Erkrankungen, die durch eine oder mehrere nicht funktionale Proteinkinasen verursacht werden. Neurodegenerative Erkrankungen fallen in diese Klasse von Erkrankungen, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf die Parkinson Erkrankung und die Alzheimer Erkrankung. Die Verbindungen können modifiziert werden, so dass sie für ihr Ziel oder Ziele spezifisch sind, und demnach weniger Nebenwirkungen verursachen und daher eine neue Generation von potentiellen Krebstherapeutika darstellen. Diese Eigenschaften sind wichtige Verbesserungen gegenüber den derzeit verwendeten Krebstherapeutika, die viele Nebenwirkungen haben und die Patienten auf schädliche Weise schwächen.
Es wird vermutet, dass die Verbindungen der Erfindung feste Tumoren durch spezifisches Inhibieren der Aktivität der FLK-Proteinkinase minimieren und auslöschen werden, oder zumindest das Tumorwachstum und/oder Metastasen modulieren oder inhibieren werden. Die FLK-Proteinkinase reguliert die Proliferation von Blutgefäßen während der Angiogenese. Erhöhte Angiogeneseraten begleiten das Krebstumorwachstum in Zellen, da Krebstumoren durch sauerstoffhaltiges Blut während des Wachstums ernährt werden müssen. Daher werden die Inhibition der FLK-Proteinkinase und die entsprechenden Verringerungen der Angiogenese die Tumoren in Bezug auf die Nährstoffe aushungern und sie höchstwahrscheinlich auslöschen.
Da ein genaues Verständnis des Mechanismus durch den Verbindungen PTK's inhibieren (z.B. der Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor 1 [FGFR1]), nicht erforderlich ist, um die vorliegende Erfindung auszuführen, glaubt man, dass die Verbindungen mit den Aminosäuren des katalytischen Bereiches der PTK's interagieren. PTK's besitzen für gewöhnlich eine zweilappige Struktur und ATP scheint in der Spalte zwischen den zwei Lappen in einem Bereich zu binden, in dem die Aminosäuren bei PTK's konserviert sind; man glaubt, dass die Inhibitoren von PTK's an die PTK's durch nicht kovalente Interaktionen, wie z.B. Wasserstoffbrückenbindung, Van-der-Waals Interaktionen und ionische Bindung, im gleichen allgemeinen Bereich binden, der ATP an die PTK's bindet. Man glaubt insbesondere, dass die Oxindolkomponente der Verbindungen der vorliegenden Erfindung im gleichen allgemeinen Raum bindet, der durch den Adeninring von ATP besetzt wird. Die Spezifität eines Indolinon-PTK-Inhibitors für eine bestimmte PTK kann durch Interaktionen zwischen den Konstituenten um den Oxindolkern herum mit Aminosäuredomänen, die für individuelle PTK's spezifisch sind, übertragen werden. Daher können verschiedene Indolinonsubstituenten zur bevorzugten Bindung an bestimmte PTK's beitragen. Die Fähigkeit solche Verbindungen auszuwählen, die an verschiedenen ATP oder anderen Nukleotidbindungsstellen aktiv sind, macht sie beim gezielten Ansteuern aller Proteine mit einer solchen Stelle, nicht nur Proteintyrosinkinasen, sondern auch Serin/Threoninkinasen und Proteinphosphatasen, verwendbar. Demnach haben solche Verbindungen einen Nutzen für in vitro Assays für solche Proteine, und für die therapeutische Wirkung durch solche Proteine in vivo.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine Indolinonverbindung der folgenden Formel
wobei

(a) R₁ aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
(i) Wasserstoff;
(ii) C₁-C₁₀ Alkyl, das optional mit einem monozyklischen oder bizyklischen fünf-, sechs-, acht-, neun- oder zehngliedrigem Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring substituiert ist, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist;
(iii) ein fünf-, sechs-, acht-, neun- oder zehngliedriger monozyklischer oder bizyklischer Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist;
(iv) einem Keton der Formel -CO-R₁₉, wobei R₁₉ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt wird;
(v) einer Carbonsäure der Formel -(R₁₂)_n-COOH oder einem Ester der Formel -(R₁₃)_m-COO-R₁₄, wobei R₁₂, R₁₃ und R₁₄ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden, und n und m unabhängig voneinander 0 oder 1 sind;
(vi) ein Sulfon der Formel -(SO₂)-R₁₅, wobei R₁₅ aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt wird, wobei der Ring optional mit einem C₁-C₁₀ Alkylrest substituiert ist;
(vii) ein -(R₁₆)_n-(Indol-1-yl) oder -(R₁₇)_m-CHOH-(R₁₈)_p-(Indol-1-yl), wobei der Indolrest optional mit einem Aldehyd substituiert ist, und R₁₆, R₁₇ und R₁₈ C₁-C₁₀ Alkyl, und n, m und p unabhängig voneinander 0 oder 1 sind;
(viii) zusammengenommen mit einem 2' Substituenten des Indolrings einen trizyklischen Rest bildet, wobei jeder Ring in dem trizyklischen Rest ein fünf- oder sechsgliedriger Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring ist;
(b) R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₇, R₈, R₉ und R₁₀ unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus
(i) Wasserstoff;
(ii) C₁-C₁₀ Alkyl, das optional mit einem monozyklischen oder bizyklischen fünf-, sechs-, acht-, neun- oder zehngliedrigem Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring substituiert ist, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist;
(iii) ein fünf-, sechs-, acht-, neun- oder zehngliedriger monozyklischer oder bizyklischer Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist;
(iv) einem Keton der Formel -CO-R₂₀, wobei R₂₀ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltenden heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt wird;
(v) einer Carbonsäure der Formel -(R₂₁)_n-COOH oder einem Ester der Formel -(R₂₂)_m-COO-R₂₃, wobei R₂₁, R₂₂ und R₂₃ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden, und n und m unabhängig voneinander 0 oder 1 sind;
(vi) Halogen;
(vii) einem Alkohol der Formel (R₂₄)_m-OH oder einem Ether der Formel -(R₂₄)_n-O-R₂₅, wobei R₂₄ und R₂₅ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden, und m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 sind;
(viii) -NR₂₆R₂₇, wobei R₂₆ und R₂₇ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Sauerstoff, C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltenden heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden;
(ix) -NHCOR₂₈, wobei R₂₈ aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Hydroxyl, C₁-C₁₀ Alkyl, einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring, wobei der Ring optional substituiert ist mit C₁-C₁₀ Alkyl, Halogen, -(R)_n-COOH, wobei R aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus C₁-C₁₀ Alkyl oder Aryl einschließlich einer monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen fünf- oder sechsgliedrigen aromatischen Gruppe, wobei mindestens ein Ring ein konjugiertes pi-Elektronensystem besitzt und wobei n 0 oder 1 ist, oder -(R)_n-COOR', wobei R und R' unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus C₁-C₁₀ Alkyl oder Aryl einschließlich einer monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen fünf- oder sechsgliedrigen aromatischen Gruppe, wobei mindestens ein Ring ein konjugiertes pi-Elektronensystem besitzt und wobei n 0 oder 1 ist;
(x) -SO₂NR₂₉R₃₀, wobei R₂₉ und R₃₀ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Sauerstoff, C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden;
(xi) zwei beliebige von R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆ oder R_6' oder zwei beliebige von R₇, R₈, R₉ oder R₁₀ zusammengenommen einen bizyklischen oder trizyklischen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltenden heterozyklischen Rest bilden, der mit dem sechsgliedrigen Ring des Indoles verbunden ist, wobei jeder Ring in dem multizyklischen Rest ein fünf- oder sechsgliedriger Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring ist; und
(c) R₁₁ Wasserstoff oder C₁-C₁₀ Alkyl ist;

Der Begriff „Alkyl" betrifft eine gerade Kette, einen verzweigten oder zyklisch gesättigten oder zyklisch gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, bevorzugt ein niederes Alkyl mit von 1 bis 7 Kohlenstoffen und am meisten bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffen. Typische Alkylgruppen schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tertiäres Butyl, Pentyl, Hexyl und ähnliches ein. Die Alkylgruppe kann substituiert sein und einige typische Alkylsubstituenten schließen Hydroxyl, Cyano, Alkoxy, Sauerstoff, Schwefel, Nitroxy, Halogen, -N(CH₃)₂, Amino und -SH ein.
Der Begriff „Methyl" betrifft einen gesättigten Alkylrest eines Kohlenstoffs. Der Begriff „Ethyl" betrifft einen gesättigten Alkylrest mit zwei Kohlenstoffen. Der Begriff „Propyl" betrifft einen gesättigten Alkylrest mit drei Kohlenstoffen. Der Begriff „Butyl" betrifft einen gesättigten Alkylrest mit vier Kohlenstoffen. Der Begriff „Pentyl" betrifft einen gesättigten Alkylrest mit fünf Kohlenstoffen.
Der Begriff „Aryl" betrifft eine aromatische Gruppe, die wenigstens einen Ring mit einem konjugierten Pi-Elektronensystem aufweist und sowohl carbozyklisches Aryl (z.B. Phenyl) als auch heterozyklische Arylgruppen (z.B. Pyridin) einschließt. Arylreste schließen monozyklische, bizyklische und trizyklische Ringe ein, wobei jeder Ring bevorzugt fünf oder sechs Mitglieder aufweist. Der Arylrest kann substituiert sein, und typische Arylsubstituenten schließen Halogen, Trihalomethyl, Hydroxyl, -SH, -OH, -NO₂, Amin, Thioether, Cyano, Alkoxy, Alkyl und Amino ein.
Die Begriffe „Heterozyklus" oder „heterozyklisch" betreffen Verbindungen, die einen Ring bilden und bis zu vier Heteroatome enthalten, wobei der Rest der Atome, die den Ring bilden, Kohlenstoffe sind. Demnach kann jeder Ring in der Struktur null, ein, zwei, drei oder vier Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome innerhalb des Rings enthalten. Der Ring kann bevorzugt mit Wasserstoffatomen gesättigt sein, noch bevorzugter eine oder mehrere Nichtsättigungen beherbergen und am meisten bevorzugt ein Aryl konjugiertes Pi-Elektronensystem enthalten. Die Ringe sind bevorzugt elf-, zwölf-, dreizehn- oder vierzehngliedrige Ringe, noch bevorzugter acht-, neun- oder zehngliedrige Ringe und am meisten bevorzugt fünf- oder sechsgliedrige Ringe. Beispiele für solche Ringe sind Furyl, Thienyl, Pyrrol, Imidazolyl, Indolyl, Pyridinyl, Thiadiazolyl, Thiazolyl, Piperazinyl, Dibenzfuranyl, Dibenzthienyl. Die heterozyklischen Ringe der Erfindung können wahlweise mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sein, die für gewöhnlich an solche Ringe gebunden sind, wie z.B. Hydroxyl, Brom, Fluor, Chlor, Jod, Mercapto oder Thio, Cyano, Cyanoamido, Alkylthio, Heterozyklen, Aryl, Heteroaryl, Carboxyl, Oxo, Alkoxycarbonyl, Alkyl, Alkenyl, Nitro, Amino, Alkoxyl, Amido und ähnliche. Strukturen einiger bevorzugter heterozyklischer Ringe sind die fusionierten Ringe, die weiter oben dargestellt worden sind.
Der Begriff „Aldehyd" betrifft einen chemischen Rest mit der Formel -(R)_n-CHO, wobei R aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alkyl oder Aryl besteht, und n 0 oder 1 ist.
Der Begriff „Keton" betrifft einen chemischen Rest mit der Formel -(R)_n-CO-R', wobei R und R' aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Alkyl oder Aryl besteht, und n 0 oder 1 ist.
Der Begriff „Carbonsäure" betrifft einen chemischen Rest mit der Formel -(R)_n-COOH, wobei R aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alkyl oder Aryl besteht, und n 0 oder 1 ist.
Der Begriff „Ester" betrifft einen chemischen Rest mit der Formel -(R)_n-COOR', wobei R und R' unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Alkyl oder Aryl besteht, und n 0 oder 1 ist.
Der Begriff „Sulfon" betrifft einen chemischen Rest mit der Formel -SO₂-R, wobei R aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alkyl oder Aryl besteht.
Der Begriff „pharmazeutisch annehmbares Salz" betrifft eine Formulierung einer Verbindung, die keine bedeutsame Reizung bei einem Organismus verursacht und die biologische Aktivität und die Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt. Pharmazeutische Salze können durch Umsetzen einer Verbindung der Erfindung mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salzsäure, Hydrobromsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluensulfonsäure, Salicylsäure und ähnliche, erhalten werden.
Der Begriff „Arzneimittelvorstufe" betrifft ein Agens, das in vivo in die Arzneimittelendstufe umgewandelt wird. Arzneimittelvorstufen können in einigen Situationen einfacher verabreicht werden als die Arzneimittelendstufe. Zum Beispiel kann die Arzneimittelvorstufe durch orale Verabreichung biologisch verfügbar sein, die ausgereifte Form jedoch nicht, oder die Arzneimittelvorstufe kann die Löslichkeit verbessern, um eine intravenöse Verabreichung zu ermöglichen.
Ein bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Indolinonverbindungen der Struktur VIII und XI, wobei R₁, R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₇, R₈, R₉, R₁₀ und R₁₁ Wasserstoff sind.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Oxindolinonverbindungen der Struktur VIII und XI, wobei R₈ Brom, Chlor oder NH₂ ist , und R₁, R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₇, R₉, R₁₀ und R₁₁ Wasserstoff sind.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Indolinonverbindungen der Struktur VIII und XI, wobei R₇ Methyl ist und R₁, R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₇, R₉, R₁₀ und R₁₁ Wasserstoff sind.
In einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren einer Indolinonverbindung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Umsetzen eines Aldehyds der Formel X oder XI mit einem Oxindol der Formel XII,
wobei R₁, R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₇, R₈, R₉,R₁₀ und R₁₁ hierin beschrieben werden; und
(b) Abtrennen der Indolinonverbindung von den Aldehyd- und Oxindolreaktanden abtrennt.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Oxindolinonverbindung der Erfindung und einen physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Indolinonverbindung oder ein hierin beschriebenes Salz, das die katalytische Aktivität einer Proteinkinase moduliert.
Der Begriff „Modulieren" betrifft die Fähigkeit einer Verbindung die katalytische Aktivität einer Proteinkinase zu verändern. Ein Modulator aktiviert bevorzugt die katalytische Aktivität einer Proteinkinase, noch bevorzugter aktiviert oder inhibiert die katalytische Aktivität einer Proteinkinase abhängig von der Konzentration der Verbindung, die der Proteinkinase ausgesetzt wird, oder am meisten bevorzugt inhibiert die katalytische Aktivität einer Proteinkinase.
Der Begriff „Proteinkinase" definiert eine Klasse von Proteinen, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen reguliert. Proteinkinasen regulieren zelluläre Funktionen durch reversibles Phosphorylieren von Proteinsubstraten, die dadurch die Konformation des Substratproteins verändern. Die Konformationsänderung moduliert die katalytische Aktivität des Substrates oder seine Fähigkeit mit anderen Bindungspartnern zu interagieren.
Der Begriff „katalytische Aktivität" definiert im Kontext der Erfindung die Rate, mit der eine Proteinkinase ein Substrat phosphoryliert. Die katalytische Aktivität kann zum Beispiel durch Bestimmen der Menge eines Substrates, das in ein Produkt umgewandelt wird, als eine Funktion der Zeit gemessen werden. Die Phosphorylierung eines Substrates tritt an der aktiven Stelle einer Proteinkinase auf. Die aktive Stelle ist normalerweise eine Höhlung, in der das Substrat an die Proteinkinase bindet und phosphoryliert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Indolinonverbindung, die die katalytische Aktivität einer FLK-Proteinkinase inhibiert. Das Indolinon inhibiert bevorzugt die katalytische Aktivität der FLK-Proteinkinase mit einem IC₅₀ von weniger als 50 μM, noch bevorzugter mit einem IC₅₀ von weniger als 5 μM und am meisten bevorzugt mit einem IC₅₀ von weniger als 0,5 μM.
Der Begriff „FLK" betrifft eine Proteinkinase, die Proteinsubstrate an Tyrosinresten phosphoryliert. Die FLK-Proteinkinase reguliert die zellulären Funktionen als Reaktionen auf den VEGF-Wachstumsfaktor. Diese zellulären Funktionen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die zelluläre Proliferation und besonders die Proliferation von Blutgefäßen in Geweben.
Der Begriff „IC₅₀" im Kontext der Erfindung betrifft einen Parameter, der die Konzentration eines bestimmten Indolinons, das zur Inhibition von 50% der katalytischen Aktivität der FLK-Proteinkinase erforderlich ist, beschreibt. Der IC₅₀-Parameter kann mittels eines hierin beschriebenen Assays und durch Verändern der Konzentration einer bestimmten Indolinonverbindung gemessen werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Indolinonverbindung oder ein Salz der Erfindung und einen physiologisch annehmbaren Träger oder ein Verdünnungsmittel umfasst.
Der Begriff „pharmazeutische Zusammensetzung" betrifft eine Mischung einer Indolinonverbindung der Erfindung mit anderen chemischen Komponenten, wie z.B. Verdünnungsmitteln oder Trägern. Die pharmazeutische Zusammensetzung erleichtert das Verabreichen der Verbindung an einen Organismus. Mehrere Techniken zum Verabreichen einer Verbindung sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die orale, Injektions-, Aerosol, parenterale und topikale Verabreichung. Pharmazeutische Zusammensetzungen können auch durch Umsetzen von Verbindungen mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salzsäure, Hydrobromsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluensulfonsäure, Salicylsäure und ähnliche erhalten werden.
Der Begriff „physiologisch annehmbar" definiert einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, der/das keine bedeutsame Reizung bei einem Organismus verursacht und die biologische Aktivität und Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt.
Der Begriff „Träger" definiert eine chemische Verbindung, die das Einbringen einer Verbindung in die Zellen oder in die Gewebe vereinfacht. Zum Beispiel ist Dimethylsulfoxid (DMSO) ein herkömmlich verwendeter Träger, der die Aufnahme von vielen organischen Verbindungen in die Zellen oder die Gewebe eines Organismus erleichtert.
Der Begriff „Verdünnungsmittel" definiert in Wasser verdünnte chemische Verbindungen, die sowohl die entsprechende Verbindung auflösen als auch die biologisch aktive Form der Verbindung stabilisieren. In gepufferten Lösungen aufgelöste Salze werden im Stand der Technik als Verdünnungsmittel verwendet. Eine herkömmlich verwendete Pufferlösung ist die Phosphat gepufferte Salzlösung, da es die Salzbedingungen des menschlichen Blutes mimt. Da Puffersalze den pH einer Lösung bei niedrigen Konzentrationen kontrollieren können, modifiziert ein gepuffertes Verdünnungsmittel selten die biologische Aktivität einer Verbindung.
Ein anderer Aspekt der Erfindung beschreibt die Verwendung einer Indolinonverbindung der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zum Vorbeugen oder Behandeln eines abnormalen Zustandes in einem Organismus. Der abnormale Zustand steht im Zusammenhang mit einer Anomalie in einem Signaltransduktionsweg, der durch eine Interaktion zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner gekennzeichnet ist.
Der Begriff „Vorbeugen" betrifft ein Verfahren, das den Organismus am Erlangen des abnormalen Zustandes hindert.
Der Begriff „Behandeln" betrifft ein Verfahren zum Lindern oder Aufheben des abnormalen Zustandes im Organismus.
Der Begriff „Organismus" betrifft jede lebende Entität, die aus mindestens einer Zelle besteht. Ein Organismus kann so einfach sein wie eine eukaryotische Zelle oder so komplex wie ein Säugetier.
Der Begriff „abnormaler Zustand" betrifft eine Funktion in den Zellen oder den Geweben eines Organismus, die von ihren normalen Funktionen im Organismus abweicht. Ein abnormaler Zustand kann die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung oder das Zellüberleben betreffen.
Abweichende zellproliferative Bedingungen schließen Krebsarten, wie zum Beispiel fibrotische- und mesangiale Störungen, eine abnormale Angiogenese und Vaskulogenese, die Wundheilung, Psoriasis, Diabetes mellitus und eine Entzündung ein.
Abweichende Differenzierungszustände schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf neurodegenerative Störungen, langsame Wundheilungsraten und Gewebetransplantationstechniken.
Abweichende Zellüberlebensbedingungen betreffen Zustände, in denen die Wege des programmierten Zelltods (Apoptose) aktiviert oder aufgehoben sind. Viele Proteinkinasen sind mit den Apoptose-Wegen assoziiert. Abweichungen bei der Funktion einer der Proteinkinasen können zur Zellunsterblichkeit oder zum verfrühten Zelltod führen.
Die Zellproliferation, Differenzierung und das Überleben sind Phänomene, die durch Verfahren im Stand der Technik einfach gemessen werden. Diese Verfahren können das Beobachten der Zellzahl oder das Auftreten von Zellen unter einem Mikroskop in Bezug auf die Zeit (Tage) einschließen.
Der Begriff „Verabreichen" betrifft ein Verfahren zum Einbringen einer Verbindung in Zellen oder Gewebe eines Organismus. Den abnormalen Zustand kann man vorbeugen oder behandeln werden, wenn die Zellen oder Gewebe des Organismus innerhalb des Organismus oder außerhalb des Organismus existieren. Zellen, die außerhalb des Organismus existieren, können in Zellkulturschalen gehalten werden oder wachsen. Für Zellen, die innerhalb des Organismus liegen, existieren viele Techniken im Stand der Technik zum Verabreichen von Verbindungen, einschließlich (jedoch nicht begrenzt auf) orale, parenterale, dermale, Injektions- und Aerosolanwendungen. Für Zellen außerhalb des Organismus existieren im Stand der Technik mehrere Techniken zum Verabreichen der Verbindungen einschließlich (jedoch nicht begrenzt auf) Zellmikroinjektionstechniken, Transformationstechniken und Trägertechniken.
Dem abweichenden Zustand kann man auch durch das Verabreichen einer Gruppe von Zellen mit einer Abweichung in einem Signaltransduktionsprozess an einem Organismus vorbeugen oder behandeln. Die Wirkung des Verabreichens einer Verbindung auf die Funktion des Organismus kann dann beobachtet werden. Der Stand der Technik enthält mehrere Verfahren zum Einführen einer Gruppe von Zellen in einen Organismus als auch Verfahren zum Verabreichen einer Verbindung an einen Organismus. Der Organismus ist bevorzugt ein Frosch, noch bevorzugter eine Maus, Ratte, Hase, Meerschweinchen oder Ziege, und am meisten bevorzugt ein Affe oder Menschenaffe.
Der Begriff „Signaltransduktionsweg" betrifft die Moleküle, die ein extrazelluläres Signal durch die Zellmembran verbreiten und es zu einem intrazellulären Signal werden lassen. Dieses Signal kann dann eine zelluläre Reaktion stimulieren. Die Polypeptidmoleküle, die in Signaltransduktionsprozessen involviert sind, sind für gewöhnlich Rezeptor- und Nichtrezeptorproteinkinasen, Rezeptor- und Nichtrezeptorproteinphosphatasen, Nukleotidaustauschfaktoren und Transkriptionsfaktoren.
Der Begriff „Abweichung" in Verbindung mit einem Signaltransduktionsprozess, betrifft eine Proteinkinase, die in einem Organismus über- oder unterexprimiert ist, mutiert ist, so dass ihre katalytische Aktivität niedriger oder höher ist als die der Wildtypproteinkinaseaktivität, mutiert ist, so dass sie nicht länger mit einem natürlichen Bindungspartner interagieren kann, nicht länger durch eine andere Proteinkinase oder Proteinphosphatase modifiziert ist oder nicht länger mit einem natürlichen Bindungspartner interagiert.
Der Begriff „natürlicher Bindungspartner" betrifft ein Polypeptid, das normalerweise an den intrazellulären Bereich einer Proteinkinase in einer Zelle bindet. Diese natürlichen Bindungspartner können eine Rolle beim Vermehren eines Signals in einem Proteinkinasesignaltransduktionsprozess spielen. Der natürliche Bindungspartner kann mit hoher Affinität an einen intrazellulären Bereich einer Proteinkinase binden. Eine hohe Affinität stellt eine Gleichgewichtsbindungskonstante in einer Größenordnung von 10^–6 M oder weniger dar. Jedoch kann ein natürlicher Bindungspartner auch vorübergehend mit dem intrazellulären Bereich einer Proteinkinase interagieren und ihn chemisch modifizieren. Natürliche Bindungspartner der Proteinkinase werden aus einer Gruppe ausgewählt, die aus, jedoch nicht begrenzt auf, src Homologie 2 (SH2) oder 3 (SH3) Domänen anderen phosphoryltyrosinbindenden (PTB) Domänen und anderen Proteinkinasen oder Proteinphosphatasen besteht.
Der Begriff „Fördern oder Zerstören der abnormalen Interaktion" betrifft ein Verfahren, das durch das Verabreichen einer Verbindung der Erfindung an Zellen oder Gewebe in einem Organismus durchgeführt werden kann. Eine Verbindung kann eine Interaktion zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartnern durch das Ausbilden von günstigen Interaktionen mit mehreren Aminosäuren an der Komplexschnittstelle fördern. Alternativ dazu kann eine Verbindung eine Interaktion zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner durch das Kompromittieren von günstigen Interaktionen, die zwischen Aminosäuren an der Komplexschnittstelle ausgebildet werden, inhibieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die oben beschriebene Verwendung, wobei der Organismus ein Säugetier ist.
Der Begriff Säugetier betrifft bevorzugt solche Organismen, wie Mäuse, Ratten, Hasen, Meerschweinchen und Ziegen, noch bevorzugter Affen und Menschenaffen und am meisten bevorzugt Menschen.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die oben beschriebene Verwendung, wobei die Proteinkinase die FLK-Proteinkinase oder ein Plättchenwachstumsfaktor-Proteinkinase ist.
Das Indolinon inhibiert bevorzugt die katalytische Aktivität der Plättchenwachstumsfaktor-Proteinkinase mit einem IC₅₀ von weniger als 50 μM, noch bevorzugter mit einem IC₅₀ von weniger als 5 μM und am meisten bevorzugt mit einem IC₅₀ von weniger als 0,5 μM.
Der Begriff „Plättchenwachstumsfaktor" betrifft eine Proteinkinase, die Substrate an Tyrosinresten phosphoryliert. Die Plättchenwachstumsfaktor-Proteinkinase reguliert zelluläre Funktionen in Reaktion auf den PDGF-Wachstumsfaktor. Diese zellulären Funktionen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die zelluläre Proliferation.
Die hierin in Bezug genommenen chemischen Formeln können das Phänomen der Tautomerie oder der strukturellen Isomerie aufweisen. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Verbindungen eine cis- oder trans-Konformation über die Doppelbindung, die den Indolinon 3-Substituenten mit dem Indolinonring verbindet, annehmen oder können Mischungen von cis- und trans-Isomeren sein. Da die Abbildung der Formeln in der Beschreibung nur eine mögliche tautomere oder strukturell isomere Form darstellen kann, sollte deutlich werden, dass die Erfindung jede tautomere oder strukturell isomere Form oder Mischungen davon, die die Fähigkeit besitzt, die Tyrosinkinasesignaltransduktion oder Zellproliferation zu regulieren, inhibieren und/oder modulieren, umfasst, und ist nicht begrenzt auf irgendeine tautomere oder strukturell isomere Form, die in der Abbildung der Formeln verwendet wird.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Verbindungen betrifft die Erfindung weiterhin, wenn anwendbar, sowohl solvatierte als auch unsolvatierte Formen der Verbindungen (z.B. hydrierte Formen), die die Zellproliferation regulieren und/oder modulieren können.
Die hierin beschriebenen Verbindungen können durch jedes Verfahren hergestellt werden, von dem bekannt ist, dass es bei der Herstellung der chemisch verwandten Verbindungen anwendbar ist. Geeignete Verfahren werden in den Beispielen dargestellt. Notwendige Ausgangsmaterialien können durch Standardverfahren der organischen Chemie erhalten werden.
Die individuelle relevante Aktivität und Wirksamkeit einer Verbindung als Agens, das die Rezeptortyrosinkinase-vermittelte Signaltransduktion beeinflusst, kann mit den verfügbaren Techniken bestimmt werden. Bevorzugt wird eine Verbindung einer Serie von Untersuchungen unterzogen, um die Fähigkeit der Verbindung zu bestimmen, die Zellproliferation zu modulieren, regulieren und/oder inhibieren. Diese Untersuchungen, in der Reihenfolge in der sie durchgeführt werden, schließen biochemische Assays, Zellwachstumsassays und in vivo Experimente ein.
Die oben beschriebene Zusammenfassung der Erfindung ist nicht begrenzend und andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung und von den Ansprüchen deutlich.
Kurze Beschreibung der Figuren und Tabellen
Tabelle 1 zeigt bevorzugte Oxindole, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Tabelle 2 zeigt Beispiele von Verbindungen der Erfindung. Die Tabelle stellt die Molekülstruktur jedes Indolinons, das Molekulargewicht der Verbindung und die chemische Formel der Verbindung dar.
Tabellen 3 und 4 zeigen die biologische Aktivität von ausgewählten Verbindungen der Erfindung. Aufgelistet sind die chemische Struktur der Verbindung mit IC₅₀-Werten, die in biologischen Inhibitionsassays mit FLK-1 und der Plättchenwachstumsfaktor-Proteinkinase (PDGFR) gemessen worden sind.
Tabelle 5 zeigt die Namen verschiedener Indolinonverbindungen der vorliegenden Erfindung.
Tabelle 6 zeigt Kinasedaten für die in Tabelle 5 aufgelisteten Verbindungen, wie sie mit den hierin beschriebenen Assays bestimmt wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung ist zum Teil auf das Entwerfen von Proteinkinaseinhibitoren, die Tumoren durch Abtrennen ihrer Quellen vom zum Überleben notwendigen zerstören. Die Inhibitoren werden so entworfen, damit sie spezifisch Proteinkinasen binden, die im Gefäßsystem, das die Tumoren mit dem zum Überleben notwendigen versorgt, überexprimiert werden. Ein solches Proteinkinaseziel ist FLK-1, das in den proliferierenden Endothelzellen eines wachsenden Tumors, jedoch nicht in den umgebenden stillen Endothelzellen, überexprimiert wird. Plate et al., 1992, Nature 359: 845–848.
FLK-1 wird durch Bindung von VEGF, einem starken Regulator der Endothelzellenproliferation als auch der normalen und pathologischen Angiogenese, aktiviert. Klagsburn und Soker, 1993, Current Biology 3: 699–702. Demnach sind Verbindungen, die die FLK-Proteinkinase spezifisch inhibieren, mögliche Antikrebsagenzien, da sie das Gefäßsystem, das die Tumoren ernährt, verkleinern. Diese Inhibitoren werden höchstwahrscheinlich zum Minimieren und sogar zum Zerstören von festen Tumoren führen. Darüber hinaus werden Verbindungen, die FLK spezifisch inhibieren, möglicherweise eine neue Generation von Krebstherapeutika repräsentieren, da sie höchstwahrscheinlich weniger Nebenwirkungen verursachen werden. Diese möglichen Eigenschaften sind eine willkommene Verbesserung gegenüber den derzeit verwendeten Krebstherapeutika, die vielfach Nebenwirkungen verursachen und Patienten ernsthaft schwächen.
Synthese der Indolinonverbindungen
Die Indolinonverbindungen der Erfindung werden durch Umsetzen eines Aldehyds mit einem Oxindol, wie in den hierin bereitgestellten Beispielen dargestellt, synthetisiert. Beschreibungen von Verfahren zum Synthetisieren von Indolinonverbindungen werden in den hierin beschriebenen Beispielen bereitgestellt. Die Beispiele beschreiben vollständig die Lösungsmittel, Temperaturen, Trennungstechniken und andere Bedingungen, die für die Erfindung verwendet werden. Andere synthetische Techniken, wie z.B. solche, die in der internationalen Patentveröffentlichung WO 96/22967, die am 1. August 1996 veröffentlicht worden ist, von Ballinari et al. und der WO 98/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben werden, können ebenfalls durch den die Verbindungen der vorliegenden Erfindung herstellenden Fachmann verwendet oder angepasst werden. Beschreibungen der Verfahren, die zum spezifischen Synthetisieren der Indolinonverbindungen der Erfindung verwendet werden, werden hierin offenbart.
Biologische Aktivität von Indolinonverbindungen
Indolinonverbindungen der Erfindung können auf ihre Fähigkeit die Proteinkinasen in biologischen Assays zu aktivieren oder inhibieren, getestet werden. Die Verfahren, die zum Messen der Indolinonmodulation einer Proteinkinasefunktion verwendet werden, werden hierin beschrieben. Indolinonverbindungen der Erfindung wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die FLK-Proteinkinase zu inhibieren. Das biologische Assay und die Ergebnisse dieser Inhibitionsstudien werden hierin beschrieben.
Durch Indolinonverbindungen zu behandelnde Zielerkrankungen
Proteinkinasen sind essentielle regulatorische Moleküle, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen kontrollieren. Aus diesem Grund kann jede Veränderung in der Funktion einer Proteinkinase einen abnormalen Zustand in einem Organismus verursachen. Eine der vielen Funktionen, die durch Proteinkinasen kontrolliert werden, ist die Zellproliferation.
Veränderungen in der Funktion einer Proteinkinase, die normalerweise die Zellproliferation reguliert, kann zu erhöhten oder verringerten zellproliferativen Zuständen, die in bestimmten Erkrankungen offenkundig sind, führen. Abweichende zellproliferative Zustände schließen Krebsarten, wie z.B. fibrotische oder mesangiale Störungen, eine abnormale Angiogenese und Vaskulogenese, Wundheilung, Psoriasis, Restenose, Diabetes mellitus und Entzündungen ein.
Fibrotische Störungen und mesangiale zellproliferative Störungen werden in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben.
Angiogene und vaskulogene Störungen ergeben sich aus einer übermäßigen Proliferation von Blutgefäßen. Die Proliferation von Blutgefäßen ist bei einer Vielzahl von normalen physiologischen Prozessen, wie z.B. der embryonalen Entwicklung, der Corpus luteum Ausbildung, der Wundheilung und der Organregeneration erforderlich. Jedoch ist die Blutgefäßproliferation auch bei der Krebstumorentwicklung erforderlich. Andere Beispiele für proliferative Störungen der Blutgefäße schließen Arthritis ein, bei der neue kapillare Blutgefäße in das Gelenk eindringen und den Knorpel zerstören. Zusätzlich schließen proliferative Erkrankungen der Blutgefäße Augenerkrankungen ein, wie z.B. die diabetische Retinopathie, bei der neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper eindringen, bluten und eine Erblindung verursachen. Umgekehrt stehen Störungen, die mit dem Schrumpfen, der Kontraktion oder dem Schließen von Blutgefäßen zusammenhängen, wie z.B. der Restenose, ebenfalls mit der nachteiligen Regulation von RPK's oder RPP's in Verbindung.
Darüber hinaus stehen die Vaskulogenese und Angiogenese mit dem Wachstum von malignen festen Tumoren und Metastasen im Zusammenhang. Ein energisch wachsender Krebstumor erfordert eine nährstoff- und sauerstoffreiche Blutzufuhr, um das Wachstum fortzusetzen. Als Konsequenz davon wächst häufig eine abnormal große Anzahl von kapillaren Blutgefäßen in Übereinstimmung mit dem Tumor und dient als Versorgungsleitung für den Tumor. Zusätzlich zur Zulieferung von Nährstoffen an den Tumor stellen die neuen Blutgefäße, die in den Tumor eingebettet sind, eine Schnittstelle für Tumorzellen dar, um in den Kreislauf einzutreten und an entfernten Stellen im Organismus zu metastasieren. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 4–6.
Angiogene und vaskulogene Störungen stehen im engen Zusammenhang mit der FLK-Proteinkinase. FLK-1 wird durch das Binden von VEGF, einem starken Regulator sowohl der Proliferation von Endothelzellen als auch der normalen und pathologischen Angiogenese, aktiviert. Klagsburn und Soker, 1993, Current Biology 3: 699–702. Deshalb sind Verbindungen, die die FLK-Proteinkinase spezifisch inhibieren mögliche Antikrebsagenzien, da sie das Gefäßsystem verkleinern, das die Tumoren versorgt. Diese Inhibitoren werden höchstwahrscheinlich zum Minimieren und sogar zum Zerstören von festen Tumoren führen. Darüber hinaus repräsentieren Verbindungen, die FLK spezifisch inhibieren, möglicherweise eine neue Generation von Krebstherapeutika, da sie höchstwahrscheinlich weniger Nebenwirkungen verursachen. Diese möglichen Eigenschaften sind eine signifikante Verbesserung gegenüber den derzeit verwendeten Krebstherapeutika, die multiple Nebenwirkungen verursachen und den Patienten auf schädliche Weise schwächen.
Zusätzlich zur Zellproliferation regulieren einige RPK's und RPP's die vorletzten zellulären Funktionen, das Zellüberleben und den Zelltod. Der Gliawachstumsfaktor (GDNF) aktiviert c-ret, zum Beispiel durch das Zusammenbringen multipler c-ret-Rezeptoren in unmittelbare Umgebung zueinander und Fördern der Kreuzphosphorylierung der intrazellulären Bereiche. Signaltransduktionsmoleküle, die mit c-ret einen Komplex in Folge dieser Phosphorylreste, wie z.B. grb-2, sos, ras, und raf, bilden, verbreiten ein Signal in der Zelle, dass das Überleben der Neuronen fördert. Demnach werden die Verbindungen, die die Interaktionen dieser stimulatorischen Moleküle des c-ret fördern, die Aktivität von c-ret verstärken. Alternativ dazu können Proteinphosphatasen die Phosphorylreste, die im intrazellulären Bereich von c-ret in Reaktion auf GDNF angeordnet sind, entfernen und dadurch die Signalgebungsfähigkeit von c-ret inhibieren. Daher verstärken Verbindungen, die die Phosphatasen von c-ret inhibieren, die Signalgebungskapazität von c-ret. Im Kontext der vorliegenden Erfindung könnte die c-ret-Proteinkinase durch Indolinonverbindungen, die mit Substituenten, besonders in der 5-Position des Oxindolrings, modifiziert sind, aktiviert werden.
c-ret steht mit der Entwicklung und dem Überleben von enterischen, synaptischen und sensorischen Neuronen und Neuronen des Nierensystems nach der Stimulation durch GDNF in Verbindung. Das Fehlen von Funktionsmutationen in c-ret kann zur Hirschsprung's Erkrankung führen, die sich zum Beispiel selbst in einer Verringerung der Intestinaltraktinnervation bei Patienten manifestiert. Daher sind Verbindungen, die c-ret aktivieren, mögliche therapeutische Agenzien für die Behandlung von neurodegenerativen Störungen, die einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf die Hirschsprung's Erkrankung, Parkinson Erkrankung, Alzheimer Erkrankung und die amyotrophe Lateralsklerose. Verbindungen, die die c-ret-Funktion inhibieren, sind mögliche Antikrebsagenzien, da die Überexpression von ret in Zellen mit Krebsarten, wie z.B. Schilddrüsenkrebs, in Verbindung steht.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichung von Indolinonverbindungen
Verfahren zum Herstellen pharmazeutischer Formulierungen der Verbindungen, Verfahren zum Bestimmen der Mengen der an einen Patienten zu verabreichenden Verbindungen und Arten der Verabreichung der Verbindungen an einen Organismus sind in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/22976, die am 1. August 1996 veröffentlicht worden ist, von Ballinari et al. offenbart.
Der Fachmann wird erkennen, dass solche Beschreibungen auf die vorliegende Erfindung anwendbar sind und einfach daran angepasst werden können. Der Mechanismus einer solchen Wirkung und mögliche Verwendungen für diese Verbindungen sind in der internationalen Patentveröffentlichung WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben.
Die hierin beschriebenen Verbindungen können einem menschlichen Patienten per se oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen sie mit geeigneten Trägern oder einem Zusatzstoff(en) vermischt sind, verabreicht werden. Techniken zum Formulieren und Verabreichen der Verbindungen der derzeitigen Anmeldung, findet man in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, letzten Ausgabe oder in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al.
Wirksame Dosierung
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen ein, wobei die aktiven Inhaltsstoffe in einer Menge enthalten sind, die wirksam ist, um den beabsichtigten Zweck zu erzielen. Eine therapeutisch wirksame Menge bedeutet besonders eine Menge der Verbindung, die den Symptomen der Erkrankung wirksam Vorbeugen, sie lindern oder verbessern kann oder das Überleben des zu behandelnden Subjektes verlängert. Das Bestimmen einer therapeutisch wirksamen Menge liegt innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns, besonders im Hinblick auf die detaillierte Offenbarung, die hierin und in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. bereitgestellt wird.
Verpackung
Die Zusammensetzungen können, falls gewünscht, in einer Verpackung oder einer Dispenservorrichtung präsentiert werden, die eine oder mehrere Formen der Dosierungseinheit mit dem aktiven Inhaltsstoff gemäß der Beschreibung, die in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht wurde, von Tang et al. bereitgestellt wird, enthalten.
Beispiele
Die untenstehenden Beispiele sind nicht begrenzend und sind lediglich repräsentativ für verschiedene Aspekte und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele stellen Verfahren zum Synthetisieren von Indolinonverbindungen der Erfindung dar. Die Beispiele zeigen sowohl die Spezifität als auch die Möglichkeiten, mit der diese Verbindungen die Proteinkinasefunktion in Zellen inhibieren.
Beispiel 1: Synthese der Verbindung
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannter Techniken, wie zum Beispiel denen, die in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben worden sind, synthetisiert werden. Im Folgenden werden bevorzugte Verfahren zum Synthetisieren der Verbindungen der beanspruchten Erfindung dargestellt.

(a) Herstellung von 4-Methyl-2-oxindol. Dietyhloxalat (30 ml) in 20 ml trockenem Ether wurde unter Rühren zu 19 g Kaliumethoxid, das in 50 ml getrocknetem Ether suspendiert wurde, gegeben. Die Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt und 20 ml 3-Nitro-O-xylen in 20 ml trockenem Ether wurden langsam zugegeben. Die zähflüssige, dunkelrote Mischung wurde für 0,5 h bis zum Reflux erhitzt, zu einem dunkelroten Feststoff konzentriert und mit 10% Natriumhydroxid behandelt, bis sich fast der gesamte Feststoff aufgelöst hat. Die dunkelrote Mischung wurde mit 30% Wasserstoffperoxid behandelt, bis die rote Farbe nach gelb umschlägt. Alternativ dazu wurde die Mischung mit 10% Natriumhydroxid und 30% Wasserstoffperoxid behandelt, bis die dunkle Farbe nicht länger vorhanden war. Der Feststoff wurde abgefiltert und das Filtrat mit 6 N Salzsäure angesäuert. Das sich daraus ergebende Präzipitat wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter einem Vakuum getrocknet, um 9,8 g (45% Ausbeute) an 1-Methyl-6-nitrophenylessigsäure als cremefarbenen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wurde in Methanol über 10% Palladium auf Kohlenstoff hydriert, um 9,04 g der Titelverbindung als weißen Feststoff zu erhalten.
(b) Herstellung von 5-Nitro-2-oxindol. Das 2-Oxindol (6,5 g) wurde in 25 ml konzentrierter Schwefelsäure aufgelöst und die Mischung bei –10, –15°C gehalten, während 2,1 ml rauchender Salpetersäure tropfenweise zugegeben wurden. Nach der Zugabe der Salpetersäure wurde die Reaktionsmischung bei 0°C für 0,5 h gerührt und in Eiswasser gegossen. Das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und aus 50 Essigsäure kristallisiert. Der Endkristall wurde dann gefiltert, mit Wasser gewaschen und unter einem Vakuum getrocknet, um 6,3 g (70%) 5-Nitro-2-oxindol zu erhalten.
(c) Herstellung von 5-Amino-2-oxindol. Das 5-Nitro-2-oxindol (6,3 g) wurde in Methanol über 10% Palladium auf Kohlenstoff hydriert, um 3,0 g (60% Ausbeute) der Titelverbindung als weißen Feststoff zu erhalten.
(d) Herstellung von 5-Fluor-2-oxindol. 5-Fluorisatin (8,2 g) wurde in 50 ml Hydrazinhydrat aufgelöst und für 1 h refluxiert. Die Reaktionsmischungen wurden dann in Eiswasser gegossen. Das Präzipitat wurde dann gefiltert, mit Wasser gewaschen und unter einem Vakuumofen getrocknet, um 6,0 g 5-Fluour-2-oxindol (79% Ausbeute) zu erhalten.
(e) Herstellung von 5-Brom-2-oxindol. 2-Oxindol (1,3 g) in 20 ml Acetonitril wurden auf –10°C gekühlt und 2,0 g an N-Bromsuccinimid wurden langsam unter Rühren zugegeben. Die Reaktion wurde für 1 h bei –10°C und 2 h bei 0°C gerührt. Das Präzipitat wurde eingesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 1,9 g (90% Ausbeute) der Titelverbindung zu erhalten.

(f) Herstellung von 5-Carboxy-2-oxindol
Schritt 1. Synthese von 5-Methoxycarbonyl-2-oxindol.
5-Iod-2-oxindol (17 g) wurden mit 2 g Palladiumdiacetat, 18,15 g Triethylamin, 150 ml Methanol, 15 ml Dimethylsulfoxid und 2,6 g DPPP in einer Atmosphäre, die mit Kohlenmonoxid gesättigt war, refluxiert. Nach 24 Stunden wurde die Reaktion gefiltert, um den Katalysator zu entfernen und das Filtrat konzentriert. Das Konzentrat wurde auf einem Silikagel in 30% Ethylacetat in Hexan chromatographiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden konzentriert und stehengelassen. Das präzipitierte Produkt wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, um 0,8 g (7%) der Titelverbindung als cremefarbenen Feststoff zu erhalten.
Schritt 2: Synthese von 5-Carboxy-2-oxindol.
5-Methoxycarbonyl-2-oxindol (1 g) und 1 g Natriumhydroxid in 20 ml Methanol wurden für 3 Stunden refluxiert. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und bis zur Trockne konzentriert. Der Reststoff wurde in Wasser aufgelöst und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit 6 N Salzsäure angesäuert und der präzipitierte Feststoff gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 0,7 g (78%) der Titelverbindung als cremefarbenen Feststoff zu erhalten.
(g) Herstellung von 5-Carboxyethyl-2-oxindol Schritt 1: Synthese von 5-Chloracetyl-2-oxindol.
Aluminiumchlorid (30,8 g) und 2-Oxindol (5,0 g) wurden zu 200 ml Kohlenstoffdisulfid bei Raumtemperatur gegeben und die Mischung gerührt. Chloracetylchlorid (3,8 ml) wurde zugegeben und es wurde für 1 Stunde weiter gerührt. Die Mischung wurde für 3 Stunden bis zum Reflux erhitzt, gekühlt und das Lösungsmittel abdekantiert. Der Reststoff wurde in Eiswasser gerührt bis er zu einer festen Suspension wurde. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, in Wasser gewaschen und getrocknet, um 7,0 g (90% Ausbeute) der Titelverbindung zu erhalten.
Schritt 2: Synthese von 5-Chlorethyl-2-oxindol.
5-Chloracetyl-2-oxindol (7,0 g) wurden zu 25 ml Trifluoressigsäure gegeben und die Mischung in einem Eisbad unter Rühren gekühlt. Triethylsilan (12,3 ml) wurde tropfenweise über 2 Minuten zugegeben. Die Reaktion wurde dann bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt und in Eiswasser gegossen. Hexan wurde zugegeben, die Mischung intensiv gerührt, und der Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt und mit Hexan gewaschen, um 5,9 g (91% Ausbeute) des Produktes als weißen Feststoff zur erhalten.
Schritt 3: Synthese von 5-Cyanoethyl-2-oxindol.
Kaliumcyanid (2,02 g) wurde zu 15 ml Dimethylsulfoxid gegeben und auf 90°C erhitzt. 5-Chlorethyl-2-oxindol (3,0 g), das in 5 ml Dimethylsulfoxid aufgelöst wurde, wurde langsam unter Rühren zugegeben und die Reaktion für 2 Stunden auf 150°C erhitzt. Die Mischung wurde gekühlt, in Eiswasser gegossen und das Präzipitat durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um das Rohprodukt zu erhalten. Das Rohmaterial wurde auf einem Silikagel in 5% Methanol in Chloroform chromatographiert, um 1,2 g (42% Ausbeute) der Titelverbindung zu erhalten.
Schritt 4: Synthese von 5-Carboxyethyl-2-oxindol.
5-Cyanoethyl-2-oxindol (4,02 g) in 10 ml Wasser, das 25 ml konzentrierte Salzsäure enthält, wurde für 4 Stunden refluxiert. Die Mischung wurde gekühlt, Wasser zugegeben und der sich daraus ergebene Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 1,9 g (44 Ausbeute) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu erhalten.
(h) Herstellung von 3,5-Dimethylpyrrol-2-carboxaldehyd
5-Cyanoethyl-2-oxindol (4,02 g) in 10 ml Wasser, das 25 ml konzentrierte Salzsäure enthält, wurde für 4 Stunden refluxiert. Die Mischung wurde gekühlt, Wasser zugegeben und der sich daraus ergebene Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 1,9 g (44 Ausbeute) der Titelverbindung als gelben Feststoff zu erhalten.
(i) Herstellung von 3,5-Dimethylpyrrol-2-carboaldehyd
Zu einer Lösung aus Dimethylformamid (80,4 g) und 1 l Dichlorethan bei 0°C wurde über ein paar Minuten Phosphoroxidchlorid (153,3 g) zugegeben und die Reaktion für 1-2 h bei 0°C gerührt, 2,4-Dimethylpyrrol (114,6 g) wurde tropfenweise zur obigen Lösung bei einer Temperatur von weniger als 5°C gegeben. Nachdem Beendigung der Zugabe wurde der Reaktionsansatz erhitzt und die wässrige Schicht isoliert und sicher aufbewahrt. Die organische Schicht wurde wiederum mit 300 ml Wasser extrahiert und die zwei wässrigen Schichten kombiniert. Die wässrige Phase wurde mit 200 ml Dichlorethan extrahiert und die organische Schicht verworfen. Die wässrige Phase wurde auf 10°C abgekühlt und mit 10% Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt. Die Mischung wurde bei 10°C für 2 h gerührt. Der gelbe Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und gründlich mit Wasser gewaschen. Der Feststoff wurde bei Raumtemperatur unter einem Vakuum getrocknet, um 110,8 g (90 Ausbeute) 2,4-Dimethyl-5-formylpyrrol zu erhalten.
(j) Herstellung von 3,5-Diethylpyrrol-2-carboxaldehyd:
Die Lösung aus 25,0 g 3,5-Heptandion und 42,3 g Diethylaminomalonathydrochlorid in 200 ml Essigsäure wurde für 1,25 h auf 95–100°C erhitzt. Natriumacetat wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde für 5,35 h gerührt und für 4 h abgekühlt. Das Salz wurde gefiltert und mit Essigsäure gewaschen. Die Essigsäurelösung wurde dann konzentriert und der Reststoff in 800 ml Wasser gegossen. Der gelbe Feststoff wurde abgefiltert und in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet, um 36,0 g Ethyl-3,5-diethylpyrrol-2-carboxalat als orangene Flüssigkeit (92% Ausbeute) zu erhalten.
Die Decarboxylierung von Ethyl-3,5-diethylpyrrol-2-carboxalat nach der Hydrolyse ergab 2,4-Diethylpyrrol. Die Titelverbindung wurde dann über die Vilsmeier Formulierung von 2,4-Diethylpyrrol unter den gleichen Bedingungen, die für die Herstellung von 3,5-Dimethylpyrrol-5-carboxaldehyd verwendet wurden, synthetisiert.
(k) Herstellung von 3,5-Diisopropylpyrrol-2-carboxaldehyd
Der Verfahrensablauf war der gleiche wie der für die Herstellung von 3,5-Diethylpyrrol-2-carboxaldehyd, mit der Ausnahme, dass mit 2,6-Dimethyl-3,5-heptandion begonnen wurde.
Beispiel 2: FLK-Inhibition durch Indolinonverbindungen der Erfindung
Ein Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) wurde durchgeführt, um die katalytische Aktivität des FLK-1-Rezeptors und noch spezifischer die Inhibition oder Aktivierung der katalytischen Aktivität des FLK-1-Rezeptors durch die Indolinonverbindungen zu messen. Besonders das folgende Assay wurde durchgeführt, um die katalytische Aktivität des FLK-1-Rezeptors in FLK-1/NIH3T3-Zellen zu messen.
Die Materialien und das Protokoll für das FLK-1 ELISA-Assay entsprechen denen/dem, die in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben werden.
Die ausgewählten Verbindungen wurden im FLK-1 ELISA-Assay getestet. Die IC₅₀ Messungen werden in den Tabellen wiedergegeben. Derivate von 3-[(Indol-3-yl)methylen)-2-indolinonverbindungen mit einem Methylsubstituenten in der 1'-Position erwiesen sich als die wirksamsten Inhibitoren der Gruppe von Verbindungen, die im Assay getestet worden sind.
Beispiel 3: In Vitro RTK-Assays
Die folgenden in vitro-Assays können verwendet werden, um das Aktivitätsniveau und die Wirksamkeit der unterschiedlichen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehrere der RTK's zu bestimmen. Vergleichbare Assays können auf die gleiche Art für jede Tyrosinkinase mit im Stand der Technik bekannten Techniken entworfen werden.
(a) Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA)
Festphasen-Enzymimmunoassays (ELISA) können verwendet werden, um die Anwesenheit der Tyrosinkinaseaktivität zu detektieren und zu messen. Der ELISA kann gemäß bekannter Protokolle, die zum Beispiel von Voller, et al., 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", in: Manual of Clinical Immunology, 2. Ausgabe, überarbeitet von Rose und Friedman, S.359–371, Am. Soc. Of Micorbiology, Washington, D.C. beschrieben werden, durchgeführt werden.
Das offenbarte Protokoll kann zum Bestimmen der Aktivität in Bezug auf eine spezifische RTK angepasst werden. Zum Beispiel werden die bevorzugten Protokolle zum Durchführen der ELISA-Experimente für spezifische RTK's weiter unten bereitgestellt. Das Anpassen dieser Protokolle zum Bestimmen der Aktivität einer Verbindung für andere Mitglieder der RTK-Familie als auch anderer Rezeptor- und Nichtrezeptortyrosinkinasen, liegt innerhalb des Schutzumfangs derer im Stand der Technik.
(i) FLK-1 ELISA
Es wurde ein ELISA-Assay durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-1-Rezeptors und besonders die Inhibition oder Aktivierung der Proteintyrosinkinaseaktivität des FLK-1-Rezeptors zu messen. Es wurde insbesondere das folgende Assay durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-1-Rezeptors in FLK-1/NIH3T3-Zellen zu messen.
Materialien und Methoden
Materialien. Die folgenden Reagenzien und Hilfsstoffe wurden verwendet:

a. Corning 96-Kammer ELISA-Platten (Corning Katalog Nr. 25805-96);
b. Cappel Anti-Hasen IgG von der Ziege (Katalog Nr. 55641);
c. PBS (Gibco Katalog Nr. 450-1300EB);
d. TBSW-Puffer (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl und 0,1% Tween-20);
e. Ethanolaminstammlösung (10% Ethanolamin (pH 7,0), gelagert bei 4°C);
f. HNTG-Puffer (20 mM HEPES-Puffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2% Triton X-100 und 10% Glycerol);
g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) als 100× Stammlösung);
h. Natriumorthovanadat (0,5 M als 100× Stammlösung);
i. Natriumpyrophosphat (0,2 M als 100× Stammlösung);
j. NUNC V-bödige 96-Kammer-Polypropylenplatten (Applied Scientific Katalog Nr. AS-72092);
k. NIH3T3 C7#3-Zellen (FLK-1 exprimierende Zellen);
l. DMEM mit 1× hoher Glukose, L-Glutamin (Katalog Nr. 11965-050);
m. FBS, Gibco (Katalog Nr. 16000-028);
n. L-Glutamin, Gibco (Katalog Nr. 25030-016);
o. VEGF, PeproTech, Inc. (Katalog Nr. 100-20) (als 1 μg/100 μl Stammlösung in Milli-Q dH₂O aufbewahrt und bei –20°C gelagert);
p. Affinitätsgereinigtes Anti-FLK-1-Antiserum, das wie folgt erhalten oder gereinigt werden kann:
1. Man stellt eine durch Tresyl aktivierte Agarose/Flk-1-D-Säule durch Inkubieren von 10 ml Tresyl-aktivierter Agarose mit 20 mg gereinigtem GST-Flk-1-D-Fusionsprotein in 100 mM Natriumbicarbonat (pH 9,6)-Puffer über Nacht bei 4°C her.
2. Man wäscht die Säule einmal mit PBS.
3. Man blockiert die überzähligen Stellen auf der Säule für 2 Stunden bei 4°C mit 2 M Glycin.
4. Man wäscht die Säule mit PBS.
5. Man inkubiert die Säule mit vom Hasen gewonnenes (production bleed) Anti-Flk-1D für 2 Stunden bei 4°C.
6. Man wäscht die Säule mit PBS.
7. Man eluiert das Antiserum mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,0, und neutralisiert das Eluat sofort mit 2 M Tris, pH 9,0.
8. Man dialysiert das Eluat über Nacht gegen PBS bei 4°C, bei drei Pufferwechseln (Probe zu Pufferverhältnis ist 1:100).
9. Man stellt das dialysierte Antiserum auf 5% Glycerol ein und lagert es bei –80°C in kleinen Aliquots.
q. Monoklonaler Antikörper UB40, der für Phosphotyrosin spezifisch ist (siehe, Fendley, et al., 1990, Cancer Research 50: 1550–1558);
r. EIA reines Anti-Maus IgG-POD von der Ziege (BioRad Katalog Nr. 172-1011);
s. 2,2-Azino-bis(3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)-Lösung (100 mM Zitronensäure (wasserfrei), 250 mM Na₂HPO₄ (pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma Katalog Nr. A-1888)), die Lösung sollte im Dunklen bei 4°C gelagert werden, bis sie verwendet wird;
t. H₂O₂ (30% Lösung) (Fisher Katalog Nr. H325);
u. ABTS/H₂O₂ (15 ml ABTS-Lösung, 2 μl H₂O₂) wird 5 Minuten vor der Verwendung hergestellt und bei Raumtemperatur stehengelassen;
v. 0,2 M HCl-Stammlösung in H₂O;
w. Dimethylsulfoxid (100%) (Sigma Katalog Nr. D-8418); und
x. Trypsin-EDTA (Gibco BRL Katalog Nr. 25200-049).

Protokoll. Das folgende Protokoll wurde zur Durchführung des Assays verwendet:

1. Man beschichtet Corning 96-Kammer-ELISA-Platten mit 1,0 μg pro Kammer Cappel Anti-Hasen-IgG-Antikörper in 0,1 M Na₂CO₃, pH 9,6. Man stellt das Endvolumen auf 150 μl pro Kammer ein. Man beschichtet die Platten über Nacht bei 4°C. Die Platten können bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
2. Man kultiviert die Zellen in Wachstumsmedium (DMEM, supplementiert mit 2,0 mM L-Glutamin, 10% FBS) in geeigneten Kulturschalen bis zur Konfluenz bei 37°C, 5% CO₂.
3. Man erntet die Zellen durch Trypsinieren ab und impft sie in Corning 25850 rundbödigen 96-Polystyrenkammer-Zellplatten mit 25.000 Zellen/Kammer in 200 μl Wachstumsmedium an.
4. Man kultiviert die Zellen wenigstens einen Tag bei 37°C, 5% CO₂.
5. Man wäscht die Zellen mit D-PBS 1×.
6. Man gibt 200 μl/Kammer des Mediums zum Aushungern (DMEM, 2,0 mM L-Glutamin, 0,1% FBS) zu. Man inkubiert über Nacht bei 37°C, 5% CO₂.
7. Man verdünnt die Verbindungen/Extrakte 1:20 in 96-Polypropylenkammerplatten mit dem Medium zum Aushungern. Man verdünnt das Dimethylsulfoxid 1:20 für die Verwendung in den Kammern mit den Kontrollen.
8. Man entfernt das Medium zum Aushungern aus den 96-Kammer-Zellkulturplatten und gibt 162 μl frisches Medium zum Aushungern in jede Kammer.
9. Man gibt 18 μl einer 1:20 verdünnten Verbindungs/Extraktverdünnung (aus Schritt 7) in jede Kammer und zusätzlich die 1:20 Dimethylsulfoxidverdünnung in die Kammern mit den Kontrollen (+/– VEGF) für eine Endverdünnung von 1:200 nach der Zellstimulation. Die Endkonzentration des Dimethylsulfoxid beträgt 0,5%. Man inkubiert die Platte bei 37°C, 5% CO₂ für zwei Stunden.
10. Man entfernt den ungebundenen Antikörper aus den ELISA-Platten durch Umdrehen der Platten, um die Flüssigkeit zu entfernen. Man wäscht sie dreimal mit TBSW + 0,5% Ethanolamin, pH 7,0. Man klopft die Platte auf einem Papiertuch aus, um die überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
11. Man blockiert die Platten mit TBSW + 0,5% Ethanolamin, ph 7,0, 150 μl pro Kammer. Man inkubiert die Platte 30 Minuten unter Schütteln auf einem Mikrotiterplattenschüttler.
12. Man wäscht die Platten dreimal, wie in Schritt 10 beschrieben.
13. Man gibt 0,5 μg/Kammer des affinitätsgereinigten Anti FLU-1 polyklonalen Antiserums vom Hasen zu. Man stellt das Endvolumen auf 150 μl/Kammer mit TBSW + 0,5% Ethanolamin, pH 7,0, ein. Man inkubiert die Platte unter Schütteln für 30 Minuten.
14. Man gibt 180 μl Medium zum Aushungern zu den Zellen und stimuliert die Zellen mit 20 μl/Kammer an 10,0 mM Natriumorthovanadat und 500 ng/ml VEGF (was zu einer Endkonzentration von 1,0 mM Natriumorthovanadat und 50 ng/ml VEGF pro Kammer führt) für acht Minuten bei 37°C, 5% CO₂. Die Kammern mit den Negativkontrollen erhalten nur Medium zum Aushungern.
15. Nach acht Minuten sollte das Medium von den Zellen entfernt werden und diese einmal mit 200 μl/Kammer TBS gewaschen werden.
16. Man lysiert die Zellen mit 150 μl/Kammer HNTG unter Schütteln bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Die HNTG-Formulierung enthält Natriumorthovanadat, Natriumpyrophosphat und EDTA.
17. Man wäscht die ELISA-Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
18. Man überträgt die Zelllysate aus der Zellplatte in die ELISA-Platte und inkubiert sie unter Schütteln für zwei Stunden. Zum Übertragen des Zelllysates, pipettiert man auf und ab, während die Kammern ausgeschabt werden.
19. Man wäscht die Platten dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
20. Man inkubiert die ELISA-Platte mit 0,02 μg/Kammer UB40 in TBSW + 0,5% Ethanolamin. Man stellt das Endvolumen auf 150 μl/Kammer ein. Man inkubiert unter Schütteln für 30 Minuten.
21. Man wäscht die Platten dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
22. Man inkubiert die ELISA-Platten mit auf 1:10000 verdünntem EIA reinen Anti-Maus-IgG von der Ziege, das mit der Meerrettichperoxidase konjugiert ist, in TBSW + 0,5 Ethanolamin, pH 7,0. Man stellt das Endvolumen auf 150 μl/Kammer ein. Man inkubiert unter Schütteln für dreißig Minuten.
23. Man wäscht die Platte wie in Schritt 10 beschrieben.
24. Man gibt 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zur Kammer. Man inkubiert zehn Minuten unter Schütteln.
25. Man gibt 100 μl an 0,2 M HCl für eine Endkonzentration von 0,1 M HCl zu, um die Farbentwicklungsreaktion zu stoppen. Man schüttelt 1 Minute bei Raumtemperatur. Man entfernt die Blasen mit einem leichten Luftstrom und liest die ELISA-Platte in einem ELISA-Plattenlesegerät bei 410 nm aus.

(ii) HER-2-ELISA
HER-2-ELISA-Assays werden in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben.
(iii) PDGF-R-ELISA
Ein PDGF-R-ELISA wird in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben.
(iv) IGF-I-ELISA
Das IGF-I-ELISA Protokoll, das in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben wird, kann verwendet werden, um das Phosphotyrosinniveau am IGF-I-Rezeptor, der die IGF-I Rezeptortyrosinkinaseaktivität bezeichnet, zu messen.
(v) EGF-Rezeptor-ELISA
Die Kinaseaktivität des EGF-Rezeptors (EGFR-NIH3T2-Assay) in ganzen Zellen wurde so gemessen, wie es in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben wird.
(vi) Zellulärer Insulinrezeptor-ELISA
Das Protokoll, das in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben wird, wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine Insulinrezeptortyrosinkinaseaktivität besitzen.
(vii) EGFR-ELISA-ASSAY
Zweck
Bereitstellen eines einheitlichen Verfahrens zum Messen der in vitro Kinaseaktivität von EGFR in einem Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA).
Umfang. Das folgende Protokoll beschreibt die Verfahren, die zum Analysieren der Proteintyrosinkinaseaktivität am EGFR in einem ELISA verwendet werden. Der Verfahrensablauf beschreibt auch das Protokoll für das anfängliche Screenen von Arzneimitteln zur Inhibition oder Aktivierung der Proteintyrosinkinaseaktivität.
Reagenzien und Hilfsmittel.

1. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten Corning Katalog #25805-96
2. 05-101 monoklonaler Anti-EGFR-Antikörper (kommerziell erhältlich bei UB1) –80°C, 1 ml Aliquots
3. PBS (Dulbecco's Phospat gepufferte Salzlösung) Gibco Katalog #450-1300EB

Formulierung: 2,7 mM KCL 1,1 mM KH₂PO₄ 0,5 mM MgCl₂ (wasserfrei) 138 mM NaCl 8,1 mM Na₂HPO₄
4. TBST-Puffer

Formulierung: 50 mM Tris pH 7,2 150 mM NaCl 0,1% Triton X-100
5. Blockierpuffer

Formulierung: 5% Carnation lösliche Milch in PBS
6. A431 Zelllysat A431 Zellen sind bei mehreren kommerziellen Quellen erhältlich und können mit konventionellen Verfahren, die dem Fachmann im Stand der Technik bekannt sind oder wie für die Lyse von 3T3-Zellen im zellulären EGF-Assay, das hierin beschrieben wird, beschrieben, lysiert. –80°C, 1 ml Aliquots
7. TBS-Puffer

Formulierung: 50 mM Tris pH 7,2 150 mM NaCl
8. TBS + 10% DMSO

Formulierung: 10% DMSO in TBS-Puffer

(DMSO von Sigma, Katalog #D-2650)
9. ATP/MnC1₂-Phosphorylierungsmischung

Formulierung: 0,03 mM ATP

(Adenosin-5'-triphosphat, Sigma Katalog #A-5394) 50 mM MnCl₂ Man stellt es in autoklaviertem Milli-Q H₂O kurz vor der Verwendung her. Man lagert es bis zur Verwendung auf Eis.
10. NUNC V-bödige 96-Kammer-Polypropylenplatten Applied Scientific Katalog #AS-72092
11. EDTA

Formulierung: 200 mM EDTA, pH 8,0.
12. Polyklonales Anti-Phosphotyrosinserum vom Hasen, oder monoklonaler Antikörper UB40, der für Phosphotyrosin spezifisch ist oder UBI's mab 4610, Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York, Katalog #05-321 –80°C, 1 ml Aliquots Man taut eine 1 ml Phiole auf, und aliquotiert sie in kleinere Volumen und lagert sie bei –80°C. Das Antiserum ist über Wochen stabil, wenn es aufgetaut und bei 4°C gelagert wird.
13. Anti-Hasen-IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege. Biosource Katalog #ALI0404
14. ABTS-Lösung

Formulierung: 100 mM Zitronensäure (wasserfrei) 250 mM Na₂HPO₄, pH 4,0 0,5 mg/ml ABTS

(2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (Sigma Katalog #A-1888) Man lagert die Lösung bis zur Verwendung bei 4°C im Dunklen.
15. Wasserstoffperoxid 30% Lösung. Fisher Katalog #H325 Man lagert es im Dunklen bei 4°C bis zur Verwendung.
16. ABTS/H₂O₂

Formulierung: 15 ml ABTS-Lösung 2 μl H₂O₂

Man stellt es 5 Minuten vor der Verwendung bei Raumtemperatur her.
17. 0,2 M HCl-Stammlösung in H₂O

Verfahrensablauf:

1. Man beschichtet Corning 96-Kammer-ELISA-Platten mit 0,5 μg pro Kammer 05-101 Antikörper. Man stellt das Endvolumen mit PBS auf 100 μl pro Kammer ein. Man beschichtet die Platten über Nacht bei 4°C.
2. Man entfernt ungebundenes 05-101 durch Umdrehen der Platte, um die Flüssigkeit zu entfernen, aus den Kammern. Man wäscht 1× durch Füllen der Kammern mit destilliertem H₂O. Man klopft die Platte auf einem Papiertuch aus, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Man blockiert die Platte mit 5% Milch in PBS. 150 μl pro Kammer Man inkubiert die Platte 30 Minuten unter Schütteln auf einem Mikrotiterplattenschüttler.
4. Man wäscht die Platte 3× mit deionisiertem Wasser und dann einmal mit TBST.
5. Man gibt 7 μg A431 Zelllysat pro Kammer (EGFR Quelle) zu. Man gibt PBS bis zum Endvolumen von 100 μl pro Kammer zu. Man inkubiert 30 Minuten unter Schütteln.
6. Man wäscht wie in Schritt 4 beschrieben.
7. An diesem Punkt werden die Arzneimittel oder die Extrakte in die Kammern gegeben. Man verdünnt die Arzneimittel/Extrakte 1:100 (soweit nicht anders angegeben) in TBS + 10% DMSO in 96-Kammer-Polypropylenplatten. Man gibt 120 μl TBS in die ELISA-Platte, die eingefangenes EGFR enthält. Man gibt 13,5 μl verdünnte Arzneimittel/Extrakte in die ELISA-Platte. In die Kammern mit den Kontrollen (Kammern, die kein Arzneimittel erhalten) gibt man 135 μl TBS + 1% DMSO. Man inkubiert die Platte 30 Minuten unter Schütteln.
8. Man gibt 15 μl einer 0,03 mM ATP + 50 mM MnCl₂-Phosphorylierungsmischung direkt in alle Kammern, mit Ausnahme der Kammer mit der Negativkontrolle, die kein ATP/MnCl₂ erhält (siehe Diagramm). (150 μl Endvolumen in der Kammer mit einer Endkonzentration von 3 μM ATP/5 mM MnCl₂ in der Kammer) Man inkubiert 5 Minuten unter starkem Schütteln. *BEACHTE: Es ist wichtig, dass ATP/MnCl₂ den Rezeptor nur für 5 Minuten phosphoryliert. Man gibt das ATP/MnCl₂ am besten mit einer Zwölfkanalpipette jeweils Reihe für Reihe zu, wobei 20 Sekunden zwischen jeder Reihe gelassen werden, so dass die Reaktion mit EDTA exakt 5 Minuten später gestoppt wird (dies hängt von der Anzahl der Platten ab, die in einem Batch phosphoryliert werden). Man schüttelt zwischen jeder Zugabe.
9. Um nach 5 Minuten die Reaktion zu stoppen, gibt man 16,5 μl an 200 mM EDTA, pH 8,0, für eine Endkonzentration von 20 mM in der Kammer zu und schüttelt fortwährend zwischen jeder Zugabe. Dies wird, wie weiter oben, durch Verwenden des gleichen zeitlichen Verfahrensablaufes erreicht. Nachdem die letzte Reihe EDTA erhalten hat, schüttelt man die Platte für eine zusätzliche Minute.
10. Man wäscht 4× mit deionisiertem Wasser und zweimal mit TBST.
11. Man gibt polyklonales Anti-Phosphotyrosinserum vom Hasen zu. Man verdünnt 1:3000 in TBST. Man gibt 100 μl pro Kammer zu. Man inkubiert 30–45 Minuten unter Schütteln.
12. Man wäscht wie weiter oben in Schritt 4 beschrieben.
13. Man gibt BioSource Anti-Hasen, Peroxidase konjugierten Antikörper zu. Man verdünnt 1:2000 in TBST. Man gibt 100 μl pro Kammer zu. Man inkubiert 30 Minuten unter Schütteln.
14. Man wäscht wie in Schritt 4 beschrieben.
15. Man gibt 100 μl der ABTS/H₂0₂-Lösung in die Kammer. Man inkubiert 5 bis 10 Minuten unter Schütteln. Man entfernt die Blasen.
16. Falls erforderlich, stoppt man die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl pro Kammer.
17. Man liest das Assay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Lesegerät aus.

Testfilter: 410 nm

Referenzfilter: 630 nm

(b) Zellwachstumsassays
Die Zellwachstumsassays, die in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben werden, können durchgeführt werden, um die Wirkung der beanspruchten Verbindungen auf das Zellwachstum infolge der Interaktion der Verbindungen mit einer oder mehreren RTK's zu messen.
(vi) Assay, das die Phosphorylierungsfunktion von Raf misst.
Das folgende Assay beschreibt die Menge der RAF-katalyisierten Phosphorylierung ihres Zielproteins MEK als auch des Ziels von MEK, MAPK. Die RAF-Gensequenz wird von Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400–1407 beschrieben und ist in mehreren Gensequenzdatenbanken einfach zugänglich. Die Konstruktion des Nukleinsäurevektors und der Zelllinien, die für diesen Abschnitt der Erfindung verwendet werden, werden vollständig von Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8855–8859 beschrieben.
Materialien und Reagenzien

1. Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Zellen; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
2. RIPA-Puffer: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4, 137 mM NaCl, 10 Glycerol, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 0,5% Triton X-100;
3. Thioredoxin-MEK-Fusionsprotein (T-MEK): T-MEK Expression und die Reinigung durch Affinitätschromatographie wurden entsprechend den Verfahren des Herstellers durchgeführt. Katalog #K 350-01 und R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
4. His-MAPK (EPK 2); Mit His markiertes MAPK wurde in XL1 Blue-Zellen exprimiert, die mit dem pUC18-Vektor, der für His-MAPK kodiert, transformiert wurden. His-MAPK wurde durch Ni-Affinitätschromatographie gereinigt. Kat #27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA.
5. Anti-Maus-IgG vom Schaf: Jackson Laboratories, West Grove, Pa Katalog, #515-006-008, Charge #28563.
6. RAF-1 Proteinkinase spezifischer Antikörper: URP2653 von UBI.
7. Beschichtungspuffer: PBS, Phosphat gepufferte Salzlösung, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD
8. Waschpuffer: TBST – 50 mM Tris/HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100
9. Blockierpuffer: TBST, 0,1% Ethanolamin, pH 7,4
10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO
11. Kinasepuffer (KB): 20 mM HEPES/HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 75 μM Natriumorthovanadat, 0,5 mM DTT und 10 mM MgCl₂.
12. ATP Mischung: 100 mM MgCl₂, 300 μM ATP, 10 μCi γ-³³p ATP (Dupont-NEN)/ml.
13. Stopplösung: 1% Phosphorsäure; Fisher, Pittsburgh, PA.
14. Wallac Zellulose-Phosphatfiltermatten; Wallac, Turku, Finnland.
15. Filterwaschlösung: 1% Phosphorsäure, Fisher, Pittsburgh, PA.
16. Tomtec-Plattenernter, Wallac, Turku, Finnland.
17. Wallac Beta-Plattenlesegerät #1205, Wallac, Turku, Finnland.
18. NUNC V-bödige 96-Kammer-Polypropylenplatten für Verbindungen, Applied Scientific Katalog #AS-72092.

Verfahrensablauf
Alle folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, soweit nichts anderes angegeben wird.

1. ELISA-Plattenbeschichtung: ELISA-Kammern werden mit 100 μl affinitätsgereinigtem Anti-Maus-Anitserum vom Schaf (1 μg/100 μl Beschichtungspuffer) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die ELISA-Platten können für zwei Wochen verwendet werden, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
2. Man dreht die Platte um und entfernt die Flüssigkeit. Man gibt 100 μl der Blockierlösung zu und inkubiert für 30 min.
3. Man entfernt die Blockierlösung und wäscht viermal mit dem Waschpuffer. Man klopft die Platte auf einem Papiertuch aus, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
4. Man gibt 1 μg des gereinigten Sumo 22 in jede Kammer und inkubiert für 1 Stunde. Man wäscht wie in Schritt 3 beschrieben.
5. Man taut die Lysate von RAS/RAF-infizierten Sf9-Zellen auf und verdünnt sie mit TBST auf 10 μg/100 μl. Man gibt 10 μg des verdünnten Lysats in die Kammern und inkubiert für 1 Stunde. Man schüttelt die Platte während der Inkubation. Die Negativkontrollen erhalten kein Lysat. Die Lysate von RAS/RAF-infizierten Sf9-Insektenzellen werden vorbereitet, nachdem die Zellen mit dem rekombinaten Baculoviren bei einer MOI von 5 für jedes Virus infiziert worden sind, und 48 Stunden später geerntet. Die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer lysiert. Unlösliches Material wird durch Zentrifugation (5 min bei 10.000 × g) entfernt. Aliquots der Lysate werden in trockenem Eis/Ethanol gefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
6. Man entfernt ungebundenes Material und wäscht wie weiter oben (Schritt 3).
7. Man gibt 2 μg T-MEK und 2 μg His-MAPK pro Kammer zu und stellt das Volumen mit dem Kinasepuffer auf 40 μl ein.
8. Man verdünnt die Verbindungen (Stammlösung 10 mg/ml DMSO) oder Extrakte 20-fach in TBST plus 1% DMSO vor. Man gibt 5 μl der vorverdünnten Verbindungen/Extrakte in die Kammern, wie in Schritt 6 beschrieben. Man inkubiert für 20 min. Die Kontrollen erhalten kein Arzneimittel.
9. Man startet die Kinasereaktion durch Zugabe von 5 μl der ATP-Mischung; man schüttelt die Platten während der Inkubation auf einem ELISA-Plattenschüttler.
10. Man stoppt die Kinasereaktion nach 60 min durch Zugabe von 30 μl Stopplösung in jede Kammer.
11. Man ordnet die Phosphozellulosematte und die ELISA-Platte im Tomtec-Plattenernter an. Man entnimmt und wäscht den Filter mit der Filterwaschlösung entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Man trocknet die Filtermatten. Man versiegelt die Filtermatten und ordnet sie in der Halterung an. Man setzt die Halterung in den radioaktiven Detektionsapparat ein und quantifiziert den radioaktiven Phosphor auf den Filtermatten.

Alternativ dazu können 40 μl Aliquots aus den einzelnen Kammern der Assayplatte auf die entsprechenden Positionen auf der Phosphozellulosefiltermatte übertragen werden. Nach dem Lufttrocknen der Filter, stellt man die Filter in einen Korb. Man rüttelt sanft am Korb, wechselt für 1 Stunde die Waschlösung in 15 min Intervallen. Man trocknet die Filtermatten an der Luft. Man versiegelt die Filtermatten und ordnet sie in einer Halterung an, die für das Messen des radioaktiven Phosphors in den Proben geeignet ist. Man setzt die Halterung in eine Detektionsvorrichtung und quantifiziert den radioaktiven Phosphor auf den Filtermatten.
(c) Toxizität und Tiermodelle
Die Messung der Zelltoxizität und die in vivo Tiermodelle werden in der internationalen Patentveröffentlichung Nr.
WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von Tang et al. beschrieben.
(d) MET Biochemisches Kinaseassay
Ein met biochemisches Kinaseassay kann im Allgemeinen, wie weiter oben für andere Kinasen beschrieben, durch Substituieren dieser oder einer anderen Kinase für met durchgeführt werden. Insbesondere die ELISA-Platten werden mit Anti-Hasen-Fc- Antikörpern von der Ziege, die verwendet werden, um kommerziell erhältliche (von Santa Cruz Biotechnology) polyklonale Antikörper vom Hasen gegen die cytoplasmatische Domäne von menschlichem MET einzufangen, beschichtet. Lysate werden aus 293T-Zellen, die mit einem chimären Rezeptor, der aus der extrazellulären Domäne des EGFr und der transmembranen und cytoplasmatischen Domäne des MET-Rezeptors zusammengesetzt ist, transiententransfiziert, oder aus NCI-H441-Zellen (eine menschliche Lungenadenokarzinomzelllinie), die hohe endogene MET-Mengen exprimiert, hergestellt. Die chimären Rezeptoren oder MET, aus diesen Lysaten werden auf den mit Antikörpern beschichteten Platten eingefangen. Nach dem Abwaschen von nicht gebrauchten Proteinen, werden die Testverbindungen zugegeben und ein in vitro Kinaseassay wird durch Zugabe eines geeigneten Kinasepuffers (der ATP, divalente Metallionen, etc. enthält) durchgeführt. Der Einbau von Phosphat in die eingefangenen Rezeptoren wird mit einem Anti-Phosphotyrosin-antikörperkonjugat mit einer Meerrettichperoxidase unter Verwendung von TMB als Substrat für eine kolorimetrische Detektion detektiert.
Die vorliegende Erfindung soll durch die exemplarisch dargestellten Ausführungsformen, die zur Illustration von einzelnen Aspekten der Erfindung dienen, nicht im Schutzumfang begrenzt werden. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu denen, die hierin beschrieben werden, dem Fachmann ausgehend von der vorhergehenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen deutlich werden. Solche Modifikationen sollen innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Ansprüche fallen.
Tabelle 1, Blatt 1 von 3
Tabelle 2, Blatt 2 von 3
Tabelle 1, Blatt 3 von 3
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6

Claims

Die Indolinonverbindung mit der Formel VIII oder IX
wobei (a) R₁ aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: (i) Wasserstoff; (ii) C₁-C₁₀ Alkyl, das optional mit einem monozyklischen oder bizyklischen fünf-, sechs-, acht-, neun- oder zehngliedrigem Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring substituiert ist, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist; (iii) ein fünf-, sechs-, acht-, neun- oder zehngliedriger monozyklischer oder bizyklischer Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist; (iv) einem Keton der Formel -CO-R₁₉, wobei R₁₉ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt wird; (v) einer Carbonsäure der Formel -(R₁₂)_n-COOH oder einem Ester der Formel -(R₁₃)_m-COO-R₁₄, wobei R₁₂, R₁₃ und R₁₄ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden, und n und m unabhängig voneinander 0 oder 1 sind; (vi) ein Sulfon der Formel -(SO₂)-R₁₅, wobei R₁₅ aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt wird, wobei der Ring optional mit einem C₁-C₁₀ Alkylrest substituiert ist; (vii) ein -(R₁₆)_n-(Indol-1-yl) oder -(R₁₇)_m-CHOH-(R₁₈)_p-(Indol-1-yl), wobei der Indolrest optional mit einem Aldehyd substituiert ist, und R₁₆, R₁₇ und R₁₈ C₁-C₁₀ Alkyl, und n, m und p unabhängig voneinander 0 oder 1 sind; (viii) zusammengenommen mit einem 2' Substituenten des Indolrings einen trizyklischen Rest bildet, wobei jeder Ring in dem trizyklischen Rest ein fünf- oder sechsgliedriger Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring ist; (b) R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5',R₆, R_6', R₇, R₈, R₉ und R₁₀ unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus (i) Wasserstoff; (ii) C₁-C₁₀ Alkyl, das optional mit einem monozyklischen oder bizyklischen fünf-, sechs-, acht-, neun- oder zehngliedrigem Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring substituiert ist, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist; (iii) ein fünf-, sechs-, acht-, neun- oder zehngliedriger monozyklischer oder bizyklischer Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist; (iv) einem Keton der Formel -CO-R₂₀, wobei R₂₀ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltenden heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt wird; (v) einer Carbonsäure der Formel -(R₂₁)_n-COOH oder einem Ester der Formel -(R₂₂)_m-COO-R₂₃, wobei R₂₁, R₂₂ und R₂₃ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden, und n und m unabhängig voneinander 0 oder 1 sind; (vi) Halogen; (vii) einem Alkohol der Formel (R₂₄)_m-OH oder einem Ether der Formel -(R₂₄)n-O-R₂₅, wobei R₂₄ und R₂₅ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden, und m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 sind; (viii) -NR₂₆R₂₇, wobei R₂₆ und R₂₇ unabhängig voneinander aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Sauerstoff, C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltenden heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden; (ix) -NHCOR₂₈, wobei R₂₈ aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Hydroxyl, C₁-C₁₀ Alkyl, einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring, wobei der Ring optional substituiert ist mit C₁-C₁₀ Alkyl, Halogen, -(R)_n-COOH, wobei R aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus C₁-C₁₀ Alkyl oder Aryl einschließlich einer monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen fünf- oder sechsgliedrigen aromatischen Gruppe, wobei mindestens ein Ring ein konjugiertes pi Elektronensystem besitzt und wobei n 0 oder 1 ist, oder -(R)_n-COOR', wobei R und R' unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus C₁-C₁₀ Alkyl oder Aryl einschließlich einer monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen fünf- oder sechsgliedrigen aromatischen Gruppe, wobei mindestens ein Ring ein konjugiertes pi-Elektronensystem besitzt und wobei n 0 oder 1 ist; (x) -SO₂NR₂₉R₃₀, wobei R₂₉ und R₃₀ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Sauerstoff, C₁-C-₁₀ Alkyl und einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden; (xi) zwei beliebige von R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆ oder R_6' oder zwei beliebige von R₇, R₈, R₉ oder R₁₀ zusammengenommen einen bizyklischen oder trizyklischen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltenden heterozyklischen Rest bilden, der mit dem sechsgliedrigen Ring des Indoles verbunden ist, wobei jeder Ring in dem multizyklischen Rest ein fünf- oder sechsgliedriger Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer Ring ist; und (c) R₁₁ Wasserstoff oder C₁-C₁₀ Alkyl ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Die Verbindung oder das Salz mit der Formel VIII oder IX gemäß Anspruch 1, wobei R₁, R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₇, R₈, R₉, R₁₀ und R₁₁ Wasserstoff sind.
Die Verbindung oder das Salz mit der Formel VIII oder IX gemäß Anspruch 1, wobei R₈ Brom, Chlor oder NH₂ und R₁, R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₇, R₉, R₁₀ und R₁₁ Wasserstoff sind.
Die Verbindung oder das Salz mit der Formel VIII oder IX gemäß Anspruch 1, wobei R₇ Methyl und R₁, R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₈, R₉, R₁₀ und R₁₁ Wasserstoff sind.
Die Verbindung oder das Salz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung oder das Salz die katalytische Aktivität einer Proteinkinase moduliert.
Die Verbindung oder das Salz gemäß Anspruch 5, wobei die Verbindung oder das Salz die katalytische Aktivität einer FLK Proteinkinase moduliert.
Die Verbindung oder das Salz gemäß Anspruch 5, wobei die Verbindung oder das Salz die katalytische Aktivität einer aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktorrezeptorproteinkinase moduliert.
Ein Verfahren eine Indolinonverbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zu synthetisieren, wobei das Verfahren den Schritt umfasst: Umsetzen eines Aldehyds der Formel X oder XI mit einem Oxindole der Formel XII,
wobei R₁, R₂, R₃, R_3', R₄, R_4', R₅, R_5', R₆, R_6', R₇, R₈, R₉, R₁₀ und R₁₁ wie in Anspruch 1 definiert sind, oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung die eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1–7 und einen physiologisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Die Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1–7 für die Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung eines krankhaften Zustandes in einem Organismus, wobei der krankhafte Zustand mit einer Anomalie in einem Signaltransduktionsweg, der durch eine Interaktion zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner charakterisiert ist, verbunden ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei der Organismus ein Säugetier ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Proteinkinase eine FLK Proteinkinase ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Proteinkinase eine Plättchenwachstumsfaktor-Rezeptorproteinkinase ist.