DE3850542T2

DE3850542T2 - Antikörper-Heterokonjugate zur Töting von HIV-infizierten Zellen.

Info

Publication number: DE3850542T2
Application number: DE3850542T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey A Ledbetter; Joyce M Zarling
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1987-09-23
Filing date: 1988-09-22
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2008-09-23
Also published as: ES2058199T3; AU2279988A; JPH01163134A; AU629180B2; CA1338518C; HK110594A; EP0308936A3; EP0308936B1; ATE108068T1; DE3850542D1; EP0308936A2; JP2755395B2

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antikörper- Heterokonjugate und deren Verwendung bei Verfahren zur Abtötung von Zellen, die mit dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) infiziert sind, bei der Behandlung von HIV-Infektionen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung von Antikörper-Heterokonjugaten, die einen für eine bestimmte periphere Blut-Effektorzelle spezifischen Antikörper umfassen, der mit einen Antikörper quervernetzt ist, der für ein HIV- Antigen, das sich auf der Oberfläche von HIV-infizierten Zellen befindet, spezifisch ist. Solche Antikörper-Heterokonjugate verbrücken physikalisch die Effektorzelle mit der abzutötenden Zielzelle und können den lytischen Mechanismus der Effektorzelle bei der Abtötung der HIV-infizierten Zielzelle (Target-Zelle) aktivieren. Die erfindungsgemäßen Antikörper- Heterokonjugate und Verfahren liefern einen neuen Ansatz zur Behandlung von HIV-infizierten Individuen durch Amplifizierung von endogenen HIV-spezifischen Effektormechanismen und können weiterhin prophylaktisch vor der Entwicklung einer HIV- Immunantwort bei Individuen, die frisch infiziert sind oder zufällig dem HIV-Virus ausgesetzt worden waren, von Nutzen sein.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die infektiösen Agenzien, die für das Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) und dessen prodromale Phasen,dem AIDS-related Complex (ARC) und dem Lmyphadenophathy Syndrome (LAS), verantwortlich sind, sind neue lymphotrope Retroviren, die kürzlich als Human Immunodeficiency Virus (HIV 1 und 2) bezeichnet wurden. Zu Isolaten dieser Viren zählen LAV-1, LAV-2, HTLV-III und ARV.
Die allgemeine Struktur des HIV besteht aus einem Ribonucleoprotein-Kern, der von einer Lipid-haltigen Hülle umgeben ist, die das Virus während der Knospung aus der Membran der infizierten Wirtszelle erhält. Eingebettet in die Hülle und nach außen ragend sind die viral-codierten Glycoproteine. Zum Beispiel werden die Hüllglycoproteine des HIV-1 anfänglich in der infizierten Zelle als ein Prekursor-Molekül von 150.000- 160.000 Daltons (gp150 oder gp160) synthetisiert, das danach in der Zelle zu einem N-terminalen Fragment von 110.000-120.000 Daltons (bekannt als gp110 oder gp120), wodurch ein externes Glycoprotein erzeugt wird, und zu einem C-terminalen Fragment von 41.000-46.000 Daltons (gp41), das das Transmembran- Hüllglycoprotein darstellt, prozessiert wird. Zu den inneren viralen Proteinen des HIV zählen die "gag"- und "pol"-Proteine.
Da die Ausbreitung des HIV die Ausmaße einer Pandemie annimmt, ist die Behandlung von infizierten Individuen und die Prävention der Übertragung des Virus auf nichtinfizierte Individuen, die dem Risiko einer Exposition ausgesetzt sind, von höchster Wichtigkeit. Eine Reihe therapeutischer Strategien zielte auf verschiedene Stufen des Lebenszyklus des Virus und sind in Mitsuya and Broder, Nature, 325, S. 773 (1987) aufgeführt. Ein Ansatz beinhaltet die Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für HIV-Glycoprotein-Antigene sind. Diese Antikörper können die virale Replikation entweder durch Störung des viralen Eintritts in die Wirtszellen oder aufgrund einiger anderer Mechanismen inhibieren. Sobald die viralen Proteine oder die antigenen Determinanten auf denjenigen Proteinen, die einer Antikörper-Intervention gegenüber zugänglich sind, identifiziert sind, können Antikörpertiter, die ausreichend sind, um die Infektiösität des Virus zu neutralisieren, durch eine Vakzination oder, alternativ, durch die passive Verabreichung von Immunoglobulinen oder monoklonalen Antikörper mit der gewünschten antigenen Spezifität erzeugt werden.
Das gp110-Glycoprotein des HIV-1 ist Gegenstand vieler Untersuchungen als potentielles Ziel zur Störung der Infektiosität des Virus gewesen. Es ist gezeigt worden, daß Seren von HIV-infizierten Individuen das HIV-in vitro neutralisieren und daß Antikörper, die an das gereinigte gp110 binden, in den Seren vorkommen (siehe M. Robert-Guroff et al., Nature, 316, S. 72-74 (1985); R.A. Weiss et al., Nature, 316, S. 69-72 (1985); and Mathews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, S. 9709 (1986)). Gereinigtes und rekombinantes gp110 haben die Produktion von neutralisierenden Serumantikörpern, wenn diese zur Immunisierung von Tieren verwendet werden, stimuliert (siehe Robey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, S. 7023 (1986) und Lasky et al., Science, 233, S. 209 (1986)). Die Immunisierung eines Menschen mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das HIV-gp110 und -gp41 exprimierte, induzierte HIV-neutralisierende Antikörper (siehe Zagury et al., Nature, 326, S. 249 (1986)). Weiterhin ist die Bindung des gp110-Moleküls an den CD4 (T4)-Rezeptor gezeigt worden, und es ist gezeigt worden, daß monoklonale Antikörper, die bestimmte Epitope des CD4-Rezeptors erkennen, die HIV- Bindung, die Bildung von Synzytien und die Infektiosität hemmen (siehe McDougal et al., Science, 231, S. 382 (1986)). Putney et al., Science, 234, S. 1392 (1986) erzeugten neutralisierende Serumantikörper in Tieren nach Immunisierung mit einem rekombinanten Fusionsprotein, das die Carboxyl-terminale Hälfte des gp110-Moleküls enthielt, und zeigten weiterhin, daß eine Glycosylierung des Hüllproteins für eine neutralisierende Antikörperantwort nicht notwendig ist. Weiterhin sind monoklonale Antikörper gegen HIV-Glycoproteine, wie das gp110 und das gp41, hergestellt worden (siehe z. B. L.H. Gosting et al., J. Clin. Microbiol., 25, (Nr. 5), S. 845-848 (1987)).
HIV kann sich in einem infizierten Individuum auf zwei Arten ausbreiten: als zellfreies Virus, das in Körperflüssigkeiten vorhanden ist, oder durch Fusion von infizierten Zellen mit nichtinfizierten Zellen, wodurch Synzytien gebildet werden. Obwohl neutralisierende Antikörper gegen HIV die Ausbreitung des zellfreien Virus reduzieren können, ist ein anderer Weg erforderlich, um HIV-infizierte Zellen abzutöten.
Normalerweise ermöglicht es ein gesundes Immunsystem einem Individuum, von Infektionen, die von einer Reihe von Viren verursacht werden, zu genesen. Zu den Immunmechanismen, die eine Rolle bei Prävention oder Genesung von viralen Infektionen spielen können, zählt folgendes: Erstens können neutralisierende Antikörper die Ausbreitung von zellfreien Viren verhindern. Zweitens ermöglicht es die Antikörperabhängige zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC), bei der die Virus-infizierten Zellen mit dem Antikörper überzogen werden, den Effektorzellen innerhalb der peripheren Blutleukozyten- Population, die infizierten Zellen zu lysieren. Drittens kann eine Komplement-abhängige Antikörpercytotoxizität zur Lyse von Virus-infizierten Zellen beitragen. Viertens kann die T-Zellvermittelte Immunität weiterhin an der Abtötung von Virusinfizierten Zellen beteiligt sein [siehe Introduction To Immunology (2nd ed.), J.W. Kimball (ed.). MacMillan Publishing Co. (1986) für eine allgemeine Übersicht über die Zellen und Funktionen des humanen Immunsystems].
Das HIV-Virus selbst verursacht jedoch Immunmangelzustände. Somit entwickelt ein großer Teil der HIV-infizierten Menschen AIDS, was anzeigt, daß die Immunantwort gegenüber HIV in diesen Individuen unzureichend ist, um das Fortschreiten dieser tödlichen Erkrankung zu verhindern. Daher besteht ein großes Bedürfnis, insbesondere bei der Behandlung von HIV-Infektionen, nach einem neuen Ansatz, der Mechanismen von Effektorzellen zur Abtötung von HIV-infizierten Zellen auslösen oder verstärken wird.
Die Verwendung von Antikörper-Heterokonjugaten (auch bekannt als Heteroaggregate oder Heteroantikörper) zur Abtötung von Tumorzellen ist bekannt, siehe z. B. die EP-A-0 180 171, das United States Patent 4 676 980, erteilt für D.M. Segal et al.; G. Jung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, S. 4479-4483 (1983); P. Perez et al., J. Immunol., 137, Nr. 7, S. 2069-2072 (1986); und J.A. Titus et al., J. Immunol., 138, Nr. 11, S. 4018-4022 (1987). Zum Beispiel offenbaren Perez et al., supra, die Quervernetzung von Anti-T3, einem monoklonalen Antikörper gegen den T-Rezeptor auf T-Lymphozyten, mit verschiedenen Antitumor-monoklonalen Antikörpern. Es wurde gezeigt, daß die so hergestellten Heteroaggregate die Lyse von humanen Tumorlinien und frischen Tumorzellen durch cytotoxische T- Lymphozyten fördern. Siehe auch B. Karpovsky et al.,
J. Exp. Med., 160, S. 1686-1701 (1984), wo Heteroaggregate offenbart werden, die Antikörper gegen den Fc-Rezeptor auf ADCC-Effektorzellen, die mit Antikörpern gegen TNP-behandelte Tumorzellen quervernetzt sind, zur Lyse dieser Tumorzellen enthalten.
Es gibt jedoch nirgendwo im Stand der Technik einen Vorschlag oder eine Lehre, wie monoklonale Antikörper, die für HIV- Antigene spezifisch sind und Effektorzellen, wie cytotoxischen T-Lypmphozyten oder großen, granulären Lymphozyten, zur Abtötung von HIV-infizierten Zellen bei der Behandlung von HIV- Infektionen auszuwählen und zu verwenden sind. Wegen der Immunmangelzustände, die durch das HIV-Virus verursacht werden, würde man weiterhin durch die vorherigen Untersuchungen nicht zur Verwendung des Heterokonjugate-Ansatzes bei AIDS-Patienten angeregt werden.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung neuer Antikörper-Heterokonjugate zur Behandlung von HIV-infizierten Individuen. Die erfindungsgemäßen Heterokonjugate umfassen einen Antikörper, der spezifisch für ein HIV-Antigen ist, das auf HIV-infizierten Zellen exprimiert wird, der mit einem Antikörper quervernetzt ist, der spezifisch für eine Effektorzelle des peripheren Blutsystems ist, die zur Abtötung einer HIV-infizierten Zielzelle befähigt ist. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bindet der Anti-HIV-Antikörper des Heterokonjugates an eine HIV-infizierte Zelle, d. h., an die abzutötende Zielzelle, während der Anti-Effektor-Antikörper des Heterokonjugates an eine Effektorzelle, wie denjenigen, die man innerhalb der peripheren Blutlymphozyten (PBL)-Population findet, z. B. cytotoxische T-Lymphozyten (im Stand der Technik auch bekannt als T-Zellen) oder große, granuläre Lymphozyten (LGLs), bindet. Somit verbrücken die Antikörper-Bestandteile des Heterokonjugates die Effektor- und Zielzellen und fördern die Abtötung der Zielzelle durch die cytotoxische Effektorzelle.
Gemäß bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die monoklonalen Antikörper, entweder gegen gp110 oder gp41 des HIV-1, entweder mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch für den CD3/T-Zell-Rezeptorkomplex ist, den man auf T-Lymphozyten findet, oder mit einem monoklonalen Antikörper gegen den Fc-Rezeptor, den man auf bestimmten Leukozyten findet, quervernetzt worden, wodurch Heterokonjugate gebildet wurden, die die entsprechenden Effektorzellen (z. B. T- Lymphozyten oder LGLs) von HIV-seropositiven oder seronegativen Menschen leiten (to target), um HIV-infizierte Zellen abzutöten.
Die erfindungsgemäßen Heterokonjugate können in Anti-HIV- Mitteln verwendet werden, wie solchen, die eine pharmazeutisch wirksame Menge von wenigstens einem erfindungsgemäßen Heterokonjugat umfassen. Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Kombinationen zur Verwendung bei Verfahren zur Behandlung von HIV-infizierten Individuen, die den Behandlungsschritt umfassen, daß das Individuum auf eine pharmazeutisch verträgliche Weise mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Mittel behandelt wird. Zusätzlich zur in vivo Behandlung von HIV-infizierten Individuen mit den Heterokonjugaten umfaßt ein Verfahren zur Behandlung von HIV-infizierten Individuen die in vitro Aktivierung von Effektorzellen, wie peripheren Blutlymphozyten, und die Verabreichung der aktivierten Effektorzellen und der Heterokonjugate an den HIV-infizierten Patienten.
Die erfindungsgemäßen Heterokonjugate, pharmazeutischen Mittel und Kombinationen sind zur Abtötung von HIV-infizierten Zellen in Individuen, die an HIV-Infektionen leiden, brauchbar und können besonders brauchbar sein, wenn die Heterokonjugate einen oder mehrere Antikörper enthalten, die die HIV-Infektiosität neutralisieren, oder wenn die Heterokonjugate zusammen mit HIV- neutralisierenden Antikörpern verabreicht werden. Zusätzlich können die Heterokonjugate einen prophylaktischen Wert bei der Behandlung von Individuen, die frisch oder zufällig mit HIV infiziert worden sind, besitzen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung der %-Werte der Lyse von HIV-infizierten Zellen durch anti-CD3- vorbehandelte oder -unbehandelte PBL von seronegativen Spendern gegenüber der Antikörperkonzentration entweder des 110.4 · G19- 4-Heterokonjugates gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform oder eines Kontrollgemisches der einzelnen Antikörper, die das Heterokonjugat bilden.
Fig. 2A stellt in Tabellenform die %-Werte der Lyse von HIV- infizierten und -nichtinfizierten Zellen durch anti-CD3- vorbehandelte PBL von seropositiven und seronegativen Spendern in Gegenwart entweder des 110.4 · Gl9-4-Heterokonjugates gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform oder eines Kontrollgemisches der einzelnen Antikörper, die das Heterokonjugat bilden, dar (NT = nicht untersucht).
Fig. 2B stellt in Tabellenform die %-Werte der Lyse von HIV- infizierten Zellen durch anti-CD3-vorbehandelte, nicht getrennte oder CD8&spplus;-angereicherte PBL von seronegativen Spendern in Gegenwart des 110.4 · G19-4-Heterokonjugates gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform dar.
Fig. 3 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung der %-Werte der Lyse von HIV-infizierten Zellen durch unbehandelte oder (A) mit Intetleukin-2 (IL-2)-vorbehandelten oder (B) mit β-Interferon (β-IFN)-vorbehandelten PBL von seronegativen Spendern gegenüber der Antikörperkonzentration entweder des 110.4 · Fc2-Heterokonjugates gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform oder eines Kontrollgemisches der einzelnen Antikörper, die das Heterokonjugat bilden.
Fig. 4 stellt in Tabellenform die %-Werte der Lyse von HIV- infizierten Zellen durch PBL von seronegativen Spendern dar, die 3 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen an β-IFN in Gegenwart des 110.4 · Fc2-Heterokonjugates gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, einem Gemisch der einzelnen Antikörper, die das Heterokonjugat bilden, den jeweils einzelnen Antikörpern des Konjugates alleine oder in Abwesenheit von Heterokonjugat oder Antikörpern vorbehandelt worden waren.
Fig. 5 stellt in Tabellenform die %-Werte der Lyse von HIV- infizierten und -nichtinfizierten Zellen durch IL-2- vorbehandelte seropositive und seronegative PBL in Gegenwart entweder des 110.4 · Fc2-Heterokonjugates gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform oder eines Kontrollgemisches der einzelnen Antikörper, die das Heterokonjugat bilden, dar.
Fig. 6 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung der %-Werte der Lyse von HIV-infizierten Zellen durch CD16&spplus;angereicherte seronegative PBL, die mit IL-2 vorbehandelt worden waren, durch nicht getrennte, seronegative PBL, die mit IL-2 vorbehandelt worden waren, und durch unbehandelte, nicht getrennte seronegative PBL, in Gegenwart des 110.4 · Fc2- Heterokonjugates über Verhältnisbereiche von Effektor-: Zielzellen (E:T) dar.
Fig. 7 stellt in Tabellenform die %-Werte der Lyse von HIV- infizierten Zellen durch PBL von seronegativen Spendern in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen entweder des G19-4- Heterokonjugates gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, eines Gemisches der einzelnen Antikörper, die das Heterokonjugat bilden, oder jedes einzelnen Antikörpers des Heterokonjugates alleine dar.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Um die hier beschriebene Erfindung besser verstehen zu können, wird die folgende genaue Beschreibung gegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antikörper- Heterokonjugate und deren Verwendung bei Verfahren zur Abtötung von HIV-infizierten Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung Heterokonjugate, die wenigstens zwei Antikörper, die miteinander quervernetzt sind, umfassen. Ein Antikörper ist spezifisch für ein HIV-Antigen, das auf HIV-infizierten Zellen exprimiert wird, und reagiert mit diesem. Der andere Antikörper ist spezifisch für ein und reagiert mit einem Antigen, das man auf Effektorzellen des peripheren Blutsystems, die in der Lage sind, eine HIV-infizierte Zielzelle abzutöten, findet. Zu solchen Effektorzellen zählen cytotoxische T-Zellen, Monozyten (oder Makrophagen), Granulozyten und LGLs, zu denen Zellen mit natürlicher Killerzellen(NK)-Aktivität oder ADCC-Aktivität zählen. Da der HIV-spezifische Antikörper des Heterokonjugates an HIV-infizierte Zellen bindet und der Effektorzellspezifische Antikörper des Heterokonjugates an die cytotoxische Effektorzelle bindet, stellt das erfindungsgemäße Heterokonjugat ein Mittel bereit, um beide Zellen zu verbrücken, wodurch die cytotoxische Effektorzelle mit der infizierten Zielzelle in Kontrakt gebracht wird und somit die Lyse der Zielzelle gefördert wird.
Ohne auf eine Theorie beschränkt zu sein, nimmt man an, daß die hier beschriebenen Heterokonjugate nicht nur cytotoxische Effektorzellen mit den HIV-infizierten Zielzellen verbrücken, sondern weiterhin die lytischen Mechanismen der Effektorzellen aktivieren (siehe z. B. M.A. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, S. 8648-8652 (1985) und P. Perez et al., J. Exp. Med., 163, S. 166-178 (1986)). Obwohl eine Effektorzelle, wie eine T-Zelle, eine eigene Antigenspezifität besitzen kann, kann sie durch die Wechselwirkung mit dem erfindungsgemäßen Heterokonjugat umgeleitet (retargeted) werden, wodurch HIV- infizierte Zellen, die von dem Heterokonjugat gebunden sind, abgetötet werden. Der erfindungsgemäße Heterokonjugat-Ansatz sorgt somit für eine verstärkte HIV-spezifische Effektorzellantwort bei HIV-infizierten Individuen, indem Effektorzellen, wie cytotoxische T-Zellen oder LGLs, aktiviert werden und diese sodann mit Hilfe der Antikörper- Heterokonjugat-Brücke in die nächste Nachbarschaft der abzutötenden HIV-infizierten Zielzellen gebracht werden. Außerdem können solche Heterokonjugate Effektorzellen von Individuen, die noch keine Anti-HIV-Immunität entwickelt haben (z. B. frisch infizierte Individuen) cytotoxisch machen, weil native Effektorzellen durch die erfindungsgemäßen Heterokonjugate geleitet werden können, um HIV-infizierte Zellen abzutöten.
Die Antikörper, die die erfindungsgemäßen Heterokonjugte umfassen, können polyklonal oder vorzugsweise monoklonal sein. Der in dieser Anmeldung verwendete Ausdruck "Antikörper" beinhaltet intakte Antikörpermoleküle oder Fab- oder F(ab')&sub2;- Fragmente. Falls monoklonale Antikörper verwendet werden, können die Antikörper von der Maus oder vom Menschen stammen oder chimäre Antikörper sein. Die Antikörper, die die erfindungsgemäßen Heterokonjugate umfassen, können kovalent miteinander durch Verfahren gemäß dem Stand der Technik verbunden werden, wie durch die Verwendung des heterobifunktionalen Vernetzungsreagens SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) [siehe z. B. B. Karpovsky et al., supra]. Alternativ können die Antikörper unter Verwendung von GMBS (Maleimidobutryloxysuccinimid) miteinander verbunden werden, wie von R.R. Hardy in Methods Immunol., 4. Auf., D.M. Weir (Herausg.), S. 31.1-31.12 (1986) beschrieben wurde. Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Ausführungsform Heterokonjugate beinhalten, die mehr als zwei Antikörper umfassen. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Heterokonjugat zwei Antikörper, die für die Effektorzelle spezifisch sind, und einen Antikörper, der spezifisch für die HIV-infizierte Zielzelle ist, umfassen. Alternativ kann das Heterokonjugat zwei Antikörper, die spezifisch für die Zielzelle sind und einen Antikörper, der spezifisch für die Effektorzelle ist, umfassen. Diese Heterokonjugate sind mittels der oben erwähnten Verfahren des Standes der Technik kovalent miteinander verbunden.
Der HIV-spezifische Antikörper des Heterokonjugates kann irgendein Antikörper sein, der spezifisch für ein HIV-Antigen ist, das auf der Oberfläche von HIV-infizierten Zellen ausreichend exponiert oder exprimiert wird, und mit diesem reagiert. Der Antikörper sollte außerdem eine Affinität für das HIV-Antigen auf der Zelloberfläche besitzen, so daß das Antikörper-Heterokonjugat eine stabile Brücke zwischen der infizierten Zielzelle und der Effektorzelle bildet. Der Antikörper sollte vorzugsweise eine Affinitäts- Assoziationskonstante in der Größenordnung von etwa 10&supmin;&sup8; bis etwa 10&supmin;¹² besitzen.
Der Effektor-spezifische Antikörper des Heterokonjugates kann irgendein Antikörper sein, der spezifisch für eine und reaktiv mit einer Effektorzelle des peripheren Blutsystems ist, die in der Lage ist, eine HIV-infizierte Zelle abzutöten. Vorzugsweise ist der Antikörper ein solcher, der mit einem Antigen auf der Oberfläche der Effektorzelle reagiert, so daß der lytische Mechanismus der Effektorzelle aktiviert wird. Zu solchen Antikörpern können Antikörper zählen, die mit Epitopen auf T- Lymphozyten reagieren, wie CD3 [siehe S.C. Meuer et al., J. Exp. Med., 157, S. 705 (1983)), CD28 (auch bekannt als Tp44) [siehe J.A. Ledbetter et al., J. Immunol., 137, S. 3299-3305 (1986) und Leukocyte Typing III, A.J. McMichael (Herausg.), Oxford university Press, Oxford (im Druck)), und CD2 (siehe C.H. June et al., J. Clin. Invest., 77, S. 1224 (1986) und Leukocyte Typing, A. Bernard et al. (Herausg), Springer-Verlag, New York (1984)]. Alternativ kann die Effektor-spezifische Antikörperkomponente des Hetereokonjugates Antikörper umfassen, die mit Epitopen auf den Fc-Rezeptoren verschiedener Effektorzellen, wie LGLs, Granulozyten oder Monozyten, reagieren. Zu Beispielen für solche Antikörper zählen Antikörper, die spezifisch für den CD3/T-Zell-Rezeptorkomplex auf T-Lymphozyten sind, wie der G19-4-Antikörper (siehe z. B. J.A. Ledbetter et al., J. Immunol., 135, S. 2331-2336 (1985)), und Antikörper, die mit dem CD16-Fc-Rezeptor von LGLs reagieren, wie der Fc2-Antikörper (siehe z. B. J.A. Ledbetter et al., In Perspectives In Immunogenetics And Histocompatibility, Bd. 6, E. Heise (Herausg.), Lymphocyte Surface Antigens 1984, S. 325-340, American Society For Histocompatibility And Immunogenetics, New York (1984)). Sowohl anti-CD3 als auch anti-CD-16 monoklonale Antikörper sind käuflich erhältlich (z. B. Leu 4 bzw. Leu 11 antibodies, Becton Dickinson, Mountainview, CA).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wurde ein monoklonaler Antikörper gegen das HIV-1-Glycoprotein gp110 (110.4) mit einem monoklonalen Antikörper gegen das CD3- Antigen, das man auf dem T-Zell-Rezeptor findet (G19-4), quervernetzt. Das Heterokonjugat lenkte PBL-T-Zellen von seropositiven und seronegativen Menschen, um HIV-infizierte Zellen abzutöten.
Gemäß unserem Versuchsprotokoll wurden PBL mit HIV-infizierten Zielzellen, die mit radioaktivem Chrom (&sup5;¹Cr) markiert waren, in Gegenwart eines erfindungsgemäßen 110.4 · G19-4- Heterokonjugates inkubiert, und die Lyse der Zielzellen wurde aufgrund der Freisetzung der &sup5;¹Cr-Markierung in das Medium bestimmt. Wir stellten fest, daß die PBL die HIV-infizierten Zellen in Gegenwart des Heterokonjugates lysierten, während eine geringe oder keine Lyse in Gegenwart eines bloßen Gemisches der einzelnen monoklonalen Antikörper, die das Konjugat bildeten, auftrat.
Außerdem stellten wir fest, daß PBL, die mit anti-CD3 vorinkubiert und sodann gegenüber den Zielzellen in Gegenwart des 110.4 · G19-4-Heterokonjugates exponiert wurden, sogar cytotoxischer gegenüber den HIV-infizierten Zellen als unbehandelte PBL waren. Dieses Ergebnis stimmt mit Untersuchungen überein, die auf die Verwendung von Heterokonjugaten gegen Tumorzellen gerichtet waren, wobei berichtet wurde, daß die Vorbehandlung mit einem Antikörper gegen das T3-Antigen auf T-Zellen den lytischen Mechanismus der T-Zelle stimuliert oder erhöht [siehe z. B. G. Jung et al., supra).
Von großer Wichtigkeit war die Tatsache, daß PBL von asymptomatischen HIV-infizierten, d. h. seropositiven, Individuen auch in der Lage waren, HIV-infizierte Zellen in Gegenwart des 110.4 · G19-4-Heterokonjugates zu lysieren. Somit werden durch die erfindungsgemäßen Heterokonjugate ein Mittel bereitgestellt, das die Fähigkeit von Effektorzellen im Blut von Individuen, die bereits mit HIV infiziert sind, HIV- infizierte Zellen abzutöten, auslösen oder verstärkt.
Weiterhin stellten wir fest, daß Anti-CD3-aktivierte PBL, deren CD8&spplus;-Zellen angereichert worden waren (wobei CD8 ein antigener Marker für cytotoxische T-Zellen ist), cytotoxischer als nicht fraktionierte PBL waren. Diese Beobachtung ließ annehmen, daß CD8&spplus;-cytotoxische T-Zellen innerhalb der PBL-Population durch das 110.4 · G19-4-Heterokonjugat zur Lyse der HIV-infizierten Zellen geleitet werden.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wurde ein monoklonaler Antikörper gegen gp110 (110.4) mit Fc2, einem monoklonalen Antikörper gegen CD16, einem Antigen, das als der auf LGLs und Granulozyten exprimierte Fc-Rezeptor identifiziert wurde, quervernetzt. LGLs sind Effektorzellen, die ADCC und eine natürliche Abtötung vermitteln [siehe z. B. C. Ohlander et al., Scand. J. Immunol., 15, S. 409-415 (1982)). Das Heterokonjugat lenkte LGLs von PBL von seropositiven und seronegativen Individuen zur Abtötung von HIV-infizierten Zellen.
Somit wurden PBL mit &sup5;¹Cr-markierten, HIV-infizierten Zellen in Gegenwart eines 110.4 · Fc2-Heterokonjugates inkubiert, und die Lyse wurde durch die Freisetzung von &sup5;¹Cr bestimmt. Die PBL lysierten die HIV-infizierten Zellen in Gegenwart des Heterokonjugates. Eine geringere Lyse wurde bei Kontrollversuchen beobachtet, bei denen die PBL mit Zielzellen in Gegenwart eines bloßen Gemisches der monoklonalen Antikörper, die das 110.4 · Fc2-Heterokonjugat bildeten, beobachtet. Wie bei der vorhergehenden Ausführungsform wurden weiterhin PBL von HIV-seropositiven Menschen ebenfalls zur Lyse von HIV-infizierten Zellen in Gegenwart des 110.4 · Fc2- Heterokonjugates geleitet.
Um festzustellen, welche Zellen innerhalb der PBL-Population wirklich durch dieses Heterokonjugat geleitet werden, wurden PBL mit einem erhöhten Gehalt an CD8&spplus;-T-Zellen und PBL mit einem erhöhten Gehalt an CD16&spplus;-Zellen auf ihre Fähigkeit hin untersucht, HIV-infizierte Zellen zu lysieren. PBL mit erhöhtem Gehalt an CD16&spplus;-Zellen, hauptsächlich LGLs, waren cytotoxischer gegenüber HIV-infizierten Zellen als nicht-fraktionierte PBL. In der Tat waren PBL mit erhöhtem Gehalt an CD8&spplus;-T-Zellen weniger cytotoxisch als die unfraktionierte Population. Somit lysierten CD16&spplus;-LGLs, die innerhalb der PBL-Population vorhanden waren, die HIV-infizierten Zellen in Gegenwart des 110.4 · Fc2-Heterokonjugates.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Behandlung von HIV- infizierten Individuen mit pharmazeutischen Mitteln, die die erfindungsgemäßen Heterokonjugate umfassen. Dieses Behandlungsverfahren kann in vivo durch Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge von wenigstens einem erfindungsgemäßen Antikörper-Heterokonjugat an ein HIV- infiziertes Individuum durchgeführt werden. Die Verabreichung des Heterokonjugates zusammen mit oder nach der Behandlung mit β-Interferon (β-IFN), Interleukin 2 (IL-2), anderen Interferonen, wie α- oder γ-Interferon, Interferon-Induktoren und anderen Immunmodulatoren, kann die Wirksamkeit der Behandlung erhöhen. Zum Beispiel haben unsere Versuche gezeigt, daß die Vorbehandlung der PBL mit β-IFN oder IL-2 eine stärkere Lyse der HIV-infizierten Zellen in Gegenwart des erfindungsgemäßen Heterokonjugates bewirkte als die Lyse, die mit nicht-behandelten PBL beobachtet wurde. Es kann weiterhin wünschenswert sein, HIV-infizierte Individuen mit den erfindungsgemäßen Heterokonjugaten zu behandeln, wobei die Heterokonjugate selbst HIV-neutralisierende Antikörper (d. h. als HIV-spezifische Antikörperverbindung des Heterokonjugates) umfassen, oder mit den Heterokonjugaten zusammen mit HIV- neutralisierenden Antikörpern zu behandeln, um den Angriff des Körpers auf das HIV-Virus zu verstärken.
Alternativ kann die Behandlung von HIV-infizierten Individuen Schritte beinhalten, bei denen Effektorzellen des peripheren Blutsystems, wie PBL, mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Antikörper-Heterokonjugat in vitro behandelt werden und die Effektorzellen und das Heterokonjugat dem HIV-infizierten Individuum verabreicht werden. Dieses Behandlungsverfahren beinhaltet weiterhin die in vitro-Coinkubation oder Vorinkubation der Effektorzellen mit β-IFN oder IL-2, anderen Interferonen, wie α- oder γ-Inteferon, Interferon-Induktoren und anderen Immunmodulatoren, und die Verabreichung der aktivierten Effektorzellen mit den Heterokonjugaten an ein HIV-infiziertes Individuum. Alternativ können die Effektorzellen in vitro mit einem Antikörper, der spezifisch für die bestimmte, verwendete Effektorzelle ist und mit dieser reagiert, coinkubiert oder vorinkubiert werden, und zwar vorzugsweise mit einem Antikörper, der den lytischen Mechanismus der Effektorzelle stimuliert, was zur Aktivierung der Zelle führt. Wenn zum Beispiel Heterokonjugate verwendet werden, die Antikörper gegen cytotoxische T-Zellen umfassen, kann die Behandlung eine Coinkubation oder eine Präinkubation der Effektorzellen mit einem Antikörper, der spezifisch für T-Zellen ist, aufgrund der Untersuchungen, die zeigen, daß eine solche Behandlung den lytischen Mechanismus der cytotoxischen T-Zellen weiter stimulieren kann, beinhalten. Schließlich können die Effektorzellen weiterhin mit einem Mitogen wie PHA oder ConA vor der Verabreichung an den HIV-infizierten Patienten zusammen mit dem Heterokonjugat vorbehandelt werden. Unabhängig von dem Behandlungsverfahren kann es nützlich sein, Heterokonjugate zu verwenden, die Antikörperfragmente, wie Fab oder F(ab')&sub2;, oder chimäre Antikörper, umfassen.
Die erfindungsgemäßen Heterokonjugate können unter Verwendung von üblichen Verabreichungsformen, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine intravenöse, orale, subkutane, intraperitoneale oder intralymphatische Verabreichung zählen, verabreicht werden. Eine intravenöse Verabreichung ist bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel, die die Heterokonjugate umfassen, können in einer Vielzahl von Dosierungsformen vorliegen, zu denen feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen wie Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Suppositorien, polymere Mikrokapseln oder Mikrovesikel, Lyposomen und injizierbare oder infundierbare Lösungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein. Die bevorzugte Form hängt von der Verabreichungsart und von der therapeutischen Anwendung ab.
Die Heterokonjugat-Zusammensetzungen können übliche, pharmazeutisch verträgliche Träger des Standes der Technik beinhalten, wie Serumproteine, wie humanes Serumalbumin, puffersubstanzen, wie Phosphate, Wasser oder Salze oder Elektrolyte.
Die wirksamste Verabreichungsform und das wirksamste Dosierungsschema für die erfindungsgemäßen Heterokonjugat- Zusammensetzungen hängen von der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung, von der Gesundheit des Patienten und seiner Reaktion auf die Behandlung und vom Urteil des behandelnden Arztes ab. Demgemäß sollten die Dosierungen der Heterokonjugate und begleitender Verbindungen wie β-IFN oder IL-2 beim einzelnen Patienten titriert werden.
Nichtsdestoweniger kann eine wirksame Dosis des
erfindungsgemäßen Heterokonjugates im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 mg/m² liegen. Zur in vitro-Behandlung von Effektorzellen kann eine Dosis von etwa 200 ug-2 mg des Heterokonjugates/10&sup9; Zellen zur Verabreichung verwendet werden. Eine wirksame Dosis von β-IFN, α-IFN oder γ-IFN kann im Bereich von etwa 3 0&sup6; U/Patient bis etwa 360 0&sup6; U/Patient, mit einer optimalen Dosis von 1 0&sup7; U/Patient, liegen. Bei der Verwendung von β-IFN wird eine intravenöse Verabreichung bevorzugt, während bei der Verwendung von α- oder γ-IFN eine subkutane Verabreichung bevorzugt wird. Ferner kann eine wirksame Dosis von IL-2 im Bereich von etwa 1000 bis etwa 100.000 U/kg Körpergewicht liegen. Bei Verwendung einer Dauer-Infusion kann die wirksame Dosis etwa 1-7 · 10&sup6; U pro m² der Körperoberfläche pro Tag betragen [siehe W.H. West et al., New Eng, J. Med., 316 (Nr. 15). S. 898-905 (1987)). Schließlich kann eine wirksame Dosis von HIV-neutralisierenden Antikörpern im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 mg/m² liegen.
Um die hier beschriebene Erfindung besser verständlich zu machen, werden die folgenden Beispiele aufgeführt. Es ist klar, daß diese Beispiele nur illustrativen Zwecken dienen und nicht so ausgelegt werden sollen, daß sie den Umfang dieser Erfindung auf irgendeine Weise beschränken.

BEISPIEL 1

Das folgende Beispiel zeigt das "targeting" von PBL von HIV- seropositiven und - seronegativen Individuen durch die erfindungsgemäßen Heterokonjugate zur Lyse von HIV-infizierten Zellen.
Die monoklonalen Antikörper, die zur Bildung eines erfindungsgemäßen Heterokonjugates quervernetzt wurden, waren ein HIV-spezifischer Antikörper, 110.4, und ein T-Zellspezifischer, anti-CD3-Antikörper, G19-4. Der Antikörper 110.4 gehört zu der Unterklasse IgG&sub1;, reagiert mit dem gp110- Glycoprotein des LAV innerhalb der Region, die von den Nucleotiden 6598-7178 des LAV codiert wird [siehe L.H. Gosting et al., supra], und neutralisiert die Infektiosität des HIV. G19-4 gehört zur Unterklasse IgG&sub1; und ist spezifisch für das CD3-Antigen auf dem T-Zell-Rezeptor von T-Lymphozyten.
Der monoklonale Antikörper 110.4 wurde wie folgt hergestellt: Das aus infizierten CEM-Zellen (A.T.T.C. Nr. CRL8904) [siehe F. Barre-Sinoussi et al., Science, 220, S. 868-871 (1983)] gereinigte LAV-1-Virus wurde in 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1,0% Aprotinin, 2,0% Nonidet P-40® (NP-40) (octylphenoxypolyethoxyethanol) aufgeschlossen. Der Extrakt wurde zweimal durch Zentrifugation geklärt und durch Zugabe von drei Volumina des Aufschlußpuffers ohne NP-40 auf 0,5% NP-40 eingestellt. Linsenlectin-Sepharose® (Pharmacia, Piscataway, N.J.) wurde in Aufschlußpuffer ohne NP-40 vorgewaschen und sodann in Adsorptionspuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1,0% Aprotinin, 0,5% NP-40) equilibriert. Der geklärte virale Extrakt wurde 42 Stunden bei 4ºC an Linsenlectin-Sepharoseadsorbiert. Unadsorbiertes Material wurde durch Waschen mit einem Überschuß an Adsorptionspuffer entfernt. Die Elution des adsorbierten Materials wurde mit 0,2 M alpha-Methylmannosid in Adsorptionspuffer durchgeführt. Der Eluent wurde gegen PBS dialysiert, um den Zucker zu entfernen, und das Material wurde an die Linsenlectin-Sepharose- readsorbiert.
Der Glycoprotein-Linsenlectin-Sepharose®-Komplex wurde verwendet, um BALB/c-Mause mit drei intraperitonealen Injektionen ohne Adjuvans, die mit einem 2-3-wöchigen Abstand verabreicht wurden, zu immunisieren. Die Milz wurde den immunisierten Mäusen entnommen, bei denen sich zirkulierende Antikörper gegen Glycoproteine des HIV mittels Immunoblot, Radioimmunopräzipitation und/oder ELISA nachweisen ließen.
Die zur Erzeugung der Hybridomazellinien verwendeten Verfahren entsprachen im allgemeinen denjenigen von Kohler und Milstein, Nature, 256, S. 495 (1975) mit den Modifikationen von Goldstein et al., Infect. Immun., 38, S. 273 (1982). Milz-B-Lymphozyten der immunisierten Mäuse wurden mit NS-1-Myelomazellen unter Verwendung von 40% (w/v) Polyethylenglycol fusioniert. Nach der Fusion wurde das Zellgemisch in HAT-Medium (RPMI-1640 Medium, ergänzt mit 15% fötalem Kälberserum, 1·10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4·10&supmin;&sup7; M Aminopterin und 1.6 · 10- Thymidin) resuspendiert, um auf das Wachstum von Hybridzellen zu selektieren, und sodann in einer Konzentration von 1-3·10&sup6; Zellen/ml auf Mikrokulturschalen mit 96 Vertiefungen verteilt und bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre, die 6% CO&sub2; enthielt, inkubiert. Die Kulturen wurden durch Austausch der einen Hälfte des Überstandes mit frischem HAT-Medium genährt. Die Vertiefungen wurden unter Verwendung eines Inversionsmikroskopes auf Anzeichen einer Zellproliferation hin beobachtet, und als die Zellen eine ausreichende Dichte besaßen, wurden die Überstände auf anti-LAV-Antikörper untersucht.
Vertiefungen, die Hybridzellen enthielten, die Antikörper gegen das LAV produzierten, wurden durch ELISAs identifiziert, wobei die Bindung entweder des gereinigten, vollständigen aufgeschlossenen Virus oder von biologisch exprimierten Fusionsproteinen gemessen wurde. ELISA-Untersuchungen unter Verwendung von aufgeschlossenen Viren wurden auf LAV-EIA- Platten (Genetic Systems, Seattle, Washington) durchgeführt. Die Platten wurden mit Zellkulturflüssigkeiten 45 Minuten bei 37ºC inkubiert und sodann dreimal mit 0,05% Tween®20 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS-Tween®) gewaschen.
Peroxidase-Ziege-Anti-Maus-IgG (Verdünnung 1 : 2.000 in PBS- Tween®; Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, California) wurde zugegeben (100 ul pro Vertiefung), und die Platten wurden 45 Minuten bei 37ºC inkubiert und wie oben gewaschen. Substrat (0,025 M Zitronensäure, 0,05 M zweibasisches Natriumphosphat, pH 5,0, enthaltend 14 mg o- Phenylendiamin und 10 ul 30% Wasserstoffperoxid pro 50 ml) wurde zugegeben, und die Platten wurden 30 Minuten bei Raumtempertur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde mit 3N Schwefelsäure gestoppt, und kolorimetrische Reaktionen wurden mit einem automatischen Mikroplattenleser quantifiziert. Vertiefungen, die positive Ergebnisse ergaben, wurden durch Grenzverdünnung subkloniert, erneut auf ihre Spezifität hin untersucht und sodann expandiert.
Die von den resultierenden Hybridzellinien sekretierten monoklonalen Antikörper wurden ferner in Hinsicht auf ihre Spezifizität und Reaktivität durch Immunoblotting, Immunopräzipitation und ELISA unter Verwendung von aufgeschlossenen LAV-Viren, rekombinanten LAV-Fusionsproteinen und synthetischen LAV-Peptiden charakterisiert. Es wurde festgestellt, daß alle Antikörper zum IgG&sub1;-Isotyp gehörten. Das Hybridom, das den in dieser Ausführungsform verwendeten 110.4- Antikörper produzierte, wurde bei der American Type Culture Collection unter A.T.C.C. Nr. HB9405 im Zusammenhang mit der GB 2 196 634 B hinterlegt. Außerdem ist die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen die gp110- und gp41- Glycoproteine des HIV-1 von L.H. Gosting et al., J. Clin. Microbiol., 25 (Nr. 5). S. 845-848 (1987) beschrieben worden. Der anti-CD3 monoklonale Antikörper G19-4 wurde, wie von J.A. Ledbetter and E. Clark, Human Immunology, 15, S. 30-43 (1986) beschrieben, hergestellt. Außerdem sind monoklonale Antikörper gegen das CD3-Antigen auch käuflich erhältlich [siehe P. Perez et al., 1986, supra). Das Hybridom, das den in dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendeten speziellen anti- CD-3 monoklonalen Antikörper, d. h. G19-4, produziert, wurde vor Einreichung dieser Anmeldung bei der American Type Culture Collection hinterlegt.
Die monoklonalen Antikörper 110.4 und G19-4 wurden gemäß dem Verfahren von B. Karpovsky et al., supra, unter Verwendung von SPDP quervernetzt und durch Sephacryl®S300 Größenausschlußchromatographie von freiem Antikörper abgetrennt. Fraktionen, die Konjugate mit einem hohem Molekulargewicht von > 300 Kd enthielten, wurden in Immunofluoreszenzassays [siehe z. B. J.A. Ledbetter et al., J. Exp. Med., 152, S. 280.295 (1980)] hinsichtlich ihrer Reaktivität mit a) CD3 auflebensfähigen humanen PBL und b) Aceton-fixierten CEM-Zellen, die mit LAV-1 infiziert worden waren, untersucht. Faktionen mit der höchsten Bindungsaktivität sowohl gegenüber den CD3 auch als den HIV-Antigenen wurden sodann bei den &sup5;¹Cr-Freisetzungs-Cytotoxizitätsassays verwendet, um die Fähigkeit der PBL von HIV-seropositiven oder -seronegativen Individuen zu untersuchen, HIV-infizierte CEM- Zellen in Gegenwart des 110.4 · G19-4-Heterokonjugates zu lysieren.
Der Cytotoxizitätsassay wurde wie folgt durchgeführt: CEM- Zellen wurden 48 Stunden mit dem LAV-1-Isolat infiziert, bis praktisch 100% der Zellen gp110 exprimierten, was durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 110.4 und nachfolgender Behandlung mit einem Fluorescein-Isothiocyanat-markierten Ziege-anti-Maus- Immunoglobulin G F(ab')&sub2;(Zymed) bestimmt wurde. Die infizierten Zellen wurden sodann 1 Stunde mit &sup5;¹Cr (Na&sub2;CrO&sub4;, New England Nuclear, Boston, MA) markiert und bei dem Assay als Zielzellen verwendet.
Die Effektorzellen waren Ficoll-Hypaque-gereinigte PBL von HIV- seronegativen oder -seropositiven Individuen. Die PBL wurden 3 Tage mit oder ohne monomeren anti-CD3 (G19-4) an fester Phase und sodann 24 Stunden in anti-CD3-freiem Medium inkubiert. Die unbehandelten und behandelten PBL wurden sodann vier Stunden bei 37ºC mit 3·10³ &sup5;¹Cr-markierten CEM-Zielzellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei einem Verhältnis von Effektorzellen:Zielzellen (E:T) von 50 : 1 unter verschiedenen Konzentrationen des 110.4 · G19-4-Heterokonjugates oder reinen Gemischen der einzelnen Antikörper 110.4 und G19-4 als Kontrolle inkubiert. Die Überstände wurden geerntet und in einem Gammazähler gezählt. Die %-Lyse, dargestellt als % der &sup5;¹Cr-Freisetzung, wurde wie folgt berechnet:
cpm im Versuch experimentelle Freisetzung - cpm spontane Freisetzung/cpm maximale Freisetzung - cpm spontane Freisetzung ·100
wobei: spontane Freisetzung = cpm, die von Zielzellen im Medium alleine freigesetzt wurden, und maximale Freisetzung = cpm, die von Zielzellen in einem Detergens freigesetzt wurden. Die spontane &sup5;¹Cr-Freisetzung betrug gewöhnlich weniger als 15% der maximalen Freisetzung. Die dargestellten Ergebnisse sind die Mittelwerte der %-Werte des &sup5;¹Cr, das von Zellen in 4 gleichartigen Vertiefungen freigesetzt wurde.
Fig. 1 zeigt die Lyse in % der HIV-infizierten Zielzellen durch die behandelten und unbehandelten PBL von seronegativen Individuen in Gegenwart des 110.4 · G19-4-Heterokonjugates. Wie die Figur zeigt, lysierten die unbehandelten PBL die HIV- infizierten Zielzellen in Gegenwart von 20 bis 200 ng/ml des Heterokonjugates. Die mit dem anti-CD3 vorbehandelten PBL waren sogar cytotoxischer als die unbehandelten PBL.
Fig. 2A stellt in Tabellenform die Lyse in % der HIV- infizierten Zellen gegenüber -nichtinfizierten Zellen durch anti-CD3-vorbehandelte PBL von HIV-seropositiven und - seronegativen Individuen in Gegenwart des 110.4 · G19-4- Heterokonjugates oder in Gegenwart von Gemischen der einzelnen Antikörper 110.4 und G19-4 dar. PBL von HIV-seropositiven und -seronegativen Spendern wurden drei Tage mit monomerem Anti-CD3 (G19-4) an fester Phase und sodann 24 Stunden in anti-CD3- freiem Medium kultiviert. Die PBL wurden danach auf ihre Cytotoxizität gegen HIV-infizierte und -nichtinfizierte CEM- Zellen bei einem E:T-Verhältnis von 50 : 1 in Gegenwart von 200 ng/ml des 110.4 · G19-4-Heterokonjugates oder einem Gemisch der Antikörper 110.4 und G19-4 untersucht.
Die Daten zeigen, daß ein größerer Lysegrad in Gegenwart des Heterokonjugates als in Gegenwart des Gemisches durch die PBL vermittelt wurde, während vernachlässigbare Unterschiede im Lysegrad der nichtinfizierten Zellen in Gegenwart des Heterokonjugates gegenüber dem Antikörpergemisch bestanden. Somit sind die PBL durch das Heterokonjugat zur Abtötung der HIV-infizierten Zellen geleitet worden. Die Lyse in % der HIV- infizierten oder -nichtinfizierten Zellen war in Gegenwart des Gemisches der Antikörper nicht größer als in Abwesenheit der Antikörper. Weiterhin zeigt Fig. 2A, daß PBL von asymptomatischen HIV-seropositiven Individuen in der Lage sind, HIV-infizierte Zellen in Gegenwart des 110.4 · G19-4- Heterokonjugates zu lysieren.
Fig. 2B zeigt die Lyse in % der HIV-infizierten Zellen durch CD8&spplus;- angereicherte PBL gegenüber nichtgetrennten seronegativen PBL in Gegenwart des 110.4 · G19-4-Heterokonjugates. Die Anreicherung der PBL wurde wie folgt durchgeführt: seronegative PBL wurden auf CD8&spplus;-Zellen durch negative Selektion, wie von T. Lea et al., Scand. J. Immunol., 22, S. 207-216 (1985) beschrieben, angereichert. Kurz gesagt, wurden PBL, die 3 Tage mit anti-CD3 an fester Phase aktiviert worden waren, mit monoklonalen Antikörpern gegen DR, CD20, CD16, CD11, CD4 und CDw14 behandelt, wodurch B-Zellen, Monozyten, LGLs (z.b. NK oder K-Zellen) und CD4-Zellen überzogen wurden. Die mit Antikörpern überzogenen Zellen wurden sodann mit magnetischen partikeln, die mit Schaf-Anti-Maus-IG (Dynal Inc., Fort Lee, N.J.) überzogen worden waren, inkubiert und mit einem Dynal M-450-Magneten entfernt. Alle verwendeten monoklonalen Antikörper-- DR (HB10a), CD20 (IF5), CD16 (Fc2.2), CD11 (60.1), CD4 (G19-2) und CDw14 (f13)-- sind beschrieben worden [siehe z. B. Leukocyte Typing, A. Bernard et al. (Herausgeber), Springer-Verlag, New York (1984); Leukocyte Typing II, E. Reinherz et al. (Herausgeber), Springer-Verlag, New York (1986); und Leukocyte Typing III, A.J. McMichawel (Herausgeber), Oxford University Press, Oxford (im Druck)]. Das Zelltrennungsverfahren ergab eine ungefähr dreifache Anreicherung der CD8&spplus;-Zellen -- von 23% CD8&spplus;-Zellen bei der nichtgetrennten PBL-Population zu 62% CD8&spplus;-Zellen bei der angereicherten Population. Die anti-CD3-behandelten, nichtgetrennten und CD8&spplus;-angereicherten Zellen wurden sodann über Nacht ohne anti-CD3 vor der Cytotoxizitäts-Untersuchung mit dem 110.4 · CD3-Heterokonjugat inkubiert.
Fig. 2B zeigt, daß CD3-aktivierte, CD8&spplus;-angereicherte Zellen cytotoxischer gegenüber den Zielzellen als die nichtgetrennten Zellen sind, was darauf hinweist, daß CD8&spplus;-Zellen (d. h., cytotoxische T-Zellen) innerhalb der PBL-Population größtenteils für die Lyse der HIV-infizierten Zellen verantwortlich sind.
Damit zeigt dies Beispiel die Fähigkeit des erfindungsgemäßen 110.4 · G19-4-Heterokonjugates, sowohl unbehandelte als auch anti-CD3-behandelte PBL von entweder HIV-seropositiven oder -seronegativen Individuen zur Lyse von HIV-infizierten Zellen zu lenken. Die dargelegten Daten zeigen deutlich die Brauchbarkeit dieses Ansatzes zur Behandlung von HIV- infizierten Individuen.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Heterokonjugates, das den monoklonalen Antikörper 110.4 quervernetzt mit einem monoklonalen Antikörper umfaßt, der spezifisch für den Fc-Rezeptor von bestimmten Effektorzellen (z. B. LGLs) ist, PBL zur Lyse von HIV-infizierten Zellen zu leiten.
In diesem Beispiel wird der oben beschriebene Antikörper 110.4 mit den oben beschriebenen Verfahren mit dem Antikörper Fc2 quervernetzt, der spezifisch für das CD16-Antigen ist, das als Fc-Rezeptor, der auf LGLs und Granulozyten exprimiert wird, identifiziert worden ist. FC2 ist, wie von J.A. Ledbetter et al., in Perspectives In Immunogenetics And Histocompatibility supra beschrieben, hergestellt worden. Ferner ist das Hybridom, das den Fc2-Antikörper produziert, bei der American Type Culture Collection vor der Einreichung dieser Anmeldung hinterlegt worden. Das resultierende Heterokonjugat wurde als 110.4 · Fc2 bezeichnet.
Unter Verwendung des gleichen, in Beispiel 1 beschriebenen &sup5;¹Cr- Freisetzungs-Cytotoxizitätsassay testeten wir die Fähigkeit dieses Heterokonjugates, seronegative PBL, die a) 2 Tage mit oder ohne humanem IL-2 (100 U/ml) kultiviert worden waren oder b) über Nacht mit oder ohne β-IFN (300 U/ml, HEM, Maryland) kultiviert worden waren, zu leiten, um HIV-infizierte Zellen abzutöten. Die unbehandelten und behandelten PBL wurden 4 Stunden bei 37ºC mit 3·10³ &sup5;¹Cr-markierten HIV-infizierten CEM- Zellen bei einem E:T-Verhältnis von 50 : 1 unter verschiedenen Konzentrationen des Heterokonjugates oder eines Antikörpergemisches inkubiert, und die Lyse in % wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse dieses Assays. Sowohl die behandelten als auch die unbehandelten PBL waren in der Lage, die Zielzellen in Gegenwart des Heterokonjugates bei Heterokonjugat-Konzentrationen, die so niedrig wie 15 ng/ml waren, zu lysieren. Wie in Fig. 3A gezeigt ist, waren die IL-2-aktivierten Zellen etwas cytotoxischer gegenüber den HIV- infizierten Zellen als die unbehandelten PBL in Gegenwart des Heterokonjugates. In Gegenwart des Antikörpergemisches alleine trat keine merkliche Lyse auf. Entsprechend zeigt Fig. 3B, daß die Vorbehandlung der PBL mit β-IFN Zellen ergibt, die etwas lytischer als unbehandelte PBL in Gegenwart des Heterokonjugates sind.
Fig. 4 zeigt weiterhin die Fähigkeit einer Vorbehandlung mit β-IFN, die Cytotoxizität der PBL in Gegenwart des 110.4 · Fc2- Heterokonjugates zu verstärken. PBL von seronegativen Spendern wurden durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation isoliert, zu 1·10&sup6; Zellen/ml in RPMI-1640-Medium, das mit 10% hitze-inaktiviertem Humanserum und 0, 300 oder 1000 U/ml β-IFN ergänzt worden war, suspendiert und 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Sodann wurden die PBL gewaschen, in RPMI-1640-Medium, das mit 15% Hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum ergänzt worden war, vor der Untersuchung auf Cytotoxizität gegen &sup5;¹Cr-markierte HIV- infizierte CEM-Zellen resuspendiert. Der Assay wurde, wie oben beschrieben, bei einem E:T-Zellverhältnis von 50 : 1 als 4- stündiger Assay in Gegenwart von 200 ng/ml des 110.4 · Fx2- Heterokonjugates, eines Gemisches der einzelnen Antikörper des Heterokonjugates, der einzelnen Antikörper oder ohne Antikörper durchgeführt. Wie die Tabelle in Fig. 4 zeigt, erhöht eine kurzzeitige Behandlung der PBL mit β-IFN die Cytotoxizität der PBL in Gegenwart des Heterokonjugates, und somit ist eine Behandlung über Nacht mit β-IFN nicht notwendig.
Fig. 5 stellt in Tabellenform die Lyse in % der HIV- infizierten Zellen durch IL-2-vorbehandelte PBL von HIV- seropositiven und -seronegativen Individuen in Gegenwart des 110.4 · Fc2-Heterokonjugates dar. Die PBL von HIV-seropositiven und -seronegativen Spendern wurden 2 Tage bei 37ºC mit IL-2 (100 U/ml) kultiviert und auf Cytotoxizität gegen HIV- infizierte und -nichtinfizierte CEM-Zellen bei einem E:T- Verhältnis von 50 : 1 in Gegenwart von 200 ng/ml des 110.4 · Fc2- Heterokonjugates oder eines Gemisches der beiden Antikörper untersucht. Diese Figur zeigt die Fähigkeit der PBL von seropositiven (sowie seronegativen) Individuen, durch die erfindungsgemäßen Heterokonjugate geleitet zu werden, um HIV- infizierte Zellen zu lysieren. Eine verstärkte Lyse der nichtinfizierten Zellen in Gegenwart des Heterokonjugates wurde nicht beobachtet.
Um festzustellen, welche Zellen innerhalb der PBL-Population für die Lyse, die mit 110.4 · Fc2 beobachtet wurde, verantwortlich waren, reicherten wir die PBL auf CD16&spplus;-Zellen mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens an, außer, daß die für die Umhüllung der PBL verwendeten monoklonalen Antikörper CD28 (9.3), CDS (10.2), Cp4 (G19-2), DR (HB10a), CD20 (IF5) und CDw14 (f 13) waren, die alle in den vorher beschriebenen Leukocyte Typina-Veröffentlichungen beschrieben worden sind. Die PBL wurden durch dieses Verfahren von 17% CD16&spplus;-Zellen in der nichtgetrennten PBL-Population auf 66% CD16&spplus;-Zellen in der angereicherten Population angereichert. Die nichtgetrennten und die CD16&spplus;-angereicherten Zellen wurden 2 Tage mit IL-2 vor der Untersuchung auf Cytotoxizität bei verschiedenen E:T-Verhältnissen in Gegenwart von 200 ng/ml des 110.4 · Fc2 kultiviert. Wie Fig. 6 zeigt, waren die IL-2- behandelten PBL, die hinsichtlich der CD16&spplus;-Zellen angereichert worden waren, cytotoxischer gegenüber HIV-infizierten Zellen als die nichtgetrennten Zellen, was darauf hinwies, daß CD16&spplus;- LGL-Zellen innerhalb der PBL-Population durch dieses Heterokonjugat geleitet werden, um HIV-infizierte Zellen zu lysieren.
Dieses Beispiel zeigt daher die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Heterokonjugates, eine zweite Effektorzelle des peripheren Blutsystems, d. h. LGL-Zellen, zur Abtötung von HIV-infizierten Zellen zu führen. Außerdem haben wir gezeigt, daß eine Vorbehandlung der Effektorzellen entweder mit IL-2 oder β-IFN die Fähigkeit des Heterokonjugates verstärkt, die Effektorzelle zu lenken, um die HIV-infizierte Zelle zu lysieren.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit eines anderen erfindungsgemäßen Heterokonjugates, das einen monoklonalen Antikörper gegen ein zweites HIV-Glycoprotein, gp41, das mit dem monoklonalen Antikörper G19-4 quervernetzt ist, umfaßt, PBL zu lenken, um HIV-infizierte Zellen zu lysieren.
Bei diesem Beispiel verwendeten wir den monoklonalen Antikörper 41.1 als HIV-spezifischen Antikörper des Heterokonjugates. 41.1 ist ein Antikörper der Unterklasse IgG&sub1; und reagiert mit einem Epitop einer hochkonservierten Region des gp41, die von den Nukleotiden 7178-7698 des LAV-1 codiert wird. Die Herstellung dieses monoklonalen Antikörpers wird detailliert in L.H. Gosting et al., supra beschrieben, und das Hybridom, das den Antikörper produziert, ist bei der American Type Culture Collection vor der Einreichung dieser Anmeldung hinterlegt worden.
41.1 und G19-4 wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, quervernetzt, und das resultierende Heterokonjugat wurde als 41.1 · G19-4 bezeichnet. Wie in Beispiel 1 wurde das Heterokonjugat von dem freien Antikörper durch Größenausschluß- Chromatographie unter Verwendung von Sephacryl®S300 getrennt, und die Fraktion mit der höchsten Bindungsaktivität sowohl zum gp41 auf HIV-infizierten Zellen als auch zum CD3-Antigen auf humanem PBL wurde sodann mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Cytotoxizitäts-Assay untersucht. Kurz gesagt, waren die Effektorzellen PBL von seronegativen Spendern, die drei Tage mit anti-CD3 an fester Phase kultiviert worden waren, worauf eine Inkubation über Nacht in einem anti-CD3-freien Medium folgte. Die Effektorzellen wurden sodann 4 Stunden bei 37ºC mit 3·10³ &sup5;¹Cr-markierten CEM-Zielzellen, wie in Beispiel 1 beschrieben, bei einem E:T-Verhältnis von 50 : 1 in Gegenwart entweder a) des 41.1 · G19-4-Heterokonjugates; b) eines Gemisches des 41.1- mit dem G19-4-Antikörper; c) des 41.1 alleine oder d) des G19-4 alleine, inkubiert, und die Lyse in % der CEM-Zellen wurde bestimmt. Die Ergebnisse dieses Assays sind in Fig. 7 dargestellt. Die Figur zeigt die Fähigkeit des 41.1 · G19-4-Heterokonjugates, PBL zu leiten, um HIV- infizierte Zellen abzutöten. Die PBL wurden in Gegenwart von ungefähr 50 bis 200 ng/ml des Heterokonjugates zur Lyse der HIV-infizierten Zellen stimuliert. Die Lyse in Gegenwart des Antikörpergemisches oder der einzelnen Antikörper alleine war vernachlässigbar.
Somit können bei der erfindungsgemäßen Heterokonjugat-Methode zur Abtötung von HIV-infizierten Zellen eine Vielzahl von HIV- spezifischen Antikörper, die mit Effektorzell-spezifischen Antikörpern quervernetzt sind, angewendet werden. In der Tat ist der monoklonale Antikörper 41.1 bei diesem Verfahren besonders brauchbar, da er mit dem größten Teil der untersuchten Isolate des HIV (10 von 13) reagierte, wobei die Isolate aus verschiedenen geographischen Teilen der Erde stammten.
Beispiele für die durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellten Hybridome sind die bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegten Kulturen. Die Kulturen wurden am 15. September 1987 hinterlegt und werden wie folgt bezeichnet:
Hybridom G19-4: ATCC NO. HB9536
Hybridom Fc2: ATCC No. HB9535
Hybridom 41.1: ATCC NO. HB9534.
Während vorstehend mehrere erfindungsgemäße Ausführungsformen dargestellt wurden, sollte darauf hingewiesen werden, daß der Schutzumfang dieser Erfindung eher durch die beige legten Ansprüche als durch die obigen speziellen, beispielhaften Ausführungsformen, definiert werden soll.

Claims

1. Antikörper-Heterokonjugat, umfassend wenigstens einen Antikörper, der mit einem HIV-Antigen reagiert, das auf der Oberfläche einer HIV-infizierten Zeile exprimiert wird, der mit wenigstens einem Antikörper verknüpft ist, der mit einer Effektorzelle des peripheren Blutsystems reagiert, die zur Abtötung einer HIV-infizierten Zelle befähigt ist.

2. Antikörper-Heterokonjugat nach Anspruch 1, wobei das HIV- Antigen auf einem HIV-Envelope-Glykoprotein zu finden ist.

3. Antikörper-Heterokonjugat nach Anspruch 1, worin die Effektorzelle ausgewählt ist unter T-Lymphocyten, großen granulären Lymphocyten, Granulocyten, Monocyten und Makrophagen.

4. Antikörper-Heterokonjugat nach Anspruch 1, worin der mit der Effektorzelle reagierende Antikörper ausgewählt ist unter Antikörpern, die mit dem T-Zellrezeptor auf T- Lymphocyten und einem Fc-Rezeptor auf Leukocyten reagieren.

5. Antikörper-Heterokonjugat nach Anspruch 1, worin der mit der Effektorzelle reagierende Antikörper ein Antikörper für das CD3 Antigen auf dem T-Zellrezeptor von T- Lymphocyten ist.

6. Antikörper-Heterokonjugat nach Anspruch 1, worin der mit der Effektorzelle reagierende Antikörper ein Antikörper für den CD16 Fc-Rezeptor von großen granulären Lymphocyten und Granulocyten ist.

7. Antikörper-Heterokonjugat nach Anspruch 1, worin die Antikörper und Antikörperfragmente ausgewählt sind unter Fab und F (ab')&sub2;-Fragmenten.

8. Antikörper-Heterokonjugat nach Anspruch 1, worin die Antikörper chimäre Antikörper sind.

9. Antikörper-Heterokonjugat, umfassend einen ersten Antikörper, der mit einem HIV-Antigen reagiert, das auf der Oberfläche einer HIV-infizierten Zelle exprimiert wird, der mit einem zweiten Antikörper verbunden ist, welcher mit einer Effektorzelle des peripheren Blutsystems reagiert, die zur Abtötung einer HIV-infizierten Zelle befähigt ist.

10. Antikörper-Heterokonjugat nach Anspruch 9, ausgewählt unter 110.4 · G19-4, 110.4 · Fc2 und 41.1 · G19-4.

11. Verwendung von Effektorzellen des peripheren Blutsystems in Gegenwart von wenigstens einem Antikörper- Heterokonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Abtötung HIV-infizierter Zellen.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin die Effektorzellen ausgewählt sind unter Peripherblut-Lymphocyten, Granulocyten, Monocyten und Makrophagen.

13. Verwendung nach Anspruch 11, worin die Effektorzellen erhalten wurden aus HIV-seropositiven oder -seronegativen Individuen.

14. Verwendung nach Anspruch 11, worin die Effektorzellen mit einer Verbindung vorbehandelt wurden, die ausgewählt ist unter Interleukin-2, β-Interferon, α-Interferon und γ- Interferon.

15. Verwendung nach Anspruch 11, worin die Effektorzellen mit einem Effektorzellen-spezifischen Antikörper vorbehandelt wurden.

16. Verwendung nach Anspruch 15, worin der Antikörper den lytischen Mechanismus der Effektorzellen stimuliert.

17. Verwendung nach Anspruch 16, worin der Antikörper ein Anti-CD3-Antikörper ist.

18. Verwendung nach Anspruch 11 oder 14, worin die Effektorzellen cytotoxische T-Lymphocyten sind und das Antikörper-Heterokonjugat ausgewählt ist unter 110.4 x G19-4 und 41.1 · G19-4.

19. Verwendung nach Anspruch 11 oder 14, worin die Effektorzellen große granuläre Lymphocyten sind und das Antikörper-Heterokonjugat 110.4 · Fc2 ist.

20. Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung zur Behandlung von HIV-Infektionen, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines Antikörper-Heterokonjugats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

21. Verwendung einer pharmazeutisch wirksamen Menge wenigstens eines Antikörper-Heterokonjugats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung von HIV-Infektionen.

22. Verwendung nach Anspruch 21, worin zusätzlich eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens einer Verbindung verwendet wird, die ausgewählt ist unter Interleukin-2, β- Interferon, α-Interferon und γ-Interferon.

23. Verwendung von Effektorzellen des peripheren Blutsystems, die zur Abtötung von HIV-infizierten Zellen befähigt sind, wobei die Effektorzellen mit wenigstens einem Antikörper- Heterokonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 in vitro behandelt wurden, und des Heterokonjugats zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung von HIV- Infektionen.

24. Verwendung nach Anspruch 23, worin die Effektorzelle ausgewählt ist unter T-Lymphocyten, großen granulären Lymphocyten, Granulocyten, Monocyten und Makrophagen.

25. Verwendung nach Anspruch 23, worin die Effektorzellen vorbehandelt wurden mit einer Verbindung, die ausgewählt ist unter Interleukin-2, β-Interferon, α-Interferon und γ- Interferon.

26. Verwendung nach Anspruch 23, worin die Effektorzellen mit einem Effektorzellen-spezifischen Antikörper vorbehandelt wurden.

27. Verwendung nach Anspruch 26, worin der Antikörper den lytischen Mechanismus der Effektorzelle stimuliert.

28. Verwendung nach Anspruch 27, worin der Antikörper ein Anti-CD3-Antikörper ist.

29. Verfahren zur Herstellung eines Antikörper- Heterokonjugats, umfassend wenigstens einen ersten Antikörper, der mit einem HIV-Antigen reagiert, das auf der Oberfläche einer HIV-infizierten Zelle exprimiert wird, der mit wenigstens einem zweiten Antikörper vernetzt ist, weicher mit einer Effektorzelle des peripheren Blutsystems reagiert, die zur Abtötung einer HIV- infizierten Zelle befähigt ist, wobei man den ersten und den zweiten Antikörper mit einem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel umsetzt.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Vernetzungsmittel N- Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionat (SPDP) oder Maleimidobutryloxysuccinimid (GMBS) ist.

31. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der erste Antikörper 110.4 und der zweite Antikörper G19-4 ist; oder

der erste Antikörper 110.4 und der zweite Antikörper Fc2 ist; oder

der erste Antikörper 41.4 und der zweite Antikörper G19-4 ist.