JPH05506142A

JPH05506142A - Ｈｉｖ蛋白質の非免疫支配エピトープに特異的なモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH05506142A
Application number: JP91503590A
Authority: JP
Inventors: ヒギンズ，ポール・ジェイ; スコット，チャールズ・エフ，ジュニアー
Original assignee: レプリゲン・コーポレーション
Priority date: 1990-01-16
Filing date: 1991-01-16
Publication date: 1993-09-16
Also published as: EP0511300A1; EP0511300A4; CA2073060A1; WO1991010742A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１１１Ｖ蛋白質の非免疫支配エピトープに特異的なモノクローナル抗体発労Ω背屡本発明はヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）に特異的な抗体に関する。

ＨｔＶは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子であると言われている（Ｐｏρ−ｐｏｖｉｃ　ｅＬ　ａｌ、、　１９８４＋　５ｃｔｅｎｃｅ　２２４：４９７）　＋＋これは、そのゲノムが少なくとも６ケの遺伝子産物をコードし得るヒトの病原性レトロウィルスである。そのｅｎｖ遺伝子１良蛋自分解によって、１２０　ＫＤ％層蛋白（ｇｐｌ加）と４１に口軽膜蛋白（ｇｐ４１）とに処理される１６０　ＫＤａのグリコジル蛋白（ｇｐ１６０）をコードする。　ｇｐ１２０は、非共有結合によってｇｐ４１と共に、ピリオンに磁路される。　ｇｐＬ２０　とｇｐ４Ｌとは、ピリオン粒子ならびにウィルス感染細胞双方の表面に存在している。

「■ｖの異なる株は、ウィルスのゲノムによってコードされる蛋白のアミノ酸配列部、それも特に、外層糖蛋白１ｐ１２０のアミノ酸配列順序（Ｓｔａｒｅｉｃｈ、１９８６　Ｃｅ１ｌ。

４５：６：ＩＩ：　Ｈａｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６＋　５ｃｒｅｎｃＩ？２３２：１５４８）において変異する。　ｇｐ１２０のポリペプチド配列は、その全長に亙って、ひとつのＩＩＩＶ変異体から他の変異体へ約２０−２５凌化する。全エンベロープ蛋白に及ぼす変化の度合いは一定していない。

保存領域と可変領域にはひとつのパターンがあり、これは蛋白が、明確な機能の源泉になっている領域に分割されていることを示唆している。多くの異なった領域については、例えば、ＣＤ４の結合領域、主要な中和決定因子それに細胞障害性のＴ細胞認識決定因子が、これまでに確認されている。

癌や他の病気の治療には、これまで標的細胞に対する抗体が用いられてきた。

Ｚａｒｌｉｎｇ等（ＥＰｏ　３０８９３６）は、［ｌＩＶに感染した細胞を選択的に死滅させるＧＰ１２０の主要な中和領域に特異的な抗体の異種結合体（ヘテロコンジュゲート）を開示している＊　Ｐｉｎｃｕｓ等（Ｊ、ｒａｓ＋ｕｎｏｌ −（１９８９）　１４２；３０７０）は、ｇｐ１２０の免疫支配領域をも認識する抗体毒素結合体について記述しており、ｆｉｌｌ等（Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ、＾Ｑ、Ｓｃｉ、、１９８９．８６；１９８１ンは、抗ｇｐ４１毒素結合体を開示している。

余五少概！本発明は、ＨＩＶエンベロー１蛋白の非免疫支配エピトープを認識することが可能な抗体を特色としており、この場合、エンベロープ蛋白への抗体の結合は、ＥｌＶに感染した患者の血清によって阻止されない０本川ｔｉＭｓ中で使用する［抗体１とは、全抗体分子あるいはフラグメントもしくは抗体の修飾体を指しており、例えば、抗体のフラグメントは〜分子のＦａｂｇフラグメント、Ｆａｂ＋フラグメントまたは長鎖もしくは短鎖のみであってよく、例えば修飾体は、ｆｌｕｓ−等が匍羽／的詞４で、また１、ａｄｎｅｒ等がｗｏ８８１０１６４９で記述しているように、長鎖と短鎖の双方を含む線状ポリペプチド分子であってもよい０本明細書で使用する「非免疫支配エビドーグ」とは、有意に免疫原性で、ない、つまり、少なくともヒト患者の７５ｚで、抗体反応を誘引しない天然蛋白の構造内におけるアミノ酸の配列を意味している０本発明によれば、ＨＩＶエンベロー１蛋白の非免疫支配領域に向けられた抗体は、潜在的に競合するＷＩ環抗体が不在であったり、低戯であるためにその鏝体に結合することが可能である。対照的に、エンベロープ蛋白の免疫支配領域に向けられた抗体は、愚者の、［ＩＩＶ　ＩＪ染に対する自然な免疫反応により、患者に抗体が存在するため、標的エンベロープ蛋白への結合から、部分的に、あるいは完全、ｇｐ１２ｏもしくはｇｐ４１部分内にあると思われる。非免疫支配性ｃ３　［ＩＩＶ陽性ヒト血清の存在下で、標的抗原に試験管内で抗体を結合させることによって、測定することが可能である。非免疫支配エピトープに特異的な抗体は、ＩＩＩＶ陽性血清の存在下もしくは不在下で、比較可能な結合効率を実証しよう、　ｎｒｖ陽性直清の存在下における標的抗原に対する抗体の結合効率は、少なくとも、［ｌ［Ｖ陽性血清の不在下におけるその結合効率の８０χである。

好ましい態様において、抗体によって認識される非免疫支配エピトープは、グループに共通する０本明細書において使用する「グループに共通する決定因子」とは、その株にのみ特異的でなく、少なくとも、もうひとつのＨｒｉ株上にも存在する■■ｖ株によってコードされる蛋白の、抗原部分を意味する。好ましくは、抗体は、ＨＩＶのエンベロープ糖蛋白を発現する細胞の表面に結合し得るものであり、ＲａＬｍｒ等の１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７における番号順の申し合わせによる、アミノ酸残基４７３から７５９まで（両端を含む）におけるエンベロープ蛋白の領域を認識することができ、かつ、４７３から７５９までのアミノ酸領域内に含まれるａｐ１２０の部分を認識することができるものである。このような抗体の一例は＾０丁、Ｃ，Ｃ，Ｎ。

、　Ｈｅ　１０３２１の細５．′胞系によって産生される抗体である。

他の好ましい態様としては、抗体は毒素に共有結合して結合体を形成するものであり、その結合体が、ヒ）ＨＩＶ＋血清の存在下で、［ＩＴＶに感染したＩＩ胞を死滅させ得るものである。ＩＩ胞の殺傷作用は、［ＩＩＶ　ｖＭＩＡ胞による抗体毒素結合体の、ＩＩ胞内への取込みによって生じるであろう、この結合体は、抗体と毒素分子を化学的に結合する蛋白レベルで、またはＤＮＡレベルで上記Ｈｕｓｔａｎの抗体をコードするＤＭＡの配列をクローニングし、毒素をコードするＤＮＡの配列に連結することによって作られる。

本明細書中で使用する用語’ｔｒｉｌｌ　Ｊとは、有毒レクチン、リシン、アブリン、モデクシンＣｗｗｉｅｔｃｉｎ）、ジフテリア毒素、シェードモナス外毒素または好ましくはそのトキシンＡ１１部分といった＝般に呼称される毒素、並びに放射性同位元素、ＩＩｌ！ｌｉｌ害剤ならびに制癌剤のような他の毒性剤をも含む意味に使用されている、「毒素」は、またひとつの抗体分子に結合し、それによって種々の細胞毒性を提供し得るさまざまな毒素の組合せを指すこともある。

本発明の、他の、好ましい態様では、［ｌＩＶ特異抗体は、異種凝集体（ヘテロアグリゲート）もしくは異種抗体（ヘテロ抗体）としても知られる、抗体の異種結合体（ヘテロコンジュゲート）を形成させるために、エフェクター細胞に特異的な第二の抗体に連結される。異種結合体の抗■ＩＶ抗体は、［ＩＩＶ感染棒胞つまり、死滅させるべき標的細胞に結合する一方で、異種結合体の抗エフェクター抗体は、例えば、σ細胞としても知られる）ｉｔ胞傷害性Ｔ＠胞、単核球（特にマクロファージ）、顆粒球もしくは、ナチュラルキラー作用または抗体依存性ｍ胞傷害作用を伴った細胞を含む大型顆粒リンパ球といった末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の集団内に見られるエフェクター！１１ｊ！に結合し、結果的に、異種結合体の抗体成分がエフェクターと標的ｍａとを架橋し、それによってｍ胞傷害エフェクター細胞による標的細胞の死滅を促進する。

［１１Ｖに感染した患者は、［ｖＦＪｌ！を死滅せしめるに十分な抗体毒素結合体もしくは本発明の抗体異種結合体の一定量を投与することにより治療することが可能である。ウィルスの活発な産生中、ウィルスのエンベロー１蛋白は、感染細胞の表面に発現される。ウィルスが増殖している細胞を、ウィルス特異表面抗原と反応する抗体結合体を用いて選択的に死滅せしめると、ウィルスの感染サイクルは中断されるであろう。

本発明の抗体または抗体毒素結合体もしくは抗体異種結合体のもつひとつの利点は、その抗体が特異的であるＨＩＶエンベロープ糠蛋白エピトープの、非免疫支配性である。非免疫支配性の結果、もしくは、ヒトの免疫系がエピトープに対する検出可能な応答を増大し得ないということの結果、そうしたエピトープ、つまりｕｒｖ　感染患者におけるエンベロープ蛋白の、ｇｐ１６０非免疫支配エピトープに対する＃Ｒ抗体は、もしあるとしても、掻く僅かにすぎない、従って、本発明の抗体毒素結合体もしくは抗体異種結合体を用いて、ＨＩＶ　ＦＫＩＪ、者を治療した場合、標的非免疫支配エピトープに対する循環抗体と競合することなく、ＨｔＶ　ｆｉ染ｌ１Ｉｌｉ！を選択的に標的とすることが可能になる。

本発明による特定の抗体、抗体毒素結合体ならびに抗体異種結合体が存するもうひとつの利点は、ｔＩｔＶエンベＧ−７１１蛋白の、グループに共通した決定因子を認識し得る能力である。グループに共通した決定因子と云うのは、ｇｒｖの異なった株間で、本質的に不変なエンベロープポリペプチド部分である。従って、グループに共通した決定因子を認識し得る抗体は、［ｌｔＶの、いずれの株のｇｐ１６０を認識することも可能である。そうした理由から、本発明に従って行なう［１１１／感染患者の治療は、ＨＩＶのいずれかひとつの株に限定されないばかりか、その標的決定因子が共通するすべての株を包含することになる。

本発明の、他の特色や利点は、その好ましい態様に関する下記の説明や請求の範囲から明らかになろう。

好を旦艶態損Φ脱朋最初に、図面について簡単に説明する。

図面図１．は、ｇｐＬ２０．　ｇｐ４１．　ｐ１２１　すらびニｐＥＮＶｇｓＩ域を示すｇｐ１６０蛋白の模式図である。

図２．は、ＩＣＩ抗体の、標的抗原に対する結合特異性を試験したＥＬＩＲＡ法による結果を示すグラフである。

図３（ａ）　−３（ｄ）はへ［１１ν陽性血清の存在下で、ＩＣＬ抗体もしくは対照抗体について、その結合特異性を測定したＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。

図４（ａ）　−４（ｄ＞は、ＩＣＩ抗体を用いて行なったＦＡＣ５分析の結果を示すグラフである。

次に、本発明による抗体の調製と使用方法とを説明する。

免疫源本発明による抗体の産生には、ｇ９Ｌ６０　（Ｒｅｐｌｔｇｅａ　Ｃｏｒｐ、＋　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ幻と残基４７３から残基７Ｊに及ぶエンベロープ蛋白フラグメントで、ｐＥｌｉＶ　（ｒｖａ薗ｆｆ　ｅＬａｌ、、米国特許Ｎｏ− ４，８６１，７０７＞　と命名された２種類の免疫源を使用した。

ａｐ１６Ｇは、標準技法に従って完全フロインドアジエバンド（ＣＦＡ）　（口１ｆｃｏ　Ｌａｂｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）と乳化して免疫処理のために調製した。

モノクロ−ル　の！ｋ　１　ｈ／ｃＪ系雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ、、　［Ｌａｒ　ｂｒｂｏｒ、　ＭＥ）に、−６当たりｇｐＬ６０／ＣＦ＾７０μｇの腹腔内投与による免疫化を行なった。３週間後、マウスにフロイントの不完全アジュバントによる乳化物で、ブースター免疫処理を行なったマウスを採血し、その血清について、免疫原と反応する抗体の有無を検査し九強力な直情学的反応を示したマウスには、最初のブースター免疫の５週間後、溶解状（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，ｌｉｏ、　ＣＲＩＪ２１？７．＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｊｉｏ、　Ｃ孔額圓）の骨髄腫細胞ＣＫｔｓｘ＋ｒｎｅｙ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｗｕｎｏｌ、、１９７９．１２３：１５４８）と、５：１の比率で、ｉ：ｏｈｌｅｒならびにＭｉ［５ｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）　２５６：４９５）の方法に準拠した標準的な方法により融合した。

融合の１０−２１日後に出現したハイプリドーマから得た上清を、ｐＥにｖ９の蛋白フラグメントと反応する抗体の産生についてスクリーニングにかけた。

％−ウェルのＣｏｓ　ｔａ　ｒ平底マイクロタイター板のウェルはいずれも、各ウェルでの最終濃度が２−１０μｇ／曽ｌのｐＥＮＶ９蛋白フラグメントを含むＰａＳ溶液父マイクロリフドルを加えて被覆した。　ｐＥＮｖｉ液は吸引し、ウェルは洗浄して、ＰＢＳ　＋　０．５Ｘ紹＾と入れ替えたの５２時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルは吸引、洗浄したのち、ハイブリドーマ上滑液５０μ【を加えて２時間インキュベートした。インキュベート後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄したのち、西洋ワサビペルオ牛シダーゼ（ＨＲＰ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｇ、　’４ｅｓｔ　Ｇｅｎｔａ−を結合したヤギ抗マウス免疫グロブリンの適切な希釈ｔｆ、５０ｕ＋を加えて、１時間インキュベートした。ウェルは再び、ＰＢＳで洗浄し、そして結合抗体検出のためと３０２　ＨｔＯｔの１：　ｔｏｏｏ希釈液を加えたＯ、１Ｍりｚン酸ナトリウムｐｆ１４．２中（Ｆ）Ｌ　ａ＋Ｍ　ＡＢＴＳ（２，２７ジノ、ビス（３−エチル　ベンズアゾリン６−スルホ＞ｔｏ　ｔｏｏμＩｔ西洋ワサビペルオキシダーゼの基質として加えた。　３ｏｌＩ＋後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ分光光度計の自動読みとり器（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）によりＯＤａｇｍで吸光度を測定した。

試験の結果最初の免疫抗原ｇｐ１６Ｇ−＼の結合が陽性だった４ｕのバイブリド −？（ＩＣＩ、　１１（９，２０７および２Ｄ）　ニツイて、第２の免疫抗原、ｐＥＮＶ９．と他の異なった１１株から得た。１６０への、結合能力の有無を試験した。　ＥＬｒＳ＾法により、ｐＥＮＶ９フラグメントとの反応性を示したＩＣＩと呼ばれるひとつのハイブリドーマクローンは、１株以上のＩ（ｒｖ内に存在する、つまり、下記に説明するようなグループに共通した決定因子であるエンベロー１自決定因子をも認識し得る抗体を産生じた。

上記４種類の抗体は、■ＩＶ−ｒｌ［Ｂ分離株からのｇｐ１６０あるいはＩＩＩＶ−ＲＦ分離株からのｇρ１６０の、いずれかに結合するかどうかをＥＬＩＳＡ法によって試験した。下記の表１に提示した結果は、ｐＥＮＩＩ９に特異なＩＣＩ抗体が、ＩＩＴＢならびに［ｌＦ分離株双方のｇｐ１６０とｐＥＮＶ９とに結合するが、残る３種類の抗体が、３種類の蛋白のいずれをも認識しないことを示している。

表１り０　７　Ｋｌ）１６０１＋＋＋ａ　ｇ９Ｌ６０Ｒｙ　９ＥＨＶ９　ＢＳＡ（コントロール）ＩＣ１＋す＋２０７　＋　＋２Ｈ８＋　＋　− ＩＣＩクローンのイソタイプは、主要な免疫グロブリンの各イソタイプに対応するヤギー抗マウスＨＲＰ　（Ｚｙｇｅｄ　Ｌａｂｓ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｒｓｃｏ、　ＣＡ）製品を用い、ＥＬＩＳｈ法によってｒｇＧｔａであることを確認した。　ｌ（：Ｉクローンは、サブクローニングし、上記抗原への結合能力を再度スクリーンニングした。ブリスタンによる処理を受けたＢａ１ｂ／ｃマウスに、ＩＣＩサプクａ−ンを腹腔内注射して増殖させた。腹水をマウスから採取し、抗体は下記のようにしてプロティン＾親和性クロマトグラフィーによって精製した。

モノクローナル　の　］１襄精製ＩＣＩ抗体は、ブリスタン処理した同系マウス（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ濡１ｃｅ）に、繰り返しＥＬＩＳＡ法による試験結果が陽性だったハイブリドーマのサブクローンを腹腔内注射して調製しｆ、生じた腹水は、注射の２−３週間後に回収し、抗体を下記のごとく精製したのちＰＢＳに対する透析を行なった。

ＩｇＧ２ａのＩｃＩ抗体を含む腹水は、０．１　？ｌ　Ｔｒｉｓ／３　Ｍ　ＮａＣＬ　ｐ［Ｉ８．９で５倍に希釈し、同じ緩衝液と平衡化したプロティン−＾− セファロース親和性カラムに結合させたのち、０．１５Ｍ　ＮａＣ［、０，１Ｍｌ！Ｎ！、ｐＨ３，０を用いてカラムから溶出させた。溶出後、抗体は直ちにＩ　Ｍ　ｈａＪω、を加えて中和した。

ＩＣＩ抗生の桔金特興性ＩＣＩ抗体は、それが結合するエピトープを位置づけるため、ａＩｓＡ法によりｐＥにＶ９ｇｐ１２０ならびにｐ１２１との結合の有無を試験した。　ｐ１２１　（Ｃｈａｇ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許Ｎｏ、　４，７７４，１７５）は、ｇｐ１６０のｇｐ４１部分内で、アミノ酸約５６６−６４８にまたがるおアミノ酸蛋白フラグメントであり、完全に、ρＥＮＶ９の配列内に含まれている（ｇρ１６０のこれら領域１図１に模式的に説明されている）　、　ｐ１２１は、客ｐ４Ｌ蛋の主要な免疫支配エピトープを包含している（Ｃｈａｎｇ　ｅｃ　ａｌ、＋米国特許Ｎｏ、　４，７２４，１７５ならびに−ａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａ、　Ｓｃｉ、　ａ３：６１５９）　、図２は、ＥＬＩＳＡ法による測定結果を示している。これらの結果は、ＩＣＩがｐＨ， ’ｌＶ９とｇｐ１２０とに特異的に結合するが、ρ１２１には結合しないことを示している。従って、ＩＣＩ抗体は、ｇｐｔ２ｏ内にも存在するｐＦｊｆｆ９のＮ域に結合するが、それはｐ１２１部分内に含まａ’ｎｌない、対照実験では、ｇ９４１に特異的な抗体（Ｅｐｉｔｏｐｅ、　Ｉｎｃ、、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、　０１？）が、ｐＥＮＶ９　、ｐ１２１また番よｇｐ１２０に結合するがどうかを試験したところ、予想通り、＆ｐ４１抗体はｐＥＮν９およびｐ１２］に結合したがｇｐ１２０には結合しなかった。

竺上血消のｍ−におけるＩＣＩ　−〇°今旧シエンベロープ蛋白に特異的で、治療的に有用な外因性の抗体は、競合する循環抗体の存在下で、エンベロープ蛋白を発現する）［ＩＶもしくは［ｌ［Ｖ感染細胞に結合し得る筈である。

ＩＣＩ抗体を、ＨＴＶ感染患者から得た血清の存在下で、標的抗原に結合し得るその能力を試験し、ｇｐ４１の免疫支配領域と結合することが知られている対照抗体と比較した０図３（ａ）　−３（ｄ）は、マイクロタイターのウェルを、捕捉抗原で被覆して行なったＥＩＪＳＡ法による結果を示している。その後、Ｉｃ１または対照抗体を（１）非希釈ｔｔｒｖ陰性血清、（２）非希釈ｆＨＶ陽性血清または（３）　０．５１　ＢＳＡの各５０μｍ中に加えた。２時間後、ウェルを洗浄し、ヒトＩｇと交叉反応しなかった二次抗体（ヒツジ抗マウスＩｌ′ＲＰ）を加えた。ｌｖＦ間後、二次抗体を除去し、ウェルを洗浄したのちＡＢＴＳを加え、ｘ背後に００．、、を測定した。

図３（ａ）では、ＩＣＩ抗体が、ｌｆｌ捉抗原ｐＥＮＶ９に結合するかどうかを検査している。その結果は、ｎｔｖ陽性血清もしくは）ＩＩＶ陰性血清の存在下で、ＩＣＩがほぼ等しい効率でｐＩ！１ｉＶ９に結合したことを示しているΦ０３ａ）、　ＩＣＬ抗体は、抗体濃度が０．０１Ｍｇ／ｍｌのＨＩＶ陰性血清の存在下において、最高の効率でｐＥＮＶ９に結合したが、■■Ｖ陽性血清の存在下での、この抗体のｐＥＮＶ９への結合は、抗体濃度１ｔｔｇｉ纏１および１０Ｍｇ／ｍｌの■【ν陰性血清の存在下でのｐＥＮＶ９への結合効率と比べると、それぞれほぼ８濱および９５％以上であっＬ他の４人の愚者から得たＩＴＩＶ陽性血清の存在下で、ＩｃＩの結合を試験した時にも同様な結果が得られている。これらの結果は、ＨＩＶ陽性血清中にｐＥＮＶ９特異抗体が存在しているとしても、その力価は十分に低いか結合親和性が弱く、あるいは異なったｐＥＮＶ９のエピトープと反応するため、ｐＥＷ９へのＩＣＩ抗体の結合を有意に干渉しないことを示している。従って、ＩＣＬは、一種のを用な治療剤としての可能性がある。

図３（ｂ）では、ＩｃＩ抗体のｐ１２１蛋白への結合能力を試験しているが、ＩＣＩ抗体は全＜　ｐ１２１に結合していない（０，５ｚＢＡＳ中でＯ，ｌｕｉ■ １以上のＩＣＩの濃度で観察されたｐ１２１との最ｌＪｌの反応性は、非特異的な結合によるものであろう）。

対照抗体、抗ｇｐ４１　（Ｅｐｉｔｏｐｅ、　Ｉｎｃ、）ならびに２種類の標的抗原、ｐ１２１とｐＥＮＶ９とを用いて２種類の追加対照実験を行なった０図３（ｃ）および３（ｄ）に示した結果は、抗ｇｐ４ｔが標的抗原のいずれにも結合するが、抗体濃度が０．１ｌｇ／ｍｌの場合、ｐＥＮＶ９への結合より、ｐ１２１への結合がより効率的であることを示している。この結果はまた、これらの同じ抗体濃度では、抗ｇ９４１抗体の結合力ｑＩｎ陽性血清によって部分的に阻止されている。これらの結果は、抗ｇｐ４１抗体の結合を部分的に阻止することが可能なρ１２１およびｐ［！ＩＩＶ９に特異的な抗体が、旧Ｖ陽性血清中に存在することを示している。

へのｔＣｔ　−〇　八Ｈ■ジエンベロー１蛋白を発現する細胞の表面に、ＩｃＩモノクローナル抗体が結合するかどうかを、間接免疫蛍光法とＦＡＣＳ　（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｃｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｈｏｒｔｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｒｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ、　１９８４　Ｐａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１０８：１９７）による分析と■ より下記のごとく確認した。

ＩＣＩ抗体は、その表面にｇρ１２（とｇｐ４１の両方を発現する：［Ｖ　ｅｏｖ遺伝子を含むワクチニアウィルス組換え体により感染したｃｖｌ　ＩＩ胞（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＣＣＬ７０）　（ＣＶＩ−ＥｎＶ）　、もしくは陰性対照として、ＨＩＶｅｎｖ遺伝子を含まないワクチニアウィルス組換え体によって感染したＣｖ１細１ｍ（ＣＶＩ−Ｌａｃ）のいずれにも結合した。　ＩＩＩＶエンベロープ遺伝子全長を発現することが可能な組換え体の構造に７いては、参照文献としてここに含まれるＥＰＯ２４３０２９に記載されている。　Ｖｌ　４（ａ）−４（ｄ）に結果を示す。

図４（ａ）では、ＬＣＩ抗体はＣＶＩ　、Ｅｆｉｖ細胞に結合したが、［Ｎ４（ａ）をＩＣＩ抗体とインキュベートされたＣＶＩ−Ｌａｃ細胞に対するＦＡＣＳのプロフィールを示す図４（ｂ）に重ね合わせると、ＣＶＩ−１ａｅ　ａｌ飽と比較して、ＣＶＩ−Ｅｎｖ細胞においては蛍光強度に右寄りの移動（つまり、増大）があり、このことはＩＣＩ抗体が、エンベロープ蛋白を発現しない細胞よりも、ＨＩＶエンベロープ蛋白を発現する細胞に有意に良好に結合することを意味している。このような結果は、ＩｃＩが自然状態の標的抗原に結合することを示し、かつ、ＨＩＶエンベロー１蛋白を発現する細胞が、毒素に連結したＩｃＩからなる免疫毒素結合体に対する特異標的である可能性を示唆するところから重要である０図４（ｃ）と図（ｄ）とは、それぞれＩＣＩ抗体を感染していないＣｖｌ細胞に結合させ、緩衝液のみをＩｃＩ−Ｅｎｖ細胞に結合させた対照である、　（ＣＶＩ　ＥｎｖおよびＣＶＬ４ａｄＭ胞のＦＡＣ５分析の明らかな背景の蛍光は、恐らく異種ウィルス蛋白の発現によって生じた細胞膜の変化によるものであろう）。

路種結金体■抗体桔金体調製抗体は、例えば、Ｖｉ　Ｌｅｉｃａ　ａｔ　ａｌ、、　１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１０９８に記載されているように紺胞毒性剤に結合して免疫毒素として用い、あるいは抗−１１１Ｖ薬剤もしくは毒素を含むリボゾームの表面に付加して、こうした薬剤や毒素を［ｌ［ＶＩｆｉ染細胞に対して特異的に集中させることができる０本明細書に使用した免疫毒素と云う用語は、抗体と−ＭＷもしくはそれ以上の毒素との結合体を意味している。様々な毒素を抗体分子に結合させた場合、異なった化学的機序によって、例えば、共有結合、親和性結合、挿入（インタルカレーション）、配位結合および錯体形成といった結合が利用できる。しかしながら、抗体と毒素との好ましい結合は、化学的なあるいは遺伝子融合による共有結合である。

好ましい態様では、免疫毒素は、縁■菌（Ｐｓｅｕｄ国唖ｏａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素に連結したＨｒｖエンベロープ蛋白の、非免疫支配性グループ共通エピトープに反応する抗体である。圃面の外毒素（ＰＥ）は、容易に大量ｊｊｌ製でき、ヒトがそれに対する中和抗体を通常持っていないこと、および結合に先立ってサブユニトに分層する必要がないことなどの理由で他の青票に比べて特に好ましい、ＰＥは緑厘菌によって分泌され、真核細胞内での蛋白合成を抑制する極めて活性な単量体蛋白（分子量６６にＤ）である、　ＰＥの好ましい形態は、細胞への結合領域が除去されたＰＥ４０と呼ばれる切断分子（Ｐａｓｕｏ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＰ出願公開Ｎｏ、　０２６１６７１）である。

ＰＥ４０は、例えば、ヘテロ三官能性架橋リンカ−５ｐｏｐ　＜ｓ−スクシニミジル−３，（２−ピリジルジチオール）プロピオネート）、　５１ｇｍ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ）（Ｐａｓｔａｏ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８６、　Ｃｅ１ｌ　４７：６４１）を用いたり、遺伝子融合（Ｃｈａ＋ｘｌｈａｒｙ　ｅＬ　ａｌ、、）　１９８９．　ＮａＬｕｒｅ　３３９：３９４）によって、本発明の抗体に、化学的な結合により連結することが可能である。抗体の異種結合が好ましい場合は、抗体結合に適切な任意の方法が使用でき、例えば好ましい方法には、にａｒｐｏｖｓｋｙ　ＱＣａｌ、（１９８４，Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６０：１６８６）の方法による架橋リンカ−５ｐｏｐを用いて、抗体を架橋連結する方法がある。

架橋連結に引き続いて、異種結合体はサイズ排除クロマトグラソイ−によって遊離抗体から分離される。

本発明の抗体毒素結合体または異種結合体は、該結合体をＨＩＶエンベローフ１蛋白を発現するＨＩＶに慢性感染した細胞またはＪＩＪｆｉ細胞と共にインキュベートし、該細胞を１トチミジンまたは＋４（−ロイシンで短時間標識することによって、標的特異性や死滅効率を確認し得る。毒性は、非感染対照細胞と対比した感染細胞における細胞***もしくは蛋白合成の低下によって測定できる。ＩＩ胞の死滅効率は、感染細胞を本発明の結合体と共にインキュベートし、限界希釈して平板にまき、生存細胞数を同様に処理した非患染編胞と比較するクローン性検査法（Ｃ１０ｎｏｇｅａｉｃ　ａｓｓａｙ）を用いて算出することが可能である（Ｔａｒｗｅｌｌ、　１９８１．　Ｊ、　Ｉｗｕｎｏｌ、、　１２６．１６１４）　。

用途免疫毒素として、本発明の抗体を用いる典型的な治療では、Ｈ［ｖｖＭｌｌ胞のみで発現される蛋白に結合する抗体を、ＨＩＶ感染膳胞に（および非感染細胞にも同様に）毒性である毒素（例えば、シュードモナス外毒素）に結合させる。抗体に細胞傷害側を結合することにより、非特異的毒性レベルを顕著に低めて標的細胞に対し特異的に作用する高度な毒性効果を得ることが可能である。毒性剤は、その結合する抗体が、標的（この場合は、ＨＩＶ　ｍ胞）に対して特異的に酸剤を運び、それによってＩＰＩ！ｖＪＩＰＩ−ｔ−毒素から遠避けるから、その使用が可能である、ＩＩ胞傷害剤に抗体を結合させるために使用できる技法は、上記Ｖｉｔｅｔｕ　ｅｔ　ａｌ。

および１９８８年８月２４日に頌されたヨーロバ特許出ｊｌ　Ｎｏ、　２７９，６６８に、詳細に記述されている。

本発明の抗体は、ＨＩＶに感染した個人の治療用途への使用のため、常用の製薬処方に取り入れることが可能である。更に、こうした処方は、製薬的に受け入れ得る担体−希釈側、塩およびこの科学の分野でよく知られた他の様々な物質を含むことができる０等張食塩水、減菌水、ＩＯｚマルトース、ヒト血清アルブミン、グリシンまたは他の製薬的に受け入れ得る物質が、本発明の抗体から成る製薬処方の調製上、希釈液、担体もしくは溶媒として使用できる。

薬躬組成物は、固形、半固形、液体、粉末、ビル、錠側、溶液もしくば懸濁液、坐剤、ポリマーマイクロカプセル、リポソームまたは注射もしくは注入可能な形態といった様々な剤型からなることができる。製薬処方は、静注、経口、皮下、腹腔内もしくはり゛ンパ系内を含む、常用の方法で投与されるが、それらのみに限定されない６更に、本発明の抗体、免疫毒素または異種結合体は、治療の効果を高めるために他の治療と関連して投与することもでさる。

他９態様他の態様は、丁記の請求範囲内にある０例えば、はとんどの場合、モノクローナル抗体は、ヒト以外の種から産生されているため、ヒトに対してしばしば免疫原性である。これらのモノクローナル抗体を、ヒトの治療に有効に使用するためには、リガンドとの結合に関連するポリペプチドの部分（可変Ｎ城）が、ひとつの種に由来し、構造的な安定性や他の生物学的機能の提供に関与する部分（不変領域）がヒト抗体に由来するキメラ抗体分子を創造する必要がある９本書に参照して含まれる一ｅｕｂｅｒｇｅｒ等（−〇　国際公ｆＪ　Ｎｏ、　８６／（１１５３３）ならびにＭｏｒｒｉｓｏｎ等（ＥＰ出願公開Ｎｏ、０１７３４９４）は、可変領域がひとつの宿主に由来し、不変領域が第二の宿主に由来するキメラ抗体産生の方法を開示している。

別法として、可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のみを、所望する抗原特異性の免疫グロブリンからのＣ０Ｒ５と置換することによって、抗体を産生ずる方法は、Ｗｉｎｔｅｒ　（ＧＢ　出願公開Ｎｏ、　２１８８６３８）に記載されている０例えば、グループ共通決定因子と非免疫支配領域とを認識するρＥ！ｉＶ９に特異なマウスのモノクローナル抗体のＣＤＲ５は、組み換え口Ｎ＾技法によってヒト抗体のフレームワークに移植することが可能である。こうした調製は、モノクローナル抗体を治療に応用する場合、特に有利である。

寄託細胞系ＩＣ１，ＩＨ５は、１９９０年１月ＩＯ日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託ざ顛寄託番号ＨＢ　１０３２１が付与された。出願者の譲受人であるＲｅｐｌ　ｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，が寄託の永続性を提供する保管者であり、特許が認可された場合、公衆による人手が可能である旨を保証する。かくのごとく寄託された物質の、公衆による人手上の制約はいずれも、特許が認可された時点で除去さ娠その撤回は不可能となるものとする。当該物質の人手は、３７　Ｃ，Ｆ。

Ｒ，１，１５および３５ｔ１．Ｓ、Ｃ，１２２のもとに米国特許庁長官がその資格を有すると認定した個人に対して、本特許出願の係属中可能となる。寄託された物質は、その寄託微生物のサンプル提供に関する鰻も最近の要請後、少な（とも５年間は、その生存を可能にし、かつ汚染させないため入念に必要なあらゆる処置を講じて保管し、またいかなる場合においても、寄託日後少なくとも３０年間、あるいは特許権の有効期間のいずれか長い期間は保管されるものとする。出願人の譲受人は、万一、寄託物質の状態により、要請があった時点で寄託機関がサンプルを提供し得ない場合、寄託物質を！き換える義務を認めるものである。

＾、τ、Ｃ，Ｃ，のブタベスト条約による寄託証明書の写しは、要請ある場合提出されるものとする。

要約９グループに共通する決定因子ならびにＨ■ｖエンベロープ蛋白の非免疫支配エピトープを認識し得る抗体あって、エンベロープ蛋白への抗体の結合が、ａｒｖ　ｉｓ染患者の血清によって阻止されない抗体。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＩＶエンベロープ蛋白の非免疫支配エピトープを認識することができ、且つ前記エンベロープ蛋白への結合がＨＩＶ感染患者からの血清によって阻止されない抗体。
２．前記エピトープがグループに共通なものである請求項１の抗体。
３．ＨＩＶエンベロープ糖蛋白発現細胞の表面に結合することが可能な請求項２の抗体。
４．ＨＩＶエンベロープ蛋白の４７３から７５９のアミノ酸残基間（両端を含む）の領域を認識する請求項３の抗体。
５．前記領域内のｇｐ１２０の部分を認識する請求項４の抗体。
６．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ１０３２１の細胞系によって産生される請求項５の抗体。
７．更に毒素を結合して含むことにより、ヒトＨＩＶ陽性血清の存在下でもＨＩＶ感染細胞を死滅させ得る結合体を形成した請求項１−６のいずれか１項の抗体。
８．前記結合体が、ＨＩＶ感染細胞の内部に移行することができる請求項７の抗体毒素結合体。
９．更に、異種結合体を形成するため前記抗体に共有結合した第二の抗体を含む請求項１−６のいずれか１項の抗体。
１０．ＨＩＶ感染細胞を死滅せしめるに十分な重で、請求項６の抗体毒素結合体もしくは請求項８の抗体異種結合体を投与することからなる、ＨＩＶ感染患者の治療方法。