JP7008023B2

JP7008023B2 - 低減されたポリソルベート分解を有する製剤

Info

Publication number: JP7008023B2
Application number: JP2018534668A
Authority: JP
Inventors: ブライアンコノリー，; リディアハンバーグ，; エミリーホルツ，
Original assignee: ジェネンテック，インコーポレイテッド
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: IL299759A; BR112018010945A2; SG11201804961UA; JP2019504056A; US20220040312A1; US20170189536A1; WO2017117311A1; AU2016380988A1; US20200215195A1; US10933141B2; US10525137B2; CN115400220A; EP3397287A1; CA3007419A1; KR20180098625A; CN108472379B; AU2022256163A1; IL259646A; IL259646B2; AU2016380988B2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月３０日出願の米国仮出願第６２／２７２，９６５号の利益を主張するものであり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、シクロデキストリン及びポリソルベートを含む水性薬学的製剤、ならびにポリソルベート分解を低減し、ポリソルベート分解産物を脱凝集し、可溶化するための方法に関する。

薬学的製剤は一般的に、ポリソルベート２０及び８０（ＰＳ２０及びＰＳ８０）、つまり、親水性ポリオキシエチレン頭部基及び疎水性脂肪酸尾部からなる非イオン性界面活性剤を含有する。界面活性剤の製剤への添加により、誘導表面変性及び凝集からタンパク質を保護する（Ｇｅｉｓｅｎ，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ２７：２１２－２１８（１９８４）；Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２８９：１－３０（２００５））。タンパク質の凝集は、原薬（ＤＳ）及び薬品（ＤＰ）の加工中、長期間の保管中、輸送中、及び投与中に起こり得る（Ｃｒｏｍｗｅｌｌｅｔａｌ．，ＡＡＰＳＪ．８：Ｅ５７２－Ｅ５７９（２００６））。界面活性剤（例えば、ＰＳ２０）の添加により、濾過中（Ｍａａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：８０８－８１２（１９９８）、Ｍａａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：３１９－３２８（１９９６））、攪拌中（Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０２：２４６０－２４７０（２０１３））、冷凍－解凍中（Ｋｒｅｉｌｇａａｒｄｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１５９７－１６０３（１９９８）、Ｈｉｌｌｇｒｅｎｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２３７：５７－６９（２００２））、凍結乾燥中（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．１３：５４－５４（２００４）、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：９６９－９７５（１９９７））、再構成中（Ｗｅｂｂｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９１：５４３－５５８（２００２））、投与中（Ｋｕｍｒｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０１：３６３６－３６５０（２０１２））、及び保管中にタンパク質に負荷をかけ得る界面相互作用が最小限に抑えられ得ることが示されている。

加工中、長期間の保管中、及び投与中に活性薬学的有効成分（ＡＰＩ）を確実に安定させるためには、ポリソルベート分解を防止することが重要である。しかしながら、ＰＳ２０は、加水分解性及び酸化経路を介して分解の影響を受けやすい（Ｋｕｍｒｕ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０１：３６３６－３６５０（２０１２）、Ｍａｈｌｅｒｅｔａｌ．，ＡｂｓｔｒＰａｐＡｍＣｈｅｍＳ．２３９：（２０１０））。

ポリソルベートの酸化分解は、十分に特性化されており、かつ広く研究されている（Ｋｅｒｗｉｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９７：２９２４－２９３５（２００８）、Ｋｉｓｈｏｒｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１００：７２１－７３１（２０１１））。酸化は典型的には、（１）エチレンオキシド基の自動酸化、及び（２）不飽和の部位におけるラジカル酸化という２つの機構の状況下で起こる（Ｋｉｓｈｏｒｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１００：７２１－７３１（２０１１））。ポリソルベートの酸化分解が観察されているが、ＰＳ２０酸化は、抗酸化剤（例えば、メチオニン）と共製剤化することによりタンパク質製剤中で軽減され得ることが示されている。アミノ酸残基の酸化を防止するために、トリプトファンを含有する製剤も開発されている（ＵＳ２０１４／０３２２２０３、ＵＳ２０１４／０３１４）酸化及びポリソルベートの加水分解性分解経路は、特有の分解産物プロファイルにより区別可能である。ポリソルベートの加水分解性分解は、主に脂肪酸を産生し、ポリソルベートの酸化分解は、ペルオキシド、アルデヒド、酸、キートン（ｋｅｙｔｏｎｅ）、ｎ－アルカン、脂肪酸エステル、及び他の分解産物を含むより多様な分解産物を産生する（Ｒａｖｕｒｉｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８：１１９４－１２１０（２０１１））。

ＰＳ２０を分解する２，２’－アゾビスイソブチラミジニウム（ＡＡＰＨ）を使用するポリソルベートの酸化分解のための応力モデルが、既に記載されている（Ｂｏｒｉｓｏｖｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０４：１００５－１０１８（２０１５））。類似の手法を使用して、関連する条件下でポリソルベートの酸化分解を低減する製剤を開発するために代表的な応力モデルが使用され得る。

精製されたエステラーゼ（例えば、ブタ肝臓エステラーゼなど）及びリパーゼ（例えば、ツイーナーゼなど）を使用する加水分解のための応力モデルが、既に記載されている（Ｌａｂｒｅｎｚ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．．Ｓｃｉ．１０３Ｌ２２６８－２２７７（２０１４））。類似の手法を使用して、代表的な応力モデルが、関連する条件下でポリソルベートの触媒性分解を低減する製剤を開発するために使用され得る。

近年、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）製剤中のポリソルベートの酵素分解が報告されている。例えば、Ｌａｂｒｅｎｚは、ＣＨＯ由来ｍＡｂ製剤中で観察されたポリソルベート８０（ＰＳ８０）分解を、ＰＳ２０分解プロファイルに基づいて、一般的な生物製剤加水分解機構よりむしろ特定の酵素機構に起因するとした（Ｌａｂｒｅｎｚｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０３：２２６８－２２７７（２０１４））。ＣＨＯ細胞ゲノムの配列決定により、ポリソルベートを分解することができる様々な宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えば、リパーゼ）が特定されている（Ｓ．Ｈａｍｍｏｎｄｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９：１３５３－１３５６（２０１２））。その後、Ｌｅｅらが、特定のＨＣＰの発現を低減することにより、対照の試料に対して、ＰＳ８０の加水分解が実質的に低減したことを示した。これら最近の発見は、生物製剤製造に伴うリパーゼが、上流工程において発現されることを確立する。下流精製工程（例えば、タンパク質Ａ）は、ＨＣＰを除去することができるが、いくつかのＨＣＰは、類似の特性を有し、故に、原薬及び薬品中に微量に保持されるＡＰＩ分子と共精製され得ることが示されている（Ｋ．Ｌｅｅ，ｅｔａｌ．，ＡＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙＣｅｌｌＨｏｓｔＣｅｌｌＰｒｏｔｅｉｎＴｈａｔＩｍｐａｃｔｓＰＳ－８０Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＡｃｃＢｉｏＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（２０１５）。恐らく、高活性を有するリパーゼは、検出不能なレベルでも著しいポリソルベート分解をもたらし得る。低減されたリパーゼ発現を有する細胞を操作すること、及び下流工程ステップ（例えば、クロマトグラフィー）を通して、タンパク質薬物からリパーゼを特定し、除去するための多くの努力が行われている。しかしながら、ＰＳ２０及びＰＳ８０の酵素分解は、生物学的製剤開発において著しい課題を残し、ＰＳ２０の加水分解性分解または触媒性分解を低減するための最適な製剤を特定するための著しい努力は報告されていない。

ポリソルベート分解は、タンパク質薬物製剤の安定性及び貯蔵寿命に影響を与え得る多くの結果を有する。ポリソルベート分解物は、溶液中に可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子の形成をもたらし得る乏しい可溶性脂肪酸を含む。ＰＳ２０の損失により、タンパク質製剤に対するＰＳ２０の保護効果も低減し得る。加えて、添加研究は、ＰＳ２０関連分解物のうちのいくつかが、タンパク質薬物の安定性に影響を与え得ることを裏付けたが、薬学関連条件下では影響を与えないことが観察された（Ｋｉｓｈｏｒｅｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８：１１９４－１２１０（２０１１）。

ポリソルベート分解を低減する方法が必要とされており、この方法により、製剤（例えば、ポリペプチド）上のポリソルベートの保護効果は時間が経過しても維持される。これにより、加工中、長期間の保管中、及び投与中においてより安定したポリペプチド製剤がもたらされ、ついては、ポリペプチド製剤の貯蔵寿命を延ばし、分解及び期限切れ製剤による無駄が低減されることになる。

特許出願及び公報を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれている。

本発明は、ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法を提供し、本方法は、シクロデキストリンを製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの態様において、本発明は、ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法を提供し、本方法は、シクロデキストリンを製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超であり、製剤は、約０．００５％～０．４％のポリソルベートを含む。いくつかの態様において、本発明は、ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法を提供し、本方法は、約０．０１％～３０％の濃度までシクロデキストリンを製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超であり、製剤は、約０．００５％～０．４％のポリソルベートを含む。いくつかの態様において、本発明は、ポリソルベートを含む水性製剤中の顕微鏡で見える粒子及び可視の粒子の量を低減する方法を提供し、シクロデキストリンを製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超であり、製剤は、ポリソルベート及びポリペプチドを含む。いくつかの態様において、本発明は、シクロデキストリンを製剤に添加することを含む、水性製剤中のポリソルベート分解産物を脱凝集し、可溶化する方法を提供し、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超であり、製剤は、ポリソルベート及びポリペプチドを含む。

上記の態様のいくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、ＨＰ－βシクロデキストリン、ＨＰ－γシクロデキストリン、またはスルホブチルエーテルβ－シクロデキストリンである。いくつかの実施形態において、製剤中のポリソルベートの濃度は、約０．０１％～０．４％の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤中のポリソルベートの濃度は、約０．０１％～０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤中のポリソルベートの濃度は、約０．０２％である。いくつかの実施形態において、製剤中のシクロデキストリンの濃度は、約０．５～３０％の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤中のシクロデキストリンの濃度は、約１５％である。

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、ポリソルベート分解は、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％低減される。いくつかの実施形態において、１ｍＬ当たり約１，０００、約７５０、約５００、約２５０、約１５０、約１００、約５０、または約２５個未満の、直径約２ミクロン超のポリソルベート粒子が形成される。

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、製剤は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態において、製剤中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬである。

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、製剤は、約２℃～約８℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、または少なくとも約２４ヶ月間安定している。いくつかの実施形態において、製剤は、約１℃～約１０℃で少なくとも約４８ヶ月間安定している。いくつかの実施形態において、製剤は、約２℃～約８℃で少なくとも約４８ヶ月間安定している。

いくつかの実施形態において、製剤は、約４．５～約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、約４．５～約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、約６．０のｐＨを有する。

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙａｇｅｎｔ）からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態において、製剤は、対象への静脈内、皮下、筋肉内、または硝子体内投与に好適な薬学的製剤である。

いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドと、ポリソルベートと、シクロデキストリンと、を含む水性製剤を提供し、製剤は、約１℃～約１０℃で少なくとも約６ヶ月間保管されており、製剤中の初期のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、少なくとも約３７．５：１であり、製剤中のポリソルベートの量は、製剤中のポリソルベートの初期量の少なくとも約８０％である。いくつかの態様において、本発明は、ポリペプチドと、ポリソルベートと、シクロデキストリンと、を含む水性製剤を提供し、製剤は、約１℃～約１０℃で少なくとも約６ヶ月間保管されており、製剤中のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、少なくとも約３７．５：１であり、約１％未満のポリソルベートが分解されている。

上記の態様のいくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、ＨＰ－βシクロデキストリン、ＨＰ－γシクロデキストリン、またはスルホブチルエーテルβ－シクロデキストリンである。いくつかの実施形態において、製剤中のポリソルベートの濃度は、約０．０１％～０．４％の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤中のポリソルベートの濃度は、約０．０１％～０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤中のポリソルベートの濃度は、約０．０２％である。いくつかの実施形態において、製剤中のシクロデキストリンの濃度は、約０．５～３０％の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤中のシクロデキストリンの濃度は、約１５％である。

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、製剤は、約２℃～約８℃で少なくとも約６ヶ月間安定している。いくつかの実施形態において、製剤は、約１℃～約１０℃で少なくとも約４８ヶ月間安定している。いくつかの実施形態において、製剤は、約２℃～約８℃で少なくとも約４８ヶ月間安定している。

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、製剤は、ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。製剤中のポリペプチド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬである。

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、製剤は、約４．５～約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、約４．５～約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、約６．０のｐＨを有する。

上記の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、製剤は、対象への投与に好適な薬学的製剤である。いくつかの実施形態において、製剤は、対象への静脈内、皮下、筋肉内、または硝子体内投与に好適な薬学的製剤である。

４０℃で２４時間、賦形剤不含（対照）、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有する５ｍＭのＡＡＰＨで酸化された試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤの両方を有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中でＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｔｉｃａリパーゼＢ（黒色）、リポタンパク質リパーゼ（灰色）、及びウサギ肝臓エステラーゼ（白色）酵素を使用して消化された試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中でＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（黒色）、リポタンパク質リパーゼ（灰色）、及びウサギ肝臓エステラーゼ（白色）酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された、≧２μＭ（図３Ａ）、≧５μＭ（図３Ｂ）、≧１０μＭ（図３Ｃ）、及び≧２５μＭ（図３Ｄ）の１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中でＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（黒色）、リポタンパク質リパーゼ（灰色）、及びウサギ肝臓エステラーゼ（白色）酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された、≧２μＭ（図３Ａ）、≧５μＭ（図３Ｂ）、≧１０μＭ（図３Ｃ）、及び≧２５μＭ（図３Ｄ）の１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中でＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（黒色）、リポタンパク質リパーゼ（灰色）、及びウサギ肝臓エステラーゼ（白色）酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された、≧２μＭ（図３Ａ）、≧５μＭ（図３Ｂ）、≧１０μＭ（図３Ｃ）、及び≧２５μＭ（図３Ｄ）の１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中でＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（黒色）、リポタンパク質リパーゼ（灰色）、及びウサギ肝臓エステラーゼ（白色）酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された、≧２μＭ（図３Ａ）、≧５μＭ（図３Ｂ）、≧１０μＭ（図３Ｃ）、及び≧２５μＭ（図３Ｄ）の１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。室温で５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを使用して消化された、０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０を含有するタンパク質不含試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ８０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０、ならびに０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを使用して消化された試料に関して、（図５Ａ）≧１．４μＭ、（図５Ｂ）≧２μＭ、（図５Ｃ）≧５μＭ、（図５Ｄ）≧１０μＭ、（図５Ｅ）≧１５μＭ、及び（図５Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０、ならびに０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを使用して消化された試料に関して、（図５Ａ）≧１．４μＭ、（図５Ｂ）≧２μＭ、（図５Ｃ）≧５μＭ、（図５Ｄ）≧１０μＭ、（図５Ｅ）≧１５μＭ、及び（図５Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０、ならびに０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを使用して消化された試料に関して、（図５Ａ）≧１．４μＭ、（図５Ｂ）≧２μＭ、（図５Ｃ）≧５μＭ、（図５Ｄ）≧１０μＭ、（図５Ｅ）≧１５μＭ、及び（図５Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０、ならびに０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを使用して消化された試料に関して、（図５Ａ）≧１．４μＭ、（図５Ｂ）≧２μＭ、（図５Ｃ）≧５μＭ、（図５Ｄ）≧１０μＭ、（図５Ｅ）≧１５μＭ、及び（図５Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０、ならびに０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを使用して消化された試料に関して、（図５Ａ）≧１．４μＭ、（図５Ｂ）≧２μＭ、（図５Ｃ）≧５μＭ、（図５Ｄ）≧１０μＭ、（図５Ｅ）≧１５μＭ、及び（図５Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０、ならびに０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを使用して消化された試料に関して、（図５Ａ）≧１．４μＭ、（図５Ｂ）≧２μＭ、（図５Ｃ）≧５μＭ、（図５Ｄ）≧１０μＭ、（図５Ｅ）≧１５μＭ、及び（図５Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。時間の関数として、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース（円）、ＨＰ－α－ＣＤ（ひし形）、及びＨＰ－β－ＣＤ（三角）を含有するタンパク質不含試料中で、室温で１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を用いて消化された試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。賦形剤不含（対照）、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、１％（ｗ／ｖ）のメチオニン、１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ１５００、１５％（ｗ／ｖ）のＰＶＰ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－α－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＳＢＥ－β－ＣＤ、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－γ－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。賦形剤不含（対照）、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、１％（ｗ／ｖ）のメチオニン、１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ１５００、１５％（ｗ／ｖ）のＰＶＰ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－α－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＳＢＥ－β－ＣＤ、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－γ－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された、≧２μＭ（図８Ａ）、≧５μＭ（図８Ｂ）、≧１０μＭ（図８Ｃ）、及び≧２５μＭ（図８Ｄ）の１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。賦形剤不含（対照）、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、１％（ｗ／ｖ）のメチオニン、１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ１５００、１５％（ｗ／ｖ）のＰＶＰ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－α－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＳＢＥ－β－ＣＤ、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－γ－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された、≧２μＭ（図８Ａ）、≧５μＭ（図８Ｂ）、≧１０μＭ（図８Ｃ）、及び≧２５μＭ（図８Ｄ）の１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。賦形剤不含（対照）、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、１％（ｗ／ｖ）のメチオニン、１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ１５００、１５％（ｗ／ｖ）のＰＶＰ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－α－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＳＢＥ－β－ＣＤ、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－γ－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された、≧２μＭ（図８Ａ）、≧５μＭ（図８Ｂ）、≧１０μＭ（図８Ｃ）、及び≧２５μＭ（図８Ｄ）の１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。賦形剤不含（対照）、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、１％（ｗ／ｖ）のメチオニン、１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ１５００、１５％（ｗ／ｖ）のＰＶＰ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－α－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＳＢＥ－β－ＣＤ、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－γ－ＣＤを有する０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された、≧２μＭ（図８Ａ）、≧５μＭ（図８Ｂ）、≧１０μＭ（図８Ｃ）、及び≧２５μＭ（図８Ｄ）の１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。賦形剤不含（対照）、１５％（ｗ／ｖ）のＳＢＥ－β－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－α－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤ、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－γ－ＣＤ、及び１５％（ｗ／ｖ）のスクロースを有する０．０２（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中で、ＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢを使用して消化された試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。ＰＳ－２０の酵素分解の結果として産生された既存の粒子の再可溶化を評価するために、様々な賦形剤（ＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、ＨＰ－γ－ＣＤ、ＳＢＥ－β－ＣＤ、ＰＶＰ、ＰＥＧ１５００、スクロース、及びメチオニン）を添加した後、試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された（図１０Ａ）≧２μＭ、及び（図１０Ｂ）≧５μＭの１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。ＰＳ－２０の酵素分解の結果として産生された既存の粒子の再可溶化を評価するために、様々な賦形剤（ＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、ＨＰ－γ－ＣＤ、ＳＢＥ－β－ＣＤ、ＰＶＰ、ＰＥＧ１５００、スクロース、及びメチオニン）を添加した後、試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された（図１０Ａ）≧２μＭ、及び（図１０Ｂ）≧５μＭの１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して室温で４．５時間酵素消化することにより生成されたＰＳ２０関連粒子を含む、１５．０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤの添加前（図１１Ａ）、添加後（図１１Ｂ）のバイアルを表示する。１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤの添加後、可視の粒子は存在しない。１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して室温で４．５時間酵素消化することにより生成されたＰＳ２０関連粒子を含む、１５．０％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤの添加前（図１１Ａ）、添加後（図１１Ｂ）のバイアルを表示する。１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤの添加後、可視の粒子は存在しない。５℃で２７ヶ月間保管された０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中の、ＨＩＡＣにより決定された、（図１２Ａ）≧１．４μＭ、（図１２Ｂ）≧２μＭ、（図１２Ｃ）≧５μＭ、（図１２Ｄ）≧１０μＭ、（図１２Ｅ）≧１５μＭ、及び（図１２Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。５℃で２７ヶ月間保管された０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中の、ＨＩＡＣにより決定された、（図１２Ａ）≧１．４μＭ、（図１２Ｂ）≧２μＭ、（図１２Ｃ）≧５μＭ、（図１２Ｄ）≧１０μＭ、（図１２Ｅ）≧１５μＭ、及び（図１２Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。５℃で２７ヶ月間保管された０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中の、ＨＩＡＣにより決定された、（図１２Ａ）≧１．４μＭ、（図１２Ｂ）≧２μＭ、（図１２Ｃ）≧５μＭ、（図１２Ｄ）≧１０μＭ、（図１２Ｅ）≧１５μＭ、及び（図１２Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。５℃で２７ヶ月間保管された０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中の、ＨＩＡＣにより決定された、（図１２Ａ）≧１．４μＭ、（図１２Ｂ）≧２μＭ、（図１２Ｃ）≧５μＭ、（図１２Ｄ）≧１０μＭ、（図１２Ｅ）≧１５μＭ、及び（図１２Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。５℃で２７ヶ月間保管された０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中の、ＨＩＡＣにより決定された、（図１２Ａ）≧１．４μＭ、（図１２Ｂ）≧２μＭ、（図１２Ｃ）≧５μＭ、（図１２Ｄ）≧１０μＭ、（図１２Ｅ）≧１５μＭ、及び（図１２Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。５℃で２７ヶ月間保管された０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中の、ＨＩＡＣにより決定された、（図１２Ａ）≧１．４μＭ、（図１２Ｂ）≧２μＭ、（図１２Ｃ）≧５μＭ、（図１２Ｄ）≧１０μＭ、（図１２Ｅ）≧１５μＭ、及び（図１２Ｆ）≧２５μＭの１ミリリットル当たりの顕微鏡で見える粒子数の平均（ｎ＝３）を表示する。０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０及び異なる量のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。Ｓ字モデルを使用してデータを適合する。０％、つまり賦形剤不含（対照）、０、０．５、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された（図１４Ａ）０．００５％、（図１４Ｂ）０．０２％、（図１４Ｃ）０．１％、及び（図１４Ｄ）０．４％のＰＳ２０を含有する試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。０％、つまり賦形剤不含（対照）、０、０．５、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された（図１４Ａ）０．００５％、（図１４Ｂ）０．０２％、（図１４Ｃ）０．１％、及び（図１４Ｄ）０．４％のＰＳ２０を含有する試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。０％、つまり賦形剤不含（対照）、０、０．５、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された（図１４Ａ）０．００５％、（図１４Ｂ）０．０２％、（図１４Ｃ）０．１％、及び（図１４Ｄ）０．４％のＰＳ２０を含有する試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。０％、つまり賦形剤不含（対照）、０、０．５、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された（図１４Ａ）０．００５％、（図１４Ｂ）０．０２％、（図１４Ｃ）０．１％、及び（図１４Ｄ）０．４％のＰＳ２０を含有する試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。０．０２％のＰＳ２０、ならびに０、０．１、０．５、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された（図１５Ａ）≧２μＭ、（図１５Ｂ）≧５μＭ、（図１５Ｃ）≧１０μＭの１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示するパネル棒グラフを表示する。０．０２％のＰＳ２０、ならびに０、０．１、０．５、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された（図１５Ａ）≧２μＭ、（図１５Ｂ）≧５μＭ、（図１５Ｃ）≧１０μＭの１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示するパネル棒グラフを表示する。０．０２％のＰＳ２０、ならびに０、０．１、０．５、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＨＩＡＣにより決定された（図１５Ａ）≧２μＭ、（図１５Ｂ）≧５μＭ、（図１５Ｃ）≧１０μＭの１ミリリットル当たりの粒子数の平均（ｎ＝３）を表示するパネル棒グラフを表示する。異なるＨＰ－β－ＣＤ対ＰＳ２０のモル比を含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化された試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の平均（ｎ＝３）相対パーセントを表示する。Ｓ字モデルを使用してデータを適合する。０、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有する、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して、室温で４．５時間消化された（図１７Ａ）対照、（図１７Ｂ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、（図１７Ｃ）二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）、及び（図１７Ｄ）単一Ｆａｂ抗体（ｓＦＡｂ）試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の相対パーセントを表示する。０、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有する、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して、室温で４．５時間消化された（図１７Ａ）対照、（図１７Ｂ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、（図１７Ｃ）二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）、及び（図１７Ｄ）単一Ｆａｂ抗体（ｓＦＡｂ）試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の相対パーセントを表示する。０、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有する、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して、室温で４．５時間消化された（図１７Ａ）対照、（図１７Ｂ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、（図１７Ｃ）二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）、及び（図１７Ｄ）単一Ｆａｂ抗体（ｓＦＡｂ）試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の相対パーセントを表示する。０、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有する、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して、室温で４．５時間消化された（図１７Ａ）対照、（図１７Ｂ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、（図１７Ｃ）二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）、及び（図１７Ｄ）単一Ｆａｂ抗体（ｓＦＡｂ）試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤにより決定されたＰＳ２０の相対パーセントを表示する。

本明細書の発明は、シクロデキストリンを製剤に添加することにより、ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法に関し、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。本発明は、水溶液中の顕微鏡で見える粒子及び可視の粒子の量を低減する方法、ならびにシクロデキストリンを溶液に添加することを含む、ポリソルベートを含むポリソルベート分解産物を脱凝集し、可溶化する方法も提供し、シクロデキストリン対ポリソルベートの比は、約３７．５：１超である。本発明は、ポリソルベートと、シクロデキストリンと、を含む安定した水性製剤をさらに提供し、製剤中のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、少なくとも約３７．５：１である。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリペプチドをさらに含む。

Ｉ．定義．
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象に対して許容できない程度に毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。かかる製剤は、滅菌である。

「滅菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生存微生物及びそれらの胞子を含まないか、またはそれらを本質的に含まない。

「安定した」製剤とは、内部のタンパク質が保管時にその物理的安定性、及び／または化学的安定性、及び／または生物学的活性を本質的に保持する製剤である。好ましくは、製剤は、保管時に、その物理的及び化学的安定性、ならびにその生物学的活性を本質的に保持する。安定製剤は、保管時にそのレベルのポリソルベートも保持し得る。保管期間は一般に、製剤の意図される貯蔵寿命に基づいて選択される。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技法が当該技術分野で利用可能であり、例えば、ＰｅｐｔｉｄｅａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，ＶｉｎｃｅｎｔＬｅｅＥｄ．ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）で概説されている。安定性は、選択された露光量及び／または温度で選択された期間にわたって測定され得る。安定性は、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、濁度を測定することにより、及び／または目視検査により）；ＲＯＳ形成の評価（例えば、光ストレスアッセイまたは２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）ストレスアッセイを使用することにより）；タンパク質の特定のアミノ酸残基の酸化（例えば、モノクローナル抗体のＴｒｐ残基及び／またはＭｅｔ残基）；カチオン交換クロマトグラフィー、画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動を使用した電荷不均一性の評定；アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析；質量分光分析；還元された無傷な抗体を比較するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ－Ｃ）分析；タンパク質の生物学的活性または標的結合機能（例えば、抗体の抗原結合機能）の評価などを含む様々な異なる方法で質的及び／または量的に評価され得る。不安定性は、凝集、脱アミド（例えば、Ａｓｎ脱アミド）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化及び／またはＴｒｐ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えば、ヒンジ領域断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン（複数可）、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化差異などのうちのいずれか１つ以上を伴い得る。

タンパク質は、それが、色及び／または透明度の目視検査時に、またはＵＶ光散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定されたときに、凝集、沈殿、及び／または変性の兆候をほとんどまたは全く示さない場合、薬学的製剤中で「その物理的安定性を保持する」。

タンパク質は、所与の時点での化学的安定性が、タンパク質が以下に定義されるその生物学的活性を依然として保持しているとみなされるようなものである場合、薬学的製剤中で「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、タンパク質の化学的に改変された形態を検出及び定量化することにより評定され得る。化学的改変は、例えば、トリプシンペプチドマッピング、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して評価され得るタンパク質酸化を伴い得る。他のタイプの化学的改変には、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはｉｃＩＥＦにより評価され得るタンパク質の電荷改変が含まれる。

タンパク質は、所与の時点でのタンパク質の生物学的活性が、例えば、モノクローナル抗体の抗原結合アッセイで決定される、薬学的製剤が調製された時点で呈される生物学的活性の約１０％以内（アッセイのエラー内）である場合、薬学的製剤中で「その生物学的活性を保持する」。

本明細書で使用される場合、タンパク質の「生物学的活性」とは、標的に結合するタンパク質の能力、例えば、抗原に結合するモノクローナル抗体の能力を指す。これは、インビトロまたはインビボで測定され得る生物学的応答をさらに含み得る。かかる活性は、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性であり得る。

「酸化感受性の」タンパク質は、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びチロシン（Ｔｙｒ）などであるが、これらに限定されない、酸化しやすいことが見出されている１つ以上の残基（複数可）を含むタンパク質である。例えば、モノクローナル抗体のＦａｂ部分内のトリプトファンアミノ酸またはモノクローナル抗体のＦｃ部分内のメチオニンアミノ酸が酸化感受性であり得る。

「等張」とは、目的とする製剤がヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有することを意味する。等張製剤は一般に、約２５０～３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧または氷凍結型浸透圧計を使用して測定され得る。

本明細書で使用される場合、「緩衝液」とは、その酸－塩基コンジュゲート成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝溶液を指す。本発明の緩衝液は好ましくは、約４．５～約８．０の範囲のｐＨを有する。例えば、酢酸ヒスチジンは、ｐＨをこの範囲内で制御する緩衝液の例である。

「保存料」とは、例えば、内部の細菌作用を本質的に低減させ、故に多目的製剤の産生を容易にするために製剤に任意に含まれ得る化合物である。可能性のある保存料の例には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。他の種類の保存料には、芳香族アルコール、例えば、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールが含まれる。一実施形態において、本明細書における保存料は、ベンジルアルコールである。

本明細書で使用される場合、「界面活性剤」とは、表面活性剤、好ましくは、非イオン性界面活性剤を指す。明細書における界面活性剤の例には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウレル（ｌａｕｒｅｌ）硫酸ナトリウム；オクチルグルコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピル（ｌａｕｒｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピル（ｐａｌｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル（ｌａｕｒｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；メチルココイルタウリン酸ナトリウムまたはメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（ＭｏｎａＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレン及びプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ，ＰＦ６８など）などが含まれる。

「薬学的に許容される」賦形剤または担体は、本明細書で使用される場合、薬学的に許容される担体、安定剤、緩衝液、酸、塩基、糖、保存料、界面活性剤、張性剤などを含み、これらは全て当該技術分野で周知されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄＥｄ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，２０１２）。薬学的に許容される賦形剤の例には、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート、アセテート、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、Ｌ－トリプトファン、及びメチオニン；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；金属錯体、例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が含まれる。「薬学的に許容される」賦形剤または担体は、対象に適度に投与されて、用いられる活性成分の有効用量を提供することができ、かつそれに曝露される対象に用いられる投薬量及び濃度で非毒性のものである。

「ポリソルベート」（ＰＳとも略される）という用語は、本明細書で使用される場合、脂肪酸でエステル化されたペグ化ソルビタンを指し、それには、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、ポリソルベート６０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート）、及びポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）が含まれる。

「シクロデキストリン」という用語は、環状構造内で、アルファ－（ｌ，４）グリコシド結合と連結されるｄ－グルコピラノース単位と結合されるグルコース分子を含む化合物のファミリーを指す。例示的なシクロデキストリンには、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤまたはＨＰ－ベータ－シクロデキストリン）、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン（ＨＰ－α－ＣＤまたはＨＰ－アルファ－シクロデキストリン）、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン（ＨＰ－γ－ＣＤまたはＨＰ－ガンマ－シクロデキストリン）、β－シクロデキストリン（β－ＣＤまたはベータ－シクロデキストリン）、スルホブチルエーテルβ－シクロデキストリン（ＳＢＥ－β－ＣＤまたはＳＢＥ－ベータ－シクロデキストリン）、α－シクロデキストリン（α－ＣＤまたはアルファ－シクロデキストリン）、及びγ－シクロデキストリン（γ－ＣＤまたはガンマ－シクロデキストリン）が含まれる。シクロデキストリンの同義語には、Ｃａｖｉｔｒｏｎ、環状オリゴ糖、シクロアミュロ―ス（ｃｙｃｌｏａｍｕｌｏｓｅ）、及びシクログルカンが含まれる。

「張性剤」という用語は、溶液の相対濃度を調整するか、または維持するために使用される作用物質を指す。好ましい張性剤には、多価糖アルコール、好ましくは、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが含まれる。

「安定剤」という用語は、タンパク質及び抗体などの粗大荷電生体分子を安定させる作用物質を指す。張性剤は、粗大荷電生体分子とともに使用されるとき、安定剤としての役割も果たし得る。

「低減されたポリソルベート分解」は、一定期間の経過後、類似の保管条件下の対照と比較するとより多くのポリソルベートが試料中に残る状態を指す。例えば、一定期間の経過後に９５％の残存ポリソルベートを有する試料は、同じ期間の経過後、５０％の残存ポリソルベートを有する対照試料と比較すると低減されたポリソルベート分解を示す。

「脱凝集」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリソルベート分解により引き起こされる可視の粒子及び／または顕微鏡で見える粒子の低減を指す。例えば、作用物質をポリソルベートを含有する溶液に添加すると、可視の粒子及び／または顕微鏡で見える粒子の量が低減される場合、その作用物質がポリソルベート分解産物を脱凝集させるのに有効である。

「可溶化する」という用語は、固形を液体中に溶解することを指す。例えば、化合物が作用物質の存在下でより容易に溶解する場合、その作用物質が化合物を可溶化するのに有効である。

「ｗ／ｗ比」という用語は、別の溶質の質量により除算された１つの溶質の質量を指す。例えば、１００ｍｇのシクロデキストリン及び１ｍｇのポリソルベートを含有する溶液は、１００：１のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比を有する。一実施形態によると、シクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。

「水性製剤」は、投与に好適な水系液体製剤を指す。製剤は、抗体または小分子などの療法剤を含有し得、好ましくは、滅菌である。水性製剤は、緩衝液、安定剤、張性剤、及び賦形剤も含有し得る。

製剤化されるタンパク質は、好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質である（例えば、夾雑タンパク質などを含まない）。「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を含む組成物を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９９重量％のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を含む組成物を意味する。

「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、または介入により、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作または修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上の類似体を含有するタンパク質、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。本明細書におけるこの定義に包含されるタンパク質の例には、例えば、レニンなどの哺乳動物タンパク質；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；レプチン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；腫瘍壊死因子受容体、例えば、死受容体５及びＣＤ１２０；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｂ－リンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）；増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）；血管内皮成長因子ファミリータンパク質（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、及びＰ１ＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＧＦ－Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｄ、及びそれらの二量体）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー、例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、及びＦＧＦ９；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子受容体、例えば、ＶＥＧＦ受容体（複数可）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３）、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４受容体）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＰＤＧＦＲ－α及びＰＤＧＦＲ－β）、及び線維芽細胞成長因子受容体（複数可）；ＴＩＥリガンド（アンジオポイエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）；アンジオポイエチン受容体、例えば、ＴＩＥ１及びＴＩＥ２；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－５、もしくはニューロトロフィン－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－ｂ；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータ；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、及びインターフェロン－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０；ミッドカイン；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭ；エフリン；Ｂｖ８；デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）；Ｄｅｌ－１；ＢＭＰ９；ＢＭＰ１０；ホリスタチン；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）；Ａｌｋ１；Ｒｏｂｏ４；ＥＳＭ１；パールカン；ＥＧＦ様ドメインマルチプル７（ＥＧＦＬ７）；ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー；トロンボスポンジン、例えば、トロンボスポンジン１及びトロンボスポンジン２；コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶ及びコラーゲンＸＶＩＩＩ；ニューロピリン、例えば、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；Ｎｏｔｃｈタンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４；セマフォリン、例えば、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、及びＳｅｍａ３Ｆ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）；イムノアドヘシン；ならびに上述のタンパク質のうちのいずれかの断片及び／または変異形、ならびに例えば、上述のタンパク質のうちのいずれかを含む１つ以上のタンパク質に結合する抗体断片を含む抗体が含まれる。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を網羅する。

「単離された」タンパク質（例えば、単離された抗体）とは、その天然環境の成分から特定及び分離され、及び／または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、タンパク質の研究的、診断的、または治療的使用を妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。単離されたタンパク質は、組換え細胞内にインサイツでタンパク質を含むが、これは、タンパク質の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。

「天然抗体」とは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結しているが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。

「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含む可変ドメインである免疫グロブリンの他方の部分に対してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（集合的に、ＣＨ）、ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含む。

抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖可変ドメインは、「ＶＨ」と称され得る。軽鎖可変ドメインは、「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で大きく異なるという事実を指し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。これは、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメント内、または軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方に集中している。いくつかの実施形態において、ＨＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）である。

可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖可変ドメインは各々、ベータシート構造を接続し、かつある場合には、その一部を形成するループを形成する、３つのＨＶＲにより接続されたベータシート立体配置を主に採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＨＶＲは、ＦＲ領域により近接近して一緒に保持されており、他方の鎖のＨＶＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。

任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプのうちの１つに割り当てられ得る。

ＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」という用語は、本明細書で使用される場合、それらの定常領域の化学的及び抗原的特徴により定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）が異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知されており、一般に、例えば、Ａｂｂａｓｅｔａｌ．ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．（２０００）に記載されている。抗体は、抗体の１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有会合により形成されるより大きい融合分子の一部であり得る。

「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、以下に定義される抗体断片ではない、その実質的に無傷の形態の抗体を指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は具体的には、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。

抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、ならびに名称が容易に結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）_２断片を生成し、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加だけＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。

「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施形態において、二本鎖Ｆｖ種は、密接に非共有会合している１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造に類似している「二量体」構造で会合し得るように、柔軟性ペプチドリンカーにより共有連結され得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説に関しては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇａｎｄＭｏｏｒｅｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ－ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８（１９９３）でより完全に記載されている。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な突然変異、例えば、自然発生突然変異を除いて同一である。故に、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある特定の実施形態において、かかるモノクローナル抗体は典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む過程により得られたものである。例えば、選択過程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの特有のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列が、例えば、標的への親和性の改善、標的結合配列のヒト化、細胞培養中でのその産生の改善、インビボでのその免疫原性の低減、多重特異性抗体の作製などを行うようにさらに改変されてもよく、改変された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらには他の免疫グロブリンが典型的に夾雑していないという点で有利である。

「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法により抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－９７（１９７５）、Ｈｏｎｇｏｅｔａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３－２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，２ｎｄｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，ｉｎ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ－ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓｐｐ．５６３－６８１Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１））、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）、Ｓｉｄｈｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）を参照されたい、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全てを有するヒトまたはヒト様抗体を動物で産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３、ＷＯ１９９６／３４０９６、ＷＯ１９９６／３３７３５、ＷＯ１９９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５－２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎｅｔａｌ．，ＹｅａｒｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、及び同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９－７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６－８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８１２－８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５－８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、ならびにＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照されたい）を含む、様々な技法により作製され得る。

本明細書におけるモノクローナル抗体は具体的には、所望の生物学的活性を呈する限り、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である「キメラ」抗体、ならびにかかる抗体の断片が含まれる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１－６８５５（１９８４）を参照されたい）。キメラ抗体には、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれ、この抗体の抗原結合領域は、例えば、目的とする抗原でマカクザルを免疫化することにより産生された抗体に由来する。

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基に置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合において、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾を行って、抗体の性能をさらに洗練することができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含む。さらなる詳細に関しては、例えば、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。例えば、ＶａｓｗａｎｉａｎｄＨａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ２３：１０３５－１０３８（１９９５）、ＨｕｒｌｅａｎｄＧｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号も参照されたい。

「ヒト抗体」は、ヒトにより産生され、及び／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍａｎｄＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６－９５（１９９１）に記載されている方法もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎＤｉｊｋａｎｄｖａｎｄｅＷｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８－７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原曝露に応答してかかる抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化異種マウスに抗原を投与することにより調製され得る（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体に関するＬｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）も参照されたい。

本明細書で使用されるとき、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変性であり、及び／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３は、これらの６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を表示し、特にＨ３が、抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７－４５（２０００）、ＪｏｈｎｓｏｎａｎｄＷｕ，ｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２４８：１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際には、重鎖のみからなる自然発生するラクダ科抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６－４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）を参照されたい。

いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置に言及する（ＣｈｏｔｈｉａａｎｄＬｅｓｋＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。ＡｂＭＨＶＲは、ＫａｂａｔＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の折衷案を表し、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々由来の残基が以下に記載される。

ＨＶＲは、ＶＬ内の２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６～３５（Ｈ１）、５０～６５、または４９～６５（Ｈ２）、及び９３～１０２、９４～１０２、または９５～１０２（Ｈ３）のような「伸長ＨＶＲ」を含み得る。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々に関して、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（上記参照）に従って番号付けされる。

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（上記参照）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み得、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、抗体の配列の相同領域での「標準の」Ｋａｂａｔ番号付け配列との整列により決定され得る。

Ｋａｂａｔ番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵ指標」は一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（上記参照）で報告されているＥＵ指標）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標」とは、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。

「直鎖状抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａｅｔａｌ．（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））に記載されている抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｃセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。

ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物内に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質に関連抗原（特に、合成ペプチドが使用される際）をコンジュゲートするのに有用であり得る。例えば、抗原は、二官能性物質または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２、またはＲ^１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ^１は異なるアルキル基である）を使用して、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートされ得る。

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。かかる多重特異性抗体には、完全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディなどの抗体断片、共有連結または非共有連結された抗体断片が含まれるが、これらに限定されない。重鎖定常領域の少なくとも一部分及び／または軽鎖定常領域の少なくとも一部分をさらに含むＶＨ／ＶＬ単位は、「ヘミマー」または「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施形態において、半抗体は、単一の重鎖可変領域の少なくとも一部分及び単一の軽鎖可変領域少なくとも一部分を含む。いくつかのかかる実施形態において、２つの半抗体を含み、かつ２つの抗原に結合する二重特異性抗体は、第１の抗原または第１のエピトープに結合するが、第２の抗原または第２のエピトープには結合しない第１の半抗体、及び第２の抗原または第２のエピトープに結合するが、第１の抗原または第１のエピトープには結合しない第２の半抗体を含む。いくつかの実施形態によると、多重特異性抗体は、５Ｍ～０．００１ｐＭ、３Ｍ～０．００１ｐＭ、１Ｍ～０．００１ｐＭ、０．５Ｍ～０．００１ｐＭ、または０．１Ｍ～０．００１ｐＭの親和性で各抗原またはエピトープに結合するＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、分子内ジスルフィド結合が第２のヘミマーと形成されることを可能にするのに十分な重鎖可変領域の一部分を含む。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、例えば、相補的ホール突然変異またはノブ突然変異を含む第２のヘミマーまたは半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ突然変異またはホール突然変異を含む。ノブ突然変異及びホール突然変異は、以下でさらに論じられる。

「二重特異性抗体」は、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体である。二重特異性抗体は、本明細書において、「二重特異性」を有するか、または「二重特異的」であるとも称され得る。別途示されない限り、二重特異性抗体により結合される抗原が二重特異性抗体名で列記される順序は無作為である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び任意に重鎖定常領域の少なくとも一部分、ならびに単一の軽鎖可変領域及び任意に軽鎖定常領域の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、１つよりも多くの単一の重鎖可変領域を含まず、１つよりも多くの単一の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、第１の半抗体は、第１の抗原に結合し、第２の抗原には結合せず、第２の半抗体は、第２の抗原に結合し、第１の抗原には結合しない。

「ノブ・イントゥ・ホール」または「ＫｎＨ」技術という用語は、本明細書で使用される場合、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面で一方のポリペプチドに***（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することにより、インビトロまたはインビボで一緒に対合することを誘導する技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕｅｔａｌ．，１９９７，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ６：７８１－７８８を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＫｎＨは、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖の対合を一緒に駆動する。例えば、Ｆｃ領域内にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一の可変ドメインをさらに含み得るか、または類似のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含み得る。ＫｎＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメインを一緒に、または異なる標的認識配列（例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、及び他のＦｃ融合物を含む）を含む任意の他のポリペプチド配列を対合することもできる。

「ノブ突然変異」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で***（ノブ）をポリペプチドに導入する突然変異を指す。いくつかの実施形態において、他方のポリペプチドは、ホール突然変異を有する（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，７３１，１６８、ＵＳ５，８０７，７０６、ＵＳ５，８２１，３３３、ＵＳ７，６９５，９３６、ＵＳ８，２１６，８０５を参照されたい）。

「ホール突然変異」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で空洞（ホール）をポリペプチドに導入する突然変異を指す。いくつかの実施形態において、他方のポリペプチドは、ノブ突然変異を有する（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，７３１，１６８、ＵＳ５，８０７，７０６、ＵＳ５，８２１，３３３、ＵＳ７，６９５，９３６、ＵＳ８，２１６，８０５を参照されたい）。

「約」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者により決定されるそれぞれの値の許容できる誤差範囲を指し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での１実施当たり１つまたは１つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含み、それを説明する。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。故に、例えば、「化合物（ａｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、任意に、２つ以上のかかる化合物の組み合わせを含むといった具合である。

ＩＩ．製剤及び調製
本明細書の発明は、ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法に関し、本方法は、シクロデキストリンを製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの実施形態において、本発明は、シクロデキストリンを溶液に添加することを含む、ポリソルベートを含む水溶液中の顕微鏡で見える粒子及び可視の粒子の量を低減する方法を提供し、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの実施形態において、本発明は、シクロデキストリンを製剤に添加することを含む、水性製剤中のポリソルベート分解産物を脱凝集し、可溶化する方法を提供し、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、ＨＰ－βシクロデキストリン、ＨＰ－γシクロデキストリン、またはスルホブチルエーテルベータ－シクロデキストリンである。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、ＨＰ－αシクロデキストリンである。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリペプチドをさらに含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を製剤に添加することを含み、得られたＰＶＰ対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＶＰを溶液に添加することを含む、ポリソルベートを含む水溶液中の顕微鏡で見える粒子及び可視の粒子の量を低減する方法を提供し、得られたＰＶＰ対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＶＰを製剤に添加することを含む、水性製剤中のポリソルベート分解産物を脱凝集し、可溶化する方法を提供し、得られたＰＶＰ対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。

いくつかの実施形態において、本発明は、ポリソルベートと、シクロデキストリンと、を含む水性製剤を提供し、１％未満のポリソルベートが、約１℃～約１０℃での少なくとも約６ヶ月間～少なくとも約４８ヶ月間の保管後に分解されており、製剤中のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、少なくとも約３７．５：１である。いくつかの実施形態において、本発明は、ポリソルベートと、ＰＶＰと、を含む水性製剤を提供し、１％未満のポリソルベートが、約１℃～約１０℃での少なくとも約６ヶ月間～少なくとも約４８ヶ月間の保管後に分解されており、製剤中のＰＶＰ対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、少なくとも約３７．５：１である。いくつかの実施形態において、製剤は、約２℃～約８℃で、少なくとも約６ヶ月間～少なくとも約少なくとも約４８ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間安定している。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．００５％～０．４％のポリソルベートを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．００５％～０．４％のポリソルベートを含み、シクロデキストリンは、約０．０１％～３０％の濃度まで製剤に添加される。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、ＨＰ－βシクロデキストリン、ＨＰ－γシクロデキストリン、またはスルホブチルエーテルベータ－シクロデキストリンである。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、ＨＰ－αシクロデキストリンである。いくつかの実施形態において、ポリソルベート分解は、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％低減される。さらなる実施形態において、１ｍＬ当たり約１，０００、約７５０、約５００、約２５０、約１５０、約１００、約５０、または約２５個未満の、直径約２ミクロン超のポリソルベート粒子が形成される。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、タンパク質濃度は、約２５０ｍｇ／ｍＬ超である。いくつかの実施形態において、製剤は、約４．５～約７．０、または約４．５～約６．０、または約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤のうちの１つ以上をさらに含む。さらなる実施形態において、製剤は、対象への静脈内、皮下、筋肉内、または硝子体内投与に好適である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である。いくつかの実施形態において、製剤は、小分子、核酸、脂質、及び／または炭水化物をさらに含む。

製剤中のタンパク質及び抗体は、当該技術分野で既知の方法を使用して調製され得る。抗体（例えば、完全長抗体、抗体断片、及び多重特異性抗体）を調製するための非限定的な例示的な方法が本明細書に提供される。水性製剤中の抗体は、抗体を生成するための当該技術分野で利用可能な技法を使用して調製され、その例示的な方法は、以下の節により詳細に記載される。本明細書における方法は、ペプチド系阻害剤などの他のタンパク質を含む製剤の調製のために当業者により適合され得る。例えば、治療的タンパク質産生のための、一般に十分に理解され、かつ一般的に用いられる技法及び手順に関して、ＳａｍＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，４ｔｈｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．ｅｄｓ．（２００３）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ（２００２）、Ｈｏｒｓｗｉｌｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，（２００６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄＳｐｅｃｉａｌｉｚｅｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，６ｔｈｅｄ．，Ｊ．ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ（２０１０）を参照されたく、それらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Ａ．抗体の調製
本明細書に提供される水性製剤中の抗体は、目的とする抗原に対して指向される。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与により、その哺乳動物に治療的利益がもたらされ得る。しかしながら、非ポリペプチド抗原に対して指向される抗体も企図される。

抗原がポリペプチドである場合、それは、膜貫通分子（例えば、受容体）、または成長因子などのリガンドであり得る。例示的な抗原には、分子、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ＣＤ２０；ｏｘ－ＬＤＬ；ｏｘ－ＡｐｏＢ１００；レニン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；ホルモンまたは成長因子受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－５、もしくはニューロトロフィン－６（ＮＴ－３、ＮＴ４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータ；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、及びインターフェロン－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体；ならびに上述のポリペプチドのうちのいずれかの断片が含まれる。

（ｉ）抗原の調製
他の分子に任意にコンジュゲートされる可溶性抗原またはその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体などの膜貫通分子の場合、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。かかる細胞は、天然源（例えば、がん細胞株）に由来し得るか、または膜貫通分子を発現するように組換え技法により形質転換された細胞であり得る。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。

（ｉｉ）ある特定の抗体に基づく方法
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物内に産生される。二官能性物質または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２、またはＲ^１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ^１は異なるアルキル基である）を使用して、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートすることが有用であり得る。

動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を３体積のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、複数の部位で溶液を皮内注射することにより、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化される。１ヶ月後、動物は、複数の部位での皮下注射により、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５～１／１０で追加免疫される。７～１４日後、動物が採血され、血清が抗体力価に関してアッセイされる。動物は、力価が水平状態になるまで追加免疫される。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質にコンジュゲートされた抗原及び／または異なる架橋試薬によりコンジュゲートされた抗原で追加免疫される。コンジュゲートは、タンパク質融合物として組換え細胞培養中でも作製され得る。また、ミョウバンなどの凝集剤が、免疫応答を増強するために好適に使用される。

本発明のモノクローナル抗体は、まず、Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載され、例えば、Ｈｏｎｇｏｅｔａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３－２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，２ｎｄｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，ｉｎ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ－ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、及びＮｉ，ＸｉａｎｄａｉＭｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマに関する）にさらに記載されているハイブリドーマ法を使用して作製され得る。追加の方法には、例えば、ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の産生に関して、米国特許第７，１８９，８２６号に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、ＶｏｌｌｍｅｒｓａｎｄＢｒａｎｄｌｅｉｎ，ＨｉｓｔｏｌｏｇｙａｎｄＨｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓａｎｄＢｒａｎｄｌｅｉｎ，ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＦｉｎｄｉｎｇｓｉｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。

様々な他のハイブリドーマ技法に関しては、例えば、ＵＳ２００６／２５８８４１、ＵＳ２００６／１８３８８７（完全ヒト抗体）、ＵＳ２００６／０５９５７５、ＵＳ２００５／２８７１４９、ＵＳ２００５／１００５４６、ＵＳ２００５／０２６２２９、ならびに米国特許第７，０７８，４９２号及び同第７，１５３，５０７号を参照されたい。ハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を産生するための例示的なプロトコルが以下に記載される。一実施形態において、マウスまたはハムスターなどの他の適切な宿主動物は、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、またはその抗体を産生することができるリンパ球を誘発するように免疫化される。抗体は、本発明のポリペプチドまたはその断片、及びアジュバント、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／ジクリノミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）の複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物内に産生される。本発明のポリペプチド（例えば、抗原）またはその断片は、組換え方法などの当該技術分野で周知の方法を使用して調製することができ、これらのうちのいくつかは、本明細書にさらに記載される。免疫化された動物由来の血清が抗抗原抗体に関してアッセイされ、ブースター免疫化が任意に投与される。抗抗原抗体を産生する動物由来のリンパ球が単離される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。

次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，（１９８６）を参照されたい。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性を示す骨髄腫細胞が使用され得る。例示的な骨髄腫細胞には、マウス骨髄腫株、例えば、ＳａｌｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｅｌｌＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍由来のもの、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡ．から入手可能なＳＰ－２またはＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞が含まれるが、これらに限定されない。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７）。

そのように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、好適な培養培地、例えば、融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。好ましくは、例えば、Ｅｖｅｎｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４（３），１０５－１０８（２００６）に記載されているように、ウシ胎仔血清などの動物由来の血清の使用を低減するために、無血清ハイブリドーマ細胞培養法が使用される。

ハイブリドーマ細胞培養の生産性を改善するためのツールとしてのオリゴペプチドは、Ｆｒａｎｅｋ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＲｅｓｅａｒｃｈ，１１１－１２２（２００５）に記載されている。具体的には、標準の培養培地がある特定のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）、またはタンパク質加水分解画分で富化され、アポトーシスが３～６つのアミノ酸残基から構成される合成オリゴペプチドにより著しく抑制され得る。これらのペプチドは、ミリモル濃度またはより高い濃度で存在する。

ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、本発明の抗体に結合するモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析により決定され得る。例えば、Ｍｕｎｓｏｎｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）を参照されたい。

所望の特異性、親和性、及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ得、標準の方法により成長し得る。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ（上記参照）を参照されたい。この目的に好適な培養培地には、例えば、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。タンパク質をハイブリドーマ細胞から単離する１つの手順が、ＵＳ２００５／１７６１２２及び米国特許第６，９１９，４３６号に記載されている。この方法は、結合過程で離液性塩などの最小限の塩を使用することを含み、好ましくは、溶出過程で少量の有機溶媒を使用することも含む。

（ｉｉｉ）ある特定のライブラリスクリーニング方法
本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリを使用して、所望の活性（複数可）を有する抗体に関してスクリーニングすることにより作製され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特徴を保有する抗体に関するかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。かかる方法は一般に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍｅｔａｌ．ｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１７８：１－３７，Ｏ’Ｂｒｉｅｎｅｔａｌ．，ｅｄ．，ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，（２００１）に記載されている。例えば、目的とする抗体を生成する１つの方法は、Ｌｅｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－９３（２００４）に記載されているようなファージ抗体ライブラリの使用による。

原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片をディスプレイするファージを含むファージライブラリをスクリーニングすることにより選択される。かかるファージライブラリは、所望の抗原に対する親和性クロマトグラフィーによりパニングされる。所望の抗原に結合することができるＦｖ断片を発現するクローンは、抗原に吸着し、故に、ライブラリ内の非結合クローンから分離される。次いで、結合クローンは、抗原から溶出し、追加の抗原吸着／溶出サイクルによりさらに富化され得る。本発明の抗体のうちのいずれも、目的とするファージクローンに関して選択するのに好適な抗原スクリーニング手順を設計して、続いて、目的とするファージクローン由来のＦｖ配列、及びＫａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ１－３：９１－３２４２，ＢｅｔｈｅｓｄａＭｄ．（１９９１）に記載されている好適な定常領域（Ｆｃ）配列を使用する完全長抗体クローンの構築により得ることができる。

ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合ドメインは、約１１０個のアミノ酸を有する２つの可変（Ｖ）領域から形成され、各々が軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖由来であり、両方が３つの超可変ループ（ＨＶＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されているように、ＶＨ及びＶＬが短い柔軟性ペプチドを介して共有連結される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはそれらが各々定常ドメインに融合して非共有結合的に相互作用するＦａｂ断片としてのいずれかで、ファージ上に機能的にディスプレイされ得る。本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンは、集合的に「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称される。

ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別個にクローニングされ、ファージライブラリ内でランダムに組換えられ得、次いで、これは、Ｗｉｎｔｅｒｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されているように、抗原結合クローンに関して検索され得る。免疫化源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、高親和性抗体を免疫原に提供する。あるいは、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されているように、クローニングされて、いずれの免疫化も伴うことなく、単一のヒト抗体源を広範囲の非自己抗原及び自己抗原に提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍａｎｄＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されているように、幹細胞由来の再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、かつランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによっても合成的に作製されて、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配置を達成することができる。

ある特定の実施形態において、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合により抗体断片をディスプレイするために、線維状ファージが使用される。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されているように、ＶＨ及びＶＬドメインが柔軟性ポリペプチドスペーサーにより同じポリペプチド鎖上で接続される一本鎖Ｆｖ断片として、または、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９：４１３３－４１３７（１９９１）に記載されているように、一方の鎖がｐＩＩＩに融合し、他方の鎖が細菌宿主細胞ペリプラズムに分泌され、このペリプラズムにおいて、Ｆａｂコートタンパク質構造のアセンブリが野生型コートタンパク質のうちのいくつかをディスプレイすることによりファージ表面上にディスプレイされるようになるＦａｂ断片としてディスプレイされ得る。

一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から収集される免疫細胞から得られる。抗抗原クローンに好意的にバイアスされたライブラリが所望される場合、対象は、抗原で免疫化されて抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／または循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、ライブラリ構築のために回収される。一実施形態において、抗抗原クローンに好意的にバイアスされたヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、抗原免疫化により抗原に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを持つ（かつ機能的内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスに抗抗原抗体応答を生じさせることにより得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの生成は、以下に記載される。

抗抗原反応性細胞集団のさらなる富化は、抗原特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞の単離に好適なスクリーニング手順を使用することにより、例えば、抗原親和性クロマトグラフィー、または細胞の蛍光色素標識抗原への吸着、続いて、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した細胞分離により得ることができる。

あるいは、免疫化されていないドナー由来の脾臓細胞及び／またはＢ細胞、または他のＰＢＬの使用により、可能な抗体レパートリーのより良好な表示が提供され、抗原が抗原性ではない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用した抗体ライブラリの構築も可能になる。インビトロ抗体遺伝子構築を組み込むライブラリの場合、幹細胞が対象から収集されて、再配置されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。目的とする免疫細胞は、様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種などから得ることができる。

抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸は、目的とする細胞から回収され、増幅される。再配置されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：３８３３－３８３７（１９８９）に記載されているように、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをリンパ球から単離し、続いて、再配置されたＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端に一致するプライマーとのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行い、それにより、発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することにより得ることができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉｅｔａｌ．（１９８９）及びＷａｒｄｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４：５４６（１９８９）に記載されているように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端のバックプライマー、及びＪ－セグメント内にあるフォワードプライマーを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅され得る。しかしながら、ｃＤＮＡから増幅するために、バックプライマーは、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：８８－８９（１９９１）に記載されているようにリーダーエクソン内にもあり、フォワードプライマーは、Ｓａｓｔｒｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：５７２８－５７３２（１９８９）に記載されているように定常領域内にもある。相補性を最大限に生かすために、Ｏｒｌａｎｄｉｅｔａｌ．（１９８９）またはＳａｓｔｒｙｅｔａｌ．（１９８９）に記載されているように、縮重がプライマーに組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ライブラリの多様性は、例えば、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）の方法に記載されているように、またはＯｒｕｍｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１：４４９１－４４９８（１９９３）の方法に記載されているように、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能であるＶＨ及びＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的とするＰＣＲプライマーを使用することにより最大化される。増幅されたＤＮＡの発現ベクターへのクローニングの場合、希少制限部位が、Ｏｒｌａｎｄｉｅｔａｌ．（１９８９）に記載されているように、一方の端におけるタグとして、または、Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）に記載されているように、タグ付けされたプライマーでのさらなるＰＣＲ増幅によりＰＣＲプライマー内に導入され得る。

合成的に再配置されたＶ遺伝子のレパートリーは、インビトロでＶ遺伝子セグメントから誘導され得る。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大半は、クローニング及び配列決定され（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６－７９８（１９９２）に報告される）、及びマッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，３：８８－９４（１９９３）に報告される）、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主な立体配座を含む）を使用して、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍａｎｄＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されているように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーで多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成することができる。ＶＨレパートリーは、Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７－４４６１（１９９２）に記載されているように、単一の長さで長いＨ３ループに特化した全ての配列多様性を用いても作製され得る。ヒトＶκ及びＶλセグメントは、クローニング及び配列決定されており（ＷｉｌｌｉａｍｓａｎｄＷｉｎｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４５６－１４６１（１９９３）に報告される）、それらを使用して、合成軽鎖レパートリーを作製することができる。合成Ｖ遺伝子レパートリーは、ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲、ならびにＬ３及びＨ３の長さに基づいて、かなりの構造多様性を有する抗体をコードする。Ｖ遺伝子コードＤＮＡの増幅後、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントが、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍａｎｄＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）の方法に従ってインビトロで再配置され得る。

抗体断片のレパートリーは、いくつかの方法でＶＨ遺伝子レパートリー及びＶＬ遺伝子レパートリーを一緒に組み合わせることにより構築され得る。各レパートリーは、異なるベクターで作り出され得、これらのベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２８：１１９－１２６（１９９３）に記載されるように、インビトロで組換えられ得るか、またはコンビナトリアル感染、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１：２２６５－２２６６（１９９３）に記載されているｌｏｘＰ系によりインビボで組換えられ得る。インビボ組換え手法は、Ｆａｂ断片の二本鎖性質を利用して、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換効率により課せられるライブラリサイズの制限を打開する。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーは、一方がファージミドに、他方がファージベクターに別個にクローニングされる。次いで、これらの２つのライブラリは、ファージミド含有細菌のファージ感染により組み合わせられ、これにより、各細胞が異なる組み合わせを含むようになり、ライブラリサイズが存在する細胞の数（約１０^１２個のクローン）のみにより制限されるようになる。これらのベクターはいずれもインビボ組換えシグナルを含み、これにより、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンに組換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされるようになる。これらの巨大なライブラリは、良好な親和性（約１０^－８ＭのＫ_ｄ ^－１）を有する多数の多様な抗体を提供する。

あるいは、レパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８－７９８２（１９９１）に記載されているように同じベクターに順次にクローニングされ得るか、またはＰＣＲにより一つにアセンブルされ、次いで、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）に記載されているようにクローニングされ得る。ＰＣＲアセンブリを使用して、ＶＨ及びＶＬＤＮＡを、柔軟性ペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと連結して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することもできる。なお別の技法において、Ｅｍｂｌｅｔｏｎｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０：３８３１－３８３７（１９９２）に記載されているように、ＰＣＲによりリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせ、次いで、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングするために、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」が使用される。

ナイーブライブラリ（天然または合成のいずれか）により産生された抗体は、中程度の親和性（約１０^６～１０^７Ｍ^－１のＫ_ｄ ^－１）を有するものであり得るが、親和性成熟は、Ｗｉｎｔｅｒｅｔａｌ．（１９９４）（上記参照）に記載されているように、二次ライブラリを構築し、かつそれから再選択することによりインビトロで模倣され得る。例えば、突然変異は、Ｈａｗｋｉｎｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６（１９９２）の方法か、またはＧｒａｍｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，８９：３５７６－３５８０（１９９２）の方法にある変異性ポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇｅｔａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１：１１－１５（１９８９）に報告される）を使用することによりランダムインビトロで導入され得る。加えて、親和性成熟は、選択された個別のＦｖクローンにおいて、１つ以上のＣＤＲをランダムに突然変異させることにより、例えば、目的とするＣＤＲに及ぶランダム配列を持つプライマーでのＰＣＲを使用し、より高い親和性のクローンに関してスクリーニングすることにより行われ得る。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域における突然変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリを作り出すための方法を記載している。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９－７８３（１９９２）に記載されているように、免疫化されていないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異形のレパートリーを用いてファージディスプレイにより選択されたＶＨまたはＶＬドメインを組換え、いくつかの鎖リシャッフリングラウンドでより高い親和性に関してスクリーニングすることである。この技法により、約１０^－９Ｍ以下の親和性を有する抗体及び抗体断片の産生が可能になる。

ライブラリのスクリーニングは、当該技術分野で既知の様々な技法により達成され得る。例えば、抗原は、吸着プレートに付着した宿主細胞で発現された吸着プレートのウェルを被覆するために使用され得るか、または細胞選別で使用され得るか、またはストレプトアビジン被覆ビーズで捕捉するためにビオチンにコンジュゲートされ得るか、またはファージディスプレイライブラリをパニングするための任意の他の方法で使用され得る。

ファージライブラリ試料は、吸着剤を用いてファージ粒子の少なくとも一部分への結合に好適な条件下で固定化抗原と接触する。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣するように選択される。固相に結合したファージは洗浄され、次いで、例えば、Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，８８：７９７８－７９８２（１９９１）に記載されているように、酸により、または、例えば、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されているように、アルカリにより、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）の抗原競合方法と類似の手順で抗原競合により溶出される。ファージは、単一の選択ラウンドで２０～１，０００倍富化され得る。さらに、富化されたファージは、細菌培養中で成長し、さらなる選択ラウンドに供され得る。

選択の効率は、洗浄中の解離速度、及び単一のファージ上の複数の抗体断片が抗原と同時に会合し得るかを含む多くの要因に依存する。速い解離速度（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短時間の洗浄、多価ファージディスプレイ、及び固相中の抗原の高被覆密度の使用により保持され得る。高密度は、多価相互作用によりファージを安定させるだけでなく、解離したファージの再結合にも有利に働く。遅い解離速度（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０に記載されているように、長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイの使用、ならびにＭａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９－７８３（１９９２）に記載されているように、抗原の低被覆密度の使用により促進され得る。

わずかに異なる親和性しか有しなくとも、抗原に対して異なる親和性を有するファージ抗体間での選択が可能である。しかしながら、選択された抗体のランダム突然変異（例えば、いくつかの親和性成熟技法で行われる）により、大半が抗原に結合し、数個のみより高い親和性を有する多くの突然変異体が生み出される可能性がある。抗原を制限することにより、希少高親和性ファージが競合排除され得る。全てのより高い親和性の突然変異体を保持するために、ファージは、抗原に対して一定の標的モル親和性よりも低いモル濃度のビオチン化抗原ではなく、過剰ビオチン化抗原とインキュベートされ得る。次いで、高親和性結合ファージは、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズにより捕捉され得る。かかる「平衡捕捉」により、わずか２倍高い親和性を有する突然変異体クローンの、より低い親和性を有するかなりの過剰なファージからの単離を可能にする感度で、抗体がそれらの結合親和性に従って選択されることが可能になる。解離速度に基づいて区別するために、固相に結合したファージを洗浄する際に使用される条件を操作することもできる。

抗抗原クローンは、活性に基づいて選択され得る。ある特定の実施形態において、本発明は、抗原を自然に発現する生細胞に結合するか、または浮遊抗原もしくは他の細胞構造に付着した抗原に結合する抗抗原抗体を提供する。かかる抗抗原抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上述のように抗抗原クローンをファージライブラリから単離し、任意に、ファージクローンの単離集団を、その集団を好適な細菌宿主で成長させることにより増幅すること、（２）それぞれ、遮断及び非遮断活性が所望される抗原及び第２のタンパク質を選択すること、（３）抗抗原ファージクローンを固定化抗原に吸着させること、（４）過剰な第２のタンパク質を使用して、第２のタンパク質の結合決定基と重複するか、またはそれと共有される抗原結合決定基を認識するいずれの所望されないクローンも溶出すること、ならびに（５）ステップ（４）の後に吸着したまま留まっているクローンを溶出することにより選択され得る。任意に、所望の遮断／非遮断特性を有するクローンは、本明細書に記載の選択手順を１回以上繰り返すことによりさらに富化され得る。

本発明のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体またはファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から目的とする重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）容易に単離及び配列決定される。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター内に置かれ、次いで、それらは、免疫グロブリンタンパク質を別様に産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞における所望のモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体コードＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説には、Ｓｋｅｒｒａｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６（１９９３）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ，１３０：１５１（１９９２）が含まれる。

本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／または軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列はＫａｂａｔｅｔａｌ．，（上記参照）から得ることができる）と組み合わせられて、完全長または部分長重鎖及び／または軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得、かかる定常領域が任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解される。ある動物（ヒトなど）種の可変ドメインＤＮＡから誘導され、次いで、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合して、「ハイブリッド」完全長重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成するＦｖクローンは、本明細書で使用されるような「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある特定の実施形態において、ヒト可変ＤＮＡから誘導されたＦｖクローンは、ヒト定常領域ＤＮＡに融合して、完全長または部分長ヒト重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成する。

本発明のハイブリドーマに由来する抗抗原抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローンに由来する相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによっても修飾され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）の方法にあるように）。ハイブリドーマ由来抗体またはＦｖクローン由来抗体もしくは断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を共有連結することによりさらに修飾され得る。この様式で、本発明のＦｖクローンまたはハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。

（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、「移入」残基と称され、これらは典型的には、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び同僚（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６（１９８８））の方法に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより行われ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、実質的に無傷のヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種からの対応する配列により置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体における類似の部位由来の残基により置換されるヒト抗体である。

ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖のいずれも、抗原性を低減させるのに非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る（Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。

抗体が抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、本方法の一実施形態によると、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析過程により調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、標的抗原（複数可）に対する親和性の増加などの所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基がレシピエント及び移入配列から選択され、組み合わせられ得る。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接かつ最も実質的に関与する。

本発明のヒト抗体は、上述のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることにより構築され得る。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、例えば、ＫｏｚｂｏｒＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．５１－６３（１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）により記載されている。

内因性免疫グロブリン産生の不在下で免疫化時にヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子のホモ接合型欠失により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。かかる生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入により、抗原曝露時にヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５－２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，ＹｅａｒｉｎＩｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）、及びＤｕｃｈｏｓａｌｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３５５：２５８（１９９２）を参照されたい。

遺伝子シャッフリングを使用して、ヒト抗体を非ヒト抗体、例えば、齧歯類抗体から誘導することもでき、ヒト抗体は、出発非ヒト抗体と類似の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従って、本明細書に記載のファージディスプレイ技法により得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかが、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラ集団を作り出す。抗原を用いた選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離がもたらされ、ここで、ヒト鎖が一次ファージディスプレイクローンにおける対応する非ヒト鎖の除去時に破壊された抗原結合部位を復元する、すなわち、エピトープがヒト鎖パートナーの選択を管理する（インプリントする）。残りの非ヒト鎖を置き換えるためにこの過程が繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を有しない完全なヒト抗体を提供する。

（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化などの伝統的な手段または組換え技法により生成され得る。ある特定の状況において、全抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片により、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。ある特定の抗体断片の概説に関しては、Ｈｕｄｓｏｎｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。

抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化により得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２４：１０７－１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞により直接産生され得る。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体断片が全て、Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌され得るため、これらの断片の容易な大量産生が可能になる。抗体断片は、上記で論じられた抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、化学的にカップリングされて、Ｆ（ａｂ’）_２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離され得る。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片が、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を産生するための他の技法は、当業者に明らかであろう。ある特定の実施形態において、抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠く無傷な結合部位を有する唯一の種であり、故に、それらは、インビボでの使用中の非特異的結合の低減に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質が構築されて、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでのエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる。ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（上記参照）を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」でもあり得る。かかる直鎖状抗体は、単一特異性または二重特異性であり得る。

（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、これらのエピトープは通常、異なる抗原由来である。かかる分子が通常２つの異なるエピトープのみに結合する（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）一方で、三重特異性抗体などの追加の特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合、この表現により包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）。

二重特異性抗体を作製するための方法が当該技術分野で知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類により、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の可能性のある混合物を産生し、それらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。親和性クロマトグラフィーステップにより通常行われる正しい分子の精製はやや厄介であり、生成物収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１０：３６５５－３６５９（１９９１）に開示されている。

異なる手法によると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合物のうちの少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが典型的である。免疫グロブリン重鎖融合物、及び、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不等比が最適収率を提供する実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合の調整時に高い柔軟性が提供される。しかしながら、等比での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高収率がもたらされる場合、またはそれらの比率が特に重要ではない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。

この手法の一実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とからなる。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在により容易な分離法が提供されるため、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物の望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの分離を容易にすることが見出された。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細に関しては、例えば、Ｓｕｒｅｓｈｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。

ＷＯ９６／２７０１１に記載されている別の手法によると、一対の抗体分子間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように操作され得る。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣ_Ｈ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一または類似のサイズの補償「空洞」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより第２の抗体分子の界面上に作り出される。これにより、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増加させるための機構が提供される。

二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方がアビジンにカップリングし、他方がビオチンにカップリングし得る。かかる抗体は、例えば、望ましくない細胞を免疫系細胞の標的とするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、かつＨＩＶ感染を治療するために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製され得る。好適な架橋剤が当該技術分野で周知されており、いくつかの架橋技法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。

抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法もこの文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学連結を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１（１９８５）は、無傷抗体がタンパク質分解的に切断されてＦ（ａｂ’）_２断片を生成する手順を記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、隣接するジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’－ＴＮＢ誘導体の一方がメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’－チオールに再変換され、等モル量の他方のＦａｂ’－ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の作用物質として使用され得る。

近年の進歩により、化学的にカップリングされて二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ’－ＳＨ断片のＥ．ｃｏｌｉからの直接回収が容易になった。Ｓｈａｌａｂｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７－２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）_２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから別個に分泌され、インビトロで直接化学的カップリングに供されて、二重特異性抗体を形成した。

二重特異性抗体断片を組換え細胞培養から直接作製及び単離するための様々な技法についても記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）により記載されている「ダイアボディ」技術により、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構が提供されている。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続した重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。したがって、１つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは、別の断片の相補的Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することにより二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。

２より多くの原子価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｆｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。

（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む単一のポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）。一実施形態において、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部からなる。

（ｖｉｉｉ）抗体変異形
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異形は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製され得る。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われて、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特徴を保有することを条件とする。主題の抗体アミノ酸配列が作製された時点で、アミノ酸改変がその配列に導入され得る。

（ｉｘ）抗体誘導体
本発明の抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に利用可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。ある特定の実施形態において、抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に付着するポリマーの数は異なり得、１つよりも多くのポリマーが付着する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下である療法に使用されるかなどを含むが、これらに限定されない考慮すべき事項に基づいて決定され得る。

（ｘ）ベクター、宿主細胞、組換え法
抗体は、組換え方法を使用して産生することもできる。抗抗原抗体の組換え産生に関して、抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され得、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）配列決定され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分は一般に、以下のもの、すなわち、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。

（ａ）シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に産生され得、この異種ポリペプチドは好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択された異種シグナル配列は好ましくは、宿主細胞により認識及び処理される（例えば、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識も処理もしない原核宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列により置換される。酵母分泌に関して、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ α－因子リーダーを含む）、もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。

（ｂ）複製起点
発現ベクター及びクローニングベクターのいずれも、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。かかる配列は、様々な細菌、酵母、及びウイルスに関して周知されている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が大半のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド起点が酵母に好適であり、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むという理由だけで、典型的に使用され得る）。

（ｃ）遺伝子成分の選択
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも命名される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、または（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質、例えば、Ｂａｃｉｌｌｉに関してＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子をコードする。

選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を産生し、故に選択レジメンに耐え抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。

哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、抗体コード核酸、例えば、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどを取り込むための細胞成分の特定を可能にするものである。

例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することにより特定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。内因性ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣＣＲＬ－９０９６）が使用され得る。

あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳ阻害剤であるＬ－メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することにより特定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅系が、上述のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用され得る。

あるいは、目的とする抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及び別の選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換または共形質転換された宿主細胞（具体的には、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８用の選択剤を含有する培地中で成長した細胞により選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。

酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異菌株に対する選択マーカー、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４－１を提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中でのｔｒｐ１病変の存在により、トリプトファンの不在下での成長による形質転換の検出に有効な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２が欠損した酵母菌株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を持つ既知のプラスミドにより補完される。

加えて、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターが、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用され得る。あるいは、組換え仔牛キモシンの大規模産生のための発現系として、Ｋ．ｌａｃｔｉｓが報告された。ＶａｎｄｅｎＢｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定した多コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８－９７５（１９９１）。

（ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは一般に、宿主生物により認識され、かつ抗体をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。原核宿主との使用に好適なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β－ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するためのプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されるシャイン－ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含む。

真核生物のためのプロモーター配列が知られている。事実上全ての真核遺伝子が、転写が開始する部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０～８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て、真核発現ベクターに好適に挿入される。

酵母宿主との使用に好適なプロモーター配列の例には、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。

成長条件により制御された転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に伴う分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に好適なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターとともに有利に使用される。

哺乳動物宿主細胞中のベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御され得るが、但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。

ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として好都合に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ－インターフェロンｃＤＮＡの発現について、Ｒｅｙｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２９７：５９８－６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。

（ｅ）エンハンサー要素成分
より高次の真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写はしばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核プロモーターの活性化のための増強要素について、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列の５’位または３’位でベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’部位に位置する。

（ｆ）転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。かかる配列は一般的に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。

（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター中のＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、またはより高次の真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｉ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４１Ｐ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の菌株も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。

完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされないとき、例えば、治療用抗体が単独で腫瘍細胞破壊に効果を示す細胞毒性薬（例えば、毒素）にコンジュゲートされるときに、細菌中で産生され得る。完全長抗体は、血液循環におけるより優れた半減期を有する。Ｅ．ｃｏｌｉでの産生がより迅速であり、より費用効率が高い。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現に関しては、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒｅｔ．ａｌ．）、米国特許第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙｅｔａｌ．）、米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓｅｔａｌ．）（発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載している）を参照されたい。Ｅ．ｃｏｌｉでの抗体断片の発現を記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．２４５－２５４（２００３）も参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され得、例えば、アイソタイプに応じてタンパク質ＡまたはＧカラムにより精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に行われ得る。

原核生物に加えて、糸状真菌または酵母などの真核微生物が、抗体コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、より低次の真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状真菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのいくつかの他の属、種、及び菌株が本明細書において一般的に利用可能であり、有用である。治療用タンパク質の産生のための酵母及び糸状真菌の使用を論じている概説に関しては、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）を参照されたい。

グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらすある特定の真菌及び酵母菌株が選択され得る。例えば、Ｌｉｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載している）、及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓｅｔａｌ．（上記参照）を参照されたい。

グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス菌株及び変異形、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、及びＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス菌株、例えば、ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮＰＶのＬ－１変異形及びＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＮＰＶのＢｍ－５菌株が公的に利用可能であり、かかるウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明による本明細書におけるウイルスとして使用され得る。

綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ（Ｌｅｎｉｎａｃｅａｅ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。

脊椎動物細胞は、宿主として使用され得、培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ヒト胚腎臓株（懸濁培養中での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス***腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）がある。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ^－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説に関しては、例えば、ＹａｚａｋｉａｎｄＷｕ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２４８：２５５－２６８（２００３）を参照されたい。

宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なものとして修飾された従来の栄養培地中で培養される。

（ｈ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、または同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載されている培地のいずれも、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びホスフェートなど）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源で補充され得る。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度及びｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用されているものであり、当業者には明らかであろう。

（ｘｉ）抗体の精製
組換え技法を使用するとき、抗体は、細胞内で産生され得るか、細胞膜周辺腔内で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、微粒子残屑（宿主細胞または溶解断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３－１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたって解凍される。細胞残屑は、遠心分離により除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、最初に濃縮される。タンパク質分解を阻害するためのＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を防止するための抗生物質が含まれてもよい。

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィーが典型的に好ましい精製ステップのうちの１つである。親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着するマトリックスはほぼ、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスにより、アガロースで達成され得るよりも速い流速及び短い加工時間が可能になる。抗体がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。

一般に、研究、試験、及び臨床で使用するための抗体を調製するための様々な方法論が当該技術分野で十分に確立されており、上述の方法論と一致しており、及び／または当業者により目的とする特定の抗体に適切であるとみなされる。

Ｂ．生物学的に活性な抗体の選択
上述のように産生された抗体は、治療的観点から有益な特性を有する抗体を選択するために、１つ以上の「生物学的活性」アッセイに供され得る。抗体は、それが産生される抗原に結合するその能力に関してスクリーニングされ得る。例えば、抗ＤＲ５抗体（例えば、ドロジツマブ）の場合、抗体の抗原結合特性は、死受容体５（ＤＲ５）に結合する能力を検出するアッセイで評価され得る。

別の実施形態において、抗体の親和性は、例えば、飽和結合、ＥＬＩＳＡ、及び／または競合アッセイ（例えばＲＩＡ）により決定され得る。

また、抗体は、例えば、治療薬としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイに供され得る。かかるアッセイは、当該技術分野で既知であり、抗体の標的抗原及び意図される使用に依存する。

目的とする抗原上の特定のエピトープに結合する抗体に関してスクリーニングするために、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＥｄＨａｒｌｏｗａｎｄＤａｖｉｄＬａｎｅ（１９８８）に記載されているものなどの日常的な交差遮断アッセイが行われ得る。あるいは、例えば、Ｃｈａｍｐｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８－１３９４（１９９５）に記載されているようにエピトープマッピングを行って、目的とするエピトープに抗体が結合するかを決定することができる。

Ｃ．製剤の調製
低減されたポリソルベート分解を有する、ポリソルベート及びシクロデキストリンを含む製剤が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン（ＨＰ－α－ＣＤ）、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン（ＨＰ－γ－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、β－シクロデキストリン（β－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、スルホブチルエーテルβ－シクロデキストリン（ＳＢＥ－β－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、α－シクロデキストリン（α－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、γ－シクロデキストリン（γ－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリソルベート及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含み、低減されたポリソルベート分解を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、約０．００１％～約１５％の範囲、またはこれらの値の間の任意の範囲である。ある特定の実施形態において、ポリソルベートは、約０．００１％～約０．４％、０．０１％～約０．４％、約０．０１％～約０．３％、約０．０１％～約０．２％、約０．０１％～約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．００１％、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．４％、約１％、約５％、または約１５％のポリソルベートを含む。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート２０である。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート４０である。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート６０である。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート８０である。

いくつかの実施形態において、ポリビナルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎａｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）は、モノマーＮ－ビニルピロリドンから作製されたポリマー分子のクラスである。いくつかの実施形態において、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、ポビドン（可溶性ＰＶＰ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ポビドンＫ１２（およそＭＷ：２．５ｋＤａ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ポビドンＫ１５（およそＭＷ：８ｋＤａ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ポビドンＫ１７（およそＭＷ：１０ｋＤａ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ポビドンＫ２５（およそＭＷ：３０ｋＤａ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ポビドンＫ３０（およそＭＷ：５０ｋＤａ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ポビドンＫ６０（およそＭＷ：４００ｋＤａ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ポビドンＫ９０（およそＭＷ：１，０００ｋＤａ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ポビドンＫ１２０（３，０００ｋＤａ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、クロスポビドン（不溶性ＰＶＰ）である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、コポピドン（Ｃｏｐｏｖｉｄｏｎｅ）である。

いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、約０．５％～約３０％の範囲である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、約１％～約２５％、または約５％～約２０％、または約１０％～約１５％の範囲である。さらなる実施形態において、シクロデキストリンは、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、または約３０％の濃度である。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、約０．５％～約３０％の範囲である。

いくつかの実施形態において、製剤中のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの実施形態において、製剤中のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約５０：１超、約１００：１超、約１５０：１超、約２５０：１超、約７５０：１超、約１０００：１超、または約３０００：１超である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、６７：１～１０００：１ではない。いくつかの実施形態において、製剤中のＰＶＰ対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。

いくつかの実施形態において、水性製剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬの範囲、またはこれらの値の間の任意の範囲の濃度のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約２５０ｍｇ／ｍＬ超の濃度である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約１０ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか一つの範囲、またはこれらの範囲の間の任意の範囲の濃度である。

いくつかの実施形態において、水性製剤は、抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、（ＶＥＧＦ）；ＣＤ２０；ｏｘ－ＬＤＬ；ｏｘ－ＡｐｏＢ１００；レニン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；ホルモンまたは成長因子受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－５、もしくはニューロトロフィン－６（ＮＴ－３、ＮＴ４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータ；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、及びインターフェロン－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体；ならびに上述のポリペプチドのうちのいずれかの断片を対象とする。いくつかの実施形態において、抗体は、抗ＣＤ２０抗体でない。いくつかの実施形態において、製剤は、抗ＣＤ２０抗体及び０．２％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、１０％のＨＰ－γシクロデキストリン及び０．０３％のポリソルベート２０を含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、抗ＣＤ２０抗体、１０％のＨＰ－γシクロデキストリン、及び０．０３％のポリソルベート２０を含まない。

いくつかの実施形態において、水性製剤は、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含む。本発明の水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液中で調製され得る。本発明の緩衝液は、約ｐＨ４．５～約９．０の範囲のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ４．５～約７．０の範囲、約ｐＨ４．５～約６．５の範囲、約ｐＨ４．５～約６．０の範囲、約ｐＨ４．５～約５．５の範囲、約ｐＨ４．５～約５．０の範囲、約ｐＨ５．０～約７．０の範囲、約ｐＨ５．５～約７．０の範囲、約ｐＨ５．７～約６．８の範囲、約ｐＨ５．８～約６．５の範囲、約ｐＨ５．９～約６．５の範囲、約ｐＨ６．０～約６．５の範囲、または約ｐＨ６．２～約６．５の範囲である。ある特定の実施形態において、液体製剤は、約４．７～約５．２の範囲、約５．０～６．０の範囲、または約５．２～約５．８の範囲のｐＨを有する。本発明のある特定の実施形態において、液体製剤は、６．２または約６．２のｐＨを有する。本発明のある特定の実施形態において、液体製剤は、６．０または約６．０のｐＨを有する。

ｐＨをこの範囲内で制御する緩衝液の例には、有機酸及び無機酸、ならびにそれらの塩が含まれる。例えば、アセテート（例えば、ヒスチジンアセテート、アルギニンアセテート、ナトリウムアセテート）、スクシネート（例えば、ヒスチジンスクシネート、アルギニンスクシネート、ナトリウムスクシネート）、グルコネート、ホスフェート、フマレート、オキサレート、ラクテート、シトレート、及びそれらの組み合わせ。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ～約６００ｍＭであり得る。

追加の界面活性剤は任意に、水性製剤に添加され得る。例示的な界面活性剤には、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８など）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。添加される界面活性剤の量は、それが製剤化抗体の凝集を低減させ、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小限に抑え、及び／または吸着を低減させるような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１％～約０．５％、約０．００５％～約０．２％、約０．０１％～約０．１％、または約０．０２％～約０．０６％、または約０．０３％～約０．０５％の量で製剤中に存在し得る。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、０．０４％または約０．０４％の量で製剤中に存在する。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、０．０２％または約０．０２％の量で製剤中に存在する。一実施形態において、製剤は、界面活性剤を含まない。

時に「安定剤」として既知の張性剤は、組成物中の液体の張性を調整または維持するために存在する。タンパク質及び抗体などの粗大荷電生体分子とともに使用されるとき、張性剤は、それらがアミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間及び分子内相互作用の可能性を低減させ得るため、しばしば「安定剤」として命名される。張性剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１重量％～２５重量％、またはより好ましくは、１重量％～５重量％の任意の量で存在し得る。好ましい張性剤には、多価糖アルコール、好ましくは、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが含まれる。

いくつかの実施形態において、製剤は、インビボ投与のためのものである。いくつかの実施形態において、製剤は、滅菌である。製剤は、滅菌濾過膜を通す濾過により滅菌にされ得る。本明細書における治療製剤は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静脈注射用溶液袋またはバイアル内に置かれる。投与経路は、好適な様式での長期間にわたる単回または複数回ボーラスまたは注入、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、または関節内経路による注射もしくは注入、あるいは局所投与、吸入、または持続放出もしくは徐放手段などの既知の認められている方法に従うものである。

本発明により提供される水性製剤は、ポリペプチド、ポリソルベート、及びシクロデキストリンを含み、保管期間後、増強されたポリソルベート安定性を示す。一実施形態において、ポリソルベート安定性は、保管期間後、製剤中に残っているポリソルベートの相対パーセントとして表される。例えば、初期に０．１％のポリソルベートを含有し、保管期間後に０．０９％のポリソルベートを含有する製剤の場合、１０％のポリソルベートが分解されている。さらなる実施形態において、溶液中のポリソルベートの量は、蒸発光散乱検出（ＲＰ－ＥＬＳＤ）を使用して、逆相超高性能液体クロマトグラフィーにより決定される（Ｋｉｍ，Ｊ＆Ｑｉｕ，Ｊ．２０１４，ＡｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ８０６：１４４－１５１）。いくつかの実施形態において、試料中のポリソルベートの濃度は、異なるポリソルベート濃度を使用して生成される標準曲線と試料結果とを比較することにより決定される。

いくつかの実施形態において、製剤が約１℃～約１０℃で、約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、５％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約２℃～約８℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、５％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約４℃～約６℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、５％未満のポリソルベートが分解されている。

いくつかの実施形態において、製剤が約１℃～約１０℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、１％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約２℃～約８℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、１％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約４℃～約６℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、１％未満のポリソルベートが分解されている。

いくつかの実施形態において、製剤が約１℃～約１０℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、０．１％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約２℃～約８℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、０．１％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約４℃～約６℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、０．１％未満のポリソルベートが分解されている。

いくつかの実施形態において、製剤が約２２℃～約２８℃で、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、または少なくとも約１２ヶ月間保管された後、５％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約２２℃～約２８℃で、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、または少なくとも約１２ヶ月間保管された後、１％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約２２℃～約２８℃で、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、または少なくとも約１２ヶ月間保管された後、０．１％未満のポリソルベートが分解されている。

いくつかの実施形態において、製剤が約－１５℃～約－２５℃で、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、少なくとも約４８ヶ月間、少なくとも約５４ヶ月間、少なくとも約６０ヶ月間、少なくとも約６６ヶ月間、または少なくとも約７２ヶ月間保管された後、５％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約－１５℃～約－２５℃で、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、少なくとも約４８ヶ月間、少なくとも約５４ヶ月間、少なくとも約６０ヶ月間、少なくとも約６６ヶ月間、または少なくとも約７２ヶ月間保管された後、１％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、製剤が約－１５℃～約－２５℃で、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間、少なくとも約５４ヶ月間、少なくとも約６０ヶ月間、少なくとも約６６ヶ月間、または少なくとも約７２ヶ月間保管された後、０．１％未満のポリソルベートが分解されている。

いくつかの実施形態において、製剤は、約－８℃～約－８０℃で保管される。いくつかの実施形態において、製剤は、約－２０℃、－４０℃、－７０℃、または－８０℃で保管される。

本明細書の発明により提供される製剤は、可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子などのポリソルベート分解産物を低減するのに有効である。一実施形態において、可視の粒子は、ガラスバイアル内に試料を置き、チンダル光の存在下で試料を回転させることにより観察される。一実施形態において、顕微鏡で見える粒子は、高確度（ＨＩＡＣ）粒子測定器を使用して分析される。いくつかの実施形態において、ＨＲＤＬ－１５０検出器及び１ｍＬのシリンジが備え付けられたＨＩＡＣ９７０３粒子測定器が使用され得る。いくつかの実施形態において、機器の性能は、各測定期間前に、３０００カウント／ｍＬでＮＩＳＴの追跡可能な２μｍのポリスチレンビーズ標準物を用いて実証され得る。いくつかの実施形態において、ＨＩＡＣ機器は、１０ｍＬ／分の流量、０．１ｍＬの風袋量、及び０．４ｍＬの試料体積になるように構成され得る。特定の実施形態において、試料は、０．４ｍＬ分の４回の実行を使用して分析され得、各試料の最初の実行分を、試料の残りによる測定誤差を防止するために捨てた。２、５、１０、１５、及び２５μｍのフィルターサイズが分析のために使用され得る。

いくつかの実施形態において、製剤は、１ｍＬ当たり約１０，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２５０、約１５０、約１００、約５０、または約２５個未満の、直径１．４μ超の粒子を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、１ｍＬ当たり約１０，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２５０、約１５０、約１００、約５０、または約２５個未満の、直径２μ超の粒子を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、１ｍＬ当たり約１２５０、約１５０、約１００、約５０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個未満の、直径５μ超の粒子を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、１ｍＬ当たり約２５０、約１５０、約１００、約５０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個未満の、直径１０μの粒子を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、１ｍＬ当たり約２５０、約１５０、約１００、約５０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個未満の、直径１５μ超の粒子を有する。いくつかの実施形態において、製剤は、１ｍＬ当たり約２５０、約１５０、約１００、約５０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個未満の、直径２５μ超の粒子を有する。

ＩＩＩ．製剤の投与
水性製剤は、ボーラスとしての静脈内投与、またはある期間にわたる連続注入による投与など、筋肉内、腹腔内、脳髄腔内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、硝子体内、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、眼球内、経口、局所、または吸入経路による既知の方法に従って、タンパク質（例えば、抗体）での治療を必要とする哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与される。一実施形態において、水性製剤は、静脈内投与により哺乳動物に投与される。かかる目的のために、製剤は、例えば、シリンジを使用して、または静脈ラインを介して注射され得る。一実施形態において、液体製剤は、皮下投与により哺乳動物に投与される。

タンパク質の適切な投薬量（「治療有効量」）は、例えば、治療される状態、状態の重症度及び経過、タンパク質が予防目的または治療目的のために投与されるか、以前の療法、患者の病歴及びタンパク質への応答、使用されるタンパク質の種類、ならびに主治医の裁量に依存する。タンパク質は、一度にまたは一連の治療にわたって患者に好適に投与され、診断時から任意の時点で患者に投与され得る。タンパク質は、単一治療として、または問題になっている状態の治療に有用な他の薬物もしくは療法とともに投与され得る。「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、治療的処置及び予防的手段または予防手段の両方を指す。治療を必要とする者には、障害を既に有する者、ならびに障害が予防されるべき者が含まれる。「障害」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物を問題になっている障害にかかりやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性障害または疾患を含むが、これらに限定されない、治療から利益を享受するであろう任意の状態である。

薬理学的な意味において、本発明との関連で、タンパク質（例えば、抗体）の「治療有効量」とは、抗体が有効である治療のための障害の予防または治療に有効な量を指す。一般的な提案として、投与されるタンパク質の治療有効量は、例えば、１回以上の投与によるかどうかに関わらず、約０．１～約５０ｍｇ／患者の体重ｋｇの範囲で毎日投与されることになるであろうが、使用されるタンパク質の典型的な範囲は約０．３～約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３～約１５ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。例えば、タンパク質は、１、２、３、もしくは４週間当たり、約１００もしくは４００ｍｇの用量で投与され得るか、または１、２、３、もしくは４週間当たり、約１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１５．０、もしくは２０．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。注入物などの用量は、単回用量で、または複数回用量（例えば、２回用量または３回用量）で投与されてもよい。この療法の進展は、従来の技法により容易に監視される。

ＩＶ．ポリソルベート分解を低減する方法
ポリソルベートを含有する水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法が本明細書に提供され、本方法はシクロデキストリンを製剤に添加することを含む。ポリソルベートを含有する水溶液中の可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子の量を低減する方法も本明細書に提供され、本方法はシクロデキストリンを製剤に添加することを含む。本発明は、シクロデキストリンを製剤に添加することを含む、水溶液中のポリソルベート分解産物を脱凝集させ、可溶化するための方法も含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリペプチド、核酸、脂質、及び／または炭水化物をさらに含む。

ポリビニルプリロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｒｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）（ＰＶＰ）及びポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベートを低減する方法が本明細書に提供される。ポリソルベートを含有する水溶液中の可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子の量を低減する方法も本明細書に提供され、本方法はＰＶＰを製剤に添加することを含む。本発明は、ＰＶＰを製剤に添加することを含む、水溶液中のポリソルベート分解産物を脱凝集させ、可溶化するための方法も含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ポリペプチド、核酸、脂質、及び／または炭水化物をさらに含む。

いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、約０．００１％～約０．４％の範囲、またはこれらの値の間の任意の範囲である。ある特定の実施形態において、ポリソルベートは、約０．００１％～約０．４％、約０．０１％～約０．４％、約０．０１％～約０．３％、約０．０１％～約０．２％、または約０．０１％～約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．００１％、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、または約０．４％のポリソルベートを含む。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート２０である。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート４０である。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート６０である。いくつかの実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート８０である。

いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、約０．５％～約３０％の濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、約１％～約２５％、約５％～約２０％、または約１０％～約１５％の範囲である。さらなる実施形態において、シクロデキストリンは、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、または約３０％の濃度まで添加される。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、約０．５％～約３０％の濃度まで添加される。

いくつかの実施形態において、製剤は、１０％のＨＰ－γシクロデキストリン及び０．０３％のポリソルベート２０を含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、抗ＣＤ２０抗体、１０％のＨＰ－γシクロデキストリン、及び０．０３％のポリソルベート２０を含まない。

いくつかの実施形態において、製剤中の得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの実施形態において、製剤中の得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約５０：１超、約１００：１超、約１５０：１超、約２５０：１超、約７５０～１超、約１０００：１超、または約３０００：１超である。いくつかの実施形態において、製剤中の得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、６７：１～１０００：１ではない。いくつかの実施形態において、製剤中の得られたＰＶＰ対ポリソルベートのｗ／ｗ比は、約３７．５：１超である。いくつかの実施形態において、製剤中の得られたＰＶＰ対ポリソルベートの比は、２５０：１である。

いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン（ＨＰ－α－ＣＤ）、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン（ＨＰ－γ－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、スルホブチルエーテルβ－シクロデキストリン（ＳＢＥ－β－ＣＤ）であり、いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、β－シクロデキストリン（β－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、α－シクロデキストリン（α－ＣＤ）である。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、γ－シクロデキストリン（γ－ＣＤ）である。

いくつかの実施形態において、水性製剤は、１０ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、２５０ｍｇ／ｍＬを上回る濃度である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、３０ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬ、または１００～１５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度である。

いくつかの実施形態において、水性製剤は、抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、（ＶＥＧＦ）；ＣＤ２０；ｏｘ－ＬＤＬ；ｏｘ－ＡｐｏＢ１００；レニン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；ホルモンまたは成長因子受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－５、もしくはニューロトロフィン－６（ＮＴ－３、ＮＴ４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータ；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、及びインターフェロン－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体；ならびに上述のポリペプチドのうちのいずれかの断片を対象とする。いくつかの実施形態において、抗体は、抗ＣＤ２０抗体でない。

いくつかの実施形態において、安定剤、緩衝液、界面活性剤、及び張性剤からなる群から選択される１つ以上の賦形剤が、水性製剤中に含まれる。ｐＨ緩衝溶液中で調製される本発明の方法が行われ得る。本発明の緩衝液は、約ｐＨ４．５～約９．０の範囲のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ４．５～約７．０の範囲、約ｐＨ４．５～約６．６の範囲、約ｐＨ４．５～約６．０の範囲、約ｐＨ４．５～約５．５の範囲、約ｐＨ４．５～約５．０の範囲、約ｐＨ５．０～約７．０の範囲、約ｐＨ５．５～約７．０の範囲、約ｐＨ５．７～約６．８の範囲、約ｐＨ５．８～約６．５の範囲、約ｐＨ５．９～約６．５の範囲、約ｐＨ６．０～約６．５の範囲、または約ｐＨ６．２～約６．５の範囲である。ある特定の実施形態において、液体製剤は、約４．７～約５．２の範囲、約５．０～６．０の範囲、または約５．２～約５．８の範囲のｐＨを有する。本発明のある特定の実施形態において、液体製剤は、６．２または約６．２のｐＨを有する。本発明のある特定の実施形態において、液体製剤は、６．０または約６．０のｐＨを有する。

追加の界面活性剤は任意に、水性製剤に添加され得る。例示的な界面活性剤には、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８など）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。添加される界面活性剤の量は、それが製剤化抗体の凝集を低減させ、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小限に抑え、及び／または吸着を低減させるような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１％～約０．５％、約０．００５％～約０．２％、約０．０１％～約０．１％、約０．０２％～約０．０６％、または約０．０３％～約０．０５％の量で製剤中に存在し得る。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、０．０４％または約０．０４％の量で製剤中に存在する。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、０．０２％または約０．０２％の量で製剤中に存在する。一実施形態において、製剤は、界面活性剤を含まない。

本方法は、水性製剤の張性を調整または維持するために、時に「安定剤」として既知の張性剤の使用を伴い得る。タンパク質及び抗体などの粗大荷電生体分子とともに使用されるとき、張性剤は、それらがアミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間及び分子内相互作用の可能性を低減させ得るため、しばしば「安定剤」として命名される。張性剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１重量％～２５重量％、またはより好ましくは、１重量％～５重量％の任意の量で存在し得る。好ましい張性剤には、多価糖アルコール、好ましくは、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが含まれる。

いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約１℃～約１０℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、分解されている５％未満のポリソルベートをもたらす。いくつかの実施形態において、製剤は、約２℃～約８℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、５％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約４℃～約６℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、分解されている５％未満のポリソルベートをもたらす。

いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約１℃～約１０℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、分解されている１％未満のポリソルベートをもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約２℃～約８℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、分解されている１％未満のポリソルベートをもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約４℃～約６℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、分解された１％未満のポリソルベートをもたらす。

いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約１℃～約１０℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、分解されている０．１％未満のポリソルベートをもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約２℃～約８℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、分解されている０．１％よりのポリソルベートをもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約４℃～約６℃で、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間保管された後、分解されている０．１％未満のポリソルベートをもたらす。

いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約２２℃～約２８℃で、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、または少なくとも約１２ヶ月間保管された後、分解されている５％未満のポリソルベートをもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約２２℃～約２８℃で、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、または少なくとも約１２ヶ月間保管された後、分解されている１％未満のポリソルベートをもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約２２℃～約２８℃で、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、または少なくとも約１２ヶ月間保管された後、分解されている０．１％未満のポリソルベートをもたらす。

いくつかの実施形態において、製剤が約－１５℃～約－２５℃で、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、少なくとも約４８ヶ月間、少なくとも約５４ヶ月間、少なくとも約６０ヶ月間、少なくとも約６６ヶ月間、または少なくとも約７２ヶ月間保管された後、５％未満のポリソルベートが分解されている。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約－１５℃～約－２５℃で、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、少なくとも約４８ヶ月間、少なくとも約５４ヶ月間、少なくとも約６０ヶ月間、少なくとも約６６ヶ月間、または少なくとも約７２ヶ月間保管された後、分解されている１％未満のポリソルベートをもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、製剤が約－１５℃～約－２５℃で、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間、少なくとも約３６ヶ月間、少なくとも約４２ヶ月間、または少なくとも約４８ヶ月間、少なくとも約５４ヶ月間、少なくとも約６０ヶ月間、少なくとも約６６ヶ月間、または少なくとも約７２ヶ月間保管された後、分解されている０．１％未満のポリソルベートをもたらす。

本発明により提供される方法は、顕微鏡で見える粒子及び可視の粒子の数を低減するのに有効である。いくつかの実施形態において、１ｍＬ当たり約１０，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２５０、約１５０、約１００、約５０、または約２５個未満の、直径１．４μ超の粒子が形成される。いくつかの実施形態において、製剤は、１ｍＬ当たり約１０，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２５０、約１５０、約１００、約５０、または約２５個未満の、直径２μ超の粒子を有する。いくつかの実施形態において、１ｍＬ当たり約１２５０、約１５０、約１００、約５０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個未満の、直径５μ超の粒子が形成される。いくつかの実施形態において、１ｍＬ当たり約２５０、約１５０、約１００、約５０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個未満の、直径１０μの粒子が形成される。いくつかの実施形態において、１ｍＬ当たり約２５０、約１５０、約１００、約５０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個未満の、直径１５μ超の粒子が形成される。いくつかの実施形態において、１ｍＬ当たり約２５０、約１５０、約１００、約５０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１個未満の、直径２５μ超の粒子が形成される。

製剤中でポリソルベート分解産物を再可溶化する方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ポリソルベートの添加後、製剤中に存在する１．４μ超の粒子の数は、１００、１０００、２０００、５０００、または１００００倍低減される。いくつかの実施形態において、ポリソルベートの添加後、製剤中に存在する直径２μ超の粒子の数は、１００、１０００、２０００、５０００、または１００００倍低減される。いくつかの実施形態において、ポリソルベートの添加後、製剤中に存在する直径５μ超の粒子の数は、１００、１０００、２０００、５０００、または１００００倍低減される。いくつかの実施形態において、ポリソルベートの添加後、製剤中に存在する直径１０μ超の粒子の数は、１００、１０００、２０００、５０００、または１００００倍低減される。いくつかの実施形態において、ポリソルベートの添加後、製剤中に存在する直径１５μ超の粒子の数は、１００、１０００、２０００、５０００、または１００００倍低減される。いくつかの実施形態において、ポリソルベートの添加後、製剤中に存在する直径２５μ超の粒子の数は、１００、１０００、２０００、５０００、または１００００倍低減される。

Ｖ．製品
本発明の別の実施形態において、本発明の液体製剤を保持し、かつ任意にその使用に関する指示を提供する容器を含む製品が提供される。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、及びシリンジが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。例示的な容器には、３～２０ｃｃの単回使用ガラスバイアルがある。あるいは、複数回投与量製剤の場合、容器は、３～１００ｃｃのガラスバイアルであり得る。容器は、製剤を保持し、容器上のラベルまたは容器に付随するラベルは、使用に関する指示を示し得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用に関する指示を有する添付文書を含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

ＶＩ．キット
本発明の別の実施形態において、ポリソルベート分解を低減するためのキットが提供される。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法によりポリソルベート分解を低減するのに使用するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される製剤のいずれかを含むキットが提供される。一実施形態において、かかるキットは、治療用ペプチドまたは抗体の水性製剤、及び水性製剤に添加され得るシクロデキストリンの溶液の容器を含み、シクロデキストリン対ポリソルベートの比は、３７．５：１超である。一実施形態において、かかるキットは、治療用ペプチドまたは抗体の水性製剤、及び水性製剤に添加され得るポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の溶液の容器を含み、ＰＶＰ対ポリソルベートの比は、３７．５：１超である。

本明細書は、当業者が本発明を実践することを可能にするのに十分なものであるとみなされる。本明細書に示され、かつ記載される修正に加えて、本発明の様々な修正が前述の記述から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態が例証のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。

材料及び方法
材料
ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）を、ＣａｖｉｔｒｏｎＷ７ＨＰ５ＰｈａｒｍａとしてＡｓｈｌａｎｄＩｎｃ．（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）から得た。スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン（ＳＢＥ－β－ＣＤ）を、ＣａｐｔｉｓｏｌとしてＬｉｇａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。ヒドロキシプロピル－アルファ－シクロデキストリン（ＨＰ－α－ＣＤ）、ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン（ＨＰ－γ－ＣＤ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）、及びメチオニンをＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から得た。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を、ＫｏｌｌｉｄｏｎＰｏｖｉｄｏｎｅＫ－１５７としてＳｐｅｃｔｒｕｍＣｈｅｍｉｃａｌ（Ｇａｒｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。ポリソルベート２０（ＰＳ２０）をＣｒｏｄａＩｎｃ．（ＮｅｗＣａｓｔｌｅ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）から得た。ブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｓｐ．由来のリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）、ウサギ肝臓エステラーゼ（ＲＬＥ）、及び２，２′－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）をＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から得た。

ＨＩＡＣによる顕微鏡で見える粒子数の決定
ＨＲＤＬ－１５０検出器及び１ｍＬのシリンジが備え付けられたＨＩＡＣ９７０３粒子測定器を使用して、顕微鏡で見える粒子を測定した。各測定期間前に、３０００カウント／ｍＬでＮＩＳＴの追跡可能な２μｍのポリスチレンビーズ標準物を用いて、機器の性能を実証した。ＨＩＡＣ機器を、１０ｍＬ／分の流量、０．１ｍＬの風袋量、及び０．４ｍＬの試料体積になるように構成した。試料を０．４ｍＬ分の４回の実行を使用して分析し、各試料の最初の実行分を、試料の残りによる測定誤差を防止するために捨てた。結果を、１．４、２、５、１０、１５、及び２５、５０μｍの分析フィルターサイズの平均値として報告した。

ポリソルベート濃度の決定
蒸発光散乱検出（ＲＰ－ＥＬＳＤ）を使用する、逆相超高性能液体クロマトグラフィーを使用してポリソルベート濃度を決定した。ＷａｔｅｒｓＯａｓｉｓＭＡＸカートリッジカラム（２０×２．１ｍｍ、３０μｍの粒子サイズ）で充填されたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズの高性能液体クロマトグラフィー系（ＨＰＬＣ）を使用して、試料を分析した。カラムフロースルーを廃棄または１００℃に設定したＶａｒｉａｎ３８０－ＬＣ蒸発性光散乱検出器のいずれかに誘導する切り替え弁を用いてＨＰＬＣ系を設定した。移動相は、水中の２％のギ酸（ポンプＡ）及びイソプロパノール中の２％のギ酸（ポンプＢ）から構成された。ポンプ勾配は、平衡化の間１０％ポンプＢで均一濃度、１分間２０％ポンプＢに対して直線状、２．４分間２０％ポンプＢで均一濃度、０．１分間１００％ポンプＢに対して直線状、１．１分間１００％ポンプＢで均一濃度、０．１分間１０％ポンプＢに対して直線状、及び１．９分間１０％ポンプＢで最終的に均一濃度であった。切り替え弁は、全ての注入の最初にカラムフロースルーを廃棄に誘導させ、次いで、勾配の最後まで２．４分後に流れを検出器に誘導した。ＰＳ２０の濃度を定量化するために、０％ｗ／ｖ～０．４％ｗ／ｖのＰＳ２０を含有する２０μＬの溶液を注入することにより標準曲線を生成した。カラムを通るＰＳ２０の移動時間に影響を与えた賦形剤に関して、正確な定量化を容易にするために、関連賦形剤を含有するＰＳ２０の標準曲線溶液を分析に含んだ。

Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒによる可視の粒子の撮像
６０度に傾斜したバイアル搬器を有するＳｅｉｄｅｎａｄｅｒＶ９０－Ｔ目視検査ユニット（ＭａｒｋｔＳｃｈｗａｂｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、可視の微粒子に関してバイアルを検査した。保持機内にガラスバイアルを置き、バイアルの底部に直通するチンダル光の存在下で回転させることにより、試料の可視の粒子検査を行った。事前回転（すなわち、急速回転）を最初に行って、液体を攪拌し、懸濁させ、粒子を循環させた。回転及び照明後、動いている粒子及び光の中の粒子により、それらを可視にする粒子の反射を引き起こす（すなわち、チンダル効果）。次いで、拡大レンズを使用して可視の粒子が観察された。Ｓａｍｓｕｎｇ（ｓｅｏｕｌ，ＳｏｕｔｈＫｏｒｅａ）のＧａｌａｘｙ装置を使用して、可視の粒子のビデオ及び写真を得た。

濁度の決定
ＵＶ分光法を使用して、濁度を決定した。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３分光光度計で１ｃｍの経路の長さを有する石英キュベット内の２７９ｎｍ及び３２０ｎｍにおける吸収を記録することにより、各試料のＵＶ吸収を測定した。

タンパク質濃度の決定
Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３分光光度計で１ｃｍの経路の長さを有する石英キュベット内の３４０ｎｍ～３６０ｎｍにおける平均吸収を記録することにより測定された各試料のＵＶ吸収により、タンパク質濃度を測定した。各タンパク質に関して、実験的に決定した吸収率を使用することにより、ＵＶ濃度決定を計算した。適切な緩衝液に対して、測定値は無であった。

実施例１：ポリソルベートの酸化分解
ＰＳ２０を分解すると前述されている２，２’－アゾビスイソブチラミジニウム（ＡＡＰＨ）を使用して、ＰＳ２０の酸化分解を阻害するシクロデキストリンの能力を評価した（Ｂｏｒｉｓｏｖｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０４：１００５－１０１８（２０１５））。ＰＳ２０の酸化を阻害するシクロデキストリンの能力を評価するために、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤまたは１５％（ｗ／ｖ）のスクロースのいずれかを含有する試料を、対照試料（追加の賦形剤を一切含まない）と比較した。４０℃で２４時間、賦形剤不含（対照）、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有する５ｍＭのＡＡＰＨで酸化された試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤによりポリソルベート２０分解を決定した。

図１に示されるように、データは、ＨＰ－β－ＣＤ及びスクロースの両方がＰＳ２０分解の量を減少させることを裏付ける。ＡＡＰＨでインキュベーション後、ＰＳ２０分解において１７．９相対パーセントの減少が対照試料中で観察された。対照的に、１５％（ｗ／ｖ）のスクロース及びＨＰ－β－ＣＤを含有する試料に関して、それぞれ、ＰＳ２０分解において９．８及び３．６パーセントのよりわずかな減少が観察された。

実施例２：ポリソルベート２０の酵素分解におけるＨＰ－β－ＣＤの阻害効果
ＰＳ２０の酵素分解における１５％のＨＰ－β－ＣＤの効果を測定した。追加の賦形剤を含有しないか、１５％のスクロースを含有するか、または１５％のＨＰ－β－ＣＤを含有する、ｐＨ５．５の緩衝液中の０．０２％のＰＳ２０の試料を、室温で、酵素である、ブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ＣａｎｄｉｄａＡｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ（ＣＡＬＢ）、及びウサギ肝臓エステラーゼ（ＲＬＥ）の各々を用いて消化した。ＰＰＬ試料を、１５μｇ／ｍＬの酵素を用いて４．５時間消化した。ＬＰＬ試料を、７０μｇ／ｍＬの酵素を用いて５時間消化した。ＣＡＬＢ試料を、０．１ｍｇ／ｍＬの固定化酵素を用いて１時間消化した。ＲＬＥ試料を、１５μｇ／ｍＬの酵素を用いて５時間消化した。全ての消化を室温で実行した。

８５℃の水浴中で３０分間、熱不活性することにより、ＰＰＬ消化を停止した。ＬＰＬ及びＲＬＥ消化については熱不活性による停止ができなかったため、ＰＳ２０の含有量に関して試料をすぐに分析した。固定化酵素ビーズを濾過することにより、ＣＡＬＢ消化を停止した。粒子形成を可能にするために、ＣＡＬＢ試料を５℃で一晩置いた。ＲＬＥ及びＬＰＬ試料を－２０℃で一晩凍結させて酵素活性を妨げ、次いで、氷上で解凍した直後に粒子分析した。

上述されるように、ＰＳ２０の含有量に関して全ての試料をインライン蒸発性光散乱検出器（Ｖａｒｉａｎ３８０－ＬＣシリーズ）を用いて高性能液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ）により分析した。可視の粒子検査をＳｅｉｄｅｎａｄｅｒ目視検査機器で実行した。顕微鏡で見える粒子分析をＨＩＡＣ９７０３粒子測定器で実行した。

ＣＡＬＢ、ＲＬＥ、及びＬＰＬで処理した試料は、ＰＳ２０において５９．２％～６８．３％の低減を示した（図２）。対照的に、１５％のＨＰ－β－ＣＤを含有する試料は、ＰＳ２０分解に対して著しい阻害を示した。具体的には、これらの試料に関して、ＰＳ２０の濃度は、１４．３％～３７．４％低減した（図２及び表１）。
表１－ＣＡＬＢ、ＬＰＬ、及びＲＬＥによるポリソルベート２０の酵素分解

加えて、ＨＩＡＣデータは、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤが、顕微鏡で見える微粒子（ＳＶＰ）の形成を低減することを裏付ける。複数の酵素（ＣＡＬＢ、ＬＰＬ、及びＲＬＥ）を用いた酵素分解の後、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤが試料中に含まれるとき、全ての粒子サイズ種別（≧２、≧５、≧１０、及び≧２５ミクロンの粒子）に関してＳＶＰ／ｍＬはほとんど観察されなかった。ＬＰＬ及びＲＬＥに関して類似の結果が得られたが、非常にわずかな量の≧１０及び＞≧２５ミクロンの粒子により、≧１０及び≧２５ミクロンの粒子数測定の説明がつかなかった（図３Ａ～３Ｄ）。

これらの発見は、代表的なシクロデキストリン複合体であるＨＰ－β－ＣＤが、複数の酵素によるＰＳ２０の酵素分解を阻害することができることを裏付ける。理論に束縛されるものではないが、これは、シクロデキストリン分子によるＰＳ２０の保護の主要な機構が、シクロデキストリンとポリソルベート分子との間の直接的な相互作用に関与していることを提示し得る。

実施例３：ポリソルベート８０の酵素分解におけるＨＰ－β－ＣＤの阻害効果
ＰＳ８０の酵素分解における１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤの効果を測定した。０％及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するｐＨ５．５の緩衝液中の０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０の試料を、室温で５時間、１５μｇ／ｍＬのブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）を用いて消化した。８５℃の水浴中で３０分間、熱不活性することにより、ＰＰＬ消化を停止した。

ＰＰＬ消化の後、ＲＰ－ＥＬＳＤは、ＰＳ８０においておよそ１９相対パーセントの減少を裏付ける（図４）。対照的に、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有する試料中、ＰＳ８０分解においておよそ４％の減少が観察された。

加えて、ＨＩＡＣデータは、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤが顕微鏡で見える微粒子（ＳＶＰ）の平均（ｎ＝３）量を低減することを裏付ける。ＰＰＬを用いた酵素分解の後、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤが試料中に含まれるとき、全ての粒子サイズ種別（≧１．４、≧２、≧５、≧１０、及び≧２５ミクロンの粒子）に関してＳＶＰ／ｍＬはほとんど観察されなかった（図５Ａ～５Ｆ）。

これらの発見は、代表的なシクロデキストリン複合体であるＨＰ－β－ＣＤが、ＰＳ８０の酵素分解を阻害することができることを裏付ける。これらの結果は、ポリソルベート分解を低減するシクロデキストリンの能力が、粒子形成を低減し、既存の粒子を可溶化するシクロデキストリンの能力が一般に、ポリソルベート分子のクラス（例えば、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ８０など）に適用可能であることを提示する。理論に束縛されるものではないが、これは、シクロデキストリン分子によるポリソルベートの保護の主要な機構が、シクロデキストリンと、全てのポリソルベート分子を含む保存された化学的構造サブユニット（例えば、脂肪酸）との間の直接的な相互作用に関与していることを提示し得る。

実施例４：ポリソルベート２０の酵素分解の反応速度
ＰＳ２０の酵素分解の反応速度を評価するために、０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料中で、室温で１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを用いて試料を消化し、１５％のスクロース、１５％のＨＰ－β－ＣＤ、または１５％のＨＰ－α－ＣＤを、約２５℃で１８０時間インキュベートしたＰＰＬを使用して消化した。上述されるように、ＰＳ２０の含有量に関して全ての試料をインライン蒸発性光散乱検出器（Ｖａｒｉａｎ３８０－ＬＣシリーズ）を用いて高性能液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ）により分析した。顕微鏡で見える粒子分析をＨＩＡＣ９７０３粒子測定器で実行した。

図６中の１５％のスクロースの曲線は、ＰＳ２０分解が、一相指数関数的減衰により説明され得ることを示す。半減期は、３２．９１時間であり、平坦域は、４４％である（図６）。これらの分解反応速度は、その後の研究で２５℃で４．５時間ＰＰＬを使用する、４．５時間の消化モデルの使用を支持する。

実施例５：ポリソルベートの酵素分解におけるシクロデキストリン及び他の賦形剤の阻害効果
ＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、ＨＰ－γ－ＣＤ、ＳＢＥ－β－ＣＤ、ＰＶＰ、ＰＥＧ１５００、スクロース、及びメチオニンを含むいくつかの賦形剤を、酵素加水分解に対してＰＳ２０を保護するそれらの能力に関して試験した。酵素添加後に、最終濃度０．０２％のＰＳ２０を含有する、ｐＨ５．５の緩衝液中の各賦形剤の溶液を調製した。賦形剤溶液中のＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、ＨＰ－γ－ＣＤ、及びＳＢＥ－β－ＣＤの濃度は、１０６ｍＭであった。メチオニン試料は、可溶性の限界により、１０ｍｇ／ｍＬのメチオニンを含有した。残りの賦形剤（ＰＶＰ、ＰＥＧ１５００、スクロース）を、ＨＰ－β－ＣＤのｗ／ｖ％と一致するように１５ｗ／ｖ％まで添加した。試料を、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を用いて消化し、続いて、８５℃で３０分の熱不活性を行った。ＰＳ２０の濃度に関して、インライン蒸発性光散乱検出器を用いて高性能液体クロマトグラフィーを使用して各試料を分析した。次いで、試料を５℃で一晩置いて、粒子を形成させ、前述されるように可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子を分析した。

ＲＰ－ＥＬＳＤの結果は、賦形剤のクラスがＰＳ２０の酵素分解の程度を決定する上で重要であることを裏付ける（図７）。酵素消化の後、対照試料（すなわち、賦形剤不含）は、ＰＳ２０分解において５８パーセントの減少を有した。１５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有する試料に関して、同等の５８パーセントのＰＳ２０の減少が観察された。これらの発見は、スクロースである非環式二糖類（すなわち、スクロース）がＰＳ２０の酵素分解において阻害効果を有さないことを裏付ける。他の賦形剤（例えば、スクロース）の同等の質量が、ポリソルベートの触媒性分解を軽減させないことを裏付ける結果から、シクロデキストリンの阻害効果が質量希釈効果のみによるとは言えない。

同様に、メチオニンを含有する試料は、ＰＳ２０の酵素分解またはＳＶＰ形成において阻害効果を有さなかった（図７及び８Ａ～８Ｄ）。恐らく、メチオニンは、ＰＳ２０の酸化分解を防止するであろうが、ＰＳ２０の酵素分解を防止しないであろう。理論に束縛されるものではないが、この実験において再生されるＰＳ２０分解の機構は、加水分解性であり、ＰＳ２０の酸化分解とは無関係である可能性が高い。

結果は、対照試料に対してＰＥＧがＰＳ２０分解においてわずかな阻害効果を有することを裏付ける。５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ１５００を含有する試料に関して、５１％のＰＳ２０の減少が観察された。

評価されたシクロデキストリン分子（ＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、及びＳＢＥ－β－ＣＤ）の全てが、ＰＳ２０の酵素分解及びＳＶＰ形成において著しい阻害効果を有した（図７及び８Ａ～８Ｄ）。興味深いことに、糖サブユニットの数が、シクロデキストリンによる阻害の程度を決定する上で重要であり得る。例えば、ＨＰ－α－ＣＤ及びＨＰ－β－ＣＤに関して、それぞれ１％及び７％のＰＳ２０の減少が観察された。

さらに研究を行って、ＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、及びＨＰ－γ－ＣＤの重要性を評価して、シクロデキストリンの環サイズの重要性をさらに理解した。図９に示されるデータは、ＨＰ－α－ＣＤ及びＨＰ－β－ＣＤを含有する試料に関して、著しいＰＳ２０分解は観察されなかったが、対照的に、１５％のＨＰ－γ－ＣＤを含有する試料において、ＰＳ２０分解において約８２％の減少が観察されたことを示す。同様に、対照試料（すなわち、賦形剤不含及び１５％のスクロース）において、ＰＳ２０の濃度の著しい減少が観察された（図９）。これらの発見は、よりわずかなシクロデキストリンであるＨＰ－α－ＣＤ（空洞直径：４．７～５．２Å、空洞容積：１７４Å^３）及びＨＰ－β－ＣＤ（空洞直径：６．０～６．５Å、空洞容積：２６２Å^３）が、ＨＰ－γ－ＣＤ（空洞直径：７．５～８．３Å、空洞容積：４７２Å^３）よりもポリソルベート２０分解のより有効な阻害剤であることを裏付ける。

各シクロデキストリンの物理化学的特性よりも、各シクロデキストリンの空洞の寸法及び容積がＰＳ２０の酵素分解の分子阻害剤としてのそれらの有効性を決定し得る。理論に束縛されるものではないが、この発見は、保護機構が、シクロデキストリンとポリソルベート２０の反応性部位との間のホスト－ゲスト複合化に関与し得ることを提示する。

実施例６：シクロデキストリン及び他の賦形剤によるポリソルベート２０の酵素分解に関連する可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子の可溶化
いくつかの賦形剤を、ＰＳ２０の酵素分解の結果として産生される粒子を可溶化するそれらの能力に関して試験した。濃縮したＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、ＨＰ－γ－ＣＤ、ＳＢＥ－β－ＣＤ、ＰＶＰ、ＰＥＧ１５００、スクロース、及びメチオニンの溶液をｐＨ５．５の緩衝液中に三連で調製した。ＰＳ２０の酵素分解による粒子を調製した。ｐＨ５．５の緩衝液中の０．０５％のＰＳ２０の３つの溶液を、室温で４．５時間、３７．５μｇ／ｍＬのＰＰＬを用いて酵素分解し、続いて、８５℃で３０分の熱不活性を行った。分解されたＰＳ２０溶液を５℃で置いて、粒子を結晶化した。

ＰＳ２０由来の粒子の溶解を防止するために、分解されたＰＳ２０溶液中における粒子形成の後、５℃の冷却室で残りの試料の調製を実行した。分解されたＰＳ２０溶液の各々を１１個の分割量に分割し、濃縮賦形剤を各分割量内に添加した。各試料中の賦形剤の最終濃度は以下の通りであった：スクロースが５％、メチオニンが１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＶＰが５％、ＰＥＧ１５００が５％、ＨＰ－β－ＣＤが１５％、ＨＰ－β－ＣＤが５％、ＨＰ－β－ＣＤが０．５％、ＨＰ－α－ＣＤが３５．５ｍＭ、ＨＰ－γ－ＣＤが３５．５ｍＭ、及びＳＢＥ－β－ＣＤが３５．５ｍＭ。各賦形剤の添加の後、試料を５℃で一晩置いた。翌日、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ目視検査機器で可視の粒子に関してバイアルを検査した。ＨＩＡＣ９７０３粒子測定器を使用して顕微鏡で見える粒子数を測定した。

結果は、対照及び他の賦形剤試料に対して、シクロデキストリン（ＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、及びＨＰ－γ－ＣＤ）がＳＶＰの量を著しく低減できたことを裏付ける（図１０Ａ及び１０Ｂ）。これらの結果は、ポリソルベートの酵素分解を防止することに加えて、シクロデキストリンは、ポリソルベート２０の酵素消化により生じるＰＳ２０分解物を可溶化し得ることも確立する。

加えて、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤの添加の直前及び直後に写真を撮影した。写真により、１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤの添加の前（図１１Ａ）及び後（図１１Ｂ）の、ＰＳ２０関連の可視の粒子の可溶化が描写される。可視の粒子がすぐに可溶化されたことを写真が写し出したことにより、シクロデキストリンがＰＳ２０分解に伴う可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子の可溶性を増加し得るという有力な証拠が提供される。

実施例７：シクロデキストリンによるポリソルベート２０の酸化分解に関連する可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子の可溶化
ＨＰ－β－ＣＤの異なる濃度を、ＰＳ２０の酸化分解の結果として産生される粒子を可溶化するそれらの能力に関して試験した。濃縮したＨＰ－β－ＣＤの溶液をｐＨ５．５の緩衝液中に三連で調製した。０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ２０を含有するタンパク質不含試料を５℃で２７ヶ月間保管すると、ＰＳ２０の酸化分解、ならびにＰＳ２０分解産物に関連する可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子の形成がもたらされた。分解されたＰＳ２０溶液の各々を３個の分割量に分割し、濃縮賦形剤を各分割量内に添加した。各試料中の賦形剤の最終濃度は以下の通りであった：ＨＰ－β－ＣＤ（対照）が０％（ｗ／ｖ）、ＨＰ－β－ＣＤが５％（ｗ／ｖ）、及びＨＰ－β－ＣＤが１５％（ｗ／ｖ）。ＨＰ－β－ＣＤ濃度を調整した後、試料を５℃で一晩置いた。翌日、ＨＩＡＣ９７０３粒子測定器を使用して顕微鏡で見える粒子数を測定した。

ＳＶＰの再可溶化における０％、５％、及び１５％（ｗ／ｖ）の濃度のＨＰ－β－ＣＤの効果を試験した。結果は、対照試料（０％のＨＰ－β－ＣＤ）に対して、ＨＰ－β－ＣＤを含有する試料中のＳＶＰの著しい低減があったことを裏付ける。図１２Ａ～１２Ｆに示されるように、１５％のＨＰ－β－ＣＤが１．４ミクロン以上の粒子を効果的に再可溶化する一方で、５％のＨＰ－β－ＣＤは、２ミクロン以上の粒子を効果的に再可溶化する。

これらの結果は、ポリソルベートの酵素分解を防止すること及びポリソルベート２０の酵素消化により生じるＰＳ２０分解物を可溶化することに加えて、シクロデキストリンは、ポリソルベート２０の酸化消化により生じるＰＳ２０分解産物を可溶化し得ることも確立する。

実施例８：ＰＳ２０分解におけるＨＰ－β－ＣＤ濃度及びＨＰ－β－ＣＤ：ＰＳ２０の比の効果
ＰＳ２０分解におけるＨＰ－β－ＣＤ濃度の効果を決定するために、０．００１、０．０１、０．１、１、５、または１５％のＰＳ２０を含有する試料を４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬを使用して消化した。図１３に示されるように、ＨＰ－β－ＣＤの量が増加すると、ＰＳ２０分解が低減する。

ＰＳ２０の酵素分解における異なるＰＳ２０の濃度でのＨＰ－β－ＣＤ濃度の効果を評定して、ＰＳ２０の酵素分解の阻害に最適な濃度を特定した。ＰＳ２０分解のＨＰ－β－ＣＤ濃度への依存性を評価するために、様々なＰＳ２０の濃度で異なるＨＰ－β－ＣＤ濃度を含有する三連の試料に関して、ＲＰ－ＥＬＳＤを使用してＰＳ２０含有量を決定した。０．００５％（図１４Ａ）、０．０２％（図１４Ｂ）、０．１％（図１４Ｃ）、及び０．４％（図１４Ｄ）のＰＳ２０を含有する試料を、０％、つまり賦形剤不含（対照）、０、０．５、５、及び１５％（ｗ／ｖ）のＨＰ－β－ＣＤを含有するタンパク質不含試料中で、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を使用して消化した。ＰＳ２０の１ｍｇ当たり７５ｍｇのＰＰＬの比でＰＰＬを処理溶液の各々に添加し、同等の体積の緩衝液を対照溶液に添加して、酵素分解におけるＨＰ－β－ＣＤ対ポリソルベートの比の効果を決定した。８５℃の水浴中で３０分間、熱不活性することにより、消化を停止した。上述されるように、ＰＳ２０の濃度に関して、インライン蒸発性光散乱検出器を用いて高性能液体クロマトグラフィーを使用して各試料を分析した。次いで、試料を５℃で一晩置いて、粒子を形成させ、上述されるような可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子の分析の間、氷上に置いた。
表２－ＨＰ－β－ＣＤ対ＰＳ２０の比

ＰＳ２０の酵素分解の阻害を完了させるために必要とされるシクロデキストリンの量は、ＰＳ２０の濃度による（図１３及び１４Ａ～Ｄ）。より低いＰＳ２０の濃度（例えば、０．００５％のＰＳ２０（図１４Ａ）において、ＰＳ２０分解を完全に阻害するために、必要とされるＨＰ－β－ＣＤはわずか０．５％である一方で、０．１％のＰＳ２０を含有する試料に対してはＨＰ－β－ＣＤは１５％必要とされる（図１４Ｃ）。同様に、直径２、５、または１０μ超の顕微鏡で見える粒子の形成は、シクロデキストリン対ポリソルベートの比による。０．０２％のＰＳ２０を含有する試料は、顕微鏡で見える粒子の形成を部分的に阻害するために０．５％のＨＰ－β－ＣＤを、及び顕微鏡で見える粒子の形成を完全に阻害するために１５％のＨＰ－β－ＣＤを必要とした（図１５Ａ～１５Ｃ）

これらの結果は、ＨＰ－β－ＣＤ対ＰＳ２０の比（ｗ／ｗ）との関連で説明され得る（図１６及び表２）。ＰＳ２０データは、十分なＨＰ－β－ＣＤ：ＰＳ２０（≧３７．５ｗ／ｗ）が、ＰＳ２０の酵素分解を阻害するために必要とされることを裏付ける（表２）。結果は、ＨＰ－β－ＣＤ対ＰＳ２０の比が、ＰＳ２０及びＨＰ－β－ＣＤの広義の濃度範囲にわたってＰＳ２０分解を決定する上で重要であることを提示する。

結果は、ＨＰ－β－ＣＤによるＰＳ２０分解の阻害に可能性のある機構も明確にする。この場合、阻害剤（すなわち、ＨＰ－β－ＣＤ）の濃度が固定基材（すなわち、ＰＳ２０）の濃度で増加するために、ＰＳ２０分解の量は、Ｓ字状に異なる（図１３）。故に、理論に束縛されるものではないが、シクロデキストリン濃度が増加すると、溶液中の遊離基材濃度が効果的に低減され得、ＰＳ２０分解の速度が減少する。あるいは、ＰＳ２０の分解速度を基材－阻害剤複合体により阻害することが可能である。

実施例９：抗体保管条件下でのポリソルベート分解
ＰＳ２０の酵素分解を減少させるシクロデキストリンの能力における、様々なタンパク質分子クラス（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、単一Ｆａｂ抗体（ｓＦＡｂ）、及び二重特異性抗体（ＢｓＡｂ））の影響を評定した。ｍＡｂ、ｓＦＡｂ、及びＢｓＡｂ原薬試料を、それらの未変性製剤中に提供した。試料を透析し、０．０２％のＰＳ２０を有するｐＨ５．５で２０ｍＭのヒスチジンアセテートの標的製剤に条件付けて、２０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度になるようにした。対照試料を、２０ｍＭのヒスチジンアセテート、ｐＨ５．５、０．０２％のＰＳ２０を含有するように調製した。ｍＡｂ、ｓＦＡｂ、ＢｓＡｂ、及び対照試料の各々を部分分割し、異なる量（０％、５％、及び１５％）のＨＰβＣＤを含有するように条件付けた緩衝液を使用して調整した。試料を、室温で４．５時間、１５μｇ／ｍＬのＰＰＬ酵素を用いて消化し、続いて、８５℃で３０分の熱不活性を行った。ＰＳ２０の濃度に関して、インライン蒸発性光散乱検出器を用いて高性能液体クロマトグラフィーを使用して各試料を分析した。次いで、試料を５℃で一晩置いて、粒子を形成させ、上述されるように可視の粒子及び顕微鏡で見える粒子を分析した。

結果は、０％のＨＰβＣＤを含有する各試料が異なる量のＰＳ２０分解を有することを裏付ける。結果は、タンパク質を含有する０％のＨＰβＣＤ試料（図１７Ｂ～Ｄ）が、対照試料（図１７Ａ）に対してより高量のＰＳ２０分解を有することを示す。タンパク質がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）またはＥ．Ｃｏｌｉ細胞内で発現されることにより、タンパク質試料は、ＰＳ２０分解の総量に寄与する他の不純物（すなわち、リパーゼなど）を含有し得る。

０％のＨＰβＣＤタンパク質含有試料が、より高量のＰＳ２０分解を有するように観察されても、結果は、５％及び１５％のＨＰβＣＤを含有する試料中で比較可能な量のＰＳ２０分解が観察されることを裏付ける。これらの結果は、ＨＰβＣＤが、評価された全ての分子形式に関して、それらがＰＳ２０を触媒性分解する異なる量の不純物を有し得ても、ＰＳ２０の触媒性分解を軽減する上で同等に有効であることを裏付ける（図１７Ａ～Ｄ）。これは、タンパク質分子及びそれらの未変性不純物プロファイルの存在が、ＰＳ２０分解を軽減するために必要であるシクロデキストリン対タンパク質の比に著しく影響を与えないことを確立する。理論に束縛されるものではないが、この発見は、触媒性阻害の機構が、ポリソルベートを分解する酵素ではなく、ＰＳ２０と直接的に相互作用するシクロデキストリン分子に関与していることを提示する。そうでなければ、ポリソルベートを分解する追加の酵素を含有するタンパク質含有試料は、対照と比較してＰＳ２０分解を軽減するためにより多くのＨＰβＣＤを必要とするであろう。故に、本明細書に記載のシクロデキストリン対ＰＳ２０の比は、異なるタンパク質分子及び不純物プロファイルを含有する幅広い範囲の製剤に広義に適用されるはずである。

結論
行われた研究は、ポリソルベート（ＰＳ２０及びＰＳ８０）の酵素分解及び酸化分解を阻害するシクロデキストリンの能力を示す。結果は、ＰＶＰ及びシクロデキストリン（すなわち、ＨＰ－α－ＣＤ、ＨＰ－β－ＣＤ、ＨＰ－γ－ＣＤ、ＳＢＥ－β－ＣＤ）がＰＳ２０の酵素分解を防止できたことを裏付ける。さらなる実験は、ＨＰ－β－ＣＤが複数の酵素（すなわち、ＣＡＬＢ、ＲＬＥ、ＬＰＬ、及びＰＬＬ）の存在下でポリソルベートを保護していることを裏付ける。理論に束縛されるものではないが、阻害機構は、阻害剤（すなわち、シクロデキストリン）と、基材（すなわち、ポリソルベート）との間の相互作用に関与し得る。包接複合体形成は、遊離基材の濃度を低減し得、かつ包接複合体は、活性部位及び基材との相互作用を直接立体的に阻害もし得る。加えて、濃度研究は、ＰＳ２０の酵素分解の完全な阻害を提供するのに必要である最適な範囲のＨＰ－β－ＣＤ対ＰＳ２０の比（≧３７．５ｗ／ｗ）があることを確立する。

ＰＳ２０の酵素分解を防止することに加えて、結果は、シクロデキストリンが顕微鏡で見える粒子及び可視の粒子の量を効果的に低減し得ることを裏付ける。この様式で、シクロデキストリンは、溶液中の顕微鏡で見える粒子及び可視の粒子を脱凝集させ、溶解する。粒子の形成を効果的に防止することに加えて、結果は、シクロデキストリンが、ポリソルベート分解に関連する既存の粒子を効果的に可溶化し得ることも裏付ける。恐らく、シクロデキストリンは、ポリソルベート分解の産物である遊離脂肪酸の可溶性も増加させる。

この研究による発見は、広範囲にわたる実用的意義を有する。結果は、シクロデキストリンを含有する製剤がポリソルベートの酵素分解を防止するために使用され得るという包括的な証拠を提供する。加えて、シクロデキストリンは、酸化分解及び酵素分解の両方によるポリソルベート分解に伴う遊離脂肪酸を可溶化するために使用され得る。故に、シクロデキストリンは、ポリソルベート分解に伴う分解物及び粒子を溶解するための薬品の希釈剤または再構成緩衝液としても有用であり得る。

Claims

ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法であって、前記方法が、シクロデキストリンを前記製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比が、３７．５：１超且つ６７：１未満であり、前記製剤は、ポリペプチドをさらに含む、前記方法。
ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法であって、前記方法が、シクロデキストリンを前記製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比が、３７．５：１超且つ６７：１未満であり、得られた製剤が、０．００５％－０．４％（ｗ／ｖ）のポリソルベートを含む、前記方法。
ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解を低減する方法であって、前記方法が、０．０１％～３０％の濃度までシクロデキストリンを前記製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比が、３７．５：１超且つ６７：１未満であり、前記製剤は、ポリペプチドをさらに含む、前記方法。
ポリソルベートを含む水性製剤中の顕微鏡で見える粒子及び可視の粒子の量を低減する方法であって、シクロデキストリンを前記製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比が、３７．５：１超且つ６７：１未満であり、前記製剤は、ポリペプチドをさらに含む、前記方法。
ポリソルベートを含む水性製剤中のポリソルベート分解産物を脱凝集し、可溶化する方法であって、前記方法が、シクロデキストリンを前記製剤に添加することを含み、得られたシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比が、３７．５：１超且つ６７：１未満であり、前記製剤は、ポリペプチドをさらに含む、前記方法。
前記ポリソルベートが、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記シクロデキストリンが、ＨＰ－βシクロデキストリン、ＨＰ－γシクロデキストリン、またはスルホブチルエーテルβ－シクロデキストリンである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤中のポリソルベートの濃度が、０．０１％（ｗ／ｖ）から０．４％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤中のポリソルベートの濃度が、０．０１％（ｗ／ｖ）から０．１％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤中のポリソルベートの濃度が、０．０２％（ｗ／ｖ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤中のシクロデキストリンの濃度が、０．５～３０％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤中のシクロデキストリンの濃度が、１５％（ｗ／ｖ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
１ｍＬ当たり１，０００、７５０、５００、２５０、１５０、１００、５０、または２５個未満の、直径２ミクロン超のポリソルベート粒子が形成される、請求項１～４または６～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤が、２℃～８℃で、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、または少なくとも２４ヶ月間安定している、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤が、１℃～１０℃で少なくとも４８ヶ月間安定している、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤が、２℃～８℃で少なくとも４８ヶ月間安定している、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、抗体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である、請求項１７に記載の方法。
前記製剤中のポリペプチド濃度が、１ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤が、４．５～７．０、４．５～６．０又は６．０のｐＨを有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤が、対象への投与に好適な薬学的製剤である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
前記製剤が、対象への静脈内、皮下、筋肉内、または硝子体内投与に好適な薬学的製剤である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
ポリソルベートと、シクロデキストリンと、を含む水性製剤であって、前記製剤中の初期のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比が、少なくとも３７．５：１であり且つ６７：１未満であり、前記製剤は、ポリペプチドをさらに含み、前記製剤中のポリソルベートの量が、１℃～１０℃で少なくとも６ヶ月間保管された後の前記製剤において、ポリソルベートの初期量の少なくとも８０％である、前記製剤。
ポリソルベートと、シクロデキストリンと、を含む水性製剤であって、前記製剤中のシクロデキストリン対ポリソルベートのｗ／ｗ比が、少なくとも３７．５：１であり且つ６７：１未満であり、前記製剤は、ポリペプチドをさらに含み、１℃～１０℃で少なくとも６ヶ月間保管された後に、１％未満の前記ポリソルベートが分解されている、前記製剤。
前記シクロデキストリンが、ＨＰ－βシクロデキストリン、ＨＰ－γシクロデキストリン、またはスルホブチルエーテルβ－シクロデキストリンである、請求項２３または２４に記載の製剤。
前記製剤中のポリソルベートの濃度が、０．０１％から０．４％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤中のポリソルベートの濃度が、０．０１％（ｗ／ｖ）から０．１％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤中のポリソルベートの濃度が、０．０２％（ｗ／ｖ）である、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤中のシクロデキストリンの濃度が、０．５～３０％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤中のシクロデキストリンの濃度が、１５％（ｗ／ｖ）である、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の製剤。
１ｍＬ当たり１，０００、７５０、５００、２５０、１５０、１００、５０、または２５個未満の、直径２ミクロン超のポリソルベート粒子が形成される、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の製剤。
前記ポリペプチドが、抗体である、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の製剤。
前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または抗体断片である、請求項３２に記載の製剤。
前記製剤中のポリペプチド濃度が、１ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬである、請求項２３～３３のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤が、２℃～８℃で少なくとも６ヶ月間安定している、請求項２３～３４のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤が、１℃～１０℃で少なくとも４８ヶ月間安定している、請求項２３～３５のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤が、２℃～８℃で少なくとも４８ヶ月間安定している、請求項２３～３６のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤が、４．５～７．０、４．５～６．０又は６．０のｐＨを有する、請求項２３～３７のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤が、対象への投与に好適な薬学的製剤である、請求項２３～３８のいずれか一項に記載の製剤。
前記製剤が、対象への静脈内、皮下、筋肉内、または硝子体内投与に好適な薬学的製剤である、請求項２３～３９のいずれか一項に記載の製剤。