DE3789333T2 - Menschlicher monoklonaler Antikörper gegen Lymphadenopathie assozierten Virus. - Google Patents
Menschlicher monoklonaler Antikörper gegen Lymphadenopathie assozierten Virus.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Anwendung immunologischer Techniken, um neue Materialien zu schaffen, die beim Diagnostizieren und Behandeln von Virusinfektionen nützlich sind sowie in biochemischen und histologischen Untersuchungen nützlich sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung und Charakterisierung von menschlichen monoklonalen Antikörpern, die fähig sind, mit dem Lymphadenopathie assoziierten Virus, LAV/HTLV-III, zu reagieren.
- Das erworbene Immundefektsyndrom (AIDS) ist eine übertragbare Schwäche der Zellimmunität, die durch opportunistische Infektionen und gewisse seltene bösartige Veränderungen gekennzeichnet ist. Die Hauptrisikogruppen für AIDS umfassen homosexuell aktive Männer, Drogenabhängige bei intravenöser Drogenanwendung, Empfänger von Transfusionen und Blutprodukten und die heterosexuellen Partner und Kinder von Hochrisikopersonen, was die Beteiligung eines infektiösen Agens nahelegt, das durch intimen Kontakt oder Blutprodukte übertragen wird.
- Erkenntnisse aus jüngerer Zeit zeigen, daß das für die Krankheitsübertragung verantwortliche infektiöse Agens ein neuer lymphotroper Retrovirus ist, der als Lymphadenopathie assoziierter Virus (LAV) (Barre-Sinoussi et al. Science 225 : 840 (1984)) bekannt ist und menschlicher lymphotroper T-Zellen Virus (HTLV-III), AIDS-assoziierter Retrovirus (ARV), Immundefekt assoziierter Virus (IDAV) oder menschlicher Immunschwächevirus (HIV) genannt wird. Noch neuere Daten zeigen, daß LAV, HTLV-III, ARV und IDAV einige wichtige Kennzeichen gemeinsam haben, darunter eine wesentliche Nukleotidhomologie (Wain-Hobson et al., Cell 40 : 9 (1985); Muesing et al., Nature 313 : 450 (1985); Sanchez-Pescador et al., Science 227 : 484 (1985)) und als Isolate desselben Virus zu betrachten sind, obwohl eine Wahrscheinlichkeit besteht, daß unter den Virusisolaten Variationen von Stamm zu Stamm existieren. Außer, daß sie wesentliche Nukleotidhomologie zeigen sind die Isolate im Hinblick auf Morphologie, Cytopathologie, Bedingungen für optimale Aktivität der reversen Transkriptase und mindestens einige antigene Eigenschaften ähnlich (Levy, Supra; Schupbach et al., Science 224 : 503 (1984)).
- Die Übertragbarkeit des AIDS-Virus durch Blutprodukte (Blut, Blutserum, Blutplasma und Fraktionen davon) macht es wichtig, die Blutprodukte zu überprüfen, um zu bestimmen, ob Spender dem Virus ausgesetzt waren und potentielle Träger sind. Verschiedene Produkte, die zerstörtes Virusantigen in ELISA- Formaten verwenden, werden derzeit zu diesem Zweck auf den Markt gebracht. Personen, deren Blut Antikörper auf LAV/HTLV-III enthält, werden als "seropositiv" bezeichnet. Blut dieser sero-positiven Spender kann nach Bestimmung aus dem Blutvorrat eliminiert werden, was dabei hilft, die Ausbreitung der Krankheit zu verhindern.
- Wenn eine Antikörperreaktion auf LAV/HTLV-III fehlt, ist das nicht immer ein Anzeichen für ein Fehlen der Infektionsfähigkeit von Blutprodukten. Es wurde Virus aus Blutproben kultiviert, die von Personen entnommen wurden, die als antikörpernegativ bestimmt waren und keine Zeichen klinischer Manifestationen zeigten (Salahuddin, S. Z., et al., Lancet ii:1418 (1984)). In der Technik besteht ein Bedarf für ein Assaysystem zum Einfangen von Antigenen, um zu verhindern, daß diese infektiösen, antikörpernegativen Blutprodukte in die Blutversorgung geraten. Monoklonale Antikörper, die mit hauptsächlichen Viruskomponenten reaktiv sind, können die Basis für ein solches Antigennachweissystem bilden.
- In jüngster Zeit wurde über monoklonale Antikörper von Mäusen berichtet, die mit dem p24 Kernprotein von LAV/HTLV-III und seinen Proteinvorstufen reagieren und über einen Antikörper von Mäusen, der mit dem Hüllenglycoprotein gp41 reagiert. (di Marzo Veronese et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 5199 (1985); di Marzo Veronese et al., Science 229 : 1402 (1985)). Chassagne et al. (J. Immunol. 136 : 1442 (1986)) haben ebenfalls einen für p24 und seine Vorstufen spezifischen Antikörper von Mäusen beschrieben. Diese Antikörper wurden experimentell verwendet, um die Behandlung von Kernproteinvorstufen in infizierten Zellen zu den endgültigen Virusproteinen zu verfolgen.
- Obwohl es möglich ist, antikörperpositive Personen nachzuweisen und es möglich sein kann, jene nachzuweisen, die antigenpositiv sind, wurde bislang noch keine wirksame Behandlung oder Vorsorgemaßnahme für die Krankheit gefunden. Da die Ausbreitung von AIDS außergewöhnliche, wenn nicht epidemische Ausmaße erreicht und das Maß, in dem der Virus übertragen werden kann, noch in Frage steht, gibt es im Fachbereich einen Bedarf für eine Zusammensetzung mit prophylaktischen und/oder therapeutischen Wirkungen.
- Kurz gesagt, offenbart die vorliegende Erfindung (1) menschliche monoklonale Antikörper, die fähig sind, mit einer antigenen Determinante von LAV/HTLV-III zu reagieren; (2) immortalisierte Zell-Linien, die diese menschlichen monoklonalen Antikörper erzeugen; und (3) Verfahren zur Anwendung dieser menschlichen Monoklonalen, zum Beispiel beim Bestimmen des Vorhandenseins von LAV/HTLV-III in biologischen Proben. Ein weiteres hierin beschriebenes Verfahren umfaßt eine Vorgehensweise zum Trennen spezifischer antigener Determinanten von LAV/HTLV-III aus einer Mischung. Ferner werden pharmazeutische Zusammensetzungen offenbart, die eine therapeutisch wirksame Menge eines menschlichen monoklonalen Antikörpers aufweisen, der mit einer antigenen Determinante von LAV/HTLV-III reagieren kann und einen physiologisch akzeptablen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Zusammensetzungen mit dieser Charakteristik sind insbesondere nützlich bei einem Verfahren zur deutlichen Reduzierung der Infektionsfähigkeit von LAV/HTLV-III in warmblütigen Tieren.
- Wie oben ausgeführt, stellt ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von LAV/HTLV-III in einer biologischen Probe zur Verfügung. Das Verfahren umfaßt allgemein (a) Inkubieren eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der fähig ist, mit einer antigenen Determinante von LAV/HTLV-III bei einer biologischen Probe zu reagieren; und (b) Nachweis des Vorhandenseins von zwischen dem monoklonalen Antikörper und der biologischen Probe gebildeten Immunkomplexen und davon Bestimmen des Vorhandenseins von LAV/HTLV-III. Es können markierte oder unmarkierte Antikörper verwendet werden. Das Verfahren ist zum Nachweis von LAV/HTLV-III in einer breiten Vielfalt von biologischen Proben anwendbar einschließlich Körpersekretionen, Körperflüssigkeiten und Gewebeproben.
- Einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt, wie oben angemerkt, ein Verfahren zum Trennen von spezifischen antigenen Determinanten von LAV/HTLV-III aus einer Mischung, die antigene Determinanten von LAV/HTLV-III enthält, zur Verfügung. Das Verfahren umfaßt (a) Immobilisieren eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der zur Reaktion mit den spezifischen antigenen Determinanten auf einem Substrat fähig ist; (b) in Kontakt bringen der Mischung, die die antigenen Determinanten von LAV/HTLV-III enthält, mit dem immobilisierten Antikörper unter geeigneten Bedingungen, in der Weise, daß Immunkomplexe zwischen dem Antikörper und den spezifischen antigenen Determinanten gebildet werden; und (c) Abtrennen der Immunkomplexe aus der Mischung.
- Andere Aspekte der Erfindung werden mit Bezug zu der folgenden ausführlichen Beschreibung und begleitenden Zeichnungen ersichtlich.
- Fig. 1 stellt den Ursprung der LAV-Insertionen in pENV-3 dar.
- Fig. 2 stellt die Aminosäuresequenz von ENV-3 dar.
- Bevor die Erfindung weiter ausgeführt wird, ist es zu ihrem Verständnis hilfreich, Definitionen von einigen nachfolgend verwendeten Ausdrücken anzuführen.
- ein menschlicher T-lymphotroper Retrovirus. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein Virus als derselbe oder äquivalent zu LAV betrachtet, wenn er im wesentlichen die folgenden Kriterien erfüllt:
- (a) der Virus ist tropisch für T-Lymphocyten, insbesondere T-Helferzellen (CD4+, gemäß der in Bernard et al., Hrsg., Leucocyte Typing, New York: Springer Verlag (1984) definierten internationalen Nomenklatur);
- (b) der Virus ist cytopathisch für infizierte CD4+-Zellen (anstatt transformierend wie es HTLV-I und II sind);
- (c) der Virus kodiert eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase), die Mg²&spplus;-abhängig ist (optimale Konzentration 5 mM, optimaler pH 7,8, durch Actinomycin D nicht inhibierbar) und kann (dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Primer für reverse Transkription von seinem 3' LTR verwenden;
- (d) der Virus zeigt Banden in einem Sucrosegradienten bei einer Dichte von ungefähr 1,16;
- (e) der Virus kann mit (³H)-Uridin markiert werden;
- (f) der Virus ist durch immunologische und Nukleotidsequenz- Kriterien von Mitgliedern der HTLV-I/II-Familie von Viren unterschieden (durch dieses Kriterium ist HTLV-III nicht als Mitglied der HTLV-I/II-Familie zu betrachten);
- (g) der Virus ist im wesentlichen immunologisch kreuzreaktiv mit Proteinen, die durch gag- und env-Regionen von LAV kodiert sind; und
- (h) der Virus teilt im wesentlichen die Nukleotidhomologie (78-100%) und Aminosäuresequenzhomologie (90-100%) mit LAV.
- Das Human Retrovirus Subcommittee of the International Committee on the Taxonomy of Viruses hat die Bezeichnung menschlicher Immunschwächevirus (HIV) (Human Immundeficiency Virus) empfohlen (Science 232 : 697 (1986)), daher werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, LAV/HTLV-III und HIV als äquivalent betrachtet.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue Hybridzelle für das spezifische Erkennen der Proteine und Proteinvorstufen des menschlichen Immunschwächevirus LAV/HTLV-III zur Verfügung gestellt. Die Subjektzellen besitzen ein identifizierbares Chromosom, in dem die Keimlinien-DNA sich umgeordnet hat, so daß sie für einen Antikörper kodiert, der eine Bindungsstelle für ein Epitop aufweist, das einigen oder allen klinischen menschlichen Immunschwächevirusisolaten gemeinsam ist, aber nicht auf anderen menschlichen Retroviren, wie HTLV-I und HTLV-II, zu finden ist. Diese menschlichen monoklonalen Antikörper können in einer breiten Vielfalt von Methoden, einschließlich Diagnose und Therapie verwendet werden.
- Die Herstellung monoklonaler Antikörper kann durch Immortalisieren der Expression von Nukleinsäuresequenzen, die für Antikörper kodieren, die für ein Epitop auf Antigenen von LAV/HTLV-III spezifisch sind, erreicht werden. Typischerweise werden die monoklonalen Antikörper durch zellgetriebene Transformation von Epstein-Barr-Virus (EBV) von B-Lymphocytenzellen, die von menschlichen Spendern erhalten wurden, die LAV/HTLV-III ausgesetzt sind oder waren, hergestellt. Die so hergestellten Antikörper ausscheidenden Zell-Linien sind als kontinuierlich wachsende Lymphoblastoidzellen charakterisiert, die einen diploiden Karyotyp besitzen, auf nukleares Epstein-Barr-Antigen positiv sind und monoklonale Antikörper entweder des IgG-, IgM-, IgA- oder IgD-Isotyps ausscheiden, einschließlich verschiedener Untertypen wie IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4. Der zellgetriebene Transformationsprozeß selbst ist ausführlich in US-Patent Nr. 4,464,465 beschrieben, das hier durch Bezugnahme eingebracht ist. Die monoklonalen Antikörper können intakt verwendet werden oder als Fragmente, wie als Fv, Fab, F(ab')&sub2;, aber üblicherweise intakt.
- Alternativ können die Antikörper produzierende Zell-Linien durch Zellfusion zwischen in geeigneter Weise mit Wirkstoff markierten menschlichen Myelom-, Mäusemyelom- oder menschlichen Lymphoblastoidzellen mit menschlichen B-Lymphocyten hergestellt werden, so daß sich menschliche Hybridzell-Linien ergeben.
- Die Zell-Linie der vorliegenden Erfindung kann andere Verwendungen finden als für die direkte Herstellung der menschlichen monoklonalen Antikörper. Die Zell-Linie kann mit anderen Zellen fusioniert werden (wie in geeigneter Weise mit Wirkstoff markierten menschlichen Myelom-, Mäusemyelom- oder menschlichen Lymphoblastoidzellen), um Hybridome herzustellen und so die Übertragung von Genen zu ermöglichen, die für die monoklonalen Antikörper kodieren. Alternativ kann die Zell- Linie als Quelle von Chromosomen verwendet werden, die für Immunglobuline kodieren, die isoliert und durch andere Techniken als Fusion auf Zellen übertragen werden können. Außerdem können die Gene, die für die monoklonalen Antikörper kodieren, isoliert und gemäß den Techniken der rekombinanten DNA zur Herstellung des spezifischen Immunglobulins in einer Reihe von Wirten verwendet werden. Insbesondere kann, durch Herstellung von cDNA-Bibliotheken aus Messenger-RNA, ein einzelner DNA-Klon, der für das Immunglobulin kodiert und frei von Introns ist, isoliert und in geeignete prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren eingebracht werden und anschließend in einen Wirt für die endgültige Massenproduktion überführt werden.
- Die Lymphoblastoid- oder Hybridzell-Linien können nach üblichen Techniken geklont und gescreent und Antikörper im Zellüberstand nachgewiesen werden, die zur Bindung an LAV/HTLV- III-Virusproteine, rekombinante Fusionsproteine oder synthetische Peptide fähig sind. Die geeigneten Hybridzell-Linien kann dann in vitro expandiert werden oder zur Produktion von Aszitesflüssigkeit in den Bauchhöhlenraum eines geeigneten Wirts injiziert werden. Dank des Antikörpers der vorliegenden Erfindung, von dem bekannt ist, daß er für den LAV/HTLV-III- Virus spezifisch ist, können die Überstände in Konkurrenz mit den monoklonalen Subjekt-Antikörpern in einem Konkurrenz- Assay gescreent werden. Auf diese Weise können Hybridzellen einfach aus einer Reihe von Quellen ausgehend von der Verfügbarkeit der vorliegenden Antikörper, die für das spezielle Antigen spezifisch sind, hergestellt werden.
- Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind insbesondere wegen ihrer Spezifität für gp41, exprimierte Fusionsproteine und synthetische Antigene von LAV/HTLV-III aus der Hüllenregion nützlich.
- Die monoklonalen Antikörper können auch eine breite Vielfalt von Anwendungen in vitro finden. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper zur Prüfung durch indirekte Immunfluoreszenz verwendet werden, ob Virus in infizierten kultivierten Lymphocyten vorhanden ist. Virusproteine oder Teile von Virusproteinen können aus einem zerstörten gereinigten Viruspräparat oder aus komplexen Mischungen, in denen diese Proteine als Bestandteil enthalten sind, entfernt werden.
- Diese spezifischen Virusproteine können durch Befestigung der monoklonalen Antikörper an einem Trägermaterial wie Polymerrohre, Kugeln, Polysaccharidteilchen oder dergleichen entfernt werden. Befestigungsmethoden sind dem Fachmann bekannt, siehe zum Beispiel Schall und Tenoso, Immunoassays: Clinical Laboratory Techniques for the 1980's: 127 (1980) Alan R. Liss Inc. Mischungen werden mit dem immobilisierten Antikörper unter Bedingungen kombiniert, die erlauben, daß Bindung eintritt. Immunkomplexe werden durch für den Träger geeignete Verfahren vom Rest der Mischung abgetrennt. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Isolierte Virusproteine können dann durch Anwendung von Bedingungen, die für Immunkomplexbildung ungünstig sind, vom Antikörper befreit werden.
- Für diagnostische Zwecke können die monoklonalen Antikörper entweder markiert sein oder unmarkiert sein. Typischerweise sind diagnostische Assays mit dem Nachweis der Bildung eines Komplexes durch die Bindung des monoklonalen Antikörpers an das LAV/HTLV-III-Antigen verbunden. Wenn sie unmarkiert sind, finden die Antikörper in Agglutinations-Assays Verwendung. Außerdem können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (zweiten Antikörpern) verwendet werden, die mit dem monoklonalen Antikörper reagieren, wie für Immunglobulin spezifische Antikörper. Alternativ können die monoklonalen Antikörper direkt markiert werden. Eine breite Vielfalt von Markern können benutzt werden wie Radionuklide, Fluoreszenzmarker, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene) usw. Es sind zahlreiche Arten von Immunassays erhältlich und beispielsweise umfassen einige die in den US-Patenten Nr. 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074 und 4,098,876 beschriebenen, die hier alle durch Bezugnahme eingebracht werden.
- Üblicherweise werden die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in Enzymimmunassays verwendet, wo die Subjekt-Antikörper oder zweite Antikörper einer anderen Spezies an ein Enzym konjugiert werden. Wenn eine LAV/HTLV-III-Antigene enthaltende biologische Probe wie menschliches Blutserum oder Viruszellkulturüberstand mit den Subjekt-Antikörpern kombiniert wird, tritt Bindung zwischen den Antikörpern und den Molekülen auf, die das gewünschte Epitop zeigen. Solche Proteine oder Viruspartikel können dann von den ungebundenen Reaktanten getrennt und ein zweiter Antikörper (mit einem Enzym markiert) zugegeben werden. Danach wird das Vorhandensein des spezifisch an das Antigen gebundenen Antikörper- Enzym-Konjugats bestimmt. Andere übliche, den Fachleuten bekannte Techniken können ebenfalls verwendet werden.
- Es können auch Kits zur Verwendung mit den Subjekt-Antikörpern zum Nachweis von LAV/HTLV-III-Infektion oder für das Vorhandensein von LAV/HTLV-Antigen bereitgestellt werden. Auf diese Weise kann die erfindungsgemäße monoklonale Subjekt- Antikörperzusammensetzung üblicherweise in lyophilisierter Form entweder allein oder in Verbindung mit weiteren für andere Epitope von LAV/HTLV-III spezifischen Antikörpern zur Verfügung gestellt werden. Die Antikörper, die mit einem Marker konjugiert oder unkonjugiert sein können, sind in den Kits mit Puffern wie Tris, Phosphat, Carbonat usw., Stabilisatoren, Bioziden, inerten Proteinen, z. B. Rinderserumalbumin oder dergleichen enthalten. Im allgemeinen sind diese Materialien in weniger als ungefähr 5 Gew.-%, bezogen auf die Menge an aktivem Antikörper, und üblicherweise in einer Gesamtmenge von mindestens ungefähr 0,001 Gew.-%, wiederum bezogen auf die Antikörperkonzentration, vorhanden. Häufig ist es wünschenswert, ein inertes Streckmittel oder ein Vehikel einzubringen, um die Wirkstoffe zu verdünnen, wobei das Vehikel mit von ungefähr 1 bis 99 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung vorhanden sein kann. Wo ein zweiter Antikörper verwendet wird, der zur Bindung an den monoklonalen Antikörper fähig ist, wird dieser üblicherweise in einem getrennten Gefäß vorhanden sein. Der zweite Antikörper ist typischerweise mit einem Marker konjugiert und in analoger Weise wie die oben beschriebenen Antikörperformulierungen formuliert.
- Wie zuvor angegeben ist der Nachweis von Antigen nützlich zur Diagnose einer vorliegenden Infektion durch den LAV/HTLV-III- Virus. Das Vorhandensein des Virus in verschiedenen biologischen Proben kann ebenfalls gezeigt werden. Biologische Proben können, ohne darauf beschränkt zu sein, Blutserum, Speichel, Samenflüssigkeit, Gewebebiopsieproben (Gehirn, Haut, Lymphknoten, Milz usw.), Zellkulturüberstände, zerstörte Virus- und Bakterienexpressionssysteme oder dergleichen umfassen. Das Vorhandensein von Virus wird durch Inkubieren des menschlichen monoklonalen Antikörpers mit der biologischen Probe unter Bedingungen, die für Immunkomplexbildung förderlich sind, gefolgt vom Nachweis der Komplexbildung geprüft. In einer Ausführungsform wird Komplexbildung durch Verwendung eines zweiten zur Bindung an den monoklonalen Antikörper fähigen Antikörpers, der typischerweise mit einem Marker konjugiert und in analoger Weise wie die oben beschriebenen Antikörperformulierungen formuliert ist, nachgewiesen.
- Die Fachleute werden erkennen, daß die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper auch auf zahlreiche weitere Arten Verwendung finden, wie Affinitätschromatographie, Reinigung verschiedener natürlich auftretender LAV/HTLV-III-Antigene sowie von verschiedenen Expressionssystemen exprimiert (d. h. E. coli, Impfstoffe, Hamsterovarienzellen, und andere), histologische Anfärbereagenzien und dergleichen. Siehe allgemein Immunological Methods, Bde. I und II, Hrsg. Lefkovits, I. und Pernis, V., Academic Press, New York (1979 und 1981) und Handbook of Experimental Immunology, Hrsg. Weir, D., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO (1978), die beide hier durch Bezugnahme eingebracht werden.
- Therapeutisch sind Antikörper mit geeigneten biologischen Eigenschaften direkt als therapeutische Mittel nützlich. Alternativ können die Antikörper an ein Toxin gebunden sein, um ein Immuntoxin zu bilden oder an ein radioaktives Material oder Arzneimittel, um ein Radiopharmazeutikum oder Pharmazeutikum zu bilden. Verfahren zur Herstellung von Immuntoxinen und Radiopharmazeutika aus Antikörpern sind bekannt (siehe zum Beispiel Cancer Treatment Reports 68 : 317 (1984)). Die konjugierten Antikörper sind mit physiologisch akzeptablen Trägern gemischt, wie sterilem Wasser, Salzlösung, gepufferter Salzlösung. Es können auch Adjuvantien verwendet werden wie Aluminiumhydroxid.
- Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden Experimentbeschreibungen ersichtlich, die die Erfindung durch Beispiel beschreiben. Dieses Beispiel wird nur zur Erläuterung gegeben und nicht als Einschränkung.
- Dieses Beispiel zeigt Verfahren zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern, die mit LAV-Virusproteinen reagieren und Charakterisierung dieser Antikörper unter Verwendung von synthetischen Peptiden und bakteriell exprimierten Fusionsproteinen in Immunoblots und Enzymimmunassays (enzyme-linked immunoassays).
- Eine periphere Blutprobe erhalten von einem gesunden AIDS- positiven Blutspender diente als Quelle für menschliche B-Zellen. Mononukleare Zellen wurden durch Standardzentrifugierungstechniken auf Ficoll-Paque vom Blut abgetrennt und zweimal mit calcium-/magnesiumfreier phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen.
- Die mononuklearen Zellen wurden unter Verwendung eines modifizierten E-Rosettenverfahrens von T-Zellen befreit. In Kürze, die Zellen wurden zuerst erneut auf eine Konzentration von 1 · 10&sup7; Zellen/ml in PBS, das 20% Kalbsfötenserum (FCS) enthält, bei 4ºC suspendiert. Ein ml dieser Suspension wurde dann in ein rundes Polystyrolrohr von 17 · 100 mm eingebracht, dem 1 · 10&sup9; mit 2-Amino-isothioroniumbromid (AET) behandelte rote Schafsblutzellen aus einer 10%igen (Vol./Vol.) Lösung in Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (Iscove- Medium) zugegeben wurden. Die Suspension wurde sehr vorsichtig 5-10 Minuten lang bei 4ºC gemischt und die nach dem E-Rosettenverfahren behandelten Zellen dann durch Zentrifugieren auf Ficoll-Paque 8 Minuten lang bei 2500 xg bei 4ºC entfernt. E-Rosetten-negative mononukleare pheriphere Blutzellen (E-PBMC), die sich an der Grenzfläche finden, wurden aufgenommen und einmal in Iscove-Medium gewaschen und wieder in demselben suspendiert, das 15% (Vol./Vol.) FCS, L-Glutamin (2 mmol/l), Penicillin (100 IU/ml), Streptomycin (100 ug/ml), Hypoxanthin (1 · 10&supmin;&sup4; M), Aminopterin (4 · 10&supmin;&sup7; M) und Thymidin (1,6 · 10&supmin;&sup5; M) enthält. Dieses Medium wird nachfolgend als HAT-Medium bezeichnet.
- Zellgetriebene Transformation der E-PBMC wurde durch Cokultivieren dieser Zellen mit einer transformierenden Zell-Linie erreicht. Die transformierende Zell-Linie war eine auf nukleares Epstein-Barr-Antigen positive (EBNA) menschliche Lymphoblastoidzell-Linie, die durch Mutagenese mit Ethylmethansulphonat (EMS) von der GM 1500 Lymphoblastoidzell-Linie erhalten wurde, gefolgt von Selektion in Gegenwart von 30 ug/ml 6-Thioguanin, um die Zellen arm an Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase (HGPRT) und damit HAT-empfindlich zu machen. Diese Zell-Linie ist durch die 1A2-Zell-Linie benannt und bei der American Type Culture Collection (A.T.C.C.) am 29. März 1982 unter A.T.C.C.-Nr. CRL 8119 hinterlegt. 1A2-Zellen in logarithmischer Wachstumsphase wurden in HAT-Medium suspendiert und dann mit den E-PBMC kombiniert. Die Zellmischung wurde in acht runde 96-Loch-Mikrotiterplatten (Costar 3799) bei einer Konzentration von 72000 Zellen/Vertiefung in einem Volumen von 200 ul pro Vertiefung eingebracht und bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre mit 6% CO&sub2; inkubiert. Kulturen wurden am 5. und 8. Tag nach dem Aufbringen durch Ersetzen der Hälfte des Überstandes mit frischem HAT-Medium gespeist. Die Vertiefungen wurden jeden zweiten Tag mit einem Inversions-Mikroskop auf Zeichen von Zellproliferation untersucht. Vierzehn Tage nach dem Aufbringen wurde beobachtet, daß 100% der Vertiefungen proliferierende Zellen enthielten, und daß am 21. Tag die meisten Vertiefungen proliferierende Zellen ausreichender Dichte enthielten, um sie zu entfernen und Überstände auf Anti-LAV-Antikörper zu prüfen.
- Überstände wurden unter Verwendung einer Standard-ELISA- Technik auf das Vorhandensein von Anti-LAV-Antikörpern gescreent.
- In Kürze, Immulon-II-Platten (Dynatech) wurde mit zerstörtem ganzem Virus in Carbonat-/Bicarbonatpuffer pH 9,6 beschichtet und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Gespült mit phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,05% Tween 20 (PBS-Tween) und dann mit Blotto (PBS, pH 7,2 mit 5% (Gew./Vol.) Trockenmagermilch, 0,01% (Vol./Vol.) Antifoam A (Sigma) und 0,01% (Gew./Vol.) Thimerosal 60 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS-Tween gespült und trocknen lassen. Überstände aus Vertiefungen mit wachsenden Klonen wurden den beschichteten blockierten Platten zugegeben und bei 37ºC 45 Minuten lang inkubiert, gefolgt wiederum von dreimaligem Waschen mit PBS-Tween. Es wurde Peroxidase-Ziegen-anti-Human-IgG (Verdünnung 1 : 2000 in PBS-Tween, Antibodies Inc.) zugegeben (10 ul/Vertiefung). Es wurde 45 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und wie oben gewaschen. Es wurde Enzymsubstrat, O-Phenylendiamin und Wasserstoffperoxid zugegeben und die Platten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 3 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt und unter Verwendung eines automatischen Mikroplattenlesers quantitativ analysiert.
- Analyse der Kulturüberstände ergab die Identifizierung einer Vertiefung (LT1/41-H1), die Anti-LAV-Antikörper enthielt. Dieser Überstand wurde weiter analysiert durch Immunoblot, Immunpräzipitation und ELISA mit Fusionsproteinen. Es wurde gefunden, daß die Antikörper aus diesem Klon mit gp41 durch Blot und ENV-3, Peptid 39 und Peptid 79 durch ELISA reagieren. Zell-Linie LT1/41-H1 wurde bei der ATCC unter Nr. CRL- 9128 hinterlegt.
- Diese Antigene sind wichtig, weil sie aus einer Region von LAV/HTLV-III stammen, die übereinstimmend im Serum von antikörperpositiven Spendern erkannt wird und während des Verlaufs der Krankheit vorhanden ist (Sarngadharan et al., Science 224 : 506 (1984); Safai et al., Lancet 1984-I, 1438 (1984)).
- Das Protein ENV-3 ist ein bakteriell exprimiertes Fusionsprotein von pENV-3 (ATCC Nr. #53072), das eine Region von LAV vom Basenpaar 7178 bis 7698 (Benummerung gemäß Wain-Hobson et al., Cell 44 : 9 (1985)) darstellt (Fig. 1 und 2).
- Peptid 39 ist ein als Kodierungsregion von ungefähr Basenpaar 7516 bis 7593 definiertes synthetisches Polypeptid und weist die folgende Aminosäuresequenz auf, wo Oligopeptide in der folgenden Sequenz lineare Epitope in einer solchen Sequenz aufweisen:
- ARG-ILE-LEU-ALA-VAL-GLU-ARG-TYR-LEU-LYS- ASP-GLN-GLN-LEU-LEU-GLY-ILE-TRP-GLY-CYS- SER-GLY-LYS-LEU-ILE-CYS-X, wo X OH oder NH&sub2; ist.
- Tabelle 1 zeigt einen Vergleich von Peptid 39 mit dem ganzen Viruslysat in einem ELISA zum Nachweis von Antikörpern auf LAV/HTLV-III. Tabelle 1 VERGLEICH VON PEPTID 39 MIT DEM GANZEN VIRUSLYSAT IN EINEM ELISA-ASSAY ZUM NACHWEIS VON ANTIKÖRPERN AUF LAV Positive Seren Diagnose ELISA mit Viruslysat¹ bestätigt als seropositiv² und/oder homosexuell ja gesund heterosexuell nicht seropositiv
- ¹ hergestellt wie in der U.K.-Anmeldung Nr. 83/24800, die am 15. September 1983 eingereicht wurde, beschrieben ist (siehe EP-A-0 138 667)
- ² Radiomarkierte LAV-Antigene wurden in RIPA-Puffer zerstört (Gilead et al., Nature (1976) 264 : 263) und dann mit Humanserum umgesetzt. Die erhaltenen Immunkomplexe wurden durch Bindung an ein Staphylococcus aureus-Adsorbens getrennt (Kessler, J. Immunology (1975) 115 : 1617) gefolgt von mehrfachem Waschen. Immunausgefällte Antigene wurden durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert (Laemmli, Nature (1970) 227 : 680), gefolgt von Fluorographie. Das Vorhandensein entweder einer p25- oder gp43-Bande wurde als notwendig und hinreichend zur Bestätigung einer Probe als seropositiv betrachtet.
- ³ LAS = Lymphadenopathiesyndrom
- &sup4; n.d. = nicht bestimmt
- Peptid 79 ist definiert als kodierend für die Region von ungefähr Basenpaar 7543 bis 7593 und umfaßt alle Oligopeptide, die für lineare Epitope in der folgenden Aminosäuresequenz kodieren:
- Y-LYS-ASP-GLN-GLN-LEU-LEU-GLY-ILE-TRP-GLY- CYS-SER-GLY-LYS-LEU-ILE-CYS-X, worin X OH oder NH&sub2; ist und Y TYR oder CYS.
- Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse eines ELISA zum Nachweis von Antikörpern auf LAV/HTLV-III unter Verwendung von Peptid 79. Tabelle 2 PEPTID 79 IN EINEM ELISA-ASSAY ZUM NACHWEIS VON ANTIKÖRPERN AUF LAV Serum Nr. bestätigt als seropositiv ja nein
- Fraktion von als seropositiv bestätigten als positiv nachgewiesenen Proben 18/18
- An Klonüberständen wurde Charakterisierung durch Western- Immunoblotting durchgeführt unter Verwendung von gereinigtem LAV-Virus und rekombinanten Fusionsproteinen als Antigenen. Diese Antigene wurden zunächst durch Gradientengelelektrophorese (7,0-15,0%) getrennt und durch vier Stunden Elektrophorese bei 25 V in 25 mM Natriumphosphat (pH 7,0) auf eine Nitrocellulosemembran (NCM) übertragen. Nach Übertragung wurde die NCM in PBS-Tween eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Die NCM wurde mit Ziegen-anti-Human-IgG- Meerrettich-Peroxidase verdünnt in PBS-Tween eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dies wurde gefolgt von Waschen in PBS-Tween und dann 20 Minuten lang Eintauchen in Meerrettich-Peroxidase-Farbentwicklerlösung (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Die Reaktion wurde durch Eintauchen in deionisiertes Wasser gestoppt. Die Reaktivität der monoklonalen Antikörper wurde verglichen mit einer positiven Standardserumreaktion mit gereinigtem zerstörtem Virus als positive Kontrolle.
- Virusextrakte zur Radioimmunpräzipitation wurden hergestellt aus CEM-Zellen (ATCC #CCL119) infiziert mit dem LAV 1-Isolat von LAV/HTLV-III geeignet für lytisches Wachstum durch kontinuierlichen Durchgang in Gewebskultur. Wenn ein früher cytopathischer Effekt sichtbar war, wurden die Zellen auf Markierungsmedium übertragen, das ³&sup5;(S)-Methionin (50 uCi/ml) oder ³(H)-Glucosamin (25 uCi/ml) enthält, dann 24 h lang inkubiert bis die meisten Zellen lysiert waren, wobei Virus in den Kulturüberstand entlassen wird. Aus dem zellfreien Kulturüberstand wurde Virus pelletiert (eine Stunde bei 100 000 xg) und Detergensextrakte wurden in P-RIPA-Puffer hergestellt (phosphatgepufferte Salzlösung mit 1,0% Triton X-100, 1,0% Desoxycholsäure, 0,1% SDS und 1,0% Aprotinin). Ähnliche Extrakte wurden aus nicht infizierten Zellen nach einmaligem Waschen in PBS hergestellt. Immunpräzipitationsassays wurden mit 100 ul Extraktvolumen durchgeführt, das mit Kulturüberstand 1 h lang auf Eis inkubiert wurde. In P-RIPA mit 1,0% Ovalbumin suspendiertes Immunoprecipitin (100 ul, BRL) wurde jedem Rohr zugegeben und weitere 30 Minuten lang inkubiert. Die gebundenen Komplexe wurden gewaschen und durch SDS-PAGE (7,0-15,0% Gradientengel) getrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Zellen fixiert, in Enhance (NEN) getränkt, getrocknet und einem Kodak EX-5-Film ausgesetzt.
- Ein positives Referenzserum, das alles LAV/HTLV-III-Virusprotein immunpräzipitierte wurde mit ³&sup5;(S)-methioninmarkiertem Extrakt aus Kulturüberstand von scheinbar infizierten Zellen und mit ³&sup5;(S)-methioninmarkiertem Virusextrakt als positive und negative Kontrolle umgesetzt.
- Der Antikörper LT1/41-H1 wurde ferner durch ELISA charakterisiert. Die Verfahren sind wie oben beschrieben mit der Ausnahme, daß bakteriell exprimierte Fusionsproteine und synthetische Peptide anstelle von zerstörtem ganzem Virus als Antigen verwendet werden.
- Indirekte Immunfluoreszenzassays wurden an mit Aceton fixierten und lebenden Zellen durchgeführt. Mit Aceton fixierte Objektträger, die aus LAV-infizierten CEM-Zellen hergestellt wurden, wurden mit Kulturüberstand eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, während lebende Zellen mit Kulturüberstand eine Stunde lange bei 4ºC inkubiert wurden, bevor die Zellen aufgebracht und fixiert wurden. Bei beiden Verfahren wurden reaktive Zellen von mit Fluoresceinisothiocyanat markierten anti-Human-IgG (Antibodies Inc.) nachgewiesen.
- Neutralisierungsassays wurden am monoklonalen Antikörper durch Verdünnungsreihen von Virus in 100 ul Antikörperüberstand oder Kontrollserum durchgeführt. Ein Satz von 1 : 5 Verdünnungen des Virus wurden unter Verwendung einer 96-Loch- Mikrotiterplatte hergestellt. Durch Wärme inaktiviertes LAV- seropositives Serum mit bekannter Neutralisierungsaktivität (1 : 10 Verdünnung in Medium), durch Wärme inaktiviertes normales menschliches Serum (1 : 10 Verdünnung in Medium), Überstand von einer irrelevanten menschliche monoklonale Antikörper produzierenden Zell-Linie und eine Mediumkontrollprobe wurden mit LT1/41-H1-Antikörper geprüft. Diese Präparate wurden vor Verwendung mit 0,45 u Filter gefiltert. Eine Viruskonzentration von ungefähr 2,5 · 10&sup4; Gewebekulturinfektionsdosis (TCID) wurden verwendet, um die Verdünnungsreihe zu starten. Antikörper und Virus wurden eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Eine zweite 96-Loch-Platte wurde mit bei 1 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung in 150 ul aufgebrachten CEM-F-Zellen hergestellt, gefolgt von Impfung mit 50 ul/Vertiefung (ungefähr 1 · 10&sup4; TCID in der ersten Spalte) der Antikörper-Virus-Mischung. Die zweite Platte wurde bei 37ºC 24-48 Stunden inkubiert, wobei nach der Zeit der gesamte Überstand entfernt war. Es wurde frisches Medium (200 ul) zugegeben und die Platte für weitere 7-14 Tage inkubiert, wobei alle 24-48 Stunden erneut gespeist wurde. Am 7., 10. und 14. Tag werden die Zellen geerntet und durch Immunfluoreszenz auf Virusexpression geprüft.
- Klonen von spezifischen antikörperproduzierenden Zellen aus LT1/41-H1 wurde erreicht, indem die Zellen einigen Runden begrenzendem Verdünnungsklonen unterzogen wurden, bis alle nach den obigen Verfahren untersuchten Klonungsüberstände zu Antikörpern führten, die zu Immunoblot und Immunpräzipitation von gp41 fähig waren und bei ELISA positive Reaktionen mit pENV-3, Peptid 39 und Peptid 79 ergaben. Beim Klonen wurden zur Subkultivierung Feeder-Zellen wie oben beschrieben verwendet. Mit diesen Mitteln wurde eine geklonte transformierte menschliche Zell-Linie erzielt, die kontinuierlich (immortal) ist und die einen menschlichen monoklonalen Antikörper mit den oben beschriebenen Charakteristiken ausscheidet. In diesem Beispiel tragen die Zell-Linie und der Antikörper, den sie herstellt, dieselbe Bezeichnung.
- Neutralisierung kann nach einem alternativen Verfahren durchgeführt werden. Kulturüberstand wurde nach fünffacher Konzentration mit einem Amicon-Centricon-Mikrokonzentrator oder unkonzentriert verwendet. Es wurde eine Verdünnungsreihe aufgebaut mit einer anfänglichen Verdünnung von 1 : 5, gefolgt von einer zweifachen Verdünnungsreihe unter Verwendung von 25 ul konzentriertem oder unkonzentriertem Kulturüberstand, der in Medium verdünnt ist (RPMI 1640, 15% Kalbsfötenserum, 40% durch Wärme inaktiviertes menschliches Serum). In Medium 1 400 oder 1 : 600 verdünnter Virus (1 · 10&sup5;-1 · 10&sup6; Gewebekulturinfektionseinheiten/ml) wurden der gebildeten Verdünnungsreihe in einem Gesamtvolumen von 50 ul zugegeben. Proben wurden 45 Minuten lang bei 37ºC in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
- Die Infektionsfähigkeit wurde durch die Fähigkeit des behandelten Virus zum Infizieren von MT-2-Zellen, einer HTLV-I tragenden für LAV/HTLV-III-Infektion hochempfindlichen Zell- Linie geprüft. Die MT-2-Zellen wurden in eine 96-Loch-Platte mit flachem Boden von Costar mit 1 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung in 100 M¹ Medium eingebracht. Die Platte wurde 45 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert, bevor 20 ul des behandelten Virus in jede Vertiefung zugegeben wurden. Nach 5-7 Tagen wurden die MT-2-Zellen auf Bildung von Synzytien untersucht, was ein Anzeichen für LAV/HTLV-III-Infektion ist.
Claims (30)
1. Menschlicher monoklonaler Antikörper, der zur Reaktion
mit einer antigenen Determinante von LAV/HTLV-III fähig
ist, worin der menschliche monoklonale Antikörper die
Bindung eines von Zell-Linie LT1/41-H1 erzeugten
Antikörpers an die antigene Determinante blockiert.
2. Menschlicher monoklonaler Antikörper, der ein Epitop auf
dem Hüllenglycoprotein gp41 bindet.
3. Menschlicher monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2,
worin das Epitop vom durch pENV-3 kodierten Polypeptid
definiert ist.
4. Menschlicher monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2,
worin das Epitop durch Peptid 39 definiert ist.
5. Menschlicher monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2,
worin das Epitop durch Peptid 79 definiert ist.
6. Immortalisierte Zell-Linie, die menschliche monoklonale
Antikörper erzeugt, die zur Reaktion mit einer antigenen
Determinante von LAV/HTLV-III fähig sind, worin die
Zell-Linie ein Hybrid von menschlichen B-Lymphozyten
ist, der zur Erzeugung von Antikörpern auf eine antigene
Determinante von LAV/HTLV-III fähig ist, und eine Zelle
ausgewählt aus der Gruppe von menschlichen Myelomzellen,
Mäuse-Myelomzellen und menschlichen
Lymphoblastoidzellen.
7. Immortalisierte Zell-Linie, die menschliche monoklonale
Antikörper erzeugt, die zur Reaktion mit einer antigenen
Determinante von LAV/HTLV-III fähig ist, worin die Zell-
Linie B-Lymphozytenzellen aufweist,
die zur Erzeugung
von Antikörpern auf eine antigene Determinante von
LAV/HTLV-III fähig ist, die mit Epstein-Barr-Virus
transformierten Zellen transformiert sind.
8. Die Zell-Linie LT1/41-H1 (ATCC CRL-9128).
9. Monoklonaler Antikörper erzeugt durch die Zell-Linie
nach Anspruch 8.
10. Menschlicher monoklonaler Antikörper nach einem der
Ansprüche 1 bis 5 oder 9 versehen mit einem Marker, der
fähig ist, ein nachweisbares Signal zu geben.
11. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von LAV/HTLV-III
in einer biologischen Probe umfassend:
Inkubieren eines menschlichen monoklonalen
Antikörpers, der zur Reaktion mit einer antigenen
Determinante von LAV/HTLV-III fähig ist, mit einer
biologischen Probe; und
Nachweis des Vorhandenseins von Immunkomplexen
gebildet zwischen dem monoklonalen Antikörper und der
biologischen Probe und daraus Nachweis des
Vorhandenseins von LAV/HTLV-III.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der monoklonale
Antikörper die Bindung eines von Zell-Linie LT1/41-H1
erzeugten Antikörpers an die antigene Determinante
blockiert.
13. Verfahren nach Anspruch 11, worin der monoklonale
Antikörper ein Epitop auf dem Hüllenglycoprotein gp41
bindet.
14. Verfahren nach Anspruch 11, worin der monoklonale
Antikörper von der Zell-Linie LT1/41-H1 erzeugt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin der
monoklonale Antikörper markiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der Marker ausgewählt
ist aus der Gruppe von Radionukliden, fluoreszierenden
Stoffen, Enzymen, Enzymsubstraten, Enzymcofaktoren,
Enzyminhibitoren und Liganden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, worin der
Nachweisschritt durch Enzymreaktion, Fluoreszenz,
Radioaktivität, Zell-Lysis oder Lumineszenzemission
durchgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, worin die
biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe von
Körperausscheidungen, Körperflüssigkeiten und Gewebeproben.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine
therapeutisch wirksame Menge eines menschlichen monoklonalen
Antikörpers, der zur Reaktion mit einer antigenen
Determinante von LAV/HTLV-III fähig ist, und einem
physiologisch akzeptablen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin
der monoklonale Antikörper die Bindung eines durch die
Zell-Linie LT1/41-H1 erzeugten Antikörpers an die
antigene Determinante blockiert.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin
der monoklonale Antikörper ein Epitop auf dem
Hüllenglycoprotein gp41 bindet.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin
der monoklonale Antikörper durch die Zell-Linie LT1/41-
H1 erzeugt ist.
23. Verfahren zum Trennen spezifischer antigener
Determinanten von LAV/HTLV-III von Interesse aus einer Mischung,
die antigene Determinanten von LAV/HTLV-III enthält, von
denen eine Fraktion die spezifischen antigenen
Determinanten enthält, umfassend:
Immobilisieren eines menschlichen monoklonalen
Antikörpers, der zur Reaktion mit den spezifischen
antigenen Determinanten auf einem Substrat fähig
ist;
in Kontakt bringen der Mischung, die die antigenen
Determinanten von LAV/HTLV-III enthält, mit dem
immobilisierten Antikörper unter geeigneten
Bedingungen, in der Weise, daß Immunkomplexe zwischen dem
Antikörper und den spezifischen antigenen
Determinanten gebildet werden; und
Abtrennen der Immunkomplexe aus der Mischung.
24. Verfahren nach Anspruch 23, worin der monoklonale
Antikörper die Bindung eines durch Zell-Linie LT1/41-H1
erzeugten Antikörpers an die antigene Determinante
blockiert.
25. Verfahren nach Anspruch 23, worin der monoklonale
Antikörper ein Epitop auf dem Hüllenglycoprotein gp41
bindet.
26. Verfahren nach Anspruch 23, worin der monoklonale
Antikörper durch Zell-Linie LT1/41-H1 erzeugt wird.
27. Zusammensetzung umfassend einen menschlichen
monoklonalen Antikörper, der zur Reaktion mit einer antigenen
Determinante von LAV/HTLV-III fähig ist, und einen
physiologisch akzeptablen Träger und/oder
Verdünnungsmittel zur Verwendung beim Reduzieren der
Infektionsfähigkeit von LAV/HTLV-III in warmblütigen Tieren.
28. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung umfassend Vermischen eines menschlichen
monoklonalen Antikörpers, der zur Reaktion mit einer
antigenen Determinante von LAV/HTLV-III fähig ist, und eines
physiologisch akzeptablen Trägers und/oder
Verdünnungsmittels.
29. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5
oder 9, (a) gebunden an ein Toxin, ein radioaktives
Material, ein Arzneimittel oder ein anderes Konjugat
oder (b) immobilisiert auf einem Substrat.
30. Diagnostischer Kit umfassend einen Antikörper nach einem
der Ansprüche 1 bis 5, 9, 10 oder 29.
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