JP7369127B2 - Tigitに対する単一ドメイン抗体及びその変異体 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年12月28日に出願された国際特許出願第PCT/CN2017/119506号、及び2018年7月26日に出願された国際特許出願第PCT/CN2018/097159号の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
ASCIIテキストファイル上の以下の提出物の内容、すなわち、コンピューターで読取り可能な形態(CRF)の配列表(ファイル名:761422000741SEQLISTING.txt、記録日:2018年7月18日、サイズ:392KB)は、その全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
(1)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号176のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(2)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号107のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号177のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(3)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号108のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(4)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号109のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(5)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(6)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(7)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(8)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号124のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号194のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(9)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号126のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号196のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(10)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(11)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号198のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(12)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号199のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(13)配列番号63のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号133のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号203のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(14)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号135のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号205のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(15)配列番号66のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号136のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号206のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(16)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号137のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号207のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;
(17)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号139のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号209のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体;または
(18)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号140のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号210のアミノ酸配列を含むCDR3;またはCDR領域において最大で約3つ(例えば、約1、2、または3のいずれか)のアミノ酸置換を含むその変異体。
L-VH-抗TIGIT sdAb-CH1-CH2-CH3;及び(4)抗TIGIT sdAb-CLからなり、ポリペプチド鎖(2)及び(3)のVH及びVLの各々は、第2のエピトープ(例えば、PD-1、PD-L1)のコピーに特異的に結合するscFVを形成し、及び各抗TIGIT sdAbは、TIGITのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、PD-1を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗PD-1完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、配列番号385のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号386のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの実施形態では、抗PD-1完全長抗体は、配列番号325のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号326のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗PD-1完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、配列番号387のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号388のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの実施形態では、抗PD-1完全長抗体は、配列番号390のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号391のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗PD-1完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、配列番号406のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号407のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号390のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号391のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号394または396のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号390のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号391のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号399または401のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、PD-L1を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、1)配列番号349のアミノ酸配列を含むHC-CDR1、配列番号350のアミノ酸配列を含むHC-CDR2、及び配列番号351のアミノ酸配列を含むHC-CDR3を含むVH、及び2)配列番号352のアミノ酸配列を含むLC-CDR1、配列番号353のアミノ酸配列を含むLC-CDR2、及び配列番号354のアミノ酸配列を含むLC-CDR3を含むVLを含む。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、配列番号339のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号340のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体は、配列番号323または327のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体は、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、配列番号379のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号380のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、配列番号383のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号384のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体(またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、配列番号381のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号382のアミノ酸配列を含むVLを含む。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体は、配列番号331のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号332のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗PD-L1完全長抗体は、配列番号333のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号334のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号327のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号343のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号323のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号357または359のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号341または402のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号323のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号362または364のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号405のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号331のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号332のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号347のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号333のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号334のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも1つは、上述のように、TIGITを特異的に認識するsdAb部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号345のアミノ酸配列を含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
TIGITを特異的に認識する単一ドメイン抗体(sdAb)部分を含む単離抗TIGIT構築物であって、前記sdAb部分が、配列番号36~42、54、56~59、63、65~67、69~70のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号106~112、124、126~129、133、135~137、139~140のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号176~182、194、196~199、203、205~207、209~210のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、前記単離抗TIGIT構築物。
(項目2)
前記sdAb部分が、配列番号36~42、54、56~59、63、65~67、69~70のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号106~112、124、126~129、133、135~137、139~140のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号176~182、194、196~199、203、205~207、209~210のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、項目1に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目3)
前記sdAb部分が、以下:
(1)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号176のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(2)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号107のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号177のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(3)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号108のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(4)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号109のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(5)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(6)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(7)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(8)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号124のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号194のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(9)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号126のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号196のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(10)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(11)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号198のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(12)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号199のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(13)配列番号63のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号133のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号203のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(14)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号135のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号205のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(15)配列番号66のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号136のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号206のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(16)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号137のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号207のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(17)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号139のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号209のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;または
(18)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR1、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;配列番号140のアミノ酸配列を含むCDR2、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;及び配列番号210のアミノ酸配列を含むCDR3、または最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか1つを含む、項目1または2に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目4)
前記sdAb部分が、以下:
(1)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号176のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(2)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号107のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号177のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(3)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号108のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号178のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(4)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号109のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号179のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(5)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(6)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(7)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(8)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号124のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号194のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(9)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号126のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号196のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(10)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号197のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(11)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号198のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(12)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号199のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(13)配列番号63のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号133のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号203のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(14)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号135のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号205のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(15)配列番号66のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号136のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号206のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(16)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号137のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号207のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;
(17)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号139のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号209のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体;または
(18)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号140のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号210のアミノ酸配列を含むCDR3;または前記CDR領域において最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか1つを含む、項目1~3のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目5)
前記sdAb部分が、以下:
a-1)37位のアミノ酸残基が、F、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G
、D、T、及びPからなる群から選択され;
a-2)44位のアミノ酸残基が、E、Q、G、D、A、K、R、L、P、S、V、H
、T、N、W、M、及びIからなる群から選択され;
a-3)45位のアミノ酸残基が、L、R、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D、及びVからなる群から選択され;
a-4)103位のアミノ酸残基が、W、R、G、S、K、A、M、Y、I、F、T、N、V、Q、P、E、及びCからなる群から選択され;及び
a-5)108位のアミノ酸残基が、Q、L、R、P、E、K、S、T、M、A、及びHからなる群から選択され;または
b-1)37位のアミノ酸残基が、F、Y、L、I、及びVからなる群から選択され;
b-2)44位のアミノ酸残基が、E及びQからなる群から選択され;
b-3)45位のアミノ酸残基が、R及びLからなる群から選択され;
b-4)103位のアミノ酸残基が、W、R、G、及びSからなる群から選択され;及び
b-5)108位のアミノ酸残基が、Q及びLからなる群から選択され;または
c-1)37位のアミノ酸残基が、F、Y、L、I、及びVからなる群から選択され;
c-2)44位のアミノ酸残基が、A、G、E、D、Q、R、S、及びLからなる群から選択され;
c-3)45位のアミノ酸残基が、L、R、及びCからなる群から選択され;
c-4)103位のアミノ酸残基が、P、R、及びSからなる群から選択され;及び
c-5)108位のアミノ酸残基が、Q及びLからなる群から選択され;
のいずれか1つのアミノ酸配列を含むV H Hドメインを含み、
前記アミノ酸位置が、Kabat番号付けに従っており、108位がQである場合、108位が、Lに適宜ヒト化することができる、項目1~4のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目6)
前記sdAb部分が、配列番号253~259、271、273~276、280、282~284、286~287のいずれか1つのアミノ酸配列を含むV H Hドメイン、または配列番号253~259、271、273~276、280、282~284、286~287のいずれか1つに対して少なくとも約80%の配列同一性を有するその変異体を含む、項目1~5のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目7)
前記sdAb部分が、配列番号253~259、271、273~276、280、282~284、286~287のいずれか1つのアミノ酸配列を含むV H Hドメイン、または前記V H Hドメインにおいて最大で約3つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、項目6に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目8)
前記sdAb部分と前記TIGITの間の結合のK d が、約10 -5 M~約10 -12 Mである、項目1~7のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目9)
前記sdAb部分と前記TIGITの間の結合のK d が、約10 -7 M~約10 -12 Mである、項目8に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目10)
TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分が、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である、項目1~9のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目11)
前記単離抗TIGIT構築物が、sdAb-Fc融合タンパク質である、項目1~10のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目12)
前記sdAb-Fc融合タンパク質が、単量体または二量体である、項目11に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目13)
前記Fc断片が、ヒトIgG1(hIgG1)Fc、エフェクターレス(不活性)hIgG1 Fc、またはhIgG4 Fcである、項目11または12に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目14)
前記sdAb-Fc融合タンパク質が、配列番号288~294、306、308~311、315、317~319、321~322、及び365~367のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、項目11~13のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目15)
前記単離抗TIGIT構築物が、第2のエピトープを特異的に認識する第2の抗体部分をさらに含む、項目1~10のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目16)
前記第2の抗体部分が、完全長抗体、Fab、Fab’、(Fab’) 2 、FV、一本
鎖FV(scFV)、scFV-scFV、ミニボディ、ダイアボディ、またはsdAbである、項目15に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目17)
前記抗TIGIT構築物が、多重特異性である、項目15または16に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目18)
TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分、及び前記第2の抗体部分が、ペプチドリンカーによって適宜連結される、項目15~17のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目19)
前記ペプチドリンカーが、配列番号324及び370~378のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、項目18に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目20)
前記第2の抗体部分が、2つの重鎖及び2つの軽鎖からなる完全長抗体である、項目15~19のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目21)
前記重鎖のFc断片が、IgG1 Fc、エフェクターレスIgG1 Fc、IgG2
Fc、またはIgG4 Fcであり得る、項目20に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目22)
TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分のN末端が、前記完全長抗体の少なくとも1つの重鎖のC末端に融合される、項目20または21に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目23)
TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分のC末端が、前記完全長抗体の少なくとも1つの重鎖のN末端に融合される、項目20または21に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目24)
TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分のN末端が、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つのC末端に融合される、項目20または21に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目25)
TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分のC末端が、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つのN末端に融合される、項目20または21に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目26)
前記完全長抗体が、PD-1を特異的に認識する、項目20~25のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目27)
前記完全長抗体が、配列番号385のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(V H )、及び配列番号386のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(V L )を含む、項目26に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目28)
前記完全長抗体が、配列番号387のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(V H )、及び配列番号388のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(V L )を含む、項目26に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目29)
前記完全長抗体が、配列番号406のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(V H )、及び配列番号407のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(V L )を含む、項目26に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目30)
前記完全長抗体が、配列番号390のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号391のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号394または396のアミノ酸配列を含む、項目26または29のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目31)
前記完全長抗体が、配列番号390のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号391のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号399または401のアミノ酸配列を含む、項目26または29のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目32)
前記完全長抗体が、PD-L1を特異的に認識する、項目20~25のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目33)
前記完全長抗体が、1)配列番号349のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域(HC-CDR)1、配列番号350のアミノ酸配列を含むHC-CDR2、及び配列番号351のアミノ酸配列を含むHC-CDR3を含むV H 、及び2)配列番号352のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域(LC-CDR)1、配列番号353のアミノ酸配列を含むLC-CDR2、及び配列番号354のアミノ酸配列を含むLC-CDR3を含むV L を含む、項目32に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目34)
前記完全長抗体が、配列番号339のアミノ酸配列を含むV H 、及び配列番号340のアミノ酸配列を含むV L を含む、項目33に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目35)
前記完全長抗体が、配列番号323または327のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目33または34に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目36)
前記完全長抗体が、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目33または34に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目37)
前記完全長抗体が、配列番号379のアミノ酸配列を含むV H 、及び配列番号380のアミノ酸配列を含むV L を含む、項目32に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目38)
前記完全長抗体が、配列番号383のアミノ酸配列を含むV H 、及び配列番号384のアミノ酸配列を含むV L を含む、項目32に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目39)
前記完全長抗体が、配列番号381のアミノ酸配列を含むV H 、及び配列番号382のアミノ酸配列を含むV L を含む、項目32に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目40)
前記完全長抗体が、配列番号331のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号332のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目39に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目41)
前記完全長抗体が、配列番号333のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号334のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目39に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目42)
前記完全長抗体が、配列番号327のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号343のアミノ酸配列を含む、項目32~36のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目43)
前記完全長抗体が、配列番号323のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号357または359のアミノ酸配列を含む、項目32~36のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目44)
前記完全長抗体が、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号341または402のアミノ酸配列を含む、項目32~36のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目45)
前記完全長抗体が、配列番号323のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、及び前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号362または364のアミノ酸配列を含む、項目32~36のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目46)
前記完全長抗体が、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、及び前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号405のアミノ酸配列を含む、項目32~36のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目47)
前記完全長抗体が、配列番号331のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号332のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号347のアミノ酸配列を含む、項目32及び39~41のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目48)
前記完全長抗体が、配列番号333のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号334のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、TIGITを特異的に認識する前記sdAb部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号345のアミノ酸配列を含む、項目32及び39~41のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
(項目49)
TIGITを特異的に認識するsdAb部分を含む単離抗TIGIT構築物であって、前記sdAb部分が、配列番号253~259、271、273~276、280、282~284、286~287のいずれか1つのCDR1、CDR2、及びCDR3を含む、前記単離抗TIGIT構築物。
(項目50)
項目1~49のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物と競合的にTIGITに特異的に結合する、単離抗TIGIT構築物。
(項目51)
項目1~50のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物、及び適宜、薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
(項目52)
TIGIT関連疾患を有する個体の治療方法であって、前記個体に有効量の項目51に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
(項目53)
前記TIGIT関連疾患が、がんである、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記がんが、固形腫瘍である、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記がんが、大腸がんである、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記個体に追加の療法を投与することをさらに含む、項目52~55のいずれか1項に記載の方法。
(項目57)
前記追加の療法が、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせである、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記追加の療法が、免疫療法である、項目57に記載の方法。
(項目59)
前記免疫療法が、前記個体に、免疫調節薬を含む第2の医薬組成物の有効量を投与することを含む、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記免疫調節薬が、免疫チェックポイント阻害薬である、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記免疫チェックポイント阻害薬が、PD-1またはPD-L1を特異的に認識する抗体である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記医薬組成物が、全身投与される、項目52~61のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
前記医薬組成物が、局所投与される、項目52~61のいずれか1項に記載の方法。
(項目64)
前記個体が、ヒトである、項目52~63のいずれか1項に記載の方法。
(項目65)
項目1~50のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物をコードする、単離核酸。
(項目66)
項目65に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目67)
項目65に記載の単離核酸、または項目66に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
(項目68)
項目1~50のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物、項目65に記載の単離核酸、項目66に記載のベクター、または項目67に記載の単離宿主細胞を含む、キット。
(項目69)
抗TIGIT構築物の生成方法であって、
(a)コードされた抗TIGIT構築物を発現するのに有効な条件下で、項目65に記載の単離核酸、項目66に記載のベクター、または項目67に記載の単離宿主細胞を含む宿主細胞を培養すること;及び(b)前記宿主細胞から、発現された抗TIGIT構築物を得ることを含む、前記方法。
(項目70)
工程(a)が、項目65に記載の単離核酸または項目66に記載のベクターを含む宿主細胞を生成することをさらに含む、項目69に記載の方法。
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益なまたは所望の結果としては、以下:疾患から生じる1つ以上の症状を緩和すること、疾患範囲を縮小すること、疾患を安定化すること(例えば、疾患の悪化の予防または遅らせること)、疾患の拡散(例えば、転移)を予防または遅らせること、疾患の再発を予防または遅らせること、疾患の進行を遅延または遅らせること、疾患状態を改善すること、疾患の寛解(部分的なまたは完全な)を提供すること、疾患を治療するために必要な1つ以上の他の薬物適用の用量を低下させること、疾患の進行を遅らせること、生活の質を向上させること、及び/または生存を延長することの1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。また、「治療」によって包含されるのは、がんの病理学的結果の縮小である。本発明の方法は、治療のこれらの態様のいずれか1つ以上を企図する。
表1.HVRの描写。
(I)抗TIGIT単一ドメイン抗体部分
本明細書に記載の単離抗TIGIT構築物は、TIGIT(または「抗TIGIT sdAb」)を特異的に認識する単一ドメイン抗体(sdAb)部分を含む。いくつかの実施形態では、単離抗TIGIT構築物は、抗TIGIT sdAbである。
例示的なsdAbとしては、重鎖のみ抗体に由来する重鎖可変ドメイン(例えば、ラクダ科におけるVHH(重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン)または軟骨魚類におけるVNAR(サメ新抗原受容体の可変ドメイン))、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の4鎖抗体に由来する単一ドメイン(例えば、VHまたはVL)、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生されたヒト単一ドメイン抗体、及び抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。sdAbは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、サカナ、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種由来であってもよい。本明細書で検討される単一ドメイン抗体は、ラクダ科及びサメ以外の種に由来する天然に生じる単一ドメイン抗体分子も含む。
TIGITは、CD28ファミリーに属する。26KDaのタンパク質は、細胞質中に細胞外IgVドメイン、I型膜貫通領域、細胞内免疫グロブリンテールチロシン(ITT)様モチーフ、及びC末端免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ(ITIM)モチーフからなる。ナイーブT細胞及びNK細胞では、TIGITは、細胞表面上でほとんど検出できないが、T細胞及びNK細胞の活性化の際に上方調節される。
抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウェスタンブロット、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore試験及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗TIGIT sdAb部分は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、ラクダ科の種、例えば、ラマに由来する可変領域)及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗TIGIT sdAb部分は、ヒト抗体(ヒトドメイン抗体、またはヒトDabとして知られる)である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は、一般的に、Chen,Mol.Immunol.47(4):912-21(2010)に記載されている。完全ヒト単一ドメイン抗体(またはDAb)を産生することができるトランスジェニックマウスまたはラットは、当該技術分野で公知である。例えば、US20090307787A1、米国特許第8,754,287号、US20150289489A1、US20100122358A1、及びWO2004049794を参照されたい。
本出願の抗体は、所望の活性または活性(複数)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、種々の方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。単一ドメイン抗体ライブラリーを構築する方法は、例えば、米国特許第7371849号に記載されている。
本明細書に記載の抗TIGIT sdAb部分の生物学的活性は、その50%阻害濃度(EC50)を測定することで決定することができ、これは、特異的な生物学的または生化学的機能を阻害する(例えば、TIGIT及びその主要リガンドCD155の間の結合を阻害する)抗体の効力の尺度である。例えば、ここで、EC50は、TIGIT生物活性の50%をインビトロで中和するのに必要な抗TIGIT sdAbの有効濃度を示すために使用することができる。EC50は、作動薬または他の物質(例えば、抗体)のEC50に匹敵する。EC50は、最大効果の50%をインビボで細胞に基づくサイトカイン放出アッセイも表す。EC50は、当該技術分野で公知のアッセイ、例えば、FACS分析(競合結合アッセイ)によるリガンド結合の阻害などのバイオアッセイ、細胞ベースサイトカイン放出アッセイ、または増幅発光近接均質アッセイ(AlphaLISA)によって測定することができる。
抗TIGIT sdAb部分を含む抗TIGIT構築物は、任意の可能な形式のものであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗TIGIT sdAb部分は、リンカー配列を適宜介して、1つ以上の(好ましくは、ヒト)CH2及び/またはCH3ドメイン、例えば、Fc断片に連結して、その半減期をインビボで増加させることができる。
いくつかの実施形態では、抗TIGIT構築物は、1つ以上の他の抗体部分または抗原結合部分(例えば、別の抗原または別のエピトープを特異的に認識する抗体部分)に融合した本明細書に記載の抗TIGIT sdAb部分を含む。1つ以上の他の抗体部分は、任意の抗体または抗体断片形式、例えば、多重特異性sdAb(例えば、二重特異性sdAb)、完全長抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、一本鎖Fv(scFv)、scFv-scFv、ミニボディ、ダイアボディ、またはsdAbであり得る。いくつかの実施形態では、1つ以上の抗体部分(または抗原結合部分)は、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽重鎖可変ドメイン(VL)を含む。抗体断片は、種々の技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、無傷抗体のタンパク質分解、ならびに組み換え宿主細胞(例えば、E.coliまたはファージ)による産生を含む。
いくつかの実施形態では、抗TIGIT構築物内の抗TIGIT sdAb及び他の1つ以上の抗体部分(例えば、完全長抗体、sdAb、またはVH及びVLを含む抗原結合部分)は、場合により、ペプチドリンカーによって連結することができる。抗TIGIT構築物で使用されるペプチドリンカー(複数可)の長さ、柔軟性の程度、及び/または他の特性は、1つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性、またはアビディティを含むが、これらに限定されない特性にいくらかの影響を与え得る。例えば、2つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするために、より長いペプチドリンカーが選択され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するドメインが互いに自由に動くように、可動性残基(例えば、グリシン及びセリン)を含む。例えば、グリシン-セリンダブレットは、適当なペプチドリンカーであり得る。
いくつかの実施形態では、抗TIGIT構築物は、第2の抗体部分に融合した本明細書に記載の抗TIGIT sdAb部分を含み、第2の抗体部分は、2つの重鎖及び2つの軽鎖からなる完全長抗体(例えば、抗PD-1または抗PD-L1完全長抗体)である。完全長抗体のFc断片は、例えば、IgG1 Fc、エフェクターレスIgG1 Fc、IgG2 Fc、またはIgG4 Fcであり得る。いくつかの実施形態では、Fc断片は、配列番号355、356、及び389のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、刺激性免疫チェックポイント分子のアクチベーターである。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、免疫チェックポイント阻害薬、例えば、PD-1またはPD-L1の阻害剤である。
本出願は、一般的には、完全長抗体またはVH及びVLを含む抗原結合断片に融合した本明細書に記載の抗TIGIT sdAb部分を含む抗TIGIT構築物であって、抗TIGIT構築物は、多重特異性である(以下、「多重特異性抗TIGIT構築物」または「抗TIGIT多重特異性抗原結合タンパク質(MABP)」と呼ぶ)、抗TIGIT構築物を提供する。いくつかの実施形態では、抗TIGIT MABPは、二重特異性(以下、「二重特異性抗TIGIT構築物」または「抗TIGIT二重特異性抗原結合タンパク質(BABP)」と呼ぶ)である。抗TIGIT sdAb部分は、完全長抗体またはVH及びVLを含む抗原結合断片により認識される標的(複数可)とは異なるTIGITに特異的に結合することで、より広範な標的化能力を与える。sdAbの小さいサイズのため、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗TIGIT MABP(またはBABP)は、完全長抗体または抗原結合断片成分のものと比較して、同様の分子量及び薬物動態特性を有し得る。例えば、抗TIGIT MABPは、臨床効果及び安全性が証明されたモノクローナル抗体に1つ以上の抗TIGIT sdAb部分を融合させることで設計し、多重特異性構築物の発現性を妨げることなく臨床的有用性の増加及び望ましい薬物動態特性を提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1つ以上の抗TIGIT sdAb部分は、適宜ペプチドリンカーによって完全長抗体または抗原結合断片に融合される。本明細書に記載の抗TIGIT MABP(またはBABP)は、TIGITの他にも種々の疾患関連エピトープまたは抗原の組み合わせ、例えば、免疫チェックポイント分子、細胞表面抗原(例えば、腫瘍抗原)、または炎症促進性分子との組み合わせによるTIGITを標的にするように適用し、種々の疾患及び状態、例えば、がん、炎症、及び自己免疫疾患の治療に有用な薬剤を提供することができる。抗TIGIT MABPは、PCT/CN2017/093644に開示されるものなど任意の形式であってもよく、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の抗TIGIT sdAb部分を含む第1の抗原結合部分、及び抗TIGIT MABP(またはBABP)のVH及びVLを含む第2の抗原結合部分は、互いに融合される(すなわち、共有結合される)。従って、本出願の抗TIGIT MABP(またはBABP)は、1つ以上の融合ポリペプチドを含む。各融合ポリペプチドは、本明細書に記載の抗TIGIT sdAbを含む第1の抗原結合部分、及び第2の抗原結合部分に由来するポリペプチドを含み得る。
抗TIGIT MABP(例えば、BABP)は、VH及びVLを含む少なくとも1つの第2の抗原結合部分を含む。そのような抗原結合部分は、2つの重鎖及び2つの軽鎖からなる完全長の従来抗体、またはそれらに由来する抗原結合断片であり得る。
いくつかの実施形態では、抗TIGIT MABP(例えば、BABP)は、(a)本明細書に記載のTIGITを特異的に認識するsdAbを含む第1の抗原結合部分、及び(b)VH及びVLを含む第2の抗原結合部分を含み、VH及びVLは一緒に、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第1の抗原結合部分及び第2の抗原結合部分は、互いに融合され、「TIGIT×PD-1 BABP」または「TIGIT×PD-1 BABP」と以下で呼ばれる。いくつかの実施形態では、抗TIGIT MABP(例えば、BABP)は、(a)本明細書に記載のTIGITを特異的に認識するsdAb部分を含む第1の抗原結合部分、及び(b)VH及びVLを含む第2の抗原結合部分を含み、VH及びVLは一緒に、PD-L1に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第1の抗原結合部分及び第2の抗原結合部分は、互いに融合され、「PD-L1×TIGIT BABP」または「TIGIT×PD-L1BABP」と以下で呼ばれる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗TIGIT構築物(例えば、抗TIGIT sdAb部分、抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質、抗TIGIT MABP/BABP)のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸配列に適切な改変を導入するか、またはペプチド合成によって調製し得る。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基の欠失、及び/または挿入、及び/または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴(例えば、抗原結合)を有する限り、最終構築物に到達するために、欠失、挿入及び置換のいかなる組み合わせをも行うことができる。
いくつかの実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体を提供する。置換突然変異誘発のための目的の部位には、HVR(またはCDR)及びFRが含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」という見出しの下で表2に示す。より実質的な変化は、「例示的な置換」という見出しの下で表2に提供し、これは、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下にさらに記載する通りである。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、生成物を所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合、低減した免疫原性、または改善されたADCCもしくはCDCについて、スクリーニングすることができる。
表2.アミノ酸置換
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗TIGIT構築物を変化させて、構築物がグリコシル化される程度を増加または減少させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗TIGIT構築物(例えば、抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質、PD-1×TIGIT MABP、またはPD-L1×TIGIT MABP)のFc領域に1つ以上のアミノ酸改変を導入することにより、Fc領域変異体を生成させてもよい。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4Fc領域)を含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗TIGIT構築物、例えば、「チオMAb」を作成することが望まれ得る。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲートを作成するために、例えば、薬物部分またはリンカー-薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。いくつかの実施形態では、以下の残基のいずれか1つ以上がシステインで置換され得る:軽鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン改変抗TIGIT構築物は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるように生成され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗TIGIT構築物は、当該技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキソラン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(単独重合体またはランダム共重合体のいずれか)及びデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、いずれかの分子量のものであり得、分枝鎖または未分枝鎖であり得る。抗体に結合するポリマーの数は、変動し得、1つ以上の重合体が結合する場合、それらは同じかまたは異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び/または種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのかなどを考慮しながら決定することができる。
本明細書に記載されるようにTIGITを特異的に認識するsdAbを含む抗TIGIT構築物のいずれか1つ(例えば、抗TIGIT sdAb、抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質、抗TIGIT/PD-1二重特異性抗体(例えば、PD-1×TIGIT BABP)、または抗TIGIT/PD-L1二重特異性抗体(例えば、PD-L1×TIGIT BABP))、及び適宜、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本発明でさらに提供される。医薬組成物は、所望の純度を有する本明細書に記載の抗TIGIT構築物を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と適宜混合することにより(Remington’s Pharmaceutical sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。
本明細書に記載されるようにTIGITを特異的に認識するsdAb部分を含む抗TIGIT構築物(例えば、抗TIGIT sdAb、抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質、抗TIGIT/PD-1二重特異性抗体(例えば、PD-1×TIGIT BABP)、または抗TIGIT/PD-L1二重特異性抗体(例えば、PD-L1×TIGIT BABP))、及びその組成物(例えば、医薬組成物)は、種々の用途、例えば、診断、分子アッセイ、及び治療において有用である。
本明細書に記載の抗TIGIT構築物(例えば、抗TIGIT sdAb、抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質、抗TIGIT/PD-1二重特異性抗体(例えば、PD-1×TIGIT BABP)、または抗TIGIT/PD-L1二重特異性抗体(例えば、PD-L1×TIGIT BABP))は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、または本明細書に記載されるように調製され得る。実施例1、2、4及び6も参照されたい。いくつかの実施形態では、(a)コードされた抗TIGIT構築物の発現に効果的な条件下で本明細書に記載の抗TIGIT構築物をコードする単離核酸またはベクターを含むの宿主細胞を培養すること;及び(b)発現された抗TIGIT構築物を前記宿主細胞から得ることを含む、抗TIGIT構築物の産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、(a)本明細書に記載の抗TIGIT構築物をコードする単離核酸またはベクターを含む宿主細胞を産生する工程をさらに含む。
a)ベクター構築
本出願の抗体をコードするポリ核酸配列は、標準的な組み換え技術を使用して得ることができる。所望のポリ核酸配列は、抗体産生細胞、例えば、ハイブリドーマ細胞から単離し、配列決定してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドをヌクレオチドシンセサイザーまたはPCR技術を使用して合成することができる。一旦得られると、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組み換えベクター中に挿入する。当該技術分野において利用可能で公知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクター中に挿入される核酸のサイズ及びそのベクターを用いて形質転換される特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、あるいは両方)及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下:複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボゾーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸インサート、及び転写終結配列を含む。
本出願の抗体を発現させるために適した原核生物宿主細胞は、古細菌と真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物などを含む。有用な細菌の例としては、エシェリキア属(例えば、E.coli)、バシラス属(例えば、B.subtilis)、腸内細菌、シュードモナス属(例えば、P.aeruginosa)、サルモネラ・チフィリウム、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ属、プロテウス属、シゲラ属、根粒菌、ビトレオシラ属、またはパラコッカス属が挙げられる。いくつかの実施形態では、グラム陰性細胞を使用する。いくつかの実施形態では、E.coli細胞を本発明のための宿主として使用する。E.coli株の例としては、W3110株AfhuA (AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR(米国特許第5,639,635号)を有する33D3株を含む。他の株及びその誘導体、例えば、E.coli 294(ATCC31,446)、E.coli B、E.coli 1776(ATCC31,537)及びE.coli RV308(ATCC31,608)なども適する。これらの例は、限定的よりも、むしろ説明的である。一般的に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製能を考慮に入れて適切な細菌を選択することが必要である。例えば、E.coli、セラチア属、またはサルモネラ属が、周知のプラスミド(例えば、pBR322、pBR325、pACYC177、またはpKN410など)を、レプリコンを供給するために使用する場合、宿主として使用するのに適し得る。
宿主細胞を上記の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。形質転換は、DNAを原核生物宿主中に導入し、DNAが、染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体のいずれかとして複製可能であることを意味する。使用する宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に適切である標準的な技術を使用して行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞のために一般的に使用される。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール/DMSOを用いる。使用されるさらに別の技術は、エレクトロポレーションである。
本明細書において産生される抗TIGIT構築物をさらに精製し、さらなるアッセイ及び使用のための実質的に均質である調製物を得る。当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順:免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上または陽イオン交換樹脂(例えば、DEAEなど)上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫安塩析、及びゲルろ過(例えば、Sephadex G-75を使用)は、適した精製手順の例示である。
真核生物での発現のために、ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下:シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、ならびにエンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列の1つ以上を含む。
真核生物宿主における使用のためのベクターはまた、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードするインサートを含んでもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理される(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルを利用可能である。
一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要とされない(SV40起点を典型的に使用してもよい。なぜなら、ただ、それは初期プロモーターを含むからである)。
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択遺伝子(選択可能マーカーとも呼ばれる)を含んでもよい。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン)に対して耐性を付与する、(b)栄養要求性欠損を補完する、または(c)複雑な培地から利用可能ではない決定的な栄養分を供給するタンパク質をコードする(例えば、バシラス属についてのDアラニンラセマーゼをコードする遺伝子)。
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む。事実上、全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位から約25~30塩基上流に位置付けられるATリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から70~80塩基上流に見出される別の配列は、CNCAAT領域であり、そこでNは任意のヌクレオチドであり得る。大半の真核生物の3’末端は、AATAAA配列であり、それはコード配列の3’末端へのポリAテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全てを、真核生物発現ベクター中に挿入してもよい。
より高い真核生物による本出願の抗体をコードするDNAの転写は、しばしば、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子から公知である(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、及びインスリン)。典型的には、しかしながら、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用され得る。例としては、複製開始点の後期側のSV40エンハンサー(100~270bp)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、抗体コード配列に対する位置5’または3’でベクター中にスプライシングされ得るが、しかし、好ましくはプロモーターから部位5’に位置付けられる。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞)において使用される発現ベクターは、転写の終結のために及びmRNAを安定化させるために必要な配列も含み得る。そのような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5’及び、時には3’の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026及びその中で開示される発現ベクターを参照されたい。
本明細書におけるベクター中でDNAをクローン化または発現するための適した宿主細胞は、本明細書に記載のより高い真核細胞(脊椎動物宿主細胞を含む)を含む。培養(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は、通常の手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、以下:SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7,ATCCCRL 1651);ヒト胚腎臓株(293細胞または浮遊培養中での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977));仔ハムスター腎細胞(BHK,ATCCCCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO,Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));マウスセルトリ細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));サル腎臓細胞(CV1 ATCCCCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);ヒト子宮頚癌細胞(HELA,ATCCCCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK,ATCCCCL 34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A,ATCCCRL 1442);ヒト肺細胞(W138,ATCCCCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2,HB 8065);マウス乳癌(MMT 060562,ATCCCCL51);TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝細胞癌株(Hep G2)である。
本出願の抗体を産生するために使用される宿主細胞を、種々の培地中で培養してもよい。商業的に利用可能な培地、例えば、Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及びダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma)などが、宿主細胞を培養するために適する。これらの培地に、必要に応じて、以下を補給してもよい:ホルモン及び/または他の増殖因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸など)、緩衝剤(例えば、HEPESなど)、ヌクレオチド(例えば、アデノシン及びチミジンなど)、抗生物質(例えば、GENTAMYCIN(商標)薬物など)、微量元素(通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される)、及びグルコースまたは等価のエネルギー供給源。任意の他の必要な補給剤も、当業者に公知であり得る適切な濃度で含めてもよい。培養条件、例えば、温度、pHなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。
組み換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内に、ペリプラズム間隙中に産生され得る、または培地中に直接的に分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、最初の工程として、微粒子細片、宿主細胞または溶解断片のいずれかを、例えば、遠心分離または限外ろ過により除去する。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)には、E.coliのペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離するための手順が記載される。簡単に説明すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在において約30分にわたり溶解させる。細胞片を遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、一般的に、商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えば、PMSFなどを、先の工程のいずれかに含め、タンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含め、外来性混入菌の増殖を予防してもよい。
ポリクローナル抗体は、一般的に、関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下(s.c.)または腹腔内(i.p.)注射により動物において産生される。関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二機能性薬剤または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を通じた抱合)、Nヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を通じて)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(式中、R及びR1は、非依存的により低いアルキル基である)を使用して抱合することが有用であり得る。用いてもよいアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度の実験なしに当業者により選択され得る。
モノクローナル抗体を実質的に均質な抗体の集団から得る、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に生じる突然変異及び/または翻訳後改変(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。従って、改変語「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではないとして抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製してもよく、または組み換えDNA方法により作製してもよい(米国特許第4,816,567号)。ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物(例えば、ハムスターまたはラマなど)を本明細書で上に記載する通りに免疫化し、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。リンパ球を、次に、ミエローマ細胞と、適した融合剤(例えば、ポリエチレングリコールなど)を使用して融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。ラクダの免疫化について実施例1も参照されたい。
非ヒト(例えば、ネズミ)抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片(例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2または抗体の他の抗原結合部分配列)である。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含み、それにおいてレシピエントのCDRからの残基が、非ヒト種(例えば、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギ、ラクダ、またはラマ)(ドナー抗体)のCDRからの残基により置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてまたは移入されたCDRまたはフレームワーク配列において見出されない残基も含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的に2つの可変ドメインの実質的に全てを含み得るが、それにおいてCDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む。例えば、Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)を参照されたい。
ヒト化の代わりに、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。
単離抗TIGIT構築物(例えば、抗TIGIT sdAb、抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質、PD-1×TIGIT二重特異性構築物(例えば、BABP)、PD-L1×TIGIT二重特異性構築物(例えば、BABP))、単離核酸またはそれをコードするベクター、または本明細書に記載の抗TIGIT構築物をコードする単離核酸またはベクターを含む単離宿主細胞のいずれかを含むキット及び製造品がさらに提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか1つを含むキットが提供され、好ましくは、その使用のための説明書を提供する。
免疫化
最新の動物保護規制に全て従い、組み換えTIGIT-Fc(Acrobiosystems)タンパク質によりラマを免疫化した。免疫化用に、抗原をCFA(完全フロイントアジュバント;一次免疫化)またはIFA(不完全フロイントアジュバント;ブースト免疫化)による乳剤として製剤化した。抗原は、首の筋肉内に投与した。各動物に、CFA乳剤中で100μgのTIGIT-Fcを含む乳剤を5本注射し、続いてIFA乳剤中のTIGIT-Fcを2週間間隔で4回注射した。免疫化の間の異なった時点で、動物から10mlの血液試料を回収し、血清を調製した。抗原特異的体液免疫応答の誘導は、固定化したTIGIT-Hisタンパク質によるELISAに基づく実験で血清試料を用いて確認し(図1及び図2)、重鎖免疫グロブリン(HCAb)を含む応答の十分な誘導を示した。最後の免疫化から5日後、300mlの血液試料を回収した。末梢血リンパ球(PBL)を、ラクダHCAbの遺伝源として、血液試料300mlからFicoll-Paque勾配(Amersham Biosciences)を用いて単離し、1×109個のPBLを得た。
PBLから抽出したRNAを、RT-PCRの出発物質として使用して、sdAbをコードする遺伝子断片を増幅した。これらの断片を社内プラスミドベクターにクローニングした。sdAbコード配列とインフレームで、ベクターは、C末端 His-Tagをコードしていた。ライブラリーサイズは、約6×108個である。ライブラリーファージは、標準プロトコルに従って調製し、滅菌濾過の後、さらなる使用のために4℃で保管した。
選別は、固形パニングならびに細胞に基づくパニングを用いて、上記ライブラリーで実施した。両方の条件について選別を1回だけ行なった。各々の選別のアウトプットを濃縮係数(対照と比べた溶出液中に存在するファージの数)、多様性、及びTIGIT陽性クローンの割合(ELISA)について分析した。これらのパラメーターに基づき、さらなる分析のために最良の選別を選択した。そのために、各々の選別からのアウトプットを、ハイスループットスクリーニング用の可溶性発現ベクターにプールとして再クローニングした。sdAbコード配列とインフレームで、ベクターは、C末端Hisタグをコードしていた。コロニーを採取して、96ディープウェルプレート(1ml容量)で培養し、IPTG及び0.1%Tritonを添加することにより上清中でsdAb発現を誘導した。
sdAb-Fc融合タンパク質の産生
抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質構築物は、抗TIGIT sdAbをヒトIgG1 Fc領域と融合することで生成した。構築物のマキシプレップを調製して、CHO-K1細胞を一過性発現させて、精製した。発現した抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質は、プロテインAアガロース樹脂を含有するカラムを通して、クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質純度は、SEC-HPLCによって決定した。Bristol-Myers Squibbによって生成された抗TIGIT抗体、22G2は、ヒトIgG1バックボーンにおいて、公開特許の配列(US2016/0176963を参照されたい、配列番号7及び9)に従って産生された。ネズミTIGITを遮断するハムスター抗体、10A7は、ヒトIgG1バックボーンにおいて、公開特許で報告された配列(US2015/0216970を参照されたい、配列番号13及び15)に従って産生された。
BIAcore T200機器を利用して、SPRによって、各抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の親和性定数(KD)を決定した。簡単に言えば、ヒト、カニクイザルまたはマウスTIGIT-Hisタンパク質(Acrobiosystems)を、100RU以下の密度でCM5センサーチップにアミン結合させた。抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質を、5つ以上の異なる濃度で注入した。いくつかの例示の抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の動態データを表3にまとめた。
表3.TIGITに対する非ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の親和性決定
細胞結合EC50を決定するため、ヒト、カニクイザルまたはネズミTIGITを発現するCHO-K1細胞を収穫し、勾配濃度の抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質でインキュベートした後、ヒトFcに対する二次抗体をフルオロフォア標識した。遮断アッセイでは、固定濃度のビオチン化CD155-Fcタンパク質(Acrobiosystems)をインキュベーションに加え、CHO/ヒトTIGIT細胞へのCD155-Fcの結合をフルオロフォア標識ストレプトアビジンで検出した。フローサイトメトリーで試料を分析した。抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の結合及び遮断能力のEC50を表4にまとめた。抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質は、陽性対照22G2と同様、または陽性対照22G2より良い、CHO細胞上で発現したヒトTIGITに結合する能力を有した一方、AS19584-Fc、AS19886-Fc及びAS20160-Fcは、22G2よりも優れたリガンド遮断能力を示した。さらに、AS19584-Fcは、CHO細胞上で発現したマウスTIGITに結合し、CHO細胞上で発現したヒトTIGITへのその結合のEC50は同様であることが分かった。マウスTIGIT架橋結合体対照、10A7は、AS19584-Fcと同様の0.709nMのCHO/マウスTIGIT結合EC50で検出された。
表4.TIGITに対する非ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質のリガンド結合データの結合及び遮断
TIGIT/CD155遮断レポーターアッセイは、アッセイキット(Promega、カタログ番号CS198811)のマニュアルに従って、プロメガTIGIT/CD155遮断レポーターアッセイキット(Promega、カタログ番号CS198811)を用いて行った。簡単に言えば、Thaw-and-Use TIGITエフェクター細胞を一晩培養した後、連続希釈の抗TIGIT抗体または抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質でインキュベートし、その後、CD155 aAPC/CHO-K1細胞を適切なE:T比で加えた。37℃、5%CO2で誘導した6時間後、Bio-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、発光を判断した。GraphPad Prism 6ソフトウェアで4パラメーターロジスティック曲線分析を行った。データ曲線を図3に示し、表5にまとめる。AS19584-Fc、AS19886-Fc及びAS20160-Fcは、22G2に匹敵するかまたは22G2よりも優れた遮断機能を有する。
表5.TIGIT/CD155遮断レポーターアッセイ
CT26同系腫瘍モデルにおける10A7及びAS19584-Fcの比較の効力研究
AS19584-Fc融合タンパク質及び10A7は、マウスTIGITと非常に近い細胞結合及び遮断EC50を有するため(表4を参照)、同じモル用量で異なる分子モダリティにおける2つの抗体を比較するように研究を実施した。ネズミCD155を発現するCT26腫瘍細胞を培養し、マグネシウム及びカルシウムを含まないHBSS-/-中に懸濁させて、5×105個の細胞を、6~8週齢の雌のBalb/cマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式:(長さ×幅×幅)/2で算出した。平均腫瘍体積が90~100mm3に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内(i.p.)を介して4日に一度投与した。研究全体を通じて体重を測定した。動物を犠牲にし、投与後の18日目に腫瘍組織を収穫し、コラゲナーゼIV/DNase Iで消化させて、単細胞懸濁液を調製して、表面マーカーCD3/CD4/CD8の染色、及びフローサイトメトリー分析を行った。
CT26腫瘍細胞を培養し、マグネシウム及びカルシウムを含まないHBSS-/-中に懸濁させて、5×105個の細胞を、6~8週齢の雌のBalb/cマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式:(長さ×幅×幅)/2で算出した。平均腫瘍体積が90~100mm3に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内(i.p.)を介して4日に一度投与した。研究全体を通して体重を測定した。
MC38腫瘍細胞を培養し、マグネシウム及びカルシウムを含まないHBSS-/-中に懸濁させて、1×106個の細胞を、6~8週齢の雌のC57BL/6マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式:(長さ×幅×幅)/2で算出した。平均腫瘍体積が90~100mm3に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内(i.p.)を介して4日に一度投与した。研究全体を通して体重を測定した。
抗TIGIT sdAbのヒト化
sdAb AS19584及びAS19886のタンパク質配列を、高度の相同性を共有する5つの最も近いヒト生殖系列配列と整列させた。最良のヒト生殖系列配列は、ヒトアクセプターとして選択した。相同性モデルを作成した。モデル分析データに従って、抗原結合または抗体足場形成に潜在的に重要な残基を手付かずにした一方、残りは、ヒト対応物への変換のために選択した。最初に、4~6個の配列最適化した変異体のパネルを生成した(ステージ1)。これらの変異体を多くのパラメーターについて分析し、得られた結果を使用して、第2セットのsdAbを設計した(ステージ2)。ヒト化sdAbは、それらの名称において「VH」で示した。
ヒト化変異体のうち、AS19584VH28、AS19886VH5、及びAS19886VH8を選択して、親和性及び小規模生産レベルに従って産生し、特徴付けた。ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質構築物は、ヒト化抗TIGIT sdAbをヒトIgG1 Fc領域と融合させることで生成した。構築物のマキシプレップを調製して、HEK293細胞を一過性発現させて、精製した。発現したヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質は、プロテインAアガロース樹脂を含有するカラムを通して、クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質純度は、SEC-HPLCによって決定した。発現結果を表6にまとめた。
表6.ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の発現
加熱中のより大きいタンパク質凝集物の形成は、動的光散乱法(DLS)を用いて検出した。約0.75℃の温度間隔を有する25℃~75℃の温度傾斜を、DYNAPRO(登録商標)NANOSTAR(登録商標)プレートリーダー(Wyatt,Santa Barbara,California)を用いて、1.5mg/mlで抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質試料について行った。20μlの各試料をWYATT(登録商標)使い捨てキュベットに加えた後、試料を10μlの鉱油(Sigma 8410)で覆い、蒸発を防いだ。三重測定(5個の取得/各測定)を抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質試料ごとに平均化した。選択された温度間隔による実験の最中に、熱走査速度は、1.5℃/分になるように算出した。各試料を測定しながら、標的温度が75℃(約40分)に到達するまで温度を継続的に加熱した。凝集温度(Tagg)は、DYNAMICS(商標)7.6.0.48ソフトウェア(Wyatt,Santa Barbara,California)で開始分析方法により分析した。種々の試料の測定された凝集開始温度(Tagg)を表7に示した。
表7.ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の安定性分析
ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の疎水性は、疎水性相互作用 クロマトグラフィー(HIC)によって試験した。各試料は、移動相としてトリス緩衝液(pH7.0)を含有する(NH4)2SO4の量を1ml/分の流量で増加させながら、TSKgel(登録商標)ブチル-NPR HPLCカラム上で分析した。保持時間を使用して、各試料の疎水性を比較した。表8に示すように、全てのヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質は、疎水性に関して適格である。
表8.ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の疎水性分析
溶解度を評価するため、精製したヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質を、交差相互作用クロマトグラフィー(CIC)カラムを用いて測定した。プールマウス血清から精製したネズミポリクローナル抗体は、SigMa-Aldrich(I5381)から購入した。ネズミポリクローナル抗体を樹脂マトリックスに約30mg/mLで連結させた。PBS緩衝液中の精製抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質を、ネズミIgG連結カラム及び対照カラムに0.05~0.20mg/mLの範囲の濃度でそれぞれ注入した。保持時間を使用して、表9に報告された保持因子k’値を算出した:k’=(Vr-Vo)/Vo=(Tr-Tm)/Tm。Vrは、タンパク質連結カラム上の試料の溶出体積を表し、Voは、対照カラムからの溶出体積を表し、Trは、タンパク質連結カラム上の保持時間を表し、Tmは、対照カラム上の保持時間を表す。多くの試料を同じカラム上で2回ランさせた。k’値>0.6の抗体は、一般的に大幅に少ない可溶性である。表9によれば、全てのヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質試料は、優れた溶解度を示した。
表9.ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の溶解度分析
BIAcore T200機器を利用して、SPRによる各抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の親和性定数(KD)を決定した。簡単に言えば、ヒト、カニクイザルまたはマウスTIGIT-His(Acrobiosystems)を、100RU以下の密度でCM5センサーチップにアミンカップリングさせた。抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質を5以上の異なる濃度で注入した。動態データを表10にまとめた。
表10.TIGITに対する抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の親和性決定
抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質が、CHO-K1細胞上で発現したTIGITに結合して、CD155リガンド結合を遮断する能力は、実施例2に記載のものと同じ方法で判断した。抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の結合及び遮断能力のEC50を表11にまとめた。全てのヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質は、それらの親抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質に匹敵する結合及び遮断能力を有する。
表11.TIGITに対する抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の結合及び遮断データ
TIGIT/CD155遮断レポーターアッセイ:研究は、実施例2に記載の方法に従って実施した。22G2は、陽性対照として機能した。データ曲線を図7に示し、表12にまとめる。ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質が、リガンド遮断に関して、それらの親クローンに匹敵する機能を有することを結果が示している。
表12.抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の機能性アッセイ
ヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の薬物動態研究
8週齢のC57BL/6マウスは、3mg/kgの用量で、22G2またはAS19584VH28-Fc融合タンパク質のいずれかの1回の静脈内ボーラス注射を受けた。種々の時点で、末梢血液試料を収穫し、血漿を調製し、サンドイッチELISAを用いて検査抗体の濃度を決定した。WinNonlinを使用して、各検査抗体の薬物動態プロファイルを非コンパートメント分析でモデリングした(モデル201)。データを表13にまとめ、薬物動態曲線を図9に示した。モノクローナル抗体と比較して、抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質は、半減期が短く、クリアランスが高いが、定常状態での見かけの分布量が大きいことを、本研究及びいくつかの他のもの(データ不図示)の結果が示している。
表13.モノクローナル抗TIGIT抗体及びヒト化抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質の薬物動態プロファイル
MC38腫瘍細胞を培養し、マグネシウム及びカルシウムを含まないHBSS-/-中に懸濁させて、1×106個の細胞を、6~8週齢の、ヒトTIGITノックイン(KI)を有する雌のC57BL/6マウスの脇腹に皮下注射した(Biocytogen)。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式:(長さ×幅×幅)/2で算出した。平均腫瘍体積が90~100mm3に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内(i.p.)を介して4日に一度投与した。研究全体を通して体重を測定した。
PD-1×TIGIT及びPD-L1×TIGIT POC二重特異性抗原結合タンパク質(BABP)の構築及び発現
BABPは、完全長抗体に融合した抗TIGIT sdAb、または、Fc領域がC末端にある完全長抗体由来のscFvまたはFab領域、例えば、抗PD-1抗体、例えば、キイトルーダ(登録商標)(ペンブロリズマブ)、PD1-BM-min、オプジーボ(登録商標)(ニボルマブ)、または抗PD-L1抗体、例えば、テセントリク(登録商標)(アテゾリズマブ)、IMFINZI(商標)(デュルバルマブ)、バベンチオ(登録商標)(アベルマブ)、またはヒト化53C1(h53C1)で構築することができる。抗TIGIT sdAbは、リンカー(例えば、9-アミノ酸Gly/Serリンカー(9GSリンカー)、ヒトIgG1(hIgG1)ヒンジ、または変異型hIgG1ヒンジ)を介して、またはリンカーを介さずに、完全長抗体(または、Fc領域がC末端にある完全長抗体由来のscFvまたはFab領域)に連結することができる。BABPは、図17~26に例示するいずれかの構成であり得る。例えば、抗TIGIT sdAbは、N末端またはC末端を介して、重鎖の少なくとも1つ、軽鎖の少なくとも1つ、または重鎖及び軽鎖の両方に融合することができる(図17~20を参照)。
表14.POC PD-L1×TIGIT BABPの発現
POC PD-L1×TIGIT BABPをその親エレメント(抗PD-L1 Ab及び抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質)と比較するため、テセントリク(登録商標)のFc領域を、対照として野生型ヒトIgG1(hIgG1)Fcに変更し、h53C1及びAS19584-Fc融合タンパク質は、対照として、野生型hIgG1 FcまたはエフェクターレスヒトIgG1(不活性hIgG1)Fcのいずれかで産生した。ヒト及びマウスTIGIT-His及びヒトPD-L1は、Acrobiosystemsから購入した。POC PD-L1×TIGIT BABPの親和性は、実施例2に記載のように試験し、データを表15に示した。PD-L1×TIGIT BABPは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体、及び対応するアイソタイプを有する抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質と比較して、標的タンパク質への親和性が同等または僅かに減少している。
表15.POC PD-L1×TIGIT BABPの親和性決定
POC PD-L1×TIGIT BABPが、CHO細胞上で発現したTIGITに結合し、CHO-TIGIT細胞へのCD155結合を遮断する能力は、実施例2に記載されるように評価した。CHO細胞上で発現したPD-L1に結合し、CHO-PD-L1細胞へのPD-1結合を遮断する能力についても、実施例2に記載されるように同様に評価した。22G2は、陽性抗TIGIT Ab対照として使用した。結果を表16にまとめる。PD-L1×TIGIT BABPは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体(抗PD-L1 Ab)、及び対応するアイソタイプを有する抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質と比較して、標的細胞結合及びリガンド遮断能力が同等または僅かに減少している。
表16.POC PD-L1×TIGIT BABPの結合及び遮断データ
PD-L1細胞ベースアッセイ:PD-L1標的細胞(GS-C2/PD-L1、GenScript、カタログ番号M00613)を一晩培養した後、連続希釈の検査試料でインキュベートし、その後、PD-1エフェクター細胞(GS-J2/PD-1、GenScript、カタログ番号M00612)を適切なE:T比で加えた。37℃、5%CO2での誘導の6時間後、One-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、発光を判断した。GraphPad Prism 6ソフトウェアで4パラメーターロジスティック曲線分析を行った。結果を図11に示す。
表17.POC PD-L1×TIGIT BABPのインビトロ機能性アッセイ
MC38-hPD-L1腫瘍モデルを担持するC57BL/6ヒトPD-1ノックイン(KI)マウスの効力研究
MC38腫瘍細胞におけるマウスPD-L1遺伝子をノックアウトして、ヒトPD-L1は、レンチウイルス形質導入によって安定して発現された。生成したMC38-hPD-L1細胞を培養し、マグネシウム-及びカルシウムを含まないHBSS-/-中に懸濁させて、1×106個の細胞を、6~8週齢の雌のC57BL/6 ヒトPD-1 KIマウス(Biocytogen)の脇腹に皮下注射し、ここで、ネズミPD-1遺伝子の細胞外ドメインは、ヒト対応物に置き換えている。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式:(長さ×幅×幅)/2で算出した。平均腫瘍体積が90~100mm3に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内(i.p.)を介して3回投与した。研究全体を通じて体重を測定した。
PD-1×TIGIT及びPD-L1×TIGIT BABPの構築
この実施例は、PD-L1×TIGIT及びPD-1×TIGIT BABPの構造を説明する。
PD-1×TIGIT及びPD-L1×TIGIT BABPの構築
この実施例は、PD-L1×TIGIT及びPD-1×TIGIT BABPの構造を説明する。
ヒトPD-1、PD-L1、ヒトTIGIT、及びマウスTIGITに対するBABPの親和性は、上述のように評価した。結果を表18にまとめた。簡単に言えば、PD-1×TIGIT BABPをその親エレメント(抗PD-1Ab及び抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質)と比較するため、PD1-BM-min及びAS19584VH28-Fc融合タンパク質は、対照として、野生型ヒトIgG4 Fcで産生した。PD-L1×TIGIT BABPをその親エレメント(抗PD-L1 Ab及び抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質)と比較するため、h53C1及びAS19584VH28-Fc融合タンパク質は、対照として、エフェクターレスヒトIgG1(不活性hIgG1)で産生した。ヒト及びマウスTIGIT-His、及びヒトPD-1及びPD-L1は、Acrobiosystemsから購入した。PD-1xTIGIT BABP及びPD-L1×TIGIT BABPの親和性は、実施例2に記載のように試験し、データを表18に示す。PD-1×TIGIT BABP及びPD-L1×TIGIT BABPの両方は、それらのそれぞれの親エレメント:対応するアイソタイプを有するモノクローナル抗体及び抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質と比較して、標的タンパク質に対する親和性が、同程度であるかまたはほんの少しだけ低下している。
表18.PD-1×TIGIT BABP及びPD-L1×TIGIT BABPの親和性決定
PD-1×TIGIT BABP及びPD-L1×TIGIT BABPが、CHO細胞上で発現したPD-1、PD-L1またはTIGITに結合する能力、及び、CHO-PD-L1細胞へのPD-1の結合、CHO-PD-1細胞へのPD-L1の結合、またはCHO-TIGIT細胞へのCD155の結合を遮断するそれらの能力は、実施例2に記載されるように評価した。22G2(IgG1)は、抗TIGITモノクローナル抗体であり、公開配列に従って発現される。Tiragolumab(臨床試験における抗TIGITモノクローナル抗体)、デュルバルマブ及びアテゾリズマブ(両方とも市販の抗PD-L1抗体として)は、それらの公開配列に従って発現され、追加の対照として使用した。結果を表19にまとめる。PD-1×TIGIT BABPは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体(抗PD-1Ab、PD-1-BM-min)、及び対応するアイソタイプを有する抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質と比較して、標的細胞結合及びリガンド遮断能力が同等またはほんの僅かに減少している。PD-L1×TIGIT BABPは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体(抗PD-L1Ab、h53C1)、及び対応するアイソタイプを有する抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質と比較して、標的細胞結合及びリガンド遮断能力が同等またはほんの僅かに減少している。
表19.PD-1×TIGIT BABP及びPD-L1×TIGIT BABPの結合及び遮断データ
PD-1×TIGIT BABP及びPD-L1×TIGIT BABPのインビトロ機能は、実施例2、4及び6に記載されたものと同様に、TIGITに対するPD-1細胞ベースアッセイ、PD-L1細胞ベースアッセイ、TIGIT細胞ベースレポーターアッセイ及びIL-2放出アッセイによって分析した。22G2(IgG1)は、抗TIGITモノクローナル抗体であり、公開配列に従って発現される。Tiragolumab(臨床試験における抗TIGITモノクローナル抗体)、デュルバルマブ及びアテゾリズマブ(両方とも市販の抗PD-L1抗体として)は、それらの公開配列に従って発現され、追加の対照として使用した。結果を表20にまとめる。PD-1×TIGIT BABP及びPD-L1×TIGIT BABPは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体(それぞれ、PD1-BM-min及びh53C1)、及び対応するアイソタイプを有する抗TIGIT sdAb-Fc融合タンパク質と比較して、同等またはほんの僅かに減少したインビトロ機能を示した。PD-L1×TIGIT BABP BTP-21及びBTP-22は、市販の抗TIGIT抗体Tiragolumabと比較して、さらに良好なTIGIT遮断機能を呈した。
表20.PD-1×TIGIT BABP及びPD-L1×TIGIT BABPのインビトロ機能性アッセイ
表21.PD-L1×TIGIT BABPのPD-L1/TIGIT二機能性レポーターアッセイ
BTP-11のインビボ抗腫瘍活性は、ヒトPD-1 KIを有するBalb/cマウスで確立した(ネズミCD155を発現する)同系CT26大腸がんモデルで評価した。このCT26腫瘍モデルは、実施例3のように構築した。腫瘍サイズが約100mm3に到達した場合、動物は処置を受け始めた。被験物質を、腹腔内(i.p.)を介して4日に一度投与した。研究全体を通じて体重を測定した。腫瘍体積が10mm3未満の動物は、無腫瘍(TF)と見なした。
BTP-21のインビボ抗腫瘍活性を評価するため、ヒトPD-L1(MC38-hPDL1)を過剰発現するネズミMC38大腸がん細胞を、実施例3に記載されたものと同様に、C57BL/6ヒトPD-1/PD-L1ダブルKIマウスに移植した。アテゾリズマブ(市販の抗PD-L1抗体)は、公開配列に従って発現され、追加の対照として使用した。腫瘍サイズが約100mm3に到達した場合、動物を無作為化して処置した。被験物質を、腹腔内(i.p.)を介して、0、4、6、及び8日目に投与した。研究全体を通じて体重を測定した。
表22.抗TIGIT sdAb配列番号
配列番号246(AS19584 sdAb核酸配列)
CAGGTGCAACTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACAAGTACGGTGTCTACTCCATGGGCTGGTTCCGCCTGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCCATTTGTAGTGGCGGTAGAACCACATACTCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAGCGCCAACCAAATTCTGTATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAAGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCCCGACCTCTATGGACTGGGGACTGCGATTTAAGCTCATCTTGGTATAAAACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号247(AS19852 sdAb核酸配列)
CAGGTGCAGCTGGCGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGACTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAACACCGGTAGTCGCCGGTATGTGGCATGGTTCCGCCAGGCGCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGTGTCGCACGACTCATTACTGATAGTGGCAGCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGAAGAATTAGCACCAGCTCGCAGCGGTGGTATTTGGTTTGGTGGACGGTACTTCAGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号248(AS19858 sdAb核酸配列)
CAGATTCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACGTCTGGATACACGTACAGACAGAAATGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCGATTTATACTTCTGTTGGTGGTAGTAGGACATACGTTGCCGACTCCGCGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCCAAGACAACGCCAAAAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCCAAGAGTCCGTACGATGGTGCATGCTCTTACGAAGCTGACTTTACTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号249(AS19886 sdAb核酸配列)
CAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATACACCTATAGTAGGAAATGTAGGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCGACTCTTTATACTAGTTCAGGGGGGACATATTTTGACACCTATGCCGACTCCGTGAGGGGCCGGTTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAACCTGAAACCGGAGGACAGTGGCATATACTACTGTGCGGCACGCCTGAGTACGGACTTTTGCGGACCAAGAGCTGACTTTGATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号250(AS19887 sdAb核酸配列)
CAGGTGCAGCTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAGTCACCTCCGATAGTTACCACATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGTTATTAAAACTGGTGATGCCAGCACATACTATACCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGACGGGGTTGGGTGCCGGCTCCCCTCTCGCAATATAATTATAACTATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号251(AS19888 sdAb核酸配列)
CAGGTGCAACTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGACTGGAGGGTCTCTGAGACTTTCCTGTGAAGCCTCTGGAGTGGCCGCCAGTGGCTACTGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGAGCGCGAAAGGGTCGCAGCTATTAGTAGTAATGATCTAGTTGCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAGGACAACGCCAAGACCACTCTGTATCTACAAATGAACAACCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATGGAGGTTATGGTGGTTACTGCGGACGGTTGCGACCTGGCACTGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号252(AS20160 sdAb核酸配列)
GAGGTGCAGCTGGCGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAACCTCTGGATACACCTACAGTCGCAACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAACTATTTATGTAAGTGCTGCAAGCACAAGCTTTGCCACATATGCCGACTCCGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCCTAGACAAGGCCAAGAACACGGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATCCCCCCGATCGTATCTCGAACCCCTGCGGACCCCGCCGCCCTGACTTTGGATACTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号253(AS19584 sdAbアミノ酸配列;CDRは下線付き)
ESKYGPPCPPCP
配列番号325(キイトルーダバイオシミラー(IgG4)mAb_HCアミノ酸配列;CDRは下線付き)
GYIFTGYGIT
配列番号350(h53C1 HC-CDR2アミノ酸配列)
EIFPRRVQTYYSEKFKG
配列番号351(h53C1 HC-CDR3アミノ酸配列)
DYDPYFALDY
配列番号352(h53C1 LC-CDR1アミノ酸配列)
RASQDVSTAVD
配列番号353(h53C1 LC-CDR2アミノ酸配列)
SASYRYT
配列番号354(h53C1 LC-CDR3アミノ酸配列)
QQHYSIPFTF
配列番号355(ヒト不活性IgG1 Fc領域アミノ酸配列)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号356(ヒトIgG1 Fc領域アミノ酸配列)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表23.抗TIGIT/PD-1及び抗TIGIT/PD-L1二重特異性抗体アミノ酸配列(sdAb配列は下付き、リンカー配列は太字)
配列番号365(AS19584 sdAb-Fc(不活性IgG1)融合タンパク質二量体型アミノ酸配列;CDRは下線付き、リンカーは太字)
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG
配列番号369(ヒトTIGITアミノ酸配列の細胞外ドメイン)
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP
配列番号370(ヒトIgG1(hIgG1)ヒンジアミノ酸配列)
EPKSCDKTHTCPPCP
配列番号371(変異型ヒトIgG1(hIgG1)ヒンジアミノ酸配列)
EPKSSDKTHTSPPSP
配列番号372(リンカーペプチド(9GS)アミノ酸配列)
GGGGSGGGS
配列番号373(リンカーペプチドアミノ酸配列)
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号374(リンカーペプチドアミノ酸配列、nは少なくとも1つの整数)
(G)n
配列番号375(リンカーペプチドアミノ酸配列、nは少なくとも1つの整数)
(GS)n
配列番号376(リンカーペプチドアミノ酸配列、nは少なくとも1つの整数)
(GSGGS)n
配列番号377(リンカーペプチドアミノ酸配列、nは少なくとも1つの整数)
(GGGS)n
配列番号378(リンカーペプチドアミノ酸配列、nは少なくとも1つの整数)
(GGGGS)n
配列番号379(デュルバルマブVHアミノ酸配列;CDRは下線付き)
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号390(PD1-BM-min_HCアミノ酸配列;CDRは下線付き)
Claims (29)
- TIGITを特異的に認識する単一ドメイン抗体(sdAb)部分(抗TIGITsdAb部分)を含む単離抗TIGIT構築物であって、前記抗TIGITsdAb部分が、以下:
配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR1;配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR2;及び配列番号176のアミノ酸配列を含むCDR3
を含み、前記単離抗TIGIT構築物が抗体またはタンパク質である、単離抗TIGIT構築物。 - 前記抗TIGITsdAb部分が、以下:
(I)a-1)37位のアミノ酸残基が、F、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T、及びPからなる群から選択され;
a-2)44位のアミノ酸残基が、E、Q、G、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M、及びIからなる群から選択され;
a-3)45位のアミノ酸残基が、L、R、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D、及びVからなる群から選択され;
a-4)103位のアミノ酸残基が、W、R、G、S、K、A、M、Y、I、F、T、N、V、Q、P、E、及びCからなる群から選択され;及び
a-5)108位のアミノ酸残基が、Q、L、R、P、E、K、S、T、M、A、及びHからなる群から選択され;または
(II)b-1)37位のアミノ酸残基が、F、Y、L、I、及びVからなる群から選択され;
b-2)44位のアミノ酸残基が、E及びQからなる群から選択され;
b-3)45位のアミノ酸残基が、R及びLからなる群から選択され;
b-4)103位のアミノ酸残基が、W、R、G、及びSからなる群から選択され;及び
b-5)108位のアミノ酸残基が、Q及びLからなる群から選択され;または
(III)c-1)37位のアミノ酸残基が、F、Y、L、I、及びVからなる群から選択され;
c-2)44位のアミノ酸残基が、A、G、E、D、Q、R、S、及びLからなる群から選択され;
c-3)45位のアミノ酸残基が、L、R、及びCからなる群から選択され;
c-4)103位のアミノ酸残基が、P、R、及びSからなる群から選択され;及び
c-5)108位のアミノ酸残基が、Q及びLからなる群から選択され;
のいずれか1つのアミノ酸配列を含むVHHドメインを含み、
前記アミノ酸位置が、Kabat番号付けに従っており、108位がQである場合、108位が、Lに適宜ヒト化することができる、請求項1に記載の単離抗TIGIT構築物。 - 前記抗TIGITsdAb部分が、配列番号253、271、273~276のいずれか1つのアミノ酸配列を含むVHHドメイン、または配列番号253、271、273~276のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項1または2に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記抗TIGITsdAb部分が、ラクダ、または部分ヒト化である、請求項1~3のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記単離抗TIGIT構築物が、抗TIGITsdAb-Fc融合タンパク質である、請求項1~4のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
- (i)前記抗TIGITsdAb-Fc融合タンパク質が二量体である、および/または(ii)前記Fcが、ヒトIgG1(hIgG1)Fc、エフェクターレス(不活性)hIgG1 Fc、もしくはhIgG4 Fcである、請求項5に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記抗TIGITsdAb-Fc融合タンパク質が、配列番号288、306、308~311、及び365~367のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項5または6に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記単離抗TIGIT構築物が、第2のエピトープを特異的に認識する第2の抗体部分をさらに含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記第2の抗体部分が、完全長抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、一本鎖Fv(scFv)、scFv-scFv、ミニボディ、ダイアボディ、またはsdAbである、請求項8に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記抗TIGITsdAb部分、及び前記第2の抗体部分が、ペプチドリンカーによって適宜連結される、請求項8または9に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記ペプチドリンカーが、配列番号324及び370~378のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記第2の抗体部分が、2つの重鎖及び2つの軽鎖からなる完全長抗体である、請求項8~11のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記重鎖のFc断片が、IgG1 Fc、エフェクターレスIgG1 Fc、IgG2 Fc、またはIgG4 Fcである、請求項12に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記単離抗TIGIT構築物が、以下
(i)前記抗TIGITsdAb部分のN末端が、前記完全長抗体の少なくとも1つの重鎖のC末端に融合される、
(ii)前記抗TIGITsdAb部分のC末端が、前記完全長抗体の少なくとも1つの重鎖のN末端に融合される、
(iii)前記抗TIGITsdAb部分のN末端が、前記完全長抗体の少なくとも1つの軽鎖のC末端に融合される、
(iv)前記抗TIGITsdAb部分のC末端が、前記完全長抗体の少なくとも1つの軽鎖のN末端に融合される、
(v)前記単離抗TIGIT構築物が4つの抗TIGITsdAb部分を含み、各々の抗TIGITsdAb部分のC末端が、前記完全長抗体の各々の鎖のN末端に融合される、および
(vi)前記単離抗TIGIT構築物が4つの抗TIGITsdAb部分を含み、前記4つの抗TIGITsdAb部分のうちの2つがたがいに融合されており、前記完全長抗体の各々の重鎖のN末端にさらに融合される、
からなる群から選択される構成を含む、請求項12または13に記載の単離抗TIGIT構築物。 - 前記完全長抗体が、PD-1を特異的に認識する(抗PD-1完全長抗体)、請求項12~14のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記抗PD-1完全長抗体が、
(i)配列番号385のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH)、及び配列番号386のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)、
(ii)配列番号387のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH)、及び配列番号388のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)、または
(iii)配列番号406のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH)、及び配列番号407のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)
の重鎖相補性決定領域(HC-CDR)および軽鎖相補性決定領域(LC-CDR)を含む、請求項15に記載の単離抗TIGIT構築物。 - 前記抗PD-1完全長抗体が、配列番号390のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号391のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、
(i)前記抗PD-1完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて重鎖融合ポリペプチドを形成し、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号394もしくは396のアミノ酸配列を含むか、または
(ii)前記抗PD-1完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて軽鎖融合ポリペプチドを形成し、前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号399もしくは401のアミノ酸配列を含む、
請求項15または16のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。 - 前記完全長抗体が、PD-L1を特異的に認識する(抗PD-L1完全長抗体)、請求項12~14のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物。
- 前記抗PD-L1完全長抗体が、
(i)配列番号349のアミノ酸配列を含むHC-CDR1、配列番号350のアミノ酸配列を含むHC-CDR2、及び配列番号351のアミノ酸配列を含むHC-CDR3、配列番号352のアミノ酸配列を含むLC-CDR1、配列番号353のアミノ酸配列を含むLC-CDR2、及び配列番号354のアミノ酸配列を含むLC-CDR3、
(ii)配列番号339のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号340のアミノ酸配列を含むVL、
(iii)配列番号323もしくは327のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(iv)配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖、
(v)配列番号379のアミノ酸配列を含むVHのHC-CDR1~3、及び配列番号380のアミノ酸配列を含むVLのLC-CDR1~3、
(vi)配列番号383のアミノ酸配列を含むVHのHC-CDR1~3、及び配列番号384のアミノ酸配列を含むVLのLC-CDR1~3、
(vii)配列番号381のアミノ酸配列を含むVHのHC-CDR1~3、及び配列番号382のアミノ酸配列を含むVLのLC-CDR1~3、
(viii)配列番号331のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号332のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
(ix)配列番号333のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号334のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項18に記載の単離抗TIGIT構築物。 - (i)前記抗PD-L1完全長抗体が、配列番号327のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗PD-L1完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて重鎖融合ポリペプチドを形成し、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号343のアミノ酸配列を含むか、
(ii)前記抗PD-L1完全長抗体が、配列番号323のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗PD-L1完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて重鎖融合ポリペプチドを形成し、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号357または359のアミノ酸配列を含むか、
(iii)前記抗PD-L1完全長抗体が、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗PD-L1完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて重鎖融合ポリペプチドを形成し、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号341または402のアミノ酸配列を含むか、
(iv)前記抗PD-L1完全長抗体が、配列番号323のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号328のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗PD-L1完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて軽鎖融合ポリペプチドを形成し、及び前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号362または364のアミノ酸配列を含むか、
(v)前記抗PD-L1完全長抗体が、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号330のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗PD-L1完全長抗体の軽鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて軽鎖融合ポリペプチドを形成し、及び前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号405のアミノ酸配列を含むか、
(vi)前記抗PD-L1完全長抗体が、配列番号331のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号332のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗PD-L1完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて重鎖融合ポリペプチドを形成し、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号347のアミノ酸配列を含むか、または
(vii)前記抗PD-L1完全長抗体が、配列番号333のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号334のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗PD-L1完全長抗体の重鎖の少なくとも1つが、前記抗TIGITsdAb部分に融合されて重鎖融合ポリペプチドを形成し、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号345のアミノ酸配列を含む、
請求項18または19に記載の単離抗TIGIT構築物。 - (a)前記単離抗TIGIT構築物がN末端からC末端に4つのポリペプチド:(i)VL-CL、(ii)VH-CH1-必要に応じてペプチドリンカー-第1の抗TIGITsdAb部分-CH2-CH3、(iii)VH-CH1-必要に応じてペプチドリンカー-第2の抗TIGITsdAb部分-CH2-CH3、および(iv)VL-CLを含み、ポリペプチド(i)のVL-CLおよびポリペプチド(ii)VH-CH1が、第2のエピトープを特異的に認識する第2の抗体部分を形成し、ポリペプチド(iv)のVL-CLおよびポリペプチド(iii)VH-CH1が、第3のエピトープを特異的に認識する第3の抗体部分を形成する、
(b)前記単離抗TIGIT構築物がN末端からC末端に2つのポリペプチド:(i)第2のエピトープを特異的に認識する第1のscFv-必要に応じてペプチドリンカー-第1の抗TIGITsdAb部分-CH2-CH3、および(ii)第3のエピトープを特異的に認識する第2のscFv-必要に応じてペプチドリンカー-第2の抗TIGITsdAb部分-CH2-CH3を含む、
(c)前記単離抗TIGIT構築物がN末端からC末端に4つのポリペプチド:(i)VL-CL-必要に応じてペプチドリンカー-第1の抗TIGITsdAb部分-CL、(ii)VH-CH1-必要に応じてペプチドリンカー-第2の抗TIGITsdAb部分-CH1-CH2-CH3、(iii)VH-CH1-必要に応じてペプチドリンカー-第3の抗TIGITsdAb部分-CH1-CH2-CH3、および(iv)VL-CL-必要に応じてペプチドリンカー-第4の抗TIGITsdAb部分-CLを含み、ポリペプチド(i)のVL-CLおよびポリペプチド(ii)VH-CH1が、第2のエピトープを特異的に認識する第2の抗体部分を形成し、ポリペプチド(iv)のVL-CLおよびポリペプチド(iii)のVH-CH1が、第3のエピトープを特異的に認識する第3の抗体部分を形成する、ならびに
(d)前記単離抗TIGIT構築物がN末端からC末端に4つのポリペプチド:(i)第1の抗TIGITsdAb部分-CL、(ii)第2のエピトープを特異的に認識する第1のscFv-必要に応じてペプチドリンカー-第2の抗TIGITsdAb部分-CH1-CH2-CH3、(iii)第3のエピトープを特異的に認識する第2のscFv-必要に応じてペプチドリンカー-第3の抗TIGITsdAb部分-CH1-CH2-CH3、および(iv)第4の抗TIGITsdAb部分-CL を含む、
からなる群から選択される構成を含む、請求項8~11のいずれか一項に記載の単離抗TIGIT構築物。 - 請求項1~21のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物、及び適宜、薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 個体においてTIGIT関連疾患を治療するための医薬であって、前記TIGIT関連疾患の治療に有効な量の、請求項1~21のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物または請求項22に記載の医薬組成物を含む、医薬。
- 前記TIGIT関連疾患が、がん、病原性感染または免疫関連疾患である、請求項23に記載の医薬。
- (i)前記がんが、固形腫瘍であるか、
(ii)前記病原性感染が、ウイルス感染であるか、または
(iii)前記免疫関連疾患が、T細胞機能不全障害と関連する、
請求項24に記載の医薬。 - (i)前記固形腫瘍が、大腸がんであるか、または
(ii)前記T細胞機能不全障害がT細胞消耗によって特徴付けられる、
請求項25に記載の医薬。 - 請求項1~21のいずれか1項に記載の単離抗TIGIT構築物をコードする、単離核酸。
- 請求項27に記載の単離核酸を含む、ベクター。
- 請求項27に記載の単離核酸、または請求項28に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
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