JPH06511379A

JPH06511379A - セルラーゼ遺伝子及びその他の酵素遺伝子を欠失したもしくは豊富なＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ、ならびにそれに由来するセルラーゼ組成物

Info

Publication number: JPH06511379A
Application number: JP3517943A
Authority: JP
Inventors: ウォード，マイケル; シューメイカー，シャロン　ピー; エルワイス，ジェフリー
Original assignee: ジェネンコア　インターナショナル　インコーポレーテッド
Priority date: 1990-10-05
Filing date: 1991-10-04
Publication date: 1994-12-22
Also published as: DK0553280T4; DK0551386T3; DE69132894D1; ATE257511T1; ATE211773T1; DE69133352D1; CA2093428C; JPH06502226A; ES2170748T3; EP0553280B1; CA2093424A1; EP0551386A1; EP0551386B1; FI931491A0; FI931492A; JPH06502223A; EP0551386A4; DE69132894T3; FI931495A; CA2093424C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】４７、かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能成分ＣＢＨＩＩを生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｊ形質転換細胞。

４８、かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能成分ＥＧＩを生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。

４９、かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能成分ＥＧＩ■を生成しないことを特徴とするｒｒｔｃｈｏａｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。

５０、かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能的な低ｐｉキシラナーゼタンパク質を生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞０５１、かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能的な高ｐＩキシラナーゼタンパク質を生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｗａ　ｒｅａｓｅｔ形質転換細胞０５２、かなり相同性の高いＤＮＡを含み、セルラーゼの機能成分ＥＧＩを過剰表現することを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞０５３、かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能的な高ｐｒキシラナーゼタンパク質を過剰表現することを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞０５４、かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能的な低ｐＩキシラナーゼタンパク質を過剰表現することを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｓａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。

５５、選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｎａ　ｒｅｅｓｅｊ　ｃ　ｂ　ｈ１遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。

５６、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。

５７、選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｃ　ｂ　ｈ２遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。

５８、請求の範囲第５７項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。

５つ１選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｅ　ｇ　１１遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。

６０、請求の範囲第５９項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。

６１、選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｅ　ｇ　１３遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。

６２、請求の範囲第６１項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。

６３、選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩａ　ｒｅｅｓｅｉ低ｐｉキシラナーゼ遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。

６４、請求の範囲第６３項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。

６５、選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ高ｐＩキシラナーゼ遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。

６６．請求の範囲第６５項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。

６７、低ｐＩキシラナーゼタンパク質をコードしたことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子。

６８、高ｐ■キシラナーゼタンパク質をコードしたことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｌ遺伝子。

６９、かなり精製度の高いことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ由来の低ｐＩキシラナーゼタンパク質。

７０、さらに図１６に記載したアミノ酸配列を有し、かなり精製度の高いことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉ由７１、かなり精製度の高いことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ由来の高ｐＩキシラナーゼタンパク質。

７２、さらに図１６に記載したアミノ酸配列を有し、かなり精製度の高いことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉ由来の高ｐＩキシラナーゼタンパク質。

７３、ａ）ＱＡトリスアクリル陰イオン交換樹脂カラムに細胞溶解酵素溶液を載せ、ｂ）前記の低ｐＩキシラナーゼを溶出させる各工程からなることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｊの低ｐｌキシラナーゼタンパク質の精製方法。

７４、ａ）ＱＡトリスアクリル陰イオン交換樹脂カラムに細胞溶解酵素溶液を載せ、ｂ）流出液を回収し、Ｃ）該流出液を陽イオン交換樹脂上に装填し、前記高ｐＩエキシラナーゼを溶出せしめる各工程からなることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの高ｐＩキシラナーゼタンパク質の精製方法。

明　細　書もしくは豊富なＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｊ、ならびにそれに由来するセルラーゼ組成物発明の背景発明の分野本発明は、繊維状糸状菌のＴｒｌｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの形質転換方法、Ｔｒｊｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉを形質転換させるための選択マーカーを含む相同性ＤＮＡによるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｓａ　ｒｅｅｓｅｉの形質転換、かなり相同性の高いＤＮＡの線状ＤＮＡ断片を用いて形質転換させることによるＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉの遺伝子欠失、かなり相同性の高いＤＮＡの線状ＤＮＡ断片を用いて形質転換させることによるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの遺伝子挿入、遺伝工学的手法によるＴｒｊｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの有益な形質転換体の作製、ならびに当該形質転換体により生成されるセルラーゼ組成物に関する。

先行技術セルラーゼ（すなわち、セルラーゼシステム）は、セルロース（β−１，４−Ｄ −グルカン結合）またはその誘導体（例えば、リン酸膨潤セルロース）を加水分解し、主要な分解物として、グルコース、セロビオース、セロオリゴサツカライド等を生成する酵素組成物である。特定の微生物により生産されるセルラーゼシステムは、エキソセロビオヒドロラーゼ類（ＥＣ３，２，１，９１）　じＣＢＨ ”）、エンドグルカナーゼ類（ＥＣ３，２，１，４）　（”ＥＧ″）、及びβ− グルコシダーゼ類（ＥＣ３，２，１゜２１）（”ＢＧ’）（エム・シュレイン、１９８８）として同定されるものを始めとする数種の異なる分類の酵素から成っている。また、これらの酵素分類からさらに各成分に細分することができる。例えば、複数のＣＢＨ型成分（少なくとも２種類のＣＢＨ成分、すなわちＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩを含む）及びＥＧ型成分（少なくとも３種類のＥＧ酸成分すなわちＥＧＩ、ＥＧＩＩ及びＥＧＩＩＩ成分を含む）が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを始めとする多数の細菌及び糸状菌類から分離されている。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉは、文献ではＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ　（ピー−エフ・キャノン、１９８６．マイクロバイオロジカル・サイエンス３　ｐｐ、２８５−２８７）とも称されている。

ＥＧＩＩは以前、文献によってはＥＧＩ　Ｉ　Ｉ’と称されてきたが、現在の命名法ではＥＧＩＩ″が使用されている。いずれにしても、ＥＧＩＩタンパク質は、本明細書に記載したＥＧＩＩＩタンパク質とは、分子量、ｐＩ及び最適ｐＨが全く異なるものである。

結晶性セルロースをグルコースに効果的に転換するためには、ＣＢＨ，ＥＧ及びＢＧ酸成分らなる完全なセルラーゼシステムが必要である。分離した成分は、少しは使えるとしでも、結晶性セルロースの加水分解作用かはるかに低い。さらに、セルラーゼ成分ＣＢＨＳＥＧ及びＢＧの間で、結晶性セルロースに対する相乗作用が認められている。すなわち、全ての成分を含む完全なシステムのセルロース溶解効果は、単独成分の効果を合計したものに比べ、著しく大きい。また、Ｔｒｌｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉまたはＰｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ由来のＣＢＨＩ型及びＣＢＨＩＩ型成分は、綿繊維に相乗的に作用し、可溶化することが証明されている（ウッド、１９８５）、さらに、ＣＢ　ＨＩ　（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来）はそれ自体セルラーゼ成分のうち結合親和力が最も高いが、比活性は最も低く、その他の成分と一緒になって相乗効果を発揮するものと思われる。

結晶性セルロースがセルラーゼ酵素システムにより解重合されるメカニズムは、完全に解明されていない。これまでの学説の範囲を越え、エンドグルカナーゼとエキソ−セロビオヒドロラーゼは結合及びその後加水分解に相互作用を示す多くの証拠が得られ、そのメカニズムは想像されていた以上に複雑であることが明白になっている。すなわち、エンドグルカナーゼがその作用により、エキソ−セロビオヒドロラーゼへの非還元鎖の末端を多数提供するばかりでなく、各種の酵素成分の間で結合及びその後の加水分解に何らかの相互作用も認められる。結晶化度の低い領域で選択的に加水分解が起こり、酵素の作用部位への到達性が解重合反応の限定要因となっている場合が多いと思われる。

エンドグルカナーゼは単独で内部結合に作用しく結晶化度の低いセルロース領域での反応率が高い）、主要な可溶性分解物として、セロビオース、グルコース及びセロオリゴサツカライドを生成する。これとは対称に、エキソ−セロビオヒドロラーゼは、セルロース重合体鎖の非還元性末端に作用し、主要分解物としてセロビオースを生成する。β−グルコシダーゼは重合体には作用しないが、可溶性のセロオリゴサツカライドの非還元性末端に作用し、唯一の分解物として、グルコースを生成する。

従来、セルラーゼは洗剤の洗浄力を高め、あるいは柔軟剤として有益な洗剤の成分であることが知られている。この用途に用いた場合、セルラーゼは洗濯時にセルロース性の材質、例えば綿繊維の一部を分解し、その一方で綿繊維の洗浄及び柔軟性を促進する。綿繊維の正確な洗浄・柔軟化のメカニズムは十分に解明されていないが、セルラーゼによる綿繊維の洗浄及び柔軟化は、セルラーゼ中に存在する各種の成分によるものとされている。例えば、比較例として本明細書に記載した米国特許第０７／４２２，８１４号（米国特許第０７／６８６，２６５号を継続出願するための放棄）には、ＣＢＨＩ型成分に富むセルラーゼを使用した場合綿繊維を減損することなく、優れた洗浄効果が得られることが開示されている。一方、同様に比較例として本明細書に記載した国際出願公告ＷＯ３９１０９２５９号には、そこで規定された基準に適合するエンドグルカナーゼ型成分に富むセルラーゼを使用した場合、混綿繊維の柔軟度の向上が得られることが開示されている。従って、各種セルラーゼ成分が洗浄及び柔軟効果に影響を与えることから、これらの成分を分離精製し、その１種類または複数の特定成分に富む洗浄剤組成物を調製することが望ましい。

このように特定成分に富むセルラーゼを分離する方法の１つとしては、精製法がある。しかし、クロマトグラフィー法、電気泳動法等による発酵ブロスからの精製は、一般に時間とコストがかかる。遺伝子操作により、１種類または複数のセルラーゼ成分を欠失または挿入した微生物菌株を作り出すことにより、セルラーゼの商品としての利用性が非常に向上するものと思われる。

この点で、不完全菌類のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの特定菌株ならびにその他の菌株は、容量当りの細胞外セルラーゼの生産能が高いことが知られている。実際に、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＤａｒｅｅｓｅｉはタンパク質分泌能が高いため、転換菌株の作製及びセルラーゼの生産を目的としたホスト菌として適当であると思われる。

従来、キシラナーゼは多くの生産工程に有益であることが知られている。一般に、キシラナーゼ酵素はヘミセルロースやその他の植物多糖類等のキシラン重合体の加水分解または修飾に用いられる。キシラナーゼ酵素は、木材パル動物用飼料の生産などに限らず多くの利用分野があることが知られている。遺伝子操作によりセルロース分解酵素を含まないキシラナーゼタンパク質を過剰表現する微生物菌株を作製すると、キシラナーゼの実用性は非常に高くなるものと思われる。

形質転換は、ホスト微生物に遺伝子物質を挿入するもので、公知の技術である。

この技術は、原核生物では十分に確立されているが、真核生物などの高等な生物では、多くの場合依然として試験段階にある。糸状菌の形質転換は、細胞壁の透過性が低いためある程度限界があり、多くの場合、ＤＮＡのホスト菌株への取り込みが制限される傾向にある０最近、麦酒酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の外側の細胞壁を各種の酵素で切断し、ホストのＤＮＡ取り込みを促進することにより、その形質転換システムが開発されている。クローン化したＤＮＡの塩基アミノ酸配列をホスト菌に導入し、相同性の組換えを起こさせる。すなわち、ゲノムのＤＮＡセグメントとプラスミド上に存在する類似のＤＮＡセグメントの間の組換えにより、プラスミドをゲノム内に組み込む。

また、一部のプラスミドは自己複製することができ、酵母菌中で宿主細胞のゲノムから独立して存在する。

さらに、サツカロミセス属（ヒネンら、１９７８；ベッグスら、１９７８）、ノイロスポラ属（カセら、１９７９）、ポドスポーラ属（ツジンスキー、１９８０、スタールら、１９８２）、シゾサツカロミセス属（ビーチら、１９８１）、アスペルギルス属（バランスら、１９８３）及びシゾフィーラム属（ウルリッヒら、１９８５）等多くの糸状菌について、形質転換が試みられているが、大きな成果は得られていない。しかし、糸状菌の間では、使用したホスト菌により形質転換方法が全く異なる傾向があり、糸状菌細胞の形質転換には共通した単一の方法はないものと思われる。従来の技術によると、各糸状菌の性質が特異的であるため、きわめて多様な形質転換方法及び手順が報告されている。これは、一部にはＤＮＡのホスト菌細胞へのアクセス、ホスト菌におけるＤＮＡの保持（例えば、自己複製プラスミドとして存在するか、またはホスト細胞のゲノムに組込まれた状態で存在するか）、及び遺伝子の表現が各糸状菌で全く異なるためと考えられる。

また、糸状菌のうち特定のホスト菌は、形質転換過程で得られたホスト細胞のゲノム中にＤＮＡを組込む場合、その目標設定に大きな影響を及ぼすことが知られている。糸状菌において、クーロン化または組換えＤＮＡで形質転換を行なった場合、ホスト菌中へのＤＮＡのアミノ酸配列の組込みは、ゲノムの相同性領域よりもむしろ二次部位で起こることが知られている（カセら、１９７９　；カセ、１９８６；ダワレら、１９８５；バイエッタ及びマルズルフ、１９８５）。

かってＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの形質転換方法としてベクター系に存在する異質ＤＮＡが使用されたが、このＤＮＡはホスト菌に組込むことができる選択マーカーを含んでいる。

細菌のプラスミドＤＮＡを組込んだ環状ベクターを使用し、選択マーカー遺伝子は別の菌から取っていた。例えば、ヨーロッパ特許出願筒０．２４４．２３４号によれば、アスペルギルス・ニジ二ランスに由来する選択マーカーａｒｑＢ、ｔｒｐＣまたはａｍｄｓを用いてＴｒｉｅｈＯｄｅｒｌａ　ｒｅｅｓｅｉの形質転換が行なわれている。また、ノイロスポラ・クラッナに由来するｐｙｒ４を利用することも開示されている。

これらの選択マーカーはいずれもホスト菌にとって異質な遺伝子であり、したがって形質転換菌の誘導に異質ＤＮＡが導入されている。

タンパク質生産を目的とした菌株に異質ＤＮＡのアミノ酸配列を挿入した場合、製造承認にあたって、ゲノム内の既知部位に相同ＤＮＡのみを挿入した場合よりも広範な試験が要求される。さらに、ホストゲノム内の非相同部位に異質ＤＮＡのアミノ酸配列を組込んだ場合、当該微生物により分泌されるタンパク質のスペクトルが予期せぬ変化を示し、その結果製品に変化が起こることもある。

相同性ＤＮＡの線状断片を用いたＤＮＡ介在形質転換により、アスペルギルス・ニジ二ランスの遺伝子欠失株が作製されている（ミラーら、１９８５）。アスペルギルス・ニジ二ランスＤＮＡの中心ａ　ｒｑＢをコードしたａ　ｒｑＢ遺伝子座からＤＮＡ断片を削除し、アスペルギルス・ニジ二ランスｔ　ｒｐＣ遺伝子と置換した。このＤＮＡを用いて、ｔｒｐＣ−ａｒｑＢ＋株をｔｒｐＣ”株に形質転換した。

転換菌株の一部（３０％）では、期待したようにゲノムのａ　ｒｑＢ遺伝子座に挿入したＤＮＡが組込まれ、それによってａｒｑＢ遺伝子の欠失が起こった。したがって、得られた菌株はｔ　ｒｐＣ”　ａ　ｒｑＢ−株であった。しかし、ミラーらは、当該転換菌株によるタンパク質の分泌については全く開示していない。

一方、選択マーカーとしてｇａ−２遺伝子を用い、ノイロスポラ・クラッサのａｍ遺伝子欠失株を作製するため、同様な実験が行なわれている（パイエッタ及びマルズルフ、１９８５）。この菌では、非相同性組込みがきわめて広く起こり、形質転換ＤＮＡの多重複写の組込みがしばしば起こる。目的とした遺伝子の欠失が認められる場合もあるが、単一の線状ＤＮＡ断片がａｍ遺伝子座に期待通り、単一で組込まれたという例は開示されていない。

上記のように、糸状菌においては期待通りに各種のタンパク質生産株に形質転換させることは困難である。各種の菌株について形質転換を行なうために色々な方法が用いられているが、いずれの場合にもＤＮＡが必ずしもゲノムの目的とした位置に組込まれるとは限らない。形質転換を行なう場合には、ホスト微生物の選択がきわめて重要である。

使用する微生物は、少なくともある程度の割合の形質転換体でゲノムの相同部位に組替えＤＮＡを組込むことによって形質転換する能力を有し、二次部位に組込まれる割合が少なく、目的とするタンパク質を実用的なレベルで生産する能力を有する必要がある。したがって、セルラーゼの各成分を生産するためには、セルラーゼタンパク質の生産能力がかなり高い微生物をホストとして使用するのが望ましい。上記のように、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｊは、これに適合する菌株の一つである。しかし、選択マーカーとしてｐｙｒ遺伝子を用いて作製したＴｒｉｃｈｏｄｅｒａａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体は、アスペルギルス・ニガー及びノイロスポラ・クラッセの対応する形質転換体と比較して安定性がきわめて低いことが最近報告されている（グルーバーら、１９９０；スミスら、１９９１　）　ｏ　Ｔｒｌｃｈｏｃｉｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉはホストとして望ましい微生物ではあるが、これをホスト菌として用いた場合相同性の高い組替えが得られることを予想することは困難であった。

したがって、本発明の目的は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｌに相同遺伝子または遺伝子断片を導入して、ある種の在来遺伝子欠失菌株またはそれらを過剰表現する菌株を作製することである。さらに、本発明の目的は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに由来するＤＮＡの線状断片を使用することにより、異質ＤＮＡを導入することなく、当該形質転換体を作製することである。本明細書に記載した発明の要約、好ましい実施例及び請求範囲からも明らかなように、本発明はこれらの目的及びその他の目的を達成するものである。

発明の要旨プラスミドから切離し、ゲノムの相同部位に組込まれることのできる相同ＤＮＡの線状断片を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａｒｅｅｓｅｌの形質転換体を作製することができた。さらに、この方法で作製した形質転換体では、線状ＤＮＡ断片をゲノム内の特定の遺伝子座の複写に相同的に組込むので、その遺伝子を欠失させることができる。形質転換により作製した形質転換体は異質ＤＮＡを全く含まないので、分泌されるセルラーゼ酵素等のタンパク質も異質タンパク質を全く含まない。さらに、当該形質転換法で作製した形質転換体は、機能遺伝子を含む線状ＤＮＡ断片をゲノム内の別の遺伝子座に相同的に組込んであるので特定の遺伝子を過剰表現することができる。

したがって、本発明は工程の一側面で、（ａ　）　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの少なくとも一部がかなり相同性の高い線状組替えＤＮＡを取込み、それによって形質転換体を形成する条件下でＴｒｌｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉとかなり相同性の高い線状組替えＤＮＡを処理し、（ｂ）得られたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体を選別することからなるＴｒｉｃｈｏｄｅｒａａ　ｒｅｅｓｅｊの形質転換法に関するものである。

本発明はその組成物の一側面で、セルラーゼ組成物、特に１種またはそれ以上の成分を欠くか、または余分に含むセルラーゼ組成物の合成に使用することができ、相同性タンパク質のみを生産する新規で、有用なＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質変換体に関するものである。

また、本発明はその組成物の別の側面で、成分ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩＳＥＧＩ　Ｉ及びＥＧＩＩＩのいずれが一つまたはそれ以上のセルラーゼタンパク質を含まず、非相同性タンパク質を含まないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体に由来する糸状菌セルラーゼ組成物に関するものである。

本発明はその組成物の別の側面で、一つまたはそれ以上のキシラーゼタンパク質を欠くか、または余分に含み、異質タンパク質を含まないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体に由来する糸状菌キシラーゼ組成物に関するものである。

本発明の好ましい具体例は、特定のプラスミドの調製に関するものであり、当該プラスミドの一部はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉと相同であり、ｃｂｈｌ遺伝子座からｃｂｈｌをコードしているアミノ酸配列を完全に除去し、形質転換の選択マーカーとして機能するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子を挿入したＤＮＡを含む。

本発明の別の好ましい具体例は、特定のプラスミドの調製に関するものであり、当該プラスミドの一部はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに相同てあり、ｃｂｈ２をコードしているアミノ酸配列を完全に除去し、形質転換の選択マーカーとして機能するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子を挿入したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ２遺伝子を含む。

本発明の別の好ましい具体例は、特定のプラスミドの調製に関するものであり、当該プラスミドの一部はＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉに相同てあり、形質転換の選択マーカーとじて機能するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子を挿入することにより、ｅｑ１３をコードしているアミノ酸配列を破壊したＴｒｉｃｈ。

ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｅｑ１３遺伝子を含む。ｅｑ１３遺伝子座はＥＧＩＩタンパク質をコードしている。

本発明の別の好ましい具体例は、特定のプラスミドの調製に関するものであり、当該プラスミドの一部はＴｒｉｃｈｏｄｅｒ■ａ　ｒｅｅｓｅｉに相同であり、ｅｑｌｌをコードして０るアミノ酸配列の一部を除去し、形質転換の選択マーカーとして機能するＴｒｌｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子を挿入したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｅｑｌｌ遺伝子を含む。

本発明の別の好ましい具体例は、特定のプラスミドの調製に関するものであり、当該プラスミドの一部はｃｂｈｌ遺伝子座からｃｂｈｌをコードしているアミノ酸配列を完全に除去し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉのｅｑ１１遺伝子及び形質転換の選択マーカーとして機能するＴｒｉｅｈｏｄｅｒ＋ｏａ　ｒｅｅｓａｉ遺伝子を挿入したＤＮＡを含む。

本発明の別の好ましい具体例は、特定のプラスミドの調製に関するものであり、当該プラスミドの一部はＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｌに相同であり、’ｒｒｔｃｈｏａｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのキシラーゼ遺伝子及び形質転換の選択マーカーとして機能するＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子を含む０図の簡単な説明図１は、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４の構造の概略を示す。

図２は、　Ｔｒｌｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ染色体の１本（こあるｃｂｈ１遺伝子座にｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４から調製した大きなＥｃｏＲＩ断片を組込むことによるＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子の削除を示す。

図３は、ＥｃｏＲＩで切断したｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４で形質転換させたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｇａ　ｒｅｅｓｅｉ　Ｇ　Ｃ６９株のＤＮＡを、３２ｐ標識ｐ△ＣＢＨ１ｐｙｒ４プローブを用いたサザーンプロット法で分析したオートラジオグラフである。分子量の大きさを示すマーカーは、図の左側にキロ塩基対で表示する。

図４は、ＥｃｏＲＩで切断したｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４で形質転換させたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＧ　Ｃ６９株のＤＮＡを、３２ｐ標識ｐｌｎｔｃＢＨＩプローブを用いて分析したオートラジオグラフである。分子量の大きさを示すマーカーは、図の左側にキロ塩基対で表示する。

図５は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの野性型及び形質転換型により分泌されたタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルである。特に図５のカラムＡは部分的に精製したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉのＣＢＨＩであり、カラムＢは野性型Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉであり、カラムＣはｃｂｈｌ遺伝子欠失Ｔｒ　１ｃｈｏｄｅｒｎ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉのタンパク質を示し、カラムＤはｃｂｈｌ及びＣｂｈ２遺伝子を欠失したＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩａ　ｒｅｅｓｅｊのタンパク質を示す。図５で、右側のマークは分泌されたタンパク質中の単一タンパク質の位置を示す。特にＢＧはβ−グルコシダーゼを示し、ＥｌはエンドグルカナーゼＩ、Ｅ２はエンドグルカナーゼＩＩ、Ｅ３はエンドグルカナーゼＩＩＩ、Ｃ１はエキソセロビオヒドロラーゼ■、Ｃ２はエキソセロビオヒドロラーゼＩＩを示す。

図６Ａは、ＤＮＡゲノム上の４．１ｋｂＥｃｏＲＩ断片としてクーロン化したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｌ　ｃ　ｂ　ｈ　２遺伝子座を示す。図６Ｂは、ｃｇｈ２遺伝子欠失ベクターｐＰ△ＣＢＨＩＩを示す。

図７は、ＥｃｏＲＩで切断したｐＰ△ＣＢＨＩＩで形質転換したＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉ　３７　ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６株のＤＮＡを、３２ｐ標識ｐＰΔＣＢＨＩＩプローブを用いたサザーンプロット法により分析したオートラジオグラフである。分子量の大きさを示すマーカーは、図の左側にキロ塩基対で表示する。

図８は、プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４の模式図である。

図９は、エンドヌクレアーゼによる便宜的制限解裂部位を設けるため、ｅｑｌｌ及びｃｂｈｌ遺伝子について行なった特異的修飾を示す模式図である。いずれも上段はもとのＤＮＡのアミノ酸配列を表し、加えた変化は中段に、新しいアミノ酸配列は下段に示す。

図１０は、ｐｃＥＰｃｌから得られる大きなＥｃｏＲ１断片を示す模式図である。

図１１は、形質転換しなかったＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ　Ｃ３０株及びＥｃｏＲＩで切断したｐｃＥＰｃｌで形質転換した２種類のＴｒｉｅｈＯｄｅｒｌＯａ　ｒｅｅＳｅｉの転換株のＤＮＡのオートラジオグラムである。ＤＮＡはＰｓｔｌで切断し、サザーンプロットを得、これを３２ｐ標識ｐＵＣ４：Ｈｃｂｈｌでハイブリッド化した。マーカーＤＮＡ断片の大きさは、図の左側にキロ塩基対で表示する。

図１２は、プラスミドｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１の模式図である。

図１３は、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩで切断したｐＥＧ　Ｉ　Ｉ　：：Ｐ− １で形質転換したＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉＰ　３７ＰΔΔ６７Ｐ−１株のＤＮＡのオートラジオグラムである。サザーンプロットを調製し、ｅｑｌＢ遺伝子を含むＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの放射能標識ＤＮＡの約４ｋｂのＰｓｔｌ断片を用いてハイブリッド化した。カラムＡ、Ｃ及びＥは形質転換を行わなかった株のＤＮＡを表し、カラムＢ１Ｄ及びＦは形質転換を行わなかった株のＤＮＡを表す。カラムＡ及びＢはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＤＮＡをＢｑＩＩＩで切断し、カラムＣ及びＤはＥｃｏＲＶで、カラムＥ及びＦはＰｓｔｌで切断した。マーカーＤＮＡ断片の大きさは図の左側にキロ塩基対で表示する。

図１４は、プラスミドｐＰ△ＥＧＩ−１の模式図である。

図１５は、）ｌｉｎｄｌ　ｌ　Ｉで切断したｐΔＥＧＩｐｙｒ−３で形質転換したＧＣ６９株から単離したＤＮＡのサザーンプロットのオートラジオグラムである。放射能標識ｐ△ＥＧＩｐｙｒ−３プローブを用いてハイブリッド化を行った場合、非形質転換体で期待されるパターンをカラムＣに示す。カラムＡはｅｑｌｌ遺伝子を破壊した形質転換体で期待されるパターンを示し、カラムＢはｐ△ＥＧＩｐｙｒ−３ＤＮＡをゲノムに組込んだが、ｅｑ１１遺伝子を破壊しなかった形質転換体のパターンを示す。カラムＤは、適当な大きさのマーカーを提供するため、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　１で切断したｐΔＥＧＩｐｙｒ−３を含む。マーカーＤＮＡの大きさは図の右側にキロ塩基対で表示する。

図１６は、別の微生物源キシラーゼのアミノ酸配列から推論したクーロン化ＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子のアミノ酸配列を示す０　「高ｐＩＪはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉの高ｐｉキシラーゼのアミノ酸配列を示し、［低ｐｌＪはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍ；１　ｒｅｅｓｅｉの低ｐｌキシラーゼのアミノ酸配列を、ｒｔ　ｒ　１ｃｈｖＪはエム・ヤグチ（ザ・フォース・ケミカル・コンブレス・オブ・ノース・アメリカ、ニューヨーク、１９９１年８月２５−３０日）により開示されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉキシラーゼのアミノ酸配列を、ｒｂａｃｃ　ｉ　ｒＪはバチルス・シルキュランス由来のキシラーゼのアミノ酸配列を、ｒｂａｃｐｕｍＪはバチルス・ブミラス由来のキシラーゼのアミノ酸配列を表す。

発明の詳細な説明ここで用いた用語［相同ＤＮＡＪとは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ以外の微生物に由来するＤＮＡのアミノ酸配列を含まないＤＮＡを意味する。

［かなり相同性の高い組替えＤＮＡＪとは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来の組替えＤＮＡ、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉにおけるＤＮＡのアミノ酸配列に一致するするように合成した組替えＤＮＡであり、連続合成りＮＡの塩基対数か５０を越えないものを意味する。さらに好ましくは、組替えＤＮＡはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｊに由来するか、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｏ＋ａｒｅｅｓｅｉのＤＮＡのアミノ酸配列に一致するように合成したもので、連続合成りＮＡの塩基対数が２５を越えないものを意味する。現在のガイドラインによると、「２５またはそれ以下の塩基対を有する完全なアミノ酸配列ＤＮＡの組込はホスト−ベクター系の修飾とはみなさない」　（米国健康、教育、保険省公衆衛生局国立衛生研究所「保証ホスト−ベクター系の修飾」リコンとナンドＤＮＡテクニカル・ブレティン２　（３）：１３２．１９７９）。

「非相同ＤＮＡ］とは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ以外の微生物から非合成的に生産されたあらゆる起源のＤＮＡ、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｌのＤＮＡのアミノ酸配列に一致するように合成されたものではなく、塩基対数が５０を越える合成りＮＡの断片を意味する。「非相同タンパク質」とは、非相同ＤＮＡでコードされているタンパク質を意味する。

「相同性組替え」とは、組替えＤＮＡが組替えＤＮＡの一部と同じＤＮＡのアミノ酸配列を有するゲノム内の特異的部位に組込まれており、二次部位には組込まれていないことを意味する。

「エンドグルカン（Ｅ　Ｃ）成分」とは、ＴｒｉｅｈＯｄｅｒｌｌａ　ｒｅｅｓｅｌのエンドグルカナーゼの成分である糸状菌のセルラーゼ成分またはその混合物（特に、ＥＧＩ、ＥＧＩ　Ｌ　ＥＧＩＩＩ等の単独またはその混合物）をいう。

「エキソ−セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）成分」とは、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉのエキソ−セロビオヒドロラーゼ成分である糸状菌のセルラーゼ成分（特に、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ等の単独またはその混合物）をいう。

「細胞」とは、Ｔｒｊｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの細胞に由来する細胞または細胞質を意味する。

「過剰表現」とは、遺伝子の別の複写がゲノムに組込まれ、遺伝子でコードされたタンパク質が表現されたとき、ゲノムにおける遺伝子の複写が１個のみの場合と比較してタンパク質の生産量が大きいことを意味する。

本発明は、染色体の部位をＤＮＡで正確に置換することに関するもので、そのＤＮＡのアミノ酸配列はＤＮＡ組替え技術を用いてｉｌ　ｖｉｔｒｏで修飾することもできるし、修飾しなくてもよい。形質転換するホスト微生物の、全ての遺伝子を置換することも可能である。また、本発明は従来の技術を用い、在来のｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｑｌｌまたはｅｑ１３遺伝子、またはその他のクーロン化Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子の修飾、すなわち遺伝子内の特定の核酸の１箇所またはそれ以上の削除及び形質転換微生物における天然遺伝子の置換等を目的とするものである。例えば、タンパク質の触媒部位に存在するアミノ酸を削除または別のアミノで置換することができる。このような１ｎｖｉｔｒｏにおける修飾により、ある種の基質に対する比活性、最終産物阻害、酸化感受性、温度またはｐＨ−活性プロフィールが異なるセルラーゼタンパク質が得られる。

また、本発明はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅＩを形質転換操作し、ゲノム内のある種の標的遺伝子を削除または破壊し、ｅｑｌｌ、ｅｑＩ３等のある種の在来遺伝子の余分な複写を当該菌株に相同的に組込むことを目的とするものである。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉは各種のセルローズ分解酵素を分泌する中温性、腐生性の繊維状糸状菌であり、目的とするセルラーゼ酵素またはそれら酵素の複合物を生産するために使用される。しかし、本発明は、セルロース分解酵素のみの遺伝子操作に限るものではない。本発明はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにおけるあらゆる遺伝子のあらゆる修飾を目的とするものであり、その他のエンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼまたはキシラナーゼをコートしているｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｑｌｌ、ｅｑ１３遺伝子またはウリジンの生合成（例えばｐｙｒ４）、アルギニン生合成、トリプトファン生合成等に必要なその他のカルボヒドラーゼをコードしている遺伝子を含み、これらに限らないクーロン化されたあらゆるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｎ＋ａ　ｒｅｅｓｅ＋遺伝子をゲノムから削除または破壊することができる。ｃｂｈｌとｃｂｈ２遺伝子、ｅｑｌｌとｅｑＩ３遺伝子、及びｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｑｌｌ及びｅｑ１３遺伝子を同時に削除するなど、多重削除し可能である。

形質転換糸状菌の遺伝子削除を可能にするために、まず選択マーカーを選ぶ必要がある。本発明では、形質転換体に存在していてもその性質に影響がない限り、ＴｒｔｃｈｏｄｅｒＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉに内在するあらゆる遺伝子を選択マーカーとして使用することができる。選択マーカーは、測定可能な生産物をコードしている遺伝子でなければならない。選択マーカーはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子の機能複写であり、これがホスト菌に欠失していると、ホスト菌の表現型は栄養要求性となる。選択マーカーは、通常Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉによって代謝されない代謝物を利用できる能力または化学物質の毒性に対する抵抗性、または抗生物質に対する抵抗性等の新規な表現型を規定するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子を使用することができる。また、本発明は公知の方法で合成することのできる合成遺伝子マーカーの利用を目的としている。これらの合成遺伝子は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにおける遺伝子のアミノ酸配列によく似たアミノ酸配列のＤＮＡを含む必要がある。このように導入した選択マーカーに基づいて、形質転換体を選別することができる。

使用するホスト菌は、選んだ選択マーカーに相当する一つまたはそれ以上の非機能的遺伝子を欠失または保有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体となる。例えば、ｐｙｒ４を選択マーカーとして使用する場合、特異的ｐｙｒ−誘導株誘導形質転換体として使用する。その池水発明で使用てきる選択マーカーの例は、アスペルギルス・ニジュランスの遺伝子ａｒｑＢ、ｔｒｐＣＳｎｉａＤ等に相当するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子である。したがって、相当する被形質転換体は、ａ　ｒｑＢ−、ＴｒｐＣ−、ｎ　ｉ　ａＤ−等の誘導株である。

当該菌株は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅａｓｅｔのあらゆる菌株を出発ホスト菌として得られる。しかし、シエイアーーネイスらによって報告されたＲＬ −Ｐ３７株（アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー、２０（１９８４）４６−５３頁）等のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの過剰生産株は、タンパク質、特にセルラーゼ酵素の分泌量が高いので好ましい。この菌株を用いて、形質転換工程で使用する誘導株を調製する。

Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの誘導株は、本明細書で比較例として用いたネバライネンの濾過集積法（ネバライネン、１９８５）等多くの公知の方法で調製することかできる。その他誘導株を調製する方法として、各種の培地条件下で誘導株を分離する方法がある。例えば、各種のアルギニン生合成の中間体を添加した一連の最少栄養培地でａ　ｒｑＢ−誘導株を分離することができる。別の例として、フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）で処理してｐｙｒ４−誘導株を調製することもできる。ｐｙｒ４遺伝子はウリジンの生合成に必要な酵素であるオロチジン−５′　−モノリン酸デカルボキシラーゼをコードしている。無傷のｐｙｒ４遺伝子を有する菌株はウリジンを含まない培地でも生育するが、フルオロオロチン酸に感受性である。ＦＯＡ抵抗性株を選別することにより、機能的なオロチジンモノリン酸デカルボキシラーゼ酵素を欠き、生育のためにウリジンを要求するｐｙｒ４−誘導株を選別することができる。また、ＦＯＡ法を用いて、機能的オロチン酸ピロホスフォリボンルトランスフェラーゼを欠く、ウリジン要求株を得ることもできる。

この酵素をコードしている遺伝子の機能的複写を用い、これらの細胞を形質転換させることが可能である（ベルゲス及びバロイ、１９９１、カーレント・ジエネチックス、１９．３５９−３６５頁）。本発明では、ＦＯＡ抵抗性法によって誘導株を選別することが容易であるので、選択マーカーとしてｐｙｒ４遺伝子を使用することが好ましい。

本発明では、あらゆるプラスミドを用い、ｐＵＣ−誘導株、ｐＢＲ３２２等の選択マーカーをクーロン化することができる。使用するプラスミドは、選択マーカーがプラスミド中に容易に取込まれるようにすることのできる制限酵素部位に基づいて選択する。本発明では、単−ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含むｐＵｃ１８プラスミドを使用するのが望ましい。

ついで、マニアチスら（１９８９）により報告され、本明細書にも比較例としてあげた公知の方法で、選択マーカーを各プラスミドにクーロン化する。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＩ）／ｒ４遺伝子は、スミスら（１９９１）の方法にしたがって、ｐＵｃ１８プラスミドにクーロン化することができる。

さらに、形質転換の過程てＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅａｓｅｔ株から削除するアミノ酸配列をコードしている遺伝子を包含するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノム部位を、公知の方法で第二のプラスミドにクーロン化する。

クーロン化されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅａｓｅｔ株からは、ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｑｌｌ、ｅｑＩ３等あらゆる遺伝子を削除することができる。形質転換体のゲノムから遺伝子が削除できるのみならず、遺伝子を追加複写することも可能である。例えば、ｅｑ１１遺伝子の別の複写を有する形質転換体が望ましい場合がある。本発明は、このような一つまたはそれ以上の遺伝子の追加複写を加えることもできる。

遺伝子の削除または追加にあたっては、制限酵素部位が存在し、相同ＤＮＡ断片を単一な線状断片として除去できるようにプラスミドを選択する。例えば、ｃｂｈｌを削除するにあたっては、ポリリンカ一部分に対称的なＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ制限部位を有するｐＵＣ４にプラスミドを用いるのが好ましい。

形質転換体から削除する遺伝子を、公知の方法でプラスミドに挿入する。ついで、削除または破壊すべき遺伝子を含むプラスミドを、適当な制限酵素部位で切断し、アミノ酸配列をコードしている遺伝子またはその一部を除去し、選択マーカーを挿入する。削除または破壊すべき遺伝子座（好ましくは約０．５〜２．０ｋｂの間）からのＤＮＡのアミノ酸配列フランクは、選択マーカー遺伝子のいずれかの側に残る。側腹部位があまりにも小さい場合には、形質転換の過程で相同的組込が頻繁に起こる。　適当なプラスミドベクターを調製するにあたっては、大腸菌ベクタープラスミドｐＵＣ４Ｋ及びｐＵｃ１８を用いるのが好ましい。

ｐＵＣ４にプラスミドベクターは、元来公表されているＣｂｈｌ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて設計した適当なオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリッド化により、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＲＬ　−Ｐ　３７株のゲノムＤＮＡから得たｃｂｈｌ遺伝子を有する。Ｐｓｔｌでベクターを切断することによりｃｂｈｌ遺伝子をｐＵＣ４にベクターに挿入し、Ｋａｎ″遺伝子を除去し、ｃｂｈｌ遺伝子を含むＴｒｊｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＤ　Ｎ　ＡのＰｓｔｌ断片で連結した。得られたプラスミドｐＵＣ４に：：ｃｂｈ１をＨｉｎｄｌＩＩで切断し、約６ｋｂの大きな断片を単離し、連結してプラスミドｐＵＣ４に：二ｃ　ｂ　ｈ　ＩΔＨ／Ｈを調製した。この手順によってｃｂｈｌコードのアミノ酸配列全体と約１．　２ｋｂから１．５ｋｂまでの側腹のアミノ酸配列を除去した。もとのＰｓｔｌ断片のいずれかの末端からの約１ｋｂの側腹ＤＮＡはそのまま残る。

ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩでプラスミドｐＵＣ４に：：ｃｂｈＩ△Ｈ／Ｈを切断し、ベクターの自己連結を防止するために仔牛の小腸から採ったアルカリホスファターゼで脱リン酸した。

ついで、このＤＮＡを６．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ　ｐｙｒ４遺伝子断片で連結してｐ△ＣＢＨＩｐｙｒ４を得た。また、ｐｙｒ４遺伝子を有するさらに小さいＤＮＡ断片も使用することができる。

適当なプラスミドを調製するにあたって、本発明における別の好ましい具体例を図６Ａに模式的に示す。ＣＢＨＩ■タンパク質をコードしているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ２遺伝子を、ゲノムＤＮＡの４．１ｋｂＥｃｏＲＩ断片としてクーロン化した（チェノら、１９８７）。公知の方法を用いて、ＨｉｎｄＩ１１部位とＣｌａｌ部位の間のＣｂｈ２遺伝子の１．７ｋｂ中心部分を除去し、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子で置換することによってプラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩを構成した。

別の好ましい具体例では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４遺伝子とｅｑ１１遺伝子の末端が相互に接合するようにプラスミドを構成した。

　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子を含む線状断片を単離し、ｐｙｒ４−を形質転換させることによって、プラスミドの組込を避け、ｅｑｌｌ遺伝子の多重複写をゲノムに組込ませた。このプラスミドは図８に模式的に示す。

また、ｃｂｈｌ遺伝子からのプロモーターを融合させてｅｑ１１遺伝子のアミノ酸配列をコードさせるとともに、ｅｑｌｌの終止領域を残した。ｅｑ１１終止領域に隣接して、ｃｂｈｌ遺伝子座の３′側腹部分が存在する。このＣｂｈｌ遺伝子座の３″側腹部分にｐｙｒ４遺伝子を挿入した。

本発明における適当なプラスミドベクターの調製にあたって、別の好ましい具体例を図１２に示す。ＥＧＩＩタンパク質をコードしているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉのｅｑＩ３遺伝子を、ゲノムＤＮＡの４ｋｂＰｓ　ｔ　Ｉ−Ｘｈｏ　１断片としてクーロン化した（サロヘイモら、１９８８、ジーン６３．１１−２１頁）　ｏ　Ｔｒｌｃｈｏｄｅｒｎａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子を含む２．７ｋｂＳａｌｌ断片をＥＧＩＩコードアミノ酸配列の５ａ１１部位に挿入して、ＥＧＩＩコードアミノ酸配列が破壊されるようにプラスミドｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１を構成した。

本発明における適当なプラスミドベクターを調製する別の具体例を図１４に示す。ＥＧＩタンパク質をコードしているＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉのｅｑｌｌ遺伝子を、ゲノムＤＮＡの４．２ｋｂＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片としてクーロン化した（ペンチラら、１９８６、ジーン４５．２５３−２６３頁；ファン・アースデルら、１９８７、バイオテクノロジー５．６０−６４頁）。ＥＧＩコードアミノ酸配列配列心からそのコードアミノ酸配列の３°末端を越える位置までの１ｋｂの部分を除去し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４遺伝子で置換してプラスミドｐＰ△ＥＧＩ−１を構成した。

特異的プラスミドを制限酵素で直線化し、選択マーカーを含む相同ＤＮＡ断片を調製した。当該マーカーは、形質転換の過程で選択マーカーがＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉ誘導株の正確な遺伝子座に組込まれるように働く２箇所の側腹部分の間にあるのが好ましい。形質転換ＤＮＡは二次部位に組込まれる場合もあるが、目的とする遺伝子座に線状ＤＮＡの単一複写が組込まれた形質転換体は、以下に述べる実施例に記載する方法で分離することができる。

特異的プラスミドベクターについては上記の通りであるが、本発明はこれらのベクターの調製に限るものではない。

上記の方法によって、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ株における各種遺伝子を削除または挿入することが可能である。以下に述べるごと（、あらゆる選択マーカーを使用することができる。上記の手順で、クーロン化され、したがって同定されたあらゆるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子をゲノムから削除することができる。例えば、選択マーカー遺伝子によって、ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｑｌｌ及びｅｑ１３遺伝子を削除、または挿入することができる。このような修飾は、いずれも本発明の範囲に含まれるものである。

Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉの細胞壁は透過性がきわめて低いため、目的とするＤＮＡのアミノ酸配列、遺伝子または遺伝子断片の取込は最高でもきわめてわずかである。形質転換工程に先だって、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ誘導株（すなわち、使用する選択マーカーに相当する機能遺伝子を欠く）の細胞壁の透過性を増加させるいくつかの方法がある。

使用できる方法の１例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ細胞に高濃度のアルカリ金属またはアルカリ土金属を添加する方法である。本発明でもあらゆるアルカリ金属またはアルカリ土金属を用いることができるが、好ましくはＣａＣｌ２または酢酸リチウム、さらに好ましくは酢酸リチウムを用いる。アルカリ金属またはアリカリ土金属の濃度は、使用するイオンによって異なる。アルカリ金属イオンの濃度として、一般に約０．０５Ｍから０．４Ｍを使用する。

アルカリ土金属の場合、約０．１Ｍを使用するのが好ましい。酢酸リチウムの濃度は約０．１Ｍか好ましい。

Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉにおける細胞壁透過性を誘導し、ＤＮＡ取込みを助長するために使用される別の方法としては、ソルビトール及びキャリアーの仔牛胸腺ＤＮＡを添加した培養培地に細胞を懸濁させる。ついで、培地にガラスピーズを加え、混合物を高速で約３０分間撹拌する。このようにして細胞壁を破壊することができるが、同時に多くの細胞が死亡する。

形質転換を行うためのＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉ株の別の調製法として、糸状菌の菌糸体からプロトプラストを調製する方法がある。菌糸体は胞子を発芽させ、栄養成長させることによって得ることかできる。菌糸体を酵素処理して、細胞壁を切断し、プロトプラストを得る。ついで、培地に懸濁した浸透圧安定剤の存在下でプロトプラストを保護する。

このような浸透圧安定剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム等がある。通常これらの安定剤の濃度は、０．８Ｍ〜１，２Ｍの範囲にある。懸濁培地中のソルビトールの濃度は約１．２Ｍとするのが好ましい。

ＤＮＡのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉホスト菌株への取込みは、カルシウムイオンの濃度に依存する。取込み溶液中のＣａＣｌ２の濃度は、一般に約１０ｍＭから５０ｍＭの範囲とする。カルシウムイオンの他に、通常ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７，４と１ｍＭのＥＤＴＡ）または１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（モルフォリンプロパンスルフォン酸）　、ｐＨ６，０等の緩衝液及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を取込み溶液中に添加する必要がある。ポリエチレングリコールは細胞壁溶融作用を有し、そのため培地中の成分がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの細胞質に取込まれ、プラスミドＤＮＡが核に移行すると考えられている。この溶融によって、プラスミドＤＮＡの多重複写は、往々にしてホスト染色体中に縦列に組込まれたまま残る。

通常、透過性処理を行ったＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉのプロトプラストまたは細胞を１０８〜１０９／ｍｌ、好ましくは２ｘ１０８／ｍｌの濃度で形質転換に使用する。これらのプロトプラストまたは細胞を、選択マーカーのいずれかの側にかなり相同性の高い側腹部位を有する目的とする線状選択マーカーとともに取込み溶液に添加し、形質転換用混合溶液とする。一般に、高濃度のＰＥＧを取込み溶液に添加する。プロトプラスト懸濁液に対して、０．１〜１倍量の２５％ＰＥＧ４０００を添加することができる。しかし、プロトプラスト懸濁液に対して、約０．２５倍量を添加するのが好ましい。ジメチルスルフオキシド、ヘパリン、スパーミジン、塩化カルシウム等の添加剤を取込み溶液に添加し、形質転換を助長してもよい。

一般に、当該混合液を約０℃で１０〜３０分間培養する。

混合液にＰＥＧを追加し、目的とする遺伝子またはＤＮＡのアミノ酸配列の取込みを助長する。一般に、形質転換用混合液の容量に対して、２５％ＰＥＧ４０００を５〜１５倍量添加するが、それよりも多くても、少なくてもかまわない。２５％ＰＥＧ４０００は形質転換用混合液の容量に対して約１０倍添加するのが好ましい。ＰＥＧを添加した後、形質転換用混合液を室温で振とうし、ソルビトール及びＣａＣｌ２溶液を添加する。ついで、溶融させた生育培地にプロトプラストの懸濁液を添加する。この生育培地上では、形質転換体のみが生育することができる。本発明では、目的とする形質転換体が生育できるあらゆる生育培地を使用することができる。しかし、Ｐｙｒ”形質転換体を選択した場合、ウリジンを含まない生育培地を使用することが好ましい。得られるコロニーをウリジンを含まない生育培地に移し、精製する。

この段階で、ウリジンを含まない平板培地上における生育速度及び周辺がぼろぼろではなく、滑らかな円形のコロニーの形成によって、安定な形質転換体と不安定な形質変換体を区別した。さらに、場合によっては形質転換体を非選択平面培地（すなわちウリジンを含む培地）で生育させ、この培地より胞子を採集し、これら胞子のウリジンを含まない選択培地における発芽及び生育率を測定して、安定性試験を行った。

好ましい具体例として、線状ＤＮＡ断片を用いてｐ△ＣＢＨＩ　ｐ　ｙ　ｒ４から調製される形質転換体はＰ３７Ｐ△ＣＢＨＩ株である。この菌株はｃｂｈｌ遺伝子欠失株である。

ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４からの大きなＥｃｏＲＩ断片をＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉ染色体の一方にあるｃｂｈｌ遺伝子座に組込むことによって行ったＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｃ　ｂ　ｈ　１遺伝子の削除を図２に模式的に示す。別の好ましい具体例として、少なくともｃｂｈｌ遺伝子を削除した形質転換体を作製するため、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４からの線状ＤＮＡ断片を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ株の形質転換を行い、その他のセルラーゼ成分に関連する遺伝子を欠失または過剰表現させることができる。

別の好ましい具体例として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙ　ｒ４遺伝子の一方の端に位置するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｃ　ｂ　ｈ２遺伝子座からの側腹ＤＮＡのアミノ酸配列を含む、直線化され、かなり相同性の高いＤＮＡ断片を調製することができる。例えば、ｐｙｒ４−誘導味であるＧＣ６９を線状断片で形質転換させると、ｃｂｈ２遺伝子欠失株が得られる。同様に、Ｐ３７Ｐ△ＣＢＨＩのｐｙｒ４−誘導味を線状断片で形質転換させ、ウリジンを含まない培地で生育させて選別すると、ｃｂｈｌ及びｃｂｈ２遺伝子のいずれも欠失した形質転換体が得られる。別の好ましい具体例では、線状ＤＮＡ断片を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ株の形質転換を行って少なくともｃｂｈ２遺伝子を削除した形質転換体を作製し、その他のセルラーゼ成分に関連する遺伝子を欠失または過剰表現させることもてきる。

別の好ましい具体例では、ｅｑｌｌ遺伝子座をコードし、そのコードアミノ酸配列の一部をＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙｒ４遺伝子で置換した、線状で、かなり相同性の高いＤＮＡ断片を調製することができる。例えば、線状ＤＮＡ断片でＧＣ６９株を形質転換させると、ｅｑｌｌ遺伝子欠失株が得られる。別の好ましい具体例では、線状ＤＮＡ断片を用いてＴｒｌｃｈｏｄｅｒｉ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉ株の形質転換を行って少なくともｅｑｌｌ遺伝子を削除した形質転換体を作製し、その他のセルラーゼ成分に関連する遺伝子を欠失または過剰表現させることもできる。このような形質転換体は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに由来するセルラーゼのＥＧＩ成分を産生ずることができない。

別の好ましい具体例では、ｅｑ１３遺伝子座をコードし、ＴｒｌｃｈｏｄｅｒＩＩａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子を挿入することによりｅｑ１３コードアミノ酸配列を破壊した、線状で、かなり相同性の高いＤＮＡ断片を調製することができる。例えば、線状断片でＧＣ６９株を形質転換させると、ｅｑ１３遺伝子欠失株か得られる。別の好ましい具体例では、線状ＤＮＡ断片を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｓａ　ｒｅｅｓｅｉｐ　ｙ　ｒ−株の形質転換を行って少なくともｅｑ１３遺伝子を削除した形質転換体を作製し、その他のセルラーゼ成分に関連する遺伝子を欠失または過剰表現させることもできる。このような形質転換体は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに由来するセルラーゼのＥＧＩＩ成分を産生ずることができない。

別の好ましい具体例では、ｃｂｈｌ遺伝子からのプロモーターを含む、線状で、かなり相同性の高いＤＮＡ断片を、ｅｑｌｌ遺伝子のコードアミノ酸配列に溶融させることができる。ついで、ｃｂｈｌからのｐｙｒ４−遺伝子と３′側腹部分を断片に連結する。例えば、ｅｑ１１遺伝子を含むｐｃＥＰｃｌからの線状断片でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙｒ４−の形質転換を行い、ウリジン非存在下で生育させると、在来のｅｑ１１遺伝子のほか、ｃｂｈ１プロモーターのコントロール下でｅｑｌｌ遺伝子がｃｂｈｌ遺伝子座に複写された形質転換体が得られる。別の好ましい具体例では、ｐｃＥＰｃｌからの線状ＤＮＡ断片を用いてＴ「１ｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉｐｙ　ｒ−株の形質転換を行い、多くのセルラーゼ成分遺伝子を欠失し、少なくともｅｑｌｌ遺伝子が過剰表現された形質転換体を作製し、その他のセルラーゼ成分に関連する遺伝子を欠失または過剰表現させた。

別の好ましい具体例では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの低ｐＩまたは高ｐｌ遺伝子のいずれかと、Ｔｒｉｅｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの選択マーカーを含む、線状で、かなり相同性の高いＤＮＡ断片を調製することができる。このＤＮＡ断片でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを形質転換させると、キシラナーゼタンパク質を過剰表現する形質転換体が得られる。

上記の方法で形質転換が起こったことを確認するため、形質転換体についてサザーンプロットのオートラジオグラフィー及び分泌されたタンパク質の等電点電気泳動等の分析を行った。

形質転換体が特定の遺伝子または遺伝子群を欠失または余分な遺伝子複写を含み、異質ＤＮＡを含まないことを確認した後、さらに培養した。ついで、形質転換体から分泌されたタンパク質を採取し、欠失タンパク質を含まないセルラーゼ組成物または補強タンパク質を含むセルラーゼ組成物として使用することができる。

上記のように修飾した微生物は、１種類またはそれ以上の成分を欠くセルラーゼ組成物を調製する上で特に有用である。また、天然のＥＧ成分／ＣＢＨ成分比を含むセルラーゼに比較して、当該セルラーゼ組成物は特殊用途で優れた性質を示す。特に、ＣＢＨＩ成分欠失セルラーゼ組成物、好ましくはＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩ成分欠失組成物は、洗剤組成物、例えば洗濯用洗剤組成物として有用であり、脱色防止、柔軟化等に優れ、混綿繊維の耐久性が向上する。

さらに、当該ＥＧ補強セルラーセ組成物にＣＢＨＩ成分がある程度含まれている（ただし、セルラーゼ組成物の総重量あたり５重量％以下）場合、当該セルラーゼ組成物の洗浄効果が向上する。驚くべきことに、セルラーゼのＣＢＨＩＩ成分は、洗剤組成物としてＥＧ−型の成分と混合した場合、セルラーゼＣＢＨＩ成分の代用とはならず（試験した濃度で）、洗浄効果の向上は得られなかった。

ＣＢＨＩ補強セルラーゼ組成物（すなわち、ＣＢＨＩとＥＣ成分の比が５：１を越える場合）ならびに約５重量％未満のＣＢＨＩ成分を含むＥＧ組成物は、全てのセルラーゼシステムを含む洗剤組成物に比較して、洗剤組成物に対する劣化抵抗性を付与することか認められた。例えば、本明細書に比較例としてそのままを含めた米国特許出願第０７／４２２，８１４号（１９８９年１０月１９日出願）及び米国特許出願第０７／７１３，７３８号を参照。すなわち、当該セルラーゼ組成物で処理した綿織物は、当該セルラーゼ組成物で繰り返し洗っても、全セルラーゼシステムにより得られる強度低下に比較して、強度の低下が少ない。

明らかなように、ＣＢＨＩ成分を補強または欠失したセルラーゼ組成物は、微生物の１またはそれ以上のセルラーゼ成分生産能を選択的に変えることにより生産することができる。

好ましい具体例としてここに記載した約５重量％未満のＣＢＨＩを含むＥＧセルラーゼは、上記のようにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｇａ　ｒｅｅｓｅｉを修飾し、微生物がＣＢＨＩ　Ｉ、好ましくはＣＢＨＩ及びＣＢＨＩ　Ｉ成分を生産できないようにすることによって調製することができる。本発明に係わる修飾微生物は、従来の技術では不可能であった全てのＣＢＨ成分を含まないセルラーゼ組成物を製造することができるので、当該組成物の調製に特に適している。

別の具体例において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩ成分は洗剤組成物として有用であり、ｐＨ７−８で活性が高いので、特に中性／アルカリ性洗剤組成物として使用するのに適している。例えば、本明細書に比較例として含めた米国特許申請第０７／７４７，６４７を参照。ＥＧＩＩＩを補強したセルラーゼ組成物を調製する場合の一方法は、ＣＢＨＩＳＣＢＨＩ　ｌ５ＥＧＩ及びＥＧＩＩを削除することである。

ＣＢＨＩ欠失、ＣＢＨＩ補強、またはＥＧＩＩＩ補強セルラーゼ組成物を含む洗剤組成物において、混綿織物に対する望ましい洗剤の性質、例えば脱色防止、柔軟化及び洗浄力の一つまたはそれ以上を洗剤組成物に付与するのは、セルラーゼの量であり、セルロースから還元糖を生成する特定の酵素組成物の相対的加水分解速度ではないことが知られている。

また、ＣＢＨＩ欠失セルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩ、好ましくはＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩを欠くセルラーゼ溶液を含む溶液で織物を処理しても、綿織物及び衣服（「綿織物」とは綿１００％をいい、混紡は綿４０％までをいう）の感覚及び外観を向上させる効果がある。このように、セルラーゼ組成物は綿織物の外観を向上させるのみならず、全セルラーゼ組成物（システム）に比較して、織物に柔軟性及び劣化抵抗性を付与する。

当該方法は、本明細書に比較例として完全例示した米国特許申請第０７／６７７．３８５号及び米国特許申請第０７／６７８，８６５号に開示されているような紡績への応用に、特に適している。当該具体例において、セルラーゼ組成物の全ＥＧ成分対全ＣＢＨＩ成分の比は５：１またはそれ以上であり、好ましくはＣＢＨＩ成分を含まず、さらに好ましくは全ＣＢＨ成分を含まないのがよい。明らかなように、当該セルラーゼ組成物は、ここに記載した方法を用い、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉからセルラーゼ遺伝子を選択的に削除することにより調製することができた。

本発明ならびにその利点をさらに詳細に説明するために、以下に特定の実施例をあげるが、これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明はそれに限るものではない。

実施例実施例ＩＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４−誘導菌株の選択ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に関与する酵素のオロチジン−５゛−モノリン酸デカルボキシラーゼをコードしている。野生型細胞により、有毒阻害剤の５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）をウリジンに組込み、細胞毒性を付与した。しかし、ｐｙｒ４遺伝子欠損細胞は、この阻害剤に抵抗性を有するが、生育のためにウリジンを要求する。

したがって、ＦＯＡを用いてｐｙｒ４欠損株を選別することができる。実際には、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＲＬ　−Ｐ　３７株（ジー・シエイアーーネイス及びビー・ニス・モンテネコート：アブライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー、２０．４６−５３頁（１９８４））の胞子を、２ｍｇ／ｍｌのウリジン及び１．２ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含む平板培地の表面にひろげた。３〜４日後に自然発生的なＦＯＡ抵抗性コロニーが出現し、その後生育にウリジンを要求するこれらＦＯＡ抵抗性誘導株厚味離することができた。

特にｐｙｒ４遺伝子欠損性のこれら誘厚味を分離するために、プロトプラストを調製し、野生型ｐｙｒ４遺伝子を有するプラスミドで形質転換させた（実施例３及び４を参照）。形質転換後、プロトプラストをウリジンを含まない培地に播いた。形質転換コロニーの形成を観察して、プラスミド由来ｐｙｒ４遺伝子によって欠損ｐｙ「４遺伝子が補充されたことを確認した。このようにして、ＲＬ−Ｐ３７株のｐｙｒ４−Ｘ厚味としてＧＣ６９株を同定した。

実施例２ＣＢＨＩ削除ベクターの調製公知のプローブ合成法（シューマーカーら、１９８３ｂ）を用い、この遺伝子の公知のアミノ酸配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプローブでハイブリッド化することにより、ＣＢＨＩタンパク質をコードしているｃｂｈｌ遺伝子をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＲＬ　−Ｐ　３７　ｆ５にのゲノムＤＮＡからクーロン化した。ｃｂｈｌ遺伝子は６．５ｋｂＰｓｔＩ断片に存在し、本明細書に比較例として含めたマニアスチスら（１９８９）の公知の方法で、ＰｓｔＩ切断ｐＵＣ４Ｋ　にュージャージー州ビス力タウエー、ファーマシア社から購入）に挿入し、このベクターのＫａｎ’遺伝子に置き換えた。ついで、得られたプラスミドｐＵＣ４に：：ｃｂｈｌをＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断し、約６ｋｂの大きな断片を単離し、連結してｐＵＣ４に：：ｃｂｈｌ△Ｈ／Ｈを得た（図１参照）。この手順によると、ｃｂｈｌをコードしたアミノ酸配列の全て及び側腹配列の約１．　２ｋｂから１゜５ｋｂまでが除去される。もとのＰｓｔＩ断片のいずれかの末端から約１ｋｂの側腹ＤＮＡが残る。

上記のマニアチスらの方法にしたがって、ＴｒｉｅｈｏｄｅｒＩＯａｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子をｐＵｃ１８におけるゲノムＤＮＡの６．５ｋｂＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片としてクーロン化して、ｐＴｐｙｒ２を形成させた（スミスら、１９９１）。プラスミドｐＵＣ４に：：ｃｂｈｌ△Ｈ／ＨをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その末端を牛小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。この末端を脱リン酸化したＤＮＡをＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｔ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子を含む６．５ｋｂＨｉｎｄｌＩＩ断片で連結し、ｐ△ＣＢＨＩｐｙｒ４を得た。図１にこのプラスミドの構成を示す。

実施例３プロトプラストの単離１００ｍ１のＹＥＧ　（酵母抽出物０．５％、グルコース２％）を含む５００ｍ１のフラスコにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＧＣ６９株（ｐｙｒ４− 誘厚味）の胞子約５ｘｌＯ’個を接種して、菌糸体を得た。ついで、フラスコを３７°Ｃで約１６時間振とう培養した。２，７５０ｘｇで遠心分離して菌糸体を収穫した。収穫した菌糸体は１．２Ｍのソルビトール溶液で洗い、５ｍｇ／ｍｌのノボジムＲ２３４溶液（コネチカット州ダンブリ−、ノボ・バイオラプス社製複合酵素の商品名；１，３−アルファーグルカナーゼ、１゜３−ベーター−グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼ及びプロテアーゼを含む）、５ｍｇ／ｍ１のＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，５ｍｇ／ｍ　１の牛血清アルブミン及び１６２〜工のソルビトールを含む溶液４０ｍ１に懸濁した。ミラクロス（カリフォルニア州う・ヨー子、カルバイオケム社製）で濾過して細胞片からプロトプラストを分離し、２０００ｘｇで遠心分離して集めた。プロトプラストを１．２Ｍのソルビトールで３回、１，２Ｍのソルビトール１５０ｍＭのＣａＣ１２で１回洗い、遠心分離し、約２ｘｌＯ’個／ｍｌとなるように１．２Ｍのソルビトール１５０ｍＭのＣａＣｌ２に懸濁した。

実施例４ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４による糸状菌プロトプラストの形質転換実施例３で調製したプロトプラスト懸濁液２００μｍを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス、ｐＨ７，４；　１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁したＥｃｏＲＩ切断ｐ△ＣＢＨＩｐｙｒ４　（実施例２で調製）２０μｌならびニ２５　％Ｐ　Ｅ　Ｇ　４０００　。

０．６ＭのＫＣｌ及び５０ｍＭ（７）Ｃａ　Ｃｌ　２を含むポリエチレンクリコール（ＰＥＧ）５０μｌに添加した。この混合物を氷上に２０分間装いた。その後上記のＰＥＧ溶液２゜０ｍｌをこの混合物に添加し、混合した後さらに室温で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、１゜２Ｍのソルビトールと５０ｍＭのＣａＣ１２を含む溶液４．０ｍｌをこれに添加し、混合した。１％のグルコース、１．２Ｍのソルビトール及び１％のアガロースを追加したボーゲル培地Ｎ（クエン酸ナトリウム３ｇ５ＫＨ２Ｐ０４５ｇ５ＮＨ４ＮＯ３２ｇ５Ｍｇ５０４　”　７Ｈ２００゜２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２００，Ｉｇ、ａ−ビオチン５ｕｇ、クエン酸５ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０５ｍｇ５Ｆｅ　（ＮＨ４）２　”６Ｈ２０１ｍｇ５　ＣｕＳＯ４”５Ｈ２００，２５ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０５０μｇ／Ｌ）溶融液の一部に上記のプロトプラスト溶液を直ちに添加した。ついで、プロトプラスト／培地混合物を、上記と同様のボーゲル平面培地上に注いだ。培地にはウリジンを添加しなかったので、ＧＣ６９株のｐｙｒ４変異がｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４に挿入した野生型ｐｙｒ４によって補填された形質転換体のみが生育できた。ついでこれらのコロニーは、添加剤として１％のグルコースを含むボーゲル平面培地Ｎに移して精製し、安定な形質転換体のみを選び、さらに分析した。

この段階で、安定な形質転換体は、ウリジンを含まない平面培地上での生育速度及び周りが滑らかで、ごわごわしていない円形のコロニーの形成を観察して、不安定な形質転換体と区別した。ある場合には、さらに形質転換体を非選択平面培地（ウリジンを含む）で生育させ、この培地から胞子を採集し、ウリジンを含まない選択培地上で発芽及び生育する胞子の割合を測定することによって、安定性を試験した。

実施例５形質転換体の分析実施例４で得られた形質転換体を、１％のグルコースを含むボーゲルの液体培地Ｎで生育させた後、これからＤＮＡを分離した。これらの形質転換ＤＮＡをＰｓｔｌ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。ついで、ゲルをナイトラン・メンプラン・フィルターに添加し、３２ＰｏｍｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４プローブでハイブリッド化した。在来のｃｂｈｌ遺伝子を６．５ｋｂＰｓｔｌ断片として同定し、在来のｐｙｒ４遺伝子及び形質転換ＤＮＡ断片に由来するあらゆるＤＮＡのアミノ酸配列を同定するために、このプローブを選んだ。

ハイブリッド化後の放射性バンドは、オートラジオグラフィーで可視化した。オートラジオグラフィーを図３に示す。試料Ａ、Ｂ５Ｃ５Ｄ及びＥの５点の試料を用いて、上記の試験を行った。カラムＥは非転換菌株ＧＣ６９であり、本分析の対照として使用した。カラムＡ−Ｄは上記の方法で得た形質転換体である。オートラジオグラムの横に表示した数値は、分子量マーカーの大きさである。このオートラジオグラムから明らかなように、カラムＤでは６．５ｋｂのＣＢＨＩのバンドが認められないことから、形質転換体ではｃｂｈｌ遺伝子にＤＮＡ断片を組込むことにより、この遺伝子が完全に削除されていることを示している。このｃｂｈｌ欠失株をＰ３７Ｐ△ＣＢＨＩと呼ぶ。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの染色体の一つのｃｂｈｌ遺伝子座にｐ△ＣＢＨＩｐｙｒ４からの大きなＥｃｏＲＩ断片を二重交差組込することによるＴｒｔｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　Ｃｂ　ｈ　１遺伝子の削除の概要を図２に示す。分析を行ったその他の形質転換体は、対照の非形質転換体と同じであった。

実施例６ｐｌｎｔｃＢＨＩによる形質転換体の分析本実施例では実施例５と同様な手順を用いた。ただし、プローブは３２ｐ標識ｐｌｎｔｃＢＨＩプローブを用いた。

このプローブは、ｐ　ＵＣ４Ｋ：：ｃ　ｂ　ｈ　１ΔＨ／Ｈでは削除した部分内に存在するｃｂｈｌ遺伝子座からの２ｋｂＢｑＩＩＩ断片を含むｐＵＣ−型プラスミドである。本実験では対照を含めて２点の試料、すなわち試料Ａ（非形質転換体ＧＣ６９）及び試料Ｂ（形質転換体Ｐ３７Ｐ△ＣＢＨＩ）を用いて行った。

図４から明らかなように、試料Ａでは６゜５ｋｂにバンドが認められ、ｃｂｈｌ遺伝子が存在する。

しかし、形質転換体の試料Ｂではこの６．５ｋｂのバンドが認められず、ｃｂｈｌ遺伝子及びｐＵＣプラスミドに由来するアミノ酸配列は全く存在していない。

実施例７Ｐ３７Ｐ△ＣＢＨＩ株によるタンパク質の分泌１％のグルコース、０．１４％の（ＮＨ４）５０４．０゜２％のＫＨ２ＰＯ２，０，０３％のＭｇ　Ｓ　Ｏ＜　、０．　０３％の尿素、０．７５％のバクトドリブトン、０．０５９６のツイン８０．０．００００１６％のＣｕ５Ｏ１＃　５Ｈ２０，０，００１％のＦ　ｅ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈｚ　Ｏ−０、０００１２８％のＺ　ｎ　Ｓ　０４　・７　Ｒ２０，０，０００００５４９６のＮａ２　ＭＯＯ４’　２Ｈ２０１０，００００００７％のＭｎＣ１−４Ｈ２０を含むＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ基礎培地５０ｍ１を含む２５０ｍ１容のフラスコに、Ｐ３７Ｐ△ＣＢＨＩ株の胞子を接種した。これを３７°Ｃで約４８時間振とう培養した。得られた菌糸体をミラクロス（カルバイオケム社製）で濾過して集め、１７　ｍ　Ｍのリン酸カルシウムで２〜３回洗浄した。最後に菌糸体を１ｍＭのソホロースを含む１７ｍＭのリン酸カルシウムに懸濁させ、３０℃で２４時間振とう培養した。ついで、これらの培地の上清を集め、菌糸体を廃棄した。ファルマシア・ファストゲル・システムと、メーカーの指針に従ってｐＨ３〜９のプレカストゲルを用いた電気泳動で上溝を分析した。タンパク質のバンドを可視化するため、ゲルを銀で染色した。図５に示したように、Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ株に由来する試料ではｃｂｈｌに相当するバンドが認められなかった。この電気泳動ゲルで、各Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ培養液上清に各種のタンパク質が認められる。カラムＡは部分的に精製したＣＢＨＩであり、カラムＢはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅａｓｅｉの非形質転換体の培養液上清であり、カラムＣは本発明の方法に従って調製したＰ３７ＰΔＣＢＨＩ株の上清である。各セルラーゼ成分の位置はＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩＳＥＧＩ　Ｉ及びＥＧＩＩＩで表示した。ＣＢＨＩは総細胞外タンパク質の５０％を占めていたので、分泌されたタンパク質の主要なものであり、したがってゲル上のバンドの色調は最も濃かった。この電気泳動ゲルから、Ｐ３７ＰＡＣＢＨＩ株ではＣＢＨＩタンパク質の減少が認められる。

実施例８ｐＰΔＣＢＨＩＩ株の調製ＣＢＨＩＩタンパク質をコードしているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ２遺伝子を、図６Ａに模式的に示すようにゲノムＤＮＡの４．１ｋｂＥｃｏＲＩ断片としてクーロン化した（チェノら、１９８７、バイオテクノロジー５＝２７４−２７８）、この４．１ｋｂ断片をｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲ１部分の間に挿入した。後者のプラスミドはｐＵＣの誘導体（ジェネコール・インターナショナル社のアール・エム・ベルカーによって作製された）であり、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｃ　ｌ、Ｓｍａｌ、Ｈｉｎｄｌ　ＩＩ、ＸｈｏＩＳＢｑｌｌＩ、Ｃ１ａ１．Ｂｑｌ　ＩＩ、Ｘｈｏｌ、Ｈｉｎｄｒ　Ｉ　Ｉ、Ｓｍａ　１．Ｓａｃ　ｌ、ＢａｍＨＩＳＥｃ。

Ｒ１の順序でアミノ酸配列された対称的な制限エンドニュクレアーゼ部位のパターンを有する多重クーロン化部位を含んでいる。公知の方法を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＣＢＨＩＩ翻訳開始部位の７４　ｂ　ｐ　３’　の位置）とＣｌａｌ部位（ＣＢＨＩＩの最後のコドンの２６５ｂｐ３’の位置）の間のこの遺伝子の１．７ｋｂ中心部分を除去し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子を含むｌ、５ｋｂ）（ｉｎｄｌｌｌ−Ｃ１ａｌ　ＤＮＡ断片によって置換されるように、プラスミドｐＰ△ＣＢＨＩＩを構成した（図６Ｂ）。

Ｔｒ１ｃｈｏｄｅｒｎ＋ａ　ｒｅｅｓｅｌ　ｐ　Ｙ　ｒ　４遺伝子を１．６ｋｂＮｈｅ１−５ｐｈｌ断片のＴｐｙｒ２（実施例２参照）から切除し、ｐＵｃ２１９のｓｐｈ　１とＸｂａ１部位の間に挿入しく実施例１６参照）、ｐ２１９Ｍを作製した（スミスら、１９９１、カレント・ジエネティクス１つ、２７−３３頁）。ついで、ｐｙｒ４遺伝子を、ｐＵｃ２１９多重クーロン化部位に由来する一方の末端に７ｂｐのＤＮＡと別の末端に６ｂｐのＤＮＡを育するＨｉｎｄＩＩＩ −（：１ａｌ断片として除去し、ｃｂｈ２遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ及びｃ１ａ１部位に挿入して、プラスミドｐＰ△ＣＢＨＩＩを形成させた（図６Ｂ参照）。

このプラスミドをＥｃｏＲＩで切断すると、一方の末端でｃｂｈ２遺伝子座からの０．７ｋｂの側腹ＤＮＡを有し、別の末端にｃｂｈ２からの１．７ｋｂの側腹ＤＮＡを有し、中間にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｆ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子を有する断片を遊離する。

実施例９ＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉＧ　Ｃ６９株からのｃｂｈ２遺伝子の削除ＧＣ６９株のプロトプラストを作製し、実施例３及び４と同様にＥｃｏＲＩ切断ｐｐ△ＣＢＨＩＩで形質転換させた。形質転換体のＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８で切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルがらのＤＮＡをメンブランフィルタ−に採り、実施例１１に記載した方法に従って３２ｐ標識ｐＰΔ ＣＢＨＩＩでハイブリッド化した。形質転換体は、ｃｂｈ２遺伝子座に正確に組込まれたｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一複写を有する。また、形質転換体は、実施例７で記載した振とぅフラスコ中で生育させ、培地上清中のタンパク質を等電点電気泳動で検査する。このようにして、ＣＢＨＩＩタンパク質を生産しないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｊ　Ｇ　Ｃ６９転換菌株が得られる。

実施例１０Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩのｐｙｒ４−誘導味の調製ｃｂｈｌ遺伝子を欠く形質転換体（Ｐ　３７　ＰΔＣＢＨＩ）の胞子を、ＦＯＡを含む培地に播いた。ついで、実施例１に記載した方法を用いて、この形質転換体のｐｙｒ４−誘導体を得た。このｐｙｒ４−株はＰ３７Ｐ△ＣＢＨＩＰＹｒ−２６株と称す。

実施例１１すてにｃｂｈｌ遺伝子を削除した株におけるｃｂｈ２遺伝子の削除Ｐ３７Ｐ△ＣＢＨＩＰｙｒ−２６株のプロトプラストを調製し、実施例３及び４に記載した方法にしたがってＥｃｏＲｆ切断ｐＰΔＣＢＨＩ　ｔで形質転換を行った。

実施例７と同様に、精製を行うべき形質転換体を振とうフラスコで培養し、培地上清中のタンパク質を等電点電気泳動で検査した。ＣＢＨＩＩタンパク質を全く生産しない転換菌株１株（Ｐ３７Ｐ△ΔＣＢＨ６７と命名）が同定された。図５のカラムＤは、本発明に係わる方法に従って調製したｃｂｈｌ及びｃｂｈ２遺伝子の両方を欠失した転換菌株の培養上清を示す。

Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７株からＤＮＡを抽出し、Ｅｃ。

Ｒ１及びＡｓｐ７１８で切断し、アガロースゲル電気泳動で分析した。このゲルからのＤＮＡをメンブランフィルタ−に採り、３２ｐ標識ｐＰΔＣＢＨＩＩでＩ＼イブリ・ソド（ヒした（図７）。図７のカラムＡは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの非形質転換体から抽出したＤＮＡのハイブリッドパターンを示す。野生型ｃｂｈ２遺伝子を含む４．ｌｋｂのＥｃｏＲ１断片が認められた。カラムＢはＰ３７ＰΔΔＣＢＨ６７株のハイブリッドパターンを示す。４．ｌｋｂの単一バンドが消失し、その代わり約０．　９及び３．ｌｋｂに２個のバンドが認められる。これは、ｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一複写がｃｂｈ２遺伝子座に正確に組込まれた場合、期待されるパターンである。

また、同じＤＮＡ試料をＥｃｏＲＩで切断し、前記のようにサザーンプロット分析を行った。この実施例では、プローブとして３２ｐ標識ｐｌｎｔｃＢＨＩＩを使用した。このプラスミドは、ｐＰΔＣＢＨ）Ｉプラスミドでは削除したｃｂｈ２遺伝子の断片に含まれるｃｂｈ２遺伝子コードアミノ酸配列の一部を含んでいる。Ｐ３７Ｐ△△ＣＢＨ６７株のＤＮＡではハイブリッド化が認められなかったことから、ｃｂｈ２遺伝子は削除されたが、この菌株にはｐＵＣプラスミドに由来するアミノ酸配列が存在しないことを示している。

実施例１２ｐＥＧ１ｐｙｒ４の構築公表されているアミノ酸配列（ベンチラら、１９８６、ジーン４５　：　２５３ −２６３　；ファン・アルスプールら、１９８７、バイオ／テクノロジー５　：　６Ｏ−６４）に従って合成したオリゴヌクレオチドを用いてハイブリッド化することにより、ＥＧＩをコードしているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｌのｅｑｒｌ遺伝子を、ＲＬ−Ｐ３７株からのゲノムＤＮＡの４．２ｋｂＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片としてクーロン化した。

このクーロンから３．６ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨ■断片を採り、ｐＴｐｙｒ２　（実施例２参照）及びｐｔｙｃ２１８　（ｐＵｃ２１９と同じ（実施例１６参照）であるが、反対の方向に向いた多重クーロン化部位を有する）から得たＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩｌａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子を含む１．６ｋｂのＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＢａｎＨＩ断片で連結し、ＨｉｎｄｌＩ ■で切断して、プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４を得た（図８）ｏ　Ｈｉｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　ＩでｐＥＧＩｐｙｒ４を切断すると、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡ　（ｅｑ　Ｉ　１及びｐｙｒ４遺伝子）の、２個の遺伝子の間の２４ｂｐのアミノ酸配列をもつ合成りＮＡ及び一方の末端における６ｂｐのアミノ酸配列をもつ合成りＮＡを除く部分のみを含むＤＮＡ断片が遊離する（図８参照）。

実施例１３プラスミドｐＥＧＩｐｙｒ４を含むＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの形質転換実施例１に記載した方法により、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　Ｒｕ　ｔ　Ｃ３０株（シエイアーーネイス及びモンテネコート（１９８４）、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー、２０：４６−５３）のｐｙｒ４欠損誘導株を得た。この株のプロトプラストを非切断ｐＥＧＩｐｙｒ４で形質転換させ、安定な形質転換体を精製した。

これらの形質転換体５株及び非形質転換体ＲｕｔＣ３０を２５０ｍ１容振とうフラスコ中のＹＥＧ培地（酵母抽出液５ｇ／１．グルコース２０ｇ／ｌ）に接種し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた菌糸体を殺菌水で洗浄し、５０ｍ１のＴＳＦ培地（０，０５Ｍのシュウ酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５，ｏ；アビセル微結晶セルロース　１０ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４２，Ｏｇ／ｌ　；　（ＮＨ４）２５０４１゜４ｇ／ｌ；プロテオース　ペプトン１．　０ｇ／ｌ　；尿素０゜３ｇ／ｌ　；ＭｇＳＯ４＃　７Ｈ２００，３ｇ／ｌ　；　ＣａＣ１２ｏ、３　ｇ／　１　；　Ｆ　ｅ　Ｓ　０４　・７　Ｒ２０５，Ｏｍｇ／ｌ　；ＭｎＳＯ４ｅＨ２０１，６ｍｇ／ｌ　；ＺｎＳＯ４１゜４ｍｇ／ｌ　；　ＣＯＣ１２２，０ｍｇ／ｌ　；　０．１％ツイン８０）に添加した。これを２８℃で４日間振とう培養した。

これらの培地から上清の試料を採り、総タンパク質及びエンドグルカナーゼ活性の測定を下記のように行った。

エンドグルカナーゼの測定は、レマゾール・ブリリアント・ブルー−カルボキシメチルセルロース（ＲＢＢ−ＣＭＣ１オーストラリア、ニューサウスウエルス州ノース・ロックスのメザジム社製）からの可溶性、着色オリゴサツカライドの遊離に基づくものである。激しく撹拌しながら沸騰直後の純水８０ｍ１に乾燥ＲＢＢ−ＣＭＣ２ｇを添加して基質を調製した。これを室温にまで冷し、２Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４，８）５ｍｌを添加し、ｐＨを４．５に調整した。純水を添加して容量を１００ｍ１とし、最終濃度が０．０２％となるようにナトリウム・アジドを添加した。

Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｓａ　ｒｅｅｓｅｉの対照培養、ｐＥＧＩｐｙｒ４形質転換体の培地上清及びブランクとして０．１Ｍ酢酸ナトリウム（１０〜２０μｌ）をそれぞれ試験管に採り、２５０μｌの基質を添加し、３７℃で３０分間振とうした。試験管を水中に１０分間置き、冷却した沈澱剤（酢酸ナトリウム３．３％、酢酸亜鉛０．４％、ＭＣＩでｐＨ５、エタノール７６％）を添加した。試験管を撹拌し、５分間放置した後、約１３，０００ｘｇで３分間遠心分離した。スペクトロホトメーターを用い、５９０−６００ｎｍで吸光度を測定した。

タンパク質の測定は、ピアース社（米国イリノイ州ロックフォード）から入手した試薬を用い、ＢＣＡ　（ビシンコニック酸）法を用いた。標準として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。ＢＣＡ試薬は、試薬Ｂ１部と試薬Ａ５０部を混合して調製した。ＢＣＡ試薬試薬１杏ｌおよその目安で希釈したＢＳＡまたは試験培地上清５０μｌと混合した。３７℃で３０分間振とうし、最後にスペクトロフォトメーターを用い、波長５６２ｎｍで吸光度を測定した。

上記の測定結果を表１に示す。いくつかの転換菌株では、非形質転換ＲｕｔＣ３０に比較して、エンドグルカナーゼ活性が高いことが認められた。Ｔｒｌｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉの非形質転換株で生産されたエンドグルカナーゼ及びエキソ−セロビオヒドロラーゼは、それぞれ分泌された総タンパク質の約２０及び７０％を占めていた。したがって、ＲｕｔＣ３０株に比較して約４倍も高いエンドグルカナーゼを生産するＥＰ５等の転換菌株はエンドグルカナーゼ型のタンパク質とエキソ−セロビオヒドロラーゼ型のタンパク質をほぼ同量分泌するものと期待される。

この実施例で記載した形質転換体は無傷のｐＥＧＩｐｙｒ４を用いて調製したが、ｐＵＣプラスミドに由来するゲノムに組込まれたＤＮＡのアミノ酸配列を有すると考えられる。形質転換を行う前に、ｐＥＧＩｐｙｒ４’をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｌのＤＮＡのみを含む大きなりＮＡ断片を分離することもできる。この単離したＤＮＡ断片でＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを形質転換させることによって、ＥＧＩの生産能が高く、図８に示した合成りＮＡの２個へ短片以外は異質ＤＮＡを含まない形質転換体を分離することができる。また、ｐＥＧＬｐｙ　ｒ４を用いて、ｃｂｈｌ遺伝子またはｃｂｈ２遺伝子またはその両方を欠失した菌株に形質転換させることが可能である。このようにして、ＥＧＩの生産能が高く、エキソ−セロビオヒドロラーゼの生産能がきわめて低いか、全く生産しない菌株を作製することが可能である。

実施例１３に記載した方法によって、その他のあらゆるセルラーゼ成分、キシラナーゼ成分またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｌが通常生産するその他のタンパク質の生産能が高いＴｒｊｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉ株を作製することができる。

表　１Ｔｒｊｃｈｏｄｅｒｗａ　ｒｅｅｓｅ１転換菌株により分泌されたエンドグルカナーゼの活性活　性　タンパク質　Ａ／Ｂ菌株　（５９０ｎｍにおける吸光度）　（ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）ＲｕｔＣ３００，３２４，１０，０７８ＥＰ２　０．７０　Ｂ、７　０．１８９ＥＰ４　０．　７６　３．　６５　０．　２０８ＥＰ５　１．２４　４．１　０．３０２ＥＰ６　０．　５２　２．　９３　０．　１７７ＥＰＩＩ　Ｏ，９９４，１１０，２４１上記の結果は、総タンパク質に比較してＥＧＩ成分の生産能が高いことを証明するために示したものであり、生産能の程度を示す目的で示したものではない。生産能の強弱は各実験で変動する。

実施例１４ｐｃＥＰｃｌの構成プラスミドｐｃＥＰｃ１は、ＥＧＩをコードしているアミノ酸配列がｃｂｈｌ遺伝子からのプロモーターに機能的に溶融するように構成した。これは、各翻訳開始部位のちょうど５′の位置（上流側）に便宜的な制限エンドニュクレアーゼ開裂部位を提供するために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでｃｂｈｌとｅｑ１１遺伝子のＤＮＡのアミノ酸配列を変える部位特異的突然変異を起させることにより行った。２個のＤＮＡセグメントの接合部におけるアミノ酸配列が期待通りであることを確認するため、ＤＮＡのアミノ酸配列の分析を行った。加えた特異的修飾を図９に示す。

ｐｃＥＰｃｌを形成させるために組み合わせたＤＮＡ断片を、以下のようにｐＵＣ４にのＥｃｏＲ１部位の間に挿入した（図１０参照）。

Ａ）ｃｂｈｌ遺伝子座の５°側腹部分からの２．１ｋｂ断片これはプロモータ一部分を含み、組替えＢｃｌＩ部位まで延びて、ｃｂｈｌをコードしたアミノ酸配列を含まない。

Ｂ）ｅｑ１１遺伝子座からのゲノムＤＮＡの１．９ｋｂ断片で、組替えＢａｍＨＩ部位を有する５°末端から始まり、暗号領域を通して延び、翻訳停止コドンを越える約０．５ン化部位に由来する１８ｂｐ及びこの断片と以下の断片を結合させるために使用した１５Ｍの合成オリゴヌクレオチドである。

Ｃ）ｃｂｈｌ遺伝子座の３゛側腹分からのＤＮＡ断片であり、ｃｂｈｌ翻訳停止コドンの約１ｋｂ下流から約２゜５ｋｂ下流まで延びている。

Ｄ）ｐＴｐｙｒ２　（実施例２）で得たＴｒｉｃｈｏｄｅ＋ｎａ　ｒｅｅｓｅｉｐｙｒ４遺伝子を含み、ｐＵｃ１８多重クーロン化部位（こ由来する一方の末端に２４ｂｐのＤＮＡを有るＤＮＡの３゜１ｋｂＮｈｅ　１−３ｐｈｌ断片を断片（Ｃ）のＮｈｅ１に挿入。

プラスミドｐｃＥＰｃ１は、ＥＧｌをコードしたアミノ酸配列がｃｂｈｌ遺伝子座に組込まれ、ホスト菌株１こ異質ＤＮＡを導入することなく、ＣＢＨＩをコードしたアミノ酸配列を置換するように設計した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで切断することにより、ｃｂｈｌプロモータ一部分、ｅｑｌｌをコードしたアミノ酸配列及び翻訳終了部分、Ｔｒｌｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｔ　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子及びｃｂｈｌ遺伝子座の３゛（下流側）側腹部分からのＤＮＡ断片を含んだ断片刃く遊離する（図１０）。

実施例１５ｐｃＥＰｃＩ　ＤＮＡを有する形質転換体実施例１に記載した方法により、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　Ｒｕｔｃ３０（シエイアーーネイス、前出）のｐｙｒ４欠失株を得た。この株をＥｃｏＲＩ切断ｐｃＥＰｃ１で形質転換させた。安定な形質転換体を選別し、実施例１３１こ記載したように、振とう培養してセルラーゼを生産させた。セルラーゼタンパク質を可視化するため、これらの培養液力１ら採った試料について、実施例７に記載した方法を用（１て等電点電気泳動を行った。このような方法で分析した２３株の形質転換体のうち、ｃｂｈｌ遺伝子座にＣＥＰＣＩＤＮＡが組込まれた結果期待されるように、１２株でＣＢＨｌタンパク質の生産が認められなかった。これらの形質転換体で実際にｃｂｈｌ遺伝子座に組込みが行われ、細菌プラスミドベクター（ｐＵＣ４Ｋ）に由来するアミノ酸配列が存在していないことを確認するため、サザーンプロット分析を行った（図１１参照）。分析にあたって、形質転換体のＤＮＡをＰｓｔｌで切断した後、電気泳動を行い、メンブランフィルタ−に悉加した。得られたサザーンプロットを放射能標識プラスミドｐＵＣ４に：：ｃｂｈｌでプローブした（実施例２）。このプローブを非形質転換対照培養からのＤＮＡの６．５ｋｂ断片上のｃｂｈｌ遺伝子にハイブリッド化した（図１１、カラムＡ）。ＤＮＡのＣＥＰＣ１断片をｃｂｈｌ遺伝子座に組込むことにより、この６゜５ｋｂバンドが消失し、約１．０ｋｂ、２０．ｋｂ及び３゜５ｋｂのＤＮＡ断片に相当するバンドが現れることが期待される。図１１のカラムＣに示した形質転換体では、全くその通りのパターンが認められる。また図１１に示したようにカラムＢはｐｃＥＰｃｌの多重複写がｃｂｈｌ遺伝子座以外のゲノムの部位に組込まれた形質転換体の例である。

それぞれ非形質転換体及び形質転換体の培地上清について、実施例１３に記載した方法に従ってエンドグルカナーゼ活性を測定した。ただし、測定前に試料を５０倍に希釈したので、試料中のタンパク質濃度は約０．０３と０，０７ｍｇ／ｍｌの間にあった。非形質転換体対照培養及び４種類の形質転換体（ＣＥＰＣＩ− １０１、ＣＥＰＣＩ−１０３、ＣＥＰＣＩ−１０５及びＣＥＰＣＩ−１１２と表示）について行った測定の結果を表２に示す。形質転換体ＣＥＰＣＩ−１０３及びＣＥＰＣＩ−１１２は、ＣＢＨＩの生産能を失うようにＣＥＰＣＩ断片を組込んだ例である。

表　２Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｌ形質転換体により分泌されたエンドグルカナーゼ活性活　性　タンパク質菌株　（５９０ｎｍにおける吸光度）　（ｍｇ／ｍ１）ＲｕｔＣ３０００，０３７２，３８０，０１６ＣＥＰＣＩ−１０１０，０８２２，７２０，０３０ＣＥＰＣＩ−１０３０，０９９１，９３０，０５１ＣＥＰＣＩ−１０５０，０３３２，０７０，０１６ＣＥＰＣＩ−１１２０，０９３１，７２０，０５４上記の結果は、総タンパク質に比較してＥＧＩ成分の生産能が高いことを証明するために示したものであり、生産能の程度を示す目的で示したものではない。生産能の強弱は各実験で変動する。

ｐｃＥＰｃｌと同様なプラスミドを作製することは可能であるが、その他のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子はｅｑｌｌ遺伝子で置換する。このようにして、その他の遺伝子の過剰表現と同時にｃｂｈｌ遺伝子の削除が可能となる。

また、ｐｃＥＰｃｌでその他の遺伝子、例えばｃｂｈ２をあらかじめ削除したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４誘導株を形質転換させ、例えばエキソ−セロビオヒドロラーゼを生産せず、エンドグルカナーゼを過剰表現する形質転換体を作製することも可能である。

ｃｂｈｌ遺伝子座のＤＮＡをＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの別の遺伝子座のＤＮＡで置換したｐｃＥＰｃｌと同様な構成を用い、別のプロモーターでコントロールしながらＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノムの別の遺伝子座に遺伝子を挿入することもできる。実施例１６ｐＥＧＩ　Ｉ：：Ｐ−１の構成ＥＧＩＩ（以前、人によってはＥＧＩＩＩとも表示していた）をコードしているｅｑＩ３遺伝をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉからクーロン化し、公表されたＤＮＡのアミノ酸配列（サロヘイモら、１９８８、ジーン６３　：１ｌ− ２１）を有る。遺伝子は、ｐＵｃ２１９のＰｓｔｌとＸｈｏ１部位の間に挿入したゲノムＤＮＡの約４ｋｂのＰｓｔｌ−Ｘｈｏ１断片としてＲＬ−Ｐ３７から得た。ベクターのｐＵＣ２１９は、ＢｑＩＩＩ、Ｃ１ａｌ及びＸｈｏｌの制限部位を包含させるため、ｐＵｃ１１９株（ウィルソンら、１９８９、シーン７７　：　６９−７８）の多重クーロン化部位を拡張させて調製した。公知の方法を用い、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｌのゲノムＤＮＡの２．７ｋｂＳａｌｌ断片に存在するｐｙｒ４遺伝子をＥＧＩＩをコードしたアミノ酸配列内の５ａ１１部位に挿入し、プラスミドｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１を調製した（図１２）。これによってＥＧＩＩをコードしたアミノ酸配列が削除されるが、その他のアミノ酸配列は削除されない。プラスミドｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１をＨｉｎｄｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ｐＵｃ２１９の多重クーロン化部位に由来する一方の末端の５ｂｐ及び別の末端の１６ｂｐＤＮＡ以外は全てＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉに由来する線状ＤＮＡ断片を得た。

実施例１７Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ＋＋ａ　ｒｅｅｓｅｉＧ　Ｃ６９株のｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１形質転換によるＥＧＩＩ非生産非生産型あらかじめＨｉｎｄｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｌＧ　Ｃ６９株を形質転換させ、安定形質転換体を選別する。形質転換体から総ＤＮＡを分離し、サザーンプロット分析を用いて、ｐｙｒ４及びｅｑ１３遺伝子を含むＤＮＡ断片がｅｑ１３遺伝子座に組込まれ、その結果ＥＧＩＩをコードしたアミノ酸配列が破壊されている形質転換体を同定する。当該形質転換体はＥＧＩＩを生産できない。また、ｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１を用いて、ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２またはｅｑｌｌ遺伝子のいずれか、または全てを欠失する形質転換体を作製することができる。このようにして、ある種のセルラーセ成分のみを生産し、ＥＧＩＩ成分は生産しない形質転換体を作製することができる。

実施例１８Ｔｒｆｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｐＥＧｌｌ：：Ｐ−１形質転換にょるＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ及びＥＧＩＩ非生産非生産型実施例１に記載した方法に従って、Ｐ３７ＰΔ△ＣＢＨ６７株（実施例１１で作製したもの）のｐｙｒ４欠損誘導株を得た。あらかじめＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ及びＢａｍＨＩで切断したｐＥｏｌｌ；；Ｐ−１を用い、このＰ３７Ｐ△Δ６７Ｐ−１株を形質転換させ、安定な形質転換体を選別した。

形質転換体から総ＤＮＡを分離し、サザーンプロット分析を用いて、ｐｙｒ４及びｅｑ１３遺伝子を含むＤＮＡ断片がｅｑ１３遺伝子座に組込まれ、その結果ＥＧＩＩをコードしたアミノ酸配列が破壊されている形質転換体を同定した。図１３に示したサザーンプロットを、ｐＵｃ１８のＰｓｔｌにクーロン化したｅｑ１３遺伝子を含むＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　Ｄ　Ｎ　Ａの約４ｋｂのＰｓｔｌ断片でプローブし、ついで再分離した。

Ｐ３７Ｐ△Δ６７Ｐ−１株から分離したＤＮＡをＰｓｔｌで切断し、サザーンプロット分析を行うと、ｅｑ１３遺伝子座がオートラジオグラム上に単一な４ｋｂのバンドとして可視化される（図１３、カラムＥ）。しがし、ｅｑ１３遺伝子を破壊した形質転換体では、期待したようにこのバンドが消失し、新しい２個のバンドが認められた（図１３、カラムＦ）　。ＤＮＡをＥｃｏＲＶまたはＢｑｌｌＩで切断すると、非形質転換体のＰ３７Ｐ△Δ６７Ｐ−１（図１３、カラムＡ及びＣ）とｅｑ１３を破壊した形質転換体（図１３、カラムＢ及びＤ）の間でｅｑ１３遺伝子に相当するバンドの大きさが約２，７ｋｂ増加した。図１３に示したｅｑ１３遺伝子破壊形質転換体（カラムＢ、Ｄ及びＦ）はＡ２２株と命名した。

図１３に示した当該形質転換体はＣＢＨＩ％ＣＢＨＩＩまたはＥＧＩＩを生産することができない。

実施例１９ｐｐ△ＥＧＩ−１の構成実施例１２に記載したように、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｔｔａａ　ｒｅｅｓｅＩＲＬ −２３７株のｅｑｌｌ遺伝子をゲノムＤＮＡの４．２ｋｂＨｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ断片として得た。この断片をｐＵｃｌｏｏ（多重クーロン化部位に挿入されたオリゴヌクレオチドとＢｑｌｌｌ、Ｃ１ａｌ及びＸｈｏｌ宣言部位を有するｐｔｒＣ１８の１誘導体；ヤニシューベロンら、１９８５、ジーン３３：１０３−１１９）のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位に挿入した。公知の方法を用い、ＥＧＩをコードしたアミノ酸配列の中心に近い位置から当該フード配列の３′末端を越える位置までまたがった約１ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を削除し、ｐｙｒ４遺伝子を含むＴｒｉｃｈｏｄｅｒｏ＋ａ　ｒｅｅｓｅｊ　Ｄ　Ｎ　Ａの３．５ｋｂｓｃａ　ｌ断片で置換した。得られたプラスミドはｐＰΔＥＧＩ−１と呼ぶ（図１４参照）。

プラスミドｐＰ△ＥＧＩ−１をＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断し、いずれかの末端にｅｑＩｌ遺伝子の断片を有し、ＥＧＩをコードしたアミノ酸配列の一部の中心をｐｙｒ４で置換したＴｒｉｅｈＯｄｅ！ｒｌｌａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡのみからなるＤＮＡを遊離させることができる。

Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断したｐＰΔＥＧ　Ｉ−１を用いて適当なＴｒｉｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｌ　ｐ　ｙ　ｒ　４欠失株を形質転換させると、このＤＮＡ断片が一部の形質転換体のｅｑｌｌ遺伝子座に組み込まれる。このようにして、ＥＧＩを生産することができない形質転換体が得られる。

実施ｆｌＦＩＪ２０ｐ△ＥＧ１ｐｙｒ−３の構成及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉｐ　ｙｒ４欠失欠失形質転換実施例１９に記載した方法を用いてＥＧＩ遺伝子を不活性化できるか否かを実験した。この場合、プラスミドのｐΔＥＧＩｐｙｒ−３は、選択マーカーとしてアスペルギルス０ニガーｐＹｒ４遺伝子をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｐｙｒ４遺伝子で置換し、ｐＰ△ＥＧＩ−１と同様に構成した。

この場合にも、ｅｑ１１遺伝子はＩ）ＵＣｌｏｏ（７）ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入された４、２ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ断片として存在していた。ｐＰ△ＥＧＩ−１（実施例ユ９膠照）を構成したときと同様に内在１ｋｂＥｃｏＲＶ断片を除去したが、この場合にはクーロン化したアスペルギルス・ニ：／ｆ−ｐｙｒＧ遺伝子（ウィルソンら、１９８８、ニュクレイック・アシド・リサーチ１６．２３３９）を含む２．２ｋｂ断片で置換した。Ｈｉｎｄｌｌｌで切断した後、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩａ　ｒｅｅｓｅＩ　ｐ　ｙ　ｒ　４欠失株（ＧＣ６９株）をｐ △ＥＧｌｐｙｒ−３で形質転換させ、いずれかの末端のｅｑｌｌ遺伝子座の側腹部分でｐｙｒＧ遺伝子を含む断片を遊離させると、ｅｑｌｌ遺伝子が破壊された形質転換体が得られる。サザーンプロット分析により、これらの形質転換体はＨｉｎｄＩＩＩで切断され、標識ｐΔＥＧ１ｐｙｒ−３でプローブされたＤＮＡを含む転換体であることが確認された。Ｔｒｌｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉの非形質転換体では、ｅｑｌｌ遺伝子がＤＮＡの４．２ｋｂＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片に存在するが、このハイブリッド化のパターンを図１５のカラムＣに示す。

しかし、ｐ△ＥＧ１ｐｙ、−３の望ましい断片を組込んでｅｑｌｌ遺伝子を削除すると、この４．２ｋｂ断片が消失し、約１．２ｋｂの大きな断片で置換されていた（図１５、カラムＡ）。また、図１５のカラムＢは、ｐＰ△ＥＧ１ｐｙｒ− ３の単一複写をゲノムのｅｑｌｌ遺伝子座以外の部位に組み込んだ形質転換体の例である。

実施例２１Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉのｐＰ△ＥＧＩ−１形質転換によるＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ　ｌ５ＥＧＩ及びＥＧＩＩ非生産株の作製実施例１に記載した方法でＡ２２株（実施例１８で得たもの）のｐｙｒ４欠失誘導株を得る。この菌株はあらかじめＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＰ△ＥＧＩ−１で形質転換さ・せ、いずれかの末端にｅｑｌｌ遺伝子断片を有し、かっＥＧＩをコードしたアミノ酸配列の一部がｐｙｒ４遺伝子で置換されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡのみからナルＤ　Ｎ　Ａ断片を遊離させる。

安定なｐｙｒ４＋形質転換体を選別し、形質転換体がら総ＤＮＡを分離する。ＤＮＡはサザーンプロット分析を行って３２ｐ標識ｐＰ△ＥＧＩ−１でプローブし、ｐｙｒ４遺伝子及びｅｑｌｌ遺伝子のアミノ酸配列を含むＤＮＡ断片がｅｑｌｌ遺伝子座に組込まれ、その結果ＥＧＩをコードしたアミノ酸配列が破壊された形質転換体を同定した。当該形質転換体はＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ　Ｉ、ＥＧＩ及びＥＧＩ工を生産することができない。

実施例２２Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｇ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉにおける低ｐｉ及び高ｐｌキシラナーゼ遺伝子のクーロン化及び同定サイトラーゼ１２３　”　（Ｔｒ１ｃｈｏｄｅｒａ＋ａ　ｒｅｅｓｅｉ由来の糸状菌完全セルラーゼ酵素組成物、カリフォルニア州すウス・サンフランシスコのジエネンコール拳インターナショナル社製）を出発物質として、２種類のＴｒｉｃｈｏｄｅｒＩＩａ　ｒｅｅｓｅｉ由来キシラナーゼ酵素を精製した。キシラナーゼ活性の検定には、基質として４−０−メチル−Ｄ−グルクロノ−Ｄ−キシラン、レマゾール・ブリリアント・ブルーＲ（オーストラリア、ノース・サウス・ウェールズ、ノース・ロックのメガジム社製）を用いた。セファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂（ミズリー州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー製）、ＱＡトリスアクリルＭ陰イオン交換樹脂及びＳＰトリスアクリルＭ陽イオン交換樹脂（メリーランド州すベージのＩＢＦバイオテクニックス社製）を充填したカラムを用いて、酵素の分画を行った。３ＬのセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂を充填し、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６，８で平衡させたカラムでサイトラーゼ１２３ＴＭ（０，５ｇ）を脱塩した。ついで、２０ｍ１のＱＡトリスアクリルＭ陰イオン交換樹脂を充填したカラムに、脱塩した溶液を載せた。このカラムに吸着された画分には低ｐＩキシラナーゼ（ｐＩ−５，２）が含まれている。０〜５００　ｍ　Ｍの塩化ナトリウム水溶液を用いて、低ｐＩキシラナーゼをグラジェント溶出した。このカラムに吸着されない画分には、高ｐｌキシラナーセ（ｐｉ−９，０）か含まれている。セファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂を充填し、１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３，３で平衡させたカラムを用いて、この画分を脱塩した。ついで、２０ｍ１のＳＰトリスアクリルＭ陽イオン交換樹脂を充填したカラムに、この溶液を載せた。０〜２００ｍ〜１の塩化ナトリウム水溶液を用いて、高ｐＩキシラナーゼをグラジェント溶出した。

０．１ｍｌの酵素溶液（ａ度１ｍｇ／ｍｌに相当）に０゜９ｍｌのアセトンを添加し一２０℃で１０分間インキュベリタンパク質を集め、ペレットを乾燥し、０．０５ｍ１の１００ｍＭトリスに懸濁し、ＴＥＡ（トリクロロ酢酸）及び２Ｍの尿素でｐＨ８，０に調整した。５μｇのトリプシン／キモトリプシンを添加し、混合物を３７℃で４時間インキュベーションし・た。

ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって各ペプチドを精製した。すなわち、ミリＱ純水で調製した０゜０５％ＴＥＡ　（）　ｌＪｘチルアミン）及び０．０５％ＴＦＡで、シンクロパックＲＰ−４カラムを平衡させた。ＨＰＬＣカラムに各試料を注入し、１００％アセトニトリルがら０．０５％ＴＥＡと０．０５％ＴＦＡの混合溶液まで１％／分のグラジェントで溶出した。完全自動装置を用い、エドマンの方法に従って単離したペプチド末端部分のアミノ酸配列を分析した。

１）低ｐｒキシラナーゼ遺伝子一方のペプチドのアミノ酸配列の一部分（Ｔｙｒ　１１ｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　ＡｓｎＴｙ　ｒ）に相当するオリゴヌクレオチドの変性プールを調製した。ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ及びその他の制限酵素によって切断したＴｒｊｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡのサザーンプロットを３２ｐ標識オリゴヌクレオチドブールでプローブした。

２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を観察して、オリゴヌクレオチドプールとハイブリッド化した。プローブとして放射能標識オリゴヌクレオチドプールを用い、ｐＵｃ２１９に含まれるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片のプラスミドバンクから２ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ断片を単離した。２ｋｂＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片の一方の末端に近いＤＮＡのアミノ酸配列から、翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列が認められ、これは低ｐＩキシラナーゼタンパク質の第１のペプチド（ペプチド１）から得られた完全なアミノ酸配列と同一であった。もとのアミノ酸配列に近い別の翻訳タンパク質のアミノ酸配列は、バチルス属に由来する２種類のキシラナーゼ酵素タンパク質のアミノ酸配列ときわめてよく似ていた。放射能標識２ｋｂＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片をプローブとして、制限酵素で切断したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｗａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡのサザーンプロット分析を行い、２ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片の周辺部位の制限マツプを作製した。このデータに基づいて、２ｋｂＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片をプローブとし、ｐＵｃ２１９に含まれるＴｒｌｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　Ｓ　ｐ　ｈ　１−　ＢａｍＨＩ断片のライブラリーから３ｋｂのＳｐｈｌ− ＢａｍＨＩ断片を単離した。公知の方法で３ｋｂ　Ｓｐｈｌ−ＢａｍＨＩ間のＤＮＡアミノ酸配列を分析したところ、タンパク質のアミノ酸配列の減少が認められ、その配列は低ｐｌキシラナーゼの第２のペプチド（ペプチド２）に由来するタンパク質と一致したことから、低ｐＩキシラナーゼ遺伝子がクーロン化されていることが確認された。初期のＤＮＡアミノ酸配列データを用いてタンパク質のアミノ酸配列を推定すると、低ｐｌキシラナーゼは公表されているデータから得られた２種類のバチルス菌のキシラナーゼ及び部分的にクーロン化した高ｐエキシラナーゼ遺伝子における配列（図１６参照）と多くの部分でよく似ていた。

２）高ｐｌキシラナーゼ遺伝子公知の方法によって２種類のオリゴヌクレオチド変性プール、すなわち１種類は長さ２７ｂｐ　（１０ｂｐはＥｃ。

Ｒ１制限部位に相当し、次の１７ｂｐはペプチド１のアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒをコード）で１２８個のオリゴマーからなり、別のプールは長さ２７ｂｐ　（１０ｂｐはＰｓｔｌ制限部位に相当し、残りの１７ｂｐはペプチド２のｌｉｅ　Ｖａｌ　ＧｌｕＡｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ配列の逆補体をコード）で９６個のオリゴマーを含むものを調製し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｓａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＲＣＲ）のプライマーとして使用した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約２６０ｂｐの断片が認められた。ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌで切断した後、断片をＭ１３ｍｐ１９にサブクーロン化し、ＤＮＡのアミノ酸配列を分析した。この断片の５′ 末端でアミノ酸配列の減少が認められ、その配列はペプチド１と同じであった。

１０８イントロンで分断された短いアミノ酸配列は、バチルス・シルキュランス及びバチルス・プミルスのキシラナーゼタンパク質のアミノ酸配列ときわめてよく似ていた（図１６参照）。Ａｓｐ７１８で切断したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｊのゲノムＤＮＡのサザーンブロットを放射能標識２６０ｂｐ断片でプローブすると、５ｋｂの単一バンドが認められた。

暗号領域のヌクレオチドの完全なアミノ酸配列ならびにその上流及び下流部分のアミノ酸配列を確認するためには、２種類のクーロン化したＴｒｉｃｈｏｄｅｒｉａ　ｒｅｅｓｅｉキシラナーゼ遺伝子を完全に分析する。公知の方法を用い、相当するＣＤＮＡのアミノ酸配列を分析することにより、イントロンの位置及び転写部分の５°及び３′末端を決定する。遺伝子内の制限エンドユニりレアーゼ部位及びその側腹部分のマツプを作製する。上記のデータと実施例１２及び１４の方法を用いて、キシラナーゼ遺伝子のいずれかの末端のｅｑｌｌ遺伝子が置換されているほかはｐｃＥＰｃｌ及びｐＥＧＩｐｙｒ４と同じプラスミドを構成することかできる。

実施例３及び４に記載した方法により、キシラナーゼ遺伝子及び選択マーカーを含むかなり相同性の高いＤＮＡ断片で適当なＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅＩ株の形質転換を行うと、キシラナーゼ遺伝子のいずれか一方または両方の余分な複写をＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのゲノムのｃｂｈｌ遺伝子座またはその他の場所に組み込むことができ、これによりキシラナーゼ遺伝子の過剰表現が得られる。このようにして、高ｐＩキシラナーゼタンパク質及び低ｐＩキシラナーゼタンパク質のいずれか、または両方を過剰表現するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｒａａ　ｒｅｅｓｅｉ転換菌株が得られる。さらに、本発明に記載した方法を用いて、低ｐＩかつ／または高ｐＩキシラナーゼ遺伝子を過剰表現し、セルラーゼ成分のいずれか、または全てを生産することができないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ転換菌株を得ることができる。

実施例２に記載した方法を用いて、キシラナーゼをコードした部分の全てまたは一部を削除またはｐｙｒ４遺伝子等の選択マーカーで置換したプラスミドを調製する。別の方法としては、実施例１６に記載した方法により、ｐｙｒ４遺伝子をキシラナーゼ遺伝子に挿入し、暗号領域を破壊することもできる。アミノ酸配列でフランクされた選択マーカーを含む線状で、かなり相同性の高いＤＮＡ断片を用いて、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの転換菌株を作製することができる。このようにして、機能的に高いｐｌまたは低いｐｌのキシラナーゼまｔ：はその両方を生産することのできない形質転換体を作製することができる。

本発明は、いろいろな好ましい具体例をあげて記載したが、当該技術分野の専門家にとっては本発明の技術範囲または精神を逸脱することなく、いろいろな改良を加えることが容易であることはいうまでもない。したがって、本発明の範囲は下記の請求範囲及びそれに同等なものによって制限されるものでる。

２４　ｂｐのな八０ＮＡＦＩＧ、Ｊ塁−一、東６ユＥｃｏＲＩ　を刀４ｈ１−ニリ　ｐｃＥＰｃＬｌｌ・９Ｘ弯、■（＝　ＤＮＡ　ＪＬｎりｄ倉内Ｂ　Ｃ２，３− １９−＄ＦＩＧ−１１ｐＥＧエエ：　Ｐ−１／ｌ線式邑Ａ８ＣＤＥＦＩＧ−１３３′イリ’Ｉ　Ｉｌｉ＋受緘（＾、１（、ｓ−レ：し２国際調査報告ｌ−１−ＴＩ−１＋Ｉｊ−一＋Ａ峠ｔ４ａ＋ｍ５ｌｌｔＰＣＴ／ＵＳ９１１０７２６９フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１５６Ｄ　０６　Ｌ　１／１２　７１９９−３ＢＤＯ６Ｍ　１６１００／／　Ｃ１２Ｓ　１１１００（Ｃ１２Ｎ　１／１５Ｃ１２Ｒ１：８８５）（Ｃ１２Ｎ　９／２４Ｃ１２Ｒ１：８８５）Ｄ　０６　Ｍ　１０１：０６（７１）出願人　シューメイカー、シャロン　ピーアメリカ合衆国　カリフォルニア州９４５３３　フェアフィールド　バーバンクドライヴ　３１７３（７１）出願人　ワイス、ジェフリー　エルアメリカ合衆国　カリフォルニア州９４１１７　サンフランシスコ　ブエナ　ヴイスタ　アヴエニュ−４５７Ｉ（７２）発明者　ウォード、マイケルアメリカ合衆国　カリフォルニア州９４０１９　ハーフ　ムーン　ベイ　マートルストリート　３８１（７２）発明者　シューメイカー、シャロン　ピーアメリカ合衆国　カリフォルニア州９４５３３　フェアフィールド　バーバンクドライヴ　３１７３（７２）発明者　ワイス、ジェフリー　エルアメリカ合衆国　カリフォルニア州９４１１７　サンフランシスコ　ブエナ　ヴイスタ　アヴエニュ−４５７

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの少なくとも一部の細胞がかなり相同性の高い組換えＤＮＡを取り込み、これによって形質転換体を形成することが可能な条件下で、前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ細胞またはそのプロトプラストと前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡを処理し、（ｂ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの形質転換体を得る各工程からなることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの形質転換方法。
２．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡの形態が直線的断片であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のの方法。
３．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡが所定の選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
４．前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉが選択マーカー遺伝子の機能を有さず、前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡが前記の所定の選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
５．前記の選択マーカーが測定可能な生成物をコードしている遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
６．前記選択マーカーがオロチジン５′−−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｖｒ４）であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
７．前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの細胞がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉＧＣ６９株であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
８．前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体が特定のタンパク質またはタンパク質類をコードしている特定の遺伝子または遺伝子群の一部を欠いていることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
９．前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がセルラーゼ酵素類をコードしている特定の遺伝子または遺伝子群の一部を欠いていることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
１０．前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がセルラーゼ機能成分、すなわちＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩ１及びこれらの混合物のいずれか一つまたはそれ以上の成分を生成しないことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
１１．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ１遺伝子座のＤＮＡによりフランクされた選択マーカーをコードしているかなり相同性の高いＤＮＡの直接的断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
１２．前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がセルラーゼの機能成分ＣＢＨＩを生成しないことを特徴とする請求の範囲第１１項記載の方法。
１３．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのｃｂｈ２遺伝子のＤＮＡによりフランクされた選択マーカーをコードしているかなり相同性の高いＤＮＡ断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
１４．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がセルラーゼの機能成分ＣＢＨＩＩを生成しないことを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡがｅｇ１３遺伝子のＤＮＡによりフランクされた選択マーカーをコードしたかなり相同性の高いＤＮＡ断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
１６．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がセルラーゼの機能成分ＥＧＩＩを生成しないことを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法。
１７．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡはがｅｇ１１遺伝子のＤＮＡによりフランクされた選択マーカーをコードしたかなり相同性の高いＤＮＡ断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
１８．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がセルラーゼの機能成分ＥＧＩを生成しないことを特徴とする請求の範囲第１７項記載の方法。
１９．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体が機能的な低ｐＩキシラナーゼタンパク質を生成しないことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
２０．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体が機能的な高ｐＩキシラナーゼタンパク質を生成しないことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
２１．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がタンパク質を過剰表現することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
２２．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体が酵素を過剰表現することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
２３．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡが、選択マーカー及びＥＧＩタンパク質をコードしたかなり相同性の高いＤＮＡ断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
２４．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がセルラーゼのＥＧＩ成分を過剰表現することを特徴とする請求の範囲第２３項記載の方法。
２５．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡが選択マーカー及びＥＧＩタンパク質をコードし、ｃｂｈ１遺伝子座のＤＮＡによりフランクされたかなり相同性の高いＤＮＡ断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
２６．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がセルラーゼの機能成分ＣＢＨＩを生成せず、セルラーゼのＥＧＩ成分を過剰表現することを特徴とする請求の範囲第２５項記載の方法。
２７．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体がキシラナーゼタンパク質を過剰表現することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
２８．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡが、選択マーカー及び高ｐＩキシラナーゼタンパク質をコードしたかなり相同性の高いＤＮＡ断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
２９．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体が高ｐＩキシラナーゼタンパク質を過剰表現することを特徴とする請求の範囲第２８項記載の方法。
３０．前記のかなり相同性の高い組換えＤＮＡが、選択マーカー及び低ｐＩキシラナーゼタンパク質をコードしたかなり相同性の高いＤＮＡ断片であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
３１．前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体が低ｐＩキシラナーゼタンパク質を過剰表現することを特徴とする請求の範囲第３０項記載の方法。
３２．（ａ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの少なくとも一部の細胞がかなり相同性の高い組換えＤＮＡを取り込むことが可能な条件下で、前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ細胞と前記のＤＮＡを処理し、（ｂ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの形質転換体を得、（ｃ）前記の形質転換体からタンパク質成分を分離することから成る工程で得られ、非相同性タンパク質をほとんど含まないことを特徴とするタンパク質組成物。
３３．前記のタンパク質がセルラーゼの一つまたはそれ以上の機能成分を含まないセルラーゼ組成物であることを特徴とする請求の範囲第３２項記載のタンパク質組成物。
３４．前記のタンパク質組成物が機能成分ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩ１及びそれらの混合物のいずれか一つまたはそれ以上の成分を含まないセルラーゼ組成物であることを特徴とする請求の範囲第３２項記載のタンパク質組成物。
３５．前記のタンパク質組成物が一つまたはそれ以上のキシラナーゼタンパク質を含まないキシラナーゼ組成物であることを特徴とする請求の範囲第３２項記載のタンパク質組成物。
３６．前記のタンパク質組成物が機能成分ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧ１Ｉ、ＥＧＩＩ１及びそれらの混合物のいずれか一つまたはそれ以上の成分を含まないキシラナーゼ組成物であることを特徴とする請求の範囲第３項記載のタンパク質組成物。
３７．セルラーゼの機能成分ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩＩ及びそれらの混合物のいずれか一つまたはそれ以上の成分を含まず、非相同性タンパク質をほとんど含まないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ組成物。
３８．前記のセルラーゼ組成物が機能成分ＣＢＨＩを含まないことを特徴とする請求の範囲第３７項記載のセルラーゼ組成物。
３９．前記のセルラーゼ組成物が機能成分ＣＢＨＩＩを含まないことを特徴とする請求の範囲第３７項記載のセルラーゼ組成物。
４０．前記のセルラーゼ組成物が機能成分ＥＧＩを含まないことを特徴とする請求の範囲第３７項記載のセルラーゼ組成物。
４１．前記のセルラーゼ組成物が機能成分ＥＧＩＩを含まないことを特徴とする請求の範囲第３７項記載のセルラーゼ組成物。
４２．前記のセルラーゼ組成物が機能成分ＥＧＩＩＩを含まないことを特徴とする請求の範囲第３７項記載のセルラーゼ組成物。
４３．（ａ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの少なくとも一部の細胞がかなり相同性の高い組換えＤＮＡを取り込むことが可能な条件下で、ｉ）ｃｂｈ１遺伝子座のＤＮＡによりフランクされた選択マーカーをコードしたＤＮＡ；ｉｉ）ｃｂｈ２遺伝子座のＤＮＡによりフランクされた選択マーカーをコードしたＤＮＡ；ｉｉｉ）ｅｇ１１遺伝子座のＤＮＡによりフランクされた選択マーカーをコードしたＤＮＡ；ｉｖ）ｅｇ１３遺伝子座のＤＮＡによりフランクされた選択マーカーをコードしたＤＮＡから成る群から選んだかなり相同性の高い組換えＤＮＡの直線的断片と前記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉを細胞に処理し、（ｂ）機能成分ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩを生成することができないＴｒｉｃｈｏｄｅｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換体を得、（ｃ）機能成分ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧＩ１成分を含まない前記の形質転換体から生成したセルラーゼ組成物を分離することから成る工程で得られる非相同タンパク質をほとんど含まないことを特徴とするセルラーゼ組成物。
４４．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、セルラーゼの機能成分を生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
４５．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧＩＩ１及びそれらの混合物から成る群より選択されるいずれかのセルラーゼ機能成分を生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
４６．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能成分ＣＢＨＩを生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
４７．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能成分ＣＢＨＩＩを生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
４８．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能成分ＥＧＩを生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
４９．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能成分ＥＧＩＩを生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
５０．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能的な低ｐＩキシラナーゼタンパク質を生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
５１．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能的な高ｐＩキシラナーゼタンパク質を生成しないことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
５２．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、セルラーゼの機能成分ＥＧＩを過剰表現することを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
５３．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能的な高ｐＩキシラナーゼタンパク質を過剰表現することを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
５４．かなり相同性の高いＤＮＡを含み、機能的な低ｐＩキシラナーゼタンパク質を過剰表現することを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ形質転換細胞。
５５．選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉｃｂｈ１遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。
５６．請求項５５に記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。
５７．選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉｃｂｈ２遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。
５８．請求の範囲第５７項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。
５９．選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉｅｇ１１遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。
６０．請求の範囲第５９項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。
６１．選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉｅｇ１３遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。
６２．請求の範囲第６１項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。
６３．選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ低ｐＩキシラナーゼ遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。
６４．請求の範囲第６３項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。
６５．選択マーカー遺伝子及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ高ｐＩキシラナーゼ遺伝子の全てまたは一部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ構造。
６６．請求の範囲第６５項記載の組換えＤＮＡ構造を有することを特徴とするプラスミド。
６７．低ｐＩキシラナーゼタンパク質をコードしたことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子。
６８．高ｐＩキシラナーゼタンパク質をコードしたことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ遺伝子。
６９．かなり精製度の高いことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ由来の低ｐＩキシラナーゼタンパク質。
７０．さらに図１６に記載したアミノ酸配列を有し、かなり精製度の高いことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来の低ｐＩキシラナーゼタンパク質。
７１．かなり精製度の高いことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ由来の高ｐＩキシラナーゼタンパク質。
７２．さらに図１６に記載したアミノ酸配列を有し、かなり精製度の高いことを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来の高ｐＩキシラナーゼタンパク質。
７３．ａ）ＱＡトリスアクリル陰イオン交換樹脂カラムに細胞溶解酵素溶液を載せ、ｂ）前記の低ｐＩキシラナーゼを溶出させる各工程からなることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの低ｐＩキシラナーゼタンパク質の精製方法。
７４．ａ）ＱＡトリスアクリル陰イオン交換樹脂カラムに細胞溶解酵素溶液を載せ、ｂ）流出液を回収し、ｃ）該流出液を陽イオン交換樹脂上に装填し、前記高ｐＩエキシラナーゼを溶出せしめる各工程からなることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの高ｐＩキシラナーゼタンパク質の精製方法。