DE3424640C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Bestimmung und/oder Gewinnung von
humanspezifischem Interferon (im folgenden mit "HuIFN"
bezeichnet) aus Humangesamtblut.
Die Ansprüche 2 bis 10 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.
In den letzten Jahren sind klinische Versuche, bei denen der
Spiegel eines Blutenzyms oder dessen Metabolits chemisch
bestimmt werden, vielfach verwendet worden.
Da HuIFN, ein Blutbestandteil, Antivirus- und Antitumoraktivitäten
zeigt, wurde vorgeschlagen, den Spiegel des
Serum-HuIFN in die Spezifikationen des klinischen Tests
aufzunehmen. Dieser Vorschlag konnte jedoch nicht durchgeführt
werden, da die Menge an Serum-HuIFN sehr gering ist.
Aus einem Artikel von J. Hilfenhaus in Chemie in unserer Zeit,
Nr. 3, 1981, Seiten 71 bis 77, geht hervor, daß normalerweise
durch eine Zelle (Blut besteht aus Plasma, in dem die Blutkörperchen
suspendiert sind) kein Interferon synthetisiert wird. Es
bedarf einer exogenen Stimulation, wobei beispielsweise eine
solche Stimulation eine Virusinfektion ist (vgl. insbesondere
Seite 75, rechte Spalte, Zeile 1 bis 9).
Blut besteht aus einer Flüssigkeit, dem Plasma, in dem
Blutkörperchen suspendiert sind, wie Erythrocyten, Leukocyten
und Plättchen. Ein mm³ Blut enthält im allgemeinen
zusätzlich zu 7,4×10³ Leukocyten und 3×10⁵ Plättchen beim
Erwachsenen 5,4×10⁶ Erythrocyten beim Mann oder 4,8×10⁶
bei der Frau.
Es ist wohl bekannt, daß HuIFN durch Humanleukocyten gebildet
wird.
In herkömmlichen Verfahren zur Gewinnung von HuIFN werden
abgetrennte lebensfähige Leukocyten aus Humanblut verwendet.
So werden zum Beispiel wie bei Hans Strander und Karl
Cantell, Ann. Med. exp. Fenn., Bd. 44, Seiten 265-273 (1966)
(insbesondere S. 265, rechte Spalte "Materials and methods" bis S. 266, Abs. 4 und S. 269-270)
und den JA-PS 6 111/74 und 94 008/78 beschrieben Leukocyten
von anderen vorhandenen Blutkörperchen im Gesamtblut
abgetrennt und zur Bildung von HuIFN verwendet.
Eingehende Untersuchungen dieser herkömmlichen Verfahren
bestätigen, daß nur eine geringe Leukocytenausbeute aus
Blut möglich ist, d. h. 30 bis 50%, daß Leukocyten während
der Trennung beschädigt werden, daß die Lebensfähigkeit auf
40 bis 60% und ggf. die Gesamtausbeute auf 10 bis 30%
sinkt; außerdem ist die HuIFN-Bildung in den abgetrennten
Leukocyten unbeständig; diese Tatsachen machen die
Bestimmung der HuIFN-Bildung von Blut sehr schwierig und
sind ein Hindernis für die HuIFN-Gewinnung in größeren
Mengen (siehe auch H. Strander und K. Cantell, aaO., Seite 267,
linke Spalte im Abschnitt "Incubation of the leucocytes in vitro").
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Bestimmung und/oder
Gewinnung von humanspezifischem Interferon (HuIFN) aus Humangesamtblut
zur Verfügung gestellt, wobei man das im Blut angereicherte
HuIFN in bekannter Weise bestimmt und/oder isoliert, dadurch
gekennzeichnet, daß man vor der Bestimmung und/oder Gewinnung
des HuIFN Humangesamtblut in einem Gefäß mit wirkungsvollen
Mengen eines Antikoagulanz und eines Virus versetzt und unter
solchen Bedingungen inkubiert, daß sich eine wesentliche Menge
an HuIFN anreichert.
Dadurch lassen sich größere Mengen HuIFN aus dem kostbaren Humanblut
gewinnen, und es läßt sich die Bildung von HuIFN unter
Verwendung von Spenderblut bestimmen. Außerdem wurde festgestellt,
daß die HuIFN-Bildung von Gesamtblut leicht
und mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmt werden kann,
wenn man Gesamtblut in einem Gefäß mit einem Antikoagulanz
und einem Virus versetzt und inkubiert und das angereicherte
HuIFN titriert.
Eingehende Versuche bestätigen, daß das Zusetzen eines
intakten oder inaktivierten Virus in einer Menge von 20 bis
200 000 HA/ml Gesamtblut günstig ist. "HA" bedeutet die
Einheit des Hämagglutinationstiters eines Virus.
Der Ausdruck "Gesamtblut" bedeutet Frischblut-Präparate
von Spendern sowie Suspensionen, die dadurch erhalten wurden,
daß man von solchen Blutpräparaten das Plasma entfernt
und die zurückbleibenden Blutkörperchen in einer geeigneten
Nichtplasmaflüssigkeit suspendiert, z. B. physiologische
Kochsalzlösung, Pufferlösung oder Kulturnährmedium.
Jedes Antikoagulanz, das die Koagulation von Gesamtblut
verhindert und die HuIFN-Bildung nicht beeinträchtigt,
kann im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden; so
sind z. B. Heparin, Säure-Zitrat-Dextrose (ACD) oder Zitronensäure-
Dextrose (ACD) und Zitrat-Phosphat-Dextrose (CPD)
günstig.
Viren, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden,
sind solche, die die HuIFN-Bildung in Gesamtblut induzieren
können. So können z. B. Sendai-Virus oder Newcastle-Disease-
Virus intakt oder nach Inaktivierung verwendet werden.
Bei inaktivierten Viren ist die Reproduzierbarkeit z. B.
teilweise oder vollständig unterdrückt z. B. durch UV-Bestrahlung,
Erhitzen oder Behandeln bei einem extremen pH-Wert.
Für die Beimpfung mit dem Virus ist eine Menge von 20 bis
200 000 HA/ml Gesamtblut geeignet.
Die Inkubation des Gesamtbluts in einem Gefäß bei gleichzeitiger
Behandlung des Gesamtbluts mit dem Antikoagulanz
und dem Virus wird so durchgeführt, daß das Gesamtblut
in dem Gefäß mit dem Antikoagulanz und dem Virus zur Bildung
von HuIFN behandelt wird. Zum Beispiel können die vorgeschriebenen
Mengen an Antikoagulanz und Virus in dem Gefäß mit einer
entsprechenden Menge an Gesamtblut versetzt werden; das
Gemisch wird darin inkubiert. Andererseits kann man ein
Gemisch von Antikoagulanz und Gesamtblut in einem Gefäß
mit dem Virus versetzen und inkubieren. Bei dieser Inkubation
kann man ein geeignetes Medium zusätzlich verwenden,
z. B. physiologische Kochsalzlösung, isotone Pufferlösung
oder ein Kulturnährmedium.
Behälter, Gefäße, Flaschen, Proberöhrchen, Ampullen und
Mikroplattenvertiefungen jeder Form und jeden Volumens
können als Gefäß im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet
werden.
Die Inkubationsbedingungen, bei denen HuIFN gebildet wird,
sind z. B. ein Temperaturbereich von 30 bis 40°C und eine
Inkubationszeit von 5 bis 50 h. In diesem Fall kann, wenn
notwendig, Induktion oder Superinduktion durchgeführt werden.
Nach der Inkubation zur Bildung von HuIFN und einer eventuellen
Verdünnung mit physiologischer Kochsalz- oder isotoner
Pufferlösung wird das Gesamtblut in einem (geeigneten)
Verfahren getrennt, wie Zentrifugieren oder Filtrieren,
um die Blutkörperchen, wie Blutzellen, zu entfernen; der
entstandene Überstand oder das Filtrat, die HuIFN enthalten,
werden gereinigt oder titriert.
Um ein HuIFN-Präparat mit einer höchstmöglichen Reinheit
zu erhalten, kann das HuIFN durch Kombination herkömmlicher
Verfahren gereinigt werden, z. B. durch Aussalzen, Dialyse,
Filtrieren, Einengen, Adsorption und Desorption an einem
Ionenaustauscher, Gelfiltration, Affinitätschromatographie
unter Verwendung eines geeigneten Liganden, wie eines Antikörpers,
Fraktionieren am isoelektrischen Punkt und Elektrophorese.
Das erhaltene HuIFN kann günstigerweise als Injektion oder
Arzneimittel für äußere und interne Verwendung konfektioniert
und zur Vorbeugung und Behandlung von Humanerkrankungen
allein oder in Kombination mit einer oder mehreren
Substanzen verwendet werden.
Die HuIFN-Bildung in Humangesamtblut kann erfindungsgemäß
dadurch bestimmt werden, daß man den HuIFN-Spiegel in dem
oben beschriebenen Überstand oder Filtrat titriert. Zu
diesem Zweck kann jede Bestimmungsmethode verwendet werden,
vorausgesetzt, die HuIFN-Bildung durch Gesamtblut wird durch
die Titration erfaßt, z. B. biochemische Analysen (Bioassay),
Radioimmunoassay und enzymgebundene Immunoadsorptionsversuche.
In den letzten Jahren sind enzymgebundene Immunoadsorptionsversuche
zur sehr sicheren, geeigneten und rasch durchzuführenden
Bestimmungsverfahren entwickelt worden. Jeder
enzymgebundene Immunoadsorptionsversuch, mit dem man IFN
als Antigen titrieren kann, kann im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden. Zum Beispiel sind die doppelte bzw. Doppel-Antikörper-
Sandwich-Technik und die modifizierte Doppel-Antikörper-
Sandwich-Technik günstig.
Es wurde bestätigt, daß die auf diese Weise bestimmte Bildung
von HuIFN für die klinische Untersuchung der einzelnen
Spender sehr geeignet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren bestätigt, daß das von einem
Krebspatienten gesammelte Blut eine viel geringere HuIFN-
Bildung aufweist als das Blut von gesunden freiwilligen
Spendern.
Die folgenden Versuche erläutern die Erfindung.
Die Wirkung einer Vorbehandlung von Blut auf die HuIFN-Bildung
wurde untersucht. In diesem Versuch werden frische
Blutproben von drei gesunden freiwilligen Spendern nach
der Behandlung mit Heparin verwendet.
Die in diesem Versuch verwendeten behandelten Blutproben
waren wie folgt:
eine plasmafreie Suspension, erhalten durch Zentrifugieren von Blut zur Entfernung des Plasmas und Suspendieren der zurückbleibenden Blutkörperchen in RPMI 1640-Medium in der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut;
eine mit Ammoniumchlorid behandelte Suspension, erhalten durch Behandeln von Blut mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 0,75% Ammoniumchlorid enthält, in herkömmlicher Weise, um die Hämolyse der Erythrocyten zu bewirken, Zentrifugieren des Gemisches und Suspendieren der zurückbleibenden erythrocytenfreien Blutkörperchen in RPMI 1640-Medium in der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut.
eine plasmafreie Suspension, erhalten durch Zentrifugieren von Blut zur Entfernung des Plasmas und Suspendieren der zurückbleibenden Blutkörperchen in RPMI 1640-Medium in der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut;
eine mit Ammoniumchlorid behandelte Suspension, erhalten durch Behandeln von Blut mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 0,75% Ammoniumchlorid enthält, in herkömmlicher Weise, um die Hämolyse der Erythrocyten zu bewirken, Zentrifugieren des Gemisches und Suspendieren der zurückbleibenden erythrocytenfreien Blutkörperchen in RPMI 1640-Medium in der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut.
1-ml-Proben des heparinisierten oder behandelten Bluts
werden in verschiedene Kunststoffproberöhrchen eingefüllt
und mit 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt,
die Sendai-Virus in Mengen von 0, 100 bzw. 1000 HA enthält,
und dann 16 h bei 37°C inkubiert. Die inkubierten Gemische
werden mit UV bestrahlt, um den Sendai-Virus vollständig
zu inaktivieren, und zentrifugiert; in den erhaltenen Überständen
werden die HuIFN-Titer je ml Gesamtblut bestimmt.
Der HuIFN-Titer wird durch die Farbstoffaufnahme gemäß
Anne L. R. Pidot, Applied Microbiology, Bd. 22, Nr. 4, Seiten
671 bis 677 (1971), bestimmt. Der Hämagglutationstiter (HA)
wird gemäß J. E. Salk, The Journal of Immunology, Bd. 49,
Seiten 87-98 (1944), mit einer geringfügigen Änderung bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind Gesamtblut
und plasmafreie Suspensionen, die die gesamten Blutkörperchen
enthalten, für die Bestimmung der HuIFN-Bildung günstig,
da sie HuIFN in hoher Ausbeute und Beständigkeit
bilden. Die Ergebnisse bestätigen auch, daß die mit Ammoniumchlorid
behandelte Suspension, in der die Erythrocyten
hämolysiert und entfernt worden sind, eine niedrige und
unbeständige HuIFN-Bildung geben.
Die Wirkung einer Virusimpfung auf die HuIFN-Bildung wird
untersucht. Frische Blutproben von drei gesunden freiwilligen
Spendern und zwei Krebspatienten werden nach der Behandlung
mit Heparin verwendet.
Gemäß Versuch 1 wird 1 ml jeder heparinisierten Blutprobe
in verschiedene Proberöhrchen eingefüllt, mit 0,1 ml physiologischer
Kochsalzlösung versetzt, die Sendai-Virus in
Mengen von 0, 2, 20, 200, 2000, 20 000 bzw. 200 000 HA
enthält, inkubiert; der HuIFN-Titer je ml Blut wird bestimmt.
Eine Versuchsreihe mit 2 000 000 HA Sendai-Virus je ml
Blut war geplant, wurde jedoch nicht durchgeführt, da Präparate
mit einem so hohen Sendai-Virus-Titer nicht herstellbar
waren.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind Virusbeimpfungen
im Bereich von 20 bis 200 000 HA/ml Blut günstig.
Die Ergebnisse bestätigen, daß das Blut von einem Krebspatienten
viel weniger HuIFN bildet als das Blut von gesunden
freiwilligen Spendern. Das läßt vermuten, daß die Bestimmung
der HuIFN-Bildung im Blut für den Nachweis von
Krebs im frühen Stadium hilfreich sein könnte.
Verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden nachstehend erläutert.
Ein ml heparinisiertes frisches Blut eines gesunden freiwilligen
Spenders wird in ein Kunststoffproberöhrchen eingefüllt,
mit 1000 HA Sendai-Virus versetzt, bei 37°C 20 h
inkubiert und mit UV bestrahlt, um den Virus vollständig
zu inaktivieren. Nach dem Zentrifugieren des Gemisches
wird der HuIFN-Titer des Überstandes bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3600 Einheiten je ml Blut.
Ein ml einer heparinisierten Frischblutprobe eines gesunden
freiwilligen Spenders wird mit 2000 HA Newcastle-Desease-
Virus versetzt, dessen Reproduzierbarkeit zu 90% inaktiviert
worden ist. Nach der 15stündigen Inkubation bei
37°C wird der HuIFN-Titer des Gemisches gemäß Beispiel 1
bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 2800 Einheiten je ml Blut.
Eine heparinisierte Frischblutprobe von gesunden freiwilligen
Spendern wird zur Entfernung des Plasmas zentifugiert.
Die so erhaltenen Blutkörperchen werden in der Zentrifuge
mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in RPMI
1640-Medium zu der gleichen Blutkörperchendichte wie im
Blut suspendiert.
Die entstandene Suspension wird in ein Minigefäß eingefüllt
und mit 500 HA Sendai-Virus je ml Suspension versetzt.
Nach der 16stündigen Inkubation bei 37°C wird das Gemisch
behandelt und dessen HuIFN-Titer gemäß Beispiel 1
bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3000 Einheiten je ml Blut.
Eine Blutkörperchen enthaltende Suspension wird gemäß Beispiel
3 hergestellt.
Die Suspension wird in ein Minigefäß eingefüllt, mit 300
Einheiten HuIFN je ml Suspension versetzt und 6 h bei 37°C
inkubiert. Dann wird die Suspension mit 1000 HA Sendai-
Virus je ml Suspension versetzt und weitere 16 h bei 37°C
inkubiert. Das entstandene Gemisch wird gemäß Beispiel 1
behandelt und auf HuIFN untersucht.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 27 000 Einheiten je ml Blut.
1 ml heparinisiertes Frischblut eines gesunden freiwilligen
Spenders, eines 28jährigen Mannes, wird gemäß Beispiel
1 behandelt und biochemisch auf den HuIFN-Titer untersucht.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3600 Einheiten je ml Blut.
1 ml einer heparinisierten Frischblutprobe eines gesunden
freiwilligen Spenders, einer 33jährigen Frau, wird gemäß
Beispiel 2 behandelt und dessen HuIFN-Titer gemäß Beispiel 5
bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 2800 Einheiten je ml Blut.
Eine heparinisierte Frischblutprobe eines gesunden freiwilligen
Spenders, eines 61jährigen Mannes, wird gemäß
Beispiel 3 behandelt; man erhält eine Blutkörperchen enthaltende
Suspension.
1 ml der Suspension wird in ein Kunststoffproberöhrchen
eingefüllt und mit 1000 HA Sendai-Virus versetzt. Nach
der 16stündigen Inkubation bei 37°C wird das Gemisch
zur Bestimmung des HuIFN-Titers der doppelten Antikörper-
Sandwich-Technik unterworfen, das ist ein enzymgebundener
Immunoadsorptionsversuch.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3400 Einheiten je ml Blut.
Dieser Wert entspricht dem, der durch biochemische Analyse
(bioassay) erhalten wurde.
Eine heparinisierte Frischblutprobe eines Krebspatienten,
eines 68jährigen Mannes, wird gemäß Beispiel 5 behandelt;
man erhält eine HuIFN-Bildung von etwa 140 Einheiten je
ml Blut.
Eine heparinisierte Frischblutprobe einer Krebspatientin,
einer 55jährigen Frau, wird gemäß Beispiel 5 behandelt;
man erhält eine HuIFN-Bildung von etwa 70 Einheiten je
ml Blut.
Für den Fachmann ist ersichtlich, daß verschiedene Änderungen
durchgeführt werden können, ohne den Schutzumfang der
Erfindung zu überschreiten, und daß die Erfindung nicht
auf die Beschreibung beschränkt ist.
Claims (10)
1. Verfahren zur Bestimmung und/oder Gewinnung von
humanspezifischem Interferon (HuIFN) aus Humangesamtblut, wobei
man das im Blut angereicherte HuIFN bestimmt
und/oder isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der
Bestimmung und/oder Gewinnung des HuIFN Humangesamtblut in
einem Gefäß mit wirkungsvollen Mengen eines Antikoagulanz und
eines Virus versetzt und unter solchen Bedingungen inkubiert,
daß sich eine wesentliche Menge an HuIFN anreichert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Menge des Virus im Bereich von 20 bis 200 000
Hämagglutinationstiter je ml Gesamtblut liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Antikoagulanz mindestens eine Verbindung aus der aus
Heparin, Säure-Zitrat-Dextrose und Zitrat-Phosphat-Dextrose
bestehenden Gruppe ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß der Virus aus der aus Sendai-Virus und
Newcastle-Disease-Virus bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Humangesamtblut bei einer Temperatur im
Bereich von 30 bis 40°C 5 bis 50 h lang inkubiert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß man Humangesamtblut verwendet, das durch
- - Entfernen des Plasma aus einem Spenderblut und
- - Suspendieren der zurückbleibenden Blutkörperchen in einer Lösung aus der aus physiologischer Kochsalzlösung, isotoner Pufferlösung oder einem Kulturnährmedium bestehenden Gruppe erhalten worden ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zur Bestimmung der
HuIFN-Bildung in Humangesamtblut zur Früherkennung von Krebs.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das
angereicherte HuIFN mittels Bioassay titriert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das
angereicherte HuIFN mittels Radioimmunoassay titriert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das
angereicherte HuIFN mittels Enzym-Immunoassay titriert wird.
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