DE3424640A1 - Verfahren zur gewinnung und/oder bestimmung von humanspezifischem interferon im blut - Google Patents

Verfahren zur gewinnung und/oder bestimmung von humanspezifischem interferon im blut

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DE3424640A1 DE19843424640 DE3424640A DE3424640A1 DE 3424640 A1 DE3424640 A1 DE 3424640A1 DE 19843424640 DE19843424640 DE 19843424640 DE 3424640 A DE3424640 A DE 3424640A DE 3424640 A1 DE3424640 A1 DE 3424640A1
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Description

BOETERS, BAUER VPARtNER PATENTANWÄLTE Q Λ 9 A β A Ω EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
THOMAS-WIMMER-RING 14 D-eOOO MÜNCHEN 22
■ k-
PA* BOETERS, BAUER & PARTNER THOMAS-WIMMER-ON014, D-8000 MÜNCHEN 22 MÜNCHEN
DlPL-CHEM. OR HANS D. BOETERS ROBERT BAUER
DIPU-INa VINCENZ ν. RAFFAY DIPL-CHEM. DR THOMAS FLECK HAMBURa
TEUS=ON: (ΟΘΘ) 22 OO 02
TELEX 5 24 87Θ mm
TEUsGUVMMEPfKyVENTION1MUNCHEN
Unser Z.: 3901
Anmelderin: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo, JAPAN
Verfahren zur Gewinnung und/oder Bestimmung von humanspezifischem Interferon im Blut
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von humanspezifischem Interferon (im folgenden mit "HuIFN" bezeichnet) aus Humangesamtblut und ein Verfahren zur Bestimmung der HuIFN-ßildung in Humanblut. 5
In den letzten Jahren sind klinische Versuche, bei denen der Spiegel eines Blutenzyms oder dessen Metabolits chemisch bestimmt werden, vielfach verwendet worden.
Da HuIFN, ein Blutbestandteil, Antivirus- und Antitumoraktivitäten zeigt, wurde vorgeschlagen, den Spiegel des Serum-HuIFN in die Spezifikationen des klinischen Tests aufzunehmen. Dieser Vorschlag konnte jedoch nicht durchgeführt werden, da die Menge an Serum-HuIFN sehr gering ist.
Blut besteht aus einer Flüssigkeit, dem Plasma, in dem
r- 342A640
S,
Blutkörperchen suspendiert sind, wie Erythrocyten, Leuko-
3
cyten und Plättchen. Ein mm Blut enthält im allgemeinen
3 b
zusätzlich zu 7,4x10 Leukocyten und 3x10 Plättchen beim Erwachsenen'5,4x10 Erythrocyten beim Mann oder 4,8x10 bei der Frau.
Es ist wohl bekannt, daß HuIFN durch Humanleukocyten gebildet wird.
In herkömmlichen Verfahren zur Gewinnung von HuIFN werden abgetrennte lebensfähige Leukocyten aus Humanblut verwendet. So v/erden zum Beispiel wie bei Hans Strander und Kari Cantell, Ann. Med. exp. Fenn. Bd. 44 Seiten 265 - 273 (1966) und den JA-PSen 6 111/74 und 94 008/78 beschrieben Leukocyten von anderen vorhandenen Blutkörperchen im Gesamtblut abgetrennt und zur Bildung von HuIFN verwendet.
Eingehende Untersuchungen dieser herkömmlichen Verfahren bestätigen, daß nur eine geringe Leukocytenausbeute aus Blut möglich ist, d.h. 30 bis 50 %, daß Leukocyten während der Trennung beschädigt werden, daß die Lebensfähigkeit auf 40 bis 60 % und ggf. die Gesamtausbeute auf 10 bis 30 % sinkt; außerdem ist die HuIFN-Bildung in den abgetrennten Leukocyten unbeständig; diese Tatsachen machen die Bestimmung der HuIFN-Bildung von Blut sehr schwierig und sind ein Hindernis für die HuIFN-Gewinnung in größeren Mengen.
Bei Untersuchungen zur HuIFN-Gewinnung in größeren Mengen aus kostbarem Humanblut sowie zur Bestimmung der HuIFN-Bildung unter Verwendung von Spenderblut wurde festgestellt, daß einegroße Menge von HuIFN hergestellt werden kann, indem man Gesamtblut in einem Gefäß mit einem Antikoagulanz und einem Virus versetzt und inkubiert. Außerdem wurde festgestellt, daß die HuIFN-Bildung von Gesamtblut leicht
— 3 —
und mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmt werden kann, wenn man Gesarntblut in einem Gefäß mit einem Antikoagulanz und einem Virus versetzt und inkubiert und das angereicherte HuIFN titriert.
5
Eingehende Versuche bestätigen, daß das Zusetzen eines intakten oder inaktivierten Virus in einer Menge von 20 bis 200 000 HA/ml Gesamtblut günstig ist. "HA" bedeutet die Einheit des Hämagglutinationstiters eines Virus.
Der Ausdruck "Gesamtblut" bedeutet Frischblut-Präparate von Spendern sowie Suspensionen, die dadurch erhalten wurden, daß man von solchen Blutpräparaten das Plasma entfernt und die zurückbleibenden Blutkörperchen in einer geeigneten Nichtplasmaflüssxgkeit suspendiert, z.B. physiologische Kochsalzlösung, Pufferlösung oder Kulturnährmedium.
Jedes Antikoagulanz, das die Koagulation von Gesamtblut verhindert und die HuIFN-Bildung nicht beeinträchtigt, kann im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden; so sind z.B. Heparin, Saure-Zitrat-Dextrose (ACD) oder Zitronensäure-Dextrose (ACD) und Zitrat-Phosphat-Dextrose (CPD) günstig.
2b Viren, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind solche, die die HuIFN-Bildung in Gesamtblut induzieren können. So können z.B. Sendai-Virus oder Newcastle-Disease-Virus intakt oder nach Inaktivierung verwendet werden. Bei inaktivierten Viren ist die Reproduzierbarkeit z.B.
teilweise oder vollständig unterdrückt z.B. durch UV-Bestrahlung, Erhitzen oder Behandeln bei einem extremen pH-Wert. Für die Beimpfung mit dem Virus ist eine Menge von 20 bis 200 000 HA/ml Gesarntblut geeignet.
Die Inkubation des Gesamtbluts in einem Gefäß bei gleichzeitiger Behandlung des Gesamtbluts mit dem Antikoagulanz
und dem Virus wird so durchgeführt, daf3 das Gesamtblut in dem Gefäß mit dem Antikoagulanz und dem Virus zur bildung von HuIFN behandelt wird. Z.B. können die vorgeschriebenen Mengen an Antikoagulanz und Virus in dem Gefäß mit einer entsprechenden Menge an Gesamtblut versetzt werden; das Gemisch wird darin inkubiert. Andererseits kann man ein Gemisch von Antikoagulanz und Gesamtblut in einem Gefäß mit dem Virus versetzen und inkubieren. Bei dieser Inkubation kann man ein geeignetes Medium zusätzlich verwenden, z.B. physiologische Kochsalzlösung, isotone Pufferlösung oder ein Kulturnährmedium.
Behälter, Gefäße, Flaschen, Proberöhrchen, Ampullen und Mikroplattenvertiefungen jeder Form und jeden Volumens können als Gefäß im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Die Inkubationsbedingungen, bei denen HuIFN gebildet wird, sind z.B. ein Temperaturbereich-von 30 bis 40 C und eine Inkubationszeit von 5 bis 50 h. In diesem Fall kann, wenn notwendig, Induktion oder Superinduktion durchgeführt werden
Nach der Inkubation zur Bildung von HuIFN und einer eventuellen Verdünnung mit physiologischer Kochsalz- oder isotoner Pufferlösung wird das Gesamtblut in einem (geeigneten) Verfahren getrennt, wie Zentrifugieren oder Filtrieren, um die Blutkörperchen, wie Blutzellen, zu entfernen; der entstandene überstand oder das Filtrat, die HuIFN enthalten, werden gereinigt oder titriert.
Um ein HuIFN-Präparat mit einer höchstmöglichen Reinheit zu erhalten, kann das HuIFN durch Kombination herkömmlicher Verfahren gereinigt werden, z.B. durch Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Einengen, Adsorption und Desorption an einem
Ionenaustauscher, Gelfiltration, Affinitätschromatographie unter Verwendung eines geeigneten Liganden, wie eines Antikörpers, Fraktionieren am isoelektrischen Punkt und Elektrophorese .
5
Das erhaltene HuIFN kann günstigerweise als Injektion oder Arzneimittel für äußere und interne Verwendung konfektioniert und zur Vorbeugung und Behandlung von Humanerkrankungen allein oder in Kombination mit einer oder mehreren Substanzen verwendet werden.
Die HuIFN-Bildung in Humangesamtblut kann erfindungsgemäß dadurch bestimmt werden, daß man den HuIFN-Spiegel in dem oben beschriebenen Überstand oder Filtrat titriert. Zu diesem Zweck kann jede Bestimmungsmethode verwendet werden, vorausgesetzt die HuIFN-Bildung durch Gesamtblut wird durch die Titration erfaßt, z.B. biochemische Analysen (Bioassay), Radioimmunoassay und enzymgebundene Immunoadsorptionsversuche.
In den letzten Jahren sind enzymgebundene Immunoadsorptionsversuche zur sehr sicheren, geeigneten und rasch durchzuführenden Bestimmungsverfahren entwickelt worden. Jeder enzymgebundene Immunoadsorptionsversuch, mit dem man IFN als Antigen titrieren kann, kann im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Z.B. sind die doppelte tew. Doppel-Antikörper· Sandwich-Technik und die modifizierte Doppel-Antikörper-Sandwich-Technik günstig.
Es wurde bestätigt, daß die auf diese Weise bestimmte Bildung von HuIFN für die klinische Untersuchung der einzelnen Spender sehr geeignet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren bestätigt, daß das von einem Krebspatienten gesammelte Blut eine viel geringere HuIFN-Bildung aufweist als das Blut von gesunden freiwilligen Spendern.
s 342Λ640
-Jo-
.9·
Die folgenden Versuche erläutern die Erfindung. Versuch 1
Wirkung einer Vorbehandlung auf HuIFN-Bildung in Blut
Die Wirkung einer Vorbehandlung von Blut auf die HuIFN-Bildung wurde untersucht. In diesem Versuch werden frische Blutproben von drei gesunden freiwilligen Spendern nach der Behandlung mit Heparin verwendet.
Die in diesem Versuch verwendeten behandelten Blutproben waren wie folgt:
eine plasmafreie Suspension, erhalten durch Zentrifugieren von Blut zur Entfernung des Plasmas und Suspendieren der zurückbleibenden Blutkörperchen in RPMI 1640-Medium in der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut; eine mit Ammoniumchlorid behandelte Suspension, erhalten durch Behandeln von Blut mit Tris-HCl~Puffer (pH 7,2), der 0,75 % Ammoniumchlorid enthält, in herkömmlicher Weise, um die Hämolyse der Erythrocyten zu bewirken, Zentrifugieren des Gemisches und Suspendieren der zurückbleibenden erythrocytenfreien Blutkörperchen in RPMI 1640-Medium in der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut.
1-ml-Proben des heparinisierten oder behandelten Bluts werden in verschiedene KunststoffpHoberöhrchen eingefüllt und mit 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die Sendai-Virus in Mengen von 0, 100 bzw. 1 000 HA enthält, und dann 16 h bei 37 °C inkubiert. Die inkubierten Gemische werden mit UV bestrahlt, um den Sendai-Virus vollständig zu inaktivieren, und zentrifugiert; in den erhaltenen Überständen werden die HuIFN-Titer je ml Gesamtblut bestimmt.
• /ΙΟ-
3424648
Der HuIFN-Titer wird durch die Farbstoffaufnähme gemäß Anne L.R. Pidot, Applied Microbiology, Bd. 22, Nr. 4, Seiten 671 bis 677 (1971) bestimmt. Der Hämagglutationstiter (HA) wird gemäß J.E. SaIk, The Journal of Immunology, Bd. 49, Seiten 87-98 (1944) mit einer geringfügigen Änderung bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind Gesamtblut und plasmafreie Suspensionen, die die gesamten Blutkörperchen enthalten, für die Bestimmung der HuIFN-Bildung günstig, da sie HuIFN in hoher Ausbeute und Beständigkeit . bilden. Die Ergebnisse bestätigen auch, daß die mit Ammoniumchlorid behandelte Suspension, in der die Erythrocyten hämolysiert und entfernt worden sind, eine niedrige und unbeständige HuIFN-Bildung geben. .
Tabelle 1 mit Ammoniumchlorid 1 0 gesunde
Spender		 freiwillige 4. C
behandelte Sus 100 4. 10
Behandlung ! Sendai-Virus
(HA)		 pension .000 A B 4. 200
0
100		 30 60 4. 500
.000 3.800 2.500 0
600
0 3.700 2.600 200
keine 1 100 0
3.600		 10
2.400		 0
.000 4.100 2.800 1QO
plasmafreie
Suspension		 1 0 10 70
0 200
0 300
— 8 —
342Α640
Versuch 2
Wirkung einer Virusimpfung auf die HuIFN-Rildung
Die Wirkung einer Virusimpfung auf die HuIFN-Bildung wird untersucht. Frische Blutproben von drei gesunden freiwilligen Spendern und zwei Krebspatienten werden nach der Behandlung mit Heparin verwendet.
Gemäß Versuch 1 wird 1 ml jeder heparinisierten Blutprobe in verschiedene Proberöhrchen eingefüllt, mit 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die Sendai-Virus in Mengen von 0, 2, 20, 200, 2 000, 20 000 bzw. 200 000 HA
enthält, inkubiert; der HuIFN-Titer je ml Blut wird bestimmt. 15
Eine Versuchsreihe mit 2 000 000 HA Sendai-Virus je ml Blut war geplant, wurde jedoch nicht durchgeführt, da Präparate mit einem so hohen Sendai-Virus-Titer nicht herstellbar waren.
20
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
— 9 —
Tabelle 2
342464Ö
Sendai-Virus (HA)
gesunde freiwillige Spender
Krebspatient
0 2 50 1 80 5 20 10 0
2 2 130 2 70 5 30 10 0
20 4 600 2 600 6 400 10 30
200 3 800 2 400 8 800 20 70
2 000 4 100 2 100 7 300 20 190
20 000 500 300 800 10 140
200 000 400 200 300 10 180
2 000 000 ND ND ND ND ND
ND: nicht durchgeführt.
- 10 -
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind Virusbeimpf ungen im Bereich von 20 bis 200 000 HA/ml Blut günstig.
Die Ergebnisse bestätigen, daß das Blut von einem Krebspatienten viel weniger HuIFN bildet als das Blut von gesunden freiwilligen Spendern. Das läßt vermuten, daß die Bestimmung der HuIFN-Bildung im Blut für den Nachweis von
Krebs im frühen Stadium hilfreich sein könnte.
Verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachstehend erläutert.
Bildung von HuIFN
Beispiel 1
Ein ml heparinisiertes frisches Blut eines gesunden freiwilligen Spenders wird in ein Kunststoffproberöhrchen eingefüllt, mit 1 000 HA Sendai-Virus versetzt, bei 37 0C 20 h inkubiert und mit UV bestrahlt, um den Virus vollständig
zu inaktivieren. Nach dem Zentrifugieren des Gemisches
wird der HuIFN-Titer des Überstandes bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3 600 Einheiten je ml Blut. 25
Beispiel 2
Ein ml einer heparinisierten Frischblutprobe eines gesunden freiwilligen Spenders wird mit 2 000 HA Newcastle-Deseasevirus versetzt, dessen Reproduzierbarkeit zu 90 % inaktiviert worden ist. Nach der 15-stündigen Inkubation bei
37 C wird der HuIFN-Titer des Gemisches gemäß Beispiel 1 bestimmt.
- 11 -
342A640
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 2 800 Einheiten je ml Blut. Beispiel 3
Eine heparinisierte Frischblutprobe von gesunden freiwilligen Spendern wird zur Entfernung des Plasmas zentrifugiert. Die so erhaltenen Blutkörperchen werden in der Zentrifuge mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in RPMI 1640-Medium zu der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut suspendiert.
Die entstandene Suspension wird in ein Minigefäß eingefüllt und mit 500 HA Sendai-Virus je ml Suspension versetzt. Nach der 16-stündigen Inkubation bei 37 0C wird das Gemisch behandelt und dessen HuIFN-Titer gemäß Beispiel 1 bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3 000 Einheiten je ml Blut.
Beispiel 4
Eine Blutkörperchen enthaltende Suspension wird gemäß Beispiel 3 hergestellt.
Die Suspension wird in ein Minigefäß eingefüllt, mit 300
Einheiten HuIFN je ml Suspension versetzt und 6 h bei 37 0C inkubiert. Dann wird die Suspension mit 1 000 HA Sendai-Virus je ml Suspension versetzt und weitere 16 h bei 37 0C 2Q inkubiert. Das entstandene Gemisch wird gemäß Beispiel 1 behandelt und auf HuIFN untersucht.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 27 000 Einheiten je ml Blut.
- 12 -
34246
Bestimmung der HuIFN-Bildung im Blut Beispiel 5
1 ml heparinisiertes Frischblut eines gesunden freiwilligen Spenders, eines 28-jährigen Mannes, wird gemäß Beispiel 1 behandelt und biochemisch auf den HuIFN-Titer untersucht.
Die HuIFN-bildung beträgt etwa 3 600 Einheiten je ml Blut. 10
Beispiel 6 - , :.
1 ml einer heparinisierten Frischblutprobe eines gesunden freiwilligen Spenders, einer 33-jährigen Frau, wird gemäß Beispiel 2 behandelt und dessen HuIFN-Titer gemäß Beispiel 5 bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 2 800 Einheiten je ml Blut. Beispiel 7
Eine heparinisierte Frischblutprobe eines gesunden freiwilligen Spenders, eines 61-jährigen Mannes, wird gemäß Beispiel 3 behandelt; man erhält eine Blutkörperchen enthaltende Suspension.
1 ml der Suspension wird in ein Kunststoffproberöhrchen eingefüllt und mit 1 000 HA Sendai-Virus versetzt. Nach der 16-stündigen Inkubation bei 37 0C wird das Gemisch zur Bestimmung des HuIFN-Titers der doppelten Antikörper-Sandwich-Technik unterworfen, das ist ein enzymgebundener Immunoadsorptionsversuch.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3 400 Einheiten je ml Blut.
- 13 -
342464Ü
Dieser wert entspricht dem, der durch biochemische Analyse (bioassay) erhalten wurde.
Beispiel 8
5
Eine heparinisierte Frischblutprobe eines Krebspatienten, eines 68-jährigen Mannes, wird gemäß Beispiel 5 behandelt; man erhält eine HuIFN-Bildung von etwa 140 Einheiten je ml Blut.
10
Beispiel 9
Eine heparinisierte Frischblutprobe einer Krebspatientin, einer 55-jährigen Frau, wird gemäß Beispiel 5 behandelt; man erhält eine HuIFN-Bildung von etwa 70 Einheiten je ml Blut.
Für den Fachmann ist ersichtlich, daß verschiedene Änderungen durchgeführt werden können, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu überschreiten, und daß die Erfindung nicht auf die Beschreibung beschränkt ist.

Claims (1)

  1. ANSPRÜCHE:
    I ii Verfahren zur Gewinnung von humanspezifischem Interferon (HuIFN), dadurch gekennzeichnet , daß man
    - Humangesamtblut in einem Gefäß mit wirkungsvollen Mengen f- eines Antikoagulanz und eines Virus versetzt und unter solchen Bedingungen inkubiert, daß sich eine wesentliche Iwenge an HuIFN anreichert und
    - das angereicherte HuIFN gewinnt.
    10 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge des Virus im Bereich von 20 bis 200 000 Hämagglutinationstiter je ml Gesamtblut liegt.
    15 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Antikoagulanz mindestens eine Verbindung aus der aus Heparin, Saure-Zitrat-Dextrose und Zitrat-Phosphat-Dextrose bestehenden Gruppe ist.
    20 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Virus aus der aus Sendai-Virus und Newcastle-Disease-Virus bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
    5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Humangesamtblut bei einer Temperatur
    wird.
    ratur im Bereich von 30 bis 40 C 5 bis 50 h lang inkubiert
    6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man Humangesamtblut verwendet, das durch:
    _ - Entfernen des Plasma aus einem Spenderblut und
    - Suspendieren der zurückbleibenden Blutkörperchen in einer Lösung aus der aus physiologischer Kochsalzlösung, isotoner Pufferlösung oder einem Kulturnährmedium bestehenden Gruppe erhalten worden ist.
    15
    7. Verfahren zur Bestimmung der HuIFN-Bildung in Humangesamtblut insbesondere zur Früherkennung von Krebs, dadurch gekennzeichnet , daß man
    - Humangesamtblut in einem Gefäß mit einer wirkungsvollen Menge an Antikoagulanz und Virus versetzt und unter solchen Bedingungen inkubiert, daß sich eine wesentliche Menge an HuIFN anreichert und
    - das angereicherte HuIFN titriert.
    25
    8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge des Virus im Bereich von 20 bis 200 000 Hämagglutinationstiter je ml Gesamtblut liegt.
    9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Antikoagulanz mindestens eine Verbindung aus der aus Heparin, Säure-Zitrat-Dextrose und Zitrat-Phosphat-Dextrose bestehenden Gruppe ist.
    10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß der Virus aus der aus Sendai-Virus und Newcastle-Disease-Virus bestehenden Gruppe ausgewählt
    wird.
    5
    11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Gesamtblut bei einer Temperatur im Bereich von 30 bis 40 C 5 bis 50 h lang inkubiert wird.
    Ί0 12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das angereicherte HuIFN mittels Bioassay titriert wird.
    13. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e k e η η -
    zeichnet, daß das angereicherte HuIFN mittels Radioimmunoassay titriert wird.
    14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das angereicherte HuIFN mittels Enzym- Immunoassay titriert wird.
    15. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch ge kennzeichnet , daß man Humangesamtblut verwendet, das durch
    - Entfernen des Plasmas aus einem Spenderblut und
    - Suspendieren der zurückbleibenden Blutkörperchen in einer Lösung aus der aus physiologischer Kochsalzlösung, isotoner Pufferlösung und einem Kulturnährmedium bestehenden Gruppe
    3Q erhalten worden ist.
DE19843424640 1983-07-08 1984-07-04 Verfahren zur gewinnung und/oder bestimmung von humanspezifischem interferon im blut Granted DE3424640A1 (de)

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