JPS6017361A - 血液のインタ−フエロン産生能測定方法 - Google Patents
血液のインタ−フエロン産生能測定方法Info
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- JPS6017361A JPS6017361A JP58125152A JP12515283A JPS6017361A JP S6017361 A JPS6017361 A JP S6017361A JP 58125152 A JP58125152 A JP 58125152A JP 12515283 A JP12515283 A JP 12515283A JP S6017361 A JPS6017361 A JP S6017361A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、血液のインターフェロン産生能を測定する方
法に関する。
法に関する。
近年、採血した血液中に存在する酵素またはその代謝産
物などを測定する臨床化学的検査方法が広く行々われる
ようになってきた。
物などを測定する臨床化学的検査方法が広く行々われる
ようになってきた。
血液中の一成分であるインターフェロンも、その抗ウイ
ルス性、抗腫瘍性々どから検査項目に加えることが考え
られている。しかし々から、実際には、血液中に含まれ
ているインターフェロンが微量であることなどから今だ
実現17ていない。
ルス性、抗腫瘍性々どから検査項目に加えることが考え
られている。しかし々から、実際には、血液中に含まれ
ているインターフェロンが微量であることなどから今だ
実現17ていない。
そこで、本発明者は、採血した血液に含まれるインター
フェロンを直接測定するのでは々く、採血した血液のイ
ンターフェロン産生能を測定することに着目し鋭意研究
した。
フェロンを直接測定するのでは々く、採血した血液のイ
ンターフェロン産生能を測定することに着目し鋭意研究
した。
血液は、赤血球、白血球、血小板などの有形成分が液体
成分である血漿中に浮遊液を形成l〜でいるものであり
、血液1−中には、通常、赤血球が男性の場合5.4X
10個、女性の場合4.8 X 10個、白血球が成人
の場合7,400個、血小板が300,000個含まれ
ている。
成分である血漿中に浮遊液を形成l〜でいるものであり
、血液1−中には、通常、赤血球が男性の場合5.4X
10個、女性の場合4.8 X 10個、白血球が成人
の場合7,400個、血小板が300,000個含まれ
ている。
インターフェロンは白血球により産生されることが知ら
れて、いる。
れて、いる。
従来、ヒト血液からインターフェロンを産生ずるには、
血液から分離した白血球を用いている。
血液から分離した白血球を用いている。
例えば、Hans 5trander and Kar
i Cantell、 Ann。
i Cantell、 Ann。
Med、exp、Penn (1,966) 、 Vo
l、 44 、265〜273頁、特開昭49−61.
11号公報、特開昭53−94.008号公報などの記
載からも明らかなように、血液から他の成分を除去し、
白血球を採取して、この白血球からインターフェロンを
産生させている。
l、 44 、265〜273頁、特開昭49−61.
11号公報、特開昭53−94.008号公報などの記
載からも明らかなように、血液から他の成分を除去し、
白血球を採取して、この白血球からインターフェロンを
産生させている。
しかしながら、これらの方法を詳細に検討したところ、
血液からの白血球の回収率が30〜50%程度と低いば
かυでなく、その分離操作によシ白血球がダメージを受
け、その生残率を40〜60%に゛低下させ、結果とし
て、血液からの白血球の有効回収率が約10〜30%に
も低下し、更には、採取した白血球からのインターフェ
ロン産生量が一定しないなどの理由により、血液からの
インターフェロン産生能を推定することはきわめて困難
であることが判明した。
血液からの白血球の回収率が30〜50%程度と低いば
かυでなく、その分離操作によシ白血球がダメージを受
け、その生残率を40〜60%に゛低下させ、結果とし
て、血液からの白血球の有効回収率が約10〜30%に
も低下し、更には、採取した白血球からのインターフェ
ロン産生量が一定しないなどの理由により、血液からの
インターフェロン産生能を推定することはきわめて困難
であることが判明した。
本発明者は、採血した血液を用いてインターフェロン産
生能を測定すべく研究を続けたところ、全面を抗凝血剤
及びウィルスと接触せしめ、容器中でインキュベートし
、生成したインターフェロンを測定することによシ、そ
の血液のインターフェロン産生能がきわめて容易に安定
して測定できることを見いだし、本発明を完成した。
生能を測定すべく研究を続けたところ、全面を抗凝血剤
及びウィルスと接触せしめ、容器中でインキュベートし
、生成したインターフェロンを測定することによシ、そ
の血液のインターフェロン産生能がきわめて容易に安定
して測定できることを見いだし、本発明を完成した。
更に、詳細に検討を加えたところ、ウィルスを全血me
当り赤血球凝集価20〜200.0001−(、Aの範
囲、まだはこれに相当する量の不活化ウィルスを接触せ
しめるのが好適であることが判明した。
当り赤血球凝集価20〜200.0001−(、Aの範
囲、まだはこれに相当する量の不活化ウィルスを接触せ
しめるのが好適であることが判明した。
本発明で、全血とは、採血した血液、またはその血液か
ら液体成分の血漿を除去して得られる全有形成分を他の
液体、例えば生理食塩水、緩衝液、栄養培地々どに浮遊
させた液をいう。
ら液体成分の血漿を除去して得られる全有形成分を他の
液体、例えば生理食塩水、緩衝液、栄養培地々どに浮遊
させた液をいう。
抗凝血剤としては、全血の凝固を防止でき、かつインタ
ーフェロンの産生、測定に悪影響のないものであればよ
く、例えば、ヘハリン、A、CD。
ーフェロンの産生、測定に悪影響のないものであればよ
く、例えば、ヘハリン、A、CD。
CPDなどが適宜使用される。
また、本発明に使用されるウィルスは、全血からインタ
ーフェロンを誘導産生しうる、例えば、センダイウィル
ス、ニューカッスル病ウィルスなどのウィルス、丑たけ
それらの不活化ウィルスなどが適宜使用される。不活化
ウィルスとは、例えば。紫外線照射、熱処理、PH処理
カどにより増殖能を一部または全部を失なわせたウィル
スをいう。
ーフェロンを誘導産生しうる、例えば、センダイウィル
ス、ニューカッスル病ウィルスなどのウィルス、丑たけ
それらの不活化ウィルスなどが適宜使用される。不活化
ウィルスとは、例えば。紫外線照射、熱処理、PH処理
カどにより増殖能を一部または全部を失なわせたウィル
スをいう。
使用量としては、全血ml当り赤血球凝集価20〜20
0.000 HAの範囲、まだはこれに和尚する不活化
ウィルスが使用される。
0.000 HAの範囲、まだはこれに和尚する不活化
ウィルスが使用される。
全血を抗凝血剤及びウィルスと接触せしめ、容器中でイ
ンキュベートするときは、全面に抗凝血剤及びウィルス
を接触せしめて容器中でインターフェロンの産生ができ
ればよく、その操作手順としては、例えば、予じめ所定
の抗凝血剤及びウィルスを入れた容器中に適量の全血を
加えてインキュベートしてもよく、また、抗凝血剤と全
血との混合液を容器に入れ、これにウィルスを加えてイ
ンキ−ベートしてもよい。また、必要ならば、インキ−
ベートに際して、全血、抗凝血剤、ウィルスとともに例
えば、生理食塩水、等張緩前液、栄養培地などを共存せ
しめてもよい。
ンキュベートするときは、全面に抗凝血剤及びウィルス
を接触せしめて容器中でインターフェロンの産生ができ
ればよく、その操作手順としては、例えば、予じめ所定
の抗凝血剤及びウィルスを入れた容器中に適量の全血を
加えてインキュベートしてもよく、また、抗凝血剤と全
血との混合液を容器に入れ、これにウィルスを加えてイ
ンキ−ベートしてもよい。また、必要ならば、インキ−
ベートに際して、全血、抗凝血剤、ウィルスとともに例
えば、生理食塩水、等張緩前液、栄養培地などを共存せ
しめてもよい。
使用される容器としては、その形状、容量の大小を問わ
ず、フラスコ、試験管、アンプル、マイクロプレートウ
ェルなど適宜選択できる。
ず、フラスコ、試験管、アンプル、マイクロプレートウ
ェルなど適宜選択できる。
インキュベート条件としては、インターフェロンが産生
できる条件であればよく、例えば30〜40℃に5〜5
0時間程度保てばよい。
できる条件であればよく、例えば30〜40℃に5〜5
0時間程度保てばよい。
このようにしてインキュベートしインターフェロンを産
生じた全血は、その壕まで、または必要により生理食塩
水、等張の緩衝液々とで適宜希釈した後、遠心分離また
は沢過などの分離操作によυ血球などの有形成分を除去
しだ上清または沢液がインターフェロンの測定に供され
る。
生じた全血は、その壕まで、または必要により生理食塩
水、等張の緩衝液々とで適宜希釈した後、遠心分離また
は沢過などの分離操作によυ血球などの有形成分を除去
しだ上清または沢液がインターフェロンの測定に供され
る。
インターフェロンの測定方法は、用いだ全血からのイン
ターフェロン産生量が測定できる方法であればよく、例
えば、バイオ アッセイ法(Bi。
ターフェロン産生量が測定できる方法であればよく、例
えば、バイオ アッセイ法(Bi。
As5ay )、放射免疫測定法(Radio Imm
uno As5ay)、酵素免疫測定法(Enzyme
Linked Irrynt+no 5orbent
Assay)などの方法が適宜採用できる。
uno As5ay)、酵素免疫測定法(Enzyme
Linked Irrynt+no 5orbent
Assay)などの方法が適宜採用できる。
近年、測定が簡便であり、迅速であり、安全性の高い測
定法として酵素免疫測定法が開発されている。酵素免疫
測定法の場合には、インターフェロンが抗原として測定
できる方法であればよく、例えば、二抗体サンドイツチ
法、変法二抗体サンドイツチ法などが適宜選択できる。
定法として酵素免疫測定法が開発されている。酵素免疫
測定法の場合には、インターフェロンが抗原として測定
できる方法であればよく、例えば、二抗体サンドイツチ
法、変法二抗体サンドイツチ法などが適宜選択できる。
このようにして測定されるインターフェロン産生能は、
採血した個人の臨床化学検査に充分応用できることが判
明した。
採血した個人の臨床化学検査に充分応用できることが判
明した。
また、本発明の方法によって、癌患者から採血した血液
のインターフェロン産生能が、健常者のそれと比較して
きわめて低いことも判明した。
のインターフェロン産生能が、健常者のそれと比較して
きわめて低いことも判明した。
以下、実験で本発明を説明する。
実験] インターフェロン産生能に及ぼす血液の処理の
有無の影響 インターフェロン産生能に及ぼす血液の処理の有無の影
響を調べた。使用した血液は、健常者3名から採血した
ヘパリン加新鮮血を用いた。
有無の影響 インターフェロン産生能に及ぼす血液の処理の有無の影
響を調べた。使用した血液は、健常者3名から採血した
ヘパリン加新鮮血を用いた。
処理血液としては、血液を遠心分離し液体成分血漿を除
去して得られる全有形成分をRPMI 1640培地で
血液と同濃度に浮遊させだ血漿除去浮遊液、及び血液を
常法に従って075%塩化アンモニウム含有トリス塩酸
緩衝液(PH7,2)で処理し、赤血球を溶血させ、遠
心分離して採取される赤血球を除去した有形成分を几P
MT 1640培地で血液と同濃度に浮遊させた塩化ア
ンモニウム処理液を用いた。
去して得られる全有形成分をRPMI 1640培地で
血液と同濃度に浮遊させだ血漿除去浮遊液、及び血液を
常法に従って075%塩化アンモニウム含有トリス塩酸
緩衝液(PH7,2)で処理し、赤血球を溶血させ、遠
心分離して採取される赤血球を除去した有形成分を几P
MT 1640培地で血液と同濃度に浮遊させた塩化ア
ンモニウム処理液を用いた。
血液または処理血液1 mlをプラスチック製試験管に
とり、これにセンダイウィルスを01100.1,00
0赤血球凝集価(HA)を含む生理食塩水0.1 me
ずつを加え、37℃で16時間インキ−ベートした。次
いで、このインキュベート液に紫外線照射してセンダイ
ウィルスを完全に不活化させた後、遠心分離して得られ
る上清を用いて、血液1.me”4りのインターフェロ
ン活性を測定し、血液のインターフェロン産生能とした
。
とり、これにセンダイウィルスを01100.1,00
0赤血球凝集価(HA)を含む生理食塩水0.1 me
ずつを加え、37℃で16時間インキ−ベートした。次
いで、このインキュベート液に紫外線照射してセンダイ
ウィルスを完全に不活化させた後、遠心分離して得られ
る上清を用いて、血液1.me”4りのインターフェロ
ン活性を測定し、血液のインターフェロン産生能とした
。
インターフェロンの活性は、Anne L、 R,Pi
dot 。
dot 。
Applied Microbiology 、 Vo
l、 22Na 4 、671〜677頁に報告されて
いる色素取込みによるバイオ アッセイ法で測定した。
l、 22Na 4 、671〜677頁に報告されて
いる色素取込みによるバイオ アッセイ法で測定した。
赤血球凝集価(HA)は、J。
E、 5alk 、 Journal of Irrr
nunology 、 Vol、 49 、87頁(1
94,4)の方法に準じて測定した。
nunology 、 Vol、 49 、87頁(1
94,4)の方法に準じて測定した。
結果は、第1表に示す。
第 j 表
第1表の結果から明らか々ように、血液または血液中の
全有形成分を含んだ血漿除去浮遊液の場合がインターフ
ェロン産生能が高く、その値が安定していることよシ、
インターフェロン産生能測定用試料として好適である。
全有形成分を含んだ血漿除去浮遊液の場合がインターフ
ェロン産生能が高く、その値が安定していることよシ、
インターフェロン産生能測定用試料として好適である。
赤血球を溶血除去した塩化アンモニウム処理浮遊液の場
合には、インターフェロン産生能が低く、その値も一定
しないととが判明した。
合には、インターフェロン産生能が低く、その値も一定
しないととが判明した。
実験2 インターフェロン産生能に及ぼすウィルス量の
影響 インターフェロン産生能に及ぼすウィルスlの影響を調
べた。使用した血液は、健常者3名、癌患者2名から採
取したヘパリン加新鮮血を用いた。
影響 インターフェロン産生能に及ぼすウィルスlの影響を調
べた。使用した血液は、健常者3名、癌患者2名から採
取したヘパリン加新鮮血を用いた。
実験1の方法に従って、血tL1 mlを試験管にとり
、これにセンダイウィルスを0.2.2o12oo12
.000.20,000.200,000 HAを含む
生理食塩水0]罰ずつを加え、インキュベートした後、
血液1 me当りのインターフェロン活性を測定し、血
液のインターフェロン産生能としだ。
、これにセンダイウィルスを0.2.2o12oo12
.000.20,000.200,000 HAを含む
生理食塩水0]罰ずつを加え、インキュベートした後、
血液1 me当りのインターフェロン活性を測定し、血
液のインターフェロン産生能としだ。
なお、血液1ml当りセンダイライ71z ス2,00
0,00014A添加の実験をしようとしたが、これを
満足するだけの高力画ウィルス剤が調製できず、実験不
可能であった。
0,00014A添加の実験をしようとしたが、これを
満足するだけの高力画ウィルス剤が調製できず、実験不
可能であった。
結果は第2表に示す。
第 2 表
第2表の結果から明らかなように、ウィルス量は血液m
l当!120〜200,000 HAが好適である。
l当!120〜200,000 HAが好適である。
なお、癌患者から採血した血液のインターフェロン産生
能は、健常者のそれと比較してきわめて低いことが判明
した。このことは、採血した血液のインターフェロン産
生能を測定することによシ、癌の早期発見に使用しうる
ものである。
能は、健常者のそれと比較してきわめて低いことが判明
した。このことは、採血した血液のインターフェロン産
生能を測定することによシ、癌の早期発見に使用しうる
ものである。
以下、2〜3の実施例を述べる。
実施例 1゜
健常者(男、28才)から採血したヘパリン加新鮮血1
. mlをプラスチック製試験管にとり、これにセンダ
イウィルス1..000 HAを加え、37℃で20時
間インキュベートし、次いでセンダイウィルスを紫外線
照射して完全不活化させ、遠心分離して得られる上清中
のインターフェロン活性をバイオ アッセイ法で測定し
た。
. mlをプラスチック製試験管にとり、これにセンダ
イウィルス1..000 HAを加え、37℃で20時
間インキュベートし、次いでセンダイウィルスを紫外線
照射して完全不活化させ、遠心分離して得られる上清中
のインターフェロン活性をバイオ アッセイ法で測定し
た。
血液1 ml当りのインターフェロン産生能は、約3.
600単位であった。
600単位であった。
実施例 2
健常者(女、33才)から採血したヘパリン加新鮮血]
、 mlに、ニューカッスル病ウィルス2,0OOf(
Aの約90%不活化ウィルスを加え、37℃で15時間
インキユベートシ、次いで、実施例1と同様にしてイン
タ−フェロン産生能を測定した。産生能は血液ml当り
約2,800単位であった。
、 mlに、ニューカッスル病ウィルス2,0OOf(
Aの約90%不活化ウィルスを加え、37℃で15時間
インキユベートシ、次いで、実施例1と同様にしてイン
タ−フェロン産生能を測定した。産生能は血液ml当り
約2,800単位であった。
実施例 3
健常者(男、61才)から採血したヘパリン加新鮮血を
遠心分離して血漿を除去し、得られる全有形成分を生理
食塩水にて遠心洗浄し、次いで、この全有形成分を血液
と同濃度になるようにR,PMI 1640培地にて浮
遊液としだ。
遠心分離して血漿を除去し、得られる全有形成分を生理
食塩水にて遠心洗浄し、次いで、この全有形成分を血液
と同濃度になるようにR,PMI 1640培地にて浮
遊液としだ。
この浮遊液1 mlをプラスチック製試験管にとり、こ
れにセンダイウィルス100OHAを加え、37℃で1
6時間インキ−ベートし、との標品中のインターフェロ
ン活性を二抗体サンドイツチ法による酵素免疫測定法で
測定した。
れにセンダイウィルス100OHAを加え、37℃で1
6時間インキ−ベートし、との標品中のインターフェロ
ン活性を二抗体サンドイツチ法による酵素免疫測定法で
測定した。
血fft ]、 me当“りのインターフェロン産生能
は、約3.400単位であった。なお、酵素免疫測定法
による測定値は、バイオ アッセイ法のそれとよく一致
した。
は、約3.400単位であった。なお、酵素免疫測定法
による測定値は、バイオ アッセイ法のそれとよく一致
した。
実施例 4゜
癌患者(男、68才)から採血したヘパリン加新鮮血を
用いて、実施例1と同様に処理してインターフェロン産
生能を測定したところ、約140単位であった。
用いて、実施例1と同様に処理してインターフェロン産
生能を測定したところ、約140単位であった。
実施例 5 ゛
癌患者(女、55才)から採血したヘパリン加新鮮血を
用いて、実施例1と同様に処理してインターフェロン産
生能を測定したところ、約70単位であった。
用いて、実施例1と同様に処理してインターフェロン産
生能を測定したところ、約70単位であった。
特許出願人
株式会社林原生物化学研究所
手続補正書
昭和59年8月17日
特許庁長官 志 賀 学 殿
1、事件の表示
昭和58年特許願第125152号
2、発明の名称
血液のインターフェロン産生能測定方法3、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 4、補正の対象 明細書における[発明の詳細な説明Jの項5、補正の内
容 (1)明細書第5頁第1行記載の[赤血球凝集価−1を
「赤血球凝集価」に補正し寸す。
者 事件との関係 特許出願人 4、補正の対象 明細書における[発明の詳細な説明Jの項5、補正の内
容 (1)明細書第5頁第1行記載の[赤血球凝集価−1を
「赤血球凝集価」に補正し寸す。
(2)明細書第6頁第10〜13行記載の[バイオ ア
ッセイ法・・・・・・・・などの方法が適宜採用できる
。]を[バイオアッセイ法(B 1oassay )、
放射免疫測定法(Radioimmunoassay
)、酵素免疫測定法(Enzyme−,1inkeCl
immqnosorbent assay)などの方
法が適宜採用できる。」に補正します。
ッセイ法・・・・・・・・などの方法が適宜採用できる
。]を[バイオアッセイ法(B 1oassay )、
放射免疫測定法(Radioimmunoassay
)、酵素免疫測定法(Enzyme−,1inkeCl
immqnosorbent assay)などの方
法が適宜採用できる。」に補正します。
(3) 明細書第8頁第10〜11行記載の「671〜
677頁」を[67]〜677頁(197]、 ) J
に補正します。
677頁」を[67]〜677頁(197]、 ) J
に補正します。
(4)同頁第12〜14行記載の「J、 E、 5al
k、 Journalof Immunology、
Vol、 49.87頁(1’944)Jを「J、 E
、 5alk、 The Journal of Im
munology。
k、 Journalof Immunology、
Vol、 49.87頁(1’944)Jを「J、 E
、 5alk、 The Journal of Im
munology。
Vol、 49. 87〜98頁(194,4) Jに
補正し捷す。
補正し捷す。
421
Claims (2)
- (1)全血を抗凝血剤及びウィルスと接触せしめ、容器
中でインキュベートし、生成したインターフェロンを測
定することを特徴とする血液のインターフェロン産生能
測定方法。 - (2) ウィルスが全面me当り赤血球凝集価20〜2
00,000I−I Aの範囲、またはこれに相当する
量の不活化ウィルスであることを特徴とする特許請求の
範に 囲第(1)楢己載する血液のインターフェロン産生能測
定方法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58125152A JPS6017361A (ja) | 1983-07-08 | 1983-07-08 | 血液のインタ−フエロン産生能測定方法 |
US06/624,752 US4745053A (en) | 1983-07-08 | 1984-06-26 | Process for producing human interferon and method for assaying the interferon productivity of blood |
KR1019840003855A KR920003167B1 (ko) | 1983-07-08 | 1984-07-04 | 인간 인터페론 생산방법 및 혈액의 인터페론 생산능력 측정방법 |
DE19843424640 DE3424640A1 (de) | 1983-07-08 | 1984-07-04 | Verfahren zur gewinnung und/oder bestimmung von humanspezifischem interferon im blut |
GB08417350A GB2146027B (en) | 1983-07-08 | 1984-07-06 | Process for producing human interferon and method for assaying the interferon productivity of blood |
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