JPS6017361A - 血液のインタ−フエロン産生能測定方法 - Google Patents

血液のインタ−フエロン産生能測定方法

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JPS6017361A
JPS6017361A JP58125152A JP12515283A JPS6017361A JP S6017361 A JPS6017361 A JP S6017361A JP 58125152 A JP58125152 A JP 58125152A JP 12515283 A JP12515283 A JP 12515283A JP S6017361 A JPS6017361 A JP S6017361A
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Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液のインターフェロン産生能を測定する方
法に関する。
近年、採血した血液中に存在する酵素またはその代謝産
物などを測定する臨床化学的検査方法が広く行々われる
ようになってきた。
血液中の一成分であるインターフェロンも、その抗ウイ
ルス性、抗腫瘍性々どから検査項目に加えることが考え
られている。しかし々から、実際には、血液中に含まれ
ているインターフェロンが微量であることなどから今だ
実現17ていない。
そこで、本発明者は、採血した血液に含まれるインター
フェロンを直接測定するのでは々く、採血した血液のイ
ンターフェロン産生能を測定することに着目し鋭意研究
した。
血液は、赤血球、白血球、血小板などの有形成分が液体
成分である血漿中に浮遊液を形成l〜でいるものであり
、血液1−中には、通常、赤血球が男性の場合5.4X
10個、女性の場合4.8 X 10個、白血球が成人
の場合7,400個、血小板が300,000個含まれ
ている。
インターフェロンは白血球により産生されることが知ら
れて、いる。
従来、ヒト血液からインターフェロンを産生ずるには、
血液から分離した白血球を用いている。
例えば、Hans 5trander and Kar
i Cantell、 Ann。
Med、exp、Penn (1,966) 、 Vo
l、 44 、265〜273頁、特開昭49−61.
11号公報、特開昭53−94.008号公報などの記
載からも明らかなように、血液から他の成分を除去し、
白血球を採取して、この白血球からインターフェロンを
産生させている。
しかしながら、これらの方法を詳細に検討したところ、
血液からの白血球の回収率が30〜50%程度と低いば
かυでなく、その分離操作によシ白血球がダメージを受
け、その生残率を40〜60%に゛低下させ、結果とし
て、血液からの白血球の有効回収率が約10〜30%に
も低下し、更には、採取した白血球からのインターフェ
ロン産生量が一定しないなどの理由により、血液からの
インターフェロン産生能を推定することはきわめて困難
であることが判明した。
本発明者は、採血した血液を用いてインターフェロン産
生能を測定すべく研究を続けたところ、全面を抗凝血剤
及びウィルスと接触せしめ、容器中でインキュベートし
、生成したインターフェロンを測定することによシ、そ
の血液のインターフェロン産生能がきわめて容易に安定
して測定できることを見いだし、本発明を完成した。
更に、詳細に検討を加えたところ、ウィルスを全血me
当り赤血球凝集価20〜200.0001−(、Aの範
囲、まだはこれに相当する量の不活化ウィルスを接触せ
しめるのが好適であることが判明した。
本発明で、全血とは、採血した血液、またはその血液か
ら液体成分の血漿を除去して得られる全有形成分を他の
液体、例えば生理食塩水、緩衝液、栄養培地々どに浮遊
させた液をいう。
抗凝血剤としては、全血の凝固を防止でき、かつインタ
ーフェロンの産生、測定に悪影響のないものであればよ
く、例えば、ヘハリン、A、CD。
CPDなどが適宜使用される。
また、本発明に使用されるウィルスは、全血からインタ
ーフェロンを誘導産生しうる、例えば、センダイウィル
ス、ニューカッスル病ウィルスなどのウィルス、丑たけ
それらの不活化ウィルスなどが適宜使用される。不活化
ウィルスとは、例えば。紫外線照射、熱処理、PH処理
カどにより増殖能を一部または全部を失なわせたウィル
スをいう。
使用量としては、全血ml当り赤血球凝集価20〜20
0.000 HAの範囲、まだはこれに和尚する不活化
ウィルスが使用される。
全血を抗凝血剤及びウィルスと接触せしめ、容器中でイ
ンキュベートするときは、全面に抗凝血剤及びウィルス
を接触せしめて容器中でインターフェロンの産生ができ
ればよく、その操作手順としては、例えば、予じめ所定
の抗凝血剤及びウィルスを入れた容器中に適量の全血を
加えてインキュベートしてもよく、また、抗凝血剤と全
血との混合液を容器に入れ、これにウィルスを加えてイ
ンキ−ベートしてもよい。また、必要ならば、インキ−
ベートに際して、全血、抗凝血剤、ウィルスとともに例
えば、生理食塩水、等張緩前液、栄養培地などを共存せ
しめてもよい。
使用される容器としては、その形状、容量の大小を問わ
ず、フラスコ、試験管、アンプル、マイクロプレートウ
ェルなど適宜選択できる。
インキュベート条件としては、インターフェロンが産生
できる条件であればよく、例えば30〜40℃に5〜5
0時間程度保てばよい。
このようにしてインキュベートしインターフェロンを産
生じた全血は、その壕まで、または必要により生理食塩
水、等張の緩衝液々とで適宜希釈した後、遠心分離また
は沢過などの分離操作によυ血球などの有形成分を除去
しだ上清または沢液がインターフェロンの測定に供され
る。
インターフェロンの測定方法は、用いだ全血からのイン
ターフェロン産生量が測定できる方法であればよく、例
えば、バイオ アッセイ法(Bi。
As5ay )、放射免疫測定法(Radio Imm
uno As5ay)、酵素免疫測定法(Enzyme
 Linked Irrynt+no 5orbent
Assay)などの方法が適宜採用できる。
近年、測定が簡便であり、迅速であり、安全性の高い測
定法として酵素免疫測定法が開発されている。酵素免疫
測定法の場合には、インターフェロンが抗原として測定
できる方法であればよく、例えば、二抗体サンドイツチ
法、変法二抗体サンドイツチ法などが適宜選択できる。
このようにして測定されるインターフェロン産生能は、
採血した個人の臨床化学検査に充分応用できることが判
明した。
また、本発明の方法によって、癌患者から採血した血液
のインターフェロン産生能が、健常者のそれと比較して
きわめて低いことも判明した。
以下、実験で本発明を説明する。
実験] インターフェロン産生能に及ぼす血液の処理の
有無の影響 インターフェロン産生能に及ぼす血液の処理の有無の影
響を調べた。使用した血液は、健常者3名から採血した
ヘパリン加新鮮血を用いた。
処理血液としては、血液を遠心分離し液体成分血漿を除
去して得られる全有形成分をRPMI 1640培地で
血液と同濃度に浮遊させだ血漿除去浮遊液、及び血液を
常法に従って075%塩化アンモニウム含有トリス塩酸
緩衝液(PH7,2)で処理し、赤血球を溶血させ、遠
心分離して採取される赤血球を除去した有形成分を几P
MT 1640培地で血液と同濃度に浮遊させた塩化ア
ンモニウム処理液を用いた。
血液または処理血液1 mlをプラスチック製試験管に
とり、これにセンダイウィルスを01100.1,00
0赤血球凝集価(HA)を含む生理食塩水0.1 me
ずつを加え、37℃で16時間インキ−ベートした。次
いで、このインキュベート液に紫外線照射してセンダイ
ウィルスを完全に不活化させた後、遠心分離して得られ
る上清を用いて、血液1.me”4りのインターフェロ
ン活性を測定し、血液のインターフェロン産生能とした
インターフェロンの活性は、Anne L、 R,Pi
dot 。
Applied Microbiology 、 Vo
l、 22Na 4 、671〜677頁に報告されて
いる色素取込みによるバイオ アッセイ法で測定した。
赤血球凝集価(HA)は、J。
E、 5alk 、 Journal of Irrr
nunology 、 Vol、 49 、87頁(1
94,4)の方法に準じて測定した。
結果は、第1表に示す。
第 j 表 第1表の結果から明らか々ように、血液または血液中の
全有形成分を含んだ血漿除去浮遊液の場合がインターフ
ェロン産生能が高く、その値が安定していることよシ、
インターフェロン産生能測定用試料として好適である。
赤血球を溶血除去した塩化アンモニウム処理浮遊液の場
合には、インターフェロン産生能が低く、その値も一定
しないととが判明した。
実験2 インターフェロン産生能に及ぼすウィルス量の
影響 インターフェロン産生能に及ぼすウィルスlの影響を調
べた。使用した血液は、健常者3名、癌患者2名から採
取したヘパリン加新鮮血を用いた。
実験1の方法に従って、血tL1 mlを試験管にとり
、これにセンダイウィルスを0.2.2o12oo12
.000.20,000.200,000 HAを含む
生理食塩水0]罰ずつを加え、インキュベートした後、
血液1 me当りのインターフェロン活性を測定し、血
液のインターフェロン産生能としだ。
なお、血液1ml当りセンダイライ71z ス2,00
0,00014A添加の実験をしようとしたが、これを
満足するだけの高力画ウィルス剤が調製できず、実験不
可能であった。
結果は第2表に示す。
第 2 表 第2表の結果から明らかなように、ウィルス量は血液m
l当!120〜200,000 HAが好適である。
なお、癌患者から採血した血液のインターフェロン産生
能は、健常者のそれと比較してきわめて低いことが判明
した。このことは、採血した血液のインターフェロン産
生能を測定することによシ、癌の早期発見に使用しうる
ものである。
以下、2〜3の実施例を述べる。
実施例 1゜ 健常者(男、28才)から採血したヘパリン加新鮮血1
. mlをプラスチック製試験管にとり、これにセンダ
イウィルス1..000 HAを加え、37℃で20時
間インキュベートし、次いでセンダイウィルスを紫外線
照射して完全不活化させ、遠心分離して得られる上清中
のインターフェロン活性をバイオ アッセイ法で測定し
た。
血液1 ml当りのインターフェロン産生能は、約3.
600単位であった。
実施例 2 健常者(女、33才)から採血したヘパリン加新鮮血]
、 mlに、ニューカッスル病ウィルス2,0OOf(
Aの約90%不活化ウィルスを加え、37℃で15時間
インキユベートシ、次いで、実施例1と同様にしてイン
タ−フェロン産生能を測定した。産生能は血液ml当り
約2,800単位であった。
実施例 3 健常者(男、61才)から採血したヘパリン加新鮮血を
遠心分離して血漿を除去し、得られる全有形成分を生理
食塩水にて遠心洗浄し、次いで、この全有形成分を血液
と同濃度になるようにR,PMI 1640培地にて浮
遊液としだ。
この浮遊液1 mlをプラスチック製試験管にとり、こ
れにセンダイウィルス100OHAを加え、37℃で1
6時間インキ−ベートし、との標品中のインターフェロ
ン活性を二抗体サンドイツチ法による酵素免疫測定法で
測定した。
血fft ]、 me当“りのインターフェロン産生能
は、約3.400単位であった。なお、酵素免疫測定法
による測定値は、バイオ アッセイ法のそれとよく一致
した。
実施例 4゜ 癌患者(男、68才)から採血したヘパリン加新鮮血を
用いて、実施例1と同様に処理してインターフェロン産
生能を測定したところ、約140単位であった。
実施例 5 ゛ 癌患者(女、55才)から採血したヘパリン加新鮮血を
用いて、実施例1と同様に処理してインターフェロン産
生能を測定したところ、約70単位であった。
特許出願人 株式会社林原生物化学研究所 手続補正書 昭和59年8月17日 特許庁長官 志 賀 学 殿 1、事件の表示 昭和58年特許願第125152号 2、発明の名称 血液のインターフェロン産生能測定方法3、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 4、補正の対象 明細書における[発明の詳細な説明Jの項5、補正の内
容 (1)明細書第5頁第1行記載の[赤血球凝集価−1を
「赤血球凝集価」に補正し寸す。
(2)明細書第6頁第10〜13行記載の[バイオ ア
ッセイ法・・・・・・・・などの方法が適宜採用できる
。]を[バイオアッセイ法(B 1oassay )、
放射免疫測定法(Radioimmunoassay 
)、酵素免疫測定法(Enzyme−,1inkeCl
 immqnosorbent assay)などの方
法が適宜採用できる。」に補正します。
(3) 明細書第8頁第10〜11行記載の「671〜
677頁」を[67]〜677頁(197]、 ) J
に補正します。
(4)同頁第12〜14行記載の「J、 E、 5al
k、 Journalof Immunology、 
Vol、 49.87頁(1’944)Jを「J、 E
、 5alk、 The Journal of Im
munology。
Vol、 49. 87〜98頁(194,4) Jに
補正し捷す。
421

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)全血を抗凝血剤及びウィルスと接触せしめ、容器
    中でインキュベートし、生成したインターフェロンを測
    定することを特徴とする血液のインターフェロン産生能
    測定方法。
  2. (2) ウィルスが全面me当り赤血球凝集価20〜2
    00,000I−I Aの範囲、またはこれに相当する
    量の不活化ウィルスであることを特徴とする特許請求の
    範に 囲第(1)楢己載する血液のインターフェロン産生能測
    定方法。
JP58125152A 1983-07-08 1983-07-08 血液のインタ−フエロン産生能測定方法 Granted JPS6017361A (ja)

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JP58125152A JPS6017361A (ja) 1983-07-08 1983-07-08 血液のインタ−フエロン産生能測定方法
US06/624,752 US4745053A (en) 1983-07-08 1984-06-26 Process for producing human interferon and method for assaying the interferon productivity of blood
KR1019840003855A KR920003167B1 (ko) 1983-07-08 1984-07-04 인간 인터페론 생산방법 및 혈액의 인터페론 생산능력 측정방법
DE19843424640 DE3424640A1 (de) 1983-07-08 1984-07-04 Verfahren zur gewinnung und/oder bestimmung von humanspezifischem interferon im blut
GB08417350A GB2146027B (en) 1983-07-08 1984-07-06 Process for producing human interferon and method for assaying the interferon productivity of blood
FR8410752A FR2548538B1 (fr) 1983-07-08 1984-07-06 Production d'interferon humain et procede pour le dosage de l'aptitude du sang a produire de l'interferon

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