DE2533183C3

DE2533183C3 - Verfahren zum Herstellen gereinigter Immunglobuline

Info

Publication number: DE2533183C3
Application number: DE19752533183
Authority: DE
Inventors: Joseph Prof. Leuven Heremans; Lucien Dr.Med. Bruessel Masson
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1974-07-25
Filing date: 1975-07-24
Publication date: 1980-03-20
Also published as: DE2533183B2; FR2279419A1; DE2533183A1; FR2279419B1; BE831697A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen gereinigter Immunglobuline (IG), die aus Human-Serum- oder Placentaextrakt isoliert wrden. Sie betrifft gleichfalls die Verwendung der nachdem Verfahren erhaltenen Immunglobulinpräparate zur intravenösen Applikation bei der Bekämpfung von durch Viren oder Bakterien ausgelösten Krankheiten. Es sind bereits Verfahren zur Herstellung und Reinigung menschlicher oder tierischer Immunglobuline durch Fraktionierungen bekannt, wobei die Immunglobuline jedoch Aggregate bilden, die besondere biologische Eigenschaften annehmen und insbesondere das Komplement aktivieren. Diese Eigenschaft der Aggregate wird als »antikomplematäre Aktivität« bezeichnet.

Das Vorliegen von Aggregaten in den Immunglobulinpräparaten bringt eine erhebliche Gefahr eines anaphylaktischen Schocks durch Aktivierung des Komplements bei intravenöser Verabreichung mit sich, obwohl die intravenöse Verabreichung vorteilhafter ist, da sie eine sofortige therapeutische Wirkung mit deutlich überlegener Ausnutzung gegenüber dem intramuskulären Weg hat, auf welchem nur 40% der injizierten Immunglobuline den Blutkreislauf erreichen, während der Rest zerstört wird. Selbst die intramuskuläre Injektion ist nicht gefahrlos, denn die Aggregate können örtliche schmerzhafte Reaktionen auslösen.

Es wurde daher bereits versucht, die Aggregate in ■> den Immunglobulinpräparaten durch chemische Fraktionierungen zu eliminieren, diese sind jedoch langwierig und kompliziert und führen zudem zu wesentlichen Verlusten an normalen Immunglobulinen (FR-PS 2382M). Daher wird derzeit die Behandlung

ι» der Immunglobuline durch proteolytische Enzyme bevorzugt, die aus den Immunglobulinen das Molekülfragment Fc entfernen, welches für die Aktivierung des Komplements verantwortlich ist.
Jedoch können auch die normalen, nicht aggregier- > ten Moleküle ebenfalls von der proteolytischen Wirkung erreicht werden und verlieren mit dem Verlust der Fragmente Fc auch die Möglichkeit, die Reaktionen auszuschalten, die zur Zerstörung oder Beseitigung des Antigens führen, und die so behandelten

-'· Globuline verlieren ihre Wirksamkeit.

Die Erfindung soll diese Nachteile beseitigen und ein Verfahren zum Herstellen gereinigter Immunglobuline liefern, das es ermöglicht, auf sichere und vollständige Weise die bei den Reinigungsstufen gebilde-

-'"> ten Aggregate zu eliminieren, ohne die Wirkungseigenschaften der normalen verbleibenden Globuline zu ändern oder Verluste an normalen Globulinen hervorzurufen. Ferner soll die Erfindung Immunglobulinpräparate und diese enthaltende Arzneimittel ohne

«ι inflammatorische Reaktionen und insbesonndere Reaktionen des Komplements und mit erhöhter Konzentration an normalen, unveränderten Immunglobulinen liefern.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen

π gereinigter Immunglobuline (IG), die aus Human-Serum- oder Placentaextrakt isoliert werden, durch Eliminieren ihrer Aggregate ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Aggregate mit ausreichenden Mengen von Clq-Faktor des Komplements und/oder des

ι» Rheumafaktors (FR) in löslicher oder unlöslich gemachter Form bei einer Temperatur zwischen 4 und 37° C und einem pH-Wert zwischen 6,5 und 8,5 während einer Zeit von 30 Minuten bis 24 Stunden reagieren läßt, worauf die Reaktionsprodukte aus den Im-

•i> munglobulinpräparaten abgetrennt und überschüssige Anteile an Faktoren entfernt werden.

Die die Aggregate enthaltenden Immunglobuline, die im oben angegebenen Verfahren als Ausgangsprodukt eingesetzt werden, werden ausgehend von

«n Serum oder Placentarextrakten insbesondere nach herkömmlichen Verfahren der Alkoholfraktionierung erhalten, vgl. E. J. Cohn et al, J. Am. Chem. Soc, 68, 459 bis 475 (1946) und J. L. Oncley et al, J. Am. Chem. Soc, 71, 541 bis 550 (1949) für Human-

-.-« serum und H. L. Taylor, F. C. Bloom, K. B. Mc Call, L. A. Hyndman und M. D. Anderson, J. Am. Chem. Soc, 78,1356 bis 1358 (1956) für Plazentaextrakte. Beim letzteren Verfahren wird das Filtrat einer in Salzlösung verriebenen Plazenta derart be-

hii handelt, daß eine Äthanolkonzentration vonn 25 Vol.-% erhalten wird, wonach die erhaltene Fällung gesammelt und mit 8%igem Äthanol bei einem pH von 4,8 behandelt wird. Man entfernt die verbliebene Fällung und sammelt die überstehende Flüssigkeit.

hi Durch Zugabe von Alkohol zu dieser überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Konzentration von 25 Vol.-% erhält man die Ausfällung einer an Gammaglobulinen reichen Fraktion. Die Fällung wird mit 17%igem

Äthanol bei pH von 5,1 behandelt. Man entfernt die restliche Fällung und gewinnt die überstehende Flüssigkeit. Durch Zusatz von Äthanol zur überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Konzentration von 25 Vol.-% erhält man eine Fällung von Gammaglobulinen, die als Ausgangsprodukt im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind.

Die Faktoren CIq und FR können menschlichen oder tierischen Ursprungs sein, wobei es sich versteht, daß man Faktoren anwendet, die eine Affinität zu den zu behandelnden Immunglobulinen besitzen. So kann man beispielsweise auf menschliche Immunglobuline den Faktor CIq vom Menschen, vom Kaninchen, von der Ziege oder vom Rind sowie den FR-Faktor vom Menschen oder Kaninchen anwenden. Diese verschiedenen Reagenzien können gegebenenfalls kombiniert werden.

Wie oben angegeben, wird eine genügende Menge des Faktors CIq und/oder des Faktors FR eingesetzt, d. h. eine Menge, die ausreicht, um die Aggregate vollständig zu entfernen. Diese Menge des Faktors CIq oder Fr hängt augenscheinlich vom Gehalt an Aggregaten in der zu behandelnden Immunglobulinpräparation ab. Die genügende Menge an CIq und/oder FR kann, wenn nötig, auf einfache Weise durch einen Vorversuch an einer Probe bestimmt werden.

Man geht davon aus, daß die Aggregate vollständig eliminiert sind, wenn die IG-Präparation frei ist von antikomplementärer Wirkung (bestimmt nach dem nachfolgend im Beispiel 1 angegebenen Test).

In der Praxis wird bevorzugt ein Überschuß an den Faktoren CIq oder FR eingesetzt, wobei dieser Überschuß sodann nach der Abtrennung der Aggregate beseitigt wird, wie dies nachfolgend angegeben ist.

Es ist auch möglich, die Trennung der Aggregate in mehreren Stufen durchzuführen, indem in jeder Stufe ein Unterschuß an den Faktoren CIq und/oder FR eingesetzt und die Maßnahme, so oft wiederholt wird, wie nötig ist, um eine vollständige Eliminierung der Aggregate zu erzielen, d. h. ein Verschwinden der antikomplementären Wirkung.

Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Abscheidung der Aggregate durch Zugabe der Faktoren CIq und/oder FR in löslicher Form zu der die Aggregate enthaltenden Präparation derart, daß die Abscheidung der aggregierten Immunglobuline hervorgerufen wird. Diese aggregierten Immunglobuline werden sodann bevorzugt durch Zentrifugieren entfernt.

Bevorzugt entfernt man sodann den Überschuß an CIq oder an FR in der überstehenden Flüssigkeit. Diese Entfernung kann beispielsweise durch Passage der überstehenden Flüssigkeit durch eine Kolonne mit unlöslich gemachten, gegen CIq oder FR gerichteten Antikörpern erfolgen.

Bei einer zweiten Ausführungsform eier Erfindung erfolgt die Abtrennung der Aggregate unter Einsatz der unlöslich gemachten Faktoren CIq und/oder FR, was es ermöglicht, die Faktoren in ihrer Gesamtheit leicht zu sammeln, und zudem den Vorteil bietet, keinerlei Fremdprotein in die Immunglobulinpriiparation einzuführen.

Das Unlöslichmachen der Faktoren CIq oder FR kann nach jeder üblichen Technik erfolgen, z. B. indem die Faktoren mit Hilfe eines Kupplers an Teilchen gebunden werden, z. B. an Amingruppen tragende Agarose.

Die Immunglobulinpräparation kann dann über

eine den oder die unlöslich gemachten Faktor(en) enthaltende Säule geführt oder mit einer Suspension eines oder beider Faktoren gemischt werden, wobei die Abtrennung anschließend durch Zentrifugieren oder Filtrieren erfolgt.

Zudem ist es so leichter möglich, die Faktoren CIq oder FR nach dem Eliminieren der zurückgehaltenen Aggregate wiederzugewinnen, die mit Hilfe verschiedener Lösungen mit Ionengehalt oder angemessener pH-Werte, wie z. B. mit einer 1 m-Ammoniumthiocyanatlösung abgespalten werden können.

Die Reaktionsbedingungen zwischen CIq oder FR und den zu behandelnden Immunglobulinen sind vorzugsweise folgende:

- Man arbeitet zwischen etwa 4 und 37° C; wird die Inkubation über 30 Minuten hinaus ausgedehnt, arbeitet man bevorzugt bei den tiefsten Temperaturen dieses Bereichs, z. B. bei 4° C;

- der pH-Wert des Milieus liegt zwischen etwa 6,5 und 8,5;

- die Reaktionsdauer ist mindestens 30 Minuten und beträgt im allgemeinen aus praktischen Gründen in der Größenordnung von 24 Stunden.

Die Gewinnung des Clq-Faktors kann mit allen bekannten Mitteln erfolgen. Bevorzugt gewinnt man ihn nach der Fällungstechnik der Euglobuline, beschrieben von Kuni-Yonemasu und R. M. Stroud in J. Immunol. 106, 304 bis 313 (1971). Dieses Verfahren besteht im Fällen der Euglobuline des Seerums durch Dialyse gegen einen Puffer schwacher Ionenstärke und mit einem Gehalt an Calcium-Chelatbildner (Äthylendiamintetraessigsäure).

Auch die Gewinnung des FR-Faktors kann mit derzeit bekannten Mitteln erfolgen, wie sie z. B. beschrieben sind in J. Exp. Med. 115,253 bis 273,1962. So kann der FR-Faktor beispielsweise beim Kaninchen durch intradermale Inokulation seiner eigenen, durch Wärme aggregierten und mit Freund-Adjuvans gemischten Immunglobuline induziert werden. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wird dem Tier Blut entnommen und der FR-Faktor durch Passage des Serums durch eine Kolonne mit aggregiertem und unlöslich gemachtem menschlichen IG isoliert. Die EIution des zurückgehaltenen FR-Faktors erfolgt mit zunehmenden Konzentrationen an Ammoniumthiocyanat.

Zum Erfindungsgegenstand gehört ferner die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Immunglobulinpräparationen, die sich praktisch durch einen Nullgehalt an Aggregaten und eine erhöhte Konzentration an normalen Immunglobulinen auszeichnen, zur intravenösen Applikation bei der Bekämpfung von durch Viren oder Bakterien ausgelösten Krankheiten.

Diese Arzneimittel besitzen Immunglobulin-Antikörperaktivität auch gegen auf der Wirkung bestimmter Toxine beruhenden Krankheiten, insbesondere im Falle der Kranken, die am Ausbleiben vom Immunreaktionen leiden.

Diese Arzneimittel können insbesondere zur Verhütung von Tetanus bei Personen eingesetzt werden, die gegen Serumproteine tierischen Ursprungs immunisiert sind.

Die Arzneimittel wirken in vivo durch die Wirkung (i r Antikörper, die sie enthalten. Sie weisen nicht die Gefahr eines anaphylaktischen Schocks auf und erweisen sich als für die intravenöse Injektion geeignet.

Beispiel 1

Man bereitet eine Lösung von menschlichen Gammaglobulinen zur intramuskulären Verwendung durch Alkoholfällung, ausgehend von Plazentarblut nach der Methode von H. L. Taylor, et al, wie oben erwähnt.

Man gewinnt den Clq-Faktor, isoliert aus einem Liter frischen Humanserums nach der von Kunio Yonemasu und R. M. Stroud in J. Immunol. 106,304 bis 313 (1971) beschriebenen Methode.

Der erhaltene Clq-Faktor wird in einer 0,1 m Tris (= 2 - Amino - 2 - hydroxylmethyl - 1,3J- propan diol)-Pufferlösung, 0,01m ÄDTA( = Äthylendiamintetraessigsäure), pH zwischen 8,0 und 8,5 wiederaufgenommen, dann an Amingruppen tragende Agaroseteilchen gekuppelt, z. B. an aminierte Sepharose AH, wobei der Kuppler Ghitaraldehyd ist.

Dazu wird die aminierte Sepharose AH mit Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer mit einem pH von 8,5 bei Konzentrationen zwischen 0,1 und 0,2 m gewaschen. Man nimmt 20 ml gewaschene und abgetropfte Sepharose, die man mit einer frischen, 2,5%igen Glutaraldehydlösung behandelt, in einer Menge von 1 Volumen aminierter, sedimentierter Sepharose mit einem Volumen 2,5%igen Glutaraldehyd. Man rührt 15 Minuten bei Raumtemperatur und wäscht dann mit einem großen Volumen, mindestens 10 Volumina, eines Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffers.

Der so aktivierten Sepharose in abgetropfter, lufttrockener Form setzt man die Clq-Lösung im Überschuß zu; ein ml fixiert in etwa 15 bis 25 mg Gesamtproteine.

Man rührt im Bad über wenigstens 30 Minuten bei gewöhnlicher Temperatur, trocknet über einem Büchner-Filter unter Vakuum und wäscht den Proteinüberschuß mit einer physiologischen Kochsalzlösung.

Darauf nimmt man 100 ml der zu behandelnden Immunglobulinlösung und gibt den so unlöslich gemachten Clq-Faktor in Suspension in diese 100 ml. Man rührt 30 Minuten bei gewöhnlicher Temperatur, dann trennt man die Immunglobulin-Sepharose durch Filtrieren über eine Glasfritte ab.

Das so behandelte GammaglobuHn ist frei von antikomplementärer Wirkung, wobei der Clq-Faktor an die durch Aggregation veränderten Immunglobuline komplexiert ist. Zur Prüfung der Antikomplementärwirkung setzt man bevorzugt die Technik ein, die in Public Health Monograph Nr. 74, 1965 (USA): »Standardized Diagnostic Complement Fixation Method and Adaption to Microtest« beschrieben ist, und man betrachtet ein Gammaglobulin als von Antikomplementärwirkung frei, wenn die Konzentration an Proteinen, die nötig sind, um 2 CH zu 50% zu inhibieren, gleich oder über 50 mg/ml ist.

Für den Fall, daß eine gewisse Antikomplementärwirkung noch in der Gammaglobulinlösung vorhanden ist, führt man den Vorgang mit einer neuen Menge des Clq-Faktors an Sepharose durch.

Beispiel 2

Zu 100 ml einer wie in Beispiel 1 erhaltenen 16%igen Immunglobulinlösung fügt man eine Clq-Lösung in ÄDTA-Tris-Puffer hinzu, die gemäß Beispiel 1 in einem Anteil von 300 mg Proteinen der an CIq reichen Fraktion hergestellt wurde.

Man inkubiert die Mischung 12 Stunden bei 4° C, zentrifugiert dann und filtriert über bakteriologische Filter.

So erhält man eine Immunglobulinpräparation, die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Test frei von ~ Antikomplementärwirkung und zum Einsatz bei intravenöser Anwendung beim Menschen bereit ist. Man kann jedoch noch den Überschuß an löslichem Clq-Faktor in der Lösung auf folgende Weise eliminieren:

'" Man bereitet ein Ziegenantiserum gegen den Clq-Faktor des Kaninchens. Ausgehend vom Antiserum isoliert man die Antikörper und kuppelt sie kovalent an einen festen Träger, wie z. B. Agarose. Die Immunglobulinlösung wird sodann mit den unlöslich ge-

■ "> machten Antikörpern, die den Clq-Faktor selektiv zurückhalten, in Berührung gebracht. Die Aktivität der unlöslich gemachten Antikörper kann durch Ablösen des Clq-Faktors mit Hilfe beispielsweise einer 3 m-Ammoniumthiocyanatlösung regeneriert werden.

-" Man kann die unlöslich gemachten Antikörper erneut verwenden, nachdem man sie mit einem Puffer mit physiologischem pH und physiologischer Ionenstärke erneut ins Gleichgewicht gebracht hat.

Beispiel 3

M3n setzt die gleiche Präparation menschlicher Gammaglobuline, abgetrennt aus Plazentarblut durch Alkoholfällung, wie in Beispiel 1 ein. Der Clq-Faktor wird aus Kaninchenserum nach der im J. Immunol.

106, 304 bis 313 (1971) beschriebenen Methode gewonnen.

Der Clq-Faktor wird an aminierte, durch Glutaraldehyd aktivierte Sepharose unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gekuppelt. Man wäscht den

'' an den unlöslichen Träger fixierten Clq-Faktor äußerst sorgfältig, nicht nur durch intensives Waschen mit einer physiologischen Kochsalzlösung von 9%, sondern auch mit einer Lösung, die ein chaotropes Mittel enthält, wie z. B. Ammoniumthiocyanat, das

die Spuren tierischer Proteine eliminiert, die nicht kovalent gebunden sind. Der Träger wird vor der Verwendung erneut gewaschen und mit der physiologischen Pufferlösung erneut ins Gleichgewicht gesetzt.

⁴' Man behandelt die IG-Präparation mit dem unlöslich gemachten Clq-Faktor wie in Beispiel 1. So erhält man eine Präparation menschlicher Immunglobuline, die frei ist von Antikomplementärwirkung und zudem keine Proteine tierischen Ursprungs mehr aufweist.

Beispiel 4

Die Bedingungen dieses Beispiels sind identisch mit denen des Beispiels 3, mit der Ausnahme, daß der -. Clq-Faktor aus Rinderserum an Stelle von Kaninchenserum gewonnen wird. Man erhält gleichfalls eine Präparation menschlicher Immunglobuline, die frei von Antikomplementärwirkung ist und keine Proteine tierischen Ursprungs enthält.

Beispiel 5

Man gewinnt den Rheumafaktor FR durch Induktion beim Kaninchen mittels intradermaler Inokulation seiner eigenen, durch Wärme aggregierten und h> mit Freund-Adjuvans vermischten Immunglobuline unter folgenden Bedingungen:

Man injiziert dem Kaninchen 1 mg dieser aggregierten Immunglobuline. Der FR-Faktor tritt von der

zweiten Injektion ab auf, und seine Produktion wird durch eine monatliche Injektion der aggregierten Immunglobuline aufrechterhalten.

Zwei Wochen nach der letzten Injektion wird dem Tier Blut entnommen, und der Rheumafaktor wird durch Passage des gewonnenen Serums durch eine Säule mit aggregierten und durch kovalente Kupplung an einen festen Träger, wie z. B. Agarose, unlöslich gemachten menschlichen Immunglobuünen isoliert.

Der spezifisch festgehaltene FR-Faktor wird dann mit steigenden Konzentrationen an Ammoniumthiocyanat eluiert, wobei die geringste Konzentration bei etwa 1 m liegt, die abschließende höchste Konzentration bei etwa 3 m.

Die so erhaltene Lösung des Rheumafaktors wird dann sehr langsam gegen einen physiologischen Puffer

dialysieit, um das Ammoniumthiocyanat zu eliminieren.

Man behandelt ciann 100 ml der durch Alkoholfällung ausgehend von Plazentarblut erhaltenen Immunglobulinpräparation entweder analog Beispiel 1 (wobei der FR -Faktor in unlöslicher Form vorliegt), odei analog Beispiel 2 (wobei dann der FR-Faktor in löslicher Form vorliegt).

Wird der FR-Faktor in löslicher Form eingesetzt kann der Überschuß an FR-Faktor des Kaninchen; mit Hilfe eines gegen die Immunglobuline des Kaninchens gerichteten Ziegenantiserums in der gleicher Weise eliminiert wreden, wie man den Clq-Faktor eliminiert, indem man auf ein gegen den Clq-Faktor gerichtetes Ziegenantiserum zurückgreift (siehe ober Beispiel 2).

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen gereinigter Immunglobuline (IG) die aus Human-Serum- oder Placentaextrakt isoliert werden, durch Eliminieren ihrer Aggregate, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aggregate mit ausreichenden Mengen von Clq-Faktor des Komplements und/ oder des Rheumafaktors (FR) in löslicher oder unlöslich gemachter Form bei einer Temperatur zwischen 4 und 37° C und einem pH-Wert zwischen 6,5 und 8,5 während einer Zeit von 30 Minuten bis 24 Stunden reagieren läßt, worauf die Reaktionsprodukte aus den ImmunglobuHnpräparaten abgetrennt und überschüssige Anteile an Faktoren entfernt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Arbeiten mit löslichen Faktoren die aggregierten IG durch Zentrifugieren entfernt und aus der überstehenden Flüssigkeit die überschüssigen Faktoren an unlöslich gemachte, gegen den Faktor gerichtete Antikörper bindet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Arbeiten mit unlöslich gemachten Faktoren an Amingruppen durch Kuppler gebundene Teilchen verwendet, wobei die Immunglobulinpräparation durch eine den unlöslich gemachten Faktor enthaltene Säule geführt oder mit einer Suspension des unlöslich gemachten Faktors gemischt wird, worauf die Faktoren abgetrennt und gegebenenfalls wieder rückgewonnen werden.

4. Verwendung der nach Anspruch 1-3 erhaltenen Immunglobulinpräparate zur inntravenösen Applikation bei der Bekämpfung von durch Viren oder Bakterien ausgelösten Krankheiten.