DE3586536T3

DE3586536T3 - Monoklonaler Antikörper gegen ein Cytotoxin, denselben erzeugendes Hybridoma und Verfahren für die Herstellung des gereinigten Cytotoxin.

Info

Publication number: DE3586536T3
Application number: DE3586536T
Authority: DE
Inventors: Zelig Eshhar; Talia Hahn; David Wallach
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1984-12-20
Filing date: 1985-12-13
Publication date: 2002-05-08
Anticipated expiration: 2005-12-14
Also published as: DE122004000017I1; JPH0787966A; IL73883A; NL300142I2; AU5142485A; DE3586536T2; CA1337518C; DE122004000007I1; EP0186833A2; ZA859757B; NL300142I1; EP0186833B2; EP0186833A3; DE122004000005I1; DE186833T1; IL73883A0; JPS61191620A; EP0186833B1; AU601144B2; US6090923A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Hybridomzellinie, die einen monoklonalen Antikörper exprimiert, der ein Zytotoxin mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, spezifisch erkennt und bindet, einen monoklonalen Antikörper, der das Zytotoxin spezifisch erkennt und bindet, ein Verfahren zum Herstellen eines gereinigten Zytotoxins, ein Verfahren zum Herstellen eines gereinigten Zytotoxins mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, einen Festphasenimmumtest, mit dem eine Vielzahl von Hybridomkulturen auf die Erzeugung von Antikörpern, die das Zytotoxin binden können, durchmustert werden kann, und ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers gegen das Zytotoxin.

Hintergrund der Erfindung:

Es ist festgestellt worden, daß Proteine, die einen toxischen Effekt auf Zellen ausüben, als Antwort auf eine Stimulation von mononuklearen Zellen Verschiedener Art sezerniert werden. T-Zellen, wahrscheinlich sowohl Helfer- als auch Suppressoruntergruppen, können auf die von ihnen erkannten Antigene sowie auf mitogene Lektine durch Sekretion solcher zytotoxischen Proteine antworten (Granger, G.A. und Kolb, W.P., J. Immunol., 101, 111-120 (1968); Ruddle, N.H. und Waksman, B.H., J. Exp. Med. 128, 1267-1275 (1968); Eardley, D.D., Shen, F.W., Gershon, R.K. und Ruddle, N.H., J. Immunol. 124, 1199-1202 (1980)).
Monozyten und Makrophagen erzeugen zytotoxische Proteine als Reaktion auf gewisse bakterielle Toxine (Übersicht von Ruff, M.R. und G.E. Gifford in Lymphotoxins, E. Pick und M. Landy, Verleger, Academic Press, Inc. New York, 235-272, (1981)). Natürliche Killerzellen sezernieren zytotoxische Proteine nach 1 nkubation mit entsprechenden Zielzellen (Wright, S.C. und Bonavis, B., J. Immunol. 129, 433-439, (1982)), während von Zellen bestimmter kontinuierlicher B- Lymphozytenlinien festgestellt wurde, daß sie spontan zytotoxische Proteine erzeugen (Rosenau, W., Stites, D. und Jemtrud, S., Cell. Immunol. 43, 235-244, (1979)). In Lymphozytenkulturen produzierte Proteine werden gewöhnlich als "Lymphotoxine" bezeichnet, während der Ausdruck "Tumornekrosefaktor" ("tumor necrosis factor") oft für in Kulturen von Monozyten oder Makrophagen erzeugte zytofoxische Proteine verwendet wird. Es gibt Beweise dafür, daß solche zytotoxische Proteine Tumorzellen selektiv zerstören können (Rundel, J.O. und Evans, C.H., Immunopharmacol., 3, 9-18, (1981)). Bis jetzt ist nur ein einzelnes Protein dieses Typs, das von Zellen einer B-Lymphozytenlinie spontan erzeugt wird, bis in einige Details charakterisiert worden. Es wurde bis zur Homogenität gereinigt und sein Molekulargewicht wurde auf ungefähr 20000 Dalton (Aggarwal, B.B., Moffat, B. und Harkins, R.N., J. Biol. Chem. 259, 686-691 (1984)) geschätzt.

Zusammenfassung der Erfindung:

Es wird ein Verfahren zum Herstellen eines gereinigten, im wesentlichen homogenen Cytotoxins (CT) bereitgestellt, das natürlicherweise durch periphere mononukleare Blutzellen erzeugt wird. Das gereinigte CT hat ein Molekulargewicht von ungefähr 17000 +/-500 Dalton, bestimmt mittels SDS-Gelelektrophorese, übt einen zytotoxischen Effekt auf CHl sensibilisierte SV-80 Zellen aus und kann in einer erhöhten Reinheit durch Adsorption an Glasperlen bestimmter Größe (controlled pore glass beads) und Desorption erhalten werden.
CT kann unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen ein solches CT isoliert werden, die aus Mäusen erhalten werden können, denen teilweise gereinigte oder rohe CT-Präparationen injiziert worden sind. Es wird ein Verfahren zum Etablieren von Lymphozytenlinien bereitgestellt, die solche Anti-CT-Antikörper erzeugen. Solche Linien werden vorteilhafterweise etabliert, indem eine Vielzahl von Hybridomas, die aus Splenozyten solcher immunisierten Mäuse erhalten werden, durchmustert wird. Weiterhin werden für CT spezifische monoklonale Antikörper bereitgestellt. Solche monoklonalen Antikörper werden durch solche Hybridomzellinien erzeugt und für die Isolierung von CT in im wesentlichen homogener gereinigter Form verwendet.
Das so erhaltene gereinigte Zytotoxin, CT, wird von einem spezifischen Anti-CT-Antikörper erkannt. Eine therapeutisch wirksame Menge mindestens dieses Zytotoxins oder eines seiner Salze kann für die Herstellung eines Medikaments zum selektiven Behandeln virusinfizierter Zellen verwendet werden.
Der Ausdruck "Salz" bezieht sich auf Salze der Carboxyl- und/oder der Aminogruppen des CT, und der Ausdruck "Derivate" auf kovalente Modifikationen der Polypeptidseitenketten des CT. Die Natur des Trägers für das CT, das Salz oder das Derivat hängt von der Art und Weise ab, in der es für therapeutische Zwecke verwendet wird - sei es in Form einer Creme oder einer Lotion für die topische Verwendung oder in der Form einer Flüssigkeit zur Injektion oder für die orale Applikation, in der das CT, sein Salz oder Derivat durch Zufügen von Bestandteilen wie Humanserumalbumin stabilisiert sein wird.
CT ist gegenüber Zellen in Gegenwart von metabolischen Blockern, beispielsweise Cycloheximid (CHI), Actinomycin D oder Mitomycin C, effektiv zytotoxisch, aber in Abwesenheit dieser Agenzien weisen viele Arten von Zellen Resistenz gegen seinen zytotoxischen Effekt auf. Eine Infektion mit Viren kann die Zellen ebenfalls empfänglich für die tötende Wirkung von CT machen.
Die das CT umfassenden Zusammensetzungen steigern effektiv beispielsweise das Töten von VSV-infizierten SV-80-Zellen, während sie keinen zytotoxischen Effekt auf nichtinfizierte SV-80-Zellen haben. Das Töten von virusinfizierten Zellen durch CT wird durch IFNs verstärkt, in erster Linie durch IFN-γ, wenn diese in wesentlichen Konzentrationen verwendet werden. Durch die Verwendung der CT-enthaltenden Zusammensetzungen für die Therapie sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die außerdem ein geeignetes IFN enthalten, von Vorteil, und ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen, die metabolische Blocker, beispielsweise CHI oder Actinomycin D oder Mitomycin C, enthalten.
Das gereinigte CT ist für tumor- und virusinfizierte Zellen bei Konzentrationen von nur 10 Picogramm/ml wirksam zytotoxisch. Die Mengen des zur Therapie verwendeten CTs werden so eingestellt, daß sie einen solchen Konzentrationsbereich oder höhere in den Zielgeweben erreichen.
Die die Antikörper gegen CT erzeugenden Hybridomzellen wurden bei der International Culture Collection of Institut Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Hinterlegungs-Nr. 1-472 am 16.07.1985 hinterlegt und von uns als Zelllinie CT bezeichnet.

Beschreibung der Erfindung:

Die Erfindung wird im folgenden durch Beispiele veranschaulicht.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung, die das Verfahren der Isolierung von CT veranschaulichen soll. Wie gezeigt, umfassen die Verfahrensschritte das Immunisieren eines geeigneten Labortieres (Mäuse, etc.) mit Präparationen, in denen CT durch chromatographische Verfahren angereichert ist, gefolgt vom Beobachten der Serumtiter von CT-neutralisierenden und CT-bindenden Antikörpern mittels der in Fig. 2a und 2b angegebenen Verfahren. Von den Splenozyten der immunisierten Mäuse abgeleitete Hybridomas wurden auf die Produktion CT-bindender Antikörper mittels der in Fig. 3 angegebenen Verfahren durchmustert. Hybridomas, von denen festgestellt wurde, daß sie solche Antikörper erzeugen, wurden geklont und die erzeugten monoklonalen Antikörper wurden auf Immunadsorbenssäulen aufgetragen, auf denen CT aus Lymphokinpräparationen, die in PBMC mit Concanavalin-A (ConA) und Phorbol-12-O-myristat-13-acetat (TPA) induziert worden war, affinitätsgereinigt und dann mittels Chromatographie auf Glasperlen bestimmter Porengröße (controlled pore glass beads) partiell gereinigt wurde. Der kritische Schritt war das Durchmustern einer großen Anzahl von Hybridomkulturen, um einige Antikörper gegen CT-erzeugende Hybridomas zu finden. Das zu diesem Zweck entwickelte Verfahren (dargestellt in Fig. 3) umfaßt einen Festphasen-CT-Bindungstest, der ein schnelles Durchmustern von Hybridomkulturen auf die Gegenwart solcher Antikörper gestattet, gefolgt von einem Biotest, mit dem an die Festphase gebundene CTs empfindlich nachgewiesen werden können, unter Verwendung von gegen die zytotoxischen Effekte von CT durch Cycloheximid sensibilisierte Zellen.
Fig. 4 zeigt die Selektivität der Bindungsaktivität eines so isolierten monoklonalen Antikörpers, wobei die CT-Bindung mit der Bindung von Interferon-γ durch Immunadsorbenzien, die mit diesem Antikörper konstruiert worden waren, sowie von zwei anderen, nicht verwandten monoklonalen Antikörpern (B, C), verglichen wurde. Es zeigt sich, daß von diesen drei Antikörpern nur einer CT bindet, nämlich der, der direkt gegen CT gerichtet ist (CT-1 in Fig. 4A). Es zeigt sich weiter, daß diese Bindung von CT ohne Bindung nachweisbarer Mengen eines anderen Proteins in der Zytotoxin-IFN-γ-Präparation auftritt. Unter den gleichen experimentellen Bedingungen bindet ein monoklonaler Antikörper gegen das letztere, gezeigt in B, effektiv IFN-γ, ohne CT überhaupt zu binden.
Fig. 5 zeigt in C das auf einem Immunadsorbtionsmittel, das mit dem monoklonalen Antikörper konstruiert wurde, gereinigte CT, nachgewiesen mittels Coomassie-Blau- Färbung nach Elektrophorese auf einem Acrylamidgel in Gegenwart von SDS. (Weiterhin wird das Proteinmuster der Lymphokin-Rohpräparation gezeigt, aus der CT gereinigt worden ist (A), das Fehlen jeder Bindung des Proteins, wenn die Rohpräparation auf ein Immunadsorbtionsmittel aufgetragen wird, das mit einem irrelevanten Antikörper (gegen DNP) konstruiert wird (in B) und Molekulargewichtstandards in D). Fig. 6 zeigt, wie das Molekulargewicht dieses Zytotoxins durch Vergleich mit der Mobilität der in Fig. 5D gezeigten Standardproteine auf einem Polyacrylamidgel geschätzt wird. Ein selektiver zytotoxischer Effekt von CT und seine Steigerung durch IFN sind in Fig. 7 gezeigt, die den zytotoxischen Effekt von CT auf VSV-infizierte SV-80-Zellen bei verschiedenen Konzentrationen zeigt ( ) und seine weitere Steigerung durch Behandeln dieser Zellen mit IFN-γ (10 E/ml, 16 hr vor Infektion (o) oder 100 E/ml vor Infektion (Δ)) im Vergleich zur Resistenz gegen CT in uninfizierten Zellen ( ), selbst wenn sie ebenfalls mit IFN-γ von 100 E/ml behandelt werden ( ).

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen:

Das folgende Beispiel dient nur zur Anschauung.

1. Induktion von CT:

Menschliche mononukleare Zellen aus dem peripheren Blutkreislauf (PBMC) werden auf "Ficoll-Hypaque" (Pharmacia, Upsala, Schweden) aus den "buffy-coats" aus frisch gespendetem Blut isoliert und von Plättchen durch differentielle Zentrifugation befreit. Die Zellen werden bei einer Konzentration von 10&sup7; Zellen/ml suspendiert und bei 37ºC in MEM Alphamedium (Gibco, Grand Island, N.Y.) inkubiert. CT wird in diesen Zellen durch eines der folgenden Verfahren induziert.
A. Für die Immunisierung von Mäusen verwendete Präparationen werden durch Stimulieren der PBMC mit Phytohemagglutinin-P (PHA) induziert. Vor dieser Stimulierung werden die Zellen zunächst 12 h in Gegenwart einer rohen Lymphokinpräparation inkubiert (0,2 ug/ml). Diese Behandlung führt nicht zur Produktion von CT, aber erhöht die Reaktionsfähigkeit der Zellen gegenüber einer anschließenden Stimulierung. Dann wird PHA (5 ug/ml) (Difco, Detroit) zugefügt und die PBMC 24 h weiter inkubiert. Das Medium wird dann gesammelt, bei 2500 rpm 15 min zentrifugiert, um die Zelldebris zu entfernen, und zum Konzentrieren und Anreichern des CTs, wie unten beschrieben, weiter behandelt.
B. Die zum Reinigen von CT auf Immunadsorbtionsmitteln verwendeten Lymphokinpräparationen werden vorteilhafterweise mit Con-A induziert, da es sich als schwierig herausstellte, Spuren von PHA im Reinigungsverfahren zu eliminieren. Die Zellen wurden zunächst 12 h mit 0,25 ug/ml Con-A behandelt. Bei dieser Konzentration induziert Con-A keine signifikante Sekretion von CT, aber es erhöht die Reaktionsfähigkeit der Zellen gegenüber der anschließenden Stimulierung durch eine höhere Con-A-Konzentration. Dann wird Phorbol-12-O-myristat-13-acetat (TPA) in einer Konzentration von 5 ng/ml zugefügt und 3 h später wird Con-A in einer Konzentration von 10 ug/ml zugefügt. Die Zellen werden 24 h inkubiert und dann, nach Ersetzen durch frisches Medium mit 5 ug/ml Con-A, für einen weiteren Zeitraum von 24 h inkubiert. Die Medien werden vereinigt und zentrifugiert, Methyl-α-D-mannosid (Sigma, St. Louis, MO.) in einer Konzentration von 50 mM zugefügt und die Medien dann, wie unten beschrieben, zur Reinigung des Immunadsorbtionsmittels weiter behandelt.
Alternativ kann CT wirksam in menschlichen mononuklearen Zellen des peripheren Blutkreislaufs, in aus einer mononuklearen Zellpopulation isolierten Monozyten oder in kultivierten Zellen, beispielsweise U937, deren Eigenschaften denen von Monozyten ähneln, induziert werden, indem auf diese Zellen Sendaivirus (200 HAU/ml) aufgebracht werden und die Zellen für einen Zeitraum von ungefähr 12 h inkubiert werden, um die Produktion von CT zu ermöglichen. Die Zellmedien werden dann zentrifugiert und für die unten beschriebene Reinigung von CT weiter verarbeitet.

2. Ouantifizierung von CT:

CT wird durch Bestimmen seiner zytotoxischen Wirkung mittels eines Bioassays quantifiziert (Wallach, D., J.
Immunol. 132, 2464-2469 (1984)). Die zu untersuchenden Proben werden in verschiedenen seriellen Verdünnungen gleichzeitig mit der Anwendung von Cycloheximid (CHI 50 ug/ml) in Mikrovertiefungen eingebracht, die confluente Kulturen von SV-80-Zellen enthalten. Das Ausmaß der Zelltötung, bestimmt durch Messen der Aufnähme von Neutralrot durch diese Zellen, wird 20 h später unter Verwendung eines MicroELISA Autoreaders (Dynatech, Alexandria, VA) quantifiziert.

3. Chromatographische Anreicherung von CT:

CT-Rohpräparationen werden zunächst durch Adsorption an Glasporen bestimmter Größe (controlled pore glass; CPG) (PG-350-200, Sigma St. Louis, MO) konzentriert, gefolgt von Desorption in 0,5 M Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) und dann weiter durch Ultrafiltration mit einer Amicon PM-10-Membran (Amicon, Denver, MA) konzentriert. Die zur Immunisierung von Mäusen verwendeten CT-Präparationen werden dann durch eines der folgenden Verfahren weiter gereinigt:
(A) CPG-konzentrierte CT-Präparationen werden durch Elektrophorese auf 7,5% Acrylamidgelen unter nicht-denaturierenden Bedingungen (Walker, S.M. und Lucas, Z.J., J. Immunol. 113, 813-823, (1974), Lewis, J.E., Carmack, C.E., Yamamoto, R. und Granger G.A., J. Immunol. Meth. 14, 163-176 (1977)) fraktioniert. Die aus Scheibchen der Gele eluierten Fraktionen, die eine zytotoxische Aktivität aufweisen, werden gesammelt, mittels Ultrafiltration auf einer PM-10®-Membran konzentriert und in Mäuse injiziert.
(B) CPG-konzentrierte CT-Präparationen werden mit 1 M NaCl, 30% Ethylenglykol, 10 mM Natriumphosphat und 0,1 mM EDTA equilibriert und zweimal hintereinander einer Fraktionierung mit Ultrogel® AcA44 unterworfen. Im Anschluß an jede solche Fraktionierung wurden die zytotoxische Aktivität aufweisenden Fraktionen gesammelt und auf einer PM-10®-Membran konzentriert. Die aus dem zweiten Lauf auf der Ultrogelsäule gewonnenen zytotoxischen Proteine wurden einer weiteren Reinigung durch präparatives Isoelektrofokussieren auf einem 1% Ampholingradienten (pH 3,5 bis 10) unterworfen, der in Saccharoselösung unter Verwendung von LKB-8100-1® aufgebaut wird. Die eine maximale zytotoxische Aktivität aufweisenden Fraktionen, die ihren Gipfel bei ungefähr 6,4 haben, werden gesammelt, konzentriert, mit PBS equilibriert und dann in Mäuse injiziert.

Immunisierung mit CT und Zellfusion:

Proben von 10 ug der CT-Präparationen werden vier Monate alten weiblichen CB6-Mäusen injiziert - fünf Injektionen mit CT, angereichert nach Verfahren A, wie oben beschrieben, und weitere zwei Injektionen mit nach Verfahren B angereichertem CT. Bei der ersten Immunisierung werden die Proteine in vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert und in die Fußsohlen (foot pads) der Mäuse injiziert (0,5 ml/Maus). Die zweite Injektion wird drei Wochen später verabreicht und die restlichen Injektionen, die in 1- bis 2-Wochen-Intervallen gegeben werden, werden alle subkutan unter Verwendung von Aluminiumoxidgel als Adjuvans (0,3 ug/0,25 ml/Maus) verabreicht. Die Immunisierung wird dann einen Monat ausgesetzt und der Maus mit dem höchsten Serumantikörpertiter gegen CT werden zweimal im Abstand von einem Tag intraperitoneal 10 ug einer nach Verfahren B angereicherten CT-Präparation injiziert. Am Tag nach der zweiten Immunisierung wird die Maus getötet und ihre Splenozyten werden mit Myelomzellen fusioniert.
Die fusionierten Zellen werden auf eine Vielzahl von Vertiefungen von Mikrotiterplatten verteilt und die Hybridomas in HAT-enthaltendem Gewebekulturmedium selektiert. Hybridomas, von denen festgestellt wurde, daß sie Antikörper gegen CT produzieren, werden in Weichagar geklont. Zum Wachsenlassen dieser Zellen in der Ascitisflüssigkeit von Mäusen werden 10&sup7; Zellen pro Maus zwei bis vier Wochen nach intraperitonealer Injektion von 0,5 ml Pristan intraperitoneal inokkuliert.

Quantifizierung der Antikörper gegen CT in Mausseren und in Hybridom-Wachstumsmedien:

Der Antikörperspiegel gegen CT in Mäuseseren wird durch Messen ihrer neutralisierenden und bindenden Aktivitäten bestimmt.

CT-neutralisierende Aktivität: (Fig. 2a)

CT-Proben (10 E in 50 ul Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, enthaltend 2% FCS (DMEM - 2% FCS) werden vier Stunden bei 37ºC mit seriell in DMEM - 2% FCS verdünnten Mäuseserumproben (50 ul) inkubiert. Sie werden dann weiter 12-16 h bei 4ºC inkubiert und auf CT-Aktivität in acht Zweifachverdünnungen untersucht.

CT-Bindungsaktivität: (Fig. 2b)

Proben von rohen konzentriertem CT (30 ul, 10&sup4; E/ml) werden 4 h bei 37ºC in Mikrotiterplattenvertiefungen mit konischem Boden (Greiner) mit seriell in DMEM - 2% FCS verdünnten Mäuseserumproben inkubiert. Normales Mäuseserum (20 ul einer 1 : 40-Verdünnung in PBS) wird zugefügt, gefolgt von 60 ul Ziegenantiserum gegen Maus F(ab)'&sub2;. Die Platten werden weiter 30 min bei 37ºC inkubiert und dann über Nacht bei 4ºC, und werden dann bei 1200 g für 5 min bei 4ºC zentrifugiert. Die Immunpräzipitate werden zweimal mit kaltem PBS und einmal mit ungepufferter Kochsalzlösung gewaschen, durch Zufügen von 50 ul NH&sub4;OH solubilisiert und auf CT-Aktivität bei acht zweifachen Verdünnungen untersucht.

Festphasen-Test zum Nachweis CT-bindender monoklonaler Antikörper:

(Angewendet zum Durchmustern des Hybridom-Wachstumsmediums auf Gegenwart von CT-bindenden Antikörpern, Fig. 3)
PVC-Mikrotiterplatten (Dynatech, Alexandria, VA) werden mit affinitätsgereinigten Ziegenantikörpern gegen Maus F(ab)2 (80 ug/ml in PBS, 80 ul/Vertiefung) inkubiert, dann mit Proben des Hybridom-Wachstumsmediums (50 ul/- Vertiefung) und schließlich mit Proben einer rohen konzentrierten CT-Präparation (104 E/ml, 50 ul/Vertiefung) inkubiert. Jede dieser Inkubationsperioden beträgt 12 bis 18 h (bei 4ºC) und nach jeder werden die Platten dreimal mit PBS gespült. Die Platten werden dann weiter einmal mit ungepufferter Kochsalzlösung gespült und das gebundene CT durch Anwenden von NH&sub4;OH dissoziiert (75 mM, enthaltend 0,1% FCS 20 ul/Vertiefung). 100 ul 0,04 M Na- Hepes pH 7,4 in DMEM-10% FCS werden zugefügt und die eluierte zytotoxische Aktivität auf CHI-sensibilisierten SV-80-Zellen bei vier zweifachen Verdünnungen quantifiziert.

Reinigung von CT auf Immunadsorbentien:

Monoklonale Antikörper werden aus Ascitisflüssigkeit durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat (50%) gereinigt. Antikörper vom IgM-Isotyp werden weiter durch Dialysieren gegen Wasser, gefolgt von Solubilisierungspräzipitation des IgM in PBS, gereinigt. 10 mg jedes dieser Immunglobuline werden an 1 g Trisacryl GF-2000® (LKB) gekoppelt, das mit Aminocapronsäure derivatisiert und mit N-Hydroxysuccinimid aktiviert worden ist. Ungekoppelter Antikörper wird durch Waschen des Harzes mit 50 mM Natriumcitrat pH 2,8 und dann mit 0,15 NH&sub4;OH entfernt.
Zur Reinigung des CTs auf dem Immunadsorbtionsmittel werden Proben von 0,5 ml des Harzes 2 h bei 4% mit 3 ml der CT-Präparation in Gegenwart von 0,5 M TMAC gemischt. Die Harze werden dann in kleinere Säulen gepackt und das ungebundene Protein mit 0,5 M TMAC-Lösung gewaschen. Die Säulen werden weiter mit 0,5% NP-40 in 0,5 M TMAC gewaschen, dann mit einer 1 M NaCl-Lösung, die außerdem 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 enthält, und dann mit ungepufferter Kochsalzlösung, und das gebundene CT wird durch Auftragen von 0,2 M NH&sub4;OH eluiert und mit 1 M Essigsäure innerhalb 10 min der Elution neutralisiert. Alle Schritte des Immunaffinitätsreinigungsverfahrens werden bei 4ºC durchgeführt.

Analyse des gereinigten CTs mittels SDS-Gelelektrophorese:

Fig. 5 zeigt das Proteinmuster einer auf einem SDS-Polyacrylamidgel (15%) analysierten Rohpräparation von Zytotoxinen. Es handelt sich um die Ammonium-eluierte Fraktion eines Immunadsorbens, der mit dem Antikörper U13-6 (gegen DNP) konstruiert worden ist, und auf den das rohe CT aufgetragen worden ist (in B). Aus der Rohpräparation der CT-1-Immunadsorbtionssäule (in C) gereinigtes CT und die Molekulargewichtsstandards (Phosphorylase 94 K, Rinderserumalbumin 67 K, Ovalbumin 43 K, Carbonanhydrase 30 K, Sojabohnentrypsin-Inhibitor 20,1 K und Lysozym 14,4 K Dalton (in D) sind wie in Fig. 6 gezeigt. Fig. 5c zeigt, daß das gereinigte CT nur eine einzelne Polypeptid-Art darstellt. Das Molekulargewicht des gereinigten Proteins, geschätzt durch Vergleich mit der Mobilität anderer Proteine mit bekanntem Molekulargewicht auf dem Acrylamidgel, beträgt ungefähr 17,5 KD in Fig. 6.

Claims

1. Hybridomzellinie, die einen monoklonalen Antikörper exprimiert, der ein Zytotoxin mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, spezifisch erkennt und bindet, wobei das Hybridom durch Fusion von Mausmyelomzellen mit Milzzellen einer Maus gebildet ist, die zuvor mit einer reinen oder unreinen Präparation eines aus stimulierten Monozyten oder monozytenähnlichen Zellen erhaltenen menschlichen Zytotoxins immunisiert worden ist, wobei das Zytotoxin

(i) einen zytotoxischen Effekt auf CHI-sensibilisierte SV-80 Zellen ausübt; und

(ii) in einer erhöhten Reinheit durch Adsorption des Zytotoxins aus der genannten Präparation an Glasperlen bestimmter Porengröße (controlled pore glass beads) und Desorption erhalten werden kann; und

(iii) von einem monoklonalen Referenzantikörper, der von der beim Pasteurinstitut hinterlegten Hybridomzelllinie CNCM I-472 erzeugt wird, spezifisch erkannt und gebunden wird.

2. Monoklonaler Antikörper, der ein Zytotoxin mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, spezifisch erkennt und bindet, wobei das Zytotoxin

(ii) einen zytotoxischen Effekt auf CHI-sensibilisierte SV-80 Zellen ausübt; und

(ij) in einer erhöhten Reinheit durch Adsorption des Zytoxine aus der genannten Präparation an Glasperlen bestimmter Porengröße (controlled pore glass beads) und Desorption erhalten werden kann.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, erzeugt von einer Hybridomazellinie nach Anspruch 1.

4. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Zytotoxins mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese, wobei das Zytotoxin

(ii) in einer erhöhten Reinheit durch Adsorption des Zytotoxins aus der genannten Präparation an Glasperlen bestimmter Porengröße (controlled pore glass beads) und Desorption erhalten werden kann

wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen einer das Zytotoxin enthaltenden Präparation;

(b) Adsorbieren des Zytotoxins aus der genannten Präparation an Glasperlen bestimmter Porengröße (controlled pore glass beads);

(c) Desorbieren des Zytotoxins in einem Zustand erhöhter Reinheit von den Glasperlen mit bestimmter Porengröße;

(d) In Kontakt bringen des desorbierten Zytotoxins mit einem Immunoadsorbtionsmittel, wobei das Immunoadsorbtionsmittel einen monoklonalen Antikörper entsprechend einem der Ansprüche 2 bis 3 umfaßt;

(e) Eluieren des Zytotoxins von dem Immunoadsorbtionsmittel.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Zytotoxin in Schritt c) mittels eines Desorptionspuffers, der 0,5 M Tetramethylammoniumchlorid enthält, desorbiert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei das Zytotoxin von dem Immunadsorptionsmittel mittels ungefähr 0,2 M NH&sub4;OH eluiert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Präparation aus Schritt a) aus stimulierten peripheren mononukleären Blutzellen gemacht wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Zellen nach Inkubation mit Lymphokinen mit Phytohämagglutinin stimuliert werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Zellen nach Inkubation mit einer Concanavalin-A-Konzentration, die für sich selbst keine signifikante Sekretion des Zytotoxins induziert, mit Concanavalin-A stimuliert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, in dem die Zellen mit Sendai-Virus stimuliert werden.

11. Festphasenimmuntest, mittels dessen eine Vielzahl von Hybridomkulturen auf die Erzeugung von Antikörpern untersucht werden kann, die ein Zytotoxin mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, binden können, wobei das Zytotoxin

(i) einen zytotoxischen Effekt auf CHl-sensibilisierte SV-80 Zellen ausübt; und

(ii) in einer erhöhten Reinheit durch Adsorption des Zytotoxins aus der genannten Präparation an Glasperlen bestimmter Porengröße (controlled pore glass beads) und Desorption erhalten werden kann;

wobei der Immuntest folgende Schritte umfasst:

a) Beschichten einer proteinbindenden Trägervorrichtung mit affinitätsgereinigtem Antikörper gegen Mausimmunoglobuline;

b) Inkubieren der untersuchten Hybridomwachstumsmedien in der beschichteten Trägervorrichtung, gefolgt von Waschen;

c) Inkubieren von Proben des Zytotoxins in der Trägervorrichtung, gefolgt von Waschen;

d) Dissoziieren des Zytotoxins, das an die Trägervorrichtung gebunden hat, und Bestimmen seiner Menge in einem biologischen Test.

12. Immuntest nach Anspruch 11, in dem der biologische Test das Bereitstellen von Zellen, die für die zytotoxische Wirkung des Zytotoxins mittels eines metabolischen Blockers sensibilisiert sind, das Zufügen des Zytotoxins und das Messen des Ausmaßes des Zelltods umfaßt.

13. Immuntest nach Anspruch 12, in dem der metabolische Blocker Cycloheximid ist.

14. Immuntest nach Anspruch 12, in dem metabolische Blocker Actinomycin D ist.

15. Immuntest nach Anspruch 12, in dem der metabolische Blocker Mitomyzin C ist.

16. Verfahren zum Herstellen monoklonaler Antikörper gegen ein Zytotoxin mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS- Polyacryamidgelelektrophorese, wobei das Zytotoxin

wobei das Verfahren das Immunisieren von Mäusen mit entweder reinen oder unreinen Präparationen eines solchen Proteins, das Nachweisen von

Hybridomen, die solche Antikörper erzeugen, mittels des Immuntests gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, das Kultivieren solcher Hybridome und Erhalten der erwünschten Antikörper umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, in dem die in dem biologischen Test von Schritt d) gemäß Anspruch 11 verwendeten Zellen Cycloheximidsensibilisierte SV 80-Zellen sind.

18. Verfahren zum Isolieren eines Zytotoxins mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, wobei das Zytotoxin

wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) das Herstellen eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 3 gegen das Zytotoxin nach Immunisieren mit unreinen Präparationen des Zytotoxins;

b) das Konstruieren eines Immunadsorptionsmittels aus diesen Antikörpern und Verwenden desselben zum Reinigen des Zytotoxins aus rohen Zytotoxinpräparationen.

19. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens eines Zytotoxins mit einem Molekulargewicht von 17000 +/- 500 D, bestimmt mittels SDS-Polyacryamidgelelektrophorese, wobei das Zytotoxin

(j) einen zytotoxischen Effekt auf CHI-sensibilisierte SV-80 Zellen ausübt, und

oder eines Salzes davon im wesentlichen in homogener Form für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung virusinfizierter Zellen.