DE3382716T2

DE3382716T2 - Verfahren zur Wärmebehandlung von Plasma oder Plasmafraktionen und so erhaltene Zusammensetzungen.

Info

Publication number: DE3382716T2
Application number: DE85103962T
Authority: DE
Inventors: Alan Rubenstein
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1982-05-13
Filing date: 1983-05-11
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2003-05-12
Also published as: EP0094611A3; FR2526660A1; ES8601701A1; ES8505821A1; JPS58213721A; AU568979B2; AR230186A1; EP0094611A2; IE831068L; LU84804A1; ES535745A0; AU5765986A; US4456590A; BE896724A; ES522310A0; DE3382716D1; ES8601700A1; CA1203165A; GB2144428B; DE3364057D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein hitzebehandeltes Plasma. Insbesondere betrifft die Erfindung hitzebehandelte Fraktionen, welche zum Zweck der Inaktivierung unerwünschter Mikroorganismen und Viren wie z. B. Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Hepatitis- Virus, die in den Fraktionen vorliegen, erhitzt werden können.
Die Verwendung von Gerinnungsfaktor-Konzentraten, die aus fraktioniertem Blutplasma zum Zwecke therapeutischen Eingreifens bei ererbten Blutungskrankheiten wie z. B. Hämophilie gewonnen werden, ist durch das übermäßige Risiko, dem der Hämophilie-Patient durch die Anwesenheit von Hepatitis-Virus in den Konzentraten ausgesetzt wird, stark beeinträchtigt. Handelsübliche Konzentrate von Faktor VIII und IX werden z. B. verwendet, um die Gerinnungsfähigkeit von Blut eines Hämophilie-Opfers zu erhöhen, allerdings werden die Konzentrate aus Plasmapools gewonnen, die von Tausenden von Spendern stammen und die das anhaftende Hepatitis-Risiko einer gleichen Anzahl von einzelnen Einheitstransfusionen beinhalten.
Wie McCullen und Zuckermann gezeigt haben, siehe Journal of Medical Virology, Vol. 8, Nr. 29 (1981), übertragen solche Plasmapools trotz strenger Überprüfung der einzelnen Spender auf Hepatitis B-Oberflächenantigene (HBsAg) eindeutig sowohl Hepatitis B als auch nicht-A-, nicht-B-Hepatitis.
Eine Hepatitis-Übertragung durch Albumin und andere hitzestabile Plasmakomponenten, die ohne Beziehung zur Blutgerinnung sind, ist schon früher dadurch verhindert worden, daß die Plasmakomponenten in Lösung bei Temperaturen von 60ºC für 10 Stunden erhitzt worden sind. Ähnliche Versuche, Gerinnungsfaktorkonzentrate in Lösung zu erhitzen, führen im Gegensatz dazu zu einer merklichen Reduktion oder zum Verlust der Gerinnungsfaktor-Aktivität in den Konzentraten und scheinen demnach kein gangbarer Weg zur Lösung des Problems der Hepatitis-Übertragung, das mit der herkömmlichen Hämophilie-Therapie verknüpft ist, zu sein. In jüngerer Zeit ist ein hochgereinigtes Faktor VIII-Präzipitat in einer Lösung aus Saccharose-Glycin gelöst und 10 Stunden lang bei 60ºC erhitzt worden. Obgleich das Faktor VIII- Konzentrat, das anschließend aus dem erhitzten Präzipitat abgeleitet worden ist, Gerinnungsfaktor-Aktivität behalten hatte, waren die unter Anwendung dieser Methode erzielten Ausbeuten sehr gering, z. B. etwa 8%; siehe Heimburger et al., Hemostatis, Vol. 10 (Ergänzung 1), S. 204 (1981) und Heimburger et al., Blut, Vol. 44, S. 249-251 (1982).
Demnach liefert der Stand der Technik bis heute weder ein Mittel zur wirksamen Inaktivierung des Hepatitis-Virus, der in Gerinnungsfaktor-Konzentraten vorliegt, noch lehrt der Stand der Technik ein Mittel zur wirksamen Inaktivierung des Hepatitis-Virus, der in Gerinnungsfaktor-Konzentraten vorliegt, noch lehrt der Stand der Technik ein Mittel, um die Übertragung von Hepatitis-Virus auf Patienten, die sich einer Therapie mit Gerinnungsfaktor-Konzentraten unterziehen, zu verhindern.
Gemäß der vorliegenden Erfindung inaktiviert, reduziert oder eliminiert die Hitzebehandlung von im wesentlichen trockenen Zusammensetzungen, die Faktor VIII enthalten, die Infektiosität der darin vorkommenden Mikroorganismen wie z. B. Viren, ohne die Gerinnungsfaktor-Aktivität zu verringern.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch die Hitzebehandlung von Gerinnungsfaktor-Konzentraten, die Faktor VIII enthalten, eingeschlossen, wobei die Konzentrate zuerst in lyophilisierter Form hergestellt werden, um die Stabilität der Konzentrate während des Erhitzungsprozesses zu erhöhen.
Hitzebehandelte lyophilisierte Plasmafraktionen erzeugen vorzugsweise eine Zusammensetzung und einen Impfstoff, die sowohl gegen den Hepatitis B-Virus als auch gegen den nicht-A-, nicht-B-Hepatitis-Virus wirksam sind.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden erreicht, wenn entweder das gesamte Plasma oder Plasmafraktionen einschließlich Faktor VIII-Konzentrat, lyophilisiert werden und danach das lyophilisierte gesamte Plasma oder die lyophilisierten Plasmafraktionen für verschiedene Zeiträume erhöhten Temperaturen unterworfen werden.
Die Fähigkeit, im menschlichen Blut vorkommende Gerinnungsfaktoren zu isolieren, ist bei Verständnis der Pathologie von Hämophilie und anderen ererbten Blutungskrankheiten unentbehrlich. Die Entdeckung von Plasmafraktionierungs-Schemen für die Gewinnung praktisch anwendbarer Mengen von Gerinnungsfaktor-Konzentraten ermöglichte es der medizinischen Wissenschaft, die Gerinnungsfaktor-Konzentrate als therapeutische Mittel bei der Behandlung von Blutungskrankheiten einzusetzen. Eine Transfusionsbehandlung unter Verwendung von Faktor VIII- und Faktor-IX-Konzentraten hat sich insbesondere als wirklich erfolgreich bei der Verabreichung an Hämophilie-Patienten erwiesen. Unglücklicherweise bleibt das Risiko der Hepatitis-Übertragung aufgrund der großen Anzahl der Plasmaspender, die für die wirtschaftliche Herstellung von Gerinnungsfaktor-Konzentraten notwendig sind, der einzige ernste Nachteil, der mit der Transfusionsbehandlung verbunden ist. Ein typisches Plasma-Fraktionierungsschema, das in Seminars in Thrombosis and Hemostatis, Vol. VI, Nr. 1, S. 4 (1979) offenbart ist, ergibt Cryopräzipitat und Überstand, wobei die erstgenannte Fraktion eine Quelle für Faktor VIII-Konzentrat und für Fibrinogen darstellt, die letztgenannte Fraktion eine Quelle für Faktor IX-Konzentrat zusätzlich zu Konzentraten der Faktoren II, VIII und I darstellt. Wie Gerety und Eyster in "Hepatitis Among Hemophiliacs", Non-A, Non-B Hepatitis, S. 103-106 (1981) gezeigt haben, wird der anfangs im Gesamtplasma vorliegende Hepatitis B-Virus während des Plasmafraktionierungs- Verfahrens in Derivate des Faktors VIII und des Faktors IX aufgeteilt. Wieauch von Maynard und Bradley, "Transmission by Blood Products", Non-A, Non-B Hepatitis, S. 78-79 (1981) gezeigt wurde, existiert nicht-A-, nicht-B-Hepatitis sowohl in Faktor VIII- wie auch in Faktor IX-Derivaten. Frühere Versuche, Gerinnungsfaktor-Konzentrate zum Zwecke der Inaktivierung des Hepatitis-Virus in Lösung mit Hitze zu behandeln, sind wirkungslos gewesen. Die Entwicklung von Techniken zur Lyophilisierung von Gerinnungsfaktor-Derivaten hat allerdings hinsichtlich der Stabilisierung von Gerinnungsfaktor-Derivaten während des Hitzebehandlungsprozesses einen neuen Forschungsweg geöffnet, wodurch ein Mittel zur Inaktivierung des Hepatitis-Virus, der in Gerinnungsfaktor-Derivaten vorliegt, ohne Zerstörung der Gerinnungsfaktor-Aktivität eingeführt wird.

Testverfahren zur Überprüfung

ERHALT DER GERINNUNGSFAKTOR-AKTIVITÄT

Von verschiedenen Herstellern wurden paarweise Proben von verschiedenen lyophilisierten Plasmafraktionen bezogen, wobei die Paare identische Partie-Nummern hatten. Die Proben hatten ein Gewicht von weniger als 100 g und wurden in Reaktionsgläser mit einem Volumen von 60 ml bis 90 ml gegeben. Eine Probe von jedem Paar wurde erhitzt, entweder indem das Probengläschen bei Umgebungsdruck für eine vorbestimmte Zeit in ein Wasserbad oder einen Trockenofen bei einer vorbestimmten Temperatur gestellt wurde oder indem das lyophilisierte Material selbst ohne das Reaktionsgläschen in einen Trockenofen gegeben wurde. Die übrige Probe jedes Paars diente als Kontrolle und wurde während des Hitzebehandlungsprozesses auf 4ºC-6ºC gekühlt. Nach der Hitzebehandlung wurden beide Proben, Kontrolle wie auch die hitzebehandelte lyophilisierte Probe, mit sterilem Wasser zur ursprünglichen Konzentration gelöst. Die Lösung zur ursprünglichen Konzentration wird im allgemeinen in Übereinstimmung mit den Beschreibungen des Herstellers durchgeführt, obgleich die Löslichkeit von manchen hitzebehandelten Proben merklich verbessert wurde, indem bei der Rekonstitution eine im Vergleich zur vom Hersteller empfohlenen Menge erhöhte Menge steriles Wasser verwendet wurde. Es wurden in vitro Faktor VIII- und Faktor-IX- Analysen unter Verwendung eines einstufigen manuellen Fibrometer-Verfahrens mit Verdünnungen im Bereich zwischen 1 : 40 und 1 : 400 durchgeführt, um ein Maß für die Gerinnungsaktivität von Faktor VIII und Faktor IX zu erhalten. Die in vitro-Wiedergewinnung von Fibrinogen im Anschluß an die Rekonstitution der Kontrollprobe und der hitzebehandelten lyophilisierten Fibrinogenprobe wurde in ähnlicher Weise gemessen. In einigen Versuchen wurden rekonstituierte Plasmaproben auf ihre Lichtdurchlässigkeit bei 580 nm in einem Spektrophotometer Beckmann Modell 25 betrachtet. Mit verschiedenen paarweisen Faktor VIII- und Faktor IX-Proben wurde eine Agarosegel-Elektrophorese an einer ICL-Immunoelektrophorese Platte durchgeführt, wobei ein Ziegen-Antihuman-Serum, geliefert von Hyland Diagnostics, als Standard verwendet wurde. Die Platten wurden spezifisch mit einer Buchler-Energieversorgungs- Apparatur bei 25 ma 35 Minuten lang der Elektrophorese unterworfen. Bei Beendigung der Elektrophorese wurden die Platten für 18 bis 24 Stunden in Antisera inkubiert und unter indirektem Licht untersucht. Mit zusätzlichen paarweisen Proben von Faktor VIII-Konzentrat wurde eine Panagell-Elektrophorese an einer Worthington-Diagnostic- Platte durchgeführt, wobei eine wassergekühlte Biorad- Elektrophorese-Zelle verwendet wurde.
Darüber hinaus wurde in vitro-Experimente, in denen lyophilisierte Proben von Faktor VIII-Konzentrat bei Raumtemperatur und bei vorbestimmten Temperaturen im Wasserbad über vorbestimmte Zeiträume erhitzt wurden, durchgeführt. Nach dem von Laurell in "Electroimmuno Assay", The Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, Bd. 29, S. 21-37 (1972) beschriebenen Verfahren wurde dann Faktor VIIIAg bestimmt. Die Faktor VIII-Ergebnisse wurden für Verdünnungen 1 : 40, 1 : 80, 1 : 100 und 1 : 200 berechnet, indem die Rockets der Laurell- Standardkurve gegen den Verdünnungsgrad aufgetragen wurden. Unbekannte wurden als Prozentgehalt eines Normalen, bezogen auf die Rockethöhen der Unbekannten in der Standardkurve, ausgedrückt.
Die in vivo-Wiedergewinnung der Gerinnungsfaktor-Aktivität für hitzebehandelte Konzentrate von Faktor VIII und von Faktor IX wurde gemessen, indem hitzebehandelte Faktor VIII- und Faktor IX-Konzentrate Hunden mit Hämophilie A und Hämophilie B injiziert wurden. Ein hitzebehandeltes lyophilisiertes Faktor IX-Konzentrat wurde außerdem einem Kontrollhund injiziert. Für jedes der Tiere wurden in verschiedenen Zeitabschnitten nach der Injektion die Laborwerte einschließlich Hct, Serumprotein, WBC, Thrombozytenzahl, Blutausstrich, Atmungsgeschwindigkeit, Körpertemperatur, Puls und Gerinnungsfaktor-Aktivität bestimmt.
Die Ergebnisse der mit Faktor VIII-Konzentrat durchgeführten Versuche sind in den Tabellen I und II zusammengefaßt: TABELLE I Messung der Gerinnungsfaktor-Aktivität nach der Hitzebehandlung von lyophilisiertem Faktor VIII-Konzentrat Partie Temperatur Zeit Verdünnung % Aktivität Kontrolle Bei hitzebehandelten Proben wurde im Vergleich zur Kontrolle ein Aktivitätsabfall von etwa 10% beobachtet. TABELLE I (Fortsetzung) Partie Temperatur Zeit Verdünnung % Aktivität Kontrolle geronnene Probe TABELLE I (Fortsetzung) Partie Temperatur Zeit Verdünnung % Aktivität geronnene Probe Kontrolle Anmerkung: Alle Zeit- und Temperaturangaben sind Näherungswerte. Nach der Hitzebehandlung bei höheren Temperaturen wurden zu einigen Konzentraten Mengen steriles Wasser gegeben, die über den Empfehlungen des Herstellers lagen, bis eine Solubilisierung erkennbar war.
* A-Partie wurde von Cutter Laboratories hergestellt;
B-Partie wurde von Michigan Red Cross hergestellt;
C-Partie wurde von Alpha Therapeutics hergestellt.
** In einem Trockenofen hitzebehandelt (Probe war aus dem Gläschen entfernt worden)
*** In einem Trockenofen hitzebehandelt (Probe war in einem Gläschen enthalten) TABELLE II Bestimmung von Faktor VIIIAg nach der Hitzebehandlung von lyophilisiertem Faktor VIII-Konzentrat Partie Temperatur Zeit Verdünnung Rocket-Höhe (mm) %Ag Kontrolle Anmerkung: Alle Zeit- und Temperatur-Angaben sind Näherungswerte. Nach der Hitzebehandlung bei höheren Temperaturen wurden zu einigen Konzentraten Mengen an sterilem Wasser zugegeben, die über den Empfehlungen des Herstellers lagen, bis eine Solubilisation erkennbar wurde.
* B-Partie wurde von Michigan Red Cross hergestellt; C- Partie wurde durch Alpha Therapeutics hergestellt.

DISKUSSION AUSGEWÄHLTER TESTERGEBNISSE

Die in den Tabellen I-II zusammengefaßten Ergebnisse können kombiniert werden, um eine relative Angabe über den Erhalt und die Wiedergewinnung der Gerinnungsaktivität in lyophilisierten Plasmafraktionen, die dem erfindungsgemäßen Hitzebehandlungsprozeß unterworfen worden waren, zu liefern. Insbesondere kann der Aktivitätsgrad oder die gemessene Wiedergewinnung bei verschiedenen Verdünnungen des rekonstituierten Faktors VIII für einzelne Kontrollproben gemittelt werden und mit dem in gleicher Weise gemittelten Aktivitätsgrad oder der gemessenen Wiedergewinnung in entsprechenden Probenpaaren von hitzebehandeltem Faktor VIII-Konzentrat verglichen werden. Wo solche Vergleiche angestellt wurden, kann gesehen werden, daß lyophilisiertes Faktor VIII-Konzentrat, das von einem Hersteller (Partie Nr. A C-1081) erhalten worden war und das 10 Stunden lang auf 60ºC erhitzt worden war, verglichen mit einer nicht erhitzten Kontrolle mehr als 90% seiner in vitro-Faktor VIII-Gerinnungsaktivität beibehielt. Das zur ursprünglichen Konzentration gelöste, hitzebehandelte Faktor VIII- Konzentrat zeigte außerdem eine Extinktion von 0,30 bei 580 nm im Vergleich zu einer Extinktion von 0,20 der nicht erhitzten Kontrollprobe, und auf die ursprüngliche Konzentration verdünnte Faktor VIII-Konzentrate aus einer anderen Partie (Partie Nr. A NC-8747) des gleichen Herstellers, die in lyophilisierter Form für annähernd 16 Stunden bei 62º bis 64ºC erhitzt und dann für 7 Tage bei 6ºC gelagert worden waren, zeigten im Vergleich zu einer nichterhitzten Kontrollprobe eine Wiedergewinnung der Faktor VIII-Gerinnungsaktivität von mehr als 80%. Bei der Immunelektrophorese gegen Ziegen-Antihuman-Serum wurde relativ zur nichterhitzten Kontrollprobe insgesamt ein Anstieg der anodalen Wanderung festgestellt.
In gleicher Weise zeigten lyophilisierte Faktor VIII- Konzentrate, die von einem zweiten Hersteller bezogen worden waren, wenn sie für 21 Stunden auf annähernd 78ºC erhitzt worden waren, in vitro einen Erhalt der Gerinnungsaktivität von 62%, verglichen mit einer nichterhitzten Kontrollprobe. Ein auf ursprüngliche Konzentration verdünntes Faktor VIII- Konzentrat aus der gleichen Partie des zweiten Herstellers behielt im Vergleich zu einer nichterhitzten Kontrolle nach Hitzebehandlung in lyophilisierter Form über 20 Stunden bei annähernd 80ºC in vitro noch 57% Gerinnungsaktivität, wohingegen auf die ursprüngliche Konzentration verdünnter Faktor VIII aus der gleichen Partie des zweiten Herstellers, welches vorher in lyophilisierter Form 1,5 Stunden bei annähernd 100ºC erhitzt worden war, in vitro annähernd 52% Gerinnungsaktivität, verglichen mit einer nichterhitzten Kontrolle, beibehielt. Wenn eine andere Partie (Partie Nr. C A1-1150) von lyophilisiertem Faktor VIII-Konzentrat des zweiten Herstellers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hitzebehandelt worden war, lag die in vitro- Wiedergewinnung der Gerinnungsaktivität im Vergleich zu der nichterhitzten Kontrolle im Bereich von 67% bei einer Hitzebehandlung von 26 Stunden und 20 Minuten bei 65ºC bis 34% für eine Hitzebehandlung von 24 Stunden bei 83ºC, bis 55% bei einer Hitzebehandlung von 24 Stunden bei 85ºC. Messungen des Faktor VIII-Antigens bei zwei Proben von Faktor VIII-Konzentrat, das bei 83ºC bzw. 85ºC hitzebehandelt worden war, zeigten einen 15%igen Verlust im Antigengehalt. Es sollte erwähnt werden, daß eine merklich verbesserte Löslichkeit der letztgenannten Probe des hitzebehandelten Faktor VIII-Konzentrats erreicht wurde, wenn zwischen 50 ml und 70 ml steriles Wasser anstatt der vom Hersteller empfohlenen 25 ml zu der Probe gegeben wurden.
Eine Hitzebehandlung von lyophilisierten Faktor VIII-Proben, die von einem dritten Hersteller (Partie Nr. AHF-355) bezogen worden waren, bestätigte die für die ersten beiden Hersteller erhaltenen Ergebnisse. Das heißt, eine Hitzebehandlung von lyophilisiertem Faktor VIII-Konzentrat eines dritten Herstellers bei 64ºC über 20 Stunden führte zu einer 61%igen Rückgewinnung der Gerinnungsaktivität, verglichen mit einer nichterhitzten Kontrollprobe, eine Hitzebehandlung des gleichen Konzentrats über 17 Stunden bei 74ºC führte zu einer 63%igen Rückgewinnung der Gerinnungsaktivität, und eine Hitzebehandlung des gleichen Konzentrats bei 76ºC über 17 Stunden führte zu einer 57%igen Rückgewinnung der Gerinnungsaktivität. Die Faktor VIII-Antigen-Level in den auf die ursprüngliche Konzentration verdünnten Proben, die auf 64ºC bzw. 74ºC erhitzt worden waren, zeigten im Vergleich zum Level der nichterhitzten Kontrolle keine Abnahme.
Wie vorher angegeben wurde, wurde die in vivo-Untersuchung der hitzebehandelten Faktor VIII-Konzentrate an Hunden, die an Hämophilie A oder Faktor VIII-Mangel erkrankt waren, durchgeführt. Der Hämophilie A-Hund erhielt auf die ursprüngliche Konzentration verdünntes Faktor VIII- Konzentrat, welches vorher in lyophilisierter Form bei 60ºC über 10 Stunden hitzebehandelt worden war. Die Ergebnisse der in vivo-Untersuchung sind in der untenstehenden Tabelle V aufgeführt. TABELLE V Hund mit F-VIII-Mangel, der hitzebehandeltes Faktor VIII-Konzentrat erhielt Protein Thrombozyten Temp. Atmung Puls Infusion 20 ml gegeben in 3,5 min Keuchen
Die in Tabelle V angegebenen Ergebnisse veranschaulichen ausgiebig das deutliche Ansteigen der Faktor VIII- Gerinnungsaktivität bei einem Hämophilie A-Hund nach einer Injektion von hitzebehandeltem Faktor VIII-Konzentrat. Das offensichtliche Fehlen von physiologischem Stress oder einer anderen nachteiligen Reaktion, was aus den Daten der Tabelle V ersichtlich ist, legt nahe, daß Faktor VIII-Konzentrate, welche nach den Schritten der vorliegenden Erfindung behandelt worden sind, biologisch akzeptabel bleiben.
Es ist nun demonstriert worden, daß Plasmafraktionen, wie z. B. Faktor VIII-Konzentrate unterschiedlicher Reinheit in lyophilisierter Form bei erhöhten Temperaturen über ausgedehnte Zeiträume sicher hitzebehandelt werden können, ohne daß die Gerinnungsaktivität der Konzentrate merklich zerstört wird. Visuelle Beobachtungen bestätigen, daß die Löslichkeit von lyophilisierten Faktor VIII-Konzentraten durch die Hitzebehandlung nicht nachteilig beeinträchtigt wird, insofern als die Menge an sterilem Wasser, die während der Verdünnung auf die ursprüngliche Konzentration zugesetzt wird, einfach erhöht werden kann, bis eine vollständige Lösung erreicht ist.
Es sollte darüber hinaus aus der Extrapolation der in den Tabellen I-II angegebenen Testergebnisse klar werden, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung an im wesentlichen irgendeinem Punkt im Verlauf des Plasma- Fraktionierungsprozesses durchgeführt werden kann. Das heißt zu irgendeinem Zeitpunkt während des Fraktionierungsprozesses, wo ein Plasmaderivat lyophilisiert werden kann, kann die Hitzebehandlung des Plasmaderivates durchgeführt und das Derivat wieder gelöst oder zur ursprünglichen Konzentration verdünnt werden, bevor der Fraktionierungsprozeß fortgesetzt wird. Wenn Faktor VIII-Konzentrat schließlich nach einem Plasmafraktionierungs-Schema wie z. B. jenem, das von Mammen et al., in "Treatment of Bleeding Disorders with Blood Components", Reviews of Hematology, Bd. 1, S. 144 (1980) offenbart ist, abgeleitet worden ist, können demnach Cryopräzipitat, das aus frischem gefrorenem Plasma erhalten worden ist, geklärter Extrakt, der aus Cryopräzipitat erhalten worden ist sowie Überstand, der von dem geklärten Extrakt erhalten worden ist, lyophilisiert und in der gleichen Weise wie Faktor VIII-Konzentrat selbst hitzebehandelt werden. Die Auswahl eines geeigneten Punktes zur Anwendung der Hitzebehandlung im Plasmafraktionierungs- Schema kann auf pragmatischen Betrachtungen beruhen wie z. B. Kosten oder Bequemlichkeit.
Beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung sind die Inaktivierung unerwünschter Viren, z. B. des Cytomegalovirus und des Epstein-Barr-Virus.
Ferner können verschiedene Trocknungstechniken auf die Plasmazusammensetzungen wie z. B. Plasmafraktionen, angewendet werden, nämlich Sprühtrocknung oder Vakuumtrocknung.
Die Zugabe von sterilem Wasser zu trockenem oder lyophilisiertem Plasma in größeren Mengen als die durch die Hersteller vorgeschlagenen Volumen, führt zu Plasmalösungen einer größeren Verdünnung als normalerweise empfohlen; allerdings wird die Wirksamkeit des Plasmas und seiner Bestandteile dadurch nicht merklich verschlechtert. Dies ist insbesondere nützlich, wenn die Temperatur, auf welche die Plasmazusammensetzung erhitzt werden soll, um unerwünschte Viren zu inaktivieren, so hoch ist, daß normalerweise eine Gerinnung des auf die normale Konzentration verdünnten Plasmas eintreten würde, wenn kein Überschuß an sterilem Wasser zugegeben würde.
Eine besonders bedeutende Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Behandlung von AHF-angereicherten Zusammensetzungen. Derartige Zusammensetzungen enthalten AHF-Konzentrationen, bezogen auf das gesamte Proteingewicht, welche jene Konzentrationen übersteigen, die in Plasma oder anderen herkömmlichen Plasmaproteinfraktionen wie z. B. Prothrombin-Komplex (Faktor IX-Konzentrate), Gammaglobulin, Albumin, Fibrinogen oder Antithrombin III gefunden wurden. Derartig hohe AHF-Konzentrationen werden benötigt, um sicherzustellen, daß, wenn die Zusammensetzung in Wasser oder einem anderen physiologisch akzeptablen Träger gelöst werden, sie die Gerinnungsanomalie des Patienten ausreichend korrigieren können, um einen vorteilhaften klinischen Effekt zu erzielen, ohne daß die Infusion von überschüssigem Wasser oder Fremdproteinen erforderlich ist. Im allgemeinen kann die therapeutisch wirksame Dosis an AHF leicht vom Fachmann bestimmt werden. Sie hängt vom klinischen Zustand des Patienten, insbesondere vom Bluttyp, mit dem der Patient in Kontakt gebracht wird, ab. Üblicherweise sollte eine Infusion ausreichend AHF enthalten, um im Patientenplasma einen AHF-Spiegel herzustellen, der mindestens 30% von jenem eines normalen Menschen beträgt, obwohl bei ernsten Hämorrhagien Spiegel von 50% oder mehr bevorzugt sind. Dies kann durch Infusion einer Gesamtzahl von AHF-Einheiten erreicht werden, die wie folgt berechnet wird: Erforderliche Einheiten = Körpergewicht (kg) · 0,4 · gewünschter AHF- Anstieg (in % des normalen Wertes).
Die AHF-Konzentration in der Infusionslösung sollte vorzugsweise 34 Einheiten pro ml nicht übersteigen, sollte aber größer als 15 Einheiten pro ml sein. Wenn die Konzentration 34 Einheiten pro ml übersteigt, sollten nicht mehr als 2 ml pro Minute infusiert werden. Infusionslösungen mit weniger als 34 AHF-Einheiten können schneller infusiert werden, und zwar mit etwa 10 bis 20 ml in einem Zeitraum von 3 Minuten. Eine AHF-Einheit ist definiert als die Aktivität von AHF, die in 1 ml normalem Pool-Humanplasma, das weniger als eine Stunde alt ist, vorhanden ist.
Die AHF-angereicherten Zusammensetzungen enthalten mehr als etwa 20 AHF-Einheiten, üblicherweise mehr als 300 AHF- Einheiten/Gramm Protein. Je größer die AHF-Reinheit ist, umso begehrter ist natürlich das Produkt. Zusammensetzungen, die etwa zwischen 100 und 200 AHF-Einheiten/Gramm Protein enthalten, sind im Handel am günstigsten.
Die AHF-Zusammensetzungen können von anderen Plasmaproteinen befreit werden, um den Gehalt in Abhängigkeit vom angewandten Verfahren während des Reinigungsverfahrens zu variieren. Derartige Plasmaproteine umfassen die Blutgerinnungsenzyme (damit sind sowohl die inaktiven Proenzyme als auch die aktivierten Enzyme gemeint) wie z. B. den Prothrombin-Komplex oder Faktor IX-Konzentrat (Faktoren II, VII, IX und X), die Faktoren XII oder XIII, Fibrinogen, Albumin und Gammaglobulin. Wenn eine AHF-Zusammensetzung im wesentlichen frei von Blutgerinnungsenzymen ist, enthält sie subtherapeutische Aktivitäten der Enzyme. Die AHF- Zusammensetzungen können bis zu einem Grad gereinigt werden, bei dem die Aktivität eines Blutgerinnungsenzyms im Spurenbereich liegt, im allgemeinen weniger als etwa 15 Einheiten/Gramm Protein und vorzugsweise weniger als 5 Einheiten/Gramm Protein ist. Das Verhältnis von AHF- Einheiten zu einer einzelnen Enzym-Aktivitätseinheit in solchen Zusammensetzungen liegt normalerweise im Bereich von 10 : 1 bis 500 : 1 und ist vorzugsweise größer als 300 : 1. Eine Einheit Enzymaktivität für jedes der verschiedenen Gerinnungsenzyme in ihrer aktivierten oder Proenzym-Form ist in der internationalen PCT-Anmeldung WO 82/03871 (veröffentlicht 11. November 1982) definiert.
Die hier genannten hitzebehandelten AHF-Zusammensetzungen werden hauptsächlich an Patienten mit angeborenem AHF-Mangel verabreicht. Diese Patienten können kein biologisch aktives AHF synthetisieren und sind von denen zu unterscheiden, die erworbene AHF-Inhibitoren (vermutlich Antikörper) haben, welche ebenfalls die Symptome der Hämophilie verursachen. Die zuletzt genannte Gruppe wird vorzugsweise mit Zusammensetzungen aktivierter Gerinnungsenzyme behandelt. Die Gerinnungsenzym-Zusammensetzungen enthalten therapeutisch wirksame Mengen der Enzyme. Die hier genannten Zusammensetzungen werden im allgemeinen keine derartigen Mengen an Blutgerinnungsenzymen enthalten, sondern stützen sich statt dessen hauptsächlich auf die AHF-Aktivität zur Hämostase.
Die erfindungsgemäßen verbesserten AHF-Zusammensetzungen enthalten niedrigere Mengen an denaturiertem AHF als die, die unter Verwendung älterer Verfahren hergestellt werden. Im allgemeinen liegt die Menge an denaturiertem AHF unter etwa 50% des gesamten aktiven und denaturiertem AHF in der Zusammensetzung. Vorzugsweise beträgt sie etwa 30 bis 10%. Die Menge an denaturiertem AHF entspricht dem prozentualen Verlust an AHF-Einheiten, nachdem die mit Virus infizierte AHF-Zusammensetzung dem erfindungsgemäßen Erhitzungsverfahren unterworfen worden ist.
Die Wirkung des Erhitzens der mit Virus kontaminierten AHF in trockenem Zustand kann durch Bestimmung der AHF- Gerinnungsaktivität, wie oben beschrieben, und des viralen Titers verfolgt werden. Wo es schwierig ist, den biologisch aktiven viralen Titer zu messen, wie im Fall der Hepatitis- Viren, kann ein Virus-Kandidat wie z. B. ein Bakteriophage, Sindbis, Adenovirus oder EHC-Virus verwendet werden, wie es in der internationalen PCT-Anmeldung WO 82/03871 (veröffentlicht am 11. November 1982) offenbart ist. Eine Lösung der Zusammensetzung, die hitzebehandelt werden soll, wird mit einem vorbestimmtem Titer des Viruskandidaten geimpft, die Lösung wird lyophilisiert und verschiedenen Hitzebehandlungen unterworfen. Man wählt den Punkt, bei dem die aktuellen Messungen oder die Regressionsanalyse (statistische Extrapolation) den gewünschten Grad der viralen Inaktivierung angeben sowie die Bedingungen, welche für die Hitzebehandlung des Produktes maßgebend sind. Diese Bedingungen werden im allgemeinen Zeit und Temperatur der viralen Inaktivierung sein, obgleich der Feuchtigkeitsgehalt der Zusammensetzung ebenfalls eine Variable darstellt, welche gesteuert werden sollte. Zeit und Temperatur sind wie oben angegeben. Der Feuchtigkeitsgehalt sollte unter 5 Gew.-%, normalerweise unter 1 Gew.-% liegen.
Obgleich eine Inaktivierung und Denaturierung von AHF bei einem Erhitzungsprozeß in trockenem Zustand vonstatten geht, erfolgt sie mit geringerer Geschwindigkeit als die Inaktivierung selbst der robusteren Virus-Kandidaten oder des Hepatitis-Virus. Die infizierte AHF-Zusammensetzung kann demnach im wesentlichen von dem Virus in infektiöser Form befreit werden. Das bedeutet, daß der Virustiter so erniedrigt ist, daß eine Infusion therapeutischer Mengen des Produktes bei einer Mehrzahl von normalen tierischen Wirten nicht dazu führt, daß der Virus klinische oder serologische Anzeichen einer Infektion in einer Wirtpopulation erzeugen kann, oder daß der Ausbruch der Infektion in einer solchen Population deutlich verzögert ist. Wo ein entsprechender Gewebekultur-Versuch zur Bestimmung der biologischen Infektiosität verfügbar ist, kann dieser anstelle der normalen tierischen Wirte zur Anzeige einer Infektiosität verwendet werden.
Das hier beschriebene milde Erhitzungsverfahren im trockenen Zustand erhält im wesentlichen die ganze Antigenität der infektiösen Mikroben, d. h. die epitopischen Stellen im Organismus werden nicht irreversibel denaturiert. Dies steht im Gegensatz zu anderen Verfahren, welche kovalente Reaktionen mit chemischen Substanzen, Bestrahlen mit hoher Energie oder übermäßiges Erhitzen umfassen.
Der Erhitzungsschritt kann in geschlossenen oder offenen Behältern durchgeführt werden, wie oben angemerkt, und kann am wirksamsten durch einfache kostengünstige Techniken durchgeführt werden, wie z. B. Kontakterhitzen der Produktbehälter wie in Öfen oder Wasser- oder Sand-Bädern oder durch Infrarotbestrahlung. Aus Gründen der Sicherheit und aus Kostengründen wird die Erhitzung durch Mikrowelle nicht bevorzugt.
Im vorstehenden wurden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erläutert.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung einer im wesentlichen trockenen Zusammensetzung, die menschlichen Faktor VIII enthält, um die Infektiosität von Cytomegalovirus oder Epstein-Barr-Virus, der in der Zusammensetzung vorhanden ist, zu vermindern oder zu eliminieren, umfassend Erhitzen der. Zusammensetzung über einen vorbestimmten Zeitraum bei einer Temperatur von 100 bis 110ºC, um die Infektiosität des Virus zu vermindern oder zu eliminieren.

2. Verfahren zur Behandlung einer im wesentlichen trockenen Zusammensetzung, die menschlichen Faktor VIII enthält, um die Infektiosität von Cytomegalovirus oder Epstein-Barr-Virus, der in der Zusammensetzung vorhanden ist, zu vermindern oder zu eliminieren, umfassend Erhitzen der Zusammensetzung über einen vorbestimmten Zeitraum bei einer Temperatur zwischen 60ºC und 125ºC umfaßt, um die Infektiosität des Virus zu vermindern oder zu eliminieren, wobei im wesentlichen die ganze Antigenität des Virus erhalten bleibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung Faktor VIII-Konzentrat ist.

4. AHF-angereicherte Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Blutungskrankheiten; wobei die Zusammensetzung, die ein im wesentlichen von Blutgerinnungsenzymen freies Konzentrat des menschlichen Faktors VIII enthält und die durch Erhitzen über einen vorbestimmten Zeitraum in der lyophilisierten Form bei einer Temperatur zwischen 60ºC und 125ºC behandelt worden ist, dadurch gekennzeichnet ist, daß der menschliche Faktor VIII vor und nach dem Erhitzen eine AHF-Reinheit von mehr als etwa 300 AHF-Einheiten/Gramm Protein hat, und daß die Zusammensetzung erhitzt worden ist, um Cytomegalovirus zu inaktivieren, und daß der Cytomegalovirus im wesentlichen inaktiviert worden ist.

5. AHF-angereicherte Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Blutungskrankheiten; wobei die Zusammensetzung, die ein im wesentlichen von Blutgerinnungsenzymen freies Konzentrat des menschlichen Faktors VIII enthält und durch Erhitzen über einen vorbestimmten Zeitraum in der lyophilisierten Form bei einer Temperatur zwischen 60ºC und 125ºC vorbehandelt worden ist, dadurch gekennzeichnet ist, daß der menschliche Faktor VIII vor und nach dem Erhitzen eine AHF-Reinheit von mehr als etwa 300 AHF-Einheiten/Gramm Protein hat und daß die Zusammensetzung erhitzt worden ist, um einen Epstein-Barr- Virus im wesentlichen zu inaktivieren, und daß der Epstein- Barr-Virus im wesentlichen inaktiviert worden ist.