DE3781962T2 - Verfahren zur hitzebehandlung von chemisch unmodifiziertem gamma-globulin. - Google Patents
Verfahren zur hitzebehandlung von chemisch unmodifiziertem gamma-globulin.Info
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Wärmebehandeln einer chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin enthaltenden wässrigen Lösung. Insbesondere bezieht sie sich auf ein Verfahren zum Wärmebehandeln von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin in Anwesenheit eines bestimmten Stabilisators, ohne Ansteigen des Polymergehaltes oder Ansteigen eines Antikomplement-Titers zu bewirken oder die Aktivitäten des chemisch unmodifizierten gamma-Globulins zu beeinträchtigen.
- Von den chemisch unmodifizierten Immunglobulinen, die Plasmaproteinkomponenten sind, sind chemisch unmodifizierte gamma-Globulin-Zubereitungen, die hauptsächlich IgG enthalten, in breitem Umfang für die Vorsorge und Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten verwendet worden. Das chemisch unmodifizierte gamma-Globulin ist wegen fehlender Wärmestabilität und dem Einschluss einer grossen Zahl von Antikörpern für verschiedene Viren und Bakterien nicht wärmesterilisiert worden.
- Jedoch kann bei Erhalt von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin aus einer Plasmaproteinfraktion nicht ausgeschlossen werden, dass Verunreinigungsviren, wie beispielsweise ein Hepatitisvirus, in den Präparationen eingeschlossen sein können. Deshalb hat Wärmesterilisation der Präparationen eine grosse Bedeutung im Hinblick auf die Inaktivierung von Verunreinigungsviren.
- Das Problem ist, dass chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin, wenn es in einer normalen wässrigen Lösung, beispielsweise physiologischer Kochsalzlösung, erhitzt wird, innerhalb kurzer Zeit weiss-trüb wird, wobei dieses zur wesentlichen Desaktivierung aufgrund von Proteindenaturierung führt.
- Die EP-A-0 058 993 stellt ein Verfahren zum Wärmebehandeln einer unlösliches Globulin enthaltenden wässrigen Lösung zur Verfügung. Dieses wird in Anwesenheit eines Stabilisators, wie beispielsweise Sorbit, durchgeführt. Der Stabilisator kann in einer Menge von 10 bis 50 % G/V vorhanden sein, und der pH-Wert der zu behandelnden Lösung beträgt vorzugsweise 5 bis 10.
- Als Ergebnis umfangreicher Untersuchungen ist jetzt festgestellt worden, dass, wenn eine chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin enthaltende wässrige Lösung im Hinblick auf eine Inaktivierung von Verunreinigungsviren, beispielsweise ein Hepatitisvirus und ein Aids-Virus, erhitzt wird, die Zugabe von Sorbit zu der Lösung die Wärmestabilität des chemisch unmodifizierten gamma-Globulins beträchtlich verbessert. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieses Ergebnisses vollendet worden.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Wärmebehandeln von gamma-Globulin, umfassend den Schritt des Wärmebehandelns einer wässrigen Lösung, die chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin und 10 bis 70 g Sorbit pro 100 ml der wässrigen Lösung enthält; die wässrige Lösung weist eine Ionenstärke von 0,01 oder weniger und einen pH-Wert von 4,5 bis 6,5 auf.
- Das chemisch unmodifizierte gamma-Globulin, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, ist durch folgendes gekennzeichnet: (1) es bleibt intakt, ohne modifiziert oder verändert zu werden, so dass es keine Fragmente von gamma-Globulin, beispielsweise Fab, F(ab')&sub2;, Fc, etc. enthält; (2) es erleidet keine Verminderung im Hinblick auf Komplementtiter oder Antikörperspektrum; und (3) seine Antikomplementäraktivität (Inhibierungswirkung im Hinblick auf das Komplement) ist beträchtlich niedriger als 20 Einheiten (CH 50-Wert), wobei dieses als ein sicheres Niveau auf der Grundlage des Japan Biological Product Standard gemäss Notification Nr. 159 (Oktober 1985), erlassen vom Ministerium für Öffentliche Wohlfahrt in Japan, angesehen wird.
- Bei der vorliegenden Erfindung kann nach jedem Verfahren hergestelltes, chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin verwendet werden, solange es einen natürlichen Zustand und einen niedrigen Antikomplementtiter hat. Das wirksamste Verfahren zum Erhalt von derartigem, chemisch unmodifizierten gamma-Globulin umfasst die Säurebehandlung von gamma-Globulin für intramuskuläre Injektion, welches unter Verwendung häufig verwendeter Ausrüstungen hergestellt werden kann und schon für medizinische Zwecke verwendet wird, zur Abtrennung von Agglomeraten. Wenn die Komplexität der Behandlung oder der Ausbeute keine Rolle spielt, werden gamma- Globulin-Agglomerate, welche Antikomplementäraktivität bewirken, vorzugsweise unter Verwendung nicht-ionischer, oberflächenaktiver Mittel unter Erhalt von gamma-Globulin mit einem niedrigen Antikomplementtiter entfernt.
- Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung ist auf jede wässrige Lösung, die chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin mit einem unbegrenzten Reinigungsgrad enthält, anwendbar. Insbesondere wird eine teilweise gereinigte oder hochgereinigte wässrige Lösung vorteilhaft verwendet. Der Proteingehalt (chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin) in der wässrigen, wärmezubehandelnden Lösung ist nicht besonders begrenzt, aber liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 30 Gew./Vol.%. Die wässrige Lösung hat einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 6,5 und wird vorzugsweise mit einer geeigneten Pufferlösung, wie beispielsweise einer Phosphatpufferlösung, einer Zitratpufferlösung, einer Acetatpufferlösung, etc. unter Erhalt eines pH-Wertes zwischen 5 und 6 eingestellt.
- Die Menge des als Stabilisator hinzuzufügenden Sorbits liegt im Bereich von 10 bis 70 g, vorzugsweise im Bereich von 30 bis 70 g und bevorzugter im Bereich von 40 bis 60 g pro 100 ml der wässrigen Lösung von chemisch unmodifizierten gamma-Globulin.
- Die zu erwärmende wässrige Lösung von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin hat eine niedrige Ionenstärke von nicht höher als 0,01 und am bevorzugtesten von nicht höher als 0,001.
- Die Wärmebehandlung gemäss der vorliegenden Erfindung kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die ausreichend sind, um Verunreinigungsviren zu inaktivieren. Genauer ausgedrückt heisst das, sie wird bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 70ºC, und bevorzugt etwa 60ºC und innerhalb einer Zeitdauer von 10 Minuten bis 20 Stunden und vorzugsweise etwa 10 Stunden durchgeführt.
- Um die Wirkungen der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen, wurden Experimente im Hinblick auf Wärmebehandlung mit oder ohne erfindungsgemässen Stabilisator nach Übertragung verschiedener Viren, die dazu neigen, in Präparaten von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin vorhanden zu sein, durchgeführt. Bei den Experimenten wurde eine Probe von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin, zu der jeweils Variolavirus, Mumpsvirus, Masernvirus, Vesicular stomatitis-Virus, Chikungnyavirus, Poliovirus, Coxsackievirus und Echovirus hinzugefügt worden waren, 10 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit des Stabilisators bei 60ºC erwärmt, und die Virusübertragbarkeit wurde im Laufe der Zeit untersucht. Als Ergebnis zeigte sich, dass die Viren vollständig ihre infektiöse Wirkung durch 10-stündige Wärmebehandlung verlieren, unabhängig davon, ob der Stabilisator vorhanden ist oder nicht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wärmebehandlung gemäss der vorliegenden Erfindung andere Viren als die getesteten inaktivieren würde, und dass die Virusübertragbarkeit ausreichend durch mehrminütige Wärmebehandlung reduziert werden kann.
- Die Testproben, die die Wärmebehandlung erhalten hatten, wurden im Hinblick auf Aussehen, Eigenschaften, Polymergehalt, Antikomplementtiter, Masern-Antikörpertiter und akute Toxizität untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass Präparationen von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin, die gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt worden sind, sehr sicher und wirksam im Hinblick auf medizinische Verwendung sind.
- Die gemäss dem Verfahren dieser Erfindung erhaltenen Präparationen liegen üblicherweise in Form einer Lösung vor. In dem Fall, dass ein Rohmaterial verwendet wird, wird die auf diese Weise behandelte Lösung auf übliche Art gereinigt und kann gewünschtenfalls der Dialyse oder Filtration unter Entfernung von Bakterien ausgesetzt werden. Die gereinigte Lösung wird anschliessend in Phiolen gegossen, so dass jede Phiole 500 bis 10.000 mg chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin enthält. Die Präparationen werden unter Umgebungsbedingungen aufbewahrt und vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb 30ºC. Gewünschtenfalls können die Präparationen gefriergetrocknet werden.
- Die wärmebehandelten Präparationen von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin können als solche verabreicht werden oder nach einer angemessenen bekannten Behandlung, beispielsweise nach einer Verdünnung mit injizierbarem, destillierten Wasser, oder nachdem sie in injizierbarem destillierten Wasser gelöst worden sind. Der Dosisspiegel von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin liegt üblicherweise im Bereich von 2500 bis 5000 mg/Dosis für Erwachsene oder im Bereich von 100 bis 150 mg/kg Körpergewicht/Dosis für Kinder.
- Die chemisch unmodifizierten gamma-Globulinpräparationen, die gemäss der vorliegenden Erfindung wärmebehandelt worden sind, enthalten Verunreinigungsviren, beispielsweise Hepatitisvirus, einen Aids-Virus etc., im wesentlichen in inaktivierter Form, während sie hohe Aktivitäten des chemisch unmodifizierten gamma-Globulins beibehalten. Deshalb werden diese Präparationen in zufriedenstellendem Masse von der Infektionsmöglichkeit durch Viren verschont.
- Darüber hinaus ist das wärmebehandelte, chemisch unmodifizierte gamma-Globulin gemäss der vorliegenden Erfindung ausgezeichnet im Hinblick auf Wasserlöslichkeit, so dass dessen wässrige Lösung zufriedenstellende Lösungsstabilität beibehält. Darüber hinaus ist die Wärmebehandlung gemäss der vorliegenden Erfindung wirksam im Hinblick auf eine Inhibierung der Bildung von polymeren Substanzen und der Verminderung der Zunahme von Antikomplementtiter. Somit eignet sich die Wärmebehandlung gemäss der vorliegenden Erfindung sehr zum Herstellen injizierbarer Lösungen für die intravenöse Verabreichung.
- Die vorliegende Erfindung wird jetzt detaillierter anhand der nachfolgenden Beispiele und Testbeispiele veranschaulicht. Das Testen in diesen Beispielen wurde gemäss der nachfolgenden Verfahren durchgeführt.
- Die Trübung wurde mittels Absorption (optische Dichte) bei 600 nm bestimmt.
- Bestimmt mittels Hochflüssigkeitschromatograie.
- Ein Antikomplementtiter wurde in Übereinstimmung mit dem in Capat und Mayer, Experimental Immunochemistry, 225 (1961) oder Nishioka und Okada, Men-eki no Seikagaku, 103, Kyoritsu Shuppan (1971) beschriebenen Verfahren gemessen. Das heisst, eine Probe wurde zu 100 Einheiten eines Komplements hinzugefügt und die Komplementabnahme wurde bestimmt, wobei diese als Antikomplementtiter genommen wurde.
- Bestimmt in Übereinstimmung mit einem Testverfahren der Hämagglutinierungsinhibierung und ausgedrückt als internationale Einheit (IE/150 mg).
- Zu 1 kg einer Cohn-Fraktion II + III wurden 10 l einer wässrigen 0,001 M Natriumchloridlösung gegeben. Nachdem die Lösung auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt worden war, wurde PEG #4000 bis zu einer Endkonzentration von 8 Gew./Vol.% hinzugefügt. Die sich ergebende Mischung wurde einer Zentrifugation bei 2ºC ausgesetzt.
- Die überstehende Flüssigkeit wurde mit wässriger 1 N Natriumhyroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, und PEG #4000 wurde bis zu einer Endkonzentration von 12 Gew./Vol.% hinzugegeben, wobei anschliessend bei 2ºC unter Sammeln einer IgG-Fraktion zentrifugiert wurde. Die IgG-Fraktion wurde in Wasser bis zu einer IgG-Konzentration von 7 Gew./Vol.% gelöst und die wässrige Lösung wurde auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Die sich ergebende wässrige Lösung wurde mit DEAE-Sephadex mit einer Rate von 50 ml/ml DEAE-Sephadex bei einer Temperatur von 0 bis 4ºC etwa 1 Stunde in Kontakt gebracht, wobei anschliessend unter Erhalt eines Überstandes zentrifugiert wurde.
- Ein 100 ml-Anteil der sich ergebenden, IgG enthaltenden, überstehenden Flüssigkeit wurde durch eine Säule gegeben, die mit 5 ml Benzamidin-sephalose (hergestellt von Pharmacia Co.) gefüllt war, und durch eine Säule, die mit 3 ml Formyl Cellulofine (Seikagaku Kogyo Co., Ltd.), einer menschlichen Blutgruppensubstanz, gefüllt war, wodurch ein menschlicher Blutgruppen-Antikörper mittels Adsorption entfernt wurde. Der Blutgruppen-Antikörper verringerte sich durch die Adsorption von (1:32) auf (1:2).
- Die ausfliessende Fraktion (nicht-adsorbierte Fraktion), die chemisch unmodifiziertes gamma-Globulin enthielt, wurde auf eine Konzentration von 5 Gew./Vol.% eingestellt, und Sorbit als Stabilisator wurde bis zu einer Konzentration von 20 Gew./Vol.% (20 g Sorbit pro 100 ml gamma- Globulinlösung) hinzugegeben. Die Lösung wurde anschliessend einer 1-stündigen Wärmebehandlung bei 60ºC ausgesetzt, wobei ihre Ionenstärke und ihr pH-Wert, wie in Tabelle 1 gezeigt, variiert wurden.
- Zu Vergleichszwecken wurden Proben auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass kein Stabilisator hinzugefügt wurde und keine Wärmebehandlung durchgeführt wurde. Jede der auf diese Weise hergestellten Proben wurde mittels der zuvor beschriebenen Verfahren untersucht, und die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
- Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die Wärmestabilität von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin durch Wärmebehandlung in Anwesenheit von Sorbit verbessert werden kann, und dass die Wirkung im Hinblick auf die Verbesserung der Wärmestabilität durch Einstellen der wässrigen Lösung von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin auf eine Ionenstärke von 0 bis 0,01, und insbesondere 0,001 oder weniger, und auf einen pH-Wert von 4,5 bis 6,5, und insbesondere von 5 bis 6 gewährleistet werden kann. TABELLE 1 Polymergehalt (Gew. %) Ionenstärke Sorbitkonzentration (Gew./Vol.%) Wärmebehandlung Optische Dichte (600 nm) Polymer Dimer Monomer Antikomplementtiter nicht hinzugegeben nicht durchgeführt leichte Trübung weisse Trübung FORTSETZUNG TABELLE 1 Polymergehalt (Gew. %) Ionenstärke Sorbitkonzentration (Gew./Vol.%) Wärmebehandlung Optische Dichte (600 nm) Polymer Dimer Monomer Antikomplementtiter nicht hinzugegeben nicht durchgeführt weisse Trübung leichte Trübung
- Zu der wie in Beispiel 1 hergestellten Lösung von chemisch unmodifiziertem gamma-Globulin (Konzentration des chemisch unmodifizierten gamma-Globulins: 5 Gew./Vol.%) wurde Sorbit in der in Tabelle 2 angegebenen Menge gegeben. Die sich ergebende Lösung wurde über die in der Tabelle gezeigte Zeitdauer auf 60ºC gehalten. Jede der auf diese Weise erhaltenen Proben wurde in Übereinstimmung mit den zuvor beschriebenen Testverfahren geprüft, und die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle aufgeführt.
- Wie aus der Tabelle 2 ersichtlich ist, zeigen Systeme, die 10 g/dl Sorbit enthalten, innerhalb 1 Stunde nach der Wärmebehandlung weisse Trübung und unterliegen der Denaturierung, Bildung von Polymeren, und einem Anstieg von Antikomplementtiter, wobei dieses von dem pH-Wert des Systems abhängt. Andererseits zeigen Systeme, die 15 g/dl Sorbit enthalten, verbesserte Wärmestabilität. TABELLE 2 Polymergehalt (Gew.%) Menge an Sorbit * (g/dl) Erwärmungszeit (60ºC) (h) Polymer Dimer Monomer Antikomplementtiter Antitkörpertiter (IE) nicht hinzugegeben nicht durchgeführt leichte Trübung FORTSETZUNG TABELLE 2 Polymergehalt (Gew.%) Menge an Sorbit * (g/dl) Erwärmungszeit (60ºC) (h) Polymer Dimer Monomer Antikomplementtiter Antitkörpertiter (IE) leichte Trübung ANMERKUNG: * Gramm pro 100 ml einer wässrigen gamma-Globulin-Lösung
- Jede der bei einem pH-Wert von 5 in Beispiel 1 wärmebehandelten Proben wurde gründlich gegen sterilisierte physiologische Kochsalzlösung dialysiert, und das Dialysat wurde Mäusen (5 Mäuse pro Gruppe) durch die Schwanzvene in einer Dosierung von 0,5 ml oder 1,0 ml/Tier verabreicht. Die Tiere wurden 7 Tage lang beobachtet, aber es wurde keine Abnormalität festgestellt. Die LD&sub5;&sub0; der Proben wurde unter Verwendung von Mäusen bestimmt, und jede Probe zeigte eine LD&sub5;&sub0; von 50 mg/Maus oder mehr.
- Während die Erfindung unter Bezugnahme auf ihre bestimmten Ausführungsformen detailliert beschrieben worden ist, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können.
Claims (7)
1. Verfahren zum Wärmebehandeln von gamma-Globulin, umfassend den
Schritt des Wärmebehandelns einer wässrigen Lösung, die chemisch
unmodifiziertes gamma-Globulin und 10 bis 70 g Sorbit pro 100 ml wässrige
Lösung enthält; wobei die wässrige Lösung eine Ionenstärke von 0,01 oder
weniger und einen pH-Wert von 4,5 bis 6,5 hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Sorbit in einer Menge von 30
bis 70 g pro 100 ml wässrige Lösung vorhanden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem Sorbit in einer Menge von 40
bis 60 g pro 100 ml wässrige Lösung vorhanden ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die
wässrige Lösung eine Ionenstärke von 0,001 oder weniger hat.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die
wässrige Lösung einen pH-Wert von 5 bis 6 hat.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die
Wärmebehandlung bei einer Temperatur von 50 bis 70ºC über eine Zeitdauer
von 10 Minuten bis 20 Stunden durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Wärmebehandlung bei einer
Temperatur von etwa 60ºC über eine Zeitdauer von 10 Stunden durchgeführt
wird.
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