DE3876600T2

DE3876600T2 - Plasma- und rekombinationsproteinformulierungen in einem milieu hoher ionenstaerke.

Info

Publication number: DE3876600T2
Application number: DE8888117833T
Authority: DE
Inventors: Michael E Hrinda; Ted C K Lee
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer International Holdings Inc
Current assignee: Rhone Poulenc Rorer International Holdings Inc
Priority date: 1987-10-29
Filing date: 1988-10-26
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2008-10-27
Also published as: AU622133B2; AU2452088A; ES2053676T3; GR3006506T3; CA1329760C; JP2544968B2; JPH01149733A; EP0314095A1; EP0314095B1; DE3876600D1; ATE83155T1

Description

Diese Erfindung betrifft stabile Faktor VIII-Ansätze. Genauer ausgedrückt wird ein Faktor VIII-Protein mit hoher Reinheit in Medien mit hoher Ionenstärke für die Verabreichung an Patienten formuliert, die an Hämophilie Typ A leiden.
Ein Anti-Hämophilie-Faktor oder Faktor VIII-Prokoagulationsaktivitätsprotein (nachfolgend Faktor VIII) dient dazu, den Gerinnungsfehler bei Hämophilie Typ A-Plasma zu korrigieren. Demgemäss werden Faktor VIII-Präparate für den Zweck extensiv verwendet, Faktor VIII hämophilen Patienten zu geben.
Eine bedeutende Angelegenheit, die mit der Verwendung von Faktor VIII und anderen therapeutischen Mitteln, die sich von biologischen Quellen ableiten, zusammenhängen, liegt in der Übertragung von Erkrankungen, insbesondere Viruserkrankungen. Häufige Virusverunreinigungen umfassen Hepatitis B-Virus (HBV), Nicht-A-, Nicht-B-Hepatitisvirus (NANBV) und HTLV III/LAV/HIV, das Aids verursacht. Um sicherzustellen, dass Produkte, die aus biologischen Quellen erzeugt sind, virussicher sind, wurden verschiedene Vorgehensweisen für die Virusinaktivierung vorgeschlagen. Jedoch sind die meisten Plasmaproteinpräparate instabil und erfordern besondere Vorsicht, um eine Denaturierung, die Änderung und den Verlust von Aktivität während des Virusinaktivierungsverfahrens zu verhindern. Eine Annäherung, um die Denaturierung und andere Änderungen von Plasmaproteinen zu verhindern, wendet Additive während des Pasteurisierungsverfahrens an. Repräsentative Beispiele folgen.
US-PS 4 440 679 (Fernandes et al) beschreibt ein Verfahren, worin therapeutisch aktive Proteine pasteurisiert werden, indem die Proteinzusammensetzung mit einer Stabilisierungsmenge fuhr die Pasteurisierung eines Polyols vor der Pasteurisierung vermischt wird.
US-PS 4 297 344 (Schwinn et al) offenbart ein Verfahren für die Stabilisierung gegen Wärme für die Koagulationsfaktoren II, VIII, XIII, Antithrombin III und Plasminogen in einer wässrigen Lösung, das die Zugabe sowohl von einer Aminosäure als auch von einem oder mehreren von einem Monosaccharid, einem Oligosaccharid oder einem Zuckeralkohol zu der Lösung umfasst.
US-PS 4 585 654 (Landaburu et al) betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in Plasmaproteinlösungen durch Erhitzen dieser in der Gegenwart eines Polyols, eines oberflächenaktiven Mittels und eines Chelatisierungsmittels.
US-PS 4 446 134 (Naito et al) ist auf ein Virusinaktivierungsverfahren gerichtet, worin Faktor VIII in einer wässrigen Lösung in der Gegenwart von einem Hauptstabilisator aus neutralen Aminosäuren, Monosacchariden, Oligosacchariden und Zuckeralkoholen und einem Hilfsstabilisator von Salzen von Kohlenwasserstoff- und Hydroxykohlenwasserstoffcarbonsäuren erhitzt wird.
Diese Verfahren bezwecken, die beachtliche Virus- und bakterielle Infektionsfähigkeit der Ansätze zu zerstören, während deren gewünschte biologische Aktivität im wesentlichen aufrecht erhalten wird. Mit anderen Worten stellen sie bedeutende Schritte dar, zufriedenstellende Plasmaproteinprodukte den Patienten zur Verfügung zu stellen.
Um verabreichbar zu sein, müssen die Plasmaproteinprodukte mit geeigneten Verbindungen formuliert, für die Lagerung lyophilisiert werden und für die Rückbildung fertig sein. Vor der Formulierung werden die Additive, die während des Pasteurisierungsverfahrens verwendet werden, entfernt, und deren Stabilisierungs-/Schutzwirkung ist nicht länger vorhanden, um einen Verlust der Aktivität zu verhindern. Die Anmelder sind auf Abbauprobleme mit Faktor VIII sowohl während der Lyophilisierung als auch während der Rückbildung mit normaler Kochsalzlösung gestossen. Um die Wirkungen der restlichen Stabilisierungsmittel und/oder andere Materialien, die in dem Stand der Technik während der Herstellung oder der Pasteurisierung verwendet wurden, zu eliminieren, wurde ein hochgereinigter Faktor VIII verwendet, um den Abbau zu untersuchen, der während der Lyophilisierung und der Rückbildung auftritt, so wie es durch die Lehre von US-PS 4 361 509 erzeugt ist. Das dort offenbarte Verfahren schafft eine etwa 1000-fache Reinigung von Faktor VIII, der von einem kommerziellen Konzentrat unter Verwendung einer Antikörpersäule erhalten ist. Der anschliessende Reinigungsschritt durch eine Aminohexyl-Sepharose -Säulenchromatografie erhöht weiterhin die Reinheit um das 2- bis 3-fache, was zu einer Faktor VIII-Aktivität von 2300 Einheiten/mg Protein führt.
Die Elution von Faktor VIII aus der Aminohexyl-Sepharose wird durch die Verwendung einer Kalziumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,25 bis 0,5 M vervollständigt. Diese Lösung die eine derartig hohe Konzentration an Kalziumchlorid aufweist, ist für die Injektion bei dem Patienten nicht geeignet. Genauer ausgedrückt wurde bei der Lyophilisierung ein drastischer Verlust von Faktor VIII beobachtet.
Um die Probleme zu lösen, wurde eine isotonische Lösung hergetellt, indem Faktor VIII, der in der Kalziumchloridlösung enthalten war, gegen 0,15 M Natriumchlorid, 5 mM Kalziumchlorid und 3 mM Histidin bei pH 6,8 dialysiert wurde. Bei der Untersuchung wurde ein drastischer Verlust von Faktor VIII erneut beobachtet.
Es wurde nun festgestellt, dass Faktor VIII, ebenso wie andere Plasma- und rekombinante Proteine mit physiologisch akzeptablen Verbindungen für die Stabilisierung gegen einen Verlust der Aktivität während der Lagerung in flüssigem Zustand, der Lyophilisierung, der Lagerung in dem lyophilisierten Zustand und der Rückbildung vor der Verabreichung an Patienten formuliert werden können.
Entsprechend dieser Erfindung werden Plasma- und rekombinante Proteinformulierungen zur Verfügung gestellt, die stabil sind und die nach der Rückbildung für die Verabreichung an Patienten fertig sind. Die Formulierungen umfassen zumindest ein bestimmtes Protein als den aktiven Bestandteil für die therapeutische Verwendung und ein Medium mit hoher Ionenstärke. Die Menge an Protein, die in dem Ansatz vorhanden ist, basiert auf seiner bekannten Aktivität gegen die Leiden, die behandelt werden sollen, und wird von Protein zu Protein, deren Konzentration und dem Reinheitsgrad variieren. Das Medium mit hoher Ionenstärke ist eine wässrige Losung und umfasst:
(a) von 0,35 bis 1,2 M Natriumchlorid oder Kaliumchlorid oder Mischungen davon und vorzugsweise 1 M Natriumchlorid;
(b) von 1,5 bis 40 mM und vorzugsweise 3,5 bis 15 mM Kalziumchlorid; und
(c) von 1 bis 50 mM und vorzugsweise 2 bis 10 mM Histidin als Pufferion.
Der pH des Mediums sollte von 6,0 bis 7,6 und vorzugsweise 7,0 sein.
Wahlweise können bis zu 10 % (W/V) an Zucker, wie Mannit, Sucrose und Maltose, zu den Ansätzen dieser Erfindung für die Lyophilisierung zugegeben werden.
Der Ansatz wird lyophilisiert und rückgebildet, so dass er umfasst:
(a) von 0,35 bis 1,2 M Natriumchlorid oder Kaliumchlorid oder Mischungen davon und vorzugsweise 1 M Natriumchlorid;
(b) von 1,5 bis 40 mM und vorzugsweise 3,5 bis 15 mM Kalziumchlorid; und
(c) von 1 bis 50 mM und vorzugsweise 2 bis 10 mM Histidin als Pufferion.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls eine Zusammensetzung zum Stabilisieren von 2 bis 2000 ml einer wässrigen Losung eines lyophilisierten Plasmaproteins, umfassend:
von 0,04 bis 141 g Natriumchlorid, von 0,05 bis 179 g Kaliumchlorid oder Mischungen davon;
von 0,0003 bis 8,9 g Kalziumchlorid und
von 0,0003 bis 15,6 g Histidin.
Die Formulierungen, die 2 bis 500 Einheiten Faktor VIII pro Milliliter Lösung enthalten, wurden als wirksam für die Behandlung von Hämophilie befunden.
Diese Erfindung umfasst proteinhaltige Materialien und Produkte auf dem biomedizinischen Gebiet, die bei dem menschlichen oder tierischen Körper für biomedizinische oder therapeutische Zwecke ebenso für nichttherapeutische experimentelle Zwecke verwendet werden sollen. Veranschaulichende Materialien und Produkte umfassen die folgenden, sind darauf aber nicht beschränkt:
Blutfraktionen, wie Antihämophiliefaktor (Smith, J.K. und Bidwell, E. (1979) Clinics in Haemotol. 8, Seiten 184-205);
Prothrombinkomplex, d.h. Faktoren II, VII, IX und X (Chandra, S. und Brummelhuis, H.G.J. (1981) Vox Sang. 41, Seiten 259-273);
Protein C. (Steuflo, J. (1976), J. Biol. Chem. 251, Seiten 355-363 und Bajaj, S. P. et al (1983), Prep. biochem. 13, Seiten 191-214); Protein S (diScipio, R.G. et al (1977), Biochem. 16, Seiten 698-706;
Antithrombin III (Rosenberg, R.D. und Damus, P.S. (1973), J. Biol. Chem. 248, Seiten 6490-6505);
Gamma Globulin (Oncley et al (1949) J. Amer. Chem. Soc. 71, Seiten 541-550);
biologische Materialien und Produkte, die sich von rekombinanten DNA-Techniken ableiten und in Bakterien, Pilzen oder Säugetier-Zellkultursytemen erzeugt sind (Vane, J. und Cuatrecases, P. (1984), Nature 312, Seiten 303-305 und Meniatis, T. et al (1982), Molecular cloning: A Laboratory Manual (Old Spring Harbor, N.Y.)).
Diese Produkte und Materialien sind aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich oder können durch Anwendung von gut bekannten, präparativen Techniken hergestellt werden. Beispielseise können Blutfraktionen und Blutproteine aus menschlichem Blutplasma durch Fraktionierung entsprechend bekannten Techniken, wie beispielsweise der Alkaoholfraktionierung von Cohn, beschrieben in US-PS 2 390 074 und in dem Journal of American Society, Bd. 68, Seite 459 (1946) erhalten werden. Diese Verfahren ebenso wie andere Techniken sind in "The Plasma Proteins", 2. Auflage, Bd. III, Seiten 548-550, Academic Press, New York, N.Y. (1977) zusammengefasst.
Während diese Erfindung auf diese und andere ähnliche Produkte und Materialien anwendbar ist, wird sie unter Bezugnahme auf Faktor VIII-Prokoagulansaktivitätsprotein detailliert beschrieben, das entsprechend US-PS 4 361 509 hergestellt ist. Das darin offenbarte Verfahren ist in der Lage, einen hochgereinigten und konzentrierten Faktor VIII zu erzeugen, der bei der Behandlung von Hämophilie effektiv ist, der nicht mehr als 2000 Einheiten Faktor VIII-Prokoagulansaktivität pro Milligramm Protein aufweist. Jedoch ist das Produkt, wie es duch das Verfahren erhalten wird, während der Lyophilisierung und bei der Rückbildung instabil. Weiterhin ist die hohe Kalziumionenlösung, die den Faktor enthält, für die Verabreichung an Patienten unewünscht. Die folgenden Beispiele und Versuche erläutern diese Erfindung noch näher.

BEISPIEL 1

Die Rate des Abbaus von Faktor VIII unter isotonischen Bedingungen wurde studiert. Faktor VIII, erhalten durch das Verfahren gemäss US-PS 4 361 509, in gepufferter 500 mM Kalziumchloridlösunmg wurde gegen 1 M Natriumchlorid, 0,035 M Kalziumchlorid und 3 mM Histidin bei pH 6,8 für den Salzaustausch dialysiert und dann lyophilisiert. Die Rückbildung des lyophilisierten Materials wurde auf 0,167 M Natriumchlorid, 5,8 mM Kalziumchlorid und 3 mM Histidin durchgeführt, indem ein 6-faches Volumen von 2,5 mM Histidin bei pH 6,8 im Hinblick auf das Prälyophilisierungsvolumen zugegeben wurde. Der zeitabhängige Verfall der Faktor VIII-Aktivität wurde durch ein zweistufiges Untersuchungsverfahren bestimmt, das im wesentlichen das gleiche ist wie die Verfahren, die von Newman, J., Johnson A.J., Karpatkin, S. und Puszkin, S. (1971), Br. J. Haematol. 21, Seiten 1-20, beschrieben sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Zeitabhängiger Verfall von Faktor VIII-Aktivität unter isotonischen Bedingungen Zeit (Minuten) Faktor VIII-Aktivität (Gesamteinheit) % Verfall (bei der Rückbildung)

BEISPIEL 2

Eine Reihe von Dialyseexperimenten wurde durchgeführt. Faktor VIII in 500 mM CaCl&sub2;, mM Histidin, 0,1 M Lysinhydrochlorid bei pH 6,8 wurde gegen Histidinpufferlösungen dialysiert, die verschiedene Konzentrationen an Natrium- oder Kaliumchlorid und Kalziumchlorid enthielten. Proben wurden durch das zweistufige Untersuchungsverfahren, auf das in Beispiel 1 verwiesen wurde, untersucht. Die Einzelheiten und die Ergebnisse sind in den Tabellen 2, 3, 4 und 5 angegeben. TABELLE 2 Wirkung der CaCl&sub2;-Konzentration bei der Aktivität von Faktor VIII in 0,15 M NaCl, 0,1 M Lysin-HCl, pH 6,8 Faktor VIII bei Rückbildung (E/ml) Prozent TABELLE 3 Wirkung der CaCl&sub2;-Konzentration auf die Aktivität von Faktor VIII in 0,15 M NaCl, 0,1 M Lysin-HCl, pH 6,8 Faktor VIII 4 Tage nach der Dialyse (E/ml) Prozent TABELLE 4 Wirkung der CaCl&sub2;-Konzentration auf Faktor VIII Prozent * Die Kontrolle enthielt 0,1 M Lysin, der Rest der Proben enthielt 3 mM Histidin, pH 6,8. TABELLE 5 Aktivität von Faktor VIII in verschiedenen Konzentrationen von CaCl&sub2; und NaCl Faktor VIII-Aktivität Prozent
Das folgende Beispiel erläutert das duch diese Erfindung erhaltene Ergebnis.

BEISPIEL 3

Faktor VIII (43 E/ml), hergestellt durch das Verfahren gemäss US-PS 4 351 509, wurde in 1 M Natriumchlorid, 5 mM Kalziumchlorid, 3 mM Histidin bei pH 7 gegeben und lyophilisiert. Die Rückbildung wurde mit dem 2,2-fachen Volumen an Wasser im Vergleich zu dem Volumen von Faktor VIII vor der Lyophilisierung durchgeführt. Die rückgebildete Lösung enthielt: 0,45 M Natriumchlorid, 2,3 mM Kalziumchlorid und 1,4 mM Histidin. Die Rückbildung von Faktor VIII wurde durch das zweistufige Untersuchungsverfahren gemessen, auf das in Beispiel 1 verwiesen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. TABELLE 6 Zeit (Minuten) Faktor VIII-Aktivität (E/ml)

BEISPIEL 4

Herstellung einer Losung eines Cryopräzipitates:

Das Ausgangsmaterial, das für die Herstellung von Faktor VIII verwendet wurde, war ein Cryopräzipitat von menschlichem Plasma. Jedes kg des Cryopräzipitates wurde in 1,4 kg kaltes, pyrogenfreies (PF) Wasser gegeben. 60 ml von jeweils 12 % (G/V) Glycin und 16 % (G/V) Natriumchlorid wurden zu der Mischung zugegeben. Die Mischung wurde in ein 37ºC Wasserbad angeordnet, um das meiste des Cryopräzipitates aufzulösen, und es wurde bewegt, um den Faktor VIII in der Losung zu extrahieren. Der pH der Mischung wurde von 7,45 bis 6,95 mit 30 ml 1 N Essigsäure titriert. 65 g Rehsorptar (2 % G/V Aluminiumhydroxid-Gel, Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, Illinois) wurden zu der Mischung zugegeben und 20 Minuten lang vermischt, um Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren zu absorbieren. Die Mischung wurde bei 3000 xg 20 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. 14 ml 1,5 M Natriumcitrat wurden zu dem Überstand zugegeben. Der pH der Mischung war 7,40. Die Mischung wurde mit Rehsorptar erneut behandelt und wie oben angegeben zentrifugiert. Die resultierende Proteinlösung wurde bei -40ºC bis zur Verwendung gelagert.

Isolierung von Faktor VIII durch monoklonale Anti-von Willebrand- Faktor Antikörper-Säulenchromatografie:

Die Affinitätssäulenmatrix wurde durch Konjugation von monoklonalen Anti-von Willebrand Faktor-Antikörper an Sepharose -Gel (4 g Antikörper pro 1 g Sepharosegel) hergestellt. Eine aufgetaute Cryopräzipitatlösung (4,8 l) (18.280 Einheiten Faktor VIII) wurden auf die Antikorpersäule mit einer Grosse von 1,3 l (9 x 21 cm) aufgebracht, die mit Faktor VIII- Puffer (0,15 M Natriumchlorid, 0,1 M Lysinhydrochlorid, 0,02 M Histidin, pH 6,8) äquilibriert war. Die Flussrate der Beladung war 15 ml/Minute. Die Säule wurde dann mit 3 Säulenvolumen des Faktor VIII-Puffers gewaschen. Eine Gesamtmenge von 4340 Enheiten wurde nicht an die Säule gebunden. Der Faktor VIII wurde aus der Antikorpersäule mit 0,5 M Kalziumchlorid in dem Faktor VIII-Puffer (Flussrate: 21 ml/Minute) eluiert. Die wiedergewonnene Faktor VIII-Aktivität war 7610 Einheiten in 0,68 l des Säuleneluates.

Konzentrierung, Ansatz, Lyophilisierung und Rückbildung:

Der gewonnene Faktor VIII wurde in einem Amicon -Hohlfasersystem (Typ HIX 50-20, 2,5 cm x 20 cm lang) konzentriert. Der konzentrierte Faktor VIII, 50 g (56 E/ml, 2800 Einheiten) wurde bei 4ºC über Nacht gegen einen Ansatzpuffer, der aus 1 M Natriumchlorid, 5 mM Kalziumchlorid, 3 mM Histidin bestand, pH 7,0, mit zwei Wechseln dialysiert. Das dialysierte Material, 46 E/ml wurde lyophilisiert. Die Rückbildung des lyophilisierten Materials wurde auf 0,45 M Natriumchlorid, 2,3 mM Kalziumchlorid, 1,4 mM Histidin, pH 7,0, durch die Zugabe von 2,2 Volumen Wasser für die Injektion (WFI) in bezug auf das vorlyophilisierte Volumen durchgeführt. Das rückgebildete Material war über einen Zeitraum von 3 Stunden beachtlich stabil und die Wiedergewinnung der Faktor VIII-Aktivität lag bei etwa 91 %. Die Untersuchungsergebnisse (18 bis 20 E/ml) waren innerhalb des experimentellen Fehlers im wesentlichen gleich, wie es in Tabelle 7 gezeigt ist. TABELLE 7 Zeit (Minuten) nach der Rückbildung Aktivität (E/ml)

BEISPIEL 5

Die Lösung, hergestellt von 3,113 kg eines Copräzipitates von menschlichem Plasma (18.297 Einheiuten von Faktor VIII), wurde auf eine Affinitätssäule (13,7 cm x 22,0 cm, 3,24 l) einer monoklonalen Anti-von Willebrand-Antikörpergelmatrix gegeben, die durch Konjugation von 1,2 g des Antikörpers pro Liter Sepharose -Gel hergestellt war. Die Säule wurde dann mit 3 Säulenvolumen des Faktor VIII-Puffers gemäss Beispiel 4 gewaschen. 19 % (3537 Einheiten) des Faktors VIII wurden nicht durch die Säule gebunden. Die Säule wude mit 0,25 M Kalziumchlorid in dem Faktor VIII eluiert. Der Anteil, der die Faktor VIII-Aktivität enthielt, 3,556 kg (9.880 Einheiten) wurde gesammelt. Der eluierte Faktor VIII wurde auf eine Aminohexyl-Sepharose -Säule (2,5 cm x 5,6 cm, Pharmacia) unmittelbar nach einer 5-fachen In-line-Verdünnung mit dem AH-Sepharose -Äquilibrierungspuffer (20 mM Histidin, 100 mM Lysinhydrochlorid, pH 6,8) aufgegeben. Die Flussrate lag bei 12 ml/Minute.
Es gab keine bestimmbare Faktor VIII-Aktivität in der Lösung, die die AH-Sepharose -Saule passierte. Die Säule wurde mit 209 g 50 mM Kalziumchlorid in dem AH-Sepharose -Äquilibrierungspuffer gewaschen. Eine kleine Menge an Faktor VIII-Aktivität (165 Einheiten, 1,7 %) wurde in der Waschpufferlösung, die gesammelt war, nachgewiesen. Der Faktor VIII wurde dann aus der Säule mit 500 mM Kalziumchlorid in dem AH-Sepharose -Äquilibrierungspuffer eluiert. Die Peakfraktion des Elutionsprofils enthielt 6890 Einheiten an Faktor VIII in 26,5 g. Der eluierte Faktor VIII wurde bei 4ºC über Nacht gegen die Formulierungspufferlösung dialysiert, die 1 M Natriumchlorid, 5 mM Kalziumchlorid, 3 mM Histidin, 2 % Mannit, pH 7,0, enthielt. Der dialysierte Faktor VIII hatte 266 E/ml (23 g).

BEISPIEL 6

1 kg gefrorerenes menschliches Plasma-cryopräzipitat wurde in eine Lösung aus 2,8 kg 0,055 M Glycin und 0,038 M Natriumchlorid angeordnet. Die Mischung wurde in ein 37ºC-Wasserbad gegeben und unter einem Laminarfluss an Luft bewegt, um das Cryopräzipitat aufzulosen. 0,1 N Essigsäure wurde tropfenweise zu der Suspension gegeben, um den pH auf 6,90 ±0,1 zu bringen. 100 g Rehsorptar wurden zu der Mischung zugegeben, und sie wurde 15 bis 20 Minuten lang bei 35 bis 37ºC bewegt. Die Suspension wurde bei 4000 x g bei Raumtempertur 15 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt. Die Rehsorptar -Behandlung wurde wiederholt. Der Überstand (3,8 kg) wurde mit 0,94 kg 5 M Natriumchloridlosung vermischt, um eine 1 M-Mischung in Natriumchlorid zu erzeugen. Die Mischung wies 7,6 Einheiten Faktor VIII-Aktivität pro Milliliter (35.811 Einheiten insgesamt) auf. 4,6 kg der Mischung (35.250 Einheiten) wurden auf eine monoklonale Anti-von Willebrand-Antikorpersäule (1,2 g der Antikorper/l Sepharose konjugiert) mit einer Grösse von 7,1 l (25 x 14,5 cm) bei Raumtemperatur mit einer FLussrate von 14 ml/Minute gegeben. Die Säule wurde mit 11,6 kg 1 M Natriumchlorid in der Faktor VIII-Pufferlösung von Beispiel 4 gewaschen. Die nicht-gebundene Faktor VIII-Aktivität lag bei 5950 Einheiten. Der absorbierte Faktor VIII wurde mit 0,25 M Kalziumchlorid in dem Faktor VIII-Puffer eluiert. Insgesamt wurden 20.090 Einheiten von Faktor VIII in 10,1 kg Eluat gesammelt. Der eluierte Faktor VIII wurde durch eine Aminohexyl-Sepharose -Saule (5 x 3 cm), die zuvor mit 0,02 M Histidin, 0,10 M Lysinhydrochlorid, pH 6,8 äquilibriert war, chromatografiert. Der Faktor VIII wurde auf die AH-Sepharose -Säule bei 4ºC nach der 5-fachen Verdünnung mit dem AH-Sepharose -Äquilibrierungspuffer aufgegeben. Die Flussrate lag bei 44 ml/Minute. Die gesamte Faktor VIII-Aktivität war an der Säule gebunden. Die Säule wurde mit 420 g 0,05 M Kalziumchlorid in dem obigen Äquilibrierungspuffer gewaschen. 4349 Einheiten an Faktor VIII wurden ausgewaschen. Der Faktor VIII wurde dann aus der Säule mit 0,50 M Kalziumchlorid in dem Äquilibrierungspuffer eluiert. Die Faktor VIII-Aktivität (12.538 Einheiten) wurde in 90,81 g des Eluates gesammelt. Der isolierte Faktor VIII wurde über Nacht bei 4ºC gegen 1 M Natriumchlorid, 3 mM Histidin, 5 mM Kalziumchlorid, pH 7,0, mit zwei Wechseln dialysiert. 12.621 Einheiten an Faktor VIII wurden wiedergewonnen. Das Material wurde mehrere Tage bei 4ºC gelagert. Zu einer Probe aus einer Faktor VIII-Lösung wurde pulverförmiges Mannit zur Herstellung von 2 % G/V in Mannit (83 Einheiten/ml) zugegeben. Die Mischung wurde lyophilisiert und rückgebildet und 72 Einheiten/ml wurden wiedergewonnen. Zu einer anderen Probe einer Faktor VIII-Lösung wurde pulverförmige Maltose zur Herstellung von 2 % G/V in Maltose (96 Einheiten/ml) zugegeben. Die Mischung wurde lyophilisiert und rückgebildet und 94 Einheiten/ml wurden wiedergewonnen.

Claims

1. Stabiler Plasmaproteinansatz, umfassend in einer wässrigen Lösung:

ein Plasmaprotein in einer therapeutisch effektiven Menge;

von 0,35 bis 1,2 M Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Mischungen davon;

von 1,5 bis 40 mM Kalziumchlorid; und

von 1 bis 50 mM Histidin;

wobei die wässrige Losung einen pH von 6,0 bis 7,6 aufweist.

2. Ansatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmaprotein Faktor VIII ist.

3. Ansatz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmaprotein in einer Einheitsdosierungsform vorhanden ist.

4. Ansatz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor VIII eine Konzentration von 2 bis 500 Einheiten/ml aufweist.

5. Ansatz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Ansatz 1 M Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Mischungen davon; von 3,5 bis 15 mM Kalziumchlorid, von 2 bis 10 mM Histidin enthält, wobei die wässrige Losung einen pH von 6,0 bis 7,6 aufweist.

6. Ansatz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er weiterhin bis zu 10 % G/V eines Zuckers umfasst, ausgewählt aus Mannit, Sucrose oder Maltose.

7. Stabiler Plasmaansatz, dadurch gekennzeichnet, dass der Ansatz in lyophilisierter Form vorliegt und aufgrund der Rückbildung mit pyrogenfreiem Wasser den wässrigen Ansatz nach den Ansprüchen 1 bis 6 bildet.

8. Stabiles Plasmaprotein in lyophilisierter Form zur Verwendung für die Herstellung des Ansatzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit pyrogenfreiem Wasser.

9. Zusammensetzung zum Stabilisieren von 2 bis 2000 ml einer wässrigen Losung eines lyophilisierten Plasmaproteins in einer therapeutisch effektiven Menge, umfassend:

eine Menge an Natriumchlorid oder Kaliumchlorid oder Mischungen davon, zum Schaffen von 0,35 bis 1,2 M Natriumchlorid oder Kaliumchlorid oder Mischungen davon, wenn es in der wässrigen Lösung rückgebildet ist;

eine Menge an Kalziumchlorid zum Schaffen von 1,5 bis 40 mM Kalziumchlorid, wenn es in der wässrigen Losung rückgebildet ist;

eine Menge an Histidin zum Schaffen von 1 bis 50 mM Histidin, wenn es in der wässrigen Losung rückgebildet ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmaprotein in Einheitsdosierungsform vorliegt.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmaprotein Faktor VIII ist.