WO1994013329A1

WO1994013329A1 - Verfahren zur herstellung eines virussicheren biologischen präparates

Info

Publication number: WO1994013329A1
Application number: PCT/AT1993/000191
Authority: WO
Inventors: Johann Eibl; Gabriela Hummel; Gerda Redl; Thomas Seelich; Peter Turecek; Günter WÖBER
Original assignee: Immuno Aktiengesellschaft
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1993-12-10
Publication date: 1994-06-23
Also published as: US5733885A; EP0674531A1; SI9300659A; JP3133338B2; JPH08504407A; US5639730A; AU6653094A; HRP931496B1; HRP931496A2

Abstract

Bei einem Verfahren zur Herstellung eines virussicheren biologischen Präparates durch Erhitzen unter Erhaltung von mindestens 50 % der biologischen Aktivität wird dem Präparat vor dem Erhitzungsschritt ein biologisch verträgliches Tensid zugesetzt und das Erhitzen in Gegenwart desselben durchgeführt, worauf vorzugsweise das Tensid entfernt wird.

Description

Verfahren zur Herstellung eines virussicheren

biologischen Präparates

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines virussicheren biologischen Präparates durch Erhitzen unter Erhaltung von mindestens 50% der biologischen Aktivität, sowie die Anwendung des Verfahrens zur Erhöhung der Virussicherheit eines biologischen Präparates .

Unter biologischen Präparaten versteht man Präparate biologischen Ursprungs, die beispielsweise aus Körperflüssigkeiten, wie Blut, oder aus Zellkulturen gewonnen werden können. Durch den Kontakt mit potentiell infektiösem Material besteht bei derartigen Produkten die Gefahr der Kontamination durch infektiöse Agentien.

Das Risiko der Übertragung von Viren durch Blutprodukte ist bekannt. Unter Blutprodukten werden Produkte aus menschlichem oder tierischem Blut, bzw. Plasma verstanden, die zur therapeutischen, prophylaktischen oder diagnostischen Anwendung bestimmt sind. Solche Produkte können Enzyme, Proenzyme einschließlich Gerinnungsfaktoren, Enzyminhibitoren, Immunglobuline, Albumin, Plasminogen, Fibrinogen, Fibronectin oder Plasma enthalten.

Es ist eine umfangreiche Literatur vorhanden, die sich mit der Inaktivierung von infektiösen Agentien durch Erhitzen von

Blutprodukten befaßt. Die verschiedenen Verfahren umfassen:

- Erhitzen der Blutprodukte in wässeriger Lösung in Anwesenheit von Stabilisatoren,

- Erhitzen der Blutprodukte in trockenem Zustand,

- Erhitzen der Blutprodukte in festem, nassem Zustand.

Das Bestreben bei allen diesen Inaktivierungsverfahren geht dahin, die potentielle Infektivität der Präparationen zu beseitigen, ihre biologische Aktivität aber weitgehend zu erhalten.

Durch Erhitzen der Blutprodukte werden sowohl membranumhüllte als auch nicht-membranumhüllte Viren angegriffen. Dies bedeutet einen wesentlichen Vorteil gegenüber solchen Verfahren, die nur auf der membransolubilisierenden Wirkung von Tensiden und gegebenenfalls von organischen Lösungsmitteln beruhen.

Ein Verfahren zur Behandlung von biologischen und pharmazeutischen Produkten durch die Behandlung mit Amphiphilen (Tensiden) ist bei einer Temperatur zwischen 4°C und 37°C in der

EP 0 050 061 beschrieben. Diese Behandlung zielt auf die Inaktivierung von Hepatitis B-Viren und non-A, non-B Hepatitis-Viren (membranumhüllt) ab.

Gleichfalls werden wässerige Proteinlösungen gemäß dem Verfahren der EP-0 278 487 mit bis zu 2 g/100 ml eines nichtionischen Detergens versetzt und anschließend bei niedriger Temperatur, beispielsweise 4°C, solange inkubiert, bis ein virusinaktivierender Effekt erzielt wurde.

Diese Behandlung mit Detergentien hat jedoch den Nachteil, daß sie lediglich auf membranumhüllte Viren abzielt: Wenn ein Tensid in einer Konzentration über der mizellbildenden Konzentration (CMC) vorliegt, werden lipidhaltige Membranen solubilisiert und das Virus inaktiviert. Demgegenüber werden Viren, die an sich keine lipidhaltige Membran aufweisen, wie z.B. Hepatitis A- Virus, die aber in Lipidvesikeln eingeschlossen sein können, durch eine Tensidbehandlung freigesetzt und damit aktiviert anstelle von inaktiviert (siehe dazu Manucci PM et al. (1992), The Lancet 339, 819 "Outbreak of hepatitis A among Italian patients with haemophilia").

Oberflächenaktive Mittel werden gemäß der EP-0 124 044 in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew.% gemeinsam mit einem Polyol und einem chelatbildenden Mittel zu einer fibronectinhaltigen Lösung zugesetzt, die bei einer Temperatur von 50 bis 70ºC wärmebehandelt wird. Die geringen Mengen an oberflächenaktivem Mittel schützen Fibronectin vor Denaturierung durch Scherkräfte.

Ebenso werden Detergentien als Lösungsvermittler gemeinsam mit virusinaktivierenden Mitteln (Glycyrrhizin-Triterpenoid-Verbin- bindung) zu Blutplasma zugesetzt, welches bei einer Temperatur bis zu 60°C gehalten wird (US-PS 5 186 945). Um eine gewünschte oberflächenaktive Wirkung zu erzielen, werden sehr geringe Menge an nichtionischen Detergentien eingesetzt, etwa in einer Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.%. Der Vorteil der Verwendung dieser geringen Detergensmengen liegt darin, daß diese nicht entfernt werden müssen.

Es ist weiters in der EP-0 131 740 beschrieben, daß ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in einer Lösung mit organischen Lösungsmitteln bei einer Temperatur von 0 bis 70°C durchgeführt werden kann. Als Benetzungsmittel kommen dabei 0,001 bis 10 Gew.% Detergentien zum Einsatz. Jedoch ist es erforderlich, die labilen Proteine bei Erhitzen der Lösung zu stabilisieren. Damit werden aber nicht nur das labile Protein stabilisiert, sondern auch die Viruskomponenten.

Als Hitzebehandlung von Blutprodukten in festem Zustand hat sich das Verfahren der EP 0 159 311 bewährt. Dabei werden Blutprodukte lyophilisiert, auf einen Gehalt an Wasser, Methanol, oder Ethanol von mehr als 5 Gew.% und weniger als 70 Gew.% eingestellt und in einem geschlossenen Behälter bei einer Temperatur in einem Bereich von 50 bis 121ºC erhitzt. Durch dieses Verfahren werden sogar resistente Viren, wie Vacciniavirus, abgetötet. Die Virusinaktivierung erfolgt in diesem Fall sehr langsam, so daß eine sehr lange Erhitzungsdauer bzw. eine sehr hohe Temperatur verwendet werden muß.

Zur Erhöhung der Effektivität dieses Verfahrens wird das Verfahren gemäß der EP 0 324 729 vorgeschlagen. Dabei werden Blutprodukte in festem, nassem Zustand in Gegenwart von organischen Verbindungen erhitzt. Der Wasseranteil verbleibt zum größten Teil am Blutprodukt physikalisch gebunden, während die organische Verbindung in Gasform in der Atmosphäre vorhanden ist. Als organische Verbindungen eignen sich Ethanol, Essigsäureethyl- ester, Diethylether, Chloroform und dergleichen. Nach erfolgter Inaktivierung müssen die organischen Verbindungen vom Blutprodukt abgetrennt werden. Das verbesserte Verfahren bewirkt, daß das Vacciniavirus bereits nach wenigen Stunden Erhitzungsdauer bei 60°C inaktiviert ist.

Ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in einem Produkt, das an eine feste Phase adsorbiert ist, ist in der EP-0 197 554 beschrieben. Das adsorbierte Produkt wird mit einem virusinaktivierenden Mittel in Kontakt gebracht, worauf die feste Phase abgetrennt und gewaschen wird. Zuletzt wird das Produkt wieder desorbiert. Als virusinaktivierendes Mittel ist unter anderem eine amphiphile Substanz beschrieben, die anionisch, kationisch, zwitterionisch und nichtionisch sein kann. Die Behandlung kann jedoch nur bei einer Temperatur von 0 bis 50°C vorgenommen werden.

Die Erfindung stellt sich zur Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung eines virussicheren Präparates enthaltend ein labiles Protein durch Erhitzen zur Verfügung zu stellen, dessen Wirkung im Vergleich zu den bisher bekannten Hitzebehandlungen verbessert ist, wobei die biologische Aktivität der Präparation im wesentlichen erhalten bleibt.

Resistente Viren, wie Vacciniavirus, sollen möglichst rasch und vollständig inaktiviert werden, um die biologische Aktivität des Präparates nicht unnötig zu vermindern.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung eines virussicheren biologischen Präparates durch Erhitzen unter Erhaltung von mindestens 50 % der biologischen Aktivität gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Präparat vor dem Erhitzungsschritt ein Tensid zugesetzt und das Erhitzen in Gegenwart desselben durchgeführt wird, worauf vorzugsweise das Tensid entfernt wird. Es hat sich gezeigt, daß der Zusatz eines Tensides zu dem Präparat vor der Hitzebehandlung die Wirksamkeit in synergistischer Weise erhöht, ohne die biologische Aktivität des Präparates wesentlich zu vermindern. Nach der Hitzebehandlung wird das Tensid vom Präparat abgetrennt.

Als Tenside eignen sich vor allem biologisch verträgliche anionische, kationische, nicht-ionische oder zwitterionische Amphiphile. Tenside gelten im allgemeinen dann als biologisch ver träglich, wenn sie in der angewendeten Konzentration in einem standardisierten in vitro-Test Erythrozyten nicht lysieren (siehe Pape et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res. 40, 498-502, 1990).

Beispielsweise können Tenside aus folgenden Gruppen verwendet werden:

Polyoxyethylensorbitanester (Tween^®-Verbindungen),

Alkylphenolpolyethylenglykolether bzw. deren Formaldehydpolymere

(Triton^®-Verbindungen),

Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymere (Pluronic^®-

Verbindungen),

Alkylglucoside, wie z.B. Octyl-β-D-glucosid,

Säureamidderivate, wie z.B. Decanoyl-N-methylglucamid (MEGA-10), anionische Tenside, wie z.B. Na-Desoxycholat,

kationische Tenside, wie z.B. Benzyltrimethylammoniumchlorid oder Benzyldimethyl-2-hydroxyethylammoniumchlorid, und

zwitterionische Tenside, wie z.B. N-Dodecyl-N',N-dimethyl- ammonio-3-propansulfonat (Sulfobetain SB12).

Das Tensid wird in einer hohen Konzentration entsprechend einem Verhältnis von Tensid zu Protein von mindestens 1 : 100, vorzugsweise im Bereich von 2 : 100 bis 300 : 100, zugesetzt, wenn die Behandlung des Präparats in flüssiger oder fester Form vorgenommen wird. Wenn das Präparat an einen festen Träger adsorbiert worden ist und die erfindungsgemäße Hitzebehandlung am festen Träger erfolgt, so kann die Behandlung bei noch höheren Tensidkonzentrationen, beispielsweise bis 98 Gew.%, vorgenommen werden.

Die Erfindung umfaßt gleichermaßen ein Verfahren zum Erhöhen der Virussicherheit eines biologischen Präparates unter Erhaltung von mindestens 50 %, vorzugsweise 80 % der biologischen Aktivität, insbesondere der Virussicherheit gegenüber membranumhüllten und nicht-membranumhüllten Viren, wobei das Präparat in Gegenwart eines Tensids in einer Konzentration von mindestens 1

Gew.%, vorzugsweise mehr als 10 Gew.%, bis zu 98 Gew.% erhitzt wird. Obwohl eine Virus-Inaktivierungsmethode mittels Tensiden im Stand der Technik lediglich als wirksam gegen membranumhüllte Viren beschrieben wird, kann der gewünschte Effekt auch gegen nicht-membranumhüllte Viren erzielt werden, wenn das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird.

Natürlich eignet sich das vorliegende Verfahren auch zur Inaktivierung von Virusaggregaten oder vesikulären Strukturen, die Viren, beispielsweise Hepatitis A-Viren, beherbergen.

Eine wesentliche Denaturierung von Proteinen im erfindungsgemäß erhitzten Produkt kann nicht festgestellt werden. Es war überraschend, daß hitzelabile Proteine durch die Anwesenheit von Tensiden sogar stabilisiert werden können.

Daher eignet sich das das erfindungsgemäße Verfahren überraschenderweise auch zum Stabilisieren eines biologischen Präparats, welches hitzelabile Proteine enthält, während einer Hitzebehandlung.

Maßnahmen zur Erhaltung der biologischen Aktivität während einer Hitzebehandlung sind vor allem bei hitzelabilen Proteinen von Bedeutung. Eine Behandlung von hitzestabilen Präparationen, beispielsweise einer Albumin-Präparation, ist jedoch weniger kritisch. Die Erfindung betrifft daher vor allem ein Verfahren zur Herstellung eines Präparates, ausgenommen ein Albumin-Präparat, das hitzelabile Proteine enthält.

Erfindungsgemäß können vor allem auch Präparate hergestellt werden, die labile plasmatische Proteine enthalten, wie Faktoren der Gerinnung, Fibrinolyse und Thrombolyse bzw. Proenzyme und Enzyme, oder deren Inhibitoren.

Die erfindungsgemäße Hitzebehandlung des Präparates wird vorzugsweise in festem Zustand vorgenommen, kann jedoch auch in wässeriger Lösung oder in Suspension erfolgen.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens wird so durchgeführt, daß das Tensid dem Präparat in Lösung zugesetzt wird, wo rauf dieses lyophilisiert und in lyophilisiertem Zustand hitzebehandelt wird, wobei die Hitzebehandlung dann bei wesentlich höheren Temperaturen möglich ist. Die Hitzebehandlung erfolgt vorteilhafterweise in festem, nassem Zustand, z.B. im lyophilisierten Präparat mit einem Wassergehalt von mehr als 5 Gew.% und weniger als 70 Gew.% in einem geschlossenen Behälter bei einer Temperatur von 50-121°C mindestens 10 min lang, bis die potenzielle Infektiosität des Präparates beseitigt ist, vorzugsweise 1 bis 30 h bei 60 bis 80°C.

Es kann beispielsweise auch eine wässerige Lösung enthaltend Blutgerinnungsfaktor XIII, erfindungsgemäß ohne Verwendung der üblichen Stabilisatoren erhitzt werden.

Die Hitzebehandlung in Lösung oder Suspension wird bei einer Temperatur von 55 bis 65°C, vorzugsweise bei etwa 60°C, und während einer Zeitdauer, die ausreicht, eventuell vorhandene Viren zu inaktivieren, durchgeführt, vorzugsweise während 2 min bis 100 Stunden. Am meisten bevorzugt wird eine Behandlungsdauer von 30 min bis 30 Stunden. Die benötigte Zeitdauer des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mit Hilfe von Modellviren, wie HIV,

Sindbis-, Polio-, FSME- und Vaccinia-Virus in einem Vorversuch bestimmt werden. Ein vor dem Erhitzen zugesetztes Virus darf nach dem Erhitzen nicht mehr nachweisbar sein.

Das erhaltene Präparat zeichnet sich durch seinen geringen Anteil an Denaturierungsprodukten aus, da trotz Erhitzen mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 80 % der biologischen Aktivität des Präparates erhalten bleibt. Dabei konnte beobachtet werden, daß die nach dem Erhitzen von hochkonzentrierten Präparaten auftretenden Trübungen in einer Lösung des Präparates ausbleiben. Die Extinktion E₆₀₀ des erfindungsgemäß erhitzten Präparates beträgt in einer Lösung mit mindestens 5 Gew.% Proteingehalt weniger als 0,1 (bei einer Schichtdicke von 1 cm, Referenz: Wasser). Als Ergebnis wird also ein in Lösung optisch klares Produkt, weitgehend frei von Denaturierungsprodukten, erhalten.

Es hat sich herausgestellt, daß der Zusatz eines Lösungsvermitt lers vor dem erfindungsgemäßen Erhitzen einer Lösung vorteilhaft ist. Einer Faktor XIII-haltigen Lösung kann beispielsweise Arginin zugesetzt werden, um den Effekt der Tensidwirkung auf die Reduktion der Trübungsbildung zu verstärken.

Auf einen Zusatz üblicher Stabilisatoren, wie z.B. Polyole und/ oder Aminosäuren oder deren Derivate, kann weitgehend verzichtet werden. Dies hat den Vorteil, daß die Virusinaktivierung rascher erfolgt und die Effektivität der Hitzebehandlung wesentlich besser ist. Die Entfernung der üblichen Stabilisatoren ist überdies aufwendig und kann somit vermieden werden.

Durch die hervorragende viruzide Wirkung der hochkonzentrierten Tenside kann auf die Verwendung organischer Lösungsmittel verzichtet werden. Das erfindungsgemäß behandelte Präparat enthält daher keine toxischen Spuren an organischen Lösungsmitteln.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet den Zusatz von Kohlenhydraten zum biologischen Präparat, wodurch die Hydratisierung vorhandener Proteine auch nach Lyophilisierung gewährleistet ist. So kann z.B. Saccharose oder Sorbit zur Hydratisierung von Proteinen im Präparat zugesetzt werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die virusinaktivierende Hitzebehandlung an einem an einen festen Träger adsorbierten Präparat vorgenommen, wobei das adsorbierte Präparat beim Erhitzen in einer Lösung eines Tensids suspendiert ist.

Nach Erhitzen kann das virusinaktivierte Präparat in bekannter Weise vom Träger getrennt werden. Blutfaktoren, wie Faktoren des Prothrombinkomplexes, werden beispielsweise an einem Ionenaustauscher oder an eine Affinitätsmatrix adsorbiert und in einer wässerigen Lösung in Anwesenheit hoher Tensidkonzentrationen suspendiert und erhitzt.

Das Tensid kann vorzugsweise vom Präparat durch geeignete Maßnahmen, wie Dialyse, chromatographische Reinigungsmethoden (z.B. durch Ionenaustauscher-Chromatographie) oder Proteinfällung abgetrennt werden. Beispielsweise kann das behandelte Präparat an einem festen Träger adsorbiert und tensidfrei gewaschen werden. Die Präzipitation der zu präparierenden Proteine mit Fällungsmitteln, wie Ethanol, Ammoniumsulfat oder Polyethylenglykol, die Flüssigphasenextraktion oder die Phasentrennung durch Zusatz von bestimmten Substanzen, wie Mischungen von Salz und Polyethylenglykol oder löslichem Dextran, sowie die Festphasenextraktion von Tensid an C18-Material ("reversed phase chromatography") sind gleichermaßen geeignete Methoden zur Abtrennung zumindest des Großteils an Tensid vom Präparat. Durch die geeigneten Maßnahmen zur Entfernung des Tensids wird die Tensidkonzentration im Präparat vorzugsweise auf weniger als 0,1 Gew.%, am meisten bevorzugt weniger als 0,01 Gew.% reduziert.

Die Verbesserung der Wirkung einer Hitzebehandlung durch die Anwesenheit von Tensiden ist überraschend. Aus der EP 0 345 246 ist ein Tensidzusatz zu einem Gewebeklebstoff-Lyophilisat lediglich zur Verkürzung der Rekonstitutionszeit bekannt. Dabei werden sehr geringe Konzentrationen von nachweislich toxikologisch unbedenklichen Tensiden verwendet. Das Tensid wird entweder im Lyophilisat inkorporiert oder dem Lyophilisat zugesetzt, welches gelöst werden soll. Das Tensid verbleibt hier also im lyophili- sierten Präparat und wird nicht abgetrennt, bzw. sogar dem Präparat zugesetzt. Dadurch ist die Wiederauflösbarkeit des Lyophilisates wesentlich verbessert, gemessen an der Rekonstitutionszeit. Eine verbesserte virusinaktivierende Wirkung wird nicht beobachtet.

Die verbesserte Wirkung einer Hitzebehandlung kann gezeigt werden, wenn sehr geringe Tensidmengen in einer wässerigen Lösung verwendet werden, welche per se nichtinaktivierend auf Viren wirken. Es kann also ein Virustiter in Gegenwart von Tensiden eingestellt werden, der erst durch die Hitzebehandlung eliminiert wird.

Die synergistische Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dann offensichtlich, wenn die Kinetik der Virusinaktivierung durch die Hitzebehandlung mit und ohne Tensidgehalt im Präparat miteinander verglichen wird. Modellviren, wie Vacciniavirus, Sindbis oder SIV (Simian Immunodeficiency Virus), werden in Ge genwart von an sich unwirksamen Mengen an Tensiden während einer Hitzebehandlung von Blutprodukten in festem, nassem Zustand rascher inaktiviert als während der Hitzebehandlung des Präparates ohne Tensidgehalt. Modellviren, die dem Präparat zugesetzt werden, sind unter geeigneten Bedingungen bereits nach 10 min, jedenfalls aber nach einer Stunde erfindungsgemäßer Hitzebehandlung abgetötet.

Der synergistische Effekt von Tensiden während einer Hitzebehandlung konnte nicht erwartet werden. Die solubilisierende Wirkung von Tensiden auf Membranproteine ist nämlich weitgehend von der Temperatur unabhängig. In der Fachwelt bestand die Meinung, daß eine bestimmte Konzentration eines Tensides entweder virusinaktivierend wirkt oder nicht, unabhängig von der Temperatur.

Auch wenn ein synergistischer Effekt methodenbedingt nur dann beobachtet werden kann, wenn eine Tensidkonzentration per se nicht virusinaktivierend wirkt (bei einer Konzentration unterhalb der CMC), so ist dieser Effekt selbstverständlich auch bei höheren Tensidkonzentrationen vorhanden.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter beschrieben:

B e i s p i e l 1 : Hitzebehandlung einer Faktor VIII-Präparation in Gegenwart von Octyl-ß-D-glucosid.

Eine Faktor VIII-hältige Präparation wurde gemäß der AT 391 808 hergestellt.

2,7 ml einer Lösung der Faktor VHI-hältigen Präparation (30 mg Protein/ml) wurden mit 0,3 ml einer Vacciniavirussuspension vermischt und der Lösung 0, 3 bzw. 15 mg Octylglucosid zugesetzt (0, 0,1, 0,5 Gew.%). Das Verhältnis Tensid zu Protein betrug 4:100 bzw. 19:100. Das Gemisch wurde lyophilisiert, auf einen Wassergehalt von 30 Gew.%, 20 Gew.%, 10 Gew.% bzw. ≤ 1 Gew.% (trocken) eingestellt und 10 Stunden lang bei 60°C erhitzt. Der Virustiter wurde jeweils nach 0, 1, 3 und 10 Stunden bestimmt. Ebenso wurde die spezifische Aktivität des Faktor VIII vor und nach der Hitzebehandlung bestimmt. Die Ergebnisse der Virusinaktivierung, sowie die Restaktivitäten nach den Hitzebehandlungen sind in Tabelle 1 angeführt.

Das Tensid wurde durch chromatographische Reinigung des Faktor VIII unter Verwendung eines Anionenaustauschers entfernt.

B e i s p i e l 2 : Hitzebehandlung einer Faktor VHI-Präparation in Gegenwart von Triton^® X-100

2.7 ml der Faktor VIII-hältigen Lösung aus Beispiel 1 wurden mit 0,3 ml einer Vacciniavirussuspension versetzt und der Lösung

15 mg Triton^® X-100 (0,5 Gew.%) zugesetzt. Das Verhältnis Tensid zu Protein betrug 19:100. Die Lösung wurde lyophilisiert und ein Wassergehalt von 20 Gew.% eingestellt. Danach wurde eine Hitzebehandlung bei 60°C vorgenommen. Der Virustiter wurde nach 0, 1, 3 und 10 Stunden bestimmt. Ebenso wurde die spezifische Aktivität des Faktors VIII bestimmt. Die Virusinaktivierung bzw. Restaktivitäten sind aus Tabelle 2 ersichtlich.

B e i s p i e l 3 : Hitzebehandlung einer Plasminogenpräparation in Gegenwart von Zwittergent^® 3-10

1.8 ml einer Lösung enthaltend Lys-Plasminogen, hergestellt nach dem Verfahren der AT 391 801 wurden mit 0,2 ml einer Vacciniavirussuspension vermischt, und der Lösung 10 mg Zwittergent^® 3-10 (0,5 Gew.%) zugesetzt. Das Verhältnis Tensid zu Protein betrug 1:100. Das Gemisch wurde lyophilisiert und auf einen Wassergehalt von 15 Gew.% eingestellt. Danach wurde auf 60°C erhitzt und der Virustiter nach 0, 1, 3 und 10 Stunden Dauer der Hitzebehandlung bestimmt. Ebenso wurde die spezifische Aktivität vor und nach der Hitzebehandlung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt.

Das Tensid wurde durch Dialyse entfernt. B e i s p i e l 4 : Hitzebehandlung einer Prothrombinkomplex- Präparation in Gegenwart von Tween 80

Eine Prothrombinkomplexfaktorenpräparation wurde nach der Methode von Brummelhuis ( "Methods of Plasma Protein Fractionation", J.M.Curling (ed.), S 117ff, Acad. Press, 1980) hergestellt.

1,35 ml einer Lösung dieser Präparation wurden mit 0,15 ml einer Sindbisvirussuspension vermischt und der Lösung 75 mg Tween 80 zugesetzt (5 Gew.%). Das Verhältnis Tensid zu Protein betrug 5:100. Das Gemisch wurde lyophilisiert und ein Wassergehalt von 9 Gew.% eingestellt. Die Hitzebehandlung wurde bei 60°C bzw.

80°C durchgeführt. Der Virustiter wurde nach 0, 1, 3 und 10 Stunden Dauer der Hitzebehandlung bei 60°C bestimmt, sowie nach einer weiteren Stunde Hitzebehandlung bei 80°C bzw. in einem weiteren Ansatz nach 20, 40 und ,60 Minuten bei 80°C. Die spezifische Aktivität wurde vor und nach der Hitzebehandlung bestimmt, die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt.

Das Tensid wurde durch chromatographische Reinigung des Prothrombinkomplex unter Verwendung eines Anionenaustauschers entfernt.

B e i s p i e l 5 : Hitzebehandlung einer Fibrinogenpräparation in Gegenwart von MEGA-10

Plasma wurde nach Cohn fraktioniert und die Cohn I-Fraktion enthaltend Fibrinogen hergestellt. 1,8 ml einer Lösung dieser Fraktion wurden mit 0,2 ml einer Vacciniavirussuspension vermischt und der Lösung Decanoyl-N-methylglucamid (MEGA-10) zugestzt, so daß dessen Konzentration in Lösung 0,2 Gew.% betrug. Das Verhältnis Tensid zu Protein betrug 2,5:100. Das Gemisch wurde lyophilisiert und ein Wassergehalt von 10 Gew.% eingestellt. Das Lyophilisat wurde 10 Stunden lang auf 60°C und anschließend 3 Stunden auf 80ºC erhitzt bzw. in einem weiteren Ansatz 3 Stunden lang auf 80°C. Der Virustiter wurde nach 0, 1, 3 und 10 Stunden Dauer der Erhitzung (60°C) bestimmt, sowie nach weiteren 3 Stunden (80°C). Ebenso wurde der Virustiter nach 1, 2 und 3 Stunden Dauer der Erhitzung (80°C) bestimmt. Die spezifische Aktivität des Fibrinogens wurde als gerinnbares Material pro Volumseinheit vor und nach der Hitzebehandlung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angeführt.

Das Tensid wurde durch Fällung des Fibrinogens mit Glycin entfernt.

B e i s p i e l 6 : Hitzebehandlung einer Thrombinpräparation in Gegenwart von 0,5 % Octyl-ß-D-glucosid

Eine Thrombinpräparation wurde nach dem Verfahren der österreichischen Anmeldung A 2183/91 hergestellt.

1,8 ml einer Lösung dieser Thrombinpräparation wurden mit 0,2 ml einer SlV-Suspension vermischt und der Lösung 10 mg Octylglucosid zugesetzt (0,5 Gew.%). Das Verhältnis Tensid zu Protein be trug 10:100. Das Gemisch wurde lyophilisiert und ein Wassergehalt von 10 Gew.% eingestellt. Die Hitzebehandlung wurde bei einer Temperatur von 60°C durchgeführt. Die spezifische Aktivität wurde vor und nach der Hitzebehandlung bestimmt. Der Virustiter wurde jeweils nach 0, 1, 3, 6 und 10 Stunden Dauer der Hitzebehandlung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angeführt.

Das Tensid wurde durch chromatographische Reinigung des Thrombins an einem Anionenaustauschers entfernt.

B e i s p i e l 7 : Hitzebehandlung einer Cl-Esterase-Inhibitor Präparation in Gegenwart von 0,5% Octyl-ß-D-glycosid

Ein Cl-Esterase-Inhibitor Präparat wurde nach dem Verfahren von Vogelaar et al (1973) Vox Sang. 26, 118-127 hergestellt.

1,8 ml einer Lösung dieses Präparates wurden mit 0,2 ml einer Vacciniavirussuspension vermischt und der Lösung 10 mg Octylglucosid zugesetzt (0,5 Gew.%). Das Verhältnis Tensid zu Protein betrug 12,5:100. Das Gemisch wurde lyophilisiert, ein Wassergehalt von 15 Gew.% eingestellt und auf 60°C erhitzt. Der Virustiter wurde jeweils nach 0, 1, 3, 6 und 10 Stunden Dauer der

Hitzebehandlung bestimmt. Die spezifische Aktivität wurde vor und nach der Hitzebehandlung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angeführt.

Der C1-Esterase Inhibitor wurde an DEAE-Sephadex adsorbiert und solange mit einem Puffer gewaschen, bis er frei von Tensid war.

Die in den Tabellen 1 bis 7 dargestellten Versuchsergebnisse zeigen deutlich, daß eine wesentlich erhöhte Geschwindigkeit der Inaktivierung von Viren bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber der Hitzebehandlung ohne Tensid auftritt.

Die unterschiedliche Nachweisgrenze der Virustiter bei dem Verfahrensvergleich ergibt sich aus der Wahl der Nachweismethode, welche durch die Anwesenheit von Tensiden bedingt ist. Diese unterschiedliche Nachweisgrenze ist in diesem Zusammenhang aber nicht von Belang.

B e i s p i e l 8: Hitzebehandlung von an Ionenaustauscher gebundenem aktiviertem Prothrombinkomplex (FEIBA) in Gegenwart von Tween-80 (Inaktivierung von Vaccinia-Virus)

15 mg DEAE-Sephadex A-50 (Fa. Pharmacia) wurden 15 min bei Raumtemperatur mit 1 ml einer Lösung von 30 g/1 NaCl in Wasser zur Quellung inkubiert. Danach wurde das Gel durch Zentrifugation vom Quellüberstand abgetrennt. Anschließend folgten fünf Waschungen des Gels mit je 1 ml Puffer (9 g/1 Na₂HPO₄.2H₂O, 7 g/l NaCl, pH 7,0) und weitere zwei Waschungen mit einem Puffer

(7 g/l Na₃Citrat.2H₂O, 7 g/l NaCl), wobei ebenfalls resuspendiert und zentrifugiert wurde.

30 ml frisch gefrorenes menschliches Citratplasma wurden bei 0 bis +4°C aufgetaut und das anfallende Kryopräzipitat durch Zentrifugation bei +2°C abgetrennt. Der daraus resultierende "Kryoüberstand" wurde mit dem gewaschen DEAE-Sephadex inkubiert, wobei FEIBA generiert und zusammen mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes und inertem Protein an das Gel adsorbiert wurde. Danach wurde koadsorbiertes Inertprotein vom DEAE-Gel durch Waschen mit einem Puffer (9 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 7 g/l NaCl) entfernt.

Der pufferfeuchte Gel-Proteinkomplex wurde nun mit 1 ml unverdünntem Tween-80 10 min bei 60°C suspendiert, wobei zuvor 0,1 ml einer Vacciniavirussuspension zugesetzt wurden. Der Virustiter wurde nach 2, 4, 6, 8 und 10 min bestimmt. Die Suspension des Gel-Proteinkomplexes in Tween-80 wurde dann mit einer Lösung von 30 g/1 NaCl in Wasser 1:10 verdünnt. Dabei wurde der Wirkstoff vom Gel eluiert. Das Tensid wurde aus dieser Lösung in bekannter Weise durch Adsorption mit Extracti-Gel^TMD Detergent Removing Gel (Fa. Pierce) entfernt. Die Lösung wurde nun gegen destilliertes Wasser dialysiert, eingefroren und lyophilisiert. Nach Rekonstitution des Lyophilisats wurde die FEIB-Aktivität gemäß der AT-350726 bestimmt.

Als Kontrolle dienten eine ebenso hergestellte Präparation von FEIBA, versetzt mit Virus, jedoch ohne Behandlung mit heißem Tensid, sowie eine Präparation ohne Tensid- und Hitzebehandlung.

B e i s p i e l 9 : Hitzebehandlung von an Ionenaustauscher gebundenem aktivierten Prothrombinkomplex (FEIBA) in Gegenwart von Tween-80 (Inaktivierung von FSME-Viren)

FEIBA wurde analog zu Beispiel 8 hergestellt. Zur Behandlung des pufferfeuchten Gel-Proteinkomplexes mit unverdünntem Tween-80 wurden jedoch 0,1 ml einer FSME-Virussuspension zugesetzt. Der Virustiter wurde nach 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 7 und 10 min bestimmt. Die FEIB-Aktivität im Eluat wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, bestimmt.

Als Kontrolle dienten wieder eine ebenso hergestellte Präparation von FEIBA, versetzt mit Virus, jedoch ohne Behandlung mit Tensid, sowie eine ebensolche Präparation ohne Tween-80- und ohne Hitzebehandlung.

Die Analysenergebnisse sind Tabelle 9 zu entnehmen.

B e i s p i e l 10 : Hitzebehandlung von an Ionenaustauscher gebundenem Prothrombinkomplex in Gegenwart von Tween-80 (Inaktivierung von Vaccinia-Viren)

30 ml frisch gefrorenes menschliches Citratplasma wurden bei 0 bis +4°C aufgetaut und das dabei anfallende Kryopräzipitat durch Zentrifugation bei +2°C abgetrennt. Der daraus resultierende "Kryoüberstand" wurde mit 2 IE Heparin/ml versetzt. Danach wurde die Lösung der Proteine des Prothrombinkomplexes mit 0,5 mg DEAE-Sephadex A-50 (Fa. Pharmacia) pro Milliliter adsorbiert. Der Gel-Proteinkomplex wurde von der Lösung abgetrennt und jeweils mit einem Puffer 1 (4 g/l Na₃Citrat.2H₂O, 7 g/l NaCl, 9 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 500 IE Heparin/l, pH 7,5) und anschließend mit Puffer 2 (4 g/l Na₃Citrat.2H₂O/l, 7 g/l NaCl, 500 IE Hepa- rin/1, pH 7,5) gewaschen.

Das gewaschene Gel wurde nun zur Virusinaktivierung mit 1 ml Tween-80 10 min bei 60°C suspendiert. Der Tensidlösung wurden 0,1 ml einer Vacciniavirussuspension zugesetzt. Der Virustiter wurde nach 2, 4, 6, 8 und 10 min bestimmt. Die Suspension des Gel-Proteinkomplexes in Tween-80 wurde anschließend mit einer Lösung von 1 g/l Na₃Citrat .2H₂O, 30 g/l NaCl, 1000 IE Heparin/l, pH 7,0, 1:10 verdünnt. Dabei wurde der Prothrombinkomplex eluiert. Das Tensid aus dieser Lösung wurde in bekannter Weise durch Adsorption mit Extracti-Gel^TM D Detergent Removing Gel (Fa. Pierce) entfernt. Die Prothrombinkomplex enthaltende Lösung wurde gegen einen Puffer, enthaltend 4 g/l Na₃Citrat.2H₂O und 8 g/l NaCl, pH 7,0, umgepuffert und lyophilisiert.

Im rekonstituierten Prothrombinkomplex wurde der Proteingehalt, sowie die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X bestimmt.

Als Kontrolle dienten ein wie oben beschrieben hergestellter Prothrombinkomplex, jedoch ohne Tensidbehandlung, sowie eine Präparation ohne Tensid- und Hitzebehandlung.

Die Resultate sind Tabelle 10 zu entnehmen.

B e i s p i e l 11: Hitzebehandlung von an Ionenaustauscher gebundenem Prothrombinkomplex in Gegenwart von Tween-80 ( Inaktivierung von FSME-Viren)

Prothrombinkomplex wurde analog zu Beispiel 10 hergestellt. Zur Behandlung des pufferfeuchten Gelproteinkomplexes mit unverdünntem Tween-80 wurden jedoch 0,1 ml einer FSME-Virussuspension zugesetzt. Der Virustiter wurde nach 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 7 und 10 min bestimmt. Im rekonstituierten Prothrombinkomplex wurde der Proteingehalt, sowie die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X bestimmt.

Als Kontrolle dienten ein, wie oben beschrieben hergestellter Prothrombinkomplex, jedoch ohne Tensidbehandlung, sowie eine Präparation ohne Tensid- und Hitzebehandlung.

Die Resultate sind Tabelle 11 zu entnehmen.

B e i s p i e l 12 : Stabilität des Faktor XIII beim Erhitzen in Losung (ohne Stabilisatoren) in Gegenwart eines Tensids

Eine Plasmafraktion (Cohn I Niederschlag) wurde mit der 10-fa- chen Menge einer citrathaltigen Pufferlösung, pH 7,0 (13,4 g/l Na₃Citrat.2H₂O, 29 g/l NaCl, 20 000 KIE Aprotinin/1) gelöst. Nach Zusatz von Ammoniumsulfat bis zur 16 %igen Sättigung (bei Raumtemperatur) wurde auf 4°C abgekühlt und das Gemisch noch 2 h gerührt. Der entstände Niederschlag wurde mit der Pufferlösung gelöst und die Fällung mit Ammoniumsulfat einmal wiederholt.

Der Niederschlag wurde in einer citrathaltigen Pufferlösung, pH 7,0 (5,9 g/l Na₃Citrat.2H₂O, 7 g/l NaCl, 100 KIE Aprotinin/l) gelöst und 10 min auf 56 °C erhitzt. Der entstandene Niederschlag aus denaturiertem Fibrinogen wurde abzentrifugiert. Der Hitzefällungsüberstand wurde durch Fällung mit 3,5 Gew.% PEG 4000 bei 4°C von Begleitproteinen befreit. Anschließend wurde der Faktor XIII durch Zugabe von PEG 4000 bis zu einer Konzentration von 10 Gew.% bei 4°C ausgefällt, durch Zentrifugieren abgetrennt und in 1/25 des ursprünglichen Volumens eines 0,1 gew.%igen Natriumcitratpuffers (pH 7,0) gelöst.

Die spezifische Aktivität betrug 21 E Faktor XHI/mg Protein. Die Lösung wurde geteilt und ein Teil mit 1 Gew.% Tween 80 versetzt. Beide Lösungen wurden 6 h lang auf 60°C erhitzt. Die Faktor XIII-Restaktivitäten nach 6 h Erhitzen betrugen 82 % ohne Tensidzusatz und 84 % mit Tensidzusatz.

B e i s p i e l 13: Beispiel 12 wurde mit verschiedenen Tensiden in unterschiedlichen Konzentrationen wiederholt (Erhitzen: 4 h, 60°C). TABELLE 12

Erhitzen einer Faktor XIII-haltigen Lösung in Anwesenheit von Tensid

Die Beispiele 12 und 13 zeigen, daß eine Hitzebehandlung von Faktor XIII in Gegenwart von Tensiden durchgeführt werden kann, ohne größere Verluste an Faktor XIII-Aktivität in Kauf nehmen zu müssen.

Das folgende Beispiel 14 illustriert die überraschend verbesserte Inaktivierungskinetik eines Modellvirus durch eine Hitzebehandlung in Gegenwart eines Tensids im Vergleich zur Hitzebehandlung ohne Tensidzusatz:

B e i s p i e l 14 : Inaktivierung eines Modellvirus (Sindbis) in einer Faktor XIII-haltigen Lösung in Anwesenheit bzw. Abwesenheit eines Tensids

Eine Faktor XIII-haltige Lösung entsprechend Beispiel 12 wurde geteilt und ein Teil mit 0,3 Gew.% n-Octylglukosid versetzt.

Beide Lösungen wurden auf 60°C erhitzt, mit 10 Vol.% einer

Sindbis-Virus-Suspension versetzt (Start der Virusinaktivierungsreaktion) und bei 60°C weiter inkubiert. In bestimmten Zeitabständen wurden Proben gezogen und der Virustiter bestimmt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 13 zusammenge stellt .

TABELLE 13

Virusinaktivierung in einer Faktor XIII-haltigen Lösung mit und ohne Tensid bei 60°C

Durch den Zusatz von Tensid wird eine noch schnellere und weitgehendere Virusinaktivierung erhalten, ohne größere Verluste an Faktor XIII-Aktivität in Kauf nehmen zu müssen (vergleiche Beispiel 13).

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :

1. Verfahren zur Herstellung eines virussicheren biologischen Präparates unter Anwendung eines Tensids und durch Erhitzen unter Erhaltung von mindestens 50 % der biologischen Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Erhitzen in Gegenwart des Tensids durchgeführt wird, worauf vorzugsweise das Tensid entfernt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tensid in einer Menge zugesetzt wird, entsprechend einer Konzentration von mindestens 1 Gew.%, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 98 Gew.%.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Tensid dem in Lösung vorliegenden Präparat zugesetzt wird, worauf dieses lyophilisiert und im lyophilisierten Zustand hitzebehandelt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das lyophilisierte Präparat auf einen Wassergehalt von mehr als 5 Gew.% und weniger als 70 Gew.% eingestellt wird und in einem geschlossenen Behälter bei einer Temperatur von 50 bis 121°C mindestens 10 min, vorzugsweise 1 bis 30 h bei 60 bis 80°C, hitzebehandelt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat in wässeriger Lösung vorliegt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Erhitzen bei einer Temperatur im Bereich von 55 bis 65°C während einer Zeitdauer durchgeführt wird, die ausreicht, um infektiöse Agentien zu inaktivieren, vorzugsweise während 2 Minuten bis 100 Stunden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß dem Präparat ein Kohlenhydrat, vorzugsweise

Saccharose oder Sorbit, zugesetzt wurden.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat an einem festen Träger adsorbiert ist, das adsorbierte Präparat in Suspension mit einem Tensid erhitzt wird und das virusinaktivierte Präparat gegebenenfalls vom Träger getrennt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung oder der Suspension ein Lösungsvermittler für Proteine zugesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat plasmatische Proteine enthält, vorzugsweise Faktoren der Gerinnung, Fibrinolyse und Thrombolyse, oder deren Inhibitoren.

11. Virussichere biologische Präparation, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die in Lösung optisch klar ist.

12. Verfahren zum Erhöhen der Virussicherheit eines biologischen Präparates unter Erhaltung von mindestens 50 %, vorzugsweise 80 % der biologischen Aktivität, insbesondere der Virussicherheit gegenüber membranumhüllten und nicht-membranumhüllten Viren, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat in Gegenwart eines Tensids in einer Konzentration von mindestens 1 Gew.%, vorzugsweise mehr als 10 Gew.%, bis zu 98 Gew.% erhitzt wird.

13. Verfahren zum Stabilisieren eines biologischen Präparates während einer Hitzebehandlung, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat in Gegenwart eines Tensids in einer Konzentration von mindestens 1 Gew.%, vorzugsweise mehr als 10 Gew.%, bis zu 98 Gew.% erhitzt wird.

14. Anwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 10 zur Erhöhung der Virussicherheit eines biologischen Präparates unter Erhaltung von mindestens 50 %, vorzugsweise 80 %, der biologischen Aktivität.

15. Verwendung eines Tensids zur Verbesserung der virusinaktivierenden Wirkung einer Hitzebehandlung eines biologischen Prä parates unter Erhaltung von mindestens 50 % der biologischen Aktivität.

16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Präparat in wässeriger Lösung, in Suspension oder in festem Zustand hitzebehandelt wird.