DE3888571T2

DE3888571T2 - Stabilisierung von biologischen und pharmazeutischen Produkten während der Inaktivierung von viralen und bakteriellen Keimen.

Info

Publication number: DE3888571T2
Application number: DE3888571T
Authority: DE
Inventors: Sudhish Chandra; Fred Feldman; Michael E Hrinda; Mark S Klekamp; Arthur B Shaw
Original assignee: Armour Pharmaceutical Co
Current assignee: Armour Pharmaceutical Co
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2008-05-21
Also published as: CA1337688C; EP0292003B1; IL86417A; AU1664288A; FI95778B; IL86417A0; DE3888571D1; JPS649937A; FI882387A; ATE103185T1; FI95778C; NO176234C; EP0292003A2; EP0292003A3; JP2879427B2; FI882387A0; JP2605102B2; NZ224740A; AU606159B2; NO882242D0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung biologischer und pharmazeutischer Produkte und soll deren Aktivität während einer Behandlung erhalten, die dazu dient, virale und/oder bakterielle Verunreinigungen zu inaktivieren. Insbesondere betrifft die Erfindung die Stabilisierung von proteinartigen Stoffen, die von biologischen Verunreinigungen, wie Viren usw., insbesondere dem Epstein-Barr-Virus (EBV) und Cytomegalovirus (CMV), infektiösen Hepatitisviren, wie dem Hepatitis B-Virus (HBV), dem non-A-non-B-Hepatitisvirus (NANBV) und dem menschlichen Immunschwächevirus (HTLV III/LAV/HIV), welcher AIDS verursacht, befreit werden sollen.
Biologische und pharmazeutische Produkte können verunreinigt sein oder stehen im Verdacht, durch Viren und Bakterien verunreinigt zu sein, welche sie ungeeignet und oft sehr gefährlich bei einer therapeutischen Verwendung machen. Eine solche Verunreinigung kann der Ausgangspunkt ansteckender Krankheiten sein, die ein großes Risiko für die Verwender dieser Produkte bedeuten.
Es ist möglich, die viralen und bakteriellen Verunreinigungen während der Anfangs- oder den Zwischenphasen der Herstellung oder in den Endprodukten zu inaktivieren. Inaktivierungsverfahren sind jedoch nicht sehr mild und führen normalerweise zum einem wesentlichen Aktivitätsverlust von labilen biologischen und pharmazeutischen Produkten. Daher ist es vor der Inaktivierung der Verunreinigungen notwendig, die biologischen und pharmazeutischen Produkte zu stabilisieren, um ihre Aktivität zu erhalten.
Diese Erfindung betrifft in ihrem allgemeinen Aspekt die Stabilisierung von biologischen und pharmazeutischen Produkten im flüssigen oder suspendierten Zustand, während sie von viralen und bakteriellen Verunreinigungen unter Anwendung thermischer, chemischer oder Bestrahlungs-Inaktivierungsverfahren, befreit werden.
In einem spezifischen Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung biologischer und Pharmazeutischer Produkte, die im flüssigen Zustand während ihrer Herstellung oder Reinigung pasteurisiert werden sollen.
Pasteurisierung in der Flüssigphase ist ein etabliertes Verfahren zur Inaktivierung pathogener Mikroorganismen, die aus biologischen Materialien, wie menschlichem Plasma, stammende Produkte verunreinigen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Stabilisatoren, welche die Inaktivierung von Proteinen verhindern, und eine Pasteurisierung mit einem minimalen Verlust an biologischer und therapeutischer Aktivität erlauben. Die Stabilisierung wird durch Zusatz von geeigneten Mengen eines oder mehrerer Mono-, Di- oder Trisaccharide oder Zuckeralkohole in Kombination mit einem oder mehreren Neutralsalzen vor der Pasteurisierung erreicht.
Wirkstoffe aus biologischen Quellen, die für therapeutische prophylaktische oder diagnostische Zwecke bestimmt sind, bilden ein großes und wichtiges Segment von Produkten, die in der Medizin eingesetzt werden. Beispiele solcher Produkte und ihre Verwendungen umfassen die folgenden Beispiele: Faktor VIII wird zur Behandlung von Hämophilie verwendet, Immunserumglobulin wird bei der Behandlung angeborenen gamma-Globulinmangels, Poliomyletitis und Heptatitis A und B eingesetzt; Antithrombin III ist ein Koagulationsinhibitor; der Plasminogen-Streptokinase-Komplex wird bei der Behandlung von Thrombusembolie verwendet und das Plasmawachstumshormon gleicht Wachstumsstörungen der Hirnanhangsdrüse aus.
Ein bedeutendes Problem, das mit der Verwendung therapeutischer Wirkstoffe aus biologischen Quellen verbunden ist, ist die Übertragung von Krankheiten, insbesondere viraler Krankheiten. Die vorherrschenden viralen Verunreinigungen schließen Hepatitis B-Virus (HBV), non-A-non-B- Hepatitisvirus (NANBV) und HTLV III/LAV/HIV, der AIDS verursacht, ein. Zur Sicherstellung, daß Produkte aus biologischen Quellen virusfrei sind, sind verschiedene Verfahren zur Virusinaktivierung vorgeschlagen worden. Diese können allgemein zusammengefaßt werden: Verfahren zum Erhitzen von Blutprodukten in wäßriger Lösung, falls erwünscht, unter Zusatz virusabtötender Substanzen; Verfahren zum Erhitzen von Blutprodukten in wäßriger Lösung in Anwesenheit von Stabilisatoren; Verfahren zur Behandlung von Blutprodukten mit organischen Lösungsmitteln; Verfahren zur Bestrahlung von Blutprodukten im festen Zustand; und Verfahren zum Erhitzen von Blutprodukten im trockenen Zustand.
All diese Verfahren zielen auf eine Zerstörung der potentiellen viralen und bakteriellen Infektiösität der Zubereitungen, während deren erwünschte biologische Aktivität im wesentlichen aufrechterhalten werden soll.
Beispielhafte Verfahren aus dem Stand der Technik, die für die vorliegende Erfindung von Bedeutung sein könnten, sind wie folgt:
US-Patent 4,456,590 (Rubenstein), betrifft ein Verfahren zur Hitzebehandlung von Plasmafraktionen in lyophilisierter Form zur Inaktivierung von Hepatitisvirus, der in den Fraktionen vorliegen kann.
US-Patent 4,314,997 (Shanbrom) lehrt einen chemischen Inaktivierungsprozeß, nachdem Plasma und Plasmaderivate in Lösung oder Suspension mit einem nicht-denaturierenden Amphiphil, d. h. einem oberflächenaktiven Mittel, in Kontakt gebracht werden, um eine irreversible Zerstörung von Endotoxinen und Inaktivierung von Hepatitisviren zu bewirken.
US-Patent 4,440,679 (Fernandes et al.) beschreibt ein Verfahren, worin therapeutisch wirksame Proteine durch Mischen der Proteinzusammensetzung mit einer pasteurisierungsstabilisierenden Menge eines Polyols vor der Pasteurisierung pasteurisiert werden.
US-Patent 4,297,344 (Schwinn et al.) offenbart ein Verfahren zur Stabilisierung beim Erhitzen der Gerinnungsfaktoren II, VIII, XIII, Antithrombin III und Plasminogen in wäßriger Lösung, welches den Zusatz von sowohl einer Aminosäure und einem oder mehreren Monosacchariden, einem Oligosaccharid oder einem Zuckeralkohol zur Lösung umfaßt.
US-Patent 4,585,654 (Landaburu et al.) betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in Plasmaproteinlösungen durch Erhitzen der Lösung in Gegenwart eines Polyols, eines oberflächenaktiven Mittels und eines Komplexbildners.
Mitra et al. (US-A-4,470,968) beschreiben ein Verfahren zur Pasteurisierung der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X in Gegenwart einer stabilisierenden Menge eines Polyols und einer Citrationenquelle.
EP-A-0 077 870 beschreibt die Virusinaktivierung Faktor VIII- Lösungen durch Erhitzen in Gegenwart eines Hauptstabilisators aus neutralen Aminosäuren, Monosacchariden, Polysacchariden oder Zuckeralkoholen und eines Hilfsstabilisators aus Carbonsäuresalzen mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen.
EP-A-0 177 836 beschreibt die Virusinaktivierung von Immunglobulinen durch Erhitzen im Trockenzustand in Gegenwart von Glycin, Natriumchlorid, Natriumacetat (Alkalimetallchloride und -acetate), PEG, Albumin oder Mannitol.
EP-A-0 196 761 beschreibt ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in Lösungen von gamma-Globulin durch Erhitzen in wäßriger Lösung in Gegenwart eines Monosaccharids, Disaccharids oder Zuckeralkohols und eines Hilfsstabilisators, ausgewählt aus neutralen anorganischen Säuresalzen, Salzen organischer Carbonsäuren (als Beispiele werden nur solche mit 3 bis 15 Kohlenstoffatomen angegeben) und oberflächenaktiven Mitteln. Die einzigen speziellen Neutralsalze, die in dieser Literaturstelle angegeben werden, sind alkalische Halogenide, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid.
EP-A-0 053 338 beschreibt die Virusinaktivierung von Präparationen der Faktoren IX und/oder X durch Erwärmung der Präparation in Gegenwart von Kalziumionen und einer Aminosäure und/oder eines Saccharids oder Zuckeralkohols.
EP-A-0 037 078 beschreibt ein Verfahren zur Hitzebehandlung von Faktor XIII in Gegenwart eines Hauptstabilisators, zusammengesetzt aus neutralen Aminosäuren, Monosacchariden und Zuckeralkoholen und eines Hilfsstabilisators, zusammengesetzt aus Salzen von Carbonsäuren mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen.
Nach Meinung einiger Forscher scheint das nasse Erhitzen von bestimmten biologischen Produkten wirksamer als das trockene Erhitzen zu sein. Zum Beispiel legen die Ergebnisse bei einem Vergleich einer Behandlung zur Sicherheit gegen NANBV-Übertragung durch nasses Erhitzen gegenüber trockenem Erhitzen nahe, daß das nasse Erhitzen einen höheren Grad an Sicherheit erreichte (Kernoff et al., The Lancet, 28. September 1985, Seite 721). Klinische Daten zeigen, daß in flüssiger Phase pasteurisiertes Faktor-VIII-Konzentrat kein Überträger von HBV, NANBV oder HTLV III/LAV/HIV während mehr als 6 Jahren an klinischer Erfahrung darstellte (International Congress of the World Federation of Hemophilia, 8. bis 13. Juni (1986); N. Heimburger: "Preparation of a F VIII-Concentrate free from pathogenic viruses"). Die Wirksamkeit einer Pasteurisierung in der Flüssigphase bei der Virusinaktivierung wird vielleicht am besten durch die Geschichte des Serumalbumins aufgezeigt, wo kein Fall einer Serumhepatitis nach Übertragung von erhitztem Albumin während eines Zeitraums von mehr als 35 Jahren nachgewiesen werden konnte (Milestones in Blood Transfusion and Immunohaemotology", Vox Sang 46:338-340 (1984)).
Die direkte Vorführung der viralen Inaktivierung durch Pasteurisierung im flüssigen Zustand hat gezeigt, daß Zytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Herpessimplexvirus, Poliovirus, Vacciniavirus, Hepatitis B-Virus, non-A-non-B-Hepatitisvirus und HTLV III/LAV/HIV alle aktiviert werden, und ferner, daß keine Neoantigene während der Pasteurisierung im flüssigen Zustand gebildet werden ("Pasteurization as an Efficient Method to Inactivate Blood Borne Viruses in Factor VIII Concentrates", J. Hilfenhous und E. Weidman; Arzneimittelforschung/Drug Res. 36(I) Nr. 4 (1986)).
Unter der Voraussetzung, daß Pasteurisierung in der Flüssigphase ein bewährtes Mittel zur Inaktivierung viraler Verunreinigungen darstellt, wird es notwendig, thermisch empfindliche bioaktive Moleküle gegen Hitzeinaktivierung zu stabilisieren. Stabilisierung gegen thermische Inaktivierung dieser Produkte wird durch die Verwendung von einem oder mehreren Mono-, Di- oder Trisacchariden oder Zuckeralkoholen in Kombination mit einem oder mehreren Neutralsalzen erreicht.
Dieses Verfahren unterscheidet sich wesentlich von den nächstverwandten Verfahren, wie oben in den Literaturstellen aus dem Stand der Technik beschrieben. Dies wird wie folgt belegt:
(a) Das Verfahren unterscheidet sich vom Verfahren, das eine Kombination von Monosacchariden, Oligosacchariden oder Zuckeralkoholen mit Aminosäuren oder bestimmten Aminosäureanalogen anwendet, durch Ersatz der Aminosäuren und ihrer Analoge mit einem Neutralsalz. Mit diesem Ersatz sind bestimmte Vorteile verbunden. Erstens kann der Zusatz stabilisierender Mengen von Aminosäuren zu einem biologischen oder pharmazeutischen Produkt Inaktivierung aufgrund abrupter und oft bedeutender pH-Veränderungen bewirken. Dieser Effekt wird durch die Verwendung stabilisierender Salze minimiert oder eliminiert. Zweitens sind viele Aminosäuren in wäßrigen Lösungsmitteln kaum löslich, wogegen die meisten stabilisierenden Salze ziemlich löslich sind, was den Zusatz höherer Konzentrationen an Stabilisator erlaubt. Drittens ist es bei Verwendung von Aminosäuren als Stabilisatoren notwendig, den gesamten restlichen Stabilisator aus dem Endprodukt zu entfernen, da eine intensive Therapie mit einem pharmazeutischen Produkt, welches Restaminosäure enthält, das Entgiftungssystem des Körpers bei Patienten mit schwerer Leber- oder Nierenschädigung überlasten könnte.
(b) Das Verfahren unterscheidet sich auch von dem Verfahren, welches die Verwendung eines Polyols als alleinigen Stabilisator beansprucht. Pasteurisierung unter Verwendung von nur einem Polyol bei Fehlen von Glycin führt zu einer relativ geringen Ausbeute an z. B. Faktor VIII-Aktivität. Es ist auch offensichtlich, daß die endgültigen Formulierungen der Beispielprodukte Glycin enthalten, und daß daher die Pasteurisierungsbedingungen denjenigen ähneln, bei denen ein Zucker in Kombination mit einer Aminosäure verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in einem biologischen oder pharmazeutischen Material, umfassend die Schritte: Vermischen des Materials in einer wäßrigen Lösung, die mindestens einen primären Stabilisator, ausgewählt aus Zuckern oder Zuckeralkoholen, und mindestens einen sekundären Stabilisator, ausgewählt aus Neutralsalzen, enthält, Einstellen des pH-Werts der wäßrigen Lösung auf ca. 5,0 bis 10,0, Durchführung eines Pathogen-Inaktivierungsprozesses mit der wäßrigen Lösung, und wahlweise Entfernen der primären und sekundären Stabilisatoren aus der wäßrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Stabilisator ausgewählt ist aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Lithiumacetat, Magnesiumacetat, Ammoniumacetat, Bariumacetat, Natriumsalfat, Ammoniumsulfat, Lithiumsulfat, Bariumsulfat, Kaliumsulfat und Magnesiumsulfat.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in einem biologischen oder pharmazeutischen Material zur Verfügung, indem das Material in wäßriger Lösung mit einem oder mehreren primären Stabilisatoren, ausgewählt aus Mono-, Di- oder Trisacchariden oder Zuckeralkoholen mit einer Konzentration von 10 Gew./Vol.-% bis zur Sättigung vermischt wird, ein oder mehrere sekundäre Stabilisatoren, ausgewählt aus den obigen Salzen in Konzentrationen von 0,01 M bis zur Sättigung unter Erhalt einer Mischung zugesetzt werden, Pathogene durch Einhalten einer Temperatur von 30ºC bis 100ºC über 1 min bis 72 h thermisch inaktiviert werden, der pH-Wert in einen Bereich von 6,7 bis 7,7 eingestellt wird, und die primären und sekundären Stabilisatoren nach der thermischen Inaktivierung entfernt werden.
Erfindungsgemäß werden die biologischen und pharmazeutischen Produkte in Gegenwart primärer und sekundärer Stabilisatoren pasteurisiert, die einen kombinierten Effekt bilden, welcher sicherstellt, daß die Aktivität der Produkte während des Erwärmungsprozesses aufrechterhalten bleibt.
Die Hitzebehandlung wird bei einer Temperatur und für einen Zeitraum durchgeführt, der ausreicht, die Pathogene, insbesondere infektiöse Viren, zu inaktivieren, jedoch gleichzeitig die Aktivität der Produkte aufrechterhält. Eine solche Hitzebehandlung wird für ca. 1 min bis 72 h bei einer Temperatur von 30ºC bis 100ºC, vorzugsweise für ca. 10 bis 20 h bei 55ºC bis 70ºC, und besonders bevorzugt für 10 h bei 60ºC forgesetzt.
Bei dieser Entfernung von Pathogenen aus den biologischen/pharmazeutischen Produkten wird ein wäßriges Medium eingesetzt, indem die primären und sekundären Stabilisatoren gelöst oder suspendiert sind. Das zu pasteurisierende Produkt wird mit dem Medium in Kontakt gebracht und den Pasteurisierungsbedingungen, welche zur Deaktivierung der Pathogene genügen, unterworfen. Die Behandlung des Produktes kann in jedem Stadium des Produktionsverfahrens durchgeführt werden, z. B. auf der Stufe des Ausgangsmaterials oder zu einem späteren Schritt in der Produktionsfolge, oder, bei gewissen Produkten, nach Abschluß des Herstellungsverfahrens. Im Anschluß an den Zusatz der Stabilisatoren wird der pH-Wert eingestellt, falls notwendig, auf einen Bereich von 1 mg/ml bis ca. 500 mg/ml, und besonders bevorzugt bei ca. 1 bis 100 mg/ml.
Nach Abschluß der Pasteurisierung werden die Stabilisatoren durch geeignete Mittel entfernt, welche umfassen: Dialyse (McPhie, P. (1971), Methods in Enzymol. 22, Seiten 23-32); Diafiltration (Blatt, W.F. et al. (1968) Anal. Biochem. 26, Seite 151); Säulenchromatographie (Porath, J. und Flodin, P. (1959), Nature 183, Seiten 1657-1659); Präzipitation (Dixon, M. und Webb, E.C. (1961), Adv. in Protein Chem. 16, Seiten 197-219, Academic Press, N.Y.; Honig, W. und Kula, M. R. (1976) Anal. Biochem. 72, Seiten 502-512) oder nach jedem anderen Verfahren, nach welchem die Stabilisatoren entfernt werden können.

Produkte

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf eine große Anzahl und Palette von Materialien und Produkte im biomedizinischen und pharmazeutischen Bereich anwendbar, welche zur Verwendung beim Menschen oder Tier für biomedizinische oder therapeutische Zwecke wie auch für nicht-therapeutische experimentalle Zwecke beabsichtigt sind. Die in Frage kommenden Materialien und Produkte, welche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren pathogenfrei gemacht werden können, schließen die im folgenden genannten ein, sind jedoch nicht auf sie beschränkt:
Blutfraktionen, wie antihämophiler Faktor (Smith, J.K. und Bidwell, E. (1979) Clinics in Haematol. 8, Seiten (184-205); Prothrombinkomplex, d. h. Faktoren II, VII, XI und X (Chandra, S. und Brummelhuis, H.G.J. (1981) Vox Sang. 41, Seiten 257-273); Protein C (Stenflo, J. (1976) J. Biol. Chem. 251, Seiten 355-363 und Bajaj, S. P. et al. (1983) Prep. Biochem. 13, Seiten 191-214); Protein S (DiScipio, R. G., et al. (1977) Biochemistry 16, Seiten 698-706); Antithrombin III (Rosenberg, R.D., und Damus, P.S. (1973) J. Biol. Chem. 248, Seiten 6490-6505; C-1-Esteraseinhibitor (Heimburger, N. (1974) Bayer Symposium V "Proteinase Inhibitors", Seiten 14-22, Springer-Verlag); alpha-1-Antitrypsin (Heimburger, N. supra.); Fibronectin (Mosesson, M.N. und Amrani, D. L. (1980), Blood 56 Seiten 145-158); gamma-Globulin (Oncley et al. (1949) J. Amer. Chem. Soc. 71, Seiten 541-550); biologische oder pharmazeutische Produkte menschlichen oder tierischen Ursprungs, wie Insulin, Enzyme, Coenzyme, Antikörper und Hormone; biologische oder pharmazeutische Produkte aus der menschlichen oder tierischen Plazenta, wie Blutfraktionen und Impfstoffe; biologische oder pharmazeutische Produkte aus rekombinanten DNA-Techniken und hergestellt in Bakterien, Pilzen oder Säugerzellkultursystemen (Vane, J. und Cuatrecases, P. (1984), Nature 312, Seiten 303-305 und Maniatis, T. et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.). Diese Produkte und Materialien sind von verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich oder können nach wohlbekannten präparativen Techniken hergestellt werden. Z. B. können Blutfraktionen und Blutproteine aus dem menschlichen Blutplasma durch Fraktionierung nach bekannten Techniken gewonnen werden, so z. B. durch die Cohn'sche Alkoholfraktionierung, beschrieben im US-Patent 2,390,074 und Journal of the American Chemical Society, Band 68, Seite 459 (1946). Diese Verfahren, wie auch die anderen Techniken, sind im "The Plasma Proteins", 2. Auflage, Band III, Seiten 548-550, Academic Press, New York, N.Y. (1977) zusammengefaßt.

Primäre Stabilisatoren

Die primären Stabilisatoren umfassen Mono-, Di- oder Trisaccharide und Zuckeralkohole, z. B. Glukose, Saccharose, Xylose, Fructose und Mannitol, Glucosaminitol, Sorbitol, Galactosaminitol und ähnliche. Einer oder mehrere dieser Stabilisatoren werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einem Konzentrationsbereich von 10 Gew./Vol.-% bis zur Sättigung eingesetzt.
Der bevorzugte primäre Stabilisator ist Saccharose in einer Konzentration von ca. 50 bis 70 Gew./Vol.-%.

Sekundäre Stabilisatoren

Die sekundären Stabilisatoren bestehen aus bestimmten Neutralsalzen und werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Konzentration von 0,01 M bis zur Sättigung eingesetzt. Die stabilisierenden Salze, wie für den erfindungsgemäßen Zweck definiert, sind Neutralsalze üblicher organischer und Mineralsäuren, ausgewählt aus Natriumacetat, Ammoniumacetat, Kaliumacetat, Natriumphosphat, Natriumsulfat und Ammoniumsulfat, Lithiumsulfat, Kaliumsulfat, Magnesiumsulfat, Bariumsulfat, Lithiumacetat, Magnesiumacetat und Bariumacetat.
Die Konzentration des verwendeten stabilisierenden Salzes hängt von zwei Parametern ab. Erstens wird sie von der Löslichkeit des Moleküls und zweitens von der Konzentration, bei der das Aussalzen des (der) Proteins (Proteine) in Lösung aufzutreten beginnt, bestimmt.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung und sollen sie nicht als beschränkend für die Erfindung ausgelegt werden.

Beispiel 1

Pasteurisierung eines Niedrig-Fibrinogen-AHF-Konzentrats

Stabilisierung durch Saccharose + Natriumacetat

Jede von drei Ampullen Factorate-LF (Niedrigfibrinogen Faktor VIII, hergestellt durch Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) wurde in 10 ml Wasser zur Injektion rekonstituiert. Zur ersten wurden 1,0 g Saccharose pro ml Lösung plus 0,5 g Natriumacetat pro ml Lösung zugegeben. Zur zweiten wurde 1 g Saccharose pro ml Lösung zugesetzt. Keine Stabilisatoren wurden zur dritten Ampulle zugegeben. Der pH-Wert der drei Lösungen wurde auf 7,0 unter Verwendung einer geringen Menge von 0,5 N Salzsäure eingestellt. Die Lösungen wurden auf 60ºC für 10 h erhitzt. Proben vor und nach der Pasteurisierung aus jeder Lösung wurden auf Prokoagulans-Aktivität (F.VIII:C) durch das einstufige "Activated Partial Thromboplastin Time" (APTT)-Verfahren, getestet, welches im wesentlichen den Verfahren, beschrieben von Hardisty, R.M. und MacPherson, J.C. (1962), Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 7, Seiten 215-229 und Zacharski, L. R. und Rosenstein, R. (1978), Amer. J. Clin. Path. 70, Seiten 280-286 entspricht. Die Ergegnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt: Tabelle 1 F.VIII-Einheiten/ml Stabilisatoren vor Pasteurisierung nach Pasteurisierung % Ausbeute Saccharose + Natriumacetat: Saccharose: Keine:

Beispiel 2

Pasteurisierung von hochgereinigtem Faktor VIII:C

Stabilisierung durch Saccharose + Natriumacetat

Monoclate (Faktor VIII:C, hergestellt von Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) wurde auf die folgende Weise pasteurisiert. Drei Aliquots zu je 10 ml (ca. 500 Einheiten) ultrafiltrierten Eluats aus einer Anti-F.-VIII:R-Sepharose-C1-2B-Säule wurden verwendet. Das erste Aliquot wurde mit 1,0 g Saccharose pro ml Lösung plus 0,5 g Natriumacetat pro ml Lösung vermischt. Zum zweiten Aliquot wurde 1,0 g Saccharose pro ml Lösung zugesetzt. Keine Stabilisatoren wurden dem dritten Aliquot zugegeben. Der pH-Wert der drei Lösungen wurde auf 7,0 mit einer kleinen Menge von 0,5N Salzsäure eingestellt. Die Lösungen wuden bei 60ºC 10 h erhitzt. Proben vor und nach der Pasteurisierung wurden auf Prokoagulans-Aktivität (F.VIII:C) durch das einstufige APTT-Verfahren, wie in Beispiel 1 angegeben, getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 F.VIII-Einheiten/ml Stabilisatoren vor Pasteurisierung nach Pasteurisierung % Ausbeute Saccharose + Natriumacetat: Saccharose: Keine:

Beispiel 3

Pasteurisierung von hochgereinigtem Faktor VIII:C

Stabilisierung durch Saccharose + Natriumsulfat

Monoclate (Faktor VIII:C, hergestellt von Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) wurde auf die folgende Weise pasteurisiert. Zwei Aliquots zu je 10 ml (ca. 500 Einheiten) ultrafiltrierten Eluats aus einer Anti-F.-VIII:R-Sepharose-C1-2B-Säule wurden verwendet. Das erste Aliquot wurde mit 1,0 g Saccharose pro ml Lösung plus 0,28 g Natriumsulfat pro ml Lösung vermischt. Zum zweiten Aliquot wurde 1,0 g Saccharose pro ml Lösung zugesetzt. Der pH-Wert der beiden Lösungen wurde auf 7,0 mit einer kleinen Menge von 0,5 N Salzsäure eingestellt. Die Lösungen wuden bei 60ºC 10 h erhitzt. Proben vor und nach der Pasteurisierung wurden auf Prokoagulans-Aktivität (F.VIII:C) durch das einstufige APTT-Verfahren, wie in Beispiel 1 angegeben, getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 3 F.VIII-Einheiten/ml Stabilisatoren vor Pasteurisierung nach Pasteurisierung % Ausbeute Saccharose + Natriumacetat: Saccharose

Beispiel 4

Pasteurisierung eines Niedrig-Fibrinogen-AHF-Konzentrats

Stabilisierung durch Saccharose + verschiedene Neutralsalze

Eine jede von neun Ampullen mit Factorate-LP (Niedrig-Fibrinogen Faktor VIII, hergestellt von Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) wurde in 10 ml Wasser zur Injektion rekonstituiert. Nach Abschluß der Rekonstitution wurde 1,0 g Saccharose pro ml Lösung zu jeder Ampulle zugegeben. Anschließend wurden verschiedene stabilisierende Salze in Konzentrationen von 1 bis 2 M zu jeder der Factorate-LF /Saccharose-Lösungen zugesetzt. Die verwendeten Salze waren: Kaliumacetate (2,0 g), Ammoniumacetat (1,6 g), Natriumsulfat (2,8 g), Ammoniumsulfat (2,6 g), Natriumchlorid (1,2 g), Ammoniumchlorid (1,1 g), Magnesiumchlorid (0,95 g), Cholinchlorid (2,8 g) und dibasisches Natriumphosphat (1,4 g). Der pH-Wert der Lösungen wurde dann auf 7,0 unter Verwendung von entweder 0,5 N Salzsäure oder 0,5 N Natriumhydroxid, mit Ausnahme der Lösung, welche Natriumphosphat enthielt, eingestellt. Der pH-Wert dieser Lösung war uneingestellt 8,2. Die Lösungen wurden auf 60ºC für 10 h erhitzt. Proben vor und nach Pasteurisierung aus jeder Lösung wurden auf Prokoagulans-Aktivität (F.VIII:C) durch das einstufige APTT-Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4 Stabilisatoren % Ausbeute an F.VIII nach Pasteurisierung Saccharose + Kaliumacetat Saccharose + Ammoniumacetat Saccharose + Natriumsulfat Saccharose + Ammoniumsulfat Saccharose + Natriumchlorid Saccharose + Ammoniumchlorid Saccharose + Magnesiumchlorid Saccharose + Cholinchlorid Saccharose + dibasisches Natriumphospaht
Die folgenden Schlußfolgerungen ergeben sich naheliegend aus den in den Beispielen beschriebenen Tests und den in den Tabellen aufgeführten Ergebnissen:
Die Pasteurisierung von proteinartigen Materialien bei 60ºC über 10 h führt zu einer beinahen bis vollständigen Zerstörung ihrer Aktivität, wogegen die Verwendung eines Zuckeralkohols (Saccharose) allein den Aktivitätserhalt verbessert. Es ist jedoch wesentlich weniger wirksam, als wenn eine Kombination eines Zuckers und eines bestimmten stabilisierenden Salzes als Stabilisatoren eingesetzt werden, und die Kombination eines Zuckers mit bestimmten stabilisierenden Salzen als Stabilisatoren ist der Kombination eines Zuckers und anderen stabilisierenden Salzen überlegen.

Andere Ausführungsformen

Gemäß eine weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Stabilisierung von biologischen oder pharmazeutischen Produkten auch erreicht werden, wenn andere Verfahren als Pasteurisierung zur bakteriellen und viralen Inaktivierung verwendet werden. Diese Verfahren umfassen: chemische Inaktivierung, z. B. unter Verwendung von Ozon als Pathogen-deaktivierendes Mittel, beschrieben im US-Patent Nr. 4,632,980, Verwendung einer organischen Verbindung zur Förderung der Deaktivierung, wie im US-Patent Nr. 4,640,834 beschrieben, oder Einwirkung von hochenergetischer Bestrahlung (UV, Infrarot und gamma), wie beschrieben im US-Patent Nr. 2,897,123.
Es ist offensichtlich, daß zahllose Abwandlungen und Variationen der Erfindung, ohne von ihrem Geist und Umfang abzuweichen, durchgeführt werden können. Die beschriebenen spezifischen Ausführungsformen dienen nur als Beispiel, und die Erfindung ist nur auf dem Umfang der anliegenden Ansprüche beschränkt.

Claims

1. Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen in einem biologischen oder pharmazeutischen Material, umfassend die Schritte: Vermischen des Materials in wäßriger Lösung, die mindestens einen primären Stabilisator, ausgewählt aus Zuckern oder Zuckeralkoholen, und mindestens einem sekundären Stabilisator, ausgewählt aus Neutralsalzen, enthält, Einstellen des pH-Werts der wäßrigen Lösung auf ca. 5,0 bis 10,0, Einwirken eines Pathogen-inaktivierenden Prozesses auf die wäßrige Lösung, und wahlweise Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß der sekundäre Stabilisator ausgewählt ist aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Lithiumacetat, Magnesiumacetat, Ammoniumacetat, Bariumacetat, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Lithiumsulfat, Bariumsulfat, Kaliumsulfat und Magnesiumsulfat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Pathogen-inaktivierende Prozeß eine Hitzebehandlung der wäßrigen Lösung bei einer Temperatur von 30ºC bis 100ºC für ca. 1 min bis 72 h umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Pathogen-inaktivierende Prozeß chemische Inaktivierung oder Bestrahlung umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der pH-Wert der wäßrigen Lösung auf ca. 6,7 bis ca. 7,7 eingestellt wird, und die Lösung Pasteurisierungsbedingungen unterworfen wird, die ausreichen, die darin enthaltenen Pathogene zu deaktivieren.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Pasteurisierung bei einer Temperatur von ca. 55ºC bis 70ºC für 10 bis 20 h durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der primäre Stabilisator ein Mono-, Di-, Trisaccharid ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Zucker sind: Glukose, Saccharose, Xylose, Fructose, Mannitol; und die Zuckeralkohole sind: Galactitol, Glucosaminitol, Sorbitol oder Galactosaminitol.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der primäre Stabilisator in einer Konzentration von 10 Gew./Vol.-% bis zur Sättigung vorliegt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Stabilisator Saccharose in einer Konzentration von ca. 50 Gew./Vol.-% bis 70 Gew./Vol.-% ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der zweite Stabilisator in einer Konzentration von ca. 0,01 M bis zur Sättigung vorliegt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der sekundäre Stabilisator in einer Konzentration von ca. 0,5 M bis ca. 2,5 M vorliegt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das Entfernen der primären und sekundären Stabilisatoren durch Diafiltration, Dialyse, Säulenchromatographie oder durch Präzipitation erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Material sich in einem Herstellungstadium des Endprodukts befindet, ein Wirkstoff im Endprodukt oder das Endprodukt selbst ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das Material Faktor VIII oder Prothrombinkomplex ist.

15. Proteinartiges Produkt, welches in einem erwünschten Herstellungsstadium nach einem Verfahren entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 14 behandelt wurde.