PT1289535E - Entidades apoptóticas para utilização no tratamento de desordens neurodegenerativas e de outras desordens neurológicas - Google Patents
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Description
ΡΕ1289535 1 DESCRIÇÃO "ENTIDADES APOPTÓTICAS PARA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE DESORDENS NEURODEGENERATIVAS E DE OUTRAS DESORDENS NEUROLÓGICAS"
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se para composições bioquímicas e biológicas e para as sua utilizações no tratamento e/ou profilaxia de várias desordens neurodegenera-tivas e outras desordens neurológicas em pacientes mamíferos. Mais particularmente, refere-se para o tratamento e profilaxia de desordens neurodegenerativas e outras desordens neurológicas por administração de composições que contêm os materiais celulares do mamífero e seus fragmentos, e para as composições que contêm os materiais celulares mamífero e os próprios fragmentos, e para processos para preparar tais composições.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO São reconhecidos dois mecanismos de morte celular no corpo, necrose e apoptose. Apoptose é o processo de morte celular programada, descrito por Kerr et al. em 1992 [Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR (1992). "Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in 2 ΡΕ1289535 tissue kinetics. "British Journal of Câncer 26: 239-257"], por cujos níveis de estado estacionário de vários sistemas de órgãos e tecidos no corpo são mantidos como divisão celular contínua e acontece diferenciação. Células que sofrem apoptose frequentemente exibem mudanças morfológicas distintivas tal como uma diminuição pronunciada no volume celular, modificação do citosqueletos resultando em pronunciada formação de bolhas na membrana, uma condensação da cromatina, e degradação do ADN em fragmentos de oligonucleosomais. Seguindo estas mudanças morfológicas, uma célula apoptótica pode quebrar em vários fragmentos pequenos conhecidos como corpos apoptóticos, consistindo essencialmente em corpos de ligação de membrana que contêm organelas intactas, cromatina, etc. Os corpos apoptóticos normalmente são rapidamente removidos do corpo por fagocitose atreves dos macrófagos, células dendríticas e outros antigénios presentes nas células, antes que se possam tornar lisadas e libertem os seus conteúdos intracelulares potencialmente pró-inflamatórios.
Pensa-se que a apoptose ocorre, num esboço simples, como segue. Podem ser identificadas três fases no mecanismo de apoptótico de morte celular programada: • Fase de indução; • Fase efectora; e • Fase de degradação. A fase de indução é dependente, em parte, das 3 ΡΕ1289535 interacções específicas de sinais de indução de morte na membrana da superfície celular. Um sinal comum é iniciado pela ligação de ligandos específicos a receptores da familiar de receptores de TNF presentes na membrana celular. Um tal receptor importante é Fas (APO-1, CD95) que interage com um ligando Fas para iniciar a apoptose. A fase efectora, activada pela ligação de receptores e ligandos da fase de indução, conduz à activação de caspases, proteinases que requerem cistinil-aspartato (enzimas de proteolíticas), incluindo caspases 1 e 8. Esta activação pode ser associada com uma mudança na permeabilidade da mitocôndria, permitindo a libertação do citocromo-c que está envolvido na activação da caspase. As caspases activadas iniciam uma cadeia de eventos prote-olíticos letais que culminam nas mudanças em cromatina e componentes do citoesqueleto observado na apoptose.
Muitas células que sofrem apoptose podem ser identificadas por um padrão escada característico do ADN observado em electroforese de gel de agarose, sendo o resultado da clivagem de ADN numa série de fragmentos. Estas modificações acontecem algumas horas antes da morte da célula como definido pela capacidade de uma célula para excluir corantes vitais. 0 aparecimento do padrão escada de ADN em electroforese de gel de agarose seguido de extracção de ADN das células é um método reconhecido de identificação de apoptose em células [Loo, D.T. and Rillema, J. R. (1998) "Measurement of Cell Death, "Methods in Cell Biology 57: 4 ΡΕ1289535 251-264], embora nem sempre seja bastante sensível para detectar a apoptose. A marcação in situ de fragmentação de ADN nuclear, por exemplo, utilizando ensaios de marcação de fragmentos terminais dUTP (TUNEL) comercialmente disponíveis, são uma medida alternativa e mais reprodutível para a determinação de ADN fragmentado em células apoptóticas e células que sofrem apoptose [Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA (1992), "Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation". Journal of Cell Biology 119: 493-501].
Durante a apoptose, a fosfatidilserina fica externamente exposta na membrana de célula [Fadok VA, Voelker DR, Campbell PA, Cohen jj, Bratton DL, Henson PM (1992), "Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages". Journal of Immunology 148: 2207-2216] e esta fosfatidilserina exposta liga-se a receptores específicos para mediar a retoma e depuração de células de apoptóticas em mamíferos [Fadok VA, Bratton DL, Rose DM, Pearson A, Ezekewitz RAB, Henson PM (2000), "A receptor for phosphatidylserinespecific clearance of apoptotic cells", Nature 405: 85-90]. A expressão de superfície da fosfatidilserina em células é outro método reconhecido de identificação de células apoptóticas.
Mudanças na integridade mitocondrial estão infimamente associadas com apoptose, resultando em alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial e a libertação 5 ΡΕ1289535 de citocromo-c das mitocôndrias no citoplasma da célula [Susin, S.A., Lorenzo, H.K., Zamzami, N., Marzo, I, Brenner, C., Larochette, N., Prevost, M.C., Alzari, P.M. and Kroemer, G. (1999) "Mitochondrial Release of Caspase-2 and -9 during the Apoptotic Process", Journal of Experimental Medicine, 189: 381-394]. Medições nas mudanças no potencial da membrana mitocondrial, reflectindo mudanças na permeabilidade de membrana mitocondrial, é outro método reconhecido de identificação de células apoptóticas.
Também foram descritos na literatura científica vários outros métodos de identificação de células que sofrem apoptose e de células apoptóticas, muitos que usam anticorpos monoclonais contra marcadores específicos para células apoptóticas, . A necrose, pelo contrário, é a morte da célula de uma natureza patológica, resultando de lesão, efeito de toxina bacteriana, mediadores inflamatórios, etc., e envolvendo ruptura de membrana e libertação dos conteúdos intracelulares ao tecido circundante, frequentemente com consequências inflamatórias prejudiciais. Consequentemente, um dos modos pelo qual podem ser detectadas e caracteri-zadas células necróticas é pela detecção de membranas celulares comprometidas, por exemplo por métodos de coloração com iodeto de propídio seguidos por citometria de fluxo ou microscopia.
Num primeiro aspecto da presente invenção é 6 ΡΕ1289535 fornecida a utilização de corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas na preparação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de uma perturbação neurodegenerativa ou neurológica num paciente mamífero, sendo os corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas compatíveis com as células sanguíneas do paciente.
Num segundo aspecto da presente invenção é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma suspensão líquida de material celular, desde 10% até 90% do referido material celular sendo corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas.
Esta invenção é dirigida, em parte, para a nova e inesperada descoberta que a administração de células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos a um mamífero, previamente preparados ex vivo, pode ser utilizada na profilaxia e/ou tratamento de perturbações neurodegenerativas e/ou outras perturbações neurológicas no mamífero tratado.
Consequentemente, num dos seus aspectos de composição, esta invenção é dirigida para uma composição farmacêutica compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e uma quantidade eficaz de células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos.
As composições farmacêuticas preferencialmente empregam um excipiente aquoso farmaceuticamente aceitável embora possam ser utilizados outros excipientes. 7 ΡΕ1289535
Como referido acima, estas composições são úteis na profilaxia e/ou tratamento de perturbações neurodege-nerativas e/ou outras perturbações neurológicas em mamíferos. Consequentemente, num de seus aspectos do método, esta invenção é dirigida para um método para o tratamento de uma profilaxia contra perturbações médicas neurode-generativas e/ou outras perturbações neurológicas num paciente mamífero, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas.
Estes métodos são preferencialmente realizados administrando ao paciente as composições farmacêuticas descritas aqui.
BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO A Figura é um gráfico que mostra uma comparação do inchaço líquido da orelha em ratos tratados com as composições desta invenção e um grupo de controlo.
DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS
Esta invenção é dirigida para o tratamento e/ou profilaxia das perturbações neurodegenerativas e/ou outras perturbações neurológicas pela administração de células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos. ΡΕ1289535
Perturbações neurodegenerativas, incluindo sín-drome de Down, a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, são associadas com níveis aumentados de espécies de oxigénio reactivo (ROS), certas citocinas inflamatórias, incluindo interleucina-ΐβ (IL-Ιβ) [ver Griffin WST, Stanley LC, Ling C, White L, Macleod V. Perrot LJ, White CL, Araoz C (1989). Brain interleukin 1 and S-100 immuno-reactivity are elevated in Down's syndrome and Alzheimer disease. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 867611-7615; Mogi M, Harada M, Narabayashi H, Inagaki H, Minami M, Nagatsu T (1996). Interleukin (IL)-1 beta, IL-1, IL-4, IL-6 and transforming growth factor-alpha leveis are elevated in ventricular cerebrospinal fluid in juvenile parkinsonism and Parkinson's disease. Neuroscience Letters 211:13-16]. Também foi mostrado que IL-Ιβ inibe a potenciação a longo prazo no hipocampo [Murray CA, Lynch MA (1998) . Evidence that increase hippocampal expression of the cytokine interleukin-ΐβ is a common trigger for age and stress-induced impairments in long-term potentiation. Journal of Neuroscience 18:2974-2981]. A potenciação a longo prazo no hipocampo é uma forma de plasticidade sináptica e geralmente é considerada como sendo um modelo apropriado para memória e aprendizagem [Bliss TVP, Collinridge GL, (1993). A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus, Nature 361:31-39]. Assim, acredita-se actual-mente que a expressão de citocina imprópria no cérebro está envolvida no desenvolvimento e progressão de doenças de neuro-inflamatórias. 9 ΡΕ1289535
Perturbações neurodegenerativas e outras perturbações neurológicas tratáveis pela invenção presente incluem síndrome de Down, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência senil, depressão e do género. Resumindo, pode ser substancialmente, qualquer perturbação médica neurodegenerativas ou outras perturbações neurológicas. "Células apoptóticas" e "corpos apoptóticos", como os termos são aqui utilizados, significam células e corpos celulares que exibem um ou mais das seguintes elementos característicos de apoptose: exposição de superfície de fosfatidilserina, como detectado por métodos padrão aceites de detecção tal como coloração Anexina V; alterações na permeabilidade de membrana mitocondrial medida por métodos padrão aceites (por exemplo Salvioli, S. , Ardizzoni, A., Franceschi, C. Cossarizza, A. (1997) "JC-1, but not DiOC6(3) or Rhodamine 123, is a Reliable Fluorescent Probe to assess Delta Psi Changes in Intact Cells: Implications for Studies on Mitochondrial Functionality during Apoptosis", FEBS Letters 411: 77-82]; evidência de fragmentação de ADN tal como o aparecimento de do padrão escada de ADN em electroforese de gel de agarose seguido de extracção de ADN das células [Teiger, E., Dam, T. V., Richard, L., Wisnewsky, C., Tea, B.S., Gaboury, L., Tremblay, J., Schwartz, K. and Hamet, P. (1996) "Apoptosis in Pressure Overloadinduced Heart Hypertrophy in the Rat", Journal of Clinicai Investigation 97; 2891-2897], ou por marcação in situ (ver Gavrieli et al., 1992, referido acima). 10 ΡΕ1289535
As células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos para utilização na presente invenção preferencialmente compreendem não mais do que aproximadamente 35 por cento em peso de células necrótico e/ou corpos necróticos com base no peso total das células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos; mais preferencialmente, não mais do que aproximadamente 20 por cento em peso; e ainda mais preferencialmente, não mais do que aproximadamente 10 por cento em peso. A estes niveis, acredita-se que a presença de tais células necróticos e/ou corpos não altera significativamente em processos in vivo. Na sua forma de realização mais preferida, os corpos/células apoptóticos são substancialmente livres de células e ou corpos necróticos (i.e., inferior a aproximadamente 2 por cento de peso de corpos/células necróticos).
As células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos para utilização na presente invenção são preparado ex vivo de células de mamífero que são compatível com as do paciente mamifero. Elas podem ser preparadas substancialmente de qualquer tipo de célula de mamifero incluindo linhas de célula de culturas. Preferencialmente elas são preparados de um tipo de célula derivado do próprio corpo do paciente mamifero ou de uma linha de célula estabelecida. Mais preferencialmente elas são preparadas a partir de glóbulos brancos de sangue compatível com o do paciente mamífero, mais preferencialmente os glóbulos brancos do próprio paciente e até mesmo mais preferencialmente dos 11 ΡΕ1289535 linfócitos T do próprio paciente. Ainda mais preferencialmente são preparados de uma linha de célula estabelecida. As células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos são preparados extracorporalmente antes da administração ao paciente. Assim, numa forma de realização, pode ser retirada uma aliquota do sangue do paciente, por exemplo através de venipunctura, e pelo menos uma porção dos seus glóbulos brancos sujeitos extracorporalmente disso a patologias que induzem apoptose.
Uma variedade de métodos de indução de apoptose em células de mamifero, de modo a criar células apoptóticas e corpos apoptóticos, são conhecido na técnica e essencialmente qualquer destes pode ser adoptado na preparação de corpos apoptóticos para utilização na invenção presente. Um tal método é a sujeição das células a radiação de ionizante (raios y, raios x, etc.) e/ou radiação electro-magnética de não-ionizante incluindo luz ultravioleta. A apoptose pode ser induzida sujeitando as células a ultra-sons .
Outro método é o tratamento das células com fármacos tal como inibidores não-especificos de proteína cinase como exemplificado por staurosporina (ver Bombeli, Karsan, Tait and Hirlan, (1997) "Apoptotic Vascular Endothelial Cells Become Procoagulant", Blood, Vol. 89:2429-2442). Também, certos agentes quimioterapêuticos utilizados para o tratamento de tumores malignos induzem apoptose, por exemplo adriamicina, como os fármacos esta- 12 ΡΕ1289535 tinas (inibidores da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductase) [Guijarro C, Blanco-Colio LM, Ortego M, Alonso C, Ortiz A, Plaza JJ, Diaz C, Hernandez G, Edigo J (1998), "3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase and isoprenylation inhibitors induce apoptosis of vascular smooth muscle in culture", Circulation Research 83: 490-500] e colchicina [Suzuki Y (1998), "Cell death, phago-cytosis and neurogenesis in mouse olfactory epithelium and vomeronasal organ after colcicine treatment", Annals of the New York Academy of Sciences 855: 252-254]. A utilização de ligandos para receptores de morte em células, como os ligandos Fas, será evidente para induzir a apoptose da discussão de apoptose acima.
Ainda outro método é a aplicação extracorporal de tensão oxidativa a células (ver por exemplo Buttke and Sandstrom (1994) "Oxidative Stress as a Mediator of Apoptosis", immunology Today, Vol. 15:7-10). Isto pode ser alcançado tratando as células, em suspensão, com agentes químicos oxidantes tal como peróxido de hidrogénio, outros peróxidos e hidroperóxidos, ozono, permanganatos, perio-datos, e do género. São preferencialmente utilizados tais agentes oxidantes biologicamente aceitáveis, bem como para reduzir potenciais problemas associados com resíduos e contaminações das células apoptóticas e corpos apoptóticos assim formados. A presente invenção não é restringida a qualquer método particular de produção de células apoptóticas e 13 ΡΕ1289535 corpos apoptóticos, para utilização aqui, e pode ser utilizado qualquer processo adequado, conhecido.
Podem ser utilizados métodos para a detecção e quantificação de apoptose para determinar a presença e nível de apoptose na preparação a ser administrada ao paciente na presente invenção. Pelo menos um dos métodos dos descritos na introdução acima deveria ser utilizado para confirmar o nível de apoptose alcançado antes de administração. Eles são purificados adequadamente antes de utilização, por métodos conhecidos na técnica, tal como centrifugação diferencial.
Na preparação das células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos, devem ser tomados cuidados para não aplicar níveis excessivos de tensão oxidativa, radiação, tratamento de fármaco, etc., uma vez que de outra forma existe um risco significativo de causar necrose a pelo menos algumas das células sob tratamento. A necrose causa frequentemente ruptura da membrana celular e a libertação de conteúdos celulares muitas vezes com resultados biologicamente prejudiciais, particularmente eventos inflamatórios, de forma que a presença de células necróticas e seus componentes junto com os corpos apoptóticos seja evitado por completo. Níveis apropriados de tratamento das células para criar corpos apoptóticos para utilização na presente invenção dependem até certo ponto da natureza das células escolhidas e composição celular, e o tipo de tratamento escolhido para induzir apoptose. Tais níveis apropriados 14 ΡΕ1289535 são prontamente determináveis pelos peritos na técnica, tendo em consideração literatura cientifica disponível no sujeito incluindo os artigos acima referidos.
Um processo preferido de acordo com a presente invenção envolve a cultura de células do paciente, ou uma linha de célula de um mamífero compatível. As culturas de células podem então ser tratadas para induzir apoptose e para criar células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos. As células, suspensas no plasma do paciente ou outro meio de suspensão adequado, tal como soro fisiológico ou meio de cultura de célula equilibrado de um mamífero, pode então ser administrado como indicado abaixo. 0 número de células e/ou corpos apoptóticos pode ser determinado através de métodos publicados disponíveis na literatura científica no assunto incluindo os artigos acima referidos. 0 número de tais células e/ou corpos apoptóticos requeridos para administração ao paciente para obter o benefício clínico exigido irá variar dependendo da fonte de células, da patologia do paciente, a idade e peso do paciente e outros factores pertinentes que são prontamente determináveis pelo médico assistente.
Assim, um exemplo de um processo preferido de acordo com a presente invenção envolve a extracção de uma alíquota de sangue do paciente a ser tratado, separação dos seus glóbulos brancos, e tratamento dos glóbulos brancos sob patologias causando apoptose, de modo a criar uma composição celular na qual um número significativo de glóbulos 15 ΡΕ1289535 brancos aqui, tenha sofrido apoptose para criar aqui um número substancial de células ou corpos apoptóticos. Então a composição tratada é administrada ao paciente. Mais preferencialmente, linfócitos T, isolado do sangue através de meios conhecidos, e suspensos como acima, podem ser utilizados como uma fonte de células e corpos apoptóticos. 0 número de células viáveis seleccionado para tratamento para criar células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos é adequadamente até aproximadamente 4 x109, preferencialmente desde aproximadamente 1 000 000 até aproximadamente 1 000 000 000 e mais preferencialmente desde aproximadamente 50 000 000 até aproximadamente 150 000 000, para cada administração a um paciente humano. Desde aproximadamente 10% até 90%, preferencialmente desde aproximadamente 30% até 70% da composição celular para administração é compreendido de corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas, o equilíbrio de células viáveis e células necróticas. Consequentemente, as quantidades preferidas de células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos para administração são os produzidos sujeitando estes números de células às patologias de apoptose. Quando for utilizado o sangue inteiro como a fonte das células a ser sujeito a patologias que induzem apoptose, estes números de glóbulos brancos são alcançáveis em alíquotas de sangue de volume até aproximadamente 400 ml, preferencialmente até 100 ml. Mais especificamente, 50 000 000 - 150 000 000 células é equivalente aos glóbulos brancos em alíquotas de sangue de volume 10 - 30 ml. 16 ΡΕ1289535 0 volume da alíquota de sangue retirado do paciente para tratamento para criar células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos aqui é adequado até aproximadamente 400 ml, preferencialmente desde aproximadamente 0,1 até aproximadamente 100 ml e mais preferencialmente desde aproximadamente 5 até aproximadamente 15 ml. Consequentemente, as quantidades preferidas de células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos para administração são os correspondentes ao número derivável dos glóbulos brancos, ou linfócitos T isolados, contidos em tais quantidades de sangue inteiro, seguindo sujeição a patologias que induzem apoptose. A suspensão de células e/ou corpos apoptóticos tratados para administração ao paciente está preparada num meio de suspensão liquido biologicamente aceitável, tal como o soro ou plasma do paciente, soro fisiológico ou meio equilibrado de cultura de células mamífero. A adição de outros factores, como citocinas, hormonas, produtos de células estressadas ou outro material biologicamente activo apropriado pode aumentar o benefício da administração de materiais celulares apoptóticos. A alíquota pode ser introduzida no corpo do paciente por qualquer método adequado, mais preferencialmente injecção intramuscular mas também incluindo injecção subcutânea, mini-enxerto, injecção intra-peritoneal, injecção intra-arterial, injecção intravenosa e administração oral. As entidades apoptóticas podem ser entregues ao órgão e/ou local específico do corpo utilizando qualquer sistema de entrega apropriado, conhecido. 17 ΡΕ1289535
As composições desta invenção podem opcionalmente incluir um excipiente farmaceuticamente aceitável. Alguns exemplos de excipiente adequados incluem água estéril, soro fisiológico estéril, tampão fosfato salino, e do género.
Quando administradas, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de corpos/células apoptóticas para induzir uma resposta profiláctica e/ou terapêutica adequada no paciente em risco de sofrer ou sofrendo de uma doença neurodegenerativa. Preferencialmente, a composição administrada ao paciente mamífero compreende desde aproximadamente 10 000 a 10 000 000 células ou corpos apoptóticos por quilograma de peso corporal, mais preferencialmente desde aproximadamente 500 000 a 5 000 000 e mais preferencialmente desde aproximadamente 1 500 000 até aproximadamente 4 000 000 células e/ou corpos apoptóticos por kg de peso corporal. A dose específica empregue vai, de certeza, ser dependente da idade, peso e gravidade da doença no paciente tratado todos os quais estão dentro da capacidade do médico assistente.
Para um tratamento e/ou profilaxia mais eficaz de patologias num mamífero que envolvam uma patologia neurodegenerativa ou neurológica, ao paciente pode ser dado uma linha de acção de tratamentos com células e/ou corpos apoptóticos de acordo com a invenção. Cada linha de acção de tratamentos pode envolver a administração ao paciente de 1 a 6 alíquotas de material celular suspenso, como descrito 18 ΡΕ1289535 acima. Não mais que uma tal alíquota deve ser administrada por dia, e o período máximo de descanso entre qualquer duas administrações sucessivas não deve ser maior do que aproximadamente 21 dias. Tratamentos de revacinação como descrito a seguir podem vantajosamente ser utilizados. Para manter os efeitos desejados, o paciente pode estar sujeito a tratamentos de revacinação, com uma linha de acção adicional de administração de alíquotas de células apoptóticas e/ou corpos apoptóticos suspensos, como descrito acima, a intervalos de três a quatro meses.
Como observado, a presente invenção é aplicável ao tratamento e profilaxia de uma larga variedade de patologias neurodegenerativas e outras patologias neurológicas de mamíferos. Estes incluem, mas não é limitado a, Síndrome de Down, a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência senil, depressão, esclerose múltipla, a doença de Huntington, neuropatias periféricas, doenças da coluna vertebral, doenças das articulações neuropáticas, doença desmielinizante inflamatória crónica (CIPD), neuropatias incluindo mononeuropatia, polineuropatia, neuropatia senso-rial simétrica distai, fibrose cística, patologias das articulações neuromusculares e miastenias. Em resumo, pode ser substancialmente qualquer patologia neurodegenerativa ou outra patologia neurológica. A invenção é ainda descrita, para propósitos ilustrativos, nos exemplos específicos seguintes. 19 ΡΕ1289535 EXEMPLO 1
Para demonstrar a invenção, foram conduzidas experiências em ratinhos de laboratório, sob patologias aprovadas para conduzir tais experiências. A eficácia do tratamento de acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, em hipersen-sibilidade de contacto (CHS), um exemplo de uma patologia inflamatória das células Th-1 que é conhecida para ser mediada através das citocinas inflamatórias, foi avaliada em ratinhos de laboratório, de acordo com procedimentos de experimentação animais aprovados, utilizando o método descrito por Kondo et. al., "Lymphocyte function associated antigen-1 (LFA-1) is required for maximum elicitation of allergic contact dematitis" Br. J. Dermatol. 131:354-359 (1994), com variações menores. A revelação deste está aqui incorporada por referência. Rapidamente, para induzir CHS, foi rapada a pele abdominal de cada ratinho e pintada com dinitrodifluorobenzeno DNFB, a substância quimica de sensibilização, utilizando 25 μΐ de DNFB a 0,5% numa solução 4:1 de acetona:azeite. Esta sensibilização foi aplicada a dois grupos de ratinhos de Balb/c, 10 animais em total.
Os corpos apoptóticos foram preparados a partir de fibroblastos murino. Os fibroblastos murino foram tratados com butirato de sódio 50 mM em meio de RPMI, em confluência durante um dia, e de seguida o meio de butirato 20 ΡΕ1289535 de sódio foi mudado. Para aumentar o número de células e corpos apoptóticos, as células podem adicionalmente ser irradiadas com luz UV (por exemplo 75 mj). O sobrenadante que contém as células flutuantes é removido 24 horas após a irradiação.
Os corpos apoptóticos foram quantificados centri-fugando o sobrenadante (1200 rpm, 5 minutos), aspirando o sobrenadante, lavando o sedimento de células resultante com PBS e centrifugando novamente, como acima. O sedimento que contém os corpos apoptóticos foi ressuspendido em PBS. As células foram armazenadas em PBS a 4o C durante a experiência. As células a ser coradas para quantificação foram ressuspensas em tampão de ligação lx a uma concentração de 1 x 106 células/ml. Foram transferidos 100 μΐ das células para um tubo de 5 ml, e 10 μΐ de anexina V conjugada com fluoresceina e foram adicionados 10 μΐ de reagente iodeto de propidio. As células foram suavemente submetidas a vórtex e a mistura de células incubada durante 15 minutos a 25° C no escuro. A seguir à incubação, é acrescentado a cada tubo 400 μΐ de tampão de ligação IX. A amostra foi analisada num citómetro de fluxo por mais de uma hora.
Dos dois grupos de ratinhos sensibilizados, o primeiro, grupo de controlo A, não recebeu nenhum tratamento. O segundo, grupo de teste B, foi tratado com uma injecção de corpos apoptóticos suspensos, preparada como descrito acima, 50 μΐ de volume contendo pelo menos 150 000 corpos por injecção de sangue sujeito a estressores como 21 ΡΕ1289535 descrito acima. Os tratamentos, cada um envolvendo injecção intramuscular de 50 μΐ do respectivo liquido, começou no dia da sensibilização, e foi repetido diariamente por um total de seis dias. No mesmo dia do último tratamento, mas depois de sua administração, os animais foram estimulados com DNFB, aplicando na orelha direita de cada animal 10 μΐ de uma solução 0,2% de DNFB em acetona e azeite. À orelha esquerda de cada animal foi aplicado o solvente aceto-na/azeite, sem DNFB. A inflamação devida a CHS manifesta-se numa tumefacção das orelhas direitas. Foi medida a espessura da orelha, 24 horas após o estimulo, com um micrómetro Peacock "spring-loaded" (Ozaki Co., Tóquio, Japão). Os resultados foram expressos como a espessura e diferenças na espessura das orelhas direitas e das orelhas esquerdas de cada animal, nas 24 horas após o estimulo.
As experiências foram repetidas, utilizando mais conjuntos de dois grupos de animais, um número suficiente de vezes para assegurar a significância estatística nos resultados. Foi observada uma redução notável e significativa nas espessuras das orelhas (inflamação) com os animais tratados com a suspensão de células apoptóticas e de corpos apoptóticos de acordo com a invenção, quando comparado com o grupo não tratado, demonstrando uma redução significativa na inflamação. Os resultados são apresentados na seguinte Tabela, e na Figura que acompanha, como um gráfico de barras do inchaço líquido da orelha (diferença entre a espessura da orelha direita e da orelha esquerda), 22 ΡΕ1289535 para cada grupo, com "desvio padrão" apresentado pela linha vertical no topo de cada coluna.
Tabela 1
Grupo Orelha Esquerda Orelha Direita Diferença A 17 31 14 A 18 39 21 A 17 30 13 A 18 32 14 A 18 31 13 Média: 15 D.P.: 3,391185 B 21 31 10 B 18 18 0 B 17 30 13 B 20 24 4 B 18 22 4 Média: 6,2 D.P.: 5,215362
Uma análise da suspensão de células e corpos apoptóticos administrada aos animais de grupo de teste B indicou a presença de aproximadamente 40% células e corpos apoptóticos, células com balanço viável e quantidades menores de células necróticas (não mais que 20%), a presença das quais acredita-se que é insignificativa no processo in vi vo. 23 ΡΕ1289535 EXEMPLO 2 O procedimento teste anterior foi repetido em grupos semelhantes de animais, um grupo de controlo e um grupo de teste, mas utilizando uma suspensão de células e corpos apoptóticos no grupo de teste que compreendeu cerca de 60% células e corpos apoptóticos, células com balanço viável e quantidades menores (não mais que 20%) de células necróticas. Foram obtidos resultados essencialmente semelhantes. A eficácia dos processos e composições da presente invenção na prevenção e alivio da inflamação devido a CHS indica aquela administração de células e corpos apoptóticos como descrito sobre-regula a geração in vivo de citocinas derivadas de anti-inflamatórios Th-2 como IL-10 (conhecido por estar implicado em CHS - ver Kondo, McKenzie and Sauder, "The Journal of Investigative Dermatology", Vol. 103, 1994, pág. 811-814) e/ou sub-regula as citocinas inflamatórias Th-1 tal como TNFa e IL-6. Estas citocinas inflamatórias estão implicadas nas patologias do cérebro relacionadas com inflamação, nomeadamente neuroinflamatório, neurodegenerativa e patologias neurológicas como a doença de Alzheimer, demência senil, esclerose múltipla, depressão, sindrome de Down, a doença de Huntington, neuropatias periféricas, patologias da coluna vertebral, patologias das articulações neuropáticas, doença desmielinizante inflamatória crónica (CIPD), neuro- 24 ΡΕ1289535 patias incluindo mononeuropatia, polineuropatia, neuropatia sensorial simétrica distai, fibrose cística, patologias das articulações neuromusculares, miastenias e doença de Parkinson.
As patologias neurodegenerativas, incluindo síndrome de Down, a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, estão associadas com niveis aumentados de certas citocinas inflamatórias, incluindo interleucina- 1β (IL-Ιβ) [ver Griffin WST, Stanley LC, Ling C, White L, Macleod V. Perrot LJ, White CL, Araoz C (1989). Brain interleukin 1 and S-100 immunoreactivity are elevated in Down syndrome and Alzheimer disease. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 867611-7615; Mogi M, Harada M, Narabayashi H, Inagaki H, Minami M, Nagatsu T (1996). Interleukin (IL)1 beta, IL-1, IL-4, IL-6 and transforming growth factor-alpha leveis are elevated in ventricular cerebrospinal fluid in juvenile parkinsonism and Parkinson's disease. Neuroscience Letters 211:13-16]. Também foi mostrado que IL-Ιβ inibe a potenciação a longo prazo no hipocampo [Murray CA, Lynch MA (1998). Evidence that increase hippocampal expression of the cytokine interleukinl[beta] is a common trigger for age and stress induced impairments in long-term potentiation. Journal of Neuroscience 18:2974-2981]. A potenciação a longo prazo no hipocampo é uma forma de plasticidade sináptica e geralmente é considerado como sendo um modelo apropriado para a memória e aprendizagem [Bliss TVP, Collinridge GL, (1993) . A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus, Nature 361:31-39]. 25 ΡΕ1289535
Assim, é acredita-se actualmente que expressão imprópria de citocina no cérebro está envolvida no desenvolvimento e progressão de doenças neurodegenerativas. Por conseguinte, o achado de sucesso no tratamento com CHS descrito nos Exemplos anteriores, com a sua sub-regulação auxiliar de citocinas inflamatórias Th-1, é indicativo de utilização próspera do processo e composições no tratamento e profilaxia de uma larga variedade de patologias neurológicas incluindo aquelas discutidas acima.
Lisboa, 9 de Outubro de 2007
Claims (15)
- ΡΕ1289535 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas na preparação de um medicamento para o tratamento e/profilaxia de uma patologia neurodegenerativa neurológicas num paciente mamífero, sendo os corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas compatíveis com as células sanguíneas do paciente.
- 2. Utilização como na reivindicação 1, em que o medicamento é uma suspensão líquida.
- 3. Utilização como na reivindicação 1 ou 2, em que os corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas constituem de 10% a 90% da porção celular do medicamento.
- 4. Utilização como na reivindicação 3, em que os corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas constituem de 30% - 70% da porção celular do medicamento.
- 5. Utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente em que os corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas são derivadas do tratamento extracorporal de células sanguíneas compatíveis com as do paciente mamífero.
- 6. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, em que as células e/ou corpos apoptóticos são derivados de linhas de células de cultura estabelecida. 2 ΡΕ1289535
- 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que as células sanguíneas são glóbulos brancos.
- 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que os glóbulos brancos são os glóbulos brancos do próprio paciente.
- 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que as células sanguíneas são os linfócitos T do próprio paciente.
- 10. Utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente em que a patologia é seleccionada do grupo consistindo de doença de Alzheimer, demência senil, escle-rose múltipla, doença de Parkinson, depressão, síndrome de Down, doença de Huntington, neuropatias periféricas, patologias da coluna vertebral, patologias das articulações neuropáticas, doença desmielinizante inflamatória crónica (CIPD), neuropatias incluindo mononeuropatia, polineuro-patia, neuropatia sensorial simétrica distai, fibrose cística, patologias das articulações neuromusculares e miastenias.
- 11. Utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente na preparação de uma dosagem unitária de medicamento para administração a paciente humano, contendo a referida dosagem de 10 000 a 10 000 000 de corpos apoptó-ticos e/ou células apoptóticas por quilograma de peso corporal do paciente. 3 ΡΕ1289535
- 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que a referida dosagem contém de 500 000 a 5 000 000 de corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas por quilograma de peso corporal do paciente.
- 14. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que a referida dosagem contém de 1 500 000 a 4 000 000 de corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas por quilograma de peso corporal do paciente. 15. utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o medicamento é adequado para administração intramuscular.
- 16. Composição farmacêutica compreendendo uma suspensão liquida de material celular, sendo 10% a 90% do referido material celular corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas.
- 17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, em que os corpos apoptóticos e/ou células apoptóticas compreendem de 30% - 70% do material celular. Lisboa, 9 de Outubro de 2007
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