DE3000483A1 - Mikrokapseln fuer immunologische bestimmungen - Google Patents

Mikrokapseln fuer immunologische bestimmungen

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DE3000483A1 DE19803000483 DE3000483A DE3000483A1 DE 3000483 A1 DE3000483 A1 DE 3000483A1 DE 19803000483 DE19803000483 DE 19803000483 DE 3000483 A DE3000483 A DE 3000483A DE 3000483 A1 DE3000483 A1 DE 3000483A1
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Description

PATENTANWÄLTE
WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHRENS - GOETZ
professional kepkesentatives before the european patent office agrees pres l'office europeen des brevets
1A-53 104
Fuji Photo Film
DR.-ING. FRANZ VUESTHOFF DK. PH:L. FRETA ^'ESTHOFF (1927-1916) DIf L.-ING. GtSHARU PULS (1972-1971) DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN DR.-ING. DIETER BEHRENS DIPL.-ING.; DIPU-IrIRTSCH1-INCKUPERT COETZ
D-8000 MÜNCHEN SCHWEIGERSTRASSE
telefon: (089) 66 20 ji telegramm: protectpatent telex: 524070
Pat entanmeldung
Anmelder:
Fuji Photo Film Co., Ltd.
210, Nakanuma, Minamiashigarashi,
Kanagawa, Japan
Titel:
Mikrokapseln für immunologische Bestimmungen
030029/0840
iA-55 104
Beschreibung Mikrokapseln für immunologische Bestimmungen
Die Erfindung betrifft Mikrokapseln für immunologische Bestimmungen von Spuren biochemischer Komponenten unter Ausnutzung einer immunologischen Reaktion, bestehend aus einem Kernmaterial und einem Wand- bzw. Hüllmaterial, wobei ein Antigen oder Antikörper an die Oberfläche gebunden ist. Die Erfindung betrifft auch die Bestimmung solcher biologischer Komponenten mit Hilfe der erfindungsgemäßen Mikrokapseln
Es sind verschiedene Verfahren zur immunologischen Bestimmung von biochemischen Komponenten mit immunologischer Aktivität bekannt. Zum Beispiel ist ein Verfahren repräsentativ zur Bestimmung von biochemischen Komponenten, bei dem man auf einer Mikroplatte bzw. Tüpfelplatte oder ähnlichem die Agglutination beobachtet, die eintritt zwischen Proben und an Antigen oder Antikörper gekuppelten tierischen roten Blutkörperchen (auch als Erythrozyten bezeichnet), hochmolekularem latex, hochmolekularen Polymerteilchen usw. In den letzten Jahren haben radioimmunologische und enzymimmunologische Bestimmungen Beachtung gefunden.
Bei den bekannten Verfahren werden am häufigsten rote Blutkörperchen vom Schaf zur Bindung von Antigen oder Antikörper angewandt, die zur Agglutination in einer Antigen-Antikörper-Reaktion angewandt werden· Organische oder anorganische Teilchen, wie Polystyrollatex, Polyester., Nylon, Kaolin uswe werden ebenfalls angewandt. Bei Anwendung dieser Trägerteilchen wurden rote Blutkörperchen einerseits chemisch mit einem Antigen oder Antikörper
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unter Verwendung von Aldehyden wie Glutaraldehyd usw. gekoppelt und andererseits durch (physikalische) Adsorption Polystyrollatex, Polyester, Nylon, Kaolin usw, daran gebunden«
Bei Verwendung von roten Blutkörperchen vom Schaf als Trägerteilchen ist die Qualität jedoch ungleichmäßig und die Antlgen-Antikörper-Reaktion kann nur mit geringer Genauigkeit interpretiert werden, da diese Trägerteiloben aus dem lebenden Körper stammen. Ferner tritt leicht eine unspezifische Reaktion auf, da die roten Blutkörperchen vom Schaf als Träger per se Antigen- und Antikörpereigenschaften besitzen· Deshalb ist die Reproduzierbarkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion schlecht und die Kosten sind hoch, was Nachteile bei der Anwendung von roten Blutkörperchen vom Schaf als Trägerteilchen bedeutet. Andererseits besitzen die Systeme, bei denen Polystyrollatex, Polyester, Nylon, anorganische Teilchen oder ähnliches angewandt wird, Nachteile, indem neben den hohen Kosten die Immobilisierung schwach ist aufgrund der Adsorption eines Antigens oder Antikörpers an ate Trägerteilchen und als Ergebnis kann ein Antigen oder Antikörper leicht isoliert (abgespalten) werden. Die Empfindlichkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion wird verringert und die Reproäuzierbarkeit schlechter· Diese Nachteile sind beträchtlich^ insbesondere wenn die Substanzen über längere Zeit gelagert werden·
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mikrokapseln zu entwickeln, die zur immunologischen Bestimmung von biochemischen Komponenten angewandt werden und durch die angegebenen Nachteile überwunden werden können· Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung biochemischer Komponenten.
Im Rahmen dieser Beschreibung werden die Ausdrücke "bindend" oder "gebunden" verwendet, um einen Zustand einer Bindung
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eines Antigens oder Antikörpers direkt oder Indirekt an die Oberfläche eines Hüllmaterials von Mikrokapseln im weitesten Sinne zu beschreiben« Sofern solche Antigen- oder Antikörper-gebundenen Mikrokapseln tatsächlich zu einer immunologischen Reaktion bzw. Immunanwort führen, ist es außer Präge, waB der Ausdruck "gebunden" bedeutet« In einem allgemeinen Sinne kann jjedoch ein Antigen oder Antikörper an die "Wand einer Mikrokapsel gebunden sein durch Vernetzung, kovalente Bindung oder Kupplung, Die Ausdrücke "bindend" oder "gebunden" umfassen hier alle diese Fälle«
Der Ausdruck "Antigen" ist in der Immunologie bekannt, und bezeichnet, anders gesagt, Lipide, Proteine, Glucosen und deren Komplexe (z.B. Glucoproteine. lipoproteine, Glucolipide), die immunogene Wirkung besitzen« Der Ausdruck "Antikörper" ist ebenfalls bekannt und es ist keine weitere Erklärung erforderlich. Antikörper werden Jedoch auch zusammengenommen Immogloboline genannt.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßeη Mikrokapseln bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens können Spuren von Komponenten, die in einer zu untersuchenden Probe enthalten sind, leicht und genau auf einfache Weise nachgewiesen werden.
Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln umfassen ein Kernmaterial und ein Wandmaterial, wobei Antigene oder Antikörper an die Oberfläche des Wandmaterials gebunden sind.
Zur Bindung eines Antigens oder Antikörpers an Mikrokapseln werden verschiedene übliche Verfahren angewandt, z.B. eine Vernetzung mit Aldehyd, Cyanbromidverfahren, Carbodiimid-Vernetzungsverfahren, Alkylierungsverfahren, Isocyanat-Vernetzungsverfahren, Maleinimid-Vernetzungeverfahren, Benzophenan-Vernetzungsverfahren, Perjodsäurevernetzungsverfahren usw. Einzelheiten dieser Verfahren sind z.B. beschrieben in Ichiro Ohihata, KOTEIKA KOSO (Immobilized En-
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isyme), Kodansha Publishing Co., ltd, (1975) una Eiji Ishikawa, KOSO MEHEO SOKUiEEIHO (Enzyme Immunoassay) S.34 bis 44· Während die Bindungsverfahren licht begrenzt sind, ist es wichtig, daß die gebundenen Antigene oder Antikörper nicht inaktiviert sind. Das typischste Verfahren ist eine Bindung unter Verwendung von Aldehyden wie Glutaraldehyd, !Formaldehyd, Glyoxal usw. Fach diesem Verfahren -werden Mikrokapseln mit O52 bis 2 $ z.B. Glutaraldehyd bei Temperaturen von 15 bis 4O0C, vorzugsweise Raumtemperatur 1 bis 2 h unter Normaldruck vermischt und das Gemisch dann zur Entfernung von nicht umgesetztem Aldehyd mit destilliertem Wasser gewaschen.
(Slutar)—/
Anschließend werden die mit/Aldehyd behandelten Mikrokapseln mit 0,1 bis 5 f< > Antigen oder Antikörper behandelt und anschließend 1 bis 2 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Spezifische Beispiele für andere Vernetzungsmittel als Aldehyde sind Toluol-2,4-diisocyanat, N,N1, O-Phenylendimaleinimid, m-Maleinimiabenzoyl-jN-bydroxysuccinimid-ester usw.
Um zu untersuchen, ob die Bindung zwischen Mikrokapseln und Antigen oder Antikörper gebildet werden konnte, wird allgemein ein einfacher Versuch mit Hilfe eines Immunofluoreszenz-Verfahrens angewandt (A Dictonary of Immunology, S. 128 und 129 (1979)^ herausgegeben von Hirokawa Publishing Co., Tokio), Dabei wird ein Elucrochrom an einen Antikörper gebunden und der mit Eluarochrom markierte Antikörper mit Mikrokapseln vermischt, die an Antigen gebunden sein sollten, und dann das ITluorochrom nach Waschen des Gemisches mit Wasser gemessen. Wenn das lluorochrom nachgewiesen werden kann, wird angenommen, daß das Antigen an die Mikrokapseln gebunden ist und umgekehrt.
Wenn Antigene oder Antikörper an Mikrokapseln gebunden werden, ist es notwendig, die zusammensetzung den Wandmaterials der Mikrokapseln entsprechend auszuwählen je nach der Kombination von Antigen oder Antikörpern und Wandmaterial. Zum Beispiel ist es zur Bindung von Antigen oder Antikörpern
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an Mikrokapseln water Verwendung von Aldehyden vorteilhaft, daß in dem Wandmaterial der Mikrokapseln aktive Protonen wie von Amino-, Imino- oder Hydroxygruppen vorhanden sinde Mr den Fachmann ist es ein Leichtes festzustellen,, wslehe Kombination zur Bindung von Antigen oder Antikörpern an die Wände von Mikrokapseln geeignet ist and ®ia® nähere Erläuterung ist nicht erforderliche
Die Wandmaterialiao. für die erfindungsgemäßen Mikro·= kapseln sind ttiotre begrenzt^ solange diese Materialien mit Antigenea oäor Antikörpern Bindungen eingehen können ohne die Antigen® oder Antikörper zu inaktivieren und solange sie aur Yerkapseluag befähigt sindo Typische Beispiele für Wandmaterialiens die eine Amino=;, Imino=s Hydroxy- oder Schwefelwasserstoffgruppe enthalten^ sind ZoB. Proteine (söB© Collagen, G-elatinSg Casein uswe)9 Harze wie Polyaminosäuren Polyacrylamid9 Polyamid, Polyurethan, PolyharBstoff, Polyurethan-Harnstoff9 Melamin= harz, Phenolliar29 Silicanhars und deren Derivatep CeIIu= lose und deren Derivate (zoBa Methylcellulose0 Äthylcel= lulose, Carboxymetbyl-oellulosej, litrocellulose^ Acetyl= cellulose, Cellulosesulfat uswo)p Gummi arabicum^ Stärke, Alginsäure u„äe
Die mittlere iCeilchengröße der Mikrokapseln liegt günsti=· gerweise bei ungefähr 0,1 bis ungefähr 30 /um9 vorzugsweise bei 0,5 bis 10 ^um, ist jedoch nicht auf diesen Bereich beschränkt.
Einzelheiten bezüglich verschiedener Wandmaterialien und Verfahren zur Mikroverkapselung sind ζ·Β« beschrieben in Asaj Kondo, MICROCAPSULES, Nikkan Kojyo Press, Tokio (1970)., Tamotsu Kando und Masumi Koishi, MICROPAPSUIES, Sankyo Publishing Co., Ltd, Tokio (1972), usw.
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Typische Beispiele für oleophile Substanzen, die als Kernmaterialien für Kapseln angewandt werden können, sind natürliche Mineralöle, tierische öle, Pflanzenöle und synthetische Öle.
Spezielle Beispiele für Mineralöle Bind u.a. Erdöl, Petroleum, Kerosin, Gasolin, Naphta, Paraffinöl usw. Tierische Öle sind typischerweiee Fischöl, Schmalz usw. Typische Beispiele für Pflanzenöle sind Erdnußöl, Leinsamenöl, Sojabohnenöl, Rizinusöl·, Maisöl usw. Spezielle Beispiele für synthetische Öle sind Biphenylverbindungen (z.B. Isopropyl-biphenyl, Isoamyl-biphenyl), Terphenylverbindungen (s. z.B. DE-OS 2 153 635), Naphtalinverbindungen (z.B. Diisopropylnaphtalin, US-PS 4 003 589), alkylierte Diphenylalkane (z.B. 2,4-Dimethyldipheny!methan, US-PS 3 836 383), Phthalsäureverb^näungen (z.B. Diäthylphthalat, Dibutylphthalat, Dioctylphthalat usw.).
Das in den erfindungsgemäßeη Mikrokapseln eingeschlossene Kernmaterial ist nicht auf die oben angegebenen Substanzen beschränkt.
Um den Kontrast bei der Verwendung der Mikrokapseln zur Agglutination zu verbessern, können in dem Kernmaterial oleophile Farbstoffe enthalten sein«. Während die Fabstoffe nicht darauf begrenzt sind, sind Beispiele hierfür Golor Index Lösungsmittel-Rot 1, 3, 8, 23, 24, 25, 27, 30, 49, 81, 82, 83, 84, 100, 109, 121, Color Index Lösungsmittel-Violett 8, 13, H, 21 und 27, Color Index Lösungsmittel-Blau 2, 11, 12, 25, 35, 36, 55 und 73, Color Index Lösungsmittel-Grün 3, Color Index Lösungsmitbel-Braun 3, 5i 20 und 37, Color Index Lösungsmittel-Schwarz 3, 5, 7, 22, 23, und 123, usw. Obwohl es auch bei der Verwendung von beispielsweise Polystyrollatex, Polyester, Nylon usw. möglich ist, die Trägerteilchen zu färben, um den Kontrast besonders bei der Antigen-Antikörper-Agglutination zu erhöhen, sind die dafür zur Verfügung stehenden Farbstoffe sehr begrenzt, da sehr leicht
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die Gefahr besteht, daß Farbstoffe die Antigen-Antikörper-Eeaktioa nachteilig beeinflussen,, Daher können ge= eignete Farbstoffe aiar mit großer Mühe ausgewählt werden. Ferner führt dies zu hohen Herstellungskosten«, An= dererseits ist es bei der Verwendung von Mikrokapseln als Trägerteilchen ausreichend^ diese Farbstoffe in das Kernmaterial einzubauen^ so daß keine Gefahr besteht„ daß die Antigen~Antikörper«~B.eaktion nachteilig beeinflußt wird« So ist es möglich^ Fabstoffe nur vom Gesichtspunkt der Verbesserung des Kontrastes und Verringerung der Kosten aus sia wähleno Ferner können die spezifische Diohte und die Teilchengröße nicht gesteuert werden, wenn rote Blutkörperchen vom Schaf angewandt werden, da diese eine natürliche Substanz darstellen so= wie auch dann, wenn Polystyrollatex5 Polyesterp NyIDn9 anorganische Teilchen tsswo angewandt ii?erden0 Im Falle der Verwendung von Mikrokapseln als Trägerteilchen kann die spezifische Dichte leicht gesteuert werden durch Vermischen von zwei Arten von Kernmaterialien mit unterschied= liehen spezifischen Dichten oder Dispergieren von inaktiven festen Teilchen in dem Kernmaterial uswo Bei der Verwendung von Mikrokapseln kann außb die Teilchengröße leicht gesteuert werden«, Aus diesen Gründen sind die Mikrokapseln als Trägerteilchen besonders vorteilhafte
Vom Gesichtspunkt einer sofortigen Antigen-Antikörper-Reaktion und der Verbesserung der Empfindlichkeit aus ist es günstig^ daß die spezifische Dichte der Mikrokapseln im Boreich von ungefähr 0$8 bis ungefähr 1s2O liegto Wenn die spezifische Dichte zwischen ungefähr 19O5 und ungefähr 1fl2O9 vorzugsweise zwischen ungefähr 1?07 und ungefähr 1916 liegt9 kann das System vorteilhaft angewandt werden zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern mit Hilfe eines Mikrotiter-Verfahrens (passives Agglutinationsverfahren mit Hilfe einer Mikroplatte bzw«, Tüpfelplatte)o Wenn Mikrokapseln mit einer spezifischen Dichte zwischen ungefähr 1,11 und ungefähr 1,1.5 angewandt werden, wird nicht nur die Zeit, die
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erforderlich ist, zur Beurteilung eines? so !aatersuchenden Probe, d.h. die Zeit, bis ein Unter-eoMsä asaf der Tüpfelplatte zwischen einer positiven βώΑ ©iaer aegativen Reaktion auftritt (Iuterpratationss©it)9 wesentlich verkürzt, sondern ein positivee oäer asgatives Reaktionsmuster tritt auch außerordentlich deutlieh auf« Außerdem kann, wenn die spezifische Diohte der Mikrokapseln ungefähr 0,8 erreicht, die Agglutination leicht unter Verwendung von ganzem Blut durchgeführt werden, ohne daß die roten Blutkörperchen von dem Blut abgetrennt werden, Ferner führen im Tergleicb mit deE bekanntes System, bei dem rote Blutkörperchen vom Schaf als SDrägerteilchen angewandt werden, die Mikrokapseln nicht se einer unerwünschten unspezifischea Reaktion, die unvermeidlich im Falle der natürlich vorkommenden roten Blutkörperchen vom Schaf beobachtet wird« Das Mikrokapselsysteia "besitzt auch eine ausgezeichnete Lagerstabilität über lange Zeit.
Das erfindungsgemäße Mikrokapselsystem kann für sine große Vielzahl von immunologischen Unters ucha tage β angewandt v/erden und diese Eignung wird weiter auf einen !reiten Bereich ausgedehnt, wenn das Mikrokapselsystem mit Markierungssubstanzen markiert ist. So ist das er"findungsgemäße Mikrokapselsystem auch vorteilhaft anwendbar auf das radioimmunologische Bestimmungsverfahren (Radioimmunoassay), das die Bestimmung einer unbekannten Substanz durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der unbekannten Substanz und dem mit einem Radioisotop wie J, J usw« markierten Mikrokapselsystem umfaßt (Einzelheiten sind angegeben in Eumahara und Shizume, Shinpan Radioimmunoassay, S. 3 bis 10, 1977, herausgegeben von Asakura Shoten, Tokio, usw.). Die Menge an Isotopen für Markierungszwecke variiert je nach der Art des angewandten Mikrokapselsystems, des Antigens oder Antikörpers usw. und ist nicht generell begrenzt. Allgemein werden jedoch Isotopen mit einer Intensität von 1OO mCi/ml angewandt und sind wirksam für die Markierungs-
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zwecke. Andere Markierungs8ubstansens die zur Bestimmung von unbekanntes Substanzen, geeignet sind9 sind unten näher erläuterte
dl© erfindüngsgemäß vorteilhaft angewandt wsräcm MS&neQs sitad zoBo Isotopes Enzymep fluo~ resziereede Söte'isss&gettj, magnetische Substanzen^ XJV^Ab= sorbentien^ lasbstoffo uswo Diese Markierungssubstanzen können günstigsz-wslse angewandt werden je nach dem Ge= halt an imbskasaatss1 zu bestimmender Substanz s so9 daß die Uaoteelseaipfiaäliohkeit verbessert werden kann0 Von diesen MarkierHQgssübstaagea sind aßflere Substaasen als (radioaktiv®) Isßtope bevorsiagt aufgrund der Probleme der Abfallbeseitigung Sielierheit bei der Durchführung der Verfahr©a imä lagerfähigkeit fler Markierungssubstan« zen. Außerdem fiiM?ea solche Substanzen su einer höheren Empfindlichkeit sum. nachweis und geringen Kosten auf ein= fächere Weise als bei Verwendung von Isotopen0
Diese Markiariragssubstanzen können an die Außenseite (Oberfläche) des Wandmaterials der Mikrokapseln gebunden oder ia dem Kerraasterial enthalten seino Wenn die Markierungssubstaßsoa ia dem Kernmaterial eingebaut (oder dispergiert) siacig ist eine weite Variationsmöglichkeit bezüglich der Auswahl der Mafiäcierungssubstanzen und deren Gehalt gegebens so daß es möglich ists entsprechende Markierungssubstaasen je aaoh dem Vervjendungs zweck auszuwäh«= len« Perner ist es Mögliohp immunologische Reaktionen wirksam durchsnfüliren9 da die Markierungssubstanzen nicht in direktem Kontakt mit dem Antigen oder Antikörper gebracht werden* Zum Beispiel haben die anzymmarkierten immu·= nologischen Bestimmungen bisher lachteile besessen^ da die Lagerfähigkeit und Stabilität für Markierungssubstanzen schleoht war und das- Verfahren per se unbefriedigend war bezüglich der Genauigkeit land Reproduzierbarkeit« Im Falle eines Enzyms, das in das Kernmaterial von erfindungsgemäßen Mikrokapseln, das aus einer wässrigen lösung besteht, einge»
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baut ist, können diese Nachteile der bekannten Verfahren überwunden werden.
Repräsentativ für die direkte Markierung von Antigenen oder Antikörpern mit fluoreszierenden Substanzen ist ein Verfahren unter Verwendung von PITO (Anami, et al KISO SEIKAGAKU JXEEENHO (Basic Biochemical Experiment), Bd. 6, S. 167 (1976), Moruzen Tokio) bekannt. Nach diesem Verfahren ist die Menge an fluoreszierenden Substanzen mit denen Moleküle von Antigenen oder Antikörpern markiert werden, begrenzt, um die Immunreaktion nicht zu hemmen. Daher ist es, um die Empfindlichkeit weiter zu erhöhen, erwünscht, daß fluoreszierende Substanzen in das Kernmaterial eingebaut werden. Bei dieser Arbeitsweise können Markierungssubstanzen in einer Menge angewandt werden, wie sie erforderlich ist in Beziehung auf die Nachweisempfindlichkeit, so daß eine außerordentlich hohe Markierungsintensität erzielt wird und dadurch die Nachweisempfindlichkeit wesentlich verbessert werden kann. Die Messung außerordentlich geringer Mengen an Antigenen oder Antikörpern in einer zu untersuchenden Probe kann durchgeführt werden, indem man Antigene oder Antikörper, die den Bestandteilen in der Probe entsprechen, auf die Oberfläche solcher Mikrokapseln bindet, in die z.B. fluoreszierende Substanzen eingebaut sind, was zu einer Immunreaktion zwischen ö.eu Mikrokapseln und Antigenen oder Antikörpern in der Probe direkt oder indirekt führt und anschließende Trennung des Reaktionsproduktes der Antigen-Antikörper-Reaktion von den nicht umgesetzten Antigenen oder Antikörpern und Bestimmung der Menge an fluoreszierender Substanz in den Mikrokapseln« Bei dem System, bei dem Markierungssubstanzen als Kernmaterialien eingekapselt sind, wie oben beschrieben, besitzt das Material für die immunologische Bestimmung eine verbesserte Stabilität, führt zu einer höheren Genauigkeit und Reproduzierbarkeit und höheren Empfindlichkeit aufgrund der außerordentlich
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guten Gleichmäßigkeit des ICernmaterials und der verbesser= ten Überaugsfähigkeit des WandmaterlaIb0
Die erfinduügsgemäßen Mikrokapseln können ferner als Träger bei der Xmmunantwort angewandt xtferden0 Zum Beispiel ist die Verwendung von [Trägern für radioimmunologische Bestimmungen (A Dictonary of Immunology;, S0 290 (1979)s Hirokawa Shoten5 Tokio) und ensymimmunologische Bestimmungen (s· E0 Ishikawa9 Enzymimmunoassay„ 19789 Igabushoitt^ Tokio) typiselu Ferner können die erfindungs= gemäßen Mikrokapseln anstelle von Blutzellenp wie roten Blutkörperchen (Erythrozyten) 9 weißen Blutkörperchen (Leucogyten), Lymphosyten oder Glasperlen angewandt iverden9 wie sie üblicherweise verviendet werden star Bestimmung von biologischen Komponenten in einer Probe0
Typische Beispiele für fluoreszierende Mark&erungssubstanzen, die erfindungsgemäß angewandt werden könneηs sind Stilben und dessen Derivate (z0Bo 494i)=Diaminstil·= betirDerivate, 4j49=Diaminostilbendisulfonsäure=Derivate9 Aminostilben-2,2B-disulfonsäurs=Derivate uswo)9 Kumarin= derivate, Benzoxasolderivate9 Bisoxasol;, Pyrasolinderivatep 4,4'-Bistriazinyl uswO2 wie zum Beispiel die folgenden Verbindungen?
(A)
OCH-
(B)
0OC2H5
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- Vf-
(C)
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NHCOHN
CH=CH-
NHCOHN
O3Na SO3Na
Spezielle Beispiele für Enzyme, die als Markierungssubstanzen erfindungsgemäß angewandt werden können, sind Alkali-phosphatase, /J-Galactosidase, Acetylcholinesterase, Glucoamylase, Maleinsäure-dehydrogenase, Glucose-6-pliospb.orsäure-dehydrogenase, Peroxidase, Glutaroxidase usw*
Typische Beispiele für magnetische Substanzen, die erfindungsgemäß als Markierungssubstanzen angewandt werden können, sind unter anderem Eisenpulver, Nickel, Kobalt,
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OrO2, GoO, NiO,/magnetische Zinkoxide, magnetische Eisenoxide wie MaPe2O.-Pulver, Fe5O.-Pulver,CoFe2O.-Pulver, NiFe3O.-Pulver, CuPe2O.-Pulver, MgFe2O.-Pulver usw., Legierungen von Al, Ni, Co, Cu, usw., nichtkristalline Substanzen mit magnetischen Eigenscbaften, wie Calcogenide, Ferricolloidpulver usw.
Typische Beispiele für UV-Absorbentien, die erfindungsgemäß als Markierungssubstanzen angewandt werden können, sind Salicylsäurederivate, z.B. Pbenyl-salicylat, 4-terU-Butylphenyl-salicylat, Bispbenyl-A-disalicylat usw.j Benzopbenon-derivate, z.B. 2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-2'-carboxy-benzopbenon, 2-Hydroxy-4-octocybenzophenon, 2-Hyd»oxy-4-octoxy-benzopbenon, 2-Hydroxy-4-stearyloxybenzopbenon, 2-Dodecyloxy-2-bydroxybenzapbenon, 2-Hydroxy-4-metboxy~5-solfobenzopbenon-tribydrat, 2-Hydroxy-4-metboxybenzopbenon-5-sulfonsäure, 2-Hydroxy-4-(2-hydroxy-5-metbacryloxy)-propoxypbenon, 2-Hydroxy-4-metboxy-4*-metbylbenzopbenon, 2-Hydroxy-4-benzoylbenzopbenon, 2,4-Dibydroxybenzopbenon, 2,2«-Dibydro3y-
4-metboxybenzopbenon, 2,2'-~Bibydroxy-4-n-octoxybenzopbenon, Metbyl-o-benzoylbenzonat, 2,2',4-4'-Tetrabydroxybenzopbenon usw,; Benzotriazolderivate wie 2-(2'-Hydroxy-.5f-metbylpbenyl)benzotriazol, 2-(2l-Hydroxy-3f-tert,-butyl-5l-metbylpbenyl)-5-cblorbenzotriazol, 2-(2'-Hydroxy-31,5'-di-tert.-butylpbenyl)-5-cblorbenzotriazol, 2-(2'-Hydroxy-31,5t-dibenzylphenyl)-benzotriazol, 2-(2!-Hydroxy-4f-octoxypbenylbenzotriazol usw·
Erfindungsgemäß können aucb Farbstoffe als Markierungssubstanzen angewandt werden. Typiscbe Beispiele für solcbe Farbstoffe sind die oben zum Einbau in das Kernmaterial zur Färbung der Mikrokapseln angegebenan.
Zur quantitativen Bestimmung der markierten Substanz können geeignete Yerfabren oder Mittel für die angewandten
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Markierungssubstanzen ausgewählt werden· Wenn z.B. fluoreszierende Markierungssubstanzea angewandt werden, wird die Stärke der Fluoreszenz mit einem Fluorfotometer, Fluorpolarisationsfotometer usw. bestimmte Wenn magnetische Markierungssubstanzen angewandt werden, können die elektromagnetischen Eigenschaften gemessen werden, zur Bestimmung der Markierungssubstanzen. Ferner kann, wenn UV-Absorbentien angewandt werden, die quantitative Bestimmung mit Hilfe eines Spektrometers durchgeführt werden. Bei der Messung der Trübung oder Durchlässigkeit oder der qualitativen Bestimmung der Markierungssubstanzen können vorteilhafte Laser angewandt werden.
Allgemein werden die Mikrokapseln vor der quantitativen Bestimmung als Vorbehandlung mechanisch zerdrückt (mashed).
Die Menge an Markierungssubstanzen, die angewandt wird, liegt allgemein zwischen ungefähr 0,1 und ungefähr 10 Gew.-^ bezogen auf das angewandte Kernmaterial, vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 5 Gew.-$, wenn fluoreszierende Substanzen, magnetische- Substanzen, UV-Absorber und Farbstoffe angewandt werden..Wenn Enzyme angewandt werden,
—2 —10 liegt die Menge im allgemeinen zwischen 10 und 10 Mol pro 1 g Kernmaterial, vorzugsweise bei 10" bis 10"" Mol.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Markieruugssubstanzen als Kernmaterial in den Mikrokapseln eingeschlossen, bo daß sie durch die verschiedenen Substanzen, die außerhalb der Mikrokapseln vorbanden sind, nicht nachteilig beeinflußt werden. Ferner können nachteilige Einflüsse durch verschiedene Bedingungen außerhalb der Mikrokapseln z.B. den pH-Wert oder die Temperatur vermieden werden. Die Genauigkeit bei der qualitativen Bestimmung kann verbessert werden durch eine gleichmäßige und genaue Einkapselung der Markierungssubstanzen in Mikrokapseln. Die Einkapselung der Markierungssubstanz in Mikrokapseln in einer erf arierliche η Menge führt zu einer deutlichen Verbesserung der Empfindlichkeit für den Nachweis.
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Die erfindungsgemäß an Antigen oder Antikörper gebundenen Mikrokapseln können für verschiedene immunologische Reaktionen angewandt werden. Zunächst kann dieses Mikrokapsel-system wirksam angewandt werden zur Agglutination, insbesondere beim Glasplatten-Verfahren (antigen- oder antikörpergebundene Mikrokapseln werden mit der zu untersuchenden Probe auf einer Glasplatte vermischt. Biologische Bestandteile können nachgewiesen werden, ;je nach dem, ob Agglutination auftritt oder nicht). Beim Mikroplatten-Verfahren (das auch als Mikrotiter-Verfahren oder Tüpfelverfahren bezeichnet wird); Doppel-Doppel-Reihenverdünnungen einer zu untersuchenden Probe werden in V- oder U-förmige Vertiefungen mit einem Duchmesser von ungefähr 5 mm gegeben und die antigen- oder antikörpergebundenen Mikrokapseln darauf getropfte Eine qualitative Bewertung kann durchgeführt werden durch Bestimmung, bei welcher Konzentration Agglutination eintritt).
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Antigen-Antikörper-Reaktion auf übliche Weise durchgeführt, z.B. als direktes Antikörper-Verfahren, direktes Antigenverfahren, indirektes Antikörper-Verfahren, Sandwichverfahren, indirektes Komplement-Verfahren und direktes Komplementverfahren usw. Einzelheiten sind angegeben in M. Kaneizumi, RINSHO KENSA GAIYO (Outline of Clinical Test), Bd. ΣΧ, S. 10, Kanehara Publishing Co., 1978.
Biologische Bestandteile, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden können, sind z.B. Peptid-Hormone wie Hypothalamus-hormone (z.B. TRH, LH-RH, Somatostatine, Hypophysen-hormone (z.B. Wachstumshormon , ACTH, eC-MSH, /S-MSH, Lipotropin, Prolactin, TSH, TSH /i , LH, LH-/S , PSH, FSH-/* , e£—Untereinheit, Arginin-vasopressin, Lysin-vasopressin, Oxytocin, usw.), den Calcium-metabolismus steuernde Hormone (zeB. Calcitonin, Parathormon, usw.), Pankreas-hormone (z.B. Insulin, Proinsulin, C-Peptid,
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Glucagon usw.), Hormone des Verdauungstrakts (z.B. Gastrin, Secretin, Pankreozymin-Cbolecystokinin, GIP, Enterogluoagon usw.), Hormone, die auf die Blutgefäße wirken (z.B. Angiotensin I, Angiotensin II, Bradykinine usw.), Placenta-hormone (z.B. Human-Chorion-gonadoteopin (HOG), HOG- β ψ Human-Chorionsomatomammotropin, Human-Chorion-tbyrotropin; Nichtpeptid- Hormone wie Steroide (z.B. Cortisol, Corticosteron, 11-DesoxyCortisol, 11-Desoxycorticosteron, Progesteron, 17-Hydroxyprogesteron, Pregnenolon, Aldosteron, Testosteron, Dihydrotestosteron, Ö3tradiol, Östriol, östron, 2-Hydroxyöstron, Dehydroeplandrosteron, Medroxyprogesteron usw.), Schilddrüsenhormon (z.B. Thyroxin, 3f5»3I-Trijodthyronin, 3f3f5f-Trijodthyronin usw.), Prostaglandine (z.B. Prostaglandin A, E, Έ usw.), andere Substanzen als Hormone wie Arzneimittel oder Drogen (z.B. Dlgoxin, Digitoxin,Morphin, LSD, Gentamycin, Amphetamin, Nicotin, Ootinin usw.), cyclische Nucleotide (z.B. cyclisches AMP, cyclisches GMP, cyclisches IMP, cyclisches UMP usw.), Enzyme (z.B. C--Esterase, Eruetose-1,6-diphosphatase, alkalische Phosphatase, Dopamin-p-hydroxylase, Pepsinogen, usw.), Virusspezifische Antigene (z.B. Hepatitis-B-Virus, Murin-Sarcom-Leukämie-Virns, . Wollaffen-Ieukämie-Virus, Vogel-Tumor-Virus, Pflanzenvirus, Vogel-Virus Typ O usw.) Tumor-Antigene( z.B. ·ί -Fötoprotein, Oarinoembryon-Antigen (CEA) usw.), Blutserumproteine (z.B. Thyroxin-bindendes Globulin (TBG), IgG, IgM, IgE, IgA, ^-Microglobulin, Properdin, Anti-Rh-Antikörper, Transferrin, Aplipoprotein, Pibrinogen-Abbauprodukte, antihämolytischer Paktor/ Renin, usw.), Rheumafaktor, Folsäure, Neurophysin, Somatomedin B, Nervenwaohstumsfaktor, Epidemlsviachstumsfaktor, Staphylocoocen-Enterotoxin A und B, Typ Α-Toxin von Clostridium botulinum, Myosin, encephalitogene Proteine, Substanz P, Serotonin, konjugierte Cholylgallensäure, ΗΏ -Antigen, usw.)
Selbstverständlich sind die Komponenten, die erfindungsgemäß bestimmt werden können, nicht auf die angegebenen Arten be-
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Erfindungsgemäß reioht es zum Nachweis biologischer Komponenten aus, daß der Gehalt in der zu untersuchenden Probe 10""" g/ml beträgt.
In den folgenden Beispielen ist die Empfindlichkeit zum Nachweis eines Antikörpers angegeben, duroh die minimale Antikörperkonzentration, bei der die antigengebundenen Mikrokapseln zur Agglutination führen. Diese minimale Antikörperkonzentration wird erhalten durch Vermischen von Doppel-Doppel-Reihen-Verdünnungen des Antikörpers mit einer Lösung der antigengebundenen Mikrokapseln bei einer festgelegten Konzentration und Beobachtung der minimalen Konzentration an Antikörpern, bei der Agglutination auftritt.
Beispiel 1
In 40 Teilen Wasser von 4O0C wurden 5 Teile mit Säure behandelter Gelatine mit einem isoelektrischen Punkt von 7|8 und 5 Teile Gummiarabicum gelöst. Unter heftigem Rühren wurden 50 Teile eines Gemisches aus Diisopropylnaphtalin und chloriertem Paraffinöl (Mischungsverhält-. nis 23,6 : 26,4) mit einer spezifischen Dichte von 1,10 und enthaltend 1 # eines Farbstoffs der Formel
zugegeben, wobei eine Öl-in-Wasser-Emulsion mit einer mittleren Tropfengröße von 6,0,um entstand. Anschließend wurde die Emulsion duroh Zugabe von 213 Teilen Wasser von 4O0O verdünnt. Dann wurde Essigsäure bei einer festen
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Rübrgescbwindigkeit zugetropft, um den pH-Wert des Systems auf 4f6 zu verringern und dadurch Koazervation herbeizuführen«
Nachdem das System auf 1O0C gekühlt worden war, um aus dem Koazervat ein Gel zu erhalten, wurde es durch Zugabe von 2 Teilen 37 #-igem Formaldehyd gehärtet. Dann wurden 40 Teile einer 10 #-igen wäßrigen lösung von Carboxymethylcellulose (mittlerer Polymerisationsgrad 220) zugegeben. ITm die Härtung zu verbessern, wurde eine 10 $-ige wäßrige Natriumhydroxidlösung zugetropft, um den pH-Wert auf 10 zu bringen. Die Temperatur des Systems wurde weiter auf 500C erhöht. Die so erhaltenen Mikrokapseln wurden zur Entfernung von restlichem Formaldehyd mit Wasser gewaschen und filtriert» Die Mikrokapseln besaßen eine spezifische Dichte von 1,10 und eine mittlere Teilchengröße von 6,3/Um.
Die so erhaltenen Mikrokapseln wurden dann mit einem Phospborsäurepuffer gewaschen (wäßrige Lösung erhalten durch lösen von 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,9 g Na2HPO4* 12 H2O und 0,2 g KH2PO. in Wasser auf 1 1), dabei wurden 0,5 g in 5 ml Phosphorsäurepuffer dispergiert. Zu der enstandenen Dispersion wurde 1 ml Eialbumin (10 mg/ml) als Antigen zugegeben. Anschließend wurden 100 /Ul einer 25 jS-igen wäßrigen Glutaraldehydlösung zu dem Gemisch gegeben und dieses 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und mit dem Phosphorsäurepuffer gewasohen, wobei 0,5 g verwendet und wieder in 5 ml Phosphorsäurepuffer dispergiert wurden. So erhielt man einen Puffer enthaltend 1 # an Antigen gebundene Mikrokapseln,(Probe 1)„
Anschließend wurde der Phosphorsäurepuffer mit einer Pipette in einer Menge von 1 Tropfen (25 /Ul) in jede Vertiefung der ersten und zweiten Reihe auf einer Mikroplatte bzw. Tüpfelplatte mit 12 Vertiefungen χ 2 Reihen gegeben.
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Dann wurden mit einer Verdünnungsvorrichtung 25/Ul Kaninchenantiserum gegen Eialbumin aufgenommen und zu der Verdünnungsflüssigkeit (Phosphorsäurepuffer) in der ersten Reihe (1:2 Verdünnung) gegeben· Nach gründlichem Vermischen wurden aus der ersten Vertiefung mit Verdünnungsmittel 25/Ul entnommen und in eine zweite Vertiefung der zweiten Reihe (1:4 Verdünnung) gegeben und anschließend ausreichend vermischt. Es wurden erneut 25/Ul aus der zweiten Vertiefung mit Verdünnungsmittel entnommen und in eine dritte Vertiefung der ersten Reihe gegeben und anschließend ausreichend vermischt (1:8 Verdünnung), Das Verfahren wurde wieder-
12
holt, um eine 2 (4 O96)-fache Verdünnung zu erhalten.
Ferner wurden 25/Ul 1 # antigengebundene Mikrokapseln mit einer Pipette zu den verdünnten Antisera in jeder Reihegegeben. Die Mikroplatte (Tüpfelplatte) wurde gründlich geschüttelto Nachdem das Antigen ausreichend mit dem Antiserum vermischt war, wurde die Tüpfelplatte 3 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Anschließend wurde das Präzipitationsmuster abgelesen, um eine positive oder negative Reaktion festzustellen,, Bei dieser Bewertung wurde eine positive Reaktion angenommen, wenn die Mikrokapselteilchen teilweise durch Agglutination ausgebreitet waren und eine negative Bewertung, wenn die Mikrokapselteilchen natürlich in der Mitte der Vertiefung ausgefallen waren.
Zum Vergleich wurden handelsübliche rote Blutkörperchen vom Schaf auf ähnliche Weise behandelt und Eialbumin ebenfalls an die so behandelten roten Blutkörperchen als Antigen gebunden. Die positive oder negative Bewertung wurde wie oben vorgenommen.
Zum weiteren Vergleich wurde ein Polystyrollatex mit einer mittleren Teilchengröße von 0,8/um und einer spezifischen Dichte von 1,05 auf ähnliohe Weise behandelt und Ei-
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albumin ebenfalls als Antigen an den so behandelten Polystyrollatex gebunden. Die Untersuchung wurde wie oben durchgeführt·
Die oben beschriebenen Versuche wurden jeweils für 10 Fälle durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß bei der Verwendung von roten Blutkörperchen vom Schaf die Agglutinationsempfindlichkeit gleich war derjenigen unter Verwendung von Mikrokapseln, jedoch in 2 von 10 Fällen eine unspezifisohe Reaktion auftrat. Bei der Verwendung von Polystyrollatex wurde keine unspezifische Reaktion beobachtet, aber die Agglutinationsempfindlichkeit war 1/16 derjenigen, die im Falle der Verwendung von Mikrokapseln auftrat. Andererseits trat bei Verwendung von Mikrokapseln keine unspezifische Reaktion auf.
Wie daraus deutlich hervorgeht, ergibt das System unter Verwendung von Mikrokapseln als Trägerteilchen eine hohe Agglutinationsempfindlichkeit aufgrund einer starken Bindungsfähigkeit der Mikrokapseln an das Antigen und andererseits kann keine unspezifiscbaE Reaktion auftreten, wie bei roten Blutkörperchen vom Schaf, da bei den Mikrokapseln kein Antigen oder Antikörper von Natur aus vorhanden ist, so daß die Reproduzierbarkeit deutlich erhöht werden kann.
Beispiel 2
Entsprechend Beispiel 1 wurde der RA-Faktor gamessen, mit der Ausnahme, daß Human-f-globulin als Antigen angewandt wurde. Der Versuch wurde für 10 Falle durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, daß bei der Verwendung von roten Blutkörperchen vom Schaf die Agglutinationsempfindlichkeit gleich war wie diejenige bei Verwendung von Mikrokapseln,
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jedoch in 3 von 10 Fällen eine unspezifische Reaktion beobachtet wurde· Bei Verwendung des Polystyrollatex trat keine unapezifische Reaktion auf, aber die Agglutlnationsempflndllchkeit war auf 1/8 derjenigen verringert, die bei Verwendung von Mikrokapseln auftrat, während bei Verwendung von Mikrokapseln keine unspezifische Reaktion auftrat·
Daraus geht deutlich hervor, daß bei Verwendung von Mikrokapseln als Erägerteilchen eine hohe Agglutinationsempfindlichkeit aufgrund einer starken Bindungsfähigkeit des Antigens an die Mikrokapseln erreicht wird und daß keine unspezifische Reaktion auftreten kann, da Im Gegensatz zu roten Blutkörperchen vom Schaf bei den Mikrokapseln von Natur aus kein Antikörper oder Antigen vorhanden 1st, so daß die Reproduzierbarkeit wesentlich erhöht wird.
Beispiel 3
Es wurde ein Versuch entsprechend Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß TP-Antigen als Antigen verwendet wurde zur Bestimmung eines Treptonema-Antikcrpeis. Der Versuch wurde jeweils für 10 Fälle durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, daß im Falle der Verwendung von roten Blutkörperchen vom Schaf die Agglutinationsempfindlichkeit gleich war derjenigen, die bei Verwendung von Mikrokapseln auftrat, aber in 3 von 10 Fällen eine unspezifische Reaktion eintrat» Bei der Verwendung von Polystyrollatex wurde keine unspezifische Reaktion beobachtet, aber die Agglutinationsempfindlichkeit war auf 1/16 derjenigen bei Verwendung von Mikrokapseln verringert. Bei Verwendung von Mikrokapseln 'wurde keine ünspezifische Reaktion beobachtet·
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Daraus geht hervor, daß bet Verwenduug von Mikrokapseln als Trägertellchen eine hohe Agglutinationsempfindlicbkelt erreicht wird, aufgrund der starken Bindungsfählgkelt des Antigens an die Mikrokapseln und daß keine Gefahr einer unspezifischen Reaktion besteht, da im Gegensatz zu roten Blutkörperchen vom Schaf in den Mikrokapseln von Natur aus keinerlei Antikörper oder Antigene enthalten sind. Dadurch wird die Reproduzierbarkeit deutlich erhöht.
Die folgenden Beispiele 4 bis 6 zeigen, daß die Agglutinationsempfindlichkeit noch erhöht werden kann durch Auswahl geeigneter Hüll- bzw. Wandmaterialien für die Mikrokapseln
Beispiel 4 ι ■
In 25 g eines Ölgemisches (spezifische Dichte ungefähr 1,10) aus 11,8 g Dlisopropylnaphtalin und 3,2 g chloriertem Paraffinöl (Chlorierungsgrad 50$) wurden 0,1 g eines Äthylendiamin-Propylenoxid-Additionsproduktes gelöst. Die Lösung wurde in Eis gekühlt. In dieser Lösung wurden 4 g eines 50 $-igen Methyl-äthylketonlösung von einem Addukt aus Toluol-diisocyanat und Trimethylolpropan (Desmodure-L der Bayer AG) gelöst. Die entstehende ölige Lösung wurde in 65 g einer 5 $-igen wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol (Yerseifungsgrad 88 %, Polymerisationsgrad 500) gegossen. Das Gemisch wurde unter Rühren emulgiert. Nachdem eine mittlere Tropfengröße von ungefähr 7/um erreicht war, wurde die Emulsion mit 10Og Wasser verdünnt. Das Gemisch wurde 1 h bei 750O zur Reaktion gebracht, um eine Mikroverkapselung zu erreichen.
Die so erhaltenen Mikrokapseln mit Polyurethanwänden wurden mit einem Phosphorsäurepuffer, wie in Beispiel 1 angegeben, gewaschene Anschließend wurden 0,5 g der so gewaschenen Mikrokapseln in 0,5 ml Phosphorsäurepuffer dis-
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pergiert. Zu der Dispersion wurde 1 ml Eialbumin (25 mg/ml) als Antigen gegeben. Nachdem weitere 100,ul einer 25 #-igen wäßrigen Glutaraldebydlösung eu der Dispersion zugegeben worden war, wurde das Gemisch eine Stunde bei Raumtemperatur zur Umsetzung gebracht und anschließend zentrifugiert* Der entstandene Niederschlag wurde mit Phosphorsäurepuffer gewaschen. Es wurden wiederum 0,5 g der so gewaschenen Proben in 5 ml Phosphorsäurepuffer gegeben, um einen Puffer enthaltend 1 % an Antigen gebundene Mikrokapseln zu erhalten.
Andererseits wurden Reihenverdünnungen von Kaninehenantisera bis zum 2 (4 O96)-fai
beschriebene Weise hergestellt.
antisera bis zum 2 (4 O96)-fachen auf die in Beispiel 1
Anschließend wurden 25/Ul der an Antigen gebundenen Mikro« kapseln (verdünnt auf eine Konzentration von 1 %) auf das verdünnte Anti-Albumin in den 12 Reihen der Tüpfelplatte getropft. Die Tüpfelplatte wurde gründlich geschüttelt, um das Antigen mit den Antisera (Anti-Albumin) zu vermischen. Das System wurde bei "Raumtemperatur stehen gelassen.
die/
Dann wurden/Präzipitationsmuster beobachtet und die minimale Antikörperkonzentration (Antikörpernachweisempfindlichkeit), bei der spezifische Agglutination auftrat, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben.
Beispiel 5
Zu 25 g einer 10 $-igen wäßrigen Lösung von mit Carboxylgruppen modifiziertem Polyvinylalkohol (Molekulargewicht 100 000, Verseifungsgrad 90 $, Carboxylgruppengehalt 5 bis 6 #) wurden 2,5 g Harnstoff, 0,25 Resorcin und 0,3 g Ammoniumchlorid gegeben. Das Gemisch wurde bis zur Lösung gerührt. Dann wurde der pH-Wert der entstehenden Lösung durch
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Zugabe von 0,1 η Salzsäure auf 4,0 eingestellt· Unter heftigem Rühren wurden 25 g des Ölgemisches mit einer spezifischen Dichte von 1,10 entsprechend Beispiel 4 in der oben beschriebenen wäßrigen Lösung emulgiert, um eine Öl-in-Wasser-Emulsion zu erhalten. Die Tropfengröße wurde auf einen Durchmesser von ungefähr 7/Um eingestellt. Zu der entstehenden Emulsion wurden 6,4 g einer 37 $-igen wäßrigen Formaldehydlösung gegeben. Nachdem die Temperatur des Systems auf 6O0O gebracht worden war, wurde die Verkapselung 2h lang durchgeführt. Die so erhaltenen Mikrokapseln mit Polyharnstoff wurden 3x mit dem in Beispiel 1 angewandten Phosphorsäurepuffer gewaschen zur Entfernung von verbleibenden Formalin, Harnstoff, Schutzkolloid usw.
Anschließend wurde das Antigen entsprechend Beispiel 1 an die Mikrokapseln gebunden und die Nachweisempfindlichkeit des Antikörpers bestimmt.
Beispiel 6
Mikrokapseln mit Polyurethan-Harnstoff-Wänden wurden entsprechend Beispiel 4 hergestellt mit der Ausnahme, daß,-als eine mittlere Teilchengröße von ungefähr 7/um erreicht war, 100 g einer 1 $-igen wäßrigen Lösung von Hexamethylen-diamin zugegeben wurden anstelle der Verdünnung mit 10Og Wasser.
Die so hergestellten Mikrokapseln mit Polyurethan-Harnstoff-Wänden wurden 3 x mit einem Phosphorsäurepuffer entsprechend Beispiel 1 gewaschen. Dann wurde das Antigen entsprechend Beispiel 1 an die Mikrokapseln gebunden und die Nachweisempfindlichkeit für Antikörper bestimmt. Man erhielt die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse.
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!Tabelle 1
Wr ' Wnndmaterial Empfind liebkeit zum
Kr. Wanümaterial Nachweis von Antikörpern
4 Polyurethan 2
5 Polyharnstoff 29
6 Polyuretban- 99 Harnstoff
1 gelatine ' 26
Wie aus diesen Werten deutliob hervorgeht, zeigen die Mikrokapseln, an die Antigen gebunden ist, die erbalten worden sind unter Verwendung von Polyuretban, Polybarnstoff und Polyurethan-Harnstoff als Wandmaterial selektiv eine außerordentlicb bobe Empfindlichkeit zum Nachweis von Antikörper. Vergleicht man diese Werte mit der Empfindlichkeit zum Nachweis von Antikörpern in dem System des Beispiels 1, bei dem Gelatine als Wandmaterial verwendet wurde, beträgt die Empfindlicbkeit für Mikrokapseln mit Gelatinewänden 2 , während die Mikrokapseln mit Polyharnstoff- und Polyurethan-Harnstoffwänden eine 8-fach höhere Nachweisempfindlicbkeit ergeben bezogen auf die Mikrokapseln mit Gelatinewänden und die Mikrokapseln mit Polyurethanwänden eine Naobweisempfindlicbkeitj die 32 χ größer ist als diejenige der Mikrokapseln mit Gelatinewänden,
Die folgenden Beispiele 7 bis 11 und die Vergleichsbeispiele 1 bis 5 zeigen, daß Mikrokapseln mit einer ausgewählten spezifischen Dichte die Zeit, die erforderlich ist, um die Ergebnisse zu beurteilen (im Folgenden als Bewertungszeit bezeichnet), wesentlich verbessere
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Beispiel 7
Zu einer 10 #-igen wäßrigen lösung (25 g) eines Maleinsäureanhydrid~Methylvinyläther-Copolymers (GANIREZ-AJi 139, Molekulargewicht ca· 25 000 der General Aniline & Film Co., Ltd.) wurden 2,5 g Harnstoff, 0,25 g Resorcin und 0,3 g Ammoniumchlorid gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren gelöst. Die entstehende lösung wurde auf einem pH-Wert von 4,0 eingestellt. Ein Ölgamisch aus 11,8 g Diisopropylnaphtalin und 13,2 g chloriertem Pa+ raff in (Chlorgehalt 50 $>) wurde in der oben angegebenen wäßrigen Lösung unter Bildung einer Öl-in-Wasser-Emulsion emulgiert. Wenn eine mittlere Teilchengröße von ungefähr 7/um erreicht war, wurde mit Rühren aufgehört. Zu der entstehenden Emulsion wurden 6,7 g einer 37 ?6-igen wäßrigen IFormaldehydlösung und 25 g Wasser gegeben. Nachdem die [Temperatur des Systems von Raumtemperatur auf 650C erhöht worden war, wurde die Reaktion 2 h fortgesetzt. Die so erhaltenen Mikrokapseln mit einer spezifischen Dichte von ungefähr 1,10 wurde 3 x mit dem Phosphorsäurepuffer entsprechend Beispiel 1 gewaschen, um restliches Formalin, Schutzkolloid usw. zu entfernen. 0,5 g der so gewaschenen Mikrokapseln wurden entnommen und erneut in 5 ml Phosphorsäurepuffer dispergiert. Zu der Dispersion wurde 1 ml einer 1 $-igen wäßrigen lösung von Eialbumin (25 mg/ml) (Biochemical Industry Co., Ltd.) als Antigen gegeben und 100/Ul einer wäßrigen Glutaraldehydlösung wurden anschließend zu dem Gemisch zugesetzt. Daraufhin wurde das Gemisch 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Zentrifugieren wurde das System mit dem Phosphorsäurepuffer gewaschen und 0,5 g der Mikrokapseln erneut in 5 ml Phosphorsäurepuffer dispergiert.
Beispiele 8 bis 11 und Vergleichsbeispiele 1 bis 3
Entsprechend Beispiel 7 wurden Mikrokapseln mit verschiededen spezifischen Dichten und antigengebundene Mikrokapseln
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unter Verwendung dieser Mikrokapseln hergestellt mit der Ausnahme, daß die Zusammensetzung des Öls als Kernmaterial (Mischungsverhältnis von Diisopropylnaphtalin zu chloriertem Paraffin), wie in Tabelle 2 angegeben, verändert wurdeo Als Vergleichsbeispiel 3 wurden rote Blutkörperchen vom Schaf (spezifische Dichte ungefähr 1,10) als Träger verwendet.
Tabelle 2
Bei- Bei- Bei- Beispiel 8 spiel 9 spiel 10 spiel 11
Diisopropyl
naphtalin (g)		 14,6 11, 1 7,6 6,6
chloriertes
Paraffin (g)		 10,4 13, 9 17,4 18,4
spezifische
Dichte		 1,07 1, 11 1,15 1,16
Vergleichs
beispiel 1		 Vergleichs=
Beispiel 2
Diisopropyl
naphtalin (g)		 15,6 5,9
chlüliertes
Paraffin (g)		 9,4 19,1
spezifische
Dichte		 1,06 1,17
Interpretation der Agglutination aufgrund der Antikörper= Antigen-Reaktion:
Auf Reihenverdünnungen von Kaninchenantikörpern (positive Proben) und antikörperfreien Reihenverdünnungen (negative Proben) auf einer Tüpfelplatte wurden 25/Ul der so hergestellten 1 io Antigen enthaltenden Mikrokapseln jeweils mit einer Pipette aufgetropft0 Die Tüpfelplatte wurde zum Vermischen gründlich geschüttelte Während die Platte bei Raum-OS C C 2 9 / O 8 VO /28
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temperatur stehen blieb, wurde die Zeit, bis positive und/oder negative Muster auftraten, gemessen.
Ferner wurde beobachtet, ob die positiven Proben und die negativen Proben in entsprechender Weise zu einer Agglutination bzw. Ausfällung führten oder nicht, um (+) oder (-) zu bestimmen. Dann wurde die Aussagefähigkeit untersucht,ob die positiven bzw. negativen Ergebnisse klar oder unklar waren.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt.
Tabelle 3
7 Beispiele Nr. 11 ■Vergleichs
beispiele Nr.
1,10 ä 1 _1O 1,16 112
spezifische
Dichte		 ca. 2 1,07 1,11 1,15 < 1 1,06 1,17 1,10
Bewer
tungs-
zeit (h)		 Δ ca. 5 ca 1 < 1 Δ ünfcerprs-
ca.10 tation ca. 4
nicht mög
lich
Bewert
bar
ke it		 + Λ ο O + XXO
positive
Probe		 - -H- - +
negative
Probe		 O _ — — ο + -
Gesamt
beur
teilung		 ο · Θ XXO
/29
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1Λ-^3 1ü4
30004^3
Bewertbarkeit: ο: (+) oder (-) kann leicht interpretiert
werden
Δ: (+) oder (-) kann nicht ausreichend,
aber noch interpretiert werden
x: (+) oder (-) kann nicht interpretiert
werden
(+) es tritt Agglutination ein (-) es tritt Präzipitation ein
Gesamt-Beurteilung: ® : Nachweisbarkeit ausgezeichnet
ο : Nachweis ist möglich χ : Nachweis ist nicht möglich
Wie aus den oben angegebenen Ergebnissen hervorgeht, sind die an Antigen gebundenen Mikrokapseln mit einer spezifischen Dichte im Bereich von 1,07 bis 1,16 ausgezeichnet in Beziehung auf die Bewertungszeit, obwohl die Mikrokapseln mit einer spezifischen Dichte von 1,07 nicht ganz so gut sind wie rote Blutkörperchen vom Schaf, d.h. die Bewertungszeit bei Anwendung von Mikrokapseln mit einer spezifischen Dichte in diesem Bereich ist kurz (ungefähr 2h). Insbesondere sind Mikrokapseln mit einer spezifischen Dichte im Bereich von 1,11 bis 1,15 bevorzugt, da die Nachweisbarkeiir vergleichbar mit derjenigen unter Verwendung von roten Blutkörperchen vom Schaf ist und die Bewertungszeit sehr kurz ist. Außerdem kann das erfindungsgemäße Trägersystem unter Verwendung von Mikrokapseln nicht zu unerwünschten unspezifischen Reaktionen führen und ergibt eine außerordentlich gute Reproduzierbarkeit. Betrachtet man diese Ergebnisse vom Gesichtspunkt der Untersuchungsgenauigkeit aus, sind die Mikrokapseln, an die Antigen oder Antikörper gebunden ist, und die eine spezifische Dichte im Bereich von 1,07 und 1,16 haben, zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen roten Blutkörperchen vom Schaf überlegen. Ein noch weiter verbesserter Nachweis wird erreicht mit Hilfe von an
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Antigen oder Antikörper gebundenen Mikrokapseln mit einer spezifischen Dichte (spezifischem Gewicht) im Bereich von 1,11 bis 1,15.
Die folgenden Beispiele 12 bis 14 zeigen die Verwendung von markierten Mikrokapseln nach der Erfindung zur quantitativen Bestimmung mit Hilfe der Antigen-Antikörper-Reaktion.
Beispiel 12
Zu 25 g einer 10 $-igen wäßrigen Lösung eines Maleinsäureanhydrid-Methylvinyläther-Copolymers (GANTREZ-AN 139, Molekulargewicht ca· 25 OOO, der Gaasral Anilin & Film Co., Ltd) wurden 2,5 g Harnstoff, 0,25 g Resorcin und 0,3 g Ammoniumchlorid gegeben· Das entstehende Gemisch wurde bis zur Lösung vermischt· Zu der so erhaltenen wäßrigen Lösung wurden 26 g eines Gemisches aus 1,0 g eines fluoreszierenden Aufhellers (White Flour Blue der Sumitomo Chemical Co., Ltd·, CI Fluorescent Brightening Agent 91, beschrieben in Senryo Binran (Handbook of Dye), herausgegeben von Maruzen Co., Ltd·, Tokio 1974) als Markierungssubstanz, 11,8 g Diisopropylnaphtalin und 13,2 g chloriertes Paraffin (Chlorgehalt 50 $6) gegeben· Das Gemisch wurde bis zu einer mittleren Tropfengröße von 6/um emulgiert· Dann wurden 6,4 g einer 37 $-igen wäßrigen Formaldehydlösung zu dem System gegeben» Das Gemisch wurde 2 h auf 600C erhitzt· Die so hergestellten Mikrokapseln wurden 2 χ mit Wasser gewaschen, 1 g der Kapseln entnommen und in 10 ml Phosphorsäurepuffer entsprechend Beispiel 1 suspendiert· Anschließend wurden 100/Ul einer 25 $-igen wäßrigen Glutaraldehydlösung mit der Suspension vermischt. Das Gemisch wurde dann 1 h bei 250C umgesetzt. Nach dem Zentrifugieren wurde das System mit Phosphorsäurepuffer gewaschen·
Getrennt wurden 0,95 ml physiologische Kochsalzlösung zu 0,05 ml Anti-human-IgG (28 mg Ag/ml) gegeben, um ein Lösungs-
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gemisch zu erhalten· Das Gemisch -wurde mit 2 ml (0,25 %) aer oben beschriebenen mit Glutaraldehyd behandelten Mikrokapseln gegeben. Das Gemisch wurde dann 1 h bei 370C incubiert und anschließend über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Nachdem das System 2 χ mit einer 0,2 $-igen glycinhaltigen physiologischen Kochsalzlösung gewaschen worden war, wurde der Phosphorsäurepuffer, der zusätzlich 1 ml 3 i° BSA enthielt, zu dem System gegeben. Man erhielt ein Reagens, umfassend Mikrokapseln, an die Anti-human-IgG gebunden war.
Um einen Treponema-Antikörper im Blut zu bestimmen, wurde ein TP-Antigen (Treponema pallidum (Stamm Nicholas)) mit einer elektromagnetischen Welle von 25 kHz pulverisiert. Dieses Antigen wurde auf eine Glasplatte aufgetragen und getrocknet und dann mit Aceton immobilisierte Auf den beschichteten Bereich wurden 25/Ul verdünntes Serum aufgetropft. Die Reaktion konnte 1 h bei 370C ablaufen. Nach Waschen mit Phosphorsäurepuffer wurde das oben beschriebene Reagens zu dem Reaktionsgemisch gegeben und die Reaktion konnte erneut 1 h bei 370G ablaufen« Die Eluoreszenzintensität wurde mit Hilfe eines Bluorometers gemessen« So konnte das Pallidum-Antigen leicht genau bestimmt werden.
Beispiel 13
Es wurden Mikrokapseln entsprechend Beispiel 12 hergestellt mit der Ausnahme, daß Ee^O, als Kernmaterial verwendet wurde. Nachdem die Miksokapseln mit Glutaraldehyd entsprechend Beispiel 12 behandelt worden waren, wurde ein Anti—t-Fötoprotein daran gebunden, um einen Mikrokapselträger zu erhalten. Der so erhaltene Mikrokapselträger wurde als Pestphasenträger bei einem enzymimmunologischen Sandwichverfahren angewandt und die Menge aneL-Pötoprotein im Serum bestimmt. Bei diesem System konnte der Träger leicht von einer flüssigen Phase abgetrennt werden und das Meßverfahren wurde deutlich vereinfacht und die Reproduzierbarkeit sowie die Stabilität
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verbessert, verglichen mit dem bekannten System, bei dem Glasperlen als Träger angewandt wurden.
Beispiel 14
Es wurden entsprechend Beispiel 12 Mikrokapseln hergestellt mit der Ausnahme, daß 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon als Kermaterial angewandt wurde. Nach Behandlung mit Glutaraldehyd, wie in Beispiel 12 beschrieben, wurde ein Anti-HCG an die Kapseln gebunden und die Menge an HCG in einer Probe konnte durch UV-Absorption bei 280 bis 340 nm auf einfache Weise bestimmt werden.
Beispiel 15
Es wurden Mikrokapseln mit einer spezifischen Dichte von 0,80 entsprechend Beispiel 7 hergestellt, mit der Ausnahme, daß 18,0 g Isoparaffin enthaltend 1 $ oleophilen blauen Farbstoff 0-79 (CI Lösungsmittel-Blau 55, Senryo Binran (Handbook of Dye), Maruzen Co.> Ltd. 1974) als Kernmaterial angewandt wurdene
An die so erhaltenen Mikrokapseln wurden entsprehcnd Beispiel 7 Eialbumin gebunden.
25/Ul der so hergestellten 1 # antigengebundenen Mikrokapseln wurden auf Reihen-Verdünnungen von ganzem Blut enthaltend Kaninchenantikörper (positive Proben) und antikörperfreies ganzes Blut in Reihen-Verdünnungen (negative Proben) auf einer Mikroplatte mit einer Pipette aufgetropft. Die Mikroplatte wurde zum Vermischen gut geschüttelt. Nach 10 Minuten langem Stehen bei Raumtemperatur waren die Blutkörperchen ausgefallen (präzipitiert) und die Mikrokapseln schwammen an der Oberfläche der überstehenden Serumphase, wo das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Agglutination
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mit dem bloßen Auge oder mikroskopisch bestimmt wurde. Die Interpretation war sehr leicht aufgrund der gefärbten Mikrokapseln und der Tatsache, daß die Mikrokapseln oben schwammen aufgrund der geringen spezifischen Dichte (hierdurch wird es möglich, ganzes Blut zu verwenden).
Um eine Blutkoagulation zu vermeiden, wurde Heparin zu dem ganzen Blut als Antikoagulans zugesetzt.
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Claims (13)

ΓΡ.-ING PRANZ PATENTANWÄLTE . DR. PHI— PLED/. WUJSTIiOFF (ΐΟ27-Ι95ί) WUESTHOFF-ν. PECHMANN-BEHRENS-GOETZ γ,ρμρ«·. »»*».» -ils (.„2-„7x) DIPL1-CHEM1DR-E-FREIKERr VON FECHUANN MOiBSSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENS MANDATAIRES AGRfES PRES L'oFFICE EUROPEEN DES BREVETS DIPL.-ING.J DIPL.--WIRTSCH.-ING. RUPERT GOETZ 1Δ-53 104 - D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2 Anm.: Fuji Photo PiIm telefon: (089) 66 20 51 telegrauu: protectpatent telex: j 24 070 Patentansprüche
1. Mikrokapseln aus einem Kern und einem Wand- bzw. Hüllmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß an der Oberfläche ein Antigen oder Antikörper gebunden ist.
2« Mikrokapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine spezifische Dichte von ungeföhr 0,8 bis 1,20 besitzen.
3. Mikrokapseln nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Dichte ungefähr 1,05 bis 1,20 beträgt.
4. Mikrokapseln nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Dichte ungefähr 1,07 bis 1,16 beträgt.
5. Mikrokapseln nach Ansprüche 1 bis 4f dadurch gekennzeichnet, daß das Wandmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe Polyurethan, Polyharnstoff und Polyurethan-Harnstoff.
6. Mikrokapseln nach Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Kernmaterial, Wandmaterial, Antigen und/oder Antikörper mit einer Markierungssubstanz markiert sind.
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7. Mikrokapseln nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungssubstanz ein Isotop, ein Enzym, eine fluoreszierende Substanz, eine magnetische Substanz, ein UV-Absorber und/oder ein Farbstoff ist·
8. Mikrokapseln nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Isotop ^J oder J isto
9· Mikrokapseln nach Anspruch 7» dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Enzym eine Alkaliphosphatase, /3-Galactosidase, Acetylcholinesterase, Glucoamylase, MaIeinsäuredehydrogenase, Glucose-6-phosphorsäuredehydrogenase, Peroxidase oder Glutaroxidase ist.
10. Mikrokapseln nach Anspruoh 7, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Substanz Stilben oder ein Derivat davon, ein Coumarinderivat, ein Pyrazolinderivat, ein Benzoxazolderivat, Bisoxazol oder 4,4'-Bistriazinyl ist.
11. Mikrokapseln nach Anspruch 7, dadurch g e k. e η η zeichnet, daß die magnetische Substanz Eisenpulver, Nickel, Kobalt, OrO2, CoO, HlO, Mn2O,, ein magnetisches Zinkoxid, ein magnetisches Eisenoxid, eine Legierung von Al, Ki, Co oder Cu, ein Chalcogenid oder Ferricolloidpulver ist.
12. Mikrokapseln nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der UV-Absorber ein Salicylsäurederivat, ein Benzophenonderivat oder ein Benzotriazolderivat ist,
13. Mikrokapseln nach Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungssubstanz sich an der Außenseite des Wandmaterials befindet.
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- 3 - 1.4-S3 104
14β Mikrokapseln nach Ansprüche 7 bis 12, dadurch g e kennzeichnet, daß die Markierungssubstanz
sich im Kernmaterial befindet,
15· Verwendung der Mikrokapseln nach Ansprüche 1 bis 14 zur Bestimmung einer biologischen Komponente mit immunologischer Aktivität.
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