JPH092926A - 口内組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 口内ケア用組成物を提供する。 【解決手段】 本発明組成物は、細菌のアドヒージン
（adhesin）に特異的に認識される炭水化物（糖類）又
はペプチド構造を含む特定のポリマー、より特定する
と、細菌レクチンにより認識される炭水化物含有ポリマ
ーで被覆されているか又は、プラーク細菌抗原を認識す
る抗体又は抗体フラグメントで被覆されている、コロイ
ド抗プラーク剤を含有する。そのような被覆されたコロ
イド、例えば被覆されたコロイド酸化亜鉛は、後に酸性
ｐＨにおいて抗プラーク剤が放出されるヒトの口内の特
定部位を標的にすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、(i) プラーク（pl
aque）細菌抗原（例えば、ストレプトコッカス・サング
イス（Streptococcus sanguis）、ストレプトコッカス
・ミュータンス（Streptococcus mutans）、その他）を
特異的に認識する抗体、及び／又は(ii) 細菌アドヒー
ジン（bacterial adhesins）によって特異的に認識され
る炭水化物（サッカリド）又はペプチド構造を含むポリ
マー、特に、炭水化物結合蛋白質、即ち、レクチン類に
よって認識される炭水化物含有ポリマー、の使用によっ
てコロイド状抗プラーク剤をプラーク（プラーク又は歯
苔）に供給することに関する。

【０００２】

【従来の技術】エナメルペリクラ（enamel pellicle）
及び細菌が代謝作用を有するポリサッカリドへの細菌の
付着は歯の表面上にプラーク（唾液と細菌に由来するポ
リマー中に埋め込まれた微生物の群集）を成長させる。
良好な口内衛生剤が存在しない場合、プラークは口内の
健康を損なう水準まで蓄積して、例えば、虫歯及び歯齦
炎のような疾病状態をもたらすことがしばしば起り得
る。現在までの研究は、微生物のコロニー形成は、「ア
ドヒージン（adhesins）」と呼ばれる細胞表面蛋白質
と、例えば、その他の細菌上又は宿主組織上に存在する
同種結合部位（cognate binding sites）との立体特異
的相互作用によって促進されることを示唆している（Ts
ivion Ｙ及びSharon N(1981)Biochim. Biophys. Acta 6
42、336;Kawai Y及びYano I(1983)Eur. J. Biochem. 13
6、351；Mirelman D及びOfek I(1986)、Microbial Lecti
ns and Agglutinins、Mirelman D編、Ｊohn Wiley and S
ons発行）。実際に、多くの口内種が典型的にはレクチ
ン（即ち、炭水化物結合蛋白質）であるアドヒージンを
有することが示された（Levineら、1978 Infect. Immu
n.19、107;Weerkamp及びMcBride、1980 Infect. Immun.3
0、150）。ペリクラ(pellicle)、プラークマトリック
ス、及び細菌表面上に存在する炭水化物構造体への結合
を媒介する口内細菌レクチンはプラークの成長を疑いな
く促進する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】口内の手入れ用の効果
的な活性系の発展に関連した主要な技術的な問題の１つ
は、有効成分の所望の場所への直接的な（substantiv
e）供給である。現在使用されている抗プラーク剤のほ
とんどは、(i) 静電気及び／又は (ii) 疎水性相互作用
によって口内の表面に結合する。しかしながら、この結
合は一般に可逆的であり本質的に非特異的であり、即
ち、薬剤は全ての口内組織に結合する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、コロイド状抗
プラーク剤を歯の表面を標的として供給することに関す
る。「抗プラーク剤（anti-plaque agents）」という用
語は本明細書中において、ストレプトコッカス・サング
イス又はストレプトコッカス・ミュータンスのような特
定の口内細菌を殺す抗微生物剤（antimicrobial agent
s）並びに、例えば、プラークのｐＨに作用すること又
は現場で抗微生物剤を形成することのような、別の方法
でプラークの形成を防止するか又は減少させる薬剤を包
含する。抗微生物剤の典型的な例は、銀、銅、亜鉛、
鉄、錫、水銀、ランタン、イットリウム、インジウム、
金のような抗微生物金属及び金属酸化物である。好まし
い抗微生物剤は酸化亜鉛であり、本発明を以下では酸化
亜鉛に基づいて説明するが、本発明はそれのみに限定さ
れるものではないことは理解されたい。

【０００５】その他の抗プラーク剤の例はチョーク（ch
alk）のようなプラーク−ｐＨ緩衝剤、及び、例えば、
酸化還元酵素のような、現場で抗微生物剤を形成する薬
剤であり、これらはコロイドシリカのようなコロイド状
キャリヤー物質上に吸着される。

【０００６】コロイド状酸化亜鉛は潜在的に二重の機能
を有する薬剤であり、酸性ｐＨで亜鉛イオンが放出され
ると、(i) 微生物の解糖の禁止と (ii) 緩衝剤効果をも
たらす。コロイド状酸化亜鉛の使用の追加の利点はその
小さい粒度（約１０ｎｍ）であり、これはプラークを通
しての拡散を改善し、その結果としてその効能を改善す
る。粒状の酸化亜鉛は、例えば、(i) ポリマー、特に、
糖蛋白質及びその他のサッカリド又はオリゴサッカリド
含有付加物、及び (ii) 抗体によって、特定の部位を標
的にすることができる。

【０００７】幾つかの研究が、亜鉛及び酸化亜鉛のプラ
ーク防止活性及び亜鉛イオンの微生物による解糖を禁止
する能力を説明している（例えば、Gilbert R J及びIng
ramG S(1988) J. Pharm. Pharmacol. 40、399；Scheie
A A、Assar S及びRolla G(1988) APMIS 96、761；JP 403
8904；WO 8700051；及びDE 3681289）。しかしながら、
コロイド状酸化亜鉛はこの目的に対して提案されていな
いし、特定の標的系によって特定の場所に送ることも示
唆されていない。もう１つの提案された歯科向け用途に
は、虫歯の治療用の硬化可能な材料及び／又はクッショ
ン材としての酸化亜鉛の使用である（例えば、ＥＰ ３
２９ ０９８；ＳＵ １６４８４７３）。また、酸化亜
鉛は診断方法においてモノクローナル抗体のキャリヤー
として提案されている（例えば、ＪＰ ５０１０９５
２）。

【０００８】上述したように、口内の手入れ用の効果的
な活性系の発展に関連した主要な技術的な問題の１つ
は、有効成分の所望の場所への直接的な（substantiv
e）供給である。現在使用されている抗プラーク剤のほ
とんどは、(i) 静電気及び／又は(ii) 疎水性相互作用
によって口内の表面に結合するが、この結合は一般に可
逆的であり本質的に非特異的であり、即ち、薬剤は全て
の口内組織に結合する。本発明の有効成分の直接性（su
bstantivity）は、口内部の固着点として作用できる部
位に対して特異的に狙いを付け、その後酸性ｐＨにおい
て亜鉛イオンを制御しながら放出することによって改善
される。

【０００９】錯体をコロイド状酸化亜鉛と標的化（targ
eting）系（例えば、抗体、ポリマー）との間で形成で
きる。歯の表面を化合物の標的にして虫歯に関係する細
菌の成長を制御できる。標的化及び従って直接性は必要
な有効成分の量を減少させる。標的化系群は、合成化学
（例えば、ポリマー、抗体）、天然源からの精製又は抽
出（例えば、ミルク蛋白質）によって、又は分子生物学
の方法（例えば、抗体及びフラグメント）によって生成
できる。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の目的は、コロイド状抗プ
ラーク剤、特に酸化亜鉛、をプラーク細菌に直接的に供
給するために特定の標的化系（例えば、ポリマー、抗
体）を使用することである。

【００１１】ポリマー標的化系の場合、細菌のアドヒー
ジンによって特異的に認識される構造を有するポリマー
が酸化亜鉛を運ぶために使用される。これは酸化亜鉛粒
子をこのポリマーで被覆することによって達成される。
そのようなポリマー標的化系には、細菌のアドヒージン
によって特異的に認識されるサッカリド又はペプチド構
造を含む天然又は合成のポリマーが含まれる。合成ポリ
マーには、(i) ラクトビオンアミド、マルトビオンアミ
ド、及びその他の糖構造体のような特定のサッカリド又
はオリゴサッカリド、又は (ii) ペプチド構造体とのポ
リアニオン性、ポリカチオン性、又は両性付加物が含ま
れる。天然ポリマーには、デキストラン、澱粉、ウシ糖
蛋白質、植物性糖蛋白質及びポリサッカリド、及びプラ
ーク細菌によって認識される糖基を有するその他の天然
高分子が含まれる。さらに、蛋白質の混合物を使用して
コロイド状金属酸化物錯体を運ぶことができる。適する
ポリマーには、例えば、デキストラン（上述のもの）、
フェチュイン、ウシのミルクからの食品級糖蛋白質、例
えば、κ−カゼイン、アシアロ−κ−カゼイン、スウィ
ートホエー、及びアシアロフェチュインが含まれる。

【００１２】抗体標的化系の場合、抗体又は抗体のフラ
グメントが標的の部位に結合する（例えば、ストレプト
コッカス・サングイス、ストレプトクッカス・ミュータ
ンスに対して製造された抗体はそれらの各々の抗原、即
ち、ストレプトコッカス・サングイス、ストレプトコッ
カス・ミュータンスに結合する）。抗体標的化系には、
合成により、又は分子生物学及び発酵のような天然の製
造系を使用することによって誘導される抗体の全体又は
１価又は多価の抗体のフラグメントが含まれる。抗菌抗
体（又はフラグメント）とコロイド状酸化亜鉛との間の
化学的錯化によって錯体を形成することができる。ある
いは、抗体フラグメント結合領域とコロイド状酸化亜鉛
とから成る融合体を製造することができる。コロイド状
酸化亜鉛錯体に対して効率的に吸着するぺプチド構造を
有する抗体フラグメント融合体も使用できる。さらに、
自己集合系（self assembly system）を使用してコロイ
ド状金属酸化物の標的を設定することができ、それによ
って第１のプラーク特異性抗体又はフラグメントがプラ
ーク構造体を標的にするために使用され、第１の抗体
（又はフラグメント）に対して特異的な第２の抗体（又
はフラグメント）が金属酸化物錯体を被覆するために使
用される。このようにして、二重の抗体系が現場で集合
してプラーク中の特異的構造を錯体の標的にする。

【００１３】本発明のもう１つの目的は、細菌レクチン
によって特異的に認識される炭水化物残基を含むポリマ
ーを使用して特異的部位をコロイド状酸化亜鉛の標的に
し、酸性ｐＨで亜鉛イオンを放出させることである。本
発明のもう１つの目的は、プラーク細菌を認識する抗体
を使用して特異的部位をコロイド状酸化亜鉛の標的に
し、酸性ｐＨで亜鉛イオンを放出させることである。

【００１４】上述の標的を定められたコロイド状酸化亜
鉛は、歯磨、マウスリンス、ジェル、歯間清掃用糸、及
びその他の口内手入れ用製品中に配合することができ
る。

【００１５】口内手入れ用製品は、練歯磨、ジェル、口
内清浄剤（mouthwashes）、粉末、うがい薬、咳止め錠
剤（lozenges）、チューインガム、及び類似物の形態で
よい。

【００１６】口内手入れ用製品組成物は、澱粉、スクロ
ース、ポリオール、表面活性剤、水、又は水／アルコー
ル混合物系のような医薬的見地から見て許容可能なキャ
リヤーのような従来的成分をさらに含むことができる。
歯磨に配合される場合、そのような組成物は、通常の歯
磨成分の全てを含むことができる。従って、それらは、
シリカ、アルミナ、炭酸カルシウム、燐酸二カルシウ
ム、ヒドロキシアパタイト、ピロ燐酸カルシウム、トリ
メタ燐酸塩、不溶性ヘキサメタ燐酸塩などのような粒状
研磨剤を一般に５乃至６０重量％の量で含むことができ
る。

【００１７】さらに歯磨組成物は、グリセロール、ソル
ビトール、プロピレングリコール、ラチトール（latito
l）などのような湿潤剤を含むことができる。

【００１８】アニオン性、非イオン性、両性、及び双性
合成洗浄剤のような界面活性剤も含有させることができ
る。それらの例は、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル
ベンゼンスルホン酸ナトリウム、モノ−及びジ−オクチ
ル燐酸ナトリウム、ナトリウムラウロイルサルコシネー
ト、コカミドプロピルベタインである。

【００１９】ナトリウムカルボキシメチルセルロース、
キサンタンガム、アラビアガム、その他のような結合剤
及び増粘剤も含有させることができ、また、ポリアクリ
レートのような合成ポリマー及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登
録商標）のようなカルボキシビニルポリマーも含有させ
ることができる。

【００２０】ペパーミント及びスペアミント油のような
風味剤、並びに防腐剤、不透明化剤（opacifying agent
s）、着色剤、ｐＨ調節剤、甘味剤なども含有させるこ
とができる。

【００２１】トリクロサン（Triclosan）、クロルヘキ
シジン（chlorhexidine）、硫酸銅、クエン酸亜鉛、及
びピロ燐酸第一錫のような銅、亜鉛、及び錫の塩、サン
グイナリン（sanguinarine）エキス、メトロニダゾール
（metronidazole）のような追加の抗菌剤も含有させる
ことができる。追加の抗菌剤の別の例は、セチルピリジ
ニウムクロリドのような第四アンモニウム化合物；クロ
ルヘキシジンジグルコネートのようなビス−グアニド、
ヘキセチジン（hexetidine）、オクテニジン（octenidi
ne）、アレクシジン（alexidine）、２．２′メチレン
ビス−（４−クロロ−６−ブロモフェノール）のような
ハロゲン化ビスフェノール化合物である。

【００２２】抗菌剤のような有効成分の運搬を改善でき
るポリマー化合物も含有させることができる。そのよう
なポリマーの例は、ポリビニルメチルエーテルと無水マ
レイン酸のコポリマー、及び例えば、ＤＥ−Ａ−３，９
４２，６４３（コルゲート（Colgate））に記載されて
いるもののような、その他の類似の運搬改善ポリマーで
ある。

【００２３】さらに、イブプロフェン、フルルビプロフ
ェン（flurbiprofen）、アスピリン、インドメタシン、
その他のような抗炎症剤も含有させることができる。

【００２４】弗化ナトリウム及び弗化第一錫、アミンフ
ルオリド、モノフルオロ燐酸ナトリウム、乳酸カルシウ
ム及び／又はグリセロ燐酸カルシウム、ストロンチウム
塩及びストロンチウムポリアクリレート、カゼイン及び
カゼイン消化物、及び燐蛋白質のような虫歯防止剤も含
有させることができる。

【００２５】その他の選択的成分には、ビタミンＣのよ
うなビタミン、植物エキス、クエン酸カリウム、塩化カ
リウム、及び硝酸カリウムのようなカリウム塩が含まれ
る。

【００２６】その他の選択的成分には、デキストラナー
ゼ及び／又はミュータナーゼ（mutanase）、アミログル
コシダーゼ、グルコース−オキシダーゼとラクトペルオ
キシダーゼ、ノイラミダーゼのような酵素、及びペルオ
キシ二燐酸カリウムのような過酸化水素発生化合物が含
まれる。

【００２７】さらに、口内手入れ用製品組成物は、アル
カリ金属ピロ燐酸塩、次亜燐酸塩含有ポリマー、有機ホ
スホネート、ホスホシトレート、その他のような結石防
止剤（anti-calculus agents）を含むことができる。

【００２８】含有させてもよいその他の選択的成分は、
例えば、バクテリオシン、バクテリオファージ、組織呼
吸因子、抗体、ペルオキシ化合物のような漂白剤、重炭
酸ナトリウム／クエン酸系のような発泡剤系、色変化系
などである。

【００２９】本発明を実施例によってさらに説明する。
実施例１は、文献中に報告されている種々のポリマーに
対する種々の微生物の結合の研究を確認するだけであ
る。

【００３０】

【実施例】

実施例１ 炭水化物（ポリマー）標的系 １）酸化亜鉛を被覆するポリマーの選択 いくつかの凝集検定（１．１．１．２）を（第１表に示
したような）アクチノマイセス・ナエスルンジ（Actino
myces naeslundii）、ストレプトコッカス・ソブリヌス
（Streptococcus sobrinus）、及びストレプトコッカス
・サングイスの十分に証明されているレクチン−受容体
の相互作用を研究するために使用した。本質的に、これ
らの検定は光学濃度（ＯＤ）を経時的にモニターするも
のであるが、ＯＤの低下は細菌の凝集の増大と相関し、
これはレクチン−受容体の相互作用を示す。

【００３１】 第１表：３つの口内種のレクチンによって認識される特定のポリマー中に存在 する炭水化物構造 第１表 細菌 炭水化物構造 ポリマー レクチンによる認識 −−−−−→ Ｓ．ソブリヌス α １、６ グルコース デキストラン＞７０ＫＤａ Ｓ．サングイス Ｎ−アセチルノイラミン酸 フェチュイン （シアリン酸） Ａ．ナエスルンジ β−ガラクトース アシアロフェチュイン

【００３２】１．１ ラテックス球凝集（Latex Bead A
gglutination） この検定は、Ａ．ナエスルンジ及びＳ．サングイスのポ
リマーで被覆された球への表面結合を研究するために使
用した。

【００３３】（１）微生物の準備 Ａ．ナエスルンジ ＰＫ ２９、Ｓ．サングイス Ｇ９
Ｂ、及びＳ．ソビリヌス ６７１５の培養体を脳心浸出
補充培地（brain heart infusion supplemented medi
a）（脳心浸出液 ４７ｇ／ｌ；酵母抽出物 ５ｇ／
ｌ；塩酸システイン０．１ｇ／ｌ；ハエミン（haemin）
５００ｍｌ／ｌ；ビタミンＫ ５ｍｇ／ｌ；滅菌ウマ
血液 ５０ｍｌ／ｌ）において、３７℃一晩成長させ
た。細菌培養体を次に遠心分離（２０００ｇ；１０分
間）し、生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２度洗浄
し、６００ｎｍにおいて適当な吸光度になるようにＰＢ
Ｓで再懸濁した。

【００３４】（２）ポリマーで被覆されたラテックス球
の準備 ２０ｍＭトリクスマ（Trixma）をベースとした（シグマ
（Sigma））緩衝液、ｐＨ８．２（０．７３％グリシ
ン；１％塩化ナトリウム；０．１ｍＭ塩化カルシウム及
び０．０２％アジドナトリウム“ＴＧＳ”）及び適した
被覆糖蛋白（即ち、Ａ．ナエスルンジに対してはアシア
ロフェチュイン；Ｓ．サングイスに対してはフェチュイ
ン）５ｍｇを含むポリプロピレン管（Greiner）の中
に、２００μｌのラテックス球（直径６．４μ、シグ
マ、カタログ番号ＳＤ−６Ａ）を分散させた。サンプル
をロータリーミキサー（６０ｒｐｍ，Heidolph）で３７
℃において１時間定温放置し（incubated）、次に、Ｔ
ＧＳ緩衝液に０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
加えたもので洗浄し、遠心分離した。最終的に、沈殿を
０．１％ＢＳＡ／ＴＧＳ緩衝液１０ｍｌ中に再懸濁し
た。

【００３５】（３）検定方法 全部で２．０ｍｌのサンプル容量をもつ密封できるプラ
スチック栓付き使い捨てポリスチレンキュベット（シグ
マ アルドリッチ テックウエア（Sigma Aldrich Tech
ware））を使用した。（アシアロフェチュイン又はフェ
チュイン）で処理したラテックス球１．０ｍｌをキュベ
ットに取り、次に適量のＴＧＳを加えた。最後に、細菌
懸濁液＊（Ａ．ナエスルンジ又はＳ．サングイス）０．
１ｍｌを加え、凝集を開始した。キュベットを密封し、
初期の吸光度を読み取る前に振り混ぜた。その後、読み
取りは２分おきに２０分間行った（ＯＤ ６００ｎ
ｍ）。読み取りの間キュベットを２５ｒｐｍで回転させ
た。 ＊細菌懸濁液の最終的なＯＤ（６００ｎｍ）は１．０で
あった。

【００３６】注意 対照サンプルは、細菌のレクチンに
認識されない、炭水化物を含まない蛋白ＢＳＡで被覆さ
れたラテックス球を含有した。反応の特異性は、Ａ．ナ
エスルンジの細菌レクチン部位に対して競合し凝集を阻
害するラクトース、すなわちβ−ガラクトシド、を配合
することより決定した。

【００３７】結果 アシアロフェチュインで処理されたラテックス球とＡ．
ナエスルンジを定温放置したところ、凝集の増加に付随
する吸光度の大幅な低下が生じた（図１）。ここで、細
菌の凝集は、ラテックス球上の多数のβ−ガラクトース
構造と細菌レクチンとの相互作用によるものである。細
菌の結合の特異性は、細菌レクチン部位に対して競合す
るラクトースを添加したとき、Ａ．ナエスルンジのレク
チン部位に結合し、細菌の凝集を阻害することが判明し
たラクトースの結果によって示唆されている。レクチン
部位に対して競合しないグルコースは、細菌の凝集にほ
とんどあるいは全く影響を与えない。Ｓ．サングイス
を、フェチュインで被覆されたラテックス球に加えたと
き、細菌の凝集はほとんどあるいは全く起こらなかっ
た。フェチュイン中に存在することが主張されているこ
の例において、Ｓ．サングイスはシアリン酸残基に対し
て十分に証明されたレクチンを有するので、これは予想
されなかった結果である。凝集が生じないのは、おそら
くフェチュインの製造過程によるものであり、この過程
の中で、高い比率の末端の糖、即ち、シアリン酸が切断
され、失われた可能性がある。

【００３８】１．２ ポリマーによって誘導された凝集 この検定はＳ．ソブリヌスのグルカン結合を研究するた
めに使用した。ここでは、７０ＫＤａよりも大きいデキ
ストラン中のα−１、６結合グルコース残基とＳ．ソブ
リヌスのレクチンとの間で認識が起こったときに細菌の
凝集が起きると期待される。

【００３９】検定方法 前述したように、使い捨てのキュベットをこの検定に用
いた。ＰＢＳ中に５％ＢＳＡを含む溶液０．２ｍｌをキ
ュベットに取り、次に細菌の懸濁液＊１．６ｍｌを加え
た。次に凝集素（７０ＫＤａより大きいデキストラン、
この場合、７９ＫＤａ及び２０００ＫＤａ）を懸濁液に
添加し、さらにＰＢＳを添加することによって全体の体
積を２．０ｍｌとした。キュベットを密封し、初期の吸
光度を読み取る前に振り混ぜた。次の読み取りは２分お
きに２０分間行った（ＯＤ ６００ｎｍ）。キュベット
は読み取りの間２５ｒｐｍで回転させた。対照は（ａ）
デキストラン非存在下の細菌及び（ｂ）７０ＫＤａより
小さいデキストランと細菌を含んだが、これらでは、細
菌の凝集が期待されなかった。 ＊細菌懸濁液の最終的なＯＤ（６００ｎｍ）は１．０で
あった。

【００４０】結果 ７９ＫＤａ及び２０００ＫＤａのデキストランにＳ．ソ
ブリヌスを添加したところ、細菌凝集の増大に対応する
吸光度の低下を生じた（図２）。この応答は、レクチン
が７０ＫＤａより大きいデキストランのブドウ糖残基を
認識したことを示唆した。７０ＫＤａより小さいデキス
トランにＳ．ソブリヌスを添加したときは、細菌の凝集
は見られなかった。約７０ＫＤａより小さいデキストラ
ンはおそらく多数の細菌と架橋する程大きくなく、その
ため、凝集の誘導は期待されない。

【００４１】１．３ ポリマーの選択 上記の研究に基づき、酸化亜鉛を被覆するために選択さ
れたポリマーは、迅速で特異的な凝集を生じたものであ
った。この基準に合致することが見いだされたポリマー
は、図１に記したような、β−ガラクト−スを含む糖蛋
白のアシアロフェチュインであった。

【００４２】実施例２ β−ガラクト−ス含有糖蛋白（アシアロフェチュイン）
による酸化亜鉛の細菌標的化 ２．１ 凝集検定 方法 （１）コロイド状酸化亜鉛の調製（一次粒度：約１０ｎ
ｍ） 酸化亜鉛の配位前駆錯体をエタノール中のＺｎ（ＯＡ
ｃ）₂ ２Ｈ₂ Ｏの０．１Ｍ溶液を３時間還流することに
より合成した。溶液を０℃まで冷却し、次に最終的な塩
基濃度を０．１Ｍにするために水酸化ナトリウムのエタ
ノール溶液を加えた。溶液を１時間撹拌し、その後蒸発
乾固させた。残った白色固体を蒸留水で洗浄し、凍結乾
燥し、ゆるやかに結合した有機体、とりわけ酢酸、を除
去するために１６０℃で焼成した。

【００４３】（２）アシアロフェチュインで被覆された
酸化亜鉛の調製 アシアロフェチュイン（０．０２％）を酸化亜鉛の０．
０３％蒸留水溶液に添加し、回転混合器（デンレイ、ス
ピラミックス ５（Denley, Spiramix ５））により一
晩振盪した（室温）。

【００４４】（３）検定方法 全サンプル容量２．０ｍｌを含有するポリスチレンキュ
ベットを用いた。アシアロフェチュインで被覆された酸
化亜鉛１．０ｍｌをキュベットにとり、次にＴＧＳ緩衝
液を適量加えた。細菌懸濁液＊（Ａ．ナエスルンジ又は
Ｓ．サングイス０．１ｍｌ）を次に添加し、凝集を開始
した。キュベットを密封し、初期の吸光度を読み取る前
に振り混ぜた。次の読み取りは２分おきに２０分間行っ
た（ＯＤ６００ｎｍ）。キュベットは読み取りの間２５
ｒｐｍで回転させた。 ＊細菌懸濁液の最終的なＯＤ（６００ｎｍ）は１．０で
あった。

【００４５】注意 対照サンプルは、上記の細菌レクチ
ンに認識されない、炭水化物を含まないＢＳＡで被覆さ
れた酸化亜鉛を含有した。

【００４６】特異性は、細菌レクチン部位に対して競合
し、その結果として凝集を阻害するラクトースの添加に
より決定された。

【００４７】結果 図３に示したようにＡ．ナエスルンジの細菌レクチンと
アシアロフェチュインで被覆された酸化亜鉛上のβ−ガ
ラクトース構造との間の特異的相互作用（ラクトースは
阻害する）が結果として示された。

【００４８】２．２ 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ） 方法 ＴＥＭは細菌凝集物中におけるＡ．ナエスルンジと亜鉛
の結合を視覚化するのに用いた。試験サンプル（アシア
ロフェチュインで被覆された酸化亜鉛及びＡ．ナエスル
ンジ）及び対照（ＢＳＡで被覆された酸化亜鉛＋Ａ．ナ
エスルンジ；アシアロフェチュイン＋ラクトース＋Ａ．
ナエスルンジ）を透過型電子顕微鏡のグリッド（ｇｒｉ
ｄｓ）に分与し、ＪＥＯＬ ２００ＣＸ ＴＥＭ上８０
ｋｅＶで観察した。

【００４９】結果 試験サンプルと対照サンプルでは、亜鉛の付着に関して
明らかな違いがあることが明らかとなった。試験サンプ
ル中の細菌の凝集物の上及び周囲の多量の亜鉛（０．７
ｕまで密集している）に比べて、対照サンプルでは疎ら
な亜鉛が観察された。サンプルを滴定したとき（アシア
ロフェチュインで被覆された酸化亜鉛１：４；ＢＳＡで
被覆された酸化亜鉛１：４）対照サンプルでは亜鉛は観
察されなかった。

【００５０】この結果は、アシアロフェチュイン上に存
在するβ−ガラクトース残基の、Ａ．ナエスルンジの特
異的部位をコロイド状酸化亜鉛の標的にする能力を示し
たものである。

【００５１】図３は、アシアロフェチュインで被覆され
た酸化亜鉛によるＡ．ナエスルンジのβ−ガラクト−ス
特異的凝集を示している。

【００５２】実施例３ アシアロフェチュインで被覆された酸化亜鉛からの亜鉛
イオンの伝送 方法 Ｓ．ミュ−タンス（炭水化物の代謝により酸を生成し、
虫歯に関与している有機体）をＢＨＩ（１５％二酸化炭
素、３７℃）中一晩成長させ、この培養物の接種体を４
％スクロースを含む新しいＢＨＩ（３分の１に希釈し
た）に入れた。培養物を定温放置（１５％二酸化炭素、
３７℃）したが、サンプルを開始時に取り出し、その後
１時間ごとに取り出した（９時間まで）。２ｍＭの酸化
亜鉛を含む細菌凝集体（即ち、アシアロフェチュインで
被覆された酸化亜鉛とＡ．ナエスルンジ）を同じ体積だ
けＳ．ミュ−タンス懸濁液に加え、３７℃で１時間定温
放置した。その後、サンプルをｐＨの測定及び生菌の計
数（ＣＦＵ／ｍｌ）用に採取した。

【００５３】結果 培養体のｐＨが４．２９に落ちるまで、酸化亜鉛集合体
のＳ．ミュ−タンス培養体への添加は、ｐＨあるいは生
存数にほとんど影響しなかった。このｐＨ（７時間生
長）では、酸化亜鉛集合体の添加により、培養体のｐＨ
は４．２９から５．４５へ増大し、Ｓ．ミュ−タンスの
生存数が減少するという、ｐＨ及びＳ．ミュ−タンスの
生存数へのかなりの影響が観察された（第２及び３
表）。

【００５４】 表 ２：ストレプトコッカス・ミュータンス（S.mutans）の培養物ｐＨにおけ る酸化亜鉛の集塊（aggregate）の効果 培養物ｐＨ 試験試料 ５．４５ （＋２ｍＭ ＺｎＯ） 対照試料 ４．２９ （−ＺｎＯ） （ＺｎＯ集塊がストレプトコッカス・ミュータンスの培
養物に１０分間又は１時間までの間添加された場合に、
ｐＨに関しては有意の差は見出だされなかった。）

【００５５】 表 ３：ストレプトコッカス・ミュータンスの生菌数における酸化亜鉛集塊の 効果 生 菌 計 数 ＣＦＵ／ｍｌ Ｌｏｇ 試験試料 ２．４×１０^７ ７．３８ （＋２ｍＭ ＺｎＯ） 対照試料 ４．２×１０^８ ８．６２ （−ＺｎＯ）

【００５６】ストレプトコッカス・ミュータンスの生菌
数の低減（表３に示されているように）は、恐らく、酸
性ｐＨでの亜鉛イオン解離の結果としてのグルコース代
謝の阻害によるものである。

【００５７】実施例４ 抗細菌抗体での酸化亜鉛の標的作用 ４．１ 方法 （ｉ）抗体で被覆された酸化亜鉛の生成 コロイドの酸化亜鉛（０．０３％）を、０．２５ｍｇ／
ｍｌの、抗細菌抗体［すなわち、抗ストレプトコッカス
・サングイス免疫グロブリン（anti streptococcus san
guis IgG）］のｐＨ９．１のトリス／ＨＣｌ緩衝液溶液
に添加した。この懸濁液を穏やかに超音波処理をし、回
転振盪器［６０ｒｐｎ、ハイドルフ（Hidolph）での最
終混合を５時間行った。次にその懸濁液を、トリス／Ｈ
Ｃｌ緩衝液での洗滌そして遠心分離［１０，０００ｒｐ
ｍ、２０秒、エッペンドルフ（Eppendorf）遠心分離
機］を３回行い、過剰の抗体を除去した。最終的に、そ
のペレットを１ｍｌの緩衝液で再懸濁し、４℃で保存し
た。

【００５８】（ｉｉ）抗体で被覆された酸化亜鉛の特異
性 共焦点レーザー走査鏡検法（confocal laser scanning
microscopy）（CLSM）を用いて、特異性すなわち、抗体
被覆酸化亜鉛のその抗原を認識する能力を測定した（図
４）。画像素子強度（pixel intensity）による抗体−
抗原反応を定量するこの方法では、試料のその場での検
査ができる。簡単に説明すれば、抗原（ストレプトコッ
カス・サングイス：１．１におけるように調製された）
を、唾液で被覆されたハイドロキシアパタイトディスク
に添加し、次に阻止剤（ＢＳＡ）を添加し、非特異反応
を低減させた。次に抗体被覆酸化亜鉛を添加し、次に蛍
光標識した抗体［ベクター（Vector）］を添加した。最
後に、デジタル画像が生じ、画像素子強度（２０像／試
験試料）に基づく定量がなされるそのディスクをＣＬＳ
Ｍで検査した。ＣＬＳＭにおいて用いられた設定は、１
５０のピンホール、９００のボルト数、−１０のオフセ
ット、×１０の倍率であった。

【００５９】４．２結果 画像素子強度の結果が強い抗原認識を示した（表４）、
抗細菌（ストレプトコッカス・サングイス）抗体被覆酸
化亜鉛は、特異的であるようであった。 表４ 抗体結合 画像素子強度^＊ ストレプトコッカス・サングイス １６１．１２（＋／−４５．８２） 被覆ＺｎＯ 負の対照 １４．６４（＋／−４．９７） （抗細菌抗体なし）^＊ は、蛍光の尺度である。

【００６０】実施例５ ５．１方法 ストレプトコッカス・ミュータンスをＢＨＩ（１５％の
ＣＯ_２、３７℃）で一晩増殖させ、４％スクロースを含
有する新しいＢＨＩ（１／３に希釈された）にこの培養
物の接種をした。培養物をインキュベーション（１５％
ＣＯ_２、３７℃）し、時間が０のときそして次に１時間
毎の間隔（９時間まで）で試料を採取した。同容量の抗
原（ストレプトコッカス・サングイス、調製には、１．
１（ｉ）を参照せよ）を細菌懸濁液に添加し、続いて２
ｍＭの酸化亜鉛を含有する抗体被覆酸化亜鉛を添加し
た。次に試料を３７℃で１時間までインキュベーション
した。その時間後、試料を採り、ｐＨ測定及び生菌の計
数［コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ）を行った。

【００６１】５．２ 結果 ポリマー分布作業（実施例３を参照）と同様に、その培
養物のｐＨがｐＨ４．３２に低下するまで、ストレプト
コッカス・ミュータンスへの抗体被覆酸化亜鉛の添加に
よる効果はほとんどなかった。このｐＨ（７時間増殖）
において、抗体被覆酸化亜鉛の添加が４．３２から５．
９２へと培養物ｐＨを上昇させ、そしてストレプトコッ
カス・ミュータンスの生菌数を低減させるというｐＨ及
び生菌数における有意の効果が観察された。

【００６２】 表５：ストレプトコッカス・ミュータンスの培養物ｐＨにおける抗体被覆酸化 亜鉛の効果 培養物ｐＨ 試験試料 （＋２ｍＭのＺｎＯ） ５．９２ 対照試料 （−ＺｎＯ） ４．３２ （抗体被覆酸化亜鉛がストレプトコッカス・ミュータン
スの培養物に１０分間又は１時間までの間添加された場
合に、ｐＨに関して有意の差は見出だされなかった。）

【００６３】 表６：抗体被覆酸化亜鉛の、ストレプトコッカス・ミュータンスの生菌数にお ける効果 生 菌 計 数 ＣＦＵ／ｍｌ Ｌｏｇ 試験試料 ６．５×１０^８ ６．８１ （＋２ｍＭ ＺｎＯ） 対照試料 ２．９×１０^８ ８．４６ （−ＺｎＯ）

【００６４】ストレプトコッカス・ミュータンスの生菌
計数の低減（表６に示されているように）は、恐らく、
酸性ｐＨでの亜鉛イオン解離の結果としてのグルコース
代謝の阻害によるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】アクチノマイセス・ナエスルンジイとアシアロ
フェチュイン処理ラテックスビーズ、アクチノマイセス
・ナエスルンジイとウシ血清アルブミン処理ラテックス
ビーズ、アクチノマイセス・ナエスルンジイとラクトー
ス及びアシアロフェチュイン処理ラテックスビーズ、ア
クチノマイセス・ナエスルンジイとグルコース及びアシ
アロフェチュイン処理ラテックスビーズをそれぞれイン
キュベーションした場合のそれぞれの細菌の凝集の増加
を吸光度の低減により示した図である。

【図２】デキストランを用いない場合、１０ＫＤａのデ
キストランを用いた場合、７９ＫＤａのデキストランを
用いた場合のストレプトコッカス・ソブリヌスの凝集の
増加を吸光度の低減により示した図である。

【図３】アクチノマイセス・ナエスルンジイとアシアロ
フェチュイン被覆酸化亜鉛、アクチノマイセス・ナエス
ルンジイとウシ血清アルブミン被覆酸化亜鉛、アクチノ
マイセス・ナエスルンジイとアシアロフェチュイン被覆
酸化亜鉛及びラクトース、アクチノマイセス・ナエスル
ンジイとアシアロフェチュイン被覆酸化亜鉛及びグルコ
ースでのそれぞれの細菌の凝集の増加を吸光度の低減に
より示した図である。

【図４】共焦点レーザー走査鏡検法（confocal Laser S
canning Microscopy）のプロトコールを示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年５月２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スチュアート・ウィリアム・カール 英国、エル17・７ビーキュー、リバプー ル、セント・マイケルズ・ハムレット、サ ウスウッド・ロード 14 (72)発明者 カレン・マリー・ピックアップ 英国、ワーラル、スパイタル、スティーブ ンソン・ドライブ ４ (72)発明者 フィリッパ・マーガレット・スミス 英国、チェスター、グレート・バロー、ミ レイン、フォックス・ヘイブン（番地な し) (72)発明者 カート・マシュー・シリング 英国、エル64・６ティーキュー、マーシー サイド、ワーラル、パークゲイト ５、パ ドック・ドライブ 25

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗プラーク剤が、細菌のアドヒージン
   （adhesins）により特異的に認識される炭水化物又はペ
   プチド構造を含有するポリマー又は、プラーク細菌抗原
   を認識する抗体又は抗体フラグメントで被覆された、コ
   ロイドの抗プラーク剤であることを特徴とする、抗プラ
   ーク剤を含む口内用組成物。
2. 【請求項２】 コロイド抗プラーク剤が抗細菌金属又は
   その酸化物である、請求項１に記載の口内用組成物。
3. 【請求項３】 コロイド抗プラーク剤がコロイド酸化亜
   鉛である、請求項２に記載の口内用組成物。
4. 【請求項４】 ポリマーが、細菌レクチンにより特異的
   に認識される炭水化物構造を含有する、請求項１乃至３
   のいずれか１請求項に記載の口内用組成物。
5. 【請求項５】 ポリマーが乳糖蛋白質又は糖蛋白質混合
   物：κ−カゼイン、アシアロ−κ−カゼイン、スイート
   ホエー（sweet whey）及びアシアロフェチュインであ
   る、請求項４に記載の口内用組成物。
6. 【請求項６】 コロイド抗プラーク剤が、口内細菌に対
   して産生される抗体又は抗体フラグメントで被覆されて
   いる、請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の口内
   用組成物。
7. 【請求項７】 細菌レクチンにより特異的に認識される
   炭水化物構造を有するポリマーで被覆されているか又
   は、プラーク細菌抗原を認識する抗体又は抗体フラグメ
   ントで被覆されている、ヒトの口内の特異的部位を標的
   とし、前記口内でコロイド抗プラーク剤を放出するため
   の、コロイド抗プラーク剤の使用。